Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit Hauptseminar im WS 2003/2004 Martina...

Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit

Hauptseminar im WS 2003/2004

Martina Leins

Gliederung

• Allgemeines• Motivation für die genaue Erforschung

des Bewegungsablaufes• Aufgaben der Kinesin- und Myosin V-

Moleküle• Kinesin• Myosin V• Vergleich und Zusammenfassung

Allgemeines

• Wandeln chemische in mechanische Energie um

• Viel filigraner als herkömmliche Schrittmotoren

• Messen nur wenige Nanometer• Kann das Tausendfache seines

Gewichtes transportieren

Motivation

• Anwendungen im Nanobereich• Goldman: "What concerned me was

how this little myosin motor can move along the track without letting go and floating off into the cytoplasm of the cell"

Aufgaben in der Zelle

Kinesin:Transport vonMakromolkülen undkleiner Oranellen inder Zelle

Myosin V:Transportiert verschie-dene Substanzeninnerhalb von Nerven-zellen

Struktur von Kinesin

• Kopf: Motor• Stiel: Doppelwendel• Schwanz: kann Last

binden

Kinesin

Bewegt sich entlangeiner Mikrotubuli

Bewegungsmechanismus bei Kinesin

• Aufnahme von ATP• ATP-Hydralisation• Pi-Abgabe• ADP-Abgabe• Erneute ATP-

Aufnahme

Struktur von Myosin V

• Kopf: Motorbereich• Genick: Lichtkette• Schwanz: kann Last binden

Myosin V

Bewegt sichentlang einesActinfilaments

Schrittweite des Myosin V

• Genaue Bestimmung der Schrittweite:• Früher: Bestimmungen mit festem

Actinfilament• Jetzt: Rotationsfreiheit des

Actinfilaments

Versuchsaufbau

• Actinfilament auf zwei Kügelchen

• Aufsetzen der Doppelkugel mit dem Myosin V-Molekül mit optischer Pinzette

• Ausschalten der Laserfalle

Mögliche Bewegungsformen

• Schrittweite ca. 36nm: Rechts- oder linkshändige Spirale um Actinfilament mit großer Ganghöhe

• Kleine Schrittweite: starke rechtshändige Rotation (wie RNA um DNA)

• Entlanggleiten an den Strängen

Bewegung bei maximaler Geschwindigkeit

• Linkshändige Spirale• 2 Umdrehungen über 4.4m• ATP- konzentrationsunabhängig• Nicht alle Moleküle zeigten Rotation: Gründe:

• Zurück gelegter Weg zu kurz ( < 2m)• Zu kurzes Actinfilament• Rotation durch 'Schutt' verhindert

Diagramm

Schrittweite

• Linkshändige Rotation: Schrittweite etwas kleiner als 36nm

• Rechtshändige Rotation: Schrittweite kleiner als 18nm

Schrittweite zwischen 18nm und 36 nm

Berechnung der Schrittweite

• Mittlere Schrittweite: 34,8nm 36nm*(2.200nm-72nm)/(2.200nm) =

34,8nm

• Mittlerer Drehwinkel pro Schritt: 6°

Schrittweite ist konstant

• Unabhängig von ATP-Konzentration• Last unabhängig Realisation: 104 Myosin V Moleküle an einem Doppelkügelchen

Zwei mögliche Bewegungsformen

Hand-over-hand: Beide Köpfe sindabwechselnd führend

Inchworm:Ein Kopf ist immervorn der andereimmer hinten

Hand-over-hand – Inchworm

Voraussagen der beiden Modelle

Hand-over-hand:Abwechselnd Schritte der Weite (37 2x)nm

Inchworm:Immer gleich großeSchritte der Schritt-weite 37nm

Auflösungsvermögen

• Lokalisation: 6nm bei einer Zeitauflösung von 20s

(scanning confocal microscopy)• Ortsauflösung: 2nm bei Objekten der Größe 30 –

150nm bei einer Zeitauflösung von 30ms

Einzel-Molekül-Fluoreszenz

• Lokalisation von 1.5nm in 2d• Zeitauflösung von 0.5s• Photostabilität von bis zu einigen

Minuten

Fluorescence imaging with one- nanometer accuracy: FIONA

FIONA

• Lokalisation: Gaußfit in 2d

• Photostabilität: Sauerstoffreinigungssystem

Test: FIONA

• Probe an ruhender DNA• Bewegung des Spots in definierten

Schritten und definierter Verweilzeit

• Ergebnis: Genauigkeit der Ortsbestimmung: 1.3nm

FIONA mit Mysion V

Mysion V mit Rohdamin versehen:• 50 000 bis 100 000 Photonen pro Spot• Lokalisation: 3nm, helle Spots sogar

1.5nm• 49 verschiedene Moleküle • 552 ganze Schritte

Beobachtete Schrittweiten

• gleichgroße Schritte mit einer Schrittweite von 74nm

• Alternierend zwei verschieden große Schrittweiten:

52nm und 23nm 42nm und 33nm

52-23nm und 42-33nm Schritte

74nm Schritte

1084398S1.mov

74-0nm Schritte

• Zwischen zwei 74nm-Schritten ein 0nm-Schritt versteckt

• Kinetische Überlegungen: bei gleicher ATP-Konzentration halb so große

Schrittrate wie bei 52-23- oder 42-33-Schritten: Experiment: Schrittrate (52-23/42-33): 0.35 s-1

Schrittrate (74-0): 0.17s-1

Ergebnis

• Myosin V bewegt sich nach dem Hand-over-hand Modell

• Mittlere Schrittweite: (74 + 0, 52 + 23, 42 + 33)/2 nm = 37nm

Vergleich und Zusammenfassung

Myosin V:• Actinfilament• Hand-over-hand• Schrittweite von

34.8nm

Kinesin:• Microtubuli• 8nm Schrittweite