Physiologische und pathologische Rolle der kleinen GTP-bindenden Proteine Zeitschalter der Zellen...

Physiologische und pathologische Rolle der kleinen GTP-bindenden Proteine

Zeitschalter der Zellen

Ligeti Erzsébet

Interzelluläre Verbindungen

lösliches Ligand Zelloberflächenligand

Interzelluläre Verbindungen

lösliches Ligand Zelloberflächenligand

Signalübertragunsprozesse in der Zelle

Bedenken:

Zellspezifizität

Affinität

Raum

Organisation der Signalübertragungsprozesse

im Raum

Bedenken:

Zellspezifizität Affinität Raum

Zeit

G Proteine:

GTP-Bindung

stabile, „steife” Konformation

Vetter and Wittinghofer Science 2001, 294. 1299.

Die terminale Phosphatgruppe des GTP stabilisiert das Protein

Überlappende Kristallstruktur von 4 kleinen G-Proteinen

G Proteine:

GTP-Bindung stabile, „steife” Konformation

GTP Hydrolysebewegliche Konformation

G Proteine: Zeitschalter

GTP-Bindung stabile, „steife” Konformation

GTP Hydrolysebewegliche Konformation

Zeitfaktor: Geschwindigkeit der GTP-Hydrolyse

GTP bindende Proteine

heterotrimer

(“gross”)

monomer

(“klein”)

GDP

GTP

smgGDP

smgGTP

smgGTP

smgGDP

GTP

GDP

GTPase Zyklus der G-Proteine

Ligand Bindung an GPCR

GAP (biol.Signal ) smgGTP smgGDP

GEF (biol.Signal )

Regulation der monomer G-Proteine

GAP = GTPase activating protein

GEF = Guanine nucleotide exchange factor

(aktiv) (inaktiv)

Subfamilien der monomeren GTPasen

RAS RHO RAB ARF RAN

H-Ras Rho-A Rab1- ARF1- RanK-Ras Rho-B Rab32 ARF7N-Ras Rho-C

Rap1 Rac1Rap2 Rac2

Ral Cdc42

Subfamilien der monomeren GTPasen

RAS RHO RAB ARF RAN

H-Ras Rho-A Rab1- ARF1- RanK-Ras Rho-B Rab32 ARF7N-Ras Rho-C

Rap1 Rac1Rap2 Rac2

Ral Cdc42

Proliferation

Transformation

Aktivierung des EGF-Rezeptors

Aktivierung des EGF-Rezeptors

László Buday (Chemie-Institut)

Wirkung des aktivierten Ras Proteins-1.

(Raf-Kinase)

Subfamilien der monomeren GTPasen

RAS RHO RAB ARF RAN

H-Ras Rho-A Rab1- ARF1- RanK-Ras Rho-B Rab32 ARF7N-Ras Rho-C

Rap1 Rac1Rap2 Rac2

Ral Cdc42

Proliferation

Transformation

Bewegung

Formänderung

Transformation

Hall, 1998, Science, 279, 509-514.

Wirkung der Overexpression der G-Proteine der Rho-Familie

Rac

p67p67

p47

gp91

Rac

p67p67

p47

gp91

Untereinheiten der NADPH oxidase der Phagozyten (Phox)

e-

NADPH

O2

[Rho-kinase]

[Ca2+] = 10-8 M

[Ca2+] = 10-6 M

Summierung der Wirkung von MLCK und Rho-kinase

Subfamilien der monomeren GTPasen

RAS RHO RAB ARF RAN

H-Ras Rho-A Rab1- ARF1- RanK-Ras Rho-B Rab32 ARF7N-Ras Rho-C

Rap1 Rac1Rap2 Rac2

Ral Cdc42

Proliferation

Transformation

Bewegung

Formänderung

Transformation

Membranrezirkulation

Schematische Darstellung der intrazellulären vesikulären Bewegungen

(vesicular traffic)

Prinzip der vesikularen Trennung (budding) und Fusion

Rolle des COPI Komplexes im vesikulären Transport von Golgi zum ER

Subfamilien der monomeren GTPasen

RAS RHO RAB ARF RAN

H-Ras Rho-A Rab1- ARF1- RanK-Ras Rho-B Rab32 ARF7N-Ras Rho-C

Rap1 Rac1Rap2 Rac2

Ral Cdc42

Proliferation

Transformation

Bewegung

Formänderung

Transformation

Membranrezirkulation

Nuklearer Transport

Chromosomen bewegungen

Clarke and Zhang, 2001, TiCB, 11, 366-371.

Rolle von Ran in verschiedenen Phasen des Zellzyklus

Subfamilien der kleinen GTPasen

RAS RHO RAB ARF RAN

H-Ras Rho-A Rab1- ARF1- RanK-Ras Rho-B Rab32 ARF7N-Ras Rho-C

Rap1 Rac1Rap2 Rac2

Ral Cdc42

GAP 25 70 52 27 1

GEF 50-60

Ras und Tumore

Point mutations are frequently detected in the ras family of protooncogenes (K-ras, H-ras, and N-ras).

It has been estimated that as many as 15% to 20% of unselected human tumors may contain a ras mutation.

Studies have found K-ras mutations in about 30% of lung adenocarcinomas, 50% of colon carcinomas, and 90% of carcinomas of the pancreas.

N-ras mutations are preferentially found in hematologic malignancies, with up to a 25% incidence in acute myeloid leukemias and myelodysplastic syndromes.

The majority of thyroid carcinomas have been found to have ras mutations distributed among K-ras, H-ras, and N-ras, without preference for a single ras family member but showing an association with the follicular type of differentiated thyroid carcinomas

0

20

40

60

80

100

0 5 10 15

min

[32

P]G

TP

bo

un

d

Bedeutung der Rate der GTP-Hydrolyse

Rac

V12Rac

Bedeutung der Rate der GTP-Hydrolyse

0

20

40

60

80

100

0 5 10 15

min

[32

P]G

TP

bo

un

d

Rac

V12Rac

+ GAP

+ GAP

Bedeutung der Rate der GTP-Hydrolyse

0

20

40

60

80

100

0 5 10 15

min

[32

P]G

TP

bo

un

d

Rac

V12Rac

+ GAP

+ GAP

Subfamilien der kleinen GTPasen

RAS RHO RAB ARF RAN

H-Ras Rho-A Rab1- ARF1- RanK-Ras Rho-B Rab32 ARF7N-Ras Rho-C

Rap1 Rac1Rap2 Rac2

Ral Cdc42

GAP 25 70 52 27 1

Rac

p67p67

p47

gp91

Rac

p67p67

p47

gp91

Untereinheiten der NADPH oxidase der Phagozyten (Phox)

e-

NADPH

O2

0

100

200

300

400

0,1 1 10 100

Nucleotide concentration (µM)

O2.-

prod

ucti

on (

nmol

x m

in-1x

mg-1

)

GTP

GTP + F

GTP[S]

Hemmung des GAPs erhöht die Phox-Aktivität

Bcr

p190 RhoGAP

p50 RhoGAP

mem

bran

e

cyto

sol

rat b

rain

extra

ct

Rac-GAP in neutrophilen Granulozyten

Geiszt et al.

BJ 2001

Folgen der Abwesenheit von Bcr GAP

Gewichtänderung nach LPS Behandlung

Darmnekrose

Voncken et al. Cell, 1995

Regulation des regulierenden Proteins?

Domainstruktur der Rho/Rac GAP

GTPase 4 x FF GAP

p190RhoGAP

PKCSrc

Abwesenheit (KO egér):

Störung der Entwicklung des ZNS

Störung der Differentiation der Fettzellen

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

100,0

1 10 100 1000

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

1 10 100

Relative amount of p190Rho-GAP

Bou

nd 32

P-G

TP

(%

)

Bou

nd 32

P-G

TP

(%

)

PS ändert die Substratspezifizität von p190RhoGAP

RhoGAP RacGAP

Rho Rac

+ PS

Ligeti et al. JBC 2004.

geschlossen

Interaktion mit prenyliertem Rac

geöffnet

Modell der Interaktion pRac-p50GAP

Moskwa et al. JBC 2005

189CAAXRAC 189CRAC

Prenyl-transferase

Posttranslationelle Modifizierung von G-Proteinen

Ins-R

GAP

monomere G-Proteine

ZEIT Faktor der Signalübertragung

Zusammenfassung

p50RhoGAP

Sok sejt kifejezi

Granulocitákban nagy mennyiségben

1 439

Sec14 GAPPP

0

0.10.2

0.3

0.40.5

0.6

0.7

0.80.9

1

0 min 5 min 10 min 15 min

Bou

nd 3

2P-G

TP (%

)

npRac

GAP-FL

GAP49

GAP198

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

0 min 5 min 10 min 15 minB

ou

nd

32P

-GT

P (

%)

p50RhoGAP érzékeny a preniláltsági állapotra

nem-prenilált Rac prenilált Rac

Moskwa et al. JBC, 2005

Rac

p67p47

gp91

GAP1

GAP2

Hipotézis: Különböző reakciókban különböző GAPok szabályozzák ugyanazt a G-fehérjét

Rac

Moskwa et al. Biochemistry 2002.

Bigay et al. Nature 2003. 426. 563

Az ARF1-GAP szabályozásának modellje

A p50RhoGAP fúziós fehérjeként kifejezett fragmensei

1 439

49

87

121

169

198

211

Sec14 GAPPP

GAP Rac·GTP Rac·GDP

GEF

RhoGDI·Rac·GDP

A Rac GTPáz szabályozása

GAP = GTPase activating protein

GEF = Guanine nucleotide exchange factor

GDI = Guanine nucleotide dissociation inhibitor

smgGTP

smgGDP

GTP

GDP

GAP

A G fehérjék GTPáz ciklusa

Target,RGS GEF

Ligand kötés GPCR-n

Molecular Cell Biology    20. Cell-to-Cell Signaling: Hormones and Receptors    20.4. Receptor Tyrosine Kinases and Ras

Aktivierung des EGF-Rezeptors-1.

Molecular Cell Biology    20. Cell-to-Cell Signaling: Hormones and Receptors    20.4. Receptor Tyrosine Kinases and Ras

Aktivierung des EGF-Rezeptors – 2.

Subfamilien der monomeren GTPasen

RAS RHO RAB ARF RAN

H-Ras Rho-A Rab1- ARF1- RanK-Ras Rho-B Rab32 ARF7N-Ras Rho-C

Rap1 Rac1Rap2 Rac2

Ral Cdc42

proliferáció

transzformáció

mozgás

alakváltozás

transzformáció

membrán

körforgás

magmembrán

kromoszóma mozgás