DNA- Rekombinationstechnik...

1

DNA- Rekombinationstechnik

Gentechnik

2

Verwendung von Plasmiden in der Gentechnik

Campbell 19.1

3

Transformation

(Plasmid)

Die wichtigsten Schritte bei der DNA-Klonierung

4

Durch Klonierung kann man DNA-Fragmente in reiner Form isolieren

Vektoren

DNA-Fragmente

Konstruktion rekombinanter Moleküle

Jede Kolonie enthält zahlreiche Kopien eineseinzigen rekombinantenDNA-Moleküls

5

Das Handwerkszeug der Molekularbiologen

•Restriktionsenzyme (Restriktionsendonukleasen)•Ligasen•DNA-Vektoren (leiten sich von Plasmiden ab)•Wirtsorganismen

6

Restriktionsendonukleasen: Enzyme, die DNA schneiden

Bakterien bekämpfen eindringende Viren (Fremd-DNA)mit Restriktionsendonukleasen

Purves et al. 16.1

7

Restriktionsendonukleasen erkennen bestimmte Abfolgen von Sequenzen auf der DNA-> Restriktionsschnittstellen

Enzym EcoRI (aus Escherichia coli Stamm R)

erkennt

5‘-GAATTC-3‘3‘-CTTAAG-5‘

Diese Sequenz ist ein Palindrom:

z. B. Otto oder Anna Wörter, die von vorn und hinten gelesen gleich lauten

und schneidet versetzt5‘-G3‘-CTTAA

AATTC-3‘G-5‘

Janning & Knust 19.2b

8

5‘-G3‘-CTTAA

AATTC-3‘G-5‘

EcoRI erzeugt kohäsive (klebrige, engl. sticky) Enden

Die kurzen einzelsträngigen Enden sind komplementär

PvuI aus (Proteus vulgaris) erzeugt glatte (engl. blunt) Enden

5‘-CGATCG-3‘3‘-GCTAGC-5‘

5‘-CGA TCG-3‘3‘-GTC AGC-5‘

9Janning & Knust 19.2

Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme

10

11

Die gleichen klebrigen Enden erzeugt von verschiedenen Restriktionsendonukleasen

Die Enden sind kompatibel !

12

Auftrennung der DNA durch Gelelektrophorese

Sichtbarmachen der DNA Fragmente durchEthidiumbromid und UV-Licht

kürzere Fragmentewandern schneller alslängere

DNA negativ geladenwandert zum positiven Pol

13

Die Erkennungssequenz von EcoRI GAATTC kommt statistischin einem prokaryotischen Genomca. alle 4000 Bp vor

Ein prokaryotisches Genom von 4.000.000 bp (4 Mbp) würde inca. 1000 Fragmente zerlegt werden

14Purves et al. 16.4

Analyse von DNA Fragmenten durch den Southern-BlotDenaturierung inEinzelstränge

15

stabile Hybride erlauben die Detektionkomplementärer Sequenzen

16

Autoradigram

17

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

ForensikGenetischer Fingerabdruck

18

Zerschneiden und Verknüpfen von DNA Molekülen

Purves et al. 16.4

19

Ligasen verknüpfen DNA Moleküle(DNA Replikation)

in der Gentechnologie T4 DNA-Ligase: Cofaktor ATP

aus dem Phagen T4glatte Enden + überhängende Enden : sehr ineffektiv

glatte Enden + glatte Enden : annehmbare Ausbeuten

zwei passende überhängende Enden: sehr effektiv

20

allgemeine Eigenschaften von Vektoren

- Befähigung zur autonomen Replikation (ori)

- relativ geringe Größe (< 10 kb) mit singulären Schnittstellen (Polylinker) in nicht essentiellen Bereichen

- hohe Kopienzahl

- selektionierbarer Marker (Antibiotika Resistenz)

Multiple Klonierungssetlle (Polylinker)

21

Antibiotika

Stoffe die Mikroorganismen am Wachstum hindern (bakteriostatisch) oder abtöten (bakteriocid); z. Zt. mehr als 7000 bekannt

wichtige Klassen:

Penicilline (aus Pilzen): Hemmung der bakteriellen Zellwandsynthese (z.B. Ampicillin)

Streptomycin, Chloramphenicol, Tetracyclin (aus Bakterien) Hemmung der Proteinsynthese

Resistenzgene wirken verschiedenartig: z.B.

amp (β-Lactamase): Spaltung des Penicillin-Ringes

CAT (Chloramphenicol-Acetyl-Transferase)

tet: Hemmung der Aufnahme von Tetracyclin in Bakterien

22

Klonierung mit pBR322

23

Plasmide mit dem lacZ‘ Gen

Plasmid University of California

α

α-Kompementation

PlasmidBakterielles DNA-Molekül

α-Fragment Rest der β-Galaktosidase

aktive β-Galaktosidase

lacZ mit Deletion

(inaktiv)(inaktiv)

24

Blau-Weiß-Selektion in E. coli

Protein Synthese

DNA wird in multipleKlonierungsstellekloniert

Protein Synthese

β−Galaktosidase aktiv

β−Galaktosidase inaktiv

lacZ Gen mit Deletion

α-Fragmentkomplett

α-Fragmentdefekt

ΔM15

AS11-41 fehlenAS1-146

25

H2O

ß1->4

Künstlicher InduktorKünstliches Substrat

Indigo-Farbstoff

lacZ

26

Blau-Weiß-Selektion in E. coli

27

Klonierung eines menschlichen Gens in ein bakterielles Plasmid

Campbell19.3

28

Wie findet man ein bestimmtes Gen?

29

Herstellung einer Gen-Bibliothek

Menschliches Genom3 200 000 000 bp3 200 Mbp

Plasmide können ca. 10 000 bpFremder DNA aufnehmen

mindestens 320.000 Klone!Tatsächlich > 500.000

Purves et al. 16.7

30

Problem: Introns

•Eukaryotsiche Gene sind sehr groß und durch Introns unterbrochen

•Prokaryotische Organismen haben keine Introns, können eukaryotsiche Gene nicht exprimieren

Lösung: cDNA = komplementäre DNA

Campbell 19.5

31

Poly(A)Schwanz

Isolierung vonmRNA durch Oligo(dT) Zellulose

Reverse Transkription der poly(A)mRNAdurch Reverse Transkriptase

Janning & Knust 19.8Purves et al. 16.8

mRNA

32

Identifizierung des Klons,der das gewünschte Gen trägtmit einer Koloniefilter-Hybridisierung

Campbell 19.6

33

Sequenzierung: Kettenabbruchverfahren nach Sanger

Autoradiogramm

Janning & Knust 19.16

34

Automatische DNA-Sequenzierung

4 Reaktionen mit Fluoreszenz-Markierung

Janning & Knust 19.16, verändert

4 Spuren auf dem Gel

Fluoreszenz-Markierung

Jeder Base ist ein Farbe zugeordnet

35

Die Polymerasekettenreaktion PCR: (engl. polymerase chain reaction)Jedes beliebige Molekül kann in vitro amplifiziert werden

Purves et al. 11.120

ca. 50 °C 72°C

94°C

94°C

94°C

72°C

ca. 50 °C

ca. 50 °C

36

Jeder PCR-Zyklus hat 3 Schritte:

Denatureierung der DNA (94°C)Hybridisierung der Primer (annealing 45-65°C)Synthese der neuen DNA-Stränge durch Taq-Polymerase (72°C)

Exponentieller Vorgang

1 Molekül DNA nach Zyklus 1: 2 Molekülenach Zyklus 2: 4nach Zyklus 3: 8nach Zyklus 4: 16nach Zyklus 5: 32nach Zyklus 6: 64nach Zyklus 7: 128nach Zyklus 8: 256nach Zyklus 9: 512nach Zyklus 10: 1024

Nach Zyklus 20:524288

Taq-Polymerase aus Thermus aquaticusaus heißen Quellen des Yellowstone-National-Park USA

37

Ein Expressionsvektor ermöglicht die Expression eines fremden Gens in E. coli

Purves et al 16.13

38

Medizinisch wirksame Produkte in der Biotechnologie

Löst nach Herzinfarkten und Schlaganfällen Blutgerinnsel auf

Gewebeplasminogen-aktivator

Für Menschen mit DiabetesInsulin

Ersetzt das Hormon bei Menschen mit geringem Wuchs

Wachstumshormon

Ersetzt den fehlenden Blutgerinnungsfaktor bei Patienten mit Hämophilie A

Faktor VIII

AnwendungProdukt

39Purves et al.16.14

Synthese des TPA-Proteins(Gewebeplasminogenaktivator)in E. colizur Behandlung von Schlaganfallpatienten

40

Hey, this bug makes wine, beer and bread! Why work with anything else?

Saccharomyces cerevisiae

(Bäckerhefe)

Sprossung

Synthese von Proteinen in der Bäckerhefe

41

Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe)

Wichtigster „domestizierter“ Pilz (>6000 Jahre bekannt)Wein-, Back- oder BrauhefeSetzen in Abwesenheit von Sauerstoff Zucker zu Alkohohl (Ethanol) und CO2 um

42

Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe)

Wichtigster „domestizierter“ Pilz (>6000 Jahre bekannt)Wein-, Back- oder BrauhefeEinzelliger Eukaryot -> eukaryotische Genexpression!Kurze Generationszeit (ca. 2h) Kann sowohl als Haplont als auch als Diplont existieren

Vorteile

43

Klonierung von Hefegenen durch Komplementation von E. coli -Mutanten

44

Integrierendes Hefeplasmid

YIp

Selektierbarer Hefemarker (z.B. LEU2)

klonierte Region von Interesse

Selektierbarerbakterieller Marker(z. B. AmpR)

BakteriellerReplikationsursprung(„origin of replication“)

Yeast integrating plasmid

Kopiezahl: 1 bis wenige,nicht autonom replizierbar

45

Gezielter Einbau von DNA mit Hilfe homologer Rekombination

46

Gen-Austausch durch homologe Rekombination

47

Das 2μm-Plasmid von S. cerevisiae

in fast allen S. cerevisiae Stämmen (im Kern)(cir+-Stämme, cir0-Stämme)biologische Funktion unbekannt6318 bp = 2 μm50-100 Kopien, 2-3 % der Gesamt-DNA4 ORFs

Replikationsursprung

48

Hefeplasmid

klonierte Region von Interessez.B. Gen des Menschen

Selektierbarerbakterieller Marker(z. B. AmpR)

Selektierbarer Hefemarker (z.B. LEU2)

2μm Plasmid DNAoder Replikationsursprungdes 2μm Plasmids

ReplikationsursprungS. cerevisiae

BakteriellerReplikationsursprung(„origin of replication“)

Kopiezahl: ca. 50 („multicopy“),autonom replizierbar

Schaukel-Vektor („Shuttle-Vector“) Vektor, der in verschiedenen Wirtssystemen vermehrt werden kann

49

künstliches Hefechromosome (YAC)

YAC (Yeast artificial Chromosome )

Telomer TelomerSlektionsmarke

S.cKlonierte RegionCentromerARSSelektion

E.c

Kopiezahl: 1,autonom replizierbarKlonierung großer DNA Fragmente

Aufnahme von 50 kb bis zu 1000 kbReplikationsursprung

50

Arabidopsis thaliana = Ackerschmalwand

51

52

Protoplasten-Transformation

PEG; Ca2+ + DNA

Regeneration

53

Erzeugung transgener Pflanzen mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens

Wurzelhalsgalle

54

Prinzip des Gentransfers von Agrobakterienin Pflanzenzellen

Seyffert Abb D-9

55

Erzeugung transgener Pflanzen mit Hilfe des Ti-Plasmids

Janning & Knust 2004; 20.6

Ti-Plasmid

T-DNA (23 kb)

Ti (Tumor induzeirendes) PlasmidT (transferred) DNA

56

Druckkammer

Träger für Partikel

AuffanggitterDNA-beschichtetePartikel

Petrischale mit Pflanze

Biolistische Transformation von Pflanzen

57

Transgener Goldreis enthält einen hohen Anteil an β−Carotin

Einbringung von drei artfremden Genen:zwei Gene der Osterglocke und eins von aus dem Bakterium Erwinia uredovora.Durch diese Veränderung kommt es zur Bildung von ß-Carotin (Provitamin A) im Endosperm der Reiskörner, die deshalb (gold-)gelb / orange gefärbt sind. Wird der Reis in Verbindung mit Fetten verspeist kann das Provitamin aufgenommen werden und wird dann im Körper zu Vitamin A umgewandelt.

Warum?Mittel gegen Vitamin A-Mangel(in Entwicklungsländern Asiens häufig Ursache für Erblindung)

Goldreis

58

Viel Erfolg im weiteren Studium!!