PROTEOMICS (2) Vortrag im Rahmen des Genomics/Datenbanken Seminars Von: Tabea Mundinger Betreuer:...

PROTEOMICS (2)Vortrag im Rahmen des Genomics/Datenbanken Seminars

Von: Tabea Mundinger

Betreuer: Benedikt Brors

Gliederung

Einleitung Pankreatitis, Pankreaskarzinom Durchführung Analysemethoden

2D PAGE Massenspektrometrie und Identifikation Western Blot Immunohistochemie

Ergebnisse Diskussion

Einleitung

2003 Sequenzierung des menschlichen Genoms Differentielle Genexpression kann in

verschiedenen Geweben verglichen werden (microarrays etc.)

Liefert nicht immer eindeutige Ergebnisse Warum?

Krankheiten beruhen oft auf Proteindefekten, nicht Genexpressionsdefekte

Proteomics als wichtige Methode in z.B. Krebsforschung

Einleitung

Anwendung Proteomics in Krebsforschung:

Shen et. al., Cancer Research Dez. 2004: Vergleich der Proteinexpressionsprofile von

normalem Gewebe, Gewebe befallen von Pankreatitis und Pankreaskarzinomgewebe 2D Polyacrylamide Gel Electrophoresis (2D PAGE) Matrix-Assisted laser desorption/ionization time of

flight (MALDI-TOF)

Pankreas

Wichtigste Verdauungsdrüse im Körper Exokriner Teil:

Verdauungssäfte Bicarbonat Carbohydrasen, Esterasen, Proteasen, Nukleasen

Endokriner Teil: Hormone

Insulin, Glucagon, Somatostatin, Pancreatic Polypetide (PP)

Werden in den Langerhansschen Zellen hergestellt Kontrolieren hauptsächlich Glycogenolyse,

Glycogenese, Glucoseoxidation

Pankreatitis

Entzündnug der Bauchspeicheldrüse Selten, aber gefährlich

15% der Fälle enden tödlich Auslöser (unter Anderem):

Stoffwechselstörungen, Alkoholismus, Gallensteine, Durchblutungsstörungen, Infektionen (Mumps, Coxsackie-Virus)

Gefährlich weil freiwerdende Verdauungssäfte umliegende Gewebe beschädigen

Pankreasadenokarzinom

Entsteht meistens aus exokrinem Teil Selten (1-2% aller Krebsarten)

ABER: viert-häufigste Krebstodesursache Späte Erkennung: Anfangs nur leichte

Symptome Schwere Symptome (Oberbauchschmerzen,

Gelbsucht) später mehr als ½ der Fälle schon Metastasierung

Analysemethoden (1):2D PAGE

Kombination aus Isoelektrischer Fokusierung (IEF) SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)

1. Dimension: IEF: Gelstreifen mit immobilisiertem pH Seperation nach Isoelektrischem Punkt

2. Dimension: SDS-Page Seperation nach Molekulargewicht

Analysemethoden (2):MALDI-TOF Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation

Time of Flight Co-Kristallisation von Protein und Matrix Energetische Anregung durch Laserimpuls Explosionsartige Teilchenablösung (Matrix

verhindert Fragmentierung der Proteine) Detektor: ToF

Misst Flugzeit der Proteine

Massenbestimmung

Analysemethoden (3):Western Blot Elektrophorese Blotting

Übertragung auf Nitrozellulose mittels Puffer Hybridisierung

Markierung mit Antikörpern (radioaktives oder enzymatisches Label)

Nachweis: Farbreaktion, Chemilumineszenz oder

Autoradiographie

Analysemethoden (4):Immunohistochemie Primärantikörperfärbung

Gegen ein spezifisches (schon bekanntes) Protein Sekundärantikörperfärbung

Gegen konstanten Teil des Primärantikörpers Label: enzymatisch, fluoreszierend

Hier: biotinyliert Signal wird verstärkt mehrere Antikörper können

binden Nachweis

Durchführung

Gewebeproben: 6x Normale Pankreasproben 7x Pankreatitis 6x Pankreaskarzinom 2x normale Gewebeproben von Karzinompatienten 1x Karzinom- und normale Pankreasprobe vom gleichen

Patient 2D PAGE MALDI-TOF Datenbanken Suche (MS-Fit 3.2.1) Verifikation

Western Blot, Antikörperfärbung (ICH)

Ergebnisse (Beispiel: Galectin-1) 1. Experiment: alle Proben getestet 2. Experiment:

6/8 Normal 5/7 Pankreatitis 4/6 Krebs Gewebe

29 Proteine wurden identifiziert Antioxidanten, Chaperone (oder Chaperon-

ähnliche Proteine), Calcium-abhängige Bindeproteine, Proteasen, Verdauungsenzyme, Signaltransduktionsproteine, ECM Proteine

Galectin-1

Schon durch mRNA Experimente mit Pankreas Karzinom in Verbindung gebracht

Zell-Adhesion

Reguliert Zellwachstum

Inhibiert Apoptose

Ergebnis (Galectin-1)

2D PAGE

MALDI-TOF

6x höhere Expression im Krebsgewebe

Validierung (Galectin-1)

Western Blot

4/6 Krebsgeweben 0/8 normalem Gewebe 0/7 Pankreatitis

Validierung (Galectin-1)

ICH

67% der Krebsgewebeproben (D) enthalten galectin-1

100% des Stromas (E) enthält galectin-1 Kein galectin-1 in normalem Gewebe (F)

Diskussion

Bestätigung von früheren Ergebnissen

Aber: Mehr als 30 von 40 untersuchten Proteinen

konnten durch neue Methoden erstmals mit Pankreaskarzinom in Verbindung gebracht werden

Vielen Dank!!!

Quellen:

Shen et al., Protein Expression Profiles in Pancreatic Adenocarcinoma Compared with Normal Pancreatic Tissue and Tissue Affected by Pancreatitis as Detected by Two-Dimensional Gel Electrophoresis and Mass Spectrometry, CANCER RESEARCH 64, 9018–9026, December 2004

Iacobuzio-Donahue et al. Highly expressed genes in pancreatic ductal adenocarcinomas: a comprehensive characterization and comparison of the transcription profiles obtained from three major technologies. Cancer Res 2003;63:8614 –22

Person et al. Comparative identification of prostanoid inducible proteins by LC-ESI-MS/MS and MALDI-TOF mass spectrometry. Chem Res Toxicol 2003;16:757–7

http://www.m-ww.de/krankheiten/innere_krankheiten/pankreatitis.html http://www.m-ww.de/krankheiten/krebs/pankreaskarzinom.html http://de.wikipedia.org/wiki/2D-Gelelektrophorese http://www.lexikon-glossar.de/Antikoerperfaerbung.html http://www.unics.uni-hannover.de/analytik/GrundlagenAnalytik/Analytik%202/Makromo/Maldi

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