Zum Nachweis und zur Identifizierung einiger Stoffwechselprodukte von Isonicotinsäurehydrazid

4. Auf Physiologic und Pathologic beziigliehe 157

Fiir die colorimetrisehe Best immung yon Pyramidon (I) im Serum haben R. H A S L ' ~ und W. ST~u~z 1 die Methode yon R. PCLVE~ ~ modifiziert. Da die dort angegebene Farbreaktion nicht nur yon I, sondern auch yon 4-Aminoanti- pyrin gegeben wird, haben Verf. diese Fehlerquelle dadurch ausgesehaltet, dab das im Serum enthaltene 4-Aminoant[pyrin mit Eisessig zu 4-Acetylaminoantipyrin acetyliert wird. Dutch die Behandlung mit Eisessig werden aul~erdem die hohen Leerwel~e, die auf f~rbende Komponenten im Serum zurtickzufiihren sind, wesent~ lich herabgesetzt. - - Aus/i~hrung. 2 ml Serum, 1 ml AcetatpufferlSsung (118 g Natriumaeetat, 56,5 ml Eisessig, in Wasser zu 100O ml gelsst) mad 10 ml Wasser werden 5 rain im Wasserbad erhitzt und dann filtriert. Man w/~scht den Riickstand 2 real mit je 2 ml heil~em Wasser nach, versetzt das Filtrat mit 1 ml 2 n Natron- lauge und schiittelt es 2 real 2 min mit je 20 ml ~ther aus. Dann dampft man den Jlther bei 50 ~ Cab, nimmt den noeh warmen Riickstand in 4 Tr. Eisessig auf, dampft nochmals zur Trockne ein, nimmt mit 2 ml 10% iger Natriumaeetatl5sung auf und versetzt nuch dem Abkiihlen mit 6,5 ml Azoreagens (2 ml l~oige p-Nitranilinl5sung in n-Salzs~ure werden mit 2 ml einer l~oigen Natriumnitritl5sung diazotiert. ~ach 2 min setzt man 2 ml l~oige Sulfamins~urel5sung zu, l ~ t 20 rain stehen und ver- diinnt mit 14 ml Wasser). Nach 10 rain gibt man die L5sung in einen Sehiittel- triehter, w~scht das K51behen mit 2 ml 2 n SMzs~ure und 2 ml Wasser naeh und schiittelt 2 rain lang mit 10 ml Chloroform aus. Die abgetrennte, mit wenig Natrium- sulfat getrocknete Chloroform]Ssung wird in einer 2 em~Kiivette mit Filter S 43 im Stufenphotometer gemessen. Das BEERsehe Gesetz gilt fiir den Bereich zwischen 1 und 10 mg-%. Der mittlere Fehler betrug • 4%. H. SP~L~C~

Zum Naehweis und zm' Identifizierung einiger Stoffweehselprodukte yon I so- nieotins~urehydrazid in menschlichem Urin verwenden W . F . J . Ctr~m3ERT- SO~, D. )/L I~]~LA~D und W. WoLv:~ a eine ehromatographische und eine elektro- phoretische Methode. Die chromatographische Methocle wird an Whatman-Papier Nr. 1 oder 4 bei Raumtemperatur im absteigenden Chromatogramm ausgefiihrt, wobei die ~'liissigkeitsfront 36 cm wandert. Die Rr-Werte der verschiedenen als Kontrollsubstanzen verwendeten Stoffe unterscheiden sich nicht sehr wesentlieh voneinander, gleichgiiltig, ob man wasserges~ttigtes Butanol oder ~thylmethyl- keton-- Eisessig -- Wasser (49:1 : 50) oder n-Propanol-- Wasser (4:1) verwendet. Ge- nauere Angahen werden nicht gemacht. Bei der Papier-Ionophorese in Phospha$- puffer bei p~ 6,5 wandern die sauren Verbindungen zur Anode, w/~hrend die basi- sehen Verbindungen fast an der Auftragsstelle Hegenbleiben. In Phthalatpuffer bei p~ 4 wandern die basisehen Verbindungen zur Kathode und die sauren bleiben liegen. Zur Entwieklung der Chromatogramme kann man Bromcyan, Pikrylehlorid oder Fluordinitrobenzol, p-Aminoacetophenon und 3-Methyl-l-phenylpyrazolon verwenden. - - Arbeitsweise. Harnproben yon Patienten~ die mit Isoniacid behandelt sind, werden in Mengen yon 5 ml gefriergetroeknet, der ~iickstand in 0,5 ml Wasser suspendiert, zentrifugiert und v o n d e r iiberstehenden Fliissigkeit 5 real 10 #1 auf auf dieselbe Stelle aufgetragen, naehdem der vorhandene Tropfen jeweils getroeknet ist. In gleieher Weise werden die entspreehenden Nicotins~urederivate, ]=[arn yon unbehandel~en Patienten und Kontrollharne mit Zus~tzen aufgetragen. Das Chro- matogramm wird mit n-Butanol-Wasser entwiekelt und die Flecken werden ange- f~rbt. Isoniacid wurde nur in dem t tarn yon 6 Patienten gefunden. Um Isonicotin- s~iureglycin (synthetisch hergestc]lt) nachweisen zu k5nnen, wird der auf pg 2,5 mit Salzsaure anges~uerte H a m 16 Std kontinuierlich mit ~ ther extrahiert. Die zu~

1 Arzneimittel-Forseh. 5, 61--62 (i955). Univ. Wien. Arch. int. Pharmacodynam. Th~rap. (Gent) 1950, 81.

3 Bioehemie. J. 5~0669 671 (1953). Glaxo Lab. Ltd., Greenford, Middles. (Engl.),

158 Bericht: Spezielle analytische Me~hoden

riickbleibende wai~rige LSsung wird mit Natronlauge neutralisiert, im Vakuum auf 10 ml eingedampft und 1 ml als d'finner SSrieh zur Chromatographie aufgetragen. Der Streifen, der d a s Isonicotins~ureglycin enthal~, wird ausgesehnitten, mit Wasser extrahiert, die w~Brigen Extrakte ira Vakuum auf 1 ml eingedampft und in Phosphatpuffer bei p~ 6,5 elektrophoresiert. Ein Tefl des Eluates wird bei 100 ~ C 3 Std in 5 n SalzsEure hydrolysier~ und nach Neutralisation ebenfalls elektrophore- siert. Hierbei wird Glyein mit der Ninhydrinreaktion nachgewiesen. Es zeigt sich, dal3 weniger als 20% des verabfolgten Isoniacids in 24 Std ausgesehieden werden.

K. HINSBERG

Ein colorimetrisches Verfahren zur Bestimmung yon Xanthindehydrogenase(I) in Rattenleber wird yon G. G. VILLELA 1 angegeben. Es beruht auf der l%duktion des farblosen Triphenyltetrazoliumeh]orids (TTC) dureh I zu einem roten Formazan, das in Toluol gel5st und colorimetriert wird. -- Aus/i~hrung. Die vom Blur befreite Leber wird sofort mit kaltem dest. Wasser homogenisiert und soweit verdiinnt, dab 1 ml 0,166 g Organbrei enthalt. Man flltriert das Homogenisat dureh Leinen und h~ilt das Fil trat unter Umriihren 40 mill auf 37 ~ C (Wasserbad). Dann pipettiert man in ein T~vMBERG-l~Shrchen 2 ml 0,033 m PyrophosphatpufferlSsung (p~ 8,6) und 0,5--1,0 ml Leberhomogenisat und gibt 0,1 ml 0,05 m XanthinlSsung in 0,05 n Natronlauge und 0,3 ml 0,1%ige TTC-LSsung in den seitliehen Arm, kippt den Apparat und mischt die Fliissigkeiten: Nach 30rain versetzt man mit 7,5 ml Essig- s~ure und 3 ml Toluol, sehiittelt kr~ftig und trennt die Toluolphase durch Zentri- fugieren ab. ])ann colorimetriert man bei 480 m# gegen einen Leerwert ohne Xan- thin. Das Ergebnis wird ausgedriickt in Mikro~ramm Formazan, die yon 1 mg Organtroekensubstanz gebfldet werden. Normale l~atten yon 90--160 g Gewieht gaben Werte yon 0,91--1,86. I-I. S~]~Hc~

Zur papierehromatographisehen Bestimmung yon Nucleins/iurekomponenten geben K. MAKINO und K. MATSUZAKI 2 eine Verbesserung der Methode yon 1~. MARKHAN und J. D. SNIT~ a an, wobei der durch Verwendung einer Niedervolt- Quecksilberlampe yon 100 V und 15 W die Nucleins~urekomponenten auf dem Chromatogramm direkt sichtbar werden und die photographisehe Aufnahme weg- fallen kann. Die untere Grenze der Naehweisbarkei~ liegt je nach Verbindung zwischen I und 5 #g. Fiir eine l%eihe yon Nucleins~urekomponenten werden die R~-Werte angegeben. A. KUt~TEN2~CKER

Eine Methode zur Bestimmung der Nueleotidfolge in Polyribonueleotiden gibt P. R. Wm~rFELD 4 an. Sie bedient sich zva" Dephosphorylierung eines endst~ndigen :Nucleotides bei Polyribonucleotiden einer Phosphomonoesterase und dann wird die freie angrenzende ttydroxylgruppe mit Perjoda~ oxydiert. Naeh Bebriitung bei p~ 10 spaltet der oxydiorte Nucleosidrest ab und es bleib~ eine urn ein Nuoleo. t id ~rmere Verbindung zuriiek. Diese Operation kann bis zum Zuriiekbleiben e ine s Restes wiederholt werden. (Anwendung haupts~ehlich an dem Mosaik- Virus 5 der gelben R i i b e . ) - Arbeitsweise. 0,2 g Ribonucleins~ture (I~NS) in 10 ml Wasser werden bei p~ 7 24 Std bei 55~ mit 1,7 mg Pankreasribonuelease ver- daut und gegen 3 • 100 ml Wasser dialysiert, im Vakuum eingedampft und nach

1 l%ev. brasfl. Biol. 14, 455--458 (1954) [Portugiesisch]: Inst. Oswaldo Cruz, l~io de Janeiro (Brasilien).

J . Biochemistry (Tokyo) 41, 4 5 7 ~ 6 2 (1954). 3 Nature (London) 163, 250 (1949); vgl. diese Z. 181, 287 (1950). 4 Bioehemic. J . 58, 390--396 (1954). Inst , Teehnol., Pasadena, Calif. (USA). 5'MAt~K]~AM, t~., and J. D. SMrr~: Bioehemic. J. 52, 558 (1952).