Embryotransfer beim Pferd. Definition Embryotransfer Gewinnung von Embryonen aus einem Spendertier...

Embryotransfer beim Pferd

Definition Embryotransfer

Gewinnung von Embryonen aus einem Spendertier und

Übertragung auf eine Leihmutter, die sowohl Trächtigkeit als auch

Aufzucht „übernimmt“

Anwendung des Embryotransfer beim Pferd - heute

• weltweite Nutzung für Forschungsprojekte zur Aufklärung von Embryonalentwicklung und Trächtigkeit bei der Stute

• in der Pferdezucht: begrenzter Einsatz- relativ gute Nutzung in USA (AQH)- zurückhaltende Nutzung in Europa (D: <10 registrierte Warmblutfohlen pro Jahr aus ET)

Anwendung des Embryotransfer beim Pferd

• vermehrte Produktion von Nachkommen von Spitzenklassestuten

• gleichzeitige Verwendung von Stuten in Zucht und Sport

• Erzeugung von Nachkommen aus Stuten, die nicht mehr in der Lage sind, ein Fohlen auszutragen

• Verkürzung des Generationsintervalls (=Einsatz nicht ausgewachsener Spenderstuten)

• Embryonenbanken von „bedrohten“ Pferderassen

Voraussetzungen für den Embryotransfer beim Pferd

• Registrierung von ET-Fohlen durch Zuchtverband?• Vorselektion von Spenderstuten mit

überdurchschnittlichem Zuchtwert• Verfügbarkeit einer ausreichenden Zahl von

Empfängerstuten

Voraussetzungen für den Embryotransfer beim Pferd II

• Zyklussynchronisation von Spender- und Empfängerstuten

• Verfügbarkeit hochklassiger Hengste mit sehr guter Fruchtbarkeit

• Abklärung der finanziellen Gegebenheiten

Selektion der Spenderstuten

• nur Stuten überdurchschnittlicher Qualität rechtfertigen die hohen Zusatzkosten

• bei Stuten mit Fruchtbarkeitsproblemen liegen die Embryonengewinnungsraten 50 bis 70% unter denen fertiler Spenderstuten

• Spenderstuten können gleichzeitig im Sport eingesetzt werden, allerdings müssen gynäkologische Kontrollen und Besamung während der Rosse uneingeschränkt möglich sein

• Alter 3 bis 10 Jahre (wiederholt im Zuchteinsatz)• Stuten mit nachgewiesener Fruchtbarkeit, guter

Milchleistung und überdurchschnittlichen „Mutterstuteneigenschaften“

• um negative Einflüsse auf die Fohlenentwicklung zu vermeiden, sollte die Empfängerstute mindestens die Größe der Spenderstute haben

• für gute Ergebnisse sollten 2 bis 3 Empfängerstuten pro Spenderstute bereitgestellt werden

• gelegentlich Verwendung ovariektomierter (=kastrierter) Stuten

Selektion der Empfängerstuten

Einfluß der Empfängerstute auf die Fetalentwicklung

(Allen et al. 2002)

• Transfer von Ponyembryonen auf a) Ponystuten: Geburtsgewicht: 24 kgb) Vollblutstuten: Geburtsgewicht: 37 kg

• Transfer von Vollblutembryonen aufa) Ponystuten: Geburtsgewicht: 32 kgb) Vollblutstuten: Geburtsgewicht: 55 kg

Einfluß der Empfängerstute auf die Fetalentwicklung - Schlußfolgerung

Werden Embryonen auf Empfängerstuten übertragen, die kleiner sind als die leibliche Mutter, kommen evtl. unterentwickelte Fohlen zur Welt

Einfluß auf die spätere Entwicklung?

Selektion des Hengstes

• Hengste von überdurchschnittlicher Qualität • Hengste mit nachgewiesen guter Fruchtbarkeit• unbegrenzte Verfügbarkeit des Samens

- Frischsamen/Natursprung: höchste Fruchtbarkeit

- gekühlter Samen: evtl. Transportprobleme

- Tiefgefriersamen: optimale Verfügbarkeit, aber verringerte Fruchtbarkeit

Vorbereitung von Spender und Empfänger

• Intensive Zuchttauglichkeitsuntersuchung (Uterustupfer, Endometriumsbiopsie)

• während der Rosse tägliche Ovulations- und Uteruskontrolle

• zusätzliche Kontrolle nach der Ovulation, um Gelbkörperentwicklung und Uterus zu beobachten

Management von Spender und Empfänger

• Rossesynchronisation:- Selektion einer synchronen Empfängerstute aus

einer großen Herde- Rosseinduktion mit Prostaglandinen

- mit Gestagenen und PGF- mit Gestagenen, Östrogenen und PGF

• Superovulation der Spenderstute - derzeit keine erfolgreiche Methode beim Pferd

• Ovulationssynchronisation: - Selektion einer synchronen Empfängerstute- Ovulationsinduktion während der Rosse

• beste Gewinnungsraten an Tag 7/8 post Ov.• Embryonengewinnung durch Uterusspülungen

via Zervix• ein Spülkatheter wird durch Zervix eingeführt

und mittels „Luftballon“ fixiert• Uterusspülungen mit PBS (phosphatgepufferte

Salzlösung, 1000 bis 1500ml, 37 °C, 3 bis 4 Spülungen)

• Flüssigkeitsgewinnung und anschließend Filtration (Porengröße des Filters 70- 75 µm)

Embryonengewinnung

Einfluß des Tages der Embryonengewinnung auf die Gewinnungsraten

(Squires 1993)

Tag nach Ovulation

Zahl der Spülungen

Zahl der Embryonen

Gewinnungsrate (%)

6 137 86 62

7 96 73 76

8 293 218 74

9 53 43 81

Embryonengröße an unterschiedlichen Tagen nach Ovulation

(Squires 1993)

Tag nach Ovulation Durchmesser

(mm)

Schwankungsbreite

(mm)

6 0,201 0,132-0,380

7 0,488 0,136-1,284

8 1,368 0,369-3,980

Embryonengewinnungsraten

• nach KB mit Frischsamen: 70-85%

• nach KB mit gekühltem Samen: 50-60%

• nach KB mit Tiefgefriersamen: 30-65%

sehr starke Abhängigkeit vom Hengst!

Embryonenübertragung

• innerhalb von 30 bis 60 min nach Gewinnung• sterile Lagerung bei 25 bis 30 °C• Übertragung auf Empfängerstute, die 1 bis 2

Tage nach der Spenderstute ovuliert hat• Transfer

- transzervikal (unblutig)- chirurgisch nach Flankenschnitt

(am stehenden Tier in Lokalanästhesie)

Trächtigkeitsraten nach Transfer*

• transzervikaler Transfer: 30-50%

• chirurgischer Transfer (fertiler Spender): 60-80%

• chirurgischer Transfer (subfertiler Spender): 30-60%

*Transfer innerhalb von 60min nach Embryonengewinnung

Trächtigkeitsraten nach Transfer

• Die Trächtigkeitsraten nach einem chirurgischen Transfer sind die höchsten

• Beim chirurgischen Transfer können die Empfängerstuten nicht beliebig oft verwendet werden, da es zu Verklebungen im Bereich der Operationswunden kommt

• Ein chirurgischer Transfer ist aus ethischen Gründen nur bedingt zu vertreten

Trächtigkeitsraten nach Transfer

• Beste Trächtigkeitsraten nach transferzervikalem = unblutigem Transfer werden erreicht, wenn synchrone, absolut geschlechtsgesunden Empfängerstuten zur Verfügung stehen

• In USA: Empfängerherden von >300 Stuten• In Europa ist die Verfügbarkeit an

Empfängerstuten meist sehr begrenzt, was zu schlechteren Transferergebnissen führt

Tiefgefrierkonservierung equiner Embryonen

• Trächtigkeitsraten sind derzeit zu niedrig für einen routinemäßigen Einsatz (<10%)

• Transfer früher Blastocysten führt zu etwas besseren Trächtigkeitsraten, jedoch sind Gewinnungsraten zu gering

• bei höherentwickelten Embryonalstadien scheint die equine Kapsel (azelluläre Schutzschicht) die Passage des Gefrierschutzmittels Glycerin in den Embryo zu behindern

ET-assoziierte Biotechnologien beim Pferd

• Embryonensplitting• IVF (In-vitro-Fertilization)• ICSI (IntraCytoplasmatic Sperm Injection)• GIFT (Gamete Intra Fallopian Transfer)• Klonen

derzeit nicht im routinemäßigen Einsatz

Embryonensplitting

• Produktion des kleinsten Klons

• erfolgreich in Forschungsprojekten verwendet

• relativ einfache Technik, jedoch sind die Trächtigkeitsraten nach Transfer gesplitteter Embryonen deutlich reduziert

In vitro Produktion von Pferdeembryonen

• Berichte von 2 lebenden Fohlen aus IVF waren vor ca. 10 Jahren ermutigend

• Technik beim Pferd bisher nicht wiederholbar• Maturation der Eizellen, Kultur der

Embryonen sowie Kapazitation der Spermien beim Pferd bisher in vitro kaum erfolgreich möglich

Intracytoplasmatic Sperm Injection (ICSI)

• Notwendigkeit der Eizellgewinnung durch Ovum Pickup am lebenden Tier ( 30%)

• vor der Eizellgewinnung Vorbehandlung der Stuten zwecks in vivo Maturation der Oozyten

• Spermien müssen nicht kapazitieren• sehr frühe Embryonalstadien werden blutig in

den Eileiter transferiert• aufwendige Ausrüstung erforderlich • erste Resultate vielversprechend

(>10 lebende Fohlen bisher)

Gamete intrafallopian transfer (GIFT)

• Spermien und Eizelle werden in den Eileiter der Empfängerstute übertragen

• Spermien müssen nicht in vitro kapazitieren• endoskopische Ausrüstung erforderlich• erfolgreiche Fohlengeburten nach GIFT

wurden bereits publiziert

Klonen

• Zellkern wird aus einer Körperzelle oder embryonaler Zelle entnommen und in eine reife Eizelle, deren eigener Kern entfernt worden ist, eingesetzt

• Geburten von einem Pferd und mehreren Maultieren in 2003 publiziert

• ca. 350 Versuche für 1 lebendes Fohlen• Wert für die Pferdezucht ist fraglich, da Genotyp

den Phänotyp nur zu ca. 30% bestimmt• Zuchtfortschritt durch Klonen nicht gegeben

Zusatzkosten von Fohlen, die durch ET entstanden sind im Vergleich zu KB

• Anschaffungs- und Einstellungskosten für Empfängerstuten

• Untersuchung und Synchronisation der Empfänger• Embryonenspülungen und -transfer• Einstellungskosten der Empfänger bis zum Absetzen

des Fohlens Zusatzkosten von ca. € 5000.- pro ET-Fohlen signifikant höhere Kosten für assoziierte Techniken