Praktikum: Nachweis einer gentechnischen Veränderung in Lebensmitteln durch PCR

Praktikum:Nachweis einer gentechnischen

Veränderung in Lebensmitteln durch PCR

Vorbereitung Lehrer

Für jede Arbeitsgruppe werden 550 µl InstaGene-Matrix aliquotiert!

Das Tube wird mit „IG“beschriftet!

Vorbereitung Lehrer

I. DNA-Extraktion

1. Vorbereitung1.1 Beschriften Sie 2

Schraub- tubes mit: - non GMO (-GMO) - Lebensmittelprobe (T)

und Ihrer Gruppennummer!

I. DNA-Extraktion

1.2 Pipettieren Sie jeweils 250 μl der durch Auf- und Abpipettieren homogenisierten InstaGene-Matrix aus Ihrem Vorratstube („IG“ mit 550 µl Gesamtvolumen) in die beiden beschrifteten Tubes!

Überstand

Beide Tubes sollten etwa die gleiche Menge InstaGene-Perlen enthalten!

I. DNA-Extraktion

2.1 Wiegen Sie 1 g des nicht gen-technisch veränderten Lebens-mittels (-GMO) ab und geben Sie es in einen Mörser!

2.2 Pipettieren Sie 5 ml H2Odest. hinzu!

2. DNA-Extraktion aus „nicht GV- Lebensmitteln (-GMO)“

I. DNA-Extraktion

2.3 Homogenisieren Sie dasGemisch etwa 5 Minuten!

2.4 Pipettieren Sie weitere 5 ml H2Odest. hinzu undzermörsern Sie weiter, bis ein pipettierbarer Brei entstanden ist!

I. DNA-Extraktion

2.5 Pipettieren Sie 25 μl des Lebens-mittelbreis in das mit „-GMO“beschriftete Schraubtube (Inhalt des Schraubtubes 250 µl InstaGene)!

2.6 Verschließen Sie das Tube und durchmischen Sie durch Anschnippen!

Um Kontamination mit +GMO-DNA zu vermeiden, wurde zuerst das -GMO-Material extrahiert!

Die Reinigung von Mörser und Pistill erfolgt mit einem Detergenz z.B. „Pril“. Danach wird mit H2Odest. nachgespült.

3. DNA-Extraktion aus zu testendem Lebensmittel (T)

3.1 Wiegen Sie 1 g des zu testenden Lebensmittels (T) ab und geben Sie es in

einen Mörser!

3.2 Pipettieren Sie 5 ml H2Odest. hinzu!

I. DNA-Extraktion

3.3 Homogenisieren Sie das Gemisch etwa 5 Minuten!

3.4 Pipettieren Sie weitere 5 ml H2Odest. hinzu und zermörsern Sie weiter, bis ein pipettierbarer Brei entstanden ist!

I. DNA-Extraktion

3.5 Pipettieren Sie 25 μl des Lebensmittelbreis in das mit ("T") beschriftete Schraubtube (dieses enthält bereits 250 µl InstaGene)!

3.6 Verschließen Sie das Tube und durch-mischen Sie durch Anschnippen!

I. DNA-Extraktion

Reinigen Sie den Mörser und Pistill mit einem Detergenz!

Reinigung

4. Enzymdenaturierung bei 95°C4.1 Inkubieren Sie die beiden

Schraubtubes 5 Minuten bei 95°C im Wasserbad!

4.2 Zentrifugieren Sie die Tubes 5 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro Minute!

I. DNA-Extraktion

95oC

Beachten Sie: Bei der Entnahme der Kontroll-DNA (-GMO) und der DNA der Lebensmittelproben (T) aus den Schraubtubes darf nur der Überstand ohne InstaGene- Perlen entnommen werden!

Bedeutung der InstaGene-Matrix

InstaGene-Matrix ist negativ geladen bindet vorhandene Kationen Kationen dienen als Cofaktoren von Enzymen, wie z. B. der DNasen

DNasen werden nicht aktiviert DNA-Abbau wird verhindert

Aber: InstaGene-Matrix bindet Mg2+-Ionen und hemmt damit die Polymerase bei der PCR

Aufbewahrung der Proben

Die Tubes können im Kühlschrank (bei 8oC mit der Matrix) über Tage aufbewahrt werden!

Entnahme des Überstandes

4.3 Überführen Sie jeweils 50 µl des Überstandes aus Ihren Tubes in zwei neue, zuvor entsprechend beschriftete Tubes (–GMO, T)!

I. DNA-Extraktion

Ansetzen des PCR-Master-Mix

Gebrauchsfertiges Gemisch aus PCR-Master-Mix mit Primern darf bis zum Start der PCR nicht länger als 30 Min. auf Eis stehen!

Innerhalb dieser 30 Min. müssen alle Proben für die PCR angesetzt sein!

Eis richten!

Zu beachten ist:

Achtung!!!

Nach dem Auftauen:• der Taq-Polymerase• und des Master Mix

die Tubes vor dem Öffnen zentrifugieren!

Ansetzen des Molekulargewichts-Standards durch den Lehrer

• Pipettieren Sie 30 µl Orange-D-Loading-Dye zum Molekulargewichts-Standard!

• Tube auf Eis stellen!

Aliquotieren des PCR-Master-Mixdurch den Lehrer

• Jeweils 300 µl PCR-Master-Mix werden zu den Plant Primern (6 µl)

und

GMO Primern (6 µl) pipettiert!

• Tubes auf Eis stellen!

Vorbereitung: PCR und Elektrophorese in Gruppenarbeit (20`)

Jede Arbeitsgruppe bereitet für alle weiteren Gruppen entsprechend Ihrem Arbeitsauftrag einen Teil der PCR oder

der Elektrophorese vor.

Arbeits-

aufträge

Tubes pro Arbeitsgruppe nach der Gruppenarbeit

+GVO -GVL T GMM PMM LD MWR

6 PCR-Tubes

Ansetzen und Durchführung der PCR (200`)

1. Nummerierung der PCR-Tubes

1.1 Nummerieren Sie Ihre PCR-Tubes 1 - 6!

Nr. Master Mix DNA

1

2

10 µl PMM

10 µl GMM

10 µl –GVL (Kontrolle)

10 µl –GVL (Kontrolle)

3

4

10 µl PMM

10 µl GMM

10 µl Lebensmittelprobe (T)

10 µl Lebensmittelprobe (T)

5

6

10 µl PMM

10 µl GMM

10 µl +GVL (Kontrolle)

10 µl +GVL (Kontrolle)

1.2 Pipettieren Sie die PCR-Ansätze nach folgender Tabelle!

MM: Mastermix; GVL: gentechnisch verändertes Lebensmittel

1.3 Durchmischen Sie ihre PCR-Ansätze durch Auf- und Abpipettieren!Zentrifugieren Sie Ihre PCR-Ansätzefalls notwendig 1 Minute bei 1000

Umdrehungen!

1.4 Kühlen Sie Ihre PCR-Ansätze im Eis bis zum Beginn der PCR!

III. Ansetzen und Durchführung der PCR

- Um Verwechslungen zu vermeiden tragen Sie die Position Ihrer Proben im Thermocycler auf dem Übersichtsblatt ein!

III. Ansetzen und Durchführung der PCR

- Tubes müssen gut verschlossen sein!

Über-sichts-blatt

2. Durchführung der PCR

Führen Sie die PCR entsprechend dem Temperaturprogramm am Thermocycler durch!

III. Ansetzen und Durchführung der PCR

Cycler-Programm

DNA-Amplifikation

Cycler-Programmierung

40 Zyklen

10`, 72 °CCompleting

120``, 94°C Denaturation

60``, 94 °C Denaturation

60``, 59 °CAnnealing

120``, 72 °CElongation

Durchführen der PCR

Cycler-Programmierung:Denaturieren 94 oC 2 Min.

40 Zyklen:Denaturieren 94 oC 1 Min. Primeranlagerung 59 oC 1 Min.DNA-Neusynthese72 oC 2 Min.

Vervollständigung der neuen Stränge:72 oC 10 Min.

Dauer: ca. 3 Stunden

Nach der Amplifizierung können die Proben bei – 20oC im Eisfach

oder über Nacht bei 4oC im Cycler bis zur Gelelektrophorese aufbewahrt werden.

Ende der PCR

1. Führen Sie den Nachweis der PCR-Produkte entsprechend Ihres Arbeitsauftrages als Agarose- oder Polyacrylamid-Gelelektrophorese durch!

2. Färben Sie Ihre Gele entsprechend Ihres Arbeits-auftrages und werten Sie diese aus!Arbeitsgruppe 1 - 4 Arbeitsgruppe 5 - 8

IV.Nachweis der PCR–Produkte durch Elektrophorese (Agarose/PAGE)

Agarose-

Gelelektro-

phorese

PAGEBefüllen

des Gels