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Radioanalytik in der Bioanalytik
Bitte beachten !
Vorbesprechung für das Praktikum Bioanalytik
direkt nach der Vorlesung !
Bitte bleiben Sie hier !
6. Anwendung in den Biowissenschaften
Radioimmunoassay
DNA-Sequenzierung
Radioanalytik in der Bioanalytik
Weiterführende Literatur: Lotspeich et al., Bioanalyitk
Radioimmunoassay (RIA)
Immunochemische Reaktionen
Radionuklide als Tracer zur Isolation
erstmals 1959 von Yalow und Berson beschrieben
seitdem breit angewendet in klinischer Medizin
alle RIAs gehören zu den Proteinbindungs-methoden
Basis
jährlich mehr als 10.000.000 allein in den USA
Radioimmunoassay
Messung der Konzentration von
• Serumproteinen
• Hormonen
• Enzymen
• bakterielle Antigene
• Drogen (Rechtsmedizin)
• andere in Blut, Körperflüssigkeiten oder Geweben
Radioimmunoassay
Spezifische Einweiskörper
Antikörper
Zell- oder Membranproteine
Art des Radioassays
Serum
Radio-Immuno-Assay (RIA) immunradiometrischer Assay (IRMA)
kompetitiver Protein-Bindungsassay (CPBA)
Radio-Rezeptorassay (RRA)
Radioimmunoassay (RIA)
wichtigster Radioassay: RIA
Radioimmunoassay
Vorteile: Spezifität
Sensitivität
Versatilität
präzise Messgenauigkeit
Radioimmunoassay
Nachteile: Aufwand beim Umgang mit radioaktiven Stoffen
fehlende Lagerfähigkeit wegenradioaktiven Zerfall
Bei kurzlebigen: Aktivität verschwindet
Bei langlebigen: Radiolyse
Radioimmunoassay
Antigen-Antikörper-Reaktion in Lösung
Kompetitiver RIA
Mischung radioaktiv markierten löslichen Antigens („heißes“ Antigen)
mit steigenden Mengen nicht markierten („kaltem“) Antigen.
Radionuklide: meist 125I, 3H
Radioimmunoassay
• „heißes“, durch Radioaktivität messbares Antigen
Kompetitiver RIA
• durch „kaltes“ Antigen ersetzt
• Verdrängung durch bekannte Antigenmengen kalibriert
• an Standardkurve unbekannte Antigenmenge bestimmt
RadioimmunoassayPharmakokinetik
kinetischen Grundlagen der Antigen-Antikörper-Reaktion
Massenwirkungsgesetz
[Ag] + [Ak] [AgAk] k1
k2
Ag: Konzentration des freien AntigensAk: Konzentration des freien AntikörpersAgAk: Konzentration des gebundenen Antigens
(Antigen-Antikörper-Komplex)
RadioimmunoassayPharmakokinetik des RIA
[AgAk]
[Ag]·[Ak]
k1
k2
Gleichgewichtskonstante: K = =
molare Konzentration der gesamten
(freien F und gebundenen G) Antikörperbindungsstellen
[Akges] = [Ak] + [AgAk]
Das Verhältnis von gebundenem zu freiem Antigen ergibt eine Gerade mit der Steigung K.
RadioimmunoassayPharmakokinetik des RIA
GF
= K · ([Akges] - G)
Das Verhältnis von gebundenem zu freiem Antigen ergibt eine Gerade mit der Steigung K.
RIA
0
50
100
1 10 100 1000
kaltes Antigen [pg]
geb
un
den
es r
ad
iom
ark
iert
es A
nti
gen
[%
]
U.A.
0
50
100
1 10 100 1000
kaltes Antigen [pg]
ge
bu
nd
en
es
ra
dio
mark
iert
es A
nti
ge
n [
%]
U.A.
0
50
100
1 10 100 1000
RadioimmunoassayMessung der gebundenen Antigenmenge erfordert die Trennung vom nicht gebundenen Antigen.
z.B. durch Fällung des Antikörpers
Dabei muss das nicht gebundene Antigen in Lösung bleiben
Fällung von Antikörpern geschieht z.B. in
• Adsorption des Immunkomplexes an Bentonit/Aktivkohle
• 35-50% gesättigter Ammoniumsulfatlösung
• Kopplung an unlöslichen Träger
Entfernung des gebundene Antigens vom nicht-gebundenen
• durch Waschen entfernen
RadioimmunoassayTests für die verschiedensten Plasmabestandteile
Plasmabestandteile Nachweisbare Konzentration [pg/mL]
Proteohormone ACTH
Insulin
Calcitonin
Steroidhormone Testosteron
Progesteron
Pharmaka Digoxin
Drogen Morphin
2
5
10
50
20
100
100
RadioimmunoassayAblauf
• Herstellung reiner Antigene zur Markierung
• radioaktive Markierung der Antigene z.B. 125I, 3H
• Herstellung der spezifischen Antikörper
• Trennung der freien von den gebundenen Antigenen
Reaktionsbedingungen sind genau einzuhalten:
Inkubationszeit, Temperatur, pH, Proteinkonzentration, Molarität und Ionenstärke.
Inkubationszeiten: wenigen Stunden bis mehrere Tage.
Ablauf : DNA-Sequenzierung
Radioanalytik in der Bioanalytik
Zellwände werden aufgebrochen
doppelsträngige DNA wird denaturiert in Einzelstrangstücke
Konzentration durch Zentrifugation
Durch Anwendung von Enzymen werden die Nukleotidketten weiter in kleinere Stücke zerteilt.
Zu diesen werden markierte Verbindungen hinzugefügt die selektiv an die verschiedenen Fragmente binden.
Ablauf : DNA-Sequenzierung
Radioanalytik in der Bioanalytik
ursprünglicher DNA-Strang kann in einem Klonprozess direkt markiert werden, z.B. mit 32P
geklonte DNA wird dann aufgeschnitten in Fragmenten mit verschiedenen Restriktionsenzymen
Eletrophorese in einem Gel z.B. Polyakrylamid
Autoradiographie: Charakteristische Linien
Informationen über das Individuum, von dem die DNA entnommen wurde
Markierungspositionen
Radioanalytik in der Bioanalytik
Hauptsächlich: Nucleosidtriphophate
Am häufigsten: 32P oder 33P-Phosphatmarkierung:
Austauschposition - oder -Position der Phosphatreste in
2`-Desoxyribo-, 3`-Desoxyribo(Cordycepin)- oder 2`-Ribonucleotiden.
Im Fall von 35S erfolgt der Austausch gegen ein Sauerstoffatom des -Phosphats.
Markierungspositionen
Radioanalytik in der Bioanalytik
A
O O O
│ │ │ O
O P O P O P O CH2
││ ││ ││ │
O O O
│ H H
H H
R2
R1
R1
= H; R2
= OH 2`-Desoxyribose
R1
= OH; R2
= H 3`-Desoxyribose
R1
= R2
= OH Ribose
Purin- oder
Pyrimidin-
base
Sonden zur Nukleinsäureanalytik
B R2
│
C R3
N34 5C
│ Pyrimidin
C2 1
6C H
R1
N
R2
│
C N N3
4 5C 7
│ 8C H Purin
C2 1
6C9
R1
N N
Sonden zur Nukleinsäureanalytik
Isotop Art der
Strahlung
EMax
[MeV]
Halbwerts-
Zeit
Anwendungen Eigenschaften
3H 0,0118 12,3 Jahre in situ niedrige Sensitivität
hohe Auflösung
35S 0,167 87,4 Tage Filter-Hybridisierung mittlere Sensitivität
gute Auflösung
125I 0,035
0,035
60,0 Tage in situ mittlere Sensitivität
hohe Auflösung
32P 1,71 14,2 Tage Filter-Hybridisierung
Sequenzierung
höchste
Strahlungsenergie
höchste Sensitvität
mittlere Auflösung
(Streustrahlung)
DNA-Sequenzierung: Detektion radioaktiver Nucleinsäuren
Radioanalytik in der Bioanalytik
• Autoradiographie
Strahlende Fläche
Membran,
Gel,
Zellrasen,
Gewebsschnitt
wird direkt mit dem Röntgenfilm in Kontakt gebracht.
DNA-Sequenzierung: Detektion radioaktiver Nucleinsäuren
Radioanalytik in der Bioanalytik
• Flourographie
Strahlende Fläche wird mit floureszierenden Chemikalien überschichtet; die die radioaktive Strahlungsenergie in Floureszenz umwandelt.
Flourophore: 2,5-Diphenyloxazol (PPO) und Natriumsalicylat.
DNA-Sequenzierung: Detektion radioaktiver Nucleinsäuren
Radioanalytik in der Bioanalytik
• Indirekte Autoradiographie mit Verstärkungsfolien
(intensifyer screens):
Hochenergetische -Strahlung wird durch Phosphatreste der Verstärkungsfolie absorbiert und in blaues Licht umgewandelt. Cerenkov-Effekt
DNA-Sequenzierung: Detektion radioaktiver Nucleinsäuren
Radioanalytik in der Bioanalytik
• Flüssige Emulsionen für cytologische oder cytogenetische in situ-Anwendungen:
niedrig- bis mittelenergetischen 3H- bzw. 35S-Strahler verlangen direkten Kontakt des Detektionsmediums
die feste Emulsion wird bei 45°C verflüssigt und der Objektträger eingetaucht. Nach Trocknen erfolgt die Exposition bei 4 °C unter Lichtausschluss für Tage bis zu mehreren Monaten.
DNA-Sequenzierung: Detektion radioaktiver Nucleinsäuren
Radioanalytik in der Bioanalytik
• Vorexponierte Röntgenfilme für direkte Autoradiographie und Fluorographie:
nur für Fluorographie oder Verstärkungsfolien (Lichprozesse)
Gelgestützte DNA-Sequenzierungsverfahren
Radioanalytik in der Bioanalytik
quervernetzte Polyacrylamidgele zwischen planaren Glasplatten und linear polymerisierte Gele in Glaskapilaren.
beruhen auf der Erzeugung von basenspezifisch endenden DNA-Populationen, die in einer nachfolgenden denaturierenden Polyacrylamidgelelektrophorese nach ihrer Größe getrennt werden.
Gelgestützte DNA-Sequenzierungsverfahren
Radioanalytik in der Bioanalytik
Die Erzeugung dieser Populationen kann auf zwei unterschiedlichen Wegen erfolgen:
Die Reaktionsprodukte können durch die Synthese eines DNA-Stranges erzeugt werden.
Die Gelelektrophorese wird in ultradünnem Gelen (d < 0,35 mm) oder Kapillaren durchgeführt. Die Verwendung von Kapillaren ist jedoch mit Problemen bei der Befüllung der Kapillaren, der Polymerisation der Gelmatrizen und damit geringeren Leseweiten behaftet.
Sequenzierung nach Sanger: Didesoxy-Verfahren
Radioanalytik in der Bioanalytik
Kettenbruchverfahren oder Terminatorverfahren
basiert auf der enzymatisch katalysierten Synthese einer Population von basenspezifisch terminierten DNA-Fragmenten,
die nach ihrer Größe gelelektrophoretisch getrennt werden können.
Ausgehend von einer bekannten Startsequenz wird durch Zugabe
• eines Sequenzierungsprimers
• eines Nucleotidgemischs und
• einer DNA-Polymerase
die Synthese eines komplementären DNA-Stranges initiiert
Sequenzierung nach Sanger: Didesoxy-Verfahren
Radioanalytik in der Bioanalytik
Primer ist notwendig, um
• eine definierte Startstelle zu erhalten
•den Synthesebeginn der DNA-Polymerase einzuleiten.
Primer: ein kurzes DNA-Oligonucleotid von ca. 20 Bp
Sequenzierung nach Sanger: Didesoxy-Verfahren
Radioanalytik in der Bioanalytik
Start:
Reaktion wird in vier parallelen, aliquoten Ansätzen gleichzeitig gestartet, die sich nur durch die Verwendung eines unterschiedlichen Nucleotidgemischs unterscheiden.
Die mit A, C, G und T bezeichneten Reaktionen enthalten eine Mischung aus
• natürlich vorkommenden 2´-Desoxynucleotiden und
• synthetischer 2´, 3´-Didesoxynucleotide als Terminatoren.
Sequenzierung nach Sanger: Didesoxy-Verfahren
Radioanalytik in der Bioanalytik
Verlauf:
Während der Strangsynthese durch die schrittweise Kondensation von Nucleosidtriphosphaten in 5´ → 3´-Richtung kann es nur zu zwei unterschiedlichen Reaktionsereignissen kommen:
(A) Bei der Kondensation der 5´-Triphosphatgruppe eines 2´-Desoxynucleotids (dNTP) mit dem freien 3´-Hydroxyende des DNA-Strangs entsteht unter Freisetzung von anorganischem Pyrophosphat ein um eine Base verlängertes DNA-Molekül, das wiederum die freie 3´-Hydroxygruppe besitzt.
Die Synthese kann also im nächsten Schritt fortgesetzt werden.
Sequenzierung nach Sanger: Didesoxy-Verfahren
Radioanalytik in der Bioanalytik
Verlauf:
Während der Strangsynthese durch die schrittweise Kondensation von Nucleosidtriphosphaten in 5´ → 3´-Richtung
kann es nur zu zwei unterschiedlichen Reaktionsereignissen kommen:
(B) Kommt es hingegen zu einer Kondensationsreaktion zwischen dem freien 3´-Hydroxyende eines DNA-Strangs der 5´-Triphosphatgruppe eines 2´, 3´-Didesoxynucleotids, ist nach Einbau dieses Nucleotids eine Verlängerung des Strangs nicht mehr möglich, da keine freie 3´-Hydroxygruppe vorhanden ist.
Der Strang ist terminiert.
Radioanalytik in der Bioanalytik
A
PPi
Desoxynucleotid
B
PPi
Didesoxynucleotid
PPP H OHPPP
H
A T
A
5´ OH 5´
T G A CT G A C
T G T A
T
OH
3´ 3´
PPP
5´ 5´
A C T G T A A
G T A
T G A C
OH
A
3´
A C T
OH
A
PPP
C
G AT
T G A C
OH
3´
A C T
Es entstehen Reaktionsprodukte von bis zu 1000 Bp Länge
Radioanalytik in der Bioanalytik Prinzip des Kettenabbruchverfahrens nach Sanger
In einer geprimten, durch eine Polymerase katalysierten DNA-Synthesereaktion werden basenspezifisch teminierte DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge syntethisiert. Diese Fragmente erzeugen in der Gelelektrophorese ein spezifiches Bandmuster, das zur Rekonstruktion der Basenfolge dient.
Radioanalytik in der Bioanalytik
Primer 5´ 3´
Matrize 3´
+ dNPTs + Polymerase
+ ddATP + ddCTP + ddGTP + ddTTP
GCTCTCA GC G GCT
GCTC GCTCTCAG GCTCT
GCTCTC
A C G T
▬▬▬ G 3´
▬▬▬ A
▬▬▬ C
▬▬▬ T
▬▬▬ C
▬▬▬ T
▬▬▬ C
▬▬▬ G 5´
5´
Ele
ktr
oph
ore
se
Lese
rich
tun
g
Radioanalytik in der Bioanalytik A C G T
▬▬ A
▬▬ T
▬▬ C
▬▬ ▬▬ G
▬▬ G
▬▬ G
▬▬ C
▬▬ ▬▬ T
▬▬ C
▬▬ G
▬▬ T
▬▬ ▬▬ G
▬▬ T
▬▬ G
▬▬ C
▬▬ ▬▬ G
▬▬ T
▬▬ T
▬▬ A
▬▬ ▬▬ C
▬▬ C
▬▬ T
▬▬ C
▬▬ ▬▬ G
▬▬ A
▬▬ C
▬▬ A
▬▬ ▬▬ G
▬▬ T
▬▬ T
▬▬ G
▬▬ ▬▬ T
▬▬ G
▬▬ T
▬▬ A
▬▬ ▬▬ G
▬▬ C
▬▬ T
▬▬ G
▬▬ ▬▬ G
▬▬ A
▬▬ C
▬▬ G
▬▬ ▬▬ T
Autoradiogramm eines Sequenzierungslaufes.Jeweils vier benachbarte Spuren repräsentieren die Teilreaktionen A, C, G und T eines Klons. Entsprechend der Laufrichtung des Gels befinden sich die kleineren Reaktionsprodukteam unteren Ende der Abbildung. Jede Bande unterscheidet sich von der vorhergehenden im Idealfall um eine Base.
Radioanalytik in der Bioanalytik Markierungstechniken und Nachweisverfahren (Isotopenmarkierung)
Basis der Verwendung radioaktiver Isotope in der DNA-Sequenzierung:
• Sie diskriminieren nicht zwischen verschiedenen Isotopen
• Der Einbau in DNA-Strang führt zu keinen Mobilitätsänderungen im Gel.
• 32P und 35S
• Expositionszeiten bei Autoradiographie mit 32P kürzer
• Ortsauflösung mit 32P ist jedoch aufgrund der energetisch bedingten größeren Schwärzungsbereiche bedeutend geringer
• für längere DNA- Sequenzierungsläufe 35S bevorzugt
Radioanalytik in der Bioanalytik Markierung erfolgt:
durch radioaktiv markierten Primer oder
während der Sequenzierungsreaktion
Die radioaktive Markierung eines DNA-Sequenzierungsprimers erfolgt durch eine Phosphatierung mit gamma-32P-ATP und Polynucleotid-Kinase.
Die durch chemische Synthese produzierten Primer besitzen freie 5´-OH-Gruppe, die direkt, d.h. ohne Dephosphorylierung phospohoriliert werden können.
Die Markierung während der Didesoxy-Sequenzierungsreaktion erfolgt durch Zugabe von alpha-32P-ATP.
Das Isotop wird in den synthetisierten DNA-Strang eingebaut, der somit nachweisbar wird.
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