Der erfolgreiche Einsatz von total porösen 1.8 um … · Der erfolgreiche Einsatz von total...

Der erfolgreiche Einsatz von total porösen 1.8 um Partikel und teilporösen Poroshell und teilporösen Poroshell Säulen in 400, 600 und 1200 bar LC-Systemen

Dr. Ulrike JegleProduktspezialistinSäulen und Verbrauchsmaterialien

Was ist das Geheimnis der U/HPLC-Partikel?

Gemeinsamkeiten und Unterschiede:Poroshell 120 superficial Partikel

Page 2

Poroshell 120 superficial Partikel total poröse 1.8 um Partikelin Theorie und Praxis

Theoretische Bodenhöhe

H = A + B/u + C x u

grosse Partikel kleine Partikel

1.8 um

Je kleiner die theoretische Bodenhöhe HETP

desto besser die Auflösung R!

Poroshell 120

Voraussetzung ultra-schnelle und ultra-effizienteU/HPLC – kleinste Partikel

Page 3

Theoretische Bodenhöhe

HETP

Linearer Fluss u

Mehrwegs-Term

Eddy Diffusion

Resulting Van-Deemter Kurve

Massentransfer

H = A + B/u + C x u

u opt

H min

Longitudinale Diffusion

C Term der van Deemter Kurve: Massentransfer

Abweichungen im Diffussionspfad in die Poren der Partikel

Page 4

Poröses Partikel

Statische mobile Phase

Gross, total poröser Partikel

Klein, total poröser Partikel

300 Poroshell 5 µm fester Kern, poröse Schicht

Die Diffusionsgeschw. grosser Biomoleküle ist Faktor 10 kleiner verglichen zu kleinen Molekülen

Partikeltyp – Bodenzahl

Page 5

ReduzierterDiffusionspfad

0.25 µm2.5 µm5 µm 1.8 µm

ReduzierterDiffusionspfad

Poroshell 120 2.7umfester Kern, poröse Schicht

0.5 µm

ReduzierterDiffusionspfad

Die Kerne besitzen eine uniformeGrösse und eine glatte Oberfläche

Dies führt zu einer engenPartikelgrössenverteilung – engerals das mit total porösen Partikelnmöglich wäre

Ein Coacervation Prozess wird in einem

Herstellung von Poroshell 120 Partikeln

Page 6

Ein Coacervation Prozess wird in einemeinzigen Schritt durchgeführt, nicht wiesonst üblich in einemMehrschichtprozess.

In einem Coacervation Prozess werdenkleine Sol-Partikel aggregiert um den Partikel zu formen.

Massentransfer und Eddy Diffusion werden optimiert.

Pla

te H

eigh

t

Verschiedene Diffusionspfade

A Term: Eddy Diffusion

Page 7

Pla

te H

eigh

t

Lineare Geschwindigkeit

verschiedene Länge Packqualität

A Term – Eddy Diffusion / Mehrwegsdiffusionabhängig von Partikelgrösse, Partikelgrössenverteil ung, Packqualität des Betts

PartikelgrössenverteilungTotal Poröse Partikel und Poroshell 120 Partikel

Van Deemter Plot 2.7 um Poroshell Partikel (120 A) - total poröse 1.8um (80A)

van Deemter

0.0015

0.002

0.0025

0.003

HE

TP

(cm

)

Eclipse Plus C18, 3.5 µm

Eclipse Plus C18, 1.8 µm

Poroshell 120 C18, 2.6umPoroshell 120 C18, 2.6 µm

Poroshell 120 C18, 2.7 µm

Page 9

0

0.0005

0.001

0.0015

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

Flow rate (mL/min)

HE

TP

(cm

)

Poroshell erreicht ca. 90% der Trenneffizienz von s ub2 micron Partikeln

40,0

50,0

60,0

70,0

Pea

k C

apac

ity

Average Peak Capacity

Poroshell 120 EC C18

Peakkapazität2.7 um Poroshell Partikel (120 A) - total poröse 1.8um (80A)

June 17, 2011Confidentiality Label

10

0,0

10,0

20,0

30,0

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4

Pea

k C

apac

ity

Flow Rate (ml/min) scaled gradient

Competitor C18 2.5 um

Eclipse Plus C18 5 um

Eclipse Plus 3.5 um

Eclipse Plus C18 1.8 um

Formel: Pc=1+ (tp-to)/1.699*(pw @ half height).

Poroshell 120 EC C182 ml/min 220 BarPc Ave=54

minminminmin0 1 2 3 4 5 6

mAUmAUmAUmAU

0

10

20

30

40

50

60

0.35

6

0.70

7

1.34

9

1.81

5

3.04

4

4.17

1

4.41

0

4.54

1

4.86

3

5.28

6

5.51

95.

605

6.14

4

Eclipse Plus C18 RRHTmAUmAUmAUmAU

Peakkapazität2.7 um Poroshell Partikel (120 A) - total poröse 1.8um (80A)Säulen: 4.6 x 50mm Flussrate: 2 mL/min

June 17, 2011Confidentiality Label

11

minminminmin0 1 2 3 4 5 6

Eclipse Plus C18 RRHT2 ml/min 364 BarPc Ave=61

minminminmin0 1 2 3 4 5 6

mAUmAUmAUmAU

0

10

20

30

40

50

60

0.34

8

0.76

4

1.53

1

2.04

2

3.30

9

4.38

8

4.62

6

4.78

1

5.17

7

5.47

9

5.72

75.

809

6.31

7

Probe: Hydroquinone, Resourcinol, Catechol, Phenol, 4-Nitrophenol, p-Cresol, o-Cresol, 2-nitrophenol, 3,4 di methyl phenol, 2,3 di methyl phenol, 2,5 di methyl phenol, 1 -napthol

2 ml/min

Time % B

1 1 5

2 8.5 60

3 10 60

4 11 5

Bedingungen: Compounds were combined in equal volum es to yield approximately 0.1 mg/ml in Wasser, 10ul InjektionSäule: 4.6 x 50 mm, A: 0.1 % Ameisensäure in Wasser, B: Acetonitril, Detektion: 270 nm, no reference

Rückdruck : superficial – total porös2.7um Poroshell 120 ca. 40% kleiner als 1.8um total po rös

400

500

600

Pressure, 60/40 CH3CN/H2O

Agilent Poroshell 120 EC-C18, 3.0 mm x 100 mm, 2.7 um

(USCFX01009)

Ascentis Express

Poroshell 120 EC-C18

Kinetex1.8 um

June 17, 2011

Confidentiality Label12

0

100

200

300

0 2 4 6 8 10 12

Pre

ssu

re (

ba

r)

u (mm/s)

(USCFX01009)

Supelco Ascentis Express C18, 3.0 mm x 100 mm, 2.7 um

(USKJ001754)

Phenomenex Kinetex C18, 4.6 mm x 100 mm, 2.6 um

(501286-43)

Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18, 3.0 mm x 100 mm, 1.8

um (USUYB01455)

Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18, 3.0 mm x 100 mm, 3.5

um (USUXV01435)

3.5 um

Rückdruck: Poroshell 120 - Sub 2-micron

Poroshell 120

EC-C18

2.7 um

P = 332 Bar

Säulen: 4.6 x 100 mmA: Wasser 0.1% AmeisensäureB: Acetonitrile 0.1% AmeisensäureGradient 2 ml/minInitial 8 % B10 min 30% B275 nm 2mm FlusszelleInjektion: 10 uL Agilent 1200 SL 40 °C

1. Hydroquinon2. Resorcinol3. Catechol4. 4-Nitrophenol5. p-cresol6. o-cresol7. 2-Nitrophenol8. 2,3 Dimethyl

phenol9. 2,5 Dimethyl

phenol10. 1-Naphthol

10

12

34 5

67

8

9

Agilent RRHT zeigt einen geringeren Rückdruck als die meisten sub 2um Säulen, aber für Poroshell 120 ist er noch geringer.

Page 13

min0 2 4 6 8 10

min0 2 4 6 8 10

RRHT Eclipse Plus C18

1.8 um

P = 510 Bar

10

4 56 7

8

9

12

3

Poroshell 120 liefert ähnliche Effizienz wie sub 2- micron aber bei geringerem Rückdruck.

Beladbarkeit der Poroshell 120

0,3

0,4

0,5

0,6

Pe

ak

Wid

th (

s)

Acid Loading with Benzoic Acid

Agilent Poroshell 120 EC-C18, 3.0 mm x 100 mm, 2.7 um

(USCFX01009)

Supelco Ascentis Express C18, 3.0 mm x 100 mm, 2.7 um

(USKJ001754)

Phenomenex Kinetex C18, 4.6 mm x 100 mm, 2.6 um pKa = 4.19

June 17, 2011

Confidentiality Label14

0

0,1

0,2

0,01 0,1 1 10 100

Pe

ak

Wid

th (

s)

Concentration of Benzoic Acid (mg/mL)

Phenomenex Kinetex C18, 4.6 mm x 100 mm, 2.6 um

(501286-43)

Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18, 3.0 mm x 100 mm, 1.8

um (USUYB01455)

Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18, 3.0 mm x 100 mm, 3.5

um (USUXV01435)

85% 25 mM Na2HPO4 Puffer, pH 3.0 15% Acetonitril

275 nm, 30 °C

pKa = 4.19

Superficially poröse und total poröse Säulen eine ähnliche Beladbarkeit.

Beladbarkeit der Poroshell 120

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

Pe

ak

Wid

th (

s)

Base Loading with Dextromethorphan

Agilent Poroshell 120 EC-C18, 3.0 mm x 100 mm, 2.7 um

(USCFX01009)

Supelco Ascentis Express C18, 3.0 mm x 100 mm, 2.7 um

(USKJ001754)

pKa = 8.3

June 17, 2011

Confidentiality Label15

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,001 0,01 0,1 1

Pe

ak

Wid

th (

s)

Concentration of Dextromethorphan (mg/mL)

(USKJ001754)

Phenomenex Kinetex C18, 4.6 mm x 100 mm, 2.6 um

(501286-43)

Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18, 3.0 mm x 100 mm, 1.8

um (USUYB01455)

Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18, 3.0 mm x 100 mm, 3.5

um (USUXV01435)

80% 25 mM Na2HPO4 Puffer, pH 3.0 20 % Acetonitrile205 nm, 30 °C

Superficially poröse und total poröse Säulen eine ähnliche Beladbarkeit.

Peakform und Tailingfaktor – Qualitätskriteriumstationärer Phasen

mAU

60

80 Poroshell 120

Poroshell 120 EC C18 Tf = 1.48Ascentis Express Tf = 2.68Kinetex Tf = 4.78

Amitryptilin

June 17, 2011Confidentiality Label

16

min0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8

0

20

40 KinetexAscentis Express

Säulen: 4.6 x 50mm, Mobile Phase: 20 mM 40% Na2HPO4, pH 7.00 60% Acetonitril Flussrate: 1.5 mL/minProbe: 2 uL Injektion von 250 ug/mL Amitriptylin , 50 ug/mL Uracil in H2O/CH3CN (9:1) Temp: 24°C Deteckor 254nm, 2-uL Flusszelle

Poroshell 120 Säulen für HPLC und UHPLC:

• 80-90% der Trenneffizienz von “sub 2um”• bei ~40-50% geringerem Rückdruck• Partikelgrösse: 2.7um • Fritte: 2um Porengrösse für minimiertes

Verstopfungspotential

Beschreibung: Poroshell 120

Verstopfungspotential• Druckgrenze: 600 bar

• Der superficial Partikel hat einen festenKern (1.7um) und eine poröseAussenschicht von nur 0.5 um

June 17, 2011Confidentiality Label

17

RRHD und RRHT Säulen für HPLC und UHPLC Maximale Trennleistung

• 100% der Trenneffizienz• Höherer Rückdruck (Dimension, Solvent, T)

• Partikelgrösse: 1.8 um • Fritte: 0.2/0.3 um Porengrösse• Druckgrenze: 600 bzw 1200 bar

• Beschreibung: sub 2 um total porös

June 17, 2011

Confidentiality Label18

• Druckgrenze: 600 (RRHT) bzw 1200 bar (RRHD)

• Der Partikel ist total porös und hat damitden klassischen Aufbau für ultra-reineKieselgelmaterialien.

Rapid Resolution High Definition RRHD

1.8 µm Partikel in 1200 bar Säulen-Hardware ideal für 1290 Infinity LC Systeme

StableBond C18/C8, SB Phenyl, SB CN und Eclipse Plu s C18/C8, Eclipse XDB C18, Extend C18,

Rapid Resolution High Throughput RRHT

Optionen für U/HPLCWelche Partikel in welchem Säulentyp?

Page 19

Rapid Resolution High Throughput RRHT

1.8 µm Partikel in 600 bar Säulen-Hardware mehr als 140 Optionen

StableBond, Eclipse XDB, Eclipse Plus, Bonus RP, E xtend C18

Poroshell 120

Superficial Partikel in 600 bar Säulen-Hardware

StableBond C18 and EndCapped EC C18/C8

Ultra-schnelle und ultra- hoch effiziente Analysen Wann nutze ich welche Säule?ultra-schnelle Analyse:

• Hoher Probendurchsatz oder Bedarf für schnelle Resultate

• kurze, generische Gradienten

• Kurze Säulen

• Hohe Flussrate

ultra-hoch auflösende Analyse:

• Komplexe Proben, Bedarf jede Komponente zu trennen

• lang dedizierte Gradienten

• lange Säulen

• „normale“ Flussrate

Page 20

• 1.8 um Partikel

partikel- / matrix- haltige Proben:• 2.7 um Poroshell • Säulen für Proben, die die Fritte der 1.8 µm- Partik el-Säulen blockieren würden und schnelle Analysen

• Hohe Auflösung bei moderatem Druck

• 1.8 um Partikel und 2.7 um Poroshell

Sub 2um versus Poroshell 12017 Aminosäuren auf 1290 Infinity

min0 2 4 6 8 10 12

mAU

0

50

mAU

Poroshell 120 EC-C183.0 x 100mm, 2.7um

Pmax=331 barF=0.86 mL/min

RRHT Eclipse Plus C183.0 x 100mm, 1.8um

Rs6,5=1.98

Rs6,5=2.28

Rs14,13=1.81W½ 9 =0.043 min.

.

Group/Presentation TitleAgilent Restricted

Month ##, 200X

min0 2 4 6 8 10 12

mAU

0

50

min0 2 4 6 8 10 12

mAU

0

50

3.0 x 100mm, 1.8um

Pmax=474 barF=0.86 mL/min

RRHD Eclipse Plus C183.0 x 100mm, 1.8um

Pmax=528 barF=0.86 mL/min

Rs6,5=2.28

Rs6,5=2.90

Rs14,13=2.34

Rs14,13=1.81

W½ 9 =0.036 min.

W½ 9 =0.045 min.

Überlegungen zum Einsatz der „sub-2-micron“ und Poroshell120 Säulen in der Praxis - Applikationen

June 17, 2011Confidentiality Label

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Optimale Flussrate: für Poroshell 120 höher als für 5 oder 3.5 micronErhöhung der Flussrate - kein Verlust an N

June 17, 2011Confidentiality Label

23

Empfohlene Flussratenfür Poroshell 120 Säulen:für 4.6 mm Säulen 2 ml/min für 3 mm Säulen 0.85 ml/minfür 2.1 mm Säulen 0.42 ml/min

Drei Details zu van Deemter Kurven

0.0025

0.0030

0.0035

0.0040

0.0045

HE

TP

(cm

/pla

te)

1. Van Deemter Kurven gelten nur für isokratische Läufe

2. Van Deemter Kurven sind substanzspezifisch3. Van Deemter Kurven sind auch für sub-2- µm

oder Poroshell 120 Partikel nicht horizontal, aber sehr flach

Page 24

-0.0005

0.0000

0.0005

0.0010

0.0015

0.0020

0.0025

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6

5.0 µµµµm

3.5 µµµµm

1.8 µµµµm total porös

2.7 um teilporös

HE

TP

(cm

/pla

te)

Interstitial linear velocity ( ue- cm/sec)

Flussratenerhöhung ohne Verlust an Bodenzahl

min2 4 6 8 10 12 14

mAU

0

100

200

300

400

5004.6 x 150 mm, 5 µm1 mL/min

min1 2 3 4 5

mAU

0

200

400

600

8004.6 x 50 mm, 1.8 µm1 mL/min

Page 25

min2 4 6 8 10 12 14 min1 2 3 4 5

min0.5 1 1.5 2 2.5

mAU

0

200

400

600

800 4.6 x 50 mm, 1.8 µm2 mL/min

min0.2 0.4 0.6 0.8 1

mAU

0

100

200

300

400

500

600

700 4.6 x 50 mm, 1.8 µm5 mL/min

Flussratenerhöhung ohne Verlust an Bodenzahl

min1 2 3 4 5

mAU

0

200

400

600

mAU

0

200

400

600

4.6 x 150 mm, 5 µm1 mL/min

4.6 x 50 mm, 1.8 µm1 mL/min

Page 26

min1 2 3 4 5

min1 2 3 4 5

mAU

0

200

400

600

min1 2 3 4 5

mAU

0

200

400

6004.6 x 50 mm, 1.8 µm5 mL/min

4.6 x 50 mm, 1.8 µm2 mL/min

Optimierung der Geschwindigkeit unter Erhalt der Auflösung – pharmazeutische Sulfa-Verbindungen

Methodentransfer

June 17, 2011Confidentiality Label

27

Ursprungsmethode: 4.6 x 250 mm, 5-um Säulepharmazeutische Sulfa-Verbindungen

Agilent 1100, kein Mischer, grüne Kapillaren, Temp.: 30C5 ul injection, 2 ul Flusszelle, Detektion: 254 nm, Datenrate = response time 0.1s

mAU

80

100

kritisches Peakpaar

Rs=1.21Druck = 110 bar

Zeit %B0 830 3333 33

Flussrate: 1 ml/min

A: 0.1 % Formic Acid in WasserB: 0.1 % Formic Acid in MeCN

Eclipse Plus C18, 4.6 x 250mm, 5um

Sulfadiazine,Sulfathiazole SulfapyridineSulfamerazine,Sulfamethazine, Sulfamethazole, Sulfamethoxypyridazine,SulfachloropyridazineSulfamethoxazole, Sulfadimethoxine

Methodentransfer auf Poroshell 120 EC-C18 zur Beschleu nigung unter Erhalt derAuflösung des kritischen Peakpaares

min5 10 15 20 25 30

0

20

40

60

33 3334 8

Methodentransfer auf eine 100 mm Poroshell 120 EC C18

4.35

6

4.69

1Druck = 172 bar

Time %B0 810 3311 3312 8

Angepasste ParameterSäule: Poroshell 120 EC-C18 4.6 x 100mm, 2.7umInjektion: 5 ul auf 2 ul

Zeit: (100/250 x30 min) = 12 minFlussrate: 1 ml/minGradient:

kritisches Peakpaar

Rs=1.21

min2 4 6 8 10 12

3.63

3 4.21

8

4.69

1

5.61

3

5.98

1 6.06

4

7.46

0

8.27

0

10.4

00

Druck = 172 bar

Beschleunigung > Faktor 2 unter Erhalt der Auflösung des kritischen Peakpaares

2.43

0

2.82

62.

921

3.14

5

3.77

4

4.01

74.

075

5.00

2

5.53

9

6.97

4

Time %B0 8

6.7 337.4 33

1.5 ml/min

Poroshell 120 EC-C18 4.6 x 100mm, 2.7um

Methodentransfer: weitere Beschleunigung durch Flussra te

angepasste Parameter

min2 4 6 8

min2 4 6

1.82

1

2.12

12.

192

2.35

8

2.83

3

3.01

03.

055

3.73

9

4.13

5

5.21

9

Flussratenerhöhung unter Erhalt der Gradientensteilheit – Beschleunigung unter Erhalt der Auflösung

Time %B0 85 335.5 33

2.0 ml/min

Druck < 400 bar

Optimierung der Auflösung bei optimal hoher Flussrate zur schnellst möglichen hochauflösenden Analyse - Phenole

June 17, 2011Confidentiality Label

31

Trennung: 12 Phenole auf Poroshell 120 EC-C18

Instrument: 1200 SLSäule: Poroshell 120 EC-C18, 4.6 x 50mm, 2.7umMobile Phase:Solvent A: Wasser with 0.1% AmeisensäureSolvent B: AcetonitrilTemp.: 25 °CGradient::Time %B0.8 5%6.8 60%Detektion: 2 mm Flusszelle

1. Hydroquinon2. Resourcinol3. Catechol4. Phenol5. 4-Nitrophenol6. p-Cresol7. o-Cresol8. 2-Nitrophenol9. 3,4 Di methyl phenol10. 2,3 Di methyl phenol11. 2,5 Di methyl phenol12. 1-Napthol

274 bar, 2.5 ml/mintrotz der hohen Flussrate

min0 5

gute Trenneffizienz, gute Auflösung und schnell, aber k eine Basislinientrennung des kritischen Peakpaares -> höhere Auflösung?

Höhere Auflösung durch längere Säule

mAU100

Instrument: 1200 SLSäule: Poroshell 120 EC-C18, 4.6 x 100 mm, 2.7umMobile Phase:Solvent A: Wasser with 0.1% AmeisensäureSolvent B: AcetonitrilTemp.: 25 °CGradient::Time %B2.0 5%17 60%Detektion: 2 mm Flusszelle

1. Hydroquinon2. Resourcinol3. Catechol4. Phenol5. 4-Nitrophenol6. p-Cresol7. o-Cresol8. 2-Nitrophenol9. 3,4 Di methyl phenol10. 2,3 Di methyl phenol11. 2,5 Di methyl phenol12. 1-Napthol

2.0 ml/min, 394 bartrotz der hohen Flussrate und der langen Säule

20

40

60

80

min2 4 6 8 10 12

0

sehr gute Trenneffizienz, sehr gute Auflösung aber wenige r schnell -> höhere Auflösung?

Höhere Auflösung durch längere Säule

2 mL/min

min0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

mAU

0

20

40

60

80

100

120 P = 538 bar

Instrument: 1200 SL, Säulen: Poroshell 120 EC-C18, 4.6 x 150mm, 2.7um Mobile Phase: Solvent A: Wasser with 0.1% Ameisensäure Solvent B: Acetonitrile Temperatur: 25 °C, Deteketionszelle: 2 ul

1. Hydroquinon2. Resourcinol3. Catechol4. Phenol5. 4-Nitrophenol6. p-Cresol7. o-Cresol8. 2-Nitrophenol9. 3,4 Di methyl phenol10. 2,3 Di methyl phenol11. 2,5 Di methyl phenol12. 1-Napthol

für 600 bar Drucklimit

min0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

min0 5 10 15 20 25 30 35

mAU

0

20

40

60

80

100

120 1 mL/min P = 285 barGradient: 1mL/minTime%B6.0 5%51 60%Gradient: 2mL/minTime%B3.0 5%25.5 60%

12. 1-Napthol

optimaleTrenneffizienz, optimale Auflösung brauchten Z eit, höheres Drucklimit spart Zeit

für 400 bar Drucklimit

Hohe Flussraten auch für optimale Trennungen mit Rapid Resolution High Definition Eclipse Plus C18

Methode

Säule ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18, 2.1 x 50 mm, 1.8 µm

total porös (SN USDAY01001)

Mobile Phase A=0.02% H3PO4, B=Acetonitril/Methanol 3/1

Flussrate 1.6 mL/min

Gradient 0-1.85 min 30-100% B

Injektionsvolumen 1 µL

Detektor Sig=280/10 nm, Ref=400/50, 80 Hz

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Detektor Sig=280/10 nm, Ref=400/50, 80 Hz

Sig=255/10 nm, Ref=400/50, 80 Hz

Temperatur 45°C

Probe Antioxidanten ca. 100 ppm

Daten: Gerd Vanhoenacker Forschungsinstitut für C hromatographieKennedypark 26 8500 Kortrijk Belgien

1.6 mL/min ist eine sehr hohe Flussrate für 2.1 mm ID Säu len

Schnelle Analyse – hohe Flussrate: ZORBAX Rapid Resolution High Definition Eclipse Plus C18

mAU

400

500

600

DAD1 D, DAD1C, DAD: Signal C, 280 nm/Bw:10 nm Ref 400 nm/Bw:50 nm (G:\1290\AOX JASMIN\AOX-AM2-45C-101.D)

0.4

15

DAD1 E, DAD1D, DAD: Signal D, 255 nm/Bw:10 nm Ref 400 nm/Bw:50 nm (G:\1290\AOX JASMIN\AOX-AM2-45C-101.D)

THBP

Daten: Gerd Vanhoenacker Forschungsinstitut für Chromatographie

RRHD Eclipse Plus C18, 2.1 x 50mm, 1.8um, Pmax 1070 barDiese Probe mit 10 Komponenten benötigt einen Gradienten, der zu Drücken über 1000 bar führtAnalysenzeit < 2 Minuten!

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min0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8

0

100

200

300

0.2

72

0.4

80

0.7

57

0.8

83

1.0

11

1.0

55

1.5

24

1.5

56 1.6

84

PG

TBHQNDGA

BHA

Ionox-100

OGDG

BHT AP

Forschungsinstitut für ChromatographieKennedypark 26 8500 Kortrijk Belgium

Optimale Auflösung für Gradientenanalysen mit RRHD Säulen

Einfache Optimierung :

(αααα - 1)

αααα[ ]Rs = √√√√ N k-FaktorN = Bodenzahl

aaaa = Selektivität

k = Kapazitätsfaktor – isokratische ElutionK* = Retentionsfaktorsfaktor – Gradientenelution

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optimal anwendbar für Säulen im Längenbrereich von 50 – 150mm.

k* =S •••• ∆Φ∆Φ∆Φ∆Φ •••• Vm

tG •••• FEinfache Optimierung : tG = GradientenzeitF = FlussrateVm = Säulenvolumen (Änderungder Säulenlänge)∆Φ∆Φ∆Φ∆Φ = GradientenbereichS = substanzspez. Konstante

Analyse: Süssholzwurzel (Lakriz) auf RRHD Säulen 30 Minutengradienten für jede Säulenlänge

minminminmin0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

mAUmAUmAUmAU

0

50

100

150

200

mAUmAUmAUmAU

200

RRHD SB-C18 2.1 x 50 mm, 1.8umPmax=366 barnc = 424

RRHD SB-C18 2.1 x 100 mm , 1.8umRs: 1.37

Rs: 0

Instrument: 1290 InfinityMobile Phase: 10-100% B /30 min A: 0.1% Ameisensä ure B: Acetonitril mit 0.1% Ameisensäure, Flussrate: =0.4 mL/min, Raumtemperatu r, Detektion: 280nm UV

Page 38Page 38

minminminmin0 2 4 6 8 10 12 14 16 180

50

100

150

minminminmin0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

mAUmAUmAUmAU

0

50

100

150

200

RRHD SB-C18 2.1 x 100 mm , 1.8umPmax=595 bar nc = 485

RRHD SB-C18 2.1 x 150 mm, 1.8umPmax=768 bar nc = 589

Rs: 2.40

Rs: 1.37

Analyse: Süssholzwurzel (Lakriz) auf RRHD Säulen 30 Minutengradienten für jede Säulenlänge

50 mm 100 mm 150 mm

7 Peaks 8 Peaks 9 Peaks

Peakkapazität und Auflösung werden durch die Paramet er Säulenlänge und Gradietenzeit optimiert.

Page 39Page 39

1290 InfinityMobile Phase: 10-100% B /30 min, A: 0.1% Ameisensäu re B: Acetonitril mit 0.1% Ameisensäure, Flussrate =0.4 mL/min, RT, Detektion: 280nm UV

2 4 2 4 6

Rs: 2.40Rs: 1.37

2 4

Rs: 0

7 Peaks 8 Peaks 9 Peaks

Vergleich: Peakkapazität Säulenlänge und Gradientenzeit

10 Minuten 20 Minuten 30 Minuten

Analyse: SüssholzwurzelGradienten-zeit Säulen-

länge

nc= tg/wBasisline des letzten eluierten Peaks 1

Page 40

50 313 358 424

100 343 418 485

150 386 483 589

Farbig unterlegte Zahlen entsprechen vergleichbarer Peak kapazität

1. Neue, U.D., et. al, Advances in Chromatography, 41, 93 (2001)

Hochauflösende Analysen: lange 1.8um Säulen

mAU

150

200

DAD1 A, Sig=254,4 Ref=off (E:\090422JWH\PRESSURE000027.D) PMP1, PMP1B, Pressure

Gradient 10-100% B/15 min.Druck 800- 900 barDruck zu Gradientenbeginn ca. 480 bar

Lange Säulen in Serie geschaltet liefern max. Rs fü r komplexe Proben Aromastoffe für geräucherte Lebensmittel

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min0 2 4 6 8 10 12 14

0

50

100

Mobile Phase A: Wasser B:Acetonitril, Flussrate=0.2 5 mL/min, Raumtemperatur, Säule: ZORBAX RRHD, SB-C18, 2.1 x 150+100 mm, 1.8um

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Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!!