Was Sie immer schon zur Diagnostik von Pilzinfektionen ...¤analytik... · Paracoccidioides...

Was Sie immer schon zur

Diagnostik von Pilzinfektionen

wissen wollten .......

Birgit Willinger

Abteilung für Klinische Mikrobiologie

Klinisches Institut für Labormedizin

Medizinische Universität Wien

Mykosen

• Oberflächliche Mykosen• betreffen Haut, Haare, Nägel

• Subkutane Mykosen• betreffen “hautnahe” Muskulatur und Bindegewebe

• Systemische Mykosen• Befall innerer Organe• Primäre vs. opportunistische Infektionen

Überschneidungen zwischen Gruppen möglich

DHS-SystemPilze

Dermatophyten Hefen Schimmelpilze

TrichophytonMicrosporumEpidermophyton

CandidaCryptococcus

AspergillusMucor, etc.

Dimorphe PilzeHistoplasma capsulatum, Blastomyces

dermatitidis, Coccidioides immitis, Paracoccidioides brasiliensis

Nach W. Buzina, MUG

Diagnose von oberflächlichen Mykosen

• Klinisches Bild

• Mikroskopisches Präparat

• Kultur

• Identifizierung an Hand der Morphologie

und/oder biochemischem Leistungsprofil/MALDI-

TOF

• Molekularbiologie

Mykosen durch Hefen

• Candidosen• Soor

• Windeldermatitis

• Kolpitis, Balanitis

• Infektionen der Haut

• Pityriasis versicolor (Malassezia furfur)

• Hautcryptococcose (Cr. neoformans)

Oropharyngeale Candidose (OPC)

• Kinder, Diabetiker, Antibiotika, HIV

• Soor („Cottage cheese“)

• Erythematöse OPC – selten vor AIDS

• Cheilitis meist in Kombination, gel. einziges Symptom

Mikrobiologischer Nachweis von Candida ohne Klinik ist unbedeutend!

Vorkommen von Candida spp.

• GI-Trakt, Genitaltrakt, ev. Respirationstrakt

und andere Schleimhäute

• Mundschleimhaut (Zahnprothesen,

zuckerhältige Diät) - Zunge, Gaumen und

Wangenschleimhaut

• Infektionen meist endogen, gel. auch

exogen

• Nachweis aus Lebensmittel und Obstsäften

häufig - meist Kontamination durch

Mensch oder Tier

Materialentnahme und Transport bei Candidosen

• Generell aseptische Abnahme und Material in sterilen Behälter einbringen, je nach Material mit/ohne Transportmedium oder direkt auf Pilzmedium aufbringen

• Tupfer nur, wenn nicht anders möglich (Nasopharynx, äußerer Gehörgang, Vagina, Cervix)

• Entnahme vom Ort mit der höchsten Erreger-wahrscheinlichkeit, z.B.

• unter Zahnprothese

• von weißen Belägen

• Schuppenmaterial des Lippenwinkels

Materialentnahme und Transport bei Candidosen

• Generell aseptische Abnahme und Material in sterilen Behälter einbringen

• Tupfer nur, wenn nicht anders möglich (Nasopharynx, äußerer Gehörgang, Vagina, Cervix)

• Entnahme von Ort mit der höchsten Erregerwahrscheinlichkeit

• Eiter und andere Flüssigkeiten sollten aspiriert werden

• Rascher Transport ins Labor, Lagerung bei 4° C

Candida-Diagnostik

• Direkt:

• KOH, Blankophore, Methylenblau- oder

Gramfärbung

Candida-Diagnostik

• Direkt:

• KOH, Blankophore, Methylenblau- oder

Gramfärbung

• Kultur:

• Sabouraud Dextrose Agar, Chromogene Medien

• Ev. Zusatz von Öl für lipophile Vertreter

(Malassezia)

Kultur

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Vulvovaginale Candidose

• Meist durch C. albicans verursacht

• Keine routinemäßige Kultur, klinische Diagnostik ausreichend

• Vaginalabstrich mit Kultur bei

• Symptomen einer vulvovaginalen Candidose, normalen pH,

mikroskopisch keine Pathogene nachweisbar

➜Kultur verifiziert Diagnose

➜ ID der Spezies

➜ vermeidet unnötige Therapie

• persistierender oder wiederkehrender Symptomatik

➜ meist Candida non albicans - Achtung auf Azol-

Resistenz

• Achtung auf C. glabrata

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Vulvovaginale Candidose -Materialgewinnung

• Tupfer, z.B. e-Swab (Copan)

• Vaginalabstrich von der lateralen Wand

• Einbringen in Transportmedium oder

direkt auf Sabouraud Agar

• Quantifizierung nicht notwendig

• ID bis auf Speziesebene nur bei

refraktären Infektionen oder häufig

wiederkehrenden Episoden

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Was bedeutet Candida im Harn?

• Sehr kontroversiell diskutiert

• Kolonisation vs Infektion

• HWIs sind meist bakteriell

• Nachweis deutet meist auf Kontamination hin

• Weiblicher Genitaltrakt

• GI-Trakt

• Haut

• Achtung auf DK, hospitalisierte Patienten

• Infektionen möglich

• Mikroabszesse - Niere, Candidämie

Alfouzan & Dhar 2017, Myc Med 27: 293 - 302 15

Was bedeutet Candida im Harn?

• Achtung auf DK, hospitalisierte Patienten

• Achtung auf persistierende Candidurie bei DM

• Infektionen möglich

• Mikroabszesse - Niere

• Candidämie (meist beide Nieren betroffen)

• Candidurie als Quelle einer Candiämie bei Pateinten mit

obstruktiven Erkrankungen der Harnwege

• Diagnose:

• Keimzahl meist nicht aussagekräftig

• Blutkultur hilfreich, um systemische Infektion festzustellen

Alfouzan & Dhar 2017, Myc Med 27: 293 - 302 16

Gewinnung und Transport

• Bevorzugt Nativharn

• Der gewonnene Urin sollte binnen 2 Stunden im Labor

sein, ansonsten ist er KÜHL (4°C) zu lagern!

• Kein Überschreiten der Transportzeit von 24 Stunden!

• Harn > 2 Stunden bei Raumtemperatur ist für

quantitative Keimzahlbestimmung nicht mehr

geeignet!

• Alternativen:

• Gekühlter Postversand

• Urikult®

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Candidurie beim symptomatischen Patienten

Alfouzan & Dhar 2017, Myc Med 27: 293 - 302 18

Signifikante Keimzahl: ab 103 - 104

Candidurie beim asymptomatischen Patienten

Alfouzan & Dhar 2017, Myc Med 27: 293 - 302 19

Fadenpilze

Dermatophyten

• Pilze, die aufgrund ihrer

keratinolytischen Fähigkeiten

Haut, Haare, und Nägel befallen

können

• Zyklische oder polyzyklische

Inflammation, Schuppung und

Randbetonung

• Krankheitsbild: Tinea

• Übertragung: direkter und

indirekter Kontakt

Dermatophyten

• Trichophyton species• glattwandige, zigarrenförmige Makrokonidien,

einzellige Mikrokonidien

Dermatophyten

• Trichophyton species• glattwandige, zigarrenförmige Makrokonidien,

einzellige Mikrokonidien

• Microsporum species• rauwandige, spindelförmige Makrokonidien,

einzellige Mikrokonidien

Dermatophyten

• Trichophyton species• glattwandige, zigarrenförmige Makrokonidien,

einzellige Mikrokonidien

• Microsporum species• rauhwandige, spindelförmige Makrokonidien,

einzellige Mikrokonidien

• Epidermophyton floccosum• nur Makrokonidien, pantoffelförmig, häufig in

Dreiergruppen

Neue Nomenklatur

Klinische Abteilung für Klinische Mikrobiologie

Birgit WIllinger

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• Diversität der Dermatophyten mit konventionellen Methoden ist wesentlich größer als die genetische Diversität

De Hoog S. et al, Mycopathologia 2017: 182: 5 - 31

Neue Nomenklatur – wichtige Gruppen

Klinische Abteilung für Klinische Mikrobiologie

Birgit WIllinger

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De Hoog S. et al, Mycopathologia 2017: 182: 5 - 31

• Clade A: Trichophyton

• Clade B: Epidermophyton floccosum

• Clade C: Nannizia

• Clade F: Microsporum

•M. audouinii

•M. canis

•M. ferrugineum

Neue Nomenklatur

Klinische Abteilung für Klinische Mikrobiologie

Birgit WIllinger

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Konsiliarlabor für Dermatophyten, Charité Berlin

Abnahme und Transport von Untersuchungsmaterial

• Desinfektion mit 70% Alkohol

• Abnahme von der aktiven Randzone mit sterilem Skalpell oder scharfem Löffel, möglichst viele kleine Hautschuppen (20 – 30 Stück)

• Bei bullösen oder eitrigen Läsionen ev. Tupfer

Abnahme bei Tinea capitis

• Haare: epilieren, nicht abschneiden• am besten am Rand aus fluoreszierenden

Bereichen oder abgebrochene Haare oder Anteile mit Schuppen

• Haarstümpfe mit Haarwurzel entfernen (Epilationspinzette)

• Ggf. Kopfschuppen entfernen und einsenden

Abnahme bei Onychomykose

• Skalpell, scharfer Löffel, Schere, Fräse

• Nagel ev. mit Schere kürzen, leicht ablösbare und bröckelige Anteile entfernen

• Nägel: aus dem Nagelbett, Fräse

• Kleine und zahlreiche Nagelpartikel

• Nagelspäne aus den befallenen Arealen (Übergang krankes – gesundes Gewebe)

• Transport in sterilen Gefäßen, ev. schwarzes Papier

• Keine Transportmedien

• Lagerung bei Zimmertemperatur

Mikrobiologische Diagnose

1. KOH-Präparat 2. Kultur

Vor Abnahme Haut mit Alkohol desinfizieren!

CalcoFluor White Präparat(Fluoreszenzmikroskop)

• Bei Nachweis von

hyalinen Hyphen:

Dermatophyten

wahrscheinlich, aber

auch Schimmelpilze

möglich

• Bei Nachweis von

Arthrokonidien:

Dermatophyten

Suryawanshi et al. Archives of Clinical Microbiology 2012

Mikroskopie

Klinische Abteilung fürklinische Mikrobiologie

Birgit WIllinger

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• Schnell, leicht durchführbar, billig

• Keine Unterscheidung zwischen

• Spezies – keine ID möglich

• lebensfähiger oder nicht lebensfähiger Pilz

• 15-30% falsch negativ

• Besonders bei schwierig zu gewinnendem Material

• Proximale Onychomykose

• Totale Onychodystrophie

• Falsch positive Ergebnisse durch Fadenpilze bei zu

oberflächlicher Materialgewinnung

• Gewisse Expertise ist Voraussetzung

Mikroskopie

Abteilung für Klinische Mikrobiologie, Klin. Institut für Labormedizin

Birgit WIllinger

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Pihet & Le Govic Mycopathologia 2017; 182:161- 180

Kultur

• Kleine Schuppen, Nagelteile, kurze

Haaranteile (mit Wurzel)

• Abstriche ungeeignet

• Mind. 2 Medien:

• Sabouraud (+ Antibiotika)

• Mycosel (Cycloheximid)

• Inkubation bei 25 - 30°C für 2 -3 (6)

Wochen mit häufiger Inspektion

Dermatomykosen durch Schimmelpilze• Scopulariopsis brevicaulis - Onychomykosen

• Fusarium

• Alternaria

• Nattrassia mangiferae (Scytalidium

dimidiatum, Hendersonula toruloides)

• Aspergillus, z.B. A. sydowii

• und andere……..

Infektionen durch Fusarium

Brasch J. 2012, Der Hautarzt 63:872 - 876 37

Distale subungualeOnychomykose durch Fusarium

Fusarium-Onychomykose mit Paronychie

Septische vaskulitisartige Hautinfektion

Scopulariopsis brevicaulis

• Erreger von Onychomykosen

Infektion mit Natrassia mangiferae

Willinger et al. 2004, JCM 42: 478 -80

Achtung!

• Nicht jedes Pilzisolat ist der ursächliche Erreger

• Mögliche Kontaminanten:

• C. parapsilosis (Hautflora)

• Rhodotorula rubra

• Penicillium spp. und andere Schimmelpilze

PCR zum Nachweis von Dermatophyten

Wie könnte der Einsatz in der Routine aussehen?

42Gräser et al. 2012, JDDG 410: 721 - 25

Gewünscht: rascher, sensitiver, breiter und verlässlicher Test

Überlegungen zum Routineeinsatz der Dermatophyten-PCR

Klinische Abteilung für Klinische Mikrobiologie

Birgit WIllinger

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• Ausreichend Material (Haut, Haare, Nägel)

• Vorherige mikroskopische Prüfung kann hilfreich sein, um die

Menge der vorhandenen Pilzelemente besser beurteilen zu

können

• Bes. bei Onychomykose problematisch

(Materialschwankungen)

• Erreger kann Fadenpilz sein ohne zu den Dermatophyten zu

gehören – keine Detektion bei gezielter PCR

• Problem bei Mischinfektionen: z.B. T. rubrum und Fusarium

➜ Kombination Mikroskopie und PCR

• Besonders wichtig, wo rasches Ergebnis gebraucht wird

„Proper quantity and site make cultures turn out right!“Jill E. Clarridge III, PhD, Houston, Tx.

Zu guter Letzt: was ist wichtig?

• Richtige Materialabnahme

• Richtige Menge

• Richtiger Versand

• Richtige Untersuchungsanforderung

• Richtige Interpretation des Befundes

Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!