Die spektrophotometrische Bestimmung von Glyoxal und Methylglyoxal in biologischem Material

4. Anf Physiologie und Pathologie beziigliche. 397

misch yon Essigs~ure-Aeeton-Ligroin (8: 4: 88). Das Eluab verwirft man, ebenso das zu oberst befindiiehe Band der Dinitrophenylderivate der Nieht-Colamine, das man abschneidet. Das Band des Dinitrophenyl~thanolamins befindet sieh etwa 17--25 mm tiefer. Man eluiert es mit einem Gemiseh aus Essigs~ure-Aceton- Ligroin (8:35: 57), ffillt das Eluat auf ein bestimmtes Volumen auf und photome- triert bei 347 m,u. Aus einer Eiehkurve liest man die Colaminwerte ab. Von einem menschliehem Normalharn zugesetzten Mono~thano!amin warden 92--97% wieder- gefunden. Die Ergebnisse an TierversuChen wurden physiologisch ausgewertet.

H. FnEYTAG.

Eine sehnelle und vereinfaehte papierehromatographisehe Analyse yon Lipiden besehreibt M. H. I:[ACK 1. Es kommt dabei die Rundfiltermethode zur Anwendung. Als LSsungsmittel ffir die Lipide dient Benzol, Aeeton oder Chloroform-Methanol ( i : 1); mit letzterem wird aueh das Papier vor Gebraueh extrahiert. Gegrocknet wird ira Stiekstoffstrom. Zum Eluieren benutzt man Aceton, Benzol, Chloroform, MethanoI, aber aueh Pyridin, ~_thylacet~t, Schwefelkohlenstoff and DichlorSthylen, die fiber entw~ssertem Calciumsulfat destilliert werden. - - Bei der Untersuchung yon Blutserum verwendet man den Chloroform-Methanolextrakt des gefrier- getroekneten Serums; man prfift auf Cholin nach der Diehromat-H~matein- methode ~ and mit Nflblau auf Cardiolipin, Phosphatidylserin u. a. (Blauf~rbung) und lipophile Verbindungen (Rosafi~rbung). Eine bessere Trennung ist mSglieh, wenn man erst mit Aceton und dann mit Methanol eluiert. - - Ffir Cholinlipide kommen als Naehweismittel noch 0,05 n REr~ECKE-SalzlSsung 3, 0,0001 n J2-KJ- LSsung ~ sowie 0,005 n Phosphomolybdi~ns~ure 5 in Betraeht. Zum Naehweis yon Aminolipiden verwendet man 0,005 n NinhydrinlSsung und ftir Acetallipide (Plasma- Iogene) fuchsinschweflige Si~ure 6 in Gegenwart yon 0,005 n HgC12-LSsung naeh ttydrolyse der Acetalbindnng. Phosphate werden nach C. S. I~A~s und F . A . [SttERWOOD 7 identifiziert. Cholesterin wird festgestellt dutch Auftreten eines rosa- farbenen Ringes beim Eintegen des Chromatogramms in Essigsgure-Schwefels~ure (1 : 1). Der Naehweis yon Glueolipiden (Cerebrosiden) erfo]gt nach R. W. MoR~Iso~ und W. H. HACK s u n d tier yon ungesiittigten Fettsiiuren und Aldehyden durch Be- dampfen mit OsO~ (braune bis sehwarze gingf~rbung). H. F~Er~AC.

Die spektrophotometrisehe Bestimmung yon Glyoxal trod Methylglyoxal in biologisehem Material beschreiben J . M. : D E C t I A R u E. Ku~r und H. C. PITOT 9. - -

Ausfi).hrung. Ver/ahren A. Etwa 1 ml ProbelSsung der Dicarbonylverbindnng wird in ein Borosilicatreagensglas pipettier~ und, wenn nStig, mit 10 n Sehwefels/iure auf 1 ml gebraeht, dana ffigt man 0,7 ml ReagenslSsung (21,0 mg 2,3-Diamino- phenazin in 100 ml 10 n Schwefelsi~ure; bei ~- 4 ~ C im Dunkeln 5--7 Tage haltbar) und 0,5 ml konz. Schwefels/iure zu. Daneben durchli~uft ein Blindansatz mit 1 ml 10 n Schwefels~ure den Arbeitsgang. Die Gli~ser werden 1 Std lang im siedenden Wasserbad erhitzt und dann in Eiswasser abgekiihlt. Danach gibt man 1 ml KaliumnitritlSsung (20,0mg/100ml, im Eisbad aufzubewahren) zu, sehfittelt

1 Biochemic. J. 54, 602--605 (1953). 2 BAKES, J. R.i Quart. J. micr. Sci. 88, 463 (1947). z BAER, E., and M. KATES: J. Amer. chem. Soe. 72, 942 (1950).

BR~_~TE, G.: Nature (London) 163, 651 (1949); vgl. diese Z. 135, 62 (1952). 5 LEVINE, C., and E. C]tARGAFF: J. biol. Chemistry 192, 465, 481 (1951). 6 HACK, M. H. : Anatom. Ree. 112, 275 (1952). 7 Nature (London) 164, 1107 (1949).

Amer. J. Pathol. 25, 597 (1949). Analyt. Chemistry 26, 449--452 (1954). Tulane Univ., New Orleans, La. (USA).

398 Berieht: Spezielle analytische Methoden.

heftig dureh und fiigt zuletzt 1 ml 50%ige unterphosphorige Si~ure zu, sehfittelt und erhitzt die G1Aser wiederum 1 Std im siedenden Wasserbad. Die entstandene blaue F~rbung ist 24 Std best~ndig. Mit TestlSsungen aus 0,1/~m/ml Glyoxal (I), 0,7 #m/1 Monomethylglyoxal (II) und 0,7 #m/ml 2,3-Butandion (III) wurden die Absorptionsspektren ermittelt. I zeigt ein ausgeprs Maximum bei 600 m/~, wi~hrend yon II und I I I die Maxima bei 440 bzw. 450 m# und bei 620 bzw. 610 m/~ liegen. Die Eiehkurve yon 0,02--0,2 #m/ml Glyoxal wurde bei 600 m# aufgestellt und erffillt ffir den Bereich das LA~E~T-BEEnsehe Gesetz. Versehiedene Oxy- aldehyde und Oxyketone stSren, bei ]~ngerem Erhitzen (fiber 3 Std) auch Diketone. - - Ver]ahren B . Etwa 1 ml ProbelSsung (maxima] 0,15#m/ml Glyoxal oder 0,6 #m/ml 2-Oxopropan~l) erhitzt man mit 1 ml ReagenslSsung zusammen mit einem Blindansatz genau 10 rain in einem koehenden Wasserbad, kfihlt in Eis- wasser ab, gibt 1 ml KalinmnitritSsung und 0,5 ml unterphosphorige S~ure zu und erhitzt dana noeh 20 minim siedenden Wasserbad. Naeh dem Abkfihlen setzt man 0,5 ml Eisessig zu und verdiinnt auf 4 ml. Die Messung erfolgt in 10 mm-Kfivetten bei 600 m#. Dutch die abgei~nderte Arbeitsweise st5ren weder die Zucker, noeh AbkSmmlinge yon Glyoxal bzw. 2-Oxopropanal sowie Aseorbinss und andere Endiole. - - Daneben werden Angaben fiber den Ablauf der Farbreaktionen ge- bracht. H. P o ~ .

Ketos~inren, vor allem Brenztraubens~iure und Ketoglutars~iure, in Blur, Muskel, Leber und Gehirn, k5nnen naeh einer vereinfachten papierehromatographischen Methode yon D. CAV~LLI~I und N. FnO~T~I 1 in Form der Dinitrophenylhydrazone bestimmt werden. Die EnteiweiBung erfolgt mit Metaphosphors~ure oder Wolfram- si~ure. Letztere ist ffisch zu bereiten aus 60 Teilen Wasser, 20 Teilen 10%iger Natriumwolframatl5sung und 20 Teilen 0,66 n Sehwefelsi~ure. - - Arbeitsweise. Organe homogenisiert man mit der berechneten Menge Enteiwei]~ungsmittel im Waring Blendor oder zerreibt sie mit Quarzsand in Gegenwart des Enteiweil~ungs- mittels im MSrser. Das Mengenverh~ltnis yon biologischem Material zum Ent- eiweiBungsmittel betri~gt bei Wolframs~ure 1 : 5. In allen ~i~llen filtriert man nach 10 rain und entnimmt zur weiteren Verarbeitung einen aliquoten Teil, etwa 20--30 ml. In einem Sehliffreagensglas versetzt man diese Menge mit 1 ml 0,2%iger 2,4-DinitrophenylhydrazinlSsung in 2 n Salzs~ure und l~13t 20 rain lang stehen. Die Extraktion der Hydrazone erfo]gt mit zuni~ehst 5 ml, dann noeh 3--4mal mit 3---5 ml ~ther. Bei Emulsionsbildung zentrifugiert man und ffigt die klare fiber- stehende Flfissigkeit zu den anderen ~therischen Extrakten. Dann wird der ~ther nach Befreinng yon neutralen Phenylhydrazonen und dem fiberschfissigen Reagens auf dem warmen Wasserbade im Vakuum abdestil]iert. Zum Trockenrfickstand gibt man eine genau abgemessene Menge n AmmoniaktSsung (h5chstens 1 ml) und bringt soviel als mSglich in L5sung. Tropfenweise ffigt man die gleiehe Menge Chloroform zu, sehfittelt 1 rain und fibertri~gt in ein Zentrifugiergli~schen. Nach dem Zen~rffugieren entnimmt man der ammoniakalisehen L5sung einen aliquoten Teil (geeignet sind 0,2 ml), der auf einen 2 • 60 em-Streifen Seh. & Sch.-Papier Nr. 2043b getiipfelt wird. Zum Entwickeln eignet sich am besten ein Gemisch yon n-Butanol--~thanol Wasser (40 : 10 : 50). Der betreffende entwiekelte Tfipfel wird herausgesehnitten, der Streifen mit der Sehere zerkleinert und in ein Zentrffugier- rShrchen gegeben. Man ffigt eine genau abgemessene Menge n Natronlauge hinzu (8 ml, wenn ein Coleman-, 4 ml, wenn ein Beckman-Photometer benutzt wird) sehfittelt, zentrifugiert 10 rain und photometriert die ret gef~rbte klare L5sung. Zur Eiehkurve gelangt m~n mit ttilfe will, tiger L5sungen yon Brenztraubens~ure bzw. Ketog]utars~ure. Das BE~R-L~B~Tsche Gesetz wird ebenso befolgt, wie

1 Ricerea Sci. 23, 807--819 (1953). Centro di studio per la fisiopatologia, l~om.