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Analytik und Vorkommen von Paralytic Shellfish Poisoning
(PSP)-Toxinen in marinen Organismen
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium (Dr.rer.nat.)
vorgelegt dem Rat der Biologisch-Pharmazeutischen Fakultät
der Friedrich-Schiller-Universität Jena
von
Dipl. Troph. Elke Jaime
geboren am 27.05.1975 in Dresden
Gutachter:
1. Prof. Dr. Bernd Luckas (Friedrich-Schiller-Universität Jena)
2. Prof. Dr. Matthias Hamburger (Friedrich-Schiller-Universität Jena)
3. Prof. Dr. Dr. Hans Steinhart (Universität Hamburg)
Tag der Doktorprüfung: 05. April 2003
Tag der öffentlichen Verteidigung: 12. Mai 2003
Inhaltsverzeichnis I
Inhaltsverzeichnis
I THEORETISCHER TEIL 1
1. Einleitung 1
1.1 Zur Problematik der Algentoxine 1
1.1.1 PSP-Toxine 3
1.1.1.1 Vorkommen 3
1.1.1.2 Chemische Struktur, Eigenschaften und Biosynthese 6
1.1.1.3 Toxizität 9
1.1.1.4 Gesetzliche Regelungen 12
1.2 Analytische Erfassung von PSP-Toxinen 13
1.2.1 Nichtchromatographische Bestimmungsverfahren 14
1.2.1.1 Bioassays 14
1.2.1.2 Immunologische Assays 15
1.2.1.3 Fluorimetrische Verfahren 16
1.2.1.4 Kapillarelektrophorese 17
1.2.2 Chromatographische Bestimmungsverfahren 19
1.2.2.1 Trennverfahren auf dem Prinzip der Ionenpaarchromatographie 19
1.2.2.2 Trennverfahren auf dem Prinzip der Ionenaustauschchromatographie 20
1.2.2.3 Detektion nach HPLC-Trennung 21
1.2.2.3.1 Fluorimetrische Detektion 21
1.2.2.3.2 Elektrochemische Detektion 22
1.2.2.3.3 Massenspektrometrische Detektion 23
2. Zielstellung 27
Inhaltsverzeichnis II
II EXPERIMENTELLER TEIL 29
3. Optimierung eines ionenpaarchromatographischen Verfahrens zur Bestimmung von PSP-Toxinen 29
3.1 Analytische Ausgangslage 29
3.2 Optimierung der Methode nach Thielert et al. 29
4. Entwicklung eines ionenaustauschchromatographischen Verfahrens zur Bestimmung von PSP-Toxinen 32
4.1 Wahl der stationären und mobilen Phase 32
4.2 Einfluß verschiedener Elutionsbedingungen auf die Toxintrennung 33
4.2.1 Variation der Pufferstärke 33
4.2.2 Variation der Art des Puffers 34
4.2.3 Variation des pH-Wertes 35
4.2.4 Einfluß organischer Modifier 37
4.2.5 Optimierung der Trennleistung durch Gradientenelution 38
4.3 Detektion 40
4.4 Linearität und Reproduzierbarkeit der Fluoreszenzdetektion 41
4.5 Anwendbarkeit des entwickelten HPLC-Verfahrens zur PSP-Bestimmung aus komplexen Matrizes 42
4.5.1 Methodenvergleich bei der Bestimmung von PSP-Toxinen aus marinen Organismen 42
4.5.2 Gewinnung von PSP-Toxinen aus kontaminiertem biologischen Material 44
4.6 Diskussion der Ergebnisse 46
Inhaltsverzeichnis III
5. Der Einsatz der Ionenaustauschchromatographie in der Kopplung LC/MS 48
5.1 Einführende Untersuchungen zur massenspektrometrischen Detektion von PSP-Toxinen 48
5.2 Applikation der entwickelten HPLC-Trennmethode in der Massenspektrometrie 51
5.3 Modifizierung der LC/MS-Methode 52
5.3.1 Substitution des Puffersalzes 52
5.3.2 Verwendung organischer Modifier 53
5.4 Linearität und Nachweisempfindlichkeit der MS-Detektion 55
5.5 Anwendung der entwickelten LC/MS-Kopplung 55
5.6 Entwicklung einer schnellen Screening-Methode 59
5.7 Diskussion der Ergebnisse 62
6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen in kommerziell genutzten Muschel- und Schneckenarten der Nordsee 63
6.1 Einleitung 63
6.2 In vivo Fütterungsversuch 65
6.2.1 Versuchsdurchführung 65
6.2.1.1 Wahl der Algen- und Muschelspezies 65
6.2.1.2 Kultivierung der Algenspezies 66
6.2.1.3 Fütterungsregime und Entnahme der Schalentiere 66
6.2.1.4 PSP-Toxinanalyse der Muschel- und Schneckenproben 67
Inhaltsverzeichnis IV
6.2.2 Ergebnisse und Diskussion 67
6.2.2.1 Toxizität und Toxinprofil von Alexandrium fundyense 67
6.2.2.2 Speziesspezifische Toxinaufnahme 68
6.2.2.3 Akkumulation und Verteilung der PSP-Toxine im Organismus 69
6.2.2.4 Detoxifikation 74
6.2.2.5 Änderungen der PSP-Profile 76
6.2.2.6 Individuelle Variabilitäten 81
6.3 In vitro Inkubationsversuch 83
6.3.1 Versuchsdurchführung 83
6.3.2 Ergebnisse und Diskussion 84
6.3.2.1 Metabolisierung der PSP-Toxine 84
6.3.2.2 Entwicklung der PSP-Profile 89
6.3.2.3 Entwicklung der Gesamt-PSP-Gehalte 91
6.4 Schlußfolgerungen und Ausblick 93
III ZUSAMMENFASSUNG 96
IV LITERATURVERZEICHNIS 101
V ANHANG 115
Verzeichnis der Abbildungen V
Verzeichnis der Abbildungen
Abb. 1: Weltweite Verbreitung von PSP-Toxinen (schwarz markierte Regionen) 4
Abb. 2: Verschiedene PSP-Produzenten 5
Abb. 3: Chemische Struktur von Saxitoxin und verwandten Verbindungen 7
Abb. 4: Übersicht der in vivo Transformationen von PSP-Toxinen in Schalentieren 8 (vgl. Abb. 3 für individuelle Toxinstruktur). 1. Epimerisierung von β zu α- Epimeren; 2. Reduktion: (a) von GTX1/4 und Neo zu GTX2/3 und STX, (b) von GTX1-4 zu STX und Neo; 3. Saure Hydrolyse; 4. Enzymatische Hydrolyse: Umwandlung von N-Sulfocarbamoyl- (4a) oder Carbamoyltoxinen (4b) zu Decarbamoyltoxinen
Abb. 5: Modell zur Bindung von PSP-Toxinen an die Oberfläche erregbarer 11 Nervenmembranen
Abb. 6: Oxidation von Saxitoxin 16
Abb. 7: Prinzip der Kapillarzonenelektrophorese 18
Abb. 8: Prinzip eines FAB-Interfaces für die LC/MS-Kopplung 24
Abb. 9: Prinzip eines ESI-Interfaces für die LC/MS-Kopplung 25
Abb. 10: Optimierung der PSP-Bestimmungsmethode: Chromatogramme 30 einer PSP-Standardlösung 1. Thielert-Methode
2. optimierte Methode
Abb. 11: Reproduzierbarkeit der GTX1/GTX4-Trennung anhand der 31 Retentionszeiten nach 5facher Injektion in Folge (MW = Mittelwert, SD = Standardabweichung)
Abb. 12: Einfluß der Pufferkonzentration bei pH 6,9 auf die Elution von 34 1. STX und 2. GTX2/GTX3 (GTX2/GTX3-Standard enthält Spuren dcGTX2/dcGTX3, vorderer Peak) 1. A = 450 mmol/L Ammoniumacetat, B = 350 mmol/L, C = 300 mmol/L,
D = 250 mmol/L 2. A = 150 mmol/L Ammoniumacetat, B = 50 mmol/L, C = 20 mmol/L
Abb. 13: Einfluß der Pufferart auf die Elution von 1. STX und 2. C1/C2 35 (kleinerer Peak C1) bei pH 6,9 1. A = 300 mmol/L Ammoniumacetat, B = 300 mmol/L Ammoniumformiat
C = 300 mmol/L Trifluoressigsäure 2. A = 35 mmol/L Ammoniumacetat, B = 35 mmol/L Ammoniumformiat
C = 35 mmol/L Trifluoressigsäure
Abb. 14: Einfluß des pH-Wertes auf die Elution von 1. STX mit 300 mmol/L 36 Ammoniumacetat und 2. C1/C2 mit 20 mmol/L Ammoniumacetat 1. A = pH 6,9; B = pH 4,5; C = pH 8,5; D = pH 9,5 2. A = pH 6,9; B = pH 4,5; C = pH 8,5
Verzeichnis der Abbildungen VI
Abb. 15: Einfluß von Acetonitril bei pH 6,9 auf die Elution von 1. STX und 2. C1/C2 37 1. A = 250 mmol/L Ammoniumacetat, 30% Acetonitril (v:v) B = 250 mmol/L Ammoniumacetat, 0% Acetonitril 2. A = 10 mmol/L Ammoniumacetat, 30% Acetonitril (v:v)
B = 10 mmol/L Ammoniumacetat, 0% Acetonitril (keine Elution von C2 nach 60 min)
Abb. 16: HPLC-Chromatogramm der Alge Alexandrium fundyense, 39 dotiert mit einem PSP-Standardgemisch
Abb. 17: Korrelation der Gesamt-PSP-Gehalte, gemessen mit der optimierten 43 Thielert- und der neu entwickelten Methode
Abb. 18: Korrelation der Gehalte an Neo, gemessen mit der optimierten 43 Thielert- und der neu entwickelten Methode
Abb. 19: Massenspektren von STX, GTX2 und GTX3 (nach „flow injection analysis“) 49
Abb. 20: Abhängigkeit der Signalintensität von der Pufferkonzentration (13,4 ng 50 GTX1 bzw. 15,0 ng dcSTX injiziert)
Abb. 21: LC/MS-Chromatogramm einer PSP-Mischstandardlösung im TIC-Mode 51 (oben); GTX2, Neo und STX extrahiert (SIM-Mode)
Abb. 22: Einfluß der Pufferart auf die Signalintensität bei gleicher injizierter 52 Toxinmenge A = Ammoniumacetat B = Ammoniumformiat
Abb. 23: Einfluß von Acetonitril auf die Signalintensität bei gleicher injizierter 53 Toxinmenge A = mobile Phase mit 30% ACN (vgl. Tab. 13)
B = mobile Phase ohne ACN (vgl. Tab. 6)
Abb. 24: HPLC/Fluoreszenz/MS-Bestimmung von PSP-Toxinen (Standardgemisch): 56 C1, C2, GTX1 (34,4 ng), GTX4 (17,8 ng), dcGTX2/3, GTX2 (57,4 ng), GTX3 (20,8 ng), Neo (69,6 ng), dcSTX (50,0 ng), STX (79,8 ng). 1. Fluoreszenz-Chromatogramm 2. TIC-Chromatogramm
Abb. 25: HPLC/FLD/MS-Bestimmung von PSP-Toxinen in Muscheln (Mytilus 57 chilensis)
1. Fluoreszenz-Chromatogramm 2. TIC-Chromatogramm
Abb. 26: HPLC-System mit Ionenaustauschersäulen und paralleler MS-Detektion bzw. 58 elektrochemischer Oxidation mit Fluoreszenzdetektion und optionalem Fraktionssammler
Abb. 27: Bestimmung von PSP-Toxinen aus einer Standardlösung unter Anwendung 60 der LC/MS-Screening-Methode (SIM-Mode)
Abb. 28: Bestimmung von PSP-Toxinen aus einer Muschelprobe unter Anwendung 61 der LC/MS-Screening-Methode (TIC- und SIM-Mode)
Abb. 29: Mittleres Toxinprofil von A. fundyense (links), Entwicklung des Toxinprofils 68 von A. fundyense während der Fütterung (rechts)
Abb. 30: Gesamt-PSP-Gehalte während der Fütterung und der Entgiftung (E), rechts: 70 vergrößerte Darstellung und gesetzlicher Grenzwert
Abb. 31: PSP-Gehalte der einzelnen Muschel- und Schneckengewebe 73
Abb. 32: Prozentualer Anteil der einzelnen Kompartimente am Gesamt-PSP-Gehalt 75 der Tiere während der gesamten Versuchsdauer (E = Entgiftungsperiode)
Verzeichnis der Abbildungen VII
Abb. 33: PSP-Profile der Einzelgewebe von M. edulis und C. gigas exemplarisch 77 für die 3. und 6. Fütterungswoche und die 2. und 6. Entgiftungswoche (E = Entgiftung)
Abb. 34: PSP-Profile der Einzelgewebe von C. edule und L. littorea exemplarisch 78 für die 3. und 6. Fütterungswoche und die 2. und 6. Entgiftungswoche (E = Entgiftung)
Abb. 35: Variationen der Gesamt-PSP-Gehalte der untersuchten Spezies (links) und 82 der Toxingehalte der einzelnen Kompartimente am Bsp. von M. edulis (rechts) in der 6. Fütterungswoche ―— Median, ----- Mittelwert
Abb. 36: Absolute Änderungen im Gehalt von GTX1-4, Neo, STX im Verdauungs- 85 gewebe (links) und im Muskelgewebe (rechts)
Abb. 37: Absolute Änderungen im Gehalt von GTX2, GTX3, C1, C2 im Verdauungs- 87 gewebe (links) und im Muskelgewebe (rechts)
Abb. 38: Toxinprofile von A. fundyense und vom Muskelgewebe einiger Mollusken 89 nach 48 h Inkubation (Angaben in mol%)
Abb. 39: Toxinprofile von A. fundyense und vom Verdauungsgewebe einiger 90 Mollusken nach 48 h Inkubation (Angaben in mol%)
Abb. 40: Veränderung des Gesamt-PSP-Gehaltes während der Inkubation in 91 Abhängigkeit von der Tierspezies (links: Verdauungsgewebe, rechts: Muskelgewebe)
Verzeichnis der Tabellen VIII
Verzeichnis der Tabellen
Tab. 1: Ausgewählte Vergiftungen durch Algentoxine 2
Tab. 2: LD50-Werte von PSP-Toxinen nach einmaliger oraler Verabreichung 10
Tab. 3: Toxizitäten der PSP-Toxine 12
Tab. 4: Relative Fluoreszenzintensitäten und relative Toxizitäten der PSP-Toxine 17
Tab. 5: Chromatographische Bedingungen der optimierten Thielert-Methode 31
Tab. 6: Chromatographische Bedingungen der neu entwickelten HPLC-Methode 39 auf Basis von Ionenaustauschern zur Bestimmung von PSP-Toxinen
Tab. 7: LODs (S/N = 3:1) bei elektrochemischer Oxidation im Vergleich zur 41 chemischen Oxidation einer konventionellen HPLC-Methode
Tab. 8: Linearität der Fluoreszenzdetektion nach elektrochemischer Oxidation 41 (5 Kalibrierpunkte pro Toxin)
Tab. 9: Korrelationskoeffizienten für den Vergleich der optimierten Thielert- 42 Methode mit der neu entwickelten PSP-Methode (alle Proben sowie aufgeteilt in Algen- und Muschelproben)
Tab. 10: Wiederfindungsraten und relative Standardabweichungen von in 44 Ammoniumacetat eingedampften Lösungen von Toxinstandards (3fach- Wiederholung)
Tab. 11: Ionisierungsparameter für die massenspektrometrische Detektion von PSP- 48 Toxinen
Tab. 12: Massenspektrometrische Detektion der PSP-Toxine 50
Tab. 13: Chromatographische Bedingungen für die Bestimmung von PSP-Toxinen 54 mittels MS-Detektion
Tab. 14: Ionisierungsparameter für die massenspektrometrische Detektion von PSP- 54 Toxinen bei 30% Acetonitril im Eluenten
Tab. 15: Linearität und LODs (S/N = 3:1) der MS-Detektion von PSP-Toxinen 55 (5 Kalibrierpunkte)
Tab. 16: Anteil der einzelnen Muschel- und Schneckengewebe am Gesamtgewicht 71
Verzeichnis der Tabellen im Anhang
Tab. 17: Einzelergebnisse des Vergleiches zwischen der optimierten Thielert- und 118 der neu entwickelten HPLC-Methode (in ng/µL Probenextrakt)
Tab. 18-43: Einzeldaten des in vivo Fütterungsexperimentes 122
Tab. 44-46: Einzeldaten des in vitro Inkubationsversuches 132
Verzeichnis der Abkürzungen IX
Verzeichnis der Abkürzungen
Allgemeine Abkürzungen
Abb. Abbildung
ACN Acetonitril
AOAC Association of Official Analytical Chemists
API Atmospheric Pressure Ionisation
ASP Amnesic Shellfish Poisoning
BCR Referenzbüro der Europäischen Gemeinschaften
CE Kapillarelektrophorese
CZE Kapillarzonenelektrophorese
DSP Diarrhetic Shellfish Poisoning
E Entgiftung
ELCD Elektrochemischer Detektor
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
ESI Electrospray Ionisation
FAB-MS Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry
FIA Flow Injection Analysis
FLD Fluoreszenzdetektor
GTX Gonyautoxine
HP Hepatopankreas
HPLC High Performance Liquid Chromatography
ID Innendurchmesser
LD50 Letale Dosis für 50% der Versuchstiere
LC Liquid Chromatography (Flüssigkeitschromatographie)
LOD Limit of detection (Detektionsgrenze)
MD Mitteldarm
MS Massenspektrometrie
MU Mouse Unit (Mauseinheit)
m/z Massenzahl
NMR Nuclear Magnetic Resonance (Kernspinresonanz) Spectroscopy
NSP Neurotoxic Shellfish Poisoning
N-1-H-Toxine STX, GTX2, GTX3, dcSTX, dcGTX2, dcGTX3, B1, C1, C2
N-1-OH-Toxine Neo, GTX1, GTX4, dcNeo, dcGTX1, dcGTX4, B2, C3, C4
PBS-Puffer Phosphate buffer salin
Verzeichnis der Abkürzungen X
PSP Paralytic Shellfish Poisoning
rel. E. relative Einheiten
RP Reversed Phase (Umkehrphase)
SIM Single Ion Monitoring
Tab. Tabelle
TFA Trifluoressigsäure
THF Tetrahydrofuran
TIC Total Ion Current
UV Ultraviolett
Wo Woche
Abkürzungen der PSP-Toxine
Gebräuchlicher Name Chemische Bezeichnung
STX Saxitoxin Saxitoxin
Neo Neosaxitoxin N-1-Hydroxysaxitoxin
GTX1 Gonyautoxin 1 C-11α-Hydroxyneosaxitoxinsulfat
GTX2 Gonyautoxin 2 C-11α-Hydroxysaxitoxinsulfat
GTX3 Gonyautoxin 3 C-11β-Hydroxysaxitoxinsulfat
GTX4 Gonyautoxin 4 C-11β-Hydroxyneosaxitoxinsulfat
dcSTX Decarbamoylsaxitoxin
dcNeo Decarbamoylneosaxitoxin
dcGTX1 Decarbamoyl-C-11α-Hydroxyneosaxitoxinsulfat
dcGTX2 Decarbamoyl-C-11α-Hydroxysaxitoxinsulfat
dcGTX3 Decarbamoyl-C-11β-Hydroxysaxitoxinsulfat
dcGTX4 Decarbamoyl-C-11β-Hydroxyneosaxitoxinsulfat
B1 N-21-Sulfosaxitoxin
B2 N-21-Sulfoneosaxitoxin
C1 N-21-Sulfo-C-11α-Hydroxysaxitoxinsulfat
C2 N-21-Sulfo-C-11β-Hydroxysaxitoxinsulfat
C3 N-21-Sulfo-C-11α-Hydroxyneosaxitoxinsulfat
C4 N-21-Sulfo-C-11β-Hydroxyneosaxitoxinsulfat
1. Einleitung 1
I THEORETISCHER TEIL
1. Einleitung
1.1 Zur Problematik der Algentoxine
Meerestiere und Fische stellen einen delikaten und gesunden Bestandteil der menschlichen Nah-
rung dar. Es ist jedoch bekannt, daß viele Weichtiere mit toxischen Substanzen belastet sein
können, und daß es nach ihrem Verzehr zu Vergiftungen kommen kann 1,2. Viele der giftigen
Spezies treten in Verbindung mit verstärkten Algenblüten auf. Das deutet darauf hin, daß nicht
nur angereicherte anthropogene Schadstoffe (z.B. polyzyklische Kohlenwasserstoffe) und mikro-
bieller Verderb der Lebensmittel, sondern auch die Aufnahme und Akkumulation von Algen-
toxinen durch die Schalentiere Ursache der Muschelvergiftungen sein können 3,4. Mehrere Arten
von Vergiftungen durch Algentoxine sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Die Toxine werden von verschiedenen Spezies des Phytoplanktons synthetisiert 5. Unter optima-
len Bedingungen (Temperatur, Licht, Nährstoff-Konzentration) sind z.B. Mikroalgen zu einer
massenhaften Vermehrung fähig und bilden sogenannte Algenblüten mit mehr als 10 Millionen
Organismen pro Liter Wasser. Durch Filtration des Wassers können sich große Toxinmengen in
Muscheln und durch Sekundärtransfer auch in den nachfolgenden Gliedern der aquatischen Nah-
rungskette anreichern 6,7.
1. Einleitung 2
Tab. 1: Ausgewählte Vergiftungen durch Algentoxine 8,9
Name der Ver-giftung
Toxine Toxinbildner Wirkprinzip Effekt
DSP Okadasäure Dinophysis Inhibierung von Gastrointestinale Diarrhetic Pectenotoxin Prorocentrum Protein- Beschwerden Shellfish Poisoning Yessotoxin Protoceratium phosphatasen PSP Saxitoxin und Alexandrium Blockade von Parästhesien Paralytic Derivate Gymnodinium Natrium-Kanälen Lähmungen Shellfish Poisoning Pyrodinium ASP Domoinsäure Pseudonitzschia Exzitatorischer Gedächtnisver- Amnesic Neurotransmitter lust Shellfish Poisoning Gastrointestinale Beschwerden NSP Brevetoxine Gymnodinium Aktivierung von Parästhesien Neurologic breve Natrium-Kanälen Ichthyotoxisch Shellfish Poisoning Ciguatera Ciguatoxin Gambierdiscus Aktivierung von Parästhesien Maitotoxin toxicus Natrium-Kanälen Gastrointestinale Beschwerden Tetrodotoxin Tetrodotoxin Shewanella alga Blockade von Parästhesien Poisoning und Derivate Natrium-Kanälen Lähmungen Hepatotoxine Nodularin Nodularia Inhibierung von Schädigungen Microcystine Microcystis Protein- der Leber phosphatasen Palytoxin Palytoxin und Ostreopsis Zerstörung von Hämolyse Poisoning Derivate Zellen Spirolide Verschiedene Alexandrium unbekannt Neurotoxische Spirolidderivate ostenfeldii Wirkungen AZP Verschiedene unbekannt unbekannt Gastrointestinale Azaspiracid Azaspirazid- Beschwerden Poisoning derivate
1. Einleitung 3
Obwohl von toxischen Algenblüten seit langer Zeit berichtet wird 10, deutet sich eine Zunahme
ihres Auftretens an, welche nicht nur auf eine intensivere Überwachung zurückzuführen ist. Die
Frequenz, Intensität und Dauer spontaner Massenvermehrungen von Mikroalgen scheinen sich
zu erhöhen und toxische Algen in neue geographische Gebiete vorzudringen. Als Hauptursache
für die Stimulation von Algenblüten werden die zunehmende Verschmutzung und Eutrophierung
von Gewässern sowie Klimaveränderungen verantwortlich gemacht 11-13. Der Transport von
Dauerformen (Cysten) im Ballastwasser von Schiffen und die Versetzung von mit Cysten
infizierten Muschelstöcken im Rahmen der Aquakultur ermöglichen die Ausbreitung toxischer
Spezies in bisher unbetroffene Gebiete 14-16.
1.1.1 PSP-Toxine
1.1.1.1 Vorkommen
PSP-Toxine werden von marinen Dinoflagellaten der Gattungen Alexandrium, Gymnodinium
und Pyrodinium produziert 17. Dinoflagellaten sind einzellige, 20-200 µm große, Photosynthese
betreibende Meeresalgen. Sie treten in kugelförmiger Gestalt auf, mit einem quer und längs
gefurchten, aus 4 apikalen Zelluloseplatten zusammengesetzten Panzer mit kleinen Farbkörper-
chen, welche die Zelle rotbraun färben 18,19.
Die Anpassung an eine Vielzahl unterschiedlicher Milieus ermöglicht diesen Mikroalgen eine
weltweite Verbreitung von gemäßigten bis tropischen Küstengewässern (Abb. 1). Dabei besitzen
die zur PSP-Produktion befähigten Arten unterschiedliche Verbreitungsschwerpunkte. An der
Westküste Nordamerikas und der Küste Japans dominiert Alexandrium catenella, während im
Atlantik, an der Ostküste Nordamerikas und in Europa Alexandrium tamarensis die vorherr-
schende Spezies darstellt. Pyrodinium bahamense ist dagegen eine charakteristische Alge
tropischer Gewässer. Gymnodinium catenatum tritt vorzugsweise im Mittelmeer, an der Atlantik-
küste Südeuropas und Marokkos sowie in Mexiko und Argentinien auf 19,20.
Neben Dinoflagellaten werden PSP-Toxine auch von einigen Cyanobakterien-Arten synthetisiert
(Abb. 2). Als Verursacher giftiger Wasserblüten sind in Nordamerika und Europa Aphanizome-non flos-aquae und Lyngbya wollei sowie Anabaena circinalis in Australien identifiziert worden 21-23. Eine Gefährdung des Menschen kann auch hier nicht ausgeschlossen werden, obwohl
bisher nur bei Haustieren Fälle von Vergiftungen beobachtet wurden 24.
1. Einleitung 4
Abb. 1: Weltweite Verbreitung von PSP-Toxinen (schwarz markierte Regionen) 20,25
Die Toxinprofile der PSP-Produzenten sind von der Genetik und den Umweltbedingungen ab-
hängig, und sie können stark voneinander abweichen 26-29.
Seit einigen Jahren wird eine mögliche Produktion von PSP-Toxinen durch mit Dinoflagellaten
assoziierten Bakterien kontrovers diskutiert. Die breite Variation der toxischen Potenz in Algen-
kulturen sowie das Vorkommen von toxischen und nichttoxischen Stämmen der gleichen Spezies
suggerieren die Anwesenheit eines gemeinsamen Vektors in Form eines bakteriellen Kontami-
nanten 30,31. Teilweise konnten Bakterien von toxischen Algen isoliert werden, die PSP-Symp-
tome bei Mäusen hervorriefen und durch Kreuzimpfung in nichttoxischen Dinoflagellaten Toxi-
zität erzeugten 32-34. Andere in vitro Untersuchungen ergaben jedoch, daß die geringe Toxizität
dieser Organismen nicht für eine Erklärung hoher Toxizitäten in Algen und Muscheln ausreicht,
und meist fand keine weitere PSP-Produktion in den isolierten Bakterienkulturen statt. Auch
zeigte sich, daß einige toxische Algen keine Bakterien enthielten, diese aber dennoch im Labor-
versuch PSP-Toxine bildeten 35-38.
1. Einleitung 5
Alexandrium tamarensis Aphanizomenon flos-aquae Pyrodinium
bahamense
Anabaena circinalis Lyngbya wollei Gymnodinium
catenatum Abb. 2: Verschiedene PSP-Produzenten 39,40
Die Toxizität von Schalentieren ergibt sich aus einem komplexen Prozess über die Aufnahme
durch Filtration und die Verdauung toxischer Algen sowie der anschließenden Akkumulation,
Biotransformation (vgl. Kap. 1.1.1.2) und Detoxifikation der PSP-Toxine. Dabei weisen einzelne
Muschelarten eine unterschiedliche Sensitivität bei der Aufnahme toxischen Phytoplanktons auf 41. Außerdem sind sie in der Lage, Toxine über einen unterschiedlich langen Zeitraum zu spei-
chern, womit die Anreicherung von PSP-Toxinen ein seltenes Beispiel für die Akkumulation
wasserlöslicher Stoffe in der Nahrungskette darstellt 42. Als Speichermechanismen werden hier-
bei neben physikalischer Adsorption die Bindung an nichtspezifische Proteine (z.B. Melanin)
diskutiert 43-45. Hauptspeicherort ist der Verdauungsapparat, aber auch Siphon, Ovar, Kiemen
und Muskelfleisch können PSP-Toxine enthalten 42,46,47.
Neben der Kontamination von Muscheltieren findet ein Transfer von PSP-Toxinen zu höheren
Gliedern der aquatischen Nahrungskette wie Schnecken, Tintenfische, Krabben, Seesterne,
Hummer und, ausgehend vom Phytoplankton, über das Zooplankton bis zu Krebsen und Fischen
statt 6,48,49.
1. Einleitung 6
1.1.1.2 Chemische Struktur, Eigenschaften und Biosynthese
Der bekannteste Vertreter der PSP-Toxine ist Saxitoxin. Es war das erste Toxin, das 1957 aus
der in Alaska heimischen Venusmuschel Saxidomus giganteus isoliert wurde und von ihr den
Namen erhielt 50,51. Erst 1975 gelang die Strukturaufklärung nach Berechnung der Kristall-
struktur durch Schantz et al. 52,53. Mittels röntgenkristallographischer Analyse wurde das para-
Brombenzolsulfonsäure-STX-Derivat als heterozyklisches Tetrahydropurin-Alkaloid charakteri-
siert. Die 20 weiteren bisher isolierten PSP-Toxine lassen sich strukturell von Saxitoxin ableiten
(Abb. 3).
Charakteristisch für PSP-Toxine sind ein hoher Stickstoffanteil (35%), zwei Guanidinogruppen
sowie eine hydratisierte Carbonylfunktion am C12-Atom.
Während die Totalsynthese von STX bereits kurz nach dessen Strukturaufklärung gelang, ist nur
wenig über die Biosynthese der PSP-Toxine bekannt 54. Fütterungsexperimente mit radioaktiv
markierten Kohlenstoff- und Stickstoffverbindungen deuten auf eine Synthese des Grundkörpers
aus Arginin und Acetat hin 55-57. Der Syntheseprozeß, die involvierten Enzyme und die bio-
chemische Funktion der PSP-Toxine sind bisher jedoch noch ungeklärt.
PSP-Toxine sind stark hygroskopisch, sehr leicht löslich in Wasser, löslich in Methanol und
Ethanol, jedoch nahezu unlöslich in anderen organischen Lösungsmitteln. Im schwach sauren
Milieu sind sie stabil, aber unter alkalischen Bedingungen leicht oxidierbar.
PSP-Toxine zeigen weder eine UV-Absorption bei Wellenlängen über 220 nm noch eine natür-
liche Fluoreszenz.
Durch Variationen des Restes R4 werden 4 Gruppen von PSP-Toxinen unterschieden: N-Sulfo-
carbamoyl-, Carbamoyl-, Decarbamoyltoxine und Deoxydecarbamoyltoxine. Die unterschied-
liche Besetzung der Reste R1-R3 mit Wasserstoff-, Hydroxy- und Sulfatgruppen unterteilt wie-
derum jede dieser Gruppen in weitere verwandte Verbindungen. Mit der Konfiguration der Reste
ist die Stabilität und Toxizität der PSP-Toxine eng verbunden 58,59.
Alle Carbamoyltoxine reagieren basisch, da ihre Guanidinogruppen im physiologischen pH-
Bereich in protonierter Form vorliegen. Allerdings nimmt ihre Basizität von STX über Neo
(jeweils doppelt positiv geladen) zu den Gonyautoxinen (eine positive Nettoladung) ab.
Die Titration von STX ergab Dissoziationspunkte an pKa 8,22 und 11,28, während die pKa-
Werte von Neo bei 6,75 und 8,65 liegen 58,60.
Die Gonyautoxine zeigen Epimerisierungen am C11-Atom, wobei das Gleichgewicht zwischen
den α- und β- Epimeren im sauren Milieu ungefähr 3:1 beträgt 58.
1. Einleitung 7
Toxin R1 R2 R3 R4 Molekulargewicht [g/mol]
STX H H H 301 NEO OH H H 317 GTX1 OH H OSO3
- H2N-COO 412 GTX2 H H OSO3
- (Carbamoyl-) 396 GTX3 H OSO3
- H 396 GTX4 OH OSO3
- H 412 B1 H H H 380 B2 OH H H 396 C3 OH H OSO3
- -O3S-NH-COO 492 C1 H H OSO3
- (N-Sulfo- 476 C2 H OSO3
- H carbamoyl-) 476 C4 OH OSO3
- H 492 dcSTX H H H 258 dcNEO OH H H 274 dcGTX1 OH H OSO3
- OH 369 dcGTX2 H H OSO3
- (Decarbamoyl-) 353 dcGTX3 H OSO3
- H 353 dcGTX4 OH OSO3
- H 369 doSTX H H H H 242
doGTX2 H H OSO3- (Deoxy- 337
doGTX3 H OSO3- H decarbamoyl-) 337
Abb. 3: Chemische Struktur von Saxitoxin und verwandten Verbindungen
Die Decarbamoyltoxine leiten sich chemisch von den Carbamoyltoxinen durch Abspaltung der
Carbamatgruppe ab. So entsteht unter Einwirkung von 7,5 N Salzsäure bei 110°C dcSTX aus
STX mit einer Ausbeute von 75% 61. Dc-Toxine zeichnen sich durch eine hohe chemische und
enzymatische Stabilität aus 58.
1. Einleitung 8
Analog den Decarbamoyltoxinen lassen sich auch die N-Sulfocarbamoyltoxine von den Carba-
moyltoxinen ableiten. Sie reagieren jedoch kaum noch basisch, da ihre Guanidinogruppen
deprotoniert vorliegen. Bei pH-Werten von 7-9 tragen C3 und C4 sogar eine Nettoladung von
–1. Im sauren Milieu sind N-Sulfocarbamoyltoxine instabil und ausgesprochen hydrolyse-
empfindlich 58,62.
Erst in den letzten Jahren wurde eine weitere Gruppe von PSP-Toxinen diskutiert, und zwar die
der Deoxydecarbamoyltoxine. Die in der australischen Population von Gymnodinium catenatum
nachgewiesenen doSTX, doGTX2 und doGTX3-Toxine stellen bisher die einzigen bekannten
Vertreter dieser Gruppe dar 63,64.
Abb. 4: Übersicht der in vivo Transformationen von PSP-Toxinen in Schalentieren (vgl. Abb. 3
für individuelle Toxinstruktur). 1. Epimerisierung von β zu α- Epimeren; 2. Reduktion: (a) von GTX1/4 und Neo zu GTX2/3 und STX, (b) von GTX1-4 zu STX und Neo; 3. Saure Hydrolyse; 4. Enzymatische Hydrolyse: Umwandlung von N-Sulfocarbamoyl- (4a) oder Carbamoyltoxinen (4b) zu Decarbamoyltoxinen 42
+ 10 11
OH
OH
H2N
NH
N
-OSO3
N
NH
H2N
OH
OH
10 11+
H
(Cys, GLH etc.)Reduktion
2b
HNH
1N
O+
13
O
H2N
O
13
+
O
N1
H NH
13
+
N1
H NH
HONH
O3S- 21
Muschelenzym
Muschelenzymneutraler pH
niedriger pH
4b
4a
3
N
NH
H2N
OSO3
H
OH
OH
10 11 neutraler pH
1
+ + 10 11
OH
OH
HOSO3
H2N
NH
N
--
+
O
NHO 1
H NH
Reduktion(Cys, GLH etc.)
2aO
H2N H2N
OH
O
N 1
H NH
1. Einleitung 9
Theoretisch können von nahezu allen PSP-Toxinen mit -CO-NH2, -OH, -H und -SO3- –Gruppen
an den C-Atomen des Puringrundgerüstes Metabolite gebildet werden, wobei die Umwandlun-
gen der PSP-Toxine durch Umlagerungen und/oder Abspaltungen das Ergebnis biochemischer
Prozesse in höheren Gliedern der marinen Nahrungskette sind (Abb. 4). Die instabilen N-Sulfo-
carbamoyltoxine und 11β-Epimere der Gonyautoxine bilden die Hauptkomponenten in verschie-
denen Algenspezies 55,63. Nach der Aufnahme der Toxine in Muscheln können sowohl Epimeri-
sierungen als auch Dehydroxylierungen, Esterspaltungen und teilweise sogar Decarboxylierun-
gen erfolgen 42,65,66. So können in Muscheln durch Epimerisierung der OSO3--Gruppe am
C11-Atom die instabileren β-Formen C2, GTX3 und GTX4 in die stabileren α-Formen C1,
GTX2 und GTX1 überführt werden, und durch Spaltung der Esterbindung durch O-Sulfatase und
N-Hydroxylase entsteht aus den Gonyautoxinen und Neo das STX.
Daneben bewirken natürlich vorkommende chemische Reduktanden mit SH-Gruppen, wie
Glutathion und Cystein, unter anaeroben Bedingungen eine Metabolisierung. Beispiele hierfür
sind die Reduktion der N-1-OH-Gruppe zu N-1-H und die Umwandlung der Gonyautoxine zu
Neo bzw. STX durch Abspaltung der OSO3--Gruppe am C11-Atom.
Die Bildung von Carbamoyl- und Decarbamoyltoxinen aus N-Sulfocarbamoyltoxinen ist enzy-
matisch und durch saure Hydrolyse möglich.
1.1.1.3 Toxizität
Gegenüber DSP, ASP und NSP nehmen die durch PSP-Toxine verursachten Muschelvergiftun-
gen einen drastischeren und schnelleren Verlauf (Tab. 1). Als primäre Symptome treten periphe-
re Parästhesien auf. Innerhalb von 5-30 min nach dem Verzehr kontaminierter Muscheln entwik-
keln sich Kribbeln und brennende Empfindungen um Lippen, Zunge und Gesicht mit fortschrei-
tender Ausbreitung in den Nacken sowie in die Arme, Finger, Beine und Zehen, die sich später
in Taubheit und Lähmungen umwandeln. Der Verlust der Muskelkoordination wird begleitet von
Gleichgewichtsstörungen, Kreislaufschwäche sowie Artikulations- und Schluckschwierigkeiten.
Bei höheren Dosen kann sich die Paralyse auf die Atemmuskulatur ausdehnen und innerhalb von
2-12 Stunden zum Tod führen. Sofern der Vergiftete die ersten 24 Stunden überlebt, ist die
Prognose günstig, und es kann von einer vollständigen Rekonvaleszenz ohne erkennbare Dauer-
schäden ausgegangen werden. Bis heute existiert kein Antidot; nur durch Unterstützung der
Atmung und rechtzeitiger Verabreichung von Laxantien kann der Patient die kritischen Stunden
überstehen 58,67,68.
1. Einleitung 10
PSP-Toxine wirken vor allem in Warmblütern, wobei die einzelnen Tierarten Unterschiede in
ihren Empfindlichkeiten zeigen. In Tabelle 2 sind einige LD50-Werte für Warmblüter dargestellt.
Tab. 2: LD50-Werte von PSP-Toxinen nach einmaliger oraler Verabreichung 69 Tier LD50 µg PSP/kg Körper-
gewicht Tier LD50 µg PSP/kg Körper-
gewicht
Maus Affe Hase Meerschwein
260-263 277-800 181-200 128-135
Ratte Katze Hund Taube
192-212 254-280 180-200 91-100
Der Mensch reagiert verhältnismäßig empfindlich auf PSP-Toxine. Die für ihn ermittelten LD50-
Werte liegen zwischen 15 und 50 µg Toxin/kg Körpergewicht, so daß eine Dosis von ca. 1-4 mg
PSP-Toxine für einen erwachsenen Menschen tödlich sein kann. Eine gewisse Resistenz kann
durch die häufige Aufnahme kleiner Mengen an PSP-Toxinen erzeugt werden. Personen, die
regelmäßig Muscheln konsumieren, entwickeln somit eine Toleranz gegenüber Dosen, die bei
empfindlichen Menschen bereits schwere Symptome hervorrufen 70,71.
PSP-Toxine sind potente Nervengifte, welche die Erregungsleitung in Nerven- und Muskelzellen
blockieren. Die Reizübertragung erfolgt über Aktionspotentiale, die durch Änderungen im Ver-
hältnis von Natrium- und Kalium-Ionen an erregbaren Membranen erzeugt und über sie weiter-
geleitet werden. Wird eine Nervenzelle erregt, ändert sich die Permeabilität der Membranen für
Na+-Ionen. Durch spezifische Na-Kanäle strömen Na+-Ionen in die Zelle ein und bewirken eine
Depolarisation der Zellmembran (Aufbau des Aktionspotentials). PSP-Toxine sind in der Lage,
reversibel die Na-Kanäle zu blockieren und so die Entstehung und Weiterleitung von neuronalen
Impulsen zu verhindern 72,73.
Nach dem Bindungsmodell von Shimizu assoziieren die Guanidinogruppen der PSP-Toxine mit
anionischen Zentren auf der Membranoberfläche, während die geminalen Diolgruppen am
C12-Atom Wasserstoffbrücken zu Zentren mit hoher Elektronegativität ausbilden (Abb. 5) 74.
Daraus leiten sich auch die beträchtlichen Unterschiede in der toxischen Potenz der einzelnen
PSP-Toxine ab. Differenzen im Molekülaufbau, wie die Zahl der positiven Guanidinogruppen
und die chemische Struktur der Seitenkette, haben Einfluß auf die Stabilität der Anlagerung an
die Zelloberfläche 75-77.
Carbamoyltoxine, insbesondere STX und Neo, zeigen die höchste Toxizität aller PSP-Toxine, da
bei ihnen die Bindung an die Membranoberfläche am stärksten ausgebildet werden kann. Im
Vergleich dazu weisen die dc-Toxine eine deutlich geringere Toxizität auf.
1. Einleitung 11
Die Anwesenheit von Sulfatestern in der Seitenkette bewirkt aufgrund der zwischen der negativ
geladenen Sulfatgruppe und den anionischen Gruppen auf der Membranoberfläche auftretenden
Abstoßungskräfte einen weiteren Verlust der toxischen Aktivität.
Abb. 5: Modell zur Bindung von PSP-Toxinen an die Oberfläche erregbarer Nervenmembranen 78
Zur besseren Vergleichbarkeit der individuellen Toxizitäten wurden sogenannte STX-
Äquivalente (STXeq) mit STX als Bezugsgröße eingeführt. 1,0 mg STX entspricht 5500 Maus-
einheiten (MU, vgl. Kap. 1.2.1.1), so daß 1 MU 0,18 µg STX äquivalent ist 79. Die Toxizitäten
sind in Tabelle 3 dargestellt.
Nervenzelle außen
Signal
Nervenzelle innen
Na-Kanal
Carbamoyltoxin (STX)
Na+
1. Einleitung 12
Tab. 3: Toxizitäten der PSP-Toxine 79
Toxin MU/µmol µg STXeq/µmol Relative Toxizität
STX Neo
GTX1 GTX2 GTX3 GTX4 dcSTX dcNeo
dcGTX1 dcGTX2 dcGTX3 dcGTX4
B1 B2 C1 C2 C3 C4
2100 2300 1900 1000 1600 1900 900 900 950 380 380 950 150 150 17 -
17 -
378 414 342 180 288 342 162 162 171 68 68
171 27 27 <1 - 1 -
100 110 90 48 76 90 43 43 45 18 18 45 7 7
<1 - 1 -
1.1.1.4 Gesetzliche Regelungen
Schalentiere sind wichtige, kommerziell genutzte Nahrungsmittellieferanten in der ganzen Welt.
Die PSP-Belastung in vielen Bereichen der marinen Nahrungskette stellt somit ein ernstzu-
nehmendes Risiko für die öffentliche Gesundheit dar. Dabei ergibt sich das Problem, daß
toxische Muscheln am Phänotyp nicht erkennbar sind, die tödliche Dosis nur wenige Milligramm
beträgt und kein Antidot für die kochstabilen PSP-Toxine existiert. Verheerend sind auch die
Auswirkungen auf Aquakulturen und die verarbeitende Industrie, denn die Ernte ökonomisch
relevanter Spezies wird oft über Monate bis Jahre verhindert 46,80.
Um den Verbraucher gesundheitlich unbedenkliche, d.h. toxinfreie Ware anzubieten, haben 21
Länder (USA, Kanada, einige Länder Mittelamerikas und Ozeaniens, Australien, Japan, Süd-
korea und die meisten europäischen Länder) Monitoring-Programme und Regelungen zur Kon-
trolle bestimmter Algenspezies und/oder Muscheln eingeführt, wobei sich als geduldete Höchst-
mengen 40-80 µg PSP bzw. STXeq/100g Muschelfleisch in den meisten Ländern durchsetzte.
Als Analysenverfahren ist der Maus-Bioassay, unterstützt von der HPLC, vorgeschrieben. Bei
Grenzwertüberschreitungen erfolgen ein sofortiger Stop und die Vernichtung der belasteten Ern-
te sowie die Verhängung von Export- bzw. Importverboten 81,82. In einigen Ländern werden die
Art und Anzahl der Algen pro Liter Wasser in regelmäßigen Abständen kontrolliert. Beim
vermehrten Auftreten von potentiell giftigen Algenarten werden die Untersuchungsabstände
1. Einleitung 13
verkürzt und nach Erreichen einer Obergrenze an Dinoflagellaten pro Liter Wasser die Ernte von
Muscheln untersagt 80,83.
Nach Einführung der Monitoring-Programme ging die Anzahl der Vergiftungen stark zurück.
Einzelne Fälle traten dann meist nach Mißachtung offizieller Warnungen auf.
In den Küstengebieten der Bundesrepublik Deutschland wurde seit Jahren keine massenhafte
Vermehrung PSP-produzierender Algen mehr beobachtet, so daß PSP-Analysen stets negative
Ergebnisse erbrachten 84. Nachdem es aber mehrfach zu Vergiftungsfällen nach dem Verzehr
PSP-belasteter importierter Muschelkonserven gekommen war, legte der deutsche Gesetzgeber
in der Fisch-Verordnung vom 8. August 1988 einen Grenzwert für PSP-Toxine von 40 µg/100 g
Schalentierfleisch fest 85,86. Dieser Wert wurde am 31. März 1994 im §16 der neuen Fisch-
hygiene-Verordnung auf 80 µg/100 g Lebensmittel korrigiert 87. Als Untersuchungsverfahren ist
ein fluorimetrisches Verfahren vorgeschrieben, und bei positivem Befund soll eine Absicherung
durch den Bioassay oder eine HPLC-Methode erfolgen 88.
Die Europäische Union harmonisierte in ihrer am 1. Januar 1993 in Kraft getretenen EU-
Verordnung 91/492/EEU die Bedingungen für die Produktion und den Verkauf von lebenden
Mollusken, inklusive PSP-Höchstmengen und Überwachungsmethoden.
1.2 Analytische Erfassung von PSP-Toxinen
Die Einhaltung der gesetzlichen Regelungen zum Schutz der Gesundheit durch Kontrollen und
Monitoring-Programme sowie die Durchführung von Forschungsvorhaben auf dem Gebiet der
PSP-Toxine erfordern entsprechende analytische Methoden, mit denen die Phytotoxine eindeutig
nachgewiesen und quantifiziert werden. Dazu stehen eine Vielzahl biologischer, biochemischer
und chemischer Verfahren zur Verfügung, für deren Einschätzung die Unterteilung in nicht-
chromatographische und chromatographische Bestimmungsmethoden von Vorteil ist.
Nichtchromatographische Verfahren, zu denen Bioassays, Immunoassays und fluorimetrische
Assays zählen, erlauben, mit Ausnahme der Kapillarelektrophorese, nur die summarische Erfas-
sung mehrerer PSP-Toxine (Gesamttoxizität).
Um Aussagen über individuelle Toxinkomponenten zu treffen, wurden in den letzten 15 Jahren
chromatographische Verfahren entwickelt, die es gestatten, einzelne Verbindungen empfindlich
und eindeutig nachzuweisen.
1. Einleitung 14
Während die summarisch arbeitenden Bestimmungsmethoden beim schnellen routinemäßigen
Erfassen des vom Probenmaterial ausgehenden Gefährdungspotentials vorteilhaft einsetzbar
sind, ermöglichen chromatographische Verfahren Aussagen zur Entstehung toxischer Algen-
blüten und zum Verbleib der PSP-Toxine in der marinen Nahrungskette.
1.2.1 Nichtchromatographische Bestimmungsverfahren
1.2.1.1 Bioassays
Den Grundstein zur PSP-Bestimmung legten 1937 Sommer et al. mit der Entwicklung des Maus-
Bioassays 89. Dieses Verfahren wurde von der Association of Official Analytical Chemists
(AOAC) standardisiert und bildet noch heute die Basis vieler Monitoring-Programme 81,90.
Das zu untersuchende Probenmaterial wird nach Homogenisierung und Zugabe von 0,1 N Salz-
säure erhitzt (5 min Wasserbad), anschließend auf einen pH-Wert von 2-4 eingestellt und zentri-
fugiert. Der saure Extrakt wird den Mäusen intraperitoneal injiziert und die Zeit bis zum Tod der
Tiere gemessen. Parallel hierzu wird die Kalibrierung mit einer STX-Standardlösung durchge-
führt.
Bei logarithmischem Auftrag der STX-Dosis gegen den reziproken Wert der Zeit bis zum Tod
der Versuchstiere ergibt sich eine lineare Abhängigkeit. Das Optimum der Analysengenauigkeit
wird erreicht, wenn der Tod zwischen der 5. und 8. Minute eintritt. Hochtoxische Extrakte
müssen dementsprechend verdünnt werden.
Eine Mauseinheit (MU) wird als die Menge an Toxin definiert, die ausreicht, eine 20 g schwere,
weiße, männliche Maus innerhalb von 15 min zu töten, wenn 1 mL des sauren Probenextraktes
injiziert wird. 1 MU entspricht 0,18 µg Saxitoxin. Die Nachweisgrenze des Maus-Bioassays liegt
mit ca. 400 µg STXeq/kg Muschelfleisch nahe der in vielen Ländern gesetzlichen Höchstmenge
(vgl. Kap. 1.1.1.4) 91.
Neben der geringen Empfindlichkeit des Maus-Bioassays ist die große Streuung der Ergebnisse
von bis zu 20% von Nachteil. Insbesondere hochtoxische Extrakte können stark variierende
Ergebnisse liefern, und die Feststellung des Todeszeitpunktes einer Maus ist zudem mit
Unsicherheiten behaftet 92. Auch unterdrücken hohe Salzkonzentrationen, wie sie in Muschel-
konserven zu finden sind, die toxischen Effekte und können zu Fehlinterpretationen führen 93.
Verläßliche Aussagen sind nur bei Einsatz einer großen Anzahl von Versuchtieren zu erhalten,
deren Haltung mit erheblichem Aufwand verbunden ist.
1. Einleitung 15
Beim Bioassay mit erregbaren Muskelfasern der Ratte wird die Eigenschaft der PSP-Toxine,
selektiv und reversibel die Natriumkanäle zu blockieren, genutzt. Dieser Test gestattet die
getrennte Messung einzelner Toxine, da die durch das jeweilige Toxin ausgelöste Reaktion einer
spezifischen Toxizität entspricht. Die Analyse von Toxinmischungen jedoch erfordert einen sehr
großen Aufwand 58.
Der wachsende Widerstand gegen Tierversuche führte zur Entwicklung von Bioassays unter
Verwendung von Invertebraten wie Austernembryonen und Fischlarven bzw. zu in vitro Zell-
kultur-Assays mit Neuroblastoma-Zellen, Rezeptor-based Assays und Voltage-clamp Verfahren 94-98.
1.2.1.2 Immunologische Assays
Immunoassays zählen zu den biochemischen Techniken, die auf einer Erkennung der Toxine auf
molekularer Ebene beruhen.
Für Immunoassays werden aus Versuchstieren, die zuvor mit der zu untersuchenden Substanz
immunisiert wurden, Antikörper gewonnen. Diese Antikörper dienen im eigentlichen Test dann
als substratspezifische Erkennungssubstanzen. Die spezifischen Antikörper für STX werden aus
mit einem kovalent gebundenen Protein-STX-Komplex immunisierten Kaninchen erhalten.
Im Testsystem werden die Antigene auf einer Mikrotiterplatte fixiert. Anschließend wird die
STX-Standardlösung bzw. die Probenlösung gemeinsam mit einer Verdünnung der Antikörper
ebenfalls auf die Platte aufgebracht und die Menge der an die Antigene gebundenen Antikörper
bestimmt, indem Ziege-Antikaninchen-IgG-Peroxidase-Konjugat zugegeben und inkubiert wird.
Dabei bildet sich entsprechend der gebundenen Enzymmenge ein farbiges Reaktionsprodukt, das
spektralphotometrisch bestimmbar ist. Die Nachweisgrenze des Tests liegt bei 0,1-0,5 ng
STX/mL für Standardlösungen und damit deutlich unterhalb der des Maus-Bioassays.
Dieser von Chu et al. entwickelte enzymgekoppelte Immunoassay (ELISA) wurde bis heute
mehrfach modifiziert und bietet Vorteile aufgrund der schnellen Durchführbarkeit und geringerer
Kosten 99-101.
Daneben finden sogenannte Radioimmunoassays (RIA) Anwendung, bei denen die Mikro-
titerplatten mit STX-Antikörpern und radioaktiv markiertem STX (STX-H3) präpariert sind. Der
RIA ist ein kompetitiver Assay, bei dem das STX der zugegebenen Probe mit dem radioaktiven
STX um die Bindungsstellen der Antikörper konkurriert. Die Menge des nichtgebundenen
STX-H3 ist proportional dem STX in der Probe und wird mit einem Scintillator ermittelt 102.
1. Einleitung 16
Beide Verfahren weisen nur eine geringe Bindungsspezifität für STX auf, und es kommt zu
Kreuzreaktionen mit anderen PSP-Toxinen, insbesondere mit Neo und dcSTX 103. Die geringe
Empfindlichkeit des Testes bei der Analyse PSP-haltiger Muschelextrakte sowie die geringe
Affinität der Antikörper für andere PSP-Toxine als STX limitieren den Einsatz von immuno-
logischen Assays bei Routinemessungen 103,104.
1.2.1.3 Fluorimetrische Verfahren
Eine wesentliche Voraussetzung zur Entwicklung chromatographischer Bestimmungsverfahren
(vgl. Kap. 1.2.2) war die Entwicklung eines Verfahrens zur Oxidation des Saxitoxins im Alka-
lischen zu fluoreszierenden Produkten mit nachfolgender fluoreszenzspektrometrischer Bestim-
mung durch Bates und Rappoport 105,106.
Bei der Oxidation der PSP-Toxine in alkalischer Lösung kommt es zu einem Bruch der C12/C4-
Bindung mit anschließender Reorganisation des Moleküls zu einem planaren aromatischen
System (8-Amino-6-hydroxymethyl-2-aminopurin-3-propionsäure). Wird die Reaktionslösung
danach angesäuert, resultiert eine stark erhöhte Fluoreszenz, da sich im Sauren (pH 5) das
korrespondierende Laktam (ein Pyrimidinopurin) bilden kann (Abb. 6). Die Fluoreszenzmessung
erfolgt bei Wellenlängen von 330 nm (Ex.) und 390 nm (Em.).
sauer alkalisch Abb. 6: Oxidation von Saxitoxin
HN
NH2N
O
O
H2N
N
NNH2
H
+
HOH
OH
NaOH
H2O2
N
N+H2N
HO
N
NNH2
COOH
H
H
H
N
N
N
NNH2
N
O
OH
H
H
H+
1. Einleitung 17
Das anfänglich als Oxidationsagens eingesetzte H2O2 wurde später aufgrund höherer Fluores-
zenzausbeuten für N-1-OH-Toxine durch Perjodsäure ergänzt bzw. substituiert 107,108.
Um eine niedrige Erfassungsgrenze zu gewährleisten und falsch-positive Ergebnisse durch inter-
ferierende Matrixbestandteile weitgehend auszuschließen, wurden PSP-haltige Extrakte zunächst
an Kationenaustauschern gereinigt 88,106. Allerdings kann ohne Auftrennung der PSP-Gemische
vor der Fluoreszenzmessung die Bestimmung der Gesamttoxizität aufgrund der unterschied-
lichen Fluoreszenzintensitäten der PSP-Toxine (die nicht mit den relativen Toxizitäten korrelie-
ren) nur semiquantitativ erfolgen (Tab. 4).
Tab. 4: Relative Fluoreszenzintensitäten und relative Toxizitäten der PSP-Toxine 79,109
Toxin Rel. Fluoreszenz Rel. Toxizität Toxin Rel. Fluoreszenz Rel. Toxizität
STX 1,00 1,00 Neo 0,04 – 0,30 1,10 GTX1 0,05 0,90 GTX2 1,80 0,48 GTX3 1,80 0,76 GTX4 0,05 0,90
dcSTX 0,71 – 0,42 0,43 B1 0,41 0,07 B2 0,05 0,07 C1 0,48 <0,01 C2 0,48 0
1.2.1.4 Kapillarelektrophorese
Das Trennprinzip der Elektrophorese beruht auf der unterschiedlichen Migration von geladenen
Teilchen in Abhängigkeit vom pH-Wert in einem elektrischen Feld.
Bei der Kapillarelektrophorese (CE) findet die Elektrophorese in engporigen, puffergefüllten
Quarzkapillaren (25-100 µm ID) mit einer Länge von 0,2-2 m statt.
Wird eine hohe Spannung angelegt (20-30 kV), bewegen sich die Komponenten der Probe in
Abhängigkeit von ihrer Größe und Ladung durch die Trennkapillare und können anschließend
detektiert werden. Überlagert wird diese Migration vom elektroosmotischen Fluß (EOF), der bei
der PSP-Trennung eine kathodengerichtete Strömung des Puffers darstellt und durch die Ladun-
gen an der inneren Kapillarwand verursacht wird 110.
Wegen der einfachen Handhabung und Vielseitigkeit ist die Kapillarzonenelektrophorese (CZE)
die meistgenutzte Variante der CE, die vor allem bei der Trennung von kleineren, wasser-
löslichen Molekülen, wie die der PSP-Toxine, zum Einsatz kommt 111. Bei der CZE ist die
Kapillare nur mit Pufferlösung gefüllt, und die Trennung erfolgt durch Migration in diskreten
Zonen mit verschiedenen Geschwindigkeiten. Dadurch wird auch die gleichzeitige Analyse von
unterschiedlich geladenen Substanzen ermöglicht (Abb. 7) 110.
1. Einleitung 18
Nach dem Prinzip der CZE eluieren somit zuerst die zweifach positiv geladenen Carbamattoxine
STX, Neo, dcSTX, nachfolgend die Gonyautoxine und B-Toxine vor den C-Toxinen. Die Selek-
tivität in der CZE kann sehr leicht durch Änderung des pH-Wertes des Puffers und der angeleg-
ten Spannung sowie durch Zusatz von Additiva variiert werden 110,112.
Abb. 7: Prinzip der Kapillarzonenelektrophorese 110
Die Kapillarelektrophorese ist eine relativ neue Technik, welche eine hohe Trennleistung auf-
weist. Sie ermöglicht einen hohen Grad an Automatisierung und die Kopplung an moderne
Detektoren auf der Basis der laserinduzierten Fluoreszenz und an das Massenspektrometer 113-118.
CE-Trennungen erfordern hoch gereinigte Extrakte, um reproduzierbare Trennungen zu erhalten.
Außerdem resultiert die Begrenzung auf sehr kleine Probenvolumina in einer um mehrere
Größenordungen geringeren Sensitivität der CE/MS im Vergleich zur HPLC mit Fluoreszenz-
detektion (vgl. Kap. 1.2.2.3.1) 119.
Verbesserungen der Nachweisgrenzen für PSP-Toxine lassen sich durch eine Vorkonzentrierung
mittels Kapillarisotachophorese (CITP) und einem diskontinuierlichen Puffersystem vor der CZE
erreichen 120,121. Die CITP stellt eine Kombination von 2 Puffersystemen dar, bei der die einzel-
nen Fraktionen mit abnehmender elektrophoretischer Mobilität hintereinander mit der gleichen
Geschwindigkeit wandern. Die Zonen befinden sich dabei sandwichartig zwischen dem vorlau-
fenden („leading“) und dem abschließenden („terminating“) Elektrolyten 110.
1. Einleitung 19
1.2.2 Chromatographische Bestimmungsverfahren
Als Chromatographie wird ein physikalisch-chemisches Verfahren zur Stofftrennung bezeichnet,
bei dem Wechselwirkungen zwischen einer stationären Phase und den in einer mobilen Phase
gelösten Substanzen zur Trennung ausgenutzt werden. Die Wechselwirkungen sind substanz-
spezifisch, so daß es zu unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten durch mit der statio-
nären Phase gefüllte Trennsäulen kommt.
Die hochdruckflüssigkeitschromatographische Trennung (HPLC) der PSP-Toxine basiert auf-
grund ihres ionischen Charakters auf der Ionenchromatographie. Dabei kann sowohl das Prinzip
der Ionenpaarchromatographie als auch das der Ionenaustauschchromatographie angewendet
werden. Die große Herausforderung besteht darin, über 20 strukturell sehr ähnliche PSP-
Komponenten chromatographisch möglichst vollständig in einem Lauf (Run) zu trennen.
1.2.2.1 Trennverfahren auf dem Prinzip der Ionenpaarchromatographie
In der Ionenpaarchromatographie wird der mobilen Phase ein ionogener Stoff zugegeben, der mit
einer entgegengesetzt geladenen Probenkomponente ein Ionenpaar bildet. Diese Ionenpaare
verhalten sich chromatographisch wie nicht-ionogene organische Moleküle, so daß sie mit Hilfe
einer Reversed-Phase-Säule (RP-Säule) getrennt werden können.
Die meisten bisher entwickelten HPLC-Methoden zur PSP-Bestimmung beruhen auf der Ionen-
paarchromatographie, wobei fast immer Alkylsulfonsäuren als Ionenpaarbildner zur Trennung
der kationischen PSP-Toxine im Eluenten eingesetzt werden.
Das erste ionenpaarchromatographische HPLC-Verfahren zur PSP-Trennung wurde von Sullivan
et al. veröffentlicht und lange Zeit bei vielen Monitoring-Programmen eingesetzt 79,122. Dabei
erfolgt die Trennung der Toxine an einer Styren-Divinylbenzen-Copolymer-Phase (PRP-1). In
der mobilen Phase verwendeten Sullivan et al. ein Gemisch aus Hexan- und Heptansulfonsäuren
in wäßrigem Ammoniumphosphatpuffer als Ionenpaarreagenz versetzt mit Acetonitril als Modi-
fier, um stärker basische Toxine (Neo, dcSTX, STX) ebenfalls zu eluieren. Zur Verbesserung der
ionenpaarchromatographischen Trennung erfolgt die Elution der PSP-Toxine mit zwei Gradien-
ten; einem Modifiergradienten (durch Variation des Acetonitrilanteils) und einem Ionenstärke-
gradienten (durch Variation des pH-Wertes und der Phosphatkonzentration).
1. Einleitung 20
Ein Nachteil dieser Methode ist die Koelution von dcSTX und STX, so daß es aufgrund der
unterschiedlichen Toxizitäten beider Verbindungen zu Fehlern bei der Berechnung der Gesamt-
toxizität, ausgedrückt in STXeq/kg, kommt 85.
Lawrence et al. entwickelten ein HPLC-Verfahren mit pre-column Derivatisierung (vgl. Kap.
1.2.2.3.1), bei dem die Trennung der Reaktionsprodukte an einer RP-C18-Phase mit Hilfe eines
Phosphatpuffers und Ammoniumformiat in der mobilen Phase sowie eines linearen Acetonitril-
Gradienten (0-5%) erfolgt. Zuvor ist eine aufwendige Aufreinigung der Probenextrakte mittels
Ionenaustauscher vorgesehen, um störende Matrixbestandteile zu entfernen 123,124.
Oshima et al. benötigten drei getrennte chromatographische Runs mit unterschiedlichen Eluenten
zur PSP-Trennung an einer RP-C8-Säule. Hierbei werden die PSP-Toxine vor der HPLC-
Trennung mit Hilfe eines Ionenaustauschers in 3 Gruppen unterschiedlicher Basizität fraktioniert
(1. Gruppe: C1-C4, 2. Gruppe: GTX1-GTX4, dcGTX1-dcGTX4, B-Toxine, 3. Gruppe: Neo,
dcSTX, STX). Die Eluenten für die Trennung der Decarbamoyl- und Carbamoyltoxine enthalten
Heptansulfonsäure, der Eluent für die Trennung der anionischen C-Toxine jedoch Tetrabutyl-
ammoniumphosphat als Ionenpaarreagenz 125,126.
Thielert et al. orientierten sich an Sullivan et al., jedoch wurde die PRP-1-Säule durch eine RP-
C18-Säule substituiert und ausschließlich Oktansulfonsäure als Ionenpaarbildner eingesetzt. Bei
Verwendung von zwei Phosphatpuffern (Eluent A: 98,5% (v:v) Ammoniumphosphat (40
mmol/L) und Oktansulfonsäure (11 mmol/L), 1,5% (v:v) THF, pH = 6,6; Eluent B: 83,5% (v:v)
Ammoniumphosphat (50 mmol/L) und Oktansulfonsäure (13 mmol/L), 15% (v:v) ACN, 1,5%
(v:v) THF, pH = 6,6) erfolgt die Elution isokratisch in zwei Stufen. Die Gehalte an N-Sulfo-
carbamoyltoxinen werden nach Hydrolyse des essigsauren Probenextraktes (Umwandlung zu
ihren korrespondierenden Carbamattoxinen) und einem zweiten chromatographischen Run durch
Differenzmessung ermittelt 127.
1.2.2.2 Trennverfahren auf dem Prinzip der Ionenaustauschchromatographie
Bei der Ionenaustauschchromatographie wird als stationäre Phase eine polymere Matrix aus Harz
oder Kieselgel eingesetzt, an deren Oberfläche sich saure oder basische Gruppen befinden. Die
zu analysierenden Ionen werden von den funktionellen Gruppen des Austauscherharzes unter-
schiedlich stark gebunden und dann von der mobilen Phase eluiert.
1. Einleitung 21
Derzeit wird diese Form der Ionenchromatographie hauptsächlich zur Probenaufbereitung vor
der eigentlichen PSP-Bestimmung eingesetzt, und zwar zur Abtrennung unerwünschter Matrix-
bestandteile oder zur Fraktionierung der PSP-Toxine vor ihrer weiteren chromatographischen
Auftrennung 88,106,124,128.
Die ersten Versuche, PSP-Toxine vor ihrer Detektion underivatisiert chromatographisch zu
trennen, basierten ebenfalls auf dem Prinzip der Ionenaustauschchromatographie 129,130. Sie
wurden aber in der Folgezeit von den oben angeführten leistungsfähigeren ionenpaarchromato-
graphischen HPLC-Verfahren abgelöst. Es gab jedoch weiterhin Versuche, PSP-Toxine auf
Ionenaustauschern, insbesondere im Hinblick auf eine Kopplung der HPLC an das Massen-
spektrometer, zu trennen.
Pleasence et al. verwendeten eine PRP-1-Polymerphase (200 x 1 mm ID und 150 x 4,1 mm ID)
zur Trennung von PSP-Toxinen. Die Trennung erfolgte isokratisch mit einem Ammonium-
formiat-Eluenten (10 mmol/L), der geringe Mengen an Acetonitril (5%) enthielt. Eine vollstän-
dige Auftrennung der PSP-Toxine konnte jedoch nicht erreicht werden (Neo/STX bzw.
Neo/GTXs eluierten gemeinsam) 115.
1995 publizierten Kirschbaum et al. eine HPLC-Methode, die eine teilweise Trennung der PSP-
Toxine ermöglichte, ohne das auf Ionenpaarbildner oder nichtflüchtige Puffer zurückgegriffen
werden mußte. Die PSP-Toxine wurden an einem schwachen Kationenaustauscher auf Poly-
styren-Divinylbenzen-Basis (Hamilton PRP X-200) getrennt, wobei zuerst PSP-Toxine mit
Sulfatgruppen (C- und B-Toxine sowie Gonyautoxine), dann Neo und dcSTX sowie schließlich
STX eluierten. Als Eluent wurde ein Ammoniumacetatpuffer (0,25 mmol/L) mit pH 6,5 verwen-
det. Neo, dcSTX und STX waren gut voneinander getrennt, während GTX2 und GTX3 koeluier-
ten 131.
1.2.2.3 Detektion nach HPLC-Trennung
1.2.2.3.1 Fluorimetrische Detektion
Die alkalische Oxidation der PSP-Toxine zu fluoreszierenden Verbindungen bildete die Voraus-
setzung, die Toxine nach chromatographischer Trennung selektiv und empfindlich zu detek-
tieren. Hierfür boten sich zwei methodische Varianten der HPLC-Verfahren mit Derivatisierung
an: die Umsetzung der PSP-Toxine vor der HPLC-Trennung (pre-column) als auch nach der
HPLC-Trennung (post-column).
1. Einleitung 22
Die Vorteile der pre-column Derivatisierung (Lawrence et al.) liegen in der leichten Durchführ-
barkeit und direkten Kontrolle der Derivatisierungsreaktion. Zudem kann auf die aufwendige
Apparatur zur Nachsäulenderivatisierung verzichtet werden.
Für eine Anwendung in der Routineanalytik ist ein pre-column Verfahren jedoch wenig geeignet,
da bei der Oxidation einiger PSP-Toxine identische Reaktionsprodukte gebildet werden bzw.
mehrere Reaktionsprodukte entstehen und somit im Chromatogramm mehrere Signale für die
gleiche Verbindung angezeigt werden. Durch Variation der Oxidationsbedingungen läßt sich
zwar die Reaktion auf nur ein Reaktionsprodukt hin verschieben, jedoch kann nicht das gleiche
Oxidationsmittel für alle Toxine eingesetzt werden, so daß zweimal mit unterschiedlichen Oxi-
dationsmitteln (H2O2 und Perjodsäure) derivatisiert und chromatographiert werden muß 107,132.
Bei den HPLC-Verfahren mit Nachsäulenderivatisierung (Sullivan et al., Oshima et al., Thielert
et al.) ist die Anzahl der entstandenen Oxidationsprodukte unerheblich, da die chromato-
graphische Trennung beendet ist und die Oxidationsprodukte eines PSP-Toxins bei der Detektion
summarisch erfaßt werden. Trotz des höheren apparativen Aufwandes sind HPLC-Verfahren mit
post-column Derivatisierung als „on-line“ Verfahren leicht automatisierbar 133.
Bei der Nachsäulenderivatisierung erfolgt die Oxidation der PSP-Toxine ebenfalls überwiegend
auf chemischem Wege mit Hilfe von Perjodsäure.
1.2.2.3.2 Elektrochemische Detektion
Eine vielversprechende Alternative zur chemischen Oxidation stellt die Substitution durch einen
elektrochemischen Detektor bzw. die Kombination der elektrochemischen Oxidation mit der
Fluoreszenzdetektion dar.
Die elektrochemische Oxidation basiert auf der Reaktion des Analyten bei einem definierten
Oxidationspotential. Befindet sich ein oxidierbares Molekül im Eluenten zwischen der Referenz-
und der Arbeitselektrode, werden von diesem Elektronen abgegeben und es fließt ein meßbarer
Strom. Im allgemeinen steigt mit Zunahme des angelegten Potentials das Ausmaß der oxidierten
Komponenten und damit die Intensität des erzeugten Signals.
Zur Oxidation von PSP-Toxinen wird ein positives Potential angelegt. Hydrodynamische
Voltammogramme zeigen für Saxitoxin eine signifikante Oxidation bei Potentialen > +0,8 V.
Die erzeugten Oxidationsprodukte der PSP-Toxine sind ebenfalls fluoreszenzaktiv, so daß auch
ein Fluoreszenzdetektor zur PSP-Bestimmung eingesetzt werden kann 131,134,135.
1. Einleitung 23
Elektrochemische Zellen können nach zwei Funktionsprinzipien arbeiten, und zwar in coulo-
metrischer und amperometrischer Arbeitsweise. Bei den auf dem Markt befindlichen elektro-
chemischen Detektoren mit coulometrischer Arbeitsweise fließt der Eluent durch eine poröse
Graphitelektrode, so daß an dieser Arbeitselektrode ein Stoffumsatz von nahezu 100% resultiert 104. Mit Hilfe der selektiv und empfindlich arbeitenden elektrochemischen Oxidation wird die
Nachsäulenderivatisierung apparativ vereinfacht, und Verdünnungseffekte durch Zufluß von
zusätzlichen Reagenzien werden vermieden. Ihr Einsatz bei ionenpaarchromatographischen
Verfahren ist jedoch aufgrund der ungeeigneten Zusammensetzung der mobilen Phasen limitiert.
1.2.2.3.3 Massenspektrometrische Detektion
Im Gegensatz zur Kopplung Gaschromatographie/Massenspektrometrie (GC/MS), die technisch
ausgereift und seit langem im Einsatz ist, befinden sich Methoden, die auf der Kopplung der
Flüssigchromatographie mit der Massenspektrometrie (LC/MS) beruhen, immer noch in der
Entwicklung 136,137.
Das Vorhandensein von stark polaren und ionisierbaren Gruppen macht die PSP-Toxine theore-
tisch zu idealen Kandidaten nicht nur für Trennverfahren, die auf der Mobilität in wäßrigen
Puffern beruhen, sondern auch für LC/MS Kopplungstechniken auf der Basis dieser wäßrigen
Eluenten. Dabei stellt das Massenspektrometer ein alternatives Detektionssystem dar, mit dem
der spezifische Nachweis einzelner PSP-Toxine möglich ist.
Die Analyten müssen mit dem Eluenten vor der massenspektrometrischen Detektion in die Gas-
phase überführt und ionisiert werden. Dazu sind folgende Voraussetzungen unabdingbar: 137
1. Größere Lösungsmittelvolumina (Flußraten bis 1 mL/min) müssen in den Bereich des
Hochvakuums gebracht werden.
2. Die Moleküle der mobilen Phase als auch des Analyten müssen verdampfbar sein. Dabei
sollte die Ionisierung des Analyten weitgehend zerstörungsfrei erfolgen, um Informatio-
nen bzgl. der molaren Masse zu erhalten.
Wegen der thermischen Instabilität der PSP-Toxine haben sich schonende Ionisierungstechniken
wie FAB (Fast Atom Bombardment) –Ionisierung und API (Atmospheric Pressure Ionisation) als
geeignet für die Analyse von PSP-Toxinen erwiesen.
1. Einleitung 24
Die FAB-Ionisierung ist die ältere Ionisierungstechnik für PSP-Toxine. Hierbei erfolgt die Ioni-
sierung durch hochenergetische Atome (z.B. Xenon), die die Moleküle aus einer viskosen Matrix
(Glycerol) herauslösen. Die Bombardierung der Probe führt zur Bildung positiver und negativer
Ionen, die in einem Desorptionsprozeß von der Oberfläche gelöst werden. Diese Ionen entstehen
am häufigsten durch Protonierung von basischen oder durch Deprotonierung von sauren funktio-
nellen Gruppen.
Die FAB-Matrix wird dem LC-Eluat zugesetzt und das Gemisch über eine Kapillare in die
Ionenquelle eingeführt. Im dort herrschenden Hochvakuum verdampft das Laufmittel, evtl. un-
terstützt durch eine erhöhte Ionenquellentemperatur. Durch diesen Ansatz sind die Flußraten auf
0,5–15 µL/min beschränkt. Bei der in der PSP-Analytik eingesetzten „continuous flow“ FAB-
Ionisierung läuft das LC-Eluat in der Ionenquelle über eine Targetoberfläche, überschüssiges
Laufmittel wird von einem Filterpapierpaket aufgesaugt (Abb. 8) 138-140.
Abb. 8: Prinzip eines FAB-Interfaces für die LC/MS-Kopplung 141
Es zeigte sich jedoch, daß API-Interfaces für sehr polare Komponenten, die bereits in wäßriger
Lösung eine Ladung tragen, weitaus leistungsfähiger sind 142. Bei der API resultiert die Ionen-
bildung aus einer „Ionenevaporation“ mit Hilfe eines Spannungsfeldes. Durch Versprühen des
Eluenten und der in ihm gelösten Analyten werden Ionen aus Mikrotröpfchen (Aerosol) unter
Atmosphärendruck erzeugt und in den Hochvakuumbereich des Massenspektrometers gelenkt.
Mit Unterstützung eines Nebulizer-Gases kann dieses Ionenspray-Verfahren bei Flußraten bis zu
2 mL/min eingesetzt werden.
Glycerol
HPLC-Eluat
Target
Probe gelöst in Matrix Filter
Moleküle an der Oberfläche
10-15 kV Linsensystem der Ionenquelle
1. Einleitung 25
Für die API stehen heute zwei Techniken zur Verfügung: die API mit chemischer Ionisierung
(Atmospheric Pressure Chemical Ionisation, APCI) sowie die API mit Elektrospray-Ionisierung
(ESI), wobei letztere vorrangig zur Bestimmung von PSP-Toxinen Anwendung findet 115,143-145.
Bei der ESI wird das Eluat mit den Analyten durch eine Kapillare, an deren Ende eine Spannung
von mehreren Kilovolt anliegt, mit Druckluft versprüht. Das starke elektrische Feld und das
Versprühen bewirken die Bildung geladener Tröpfchen, die dann in Richtung Vakuumbereich
(Analysatoreintrittsöffnung des MS) driften. Dabei verringert sich die Größe der Tröpfchen
stetig durch Verdampfung des Lösungsmittels, verbunden mit einem Anstieg der elektrischen
Ladungsdichte. Die Ladung der Tröpfchen bewirkt, daß Ionen an die Tröpfchenoberfläche treten
(Coulomb-Effekt). Ab einem kritischen Wert werden die Ionen durch die Coulomb-Abstoßung
spontan in die Gasphase emittiert. In Abhängigkeit von der Anzahl basischer oder saurer
Gruppen im Analytenmolekül werden dabei einfach oder mehrfach geladene Ionen erzeugt
(Abb. 9). Die Temperatur des Inertgases hat keinen Einfluß auf die Stabilität des Analyten, da
selbst bei sehr hoher Gastemperatur die Temperatur der Tröpfchen aufgrund der Abkühlung
durch Verdampfung 50°C nicht übersteigt. Somit stellt die ESI eine schonende Ionisierungs-
technik dar, die auch für thermisch labile Moleküle wie PSP-Toxine geeignet ist. Von Nachteil
ist, daß ein sehr hoher Wasseranteil und auch eine hohe Konzentration an Elektrolyten im Eluat
die ESI erschweren 137,146.
Abb. 9: Prinzip eines ESI-Interfaces für die LC/MS-Kopplung
Je nach Meßbedingung (positive oder negative Ionisierung) werden Molekülionen wie (M+H)+
oder (M-H)- erhalten, die anschließend nach ihrem Masse-Ladungs-Verhältnis im magnetischen
oder elektrischen Feld aufgetrennt werden. Dazu finden in der PSP-Analytik vorzugsweise
Quadrupolmassenspektrometer Anwendung. Während bei der LC/MS mit Single-Quadrupol-
HPLC-Eluat
Nebulizer Gas 3-6 kV
Stickstoff-Fön
Curtain Gas
N2
N2
1. Einleitung 26
geräten meist nur Aussagen zu molaren Massen gegeben werden können, liefern bei der LC/MS-
MS sogenannte Triple-Geräte (auch als Tandem-Massenspektrometer bezeichnet) durch charak-
teristische Fragmentierungen der Molekülionen zusätzliche Informationen zur Struktur unbe-
kannter Verbindungen.
Quilliam et al. wandten die MS-Detektion mittels ESI erstmals 1989 zum Nachweis von STX an
und erzielten mittels „direct flow injection“ Nachweisgrenzen von ca. 30 pg STX, d.h. es konn-
ten noch 0,1 µmol STX aus 1 µL injiziertem Extrakt nachgewiesen werden, welches einer dem
Maus-Bioassay gegenüber fünffach höheren Sensitivität entspricht 147. Die Vorgehensweise der
„direct flow injection“ ohne direkt gekoppelte chromatographische Trennung wird bereits viel-
fach zur eindeutigen Identifizierung von zuvor aus Probenmaterial fraktionierten PSP-Toxinen
herangezogen 21,148-150. Hingegen wird die LC/MS-Kopplung bisher nur wenig eingesetzt, da die
Volatilität der Eluenten als wesentlichste Voraussetzung für die ESI-Technik bei den derzeit in
der Routineanalytik angewandten ionenpaarchromatographischen HPLC-Verfahren nicht gege-
ben ist (vgl. Kap. 1.2.2.1). Allerdings wurden durch Kirschbaum et al., Pleasance et al. und
Quilliam et al. (vgl. Kap. 1.2.2.2) in den letzten Jahren Fortschritte hinsichtlich des Einsatzes der
Kopplung LC/MS erzielt, obwohl noch keine befriedigende chromatographische Trennung der
wichtigsten PSP-Toxine vor der MS-Detektion gelungen war 115,131,132,151.
2. Zielstellung 27
2. Zielstellung
Im Hinblick auf einen effektiven Verbraucherschutz und um die betroffenen Wirtschaftszweige
vor erheblichen finanziellen Verlusten zu bewahren, ist die Kontrolle der Interaktion von PSP-
Toxinen mit biologischem Material, nicht zuletzt wegen der offensichtlichen Zunahme toxischer
Algenblüten und der damit verbundenen steigenden Kontamination von Nahrungsmitteln
mariner Herkunft mit PSP-Toxinen, unerläßlich. Voraussetzung für ein besseres Verständnis der
Rolle von Algentoxinen in der marinen Umwelt ist jedoch das Vorhandensein bzw. die Entwick-
lung leistungsfähiger analytischer Verfahren.
Die bisher entwickelten Methoden zur quantitativen Bestimmung der PSP-Toxine weisen jedoch
eine Reihe von Nachteilen auf. So sind biologische und biochemische Tests verhältnismäßig
unspezifisch und erlauben auch nach Ionenaustauscheraufreinigung, ebenso wie die Fluoreszenz-
messung, nur die summarische Bestimmung von PSP-Toxinen.
Zur Quantifizierung einzelner PSP-Toxine werden die Kapillarelektrophorese (CE) und HPLC-
Verfahren mit Fluoreszenzdetektion eingesetzt. CE-Verfahren weisen wegen der Begrenzung auf
extrem kleine Injektionsvolumina eine geringe Sensitivität sowie eine ungenügende Reprodu-
zierbarkeit bei der Analyse von Muschelextrakten auf. Die Nachteile der in der Routineanalytik
eingesetzten HPLC-Verfahren liegen in der unbefriedigenden Trennung einzelner PSP-Toxine
sowie in der chemischen Derivatisierung, d.h. in der post-column Oxidation der PSP-Toxine zu
fluoreszierenden Derivaten, welche apparativ aufwendig und sehr störanfällig ist (schwankende
Flußraten, häufiges Verstopfen des Reaktionscoils). Außerdem sind die verwendeten Ionenpaar-
bildner nicht nur kostenintensiv, sondern sie verhindern zusammen mit dem Phosphat im Eluen-
ten auch die Kopplung an ein Massenspektrometer. Die LC/MS-Kopplung ist jedoch eine
conditio sine qua non, um selektiv detektierte Toxine spezifisch nachzuweisen sowie bisher noch
nicht bekannte Strukturen potentiell toxischer Verbindungen in toxischen Extrakten aufzuklären.
Im Rahmen der Arbeiten zur Promotion stellte sich somit zunächst die Aufgabe, die an der
Universität Jena zur PSP-Bestimmung eingesetzte HPLC-Methode nach Thielert et al. zu
optimieren. Im Anschluß daran sollte eine leistungsfähigere und kostengünstigere HPLC-
Methode erarbeitet werden, wobei an eine Substitution der chemischen Oxidation durch eine
elektrochemische gedacht war. Gleichzeitig sollte durch Einsatz von ausschließlich flüchtige
Verbindungen enthaltende HPLC-Eluenten die Kopplung an ein Massenspektrometer ermöglicht
werden.
2. Zielstellung 28
Außerdem mußte die neue Methode die exakte Bestimmung einzelner PSP-Toxine in Algen- und
Muschelextrakten erlauben und nach Möglichkeit auch zur Gewinnung dringend benötigter PSP-
Standardsubstanzen einsetzbar sein.
Neben diesen rein methodischen Arbeiten waren Experimente zur Abschätzung des für den
Verbraucher bestehenden Gefährdungspotentials durch kommerziell genutzte und mit PSP-
Toxinen belastete Schalentiere sowie zur Aufklärung metabolischer Prozesse, welche das
Schicksal der PSP-Toxine in der marinen Nahrungskette bestimmen, durchzuführen. Deshalb
sollten PSP-haltige Algenzellen verschiedenen Muschel- und Schneckenarten unter kontrollier-
ten Bedingungen als Nahrung angeboten werden, um neue Erkenntnisse hinsichtlich der artspezi-
fischen Toxinaufnahme und Detoxifikation sowie bzgl. der Entstehung charakteristischer Toxin-
profile, die durch die in den Mollusken ablaufenden Metabolisierungen beeinflußt werden, zu
gewinnen.
Ergänzend zu den Fütterungsexperimenten sollten durch in vitro Inkubationsversuche mit aus
Muscheln und Schnecken gewonnenen Gewebehomogenisaten nach Zugabe eines essigsauren
PSP-haltigen Algenextraktes genauere Aussagen über die art- und gewebespezifischen Toxin-
umwandlungen in den Tieren ermöglicht werden, zumal Experimente dieser Art bisher kaum
durchgeführt worden waren.
3. Optimierung eines ionenpaarchromatischen Verfahrens... 29
II EXPERIMENTELLER TEIL
3. Optimierung eines ionenpaarchromatographischen Verfahrens zur Bestimmung
von PSP-Toxinen
3.1 Analytische Ausgangslage
An der Universität Jena wird zur PSP-Bestimmung die in den letzten Jahren mehrfach modifi-
zierte HPLC-Methode nach Thielert et al. (vgl. Kap. 1.2.2.1) sowohl für Routinemessungen als
auch für Analysen zu Forschungszwecken angewendet. So steigerte zunächst Hummert die
Effizienz der Nachsäulenderivatisierung durch eine Temperaturerhöhung auf 50 °C. Auch schlug
er einen pH-Wert von 6,9 statt des bisherigen Wertes von 6,6 für beide Eluenten vor 152. Yu et al.
gelang die Trennung der häufig vorkommenden und damit lebensmittelrechtlich relevanten
Gonyautoxine 1 und 4 (die bei der Methode nach Thielert et al. nicht getrennt werden) durch
eine Verringerung der Konzentration der Oktansulfonsäure im Starteluenten A um 50% 153.
Diese Konzentrationsabsenkung war jedoch mit einer geringen Reproduzierbarkeit der Ergebnis-
se verbunden bzw. Messungen in Serie waren nur nach Einschaltung einer sehr langen
Equilibrierungszeit von 80 Minuten möglich. Um die modifizierte Thielert-Methode dennoch zur
PSP-Bestimmung in der Routineanalytik einsetzen zu können, war eine Optimierung der
chromatographischen Bedingungen dringend erforderlich.
3.2 Optimierung der Methode nach Thielert et al.
Die erforderliche sehr lange Equilibrierungszeit ließ auf eine starke Wechselwirkung des nur im
Eluenten B enthaltenen Acetonitrils mit der stationären Phase schließen, welche sich nachteilig
auf die GTX-Trennung im nächsten Lauf auswirkte. Deshalb wurde zunächst versucht, den
Anteil des organischen Modifiers im Eluenten B ohne Verlust an Trennleistung hinsichtlich der
2fach positiv geladenen PSP-Toxine zu verringern. Es waren aber nur geringfügige Änderungen
möglich (Absenkung des Acetonitrilanteils von 15% auf 12%), die keine wesentlichen Verbes-
serungen brachten. Der Austausch von Acetonitril durch THF bzw. Oktansulfonsäure ver-
schlechterte die Trennung von Neo, dcSTX und STX.
Die Tatsache, daß bei der originalen Thielert-Methode 12minütiges Spülen der Säule mit einem
Oktansulfonsäure in höherer Konzentration enthaltenden Eluenten A zur Herstellung der Aus-
gangsbedingungen ausreicht, führte zu der Überlegung, zunächst die Equilibrierung mit diesem
Eluenten A auch bei der modifizierten Thielert-Methode durchzuführen. Anschließend sollte mit
3. Optimierung eines ionenpaarchromatischen Verfahrens... 30
dem modifizierten Starteluenten A die Wiederherstellung der Ausgangsbedingungen in deutlich
kürzerer Zeit als bei Yu et al. möglich sein, denn diese beiden Eluenten weisen nur geringe
Unterschiede in der Zusammensetzung auf. Die Umsetzung dieser Überlegungen in die Praxis
brachte den gewünschten Erfolg (Abb. 10 und 11).
Abb. 10: Optimierung der PSP-Bestimmungsmethode: Chromatogramme einer PSP-
Standardlösung 1. Thielert-Methode 2. optimierte Methode
Die gegenüber der originalen Thielert-Methode um 12 Minuten verlängerte Meßdauer war tole-
rierbar, machte jedoch die Einführung eines dritten Eluenten notwendig. Neben den Eluenten A
und B wird bei der optimierten Methode ein Eluent C, welcher der Zusammensetzung von Eluent
A ohne Oktansulfonsäure entspricht, zur „Verdünnung“ des Starteluenten eingesetzt (Tab. 5).
Nach dieser Optimierung wurde die modifizierte Thielert-Methode als robustes und effizientes
HPLC/FLD-Verfahren zur PSP-Bestimmung im Routinebetrieb eingesetzt 154.
1.
2.
3. Optimierung eines ionenpaarchromatischen Verfahrens... 31
Tab. 5: Chromatographische Bedingungen der optimierten Thielert-Methode
Stationäre Phase: RP-C18, Phenomenex, Luna 5 µm, 4,6 x 250 mm mit 30 mm Vorsäule Eluent A: 98,5% Phosphorsäure (40 mmol/L) und Oktansulfonsäure (11 mmol/L, Na-Salz), pH 6,9 eingestellt mit konz. NH3 (v:v) 1,5% Tetrahydrofuran (v:v)
Eluent B: 83,5% Phosphorsäure (50 mmol/L) und Oktansulfonsäure (13 mmol/L, Na-Salz), pH 6,9 eingestellt mit konz. NH3 (v:v) 1,5% Tetrahydrofuran (v:v) 15% Acetonitril (v:v)
Eluent C: 98,5% Phosphorsäure (40 mmol/L), pH 6,9 eingestellt mit konz. NH3 (v:v) 1,5% Tetrahydrofuran (v:v) Flow: 1,0 mL/min Gradient: Zeit (min) Eluent A (%) Eluent B (%) Eluent C % 0 50 0 50 11 50 0 50 13 0 100 0 33 0 100 0 34 100 0 0 46 100 0 0 47 50 0 50 57 50 0 50
Abb. 11: Reproduzierbarkeit der GTX1/GTX4-Trennung anhand der Retentionszeiten nach 5facher
Injektion in Folge (MW = Mittelwert, SD = Standardabweichung)
Nummer der Messung
1 2 3 4 5
Ret
entio
nsze
it, m
in
9,0
9,2
9,4
9,6
9,8
10,0
GTX4
GTX1MW = 9,71 min SD = 0,03 min
MW = 9,19 min SD = 0,03 min
4. Entwicklung eines ionenaustauschchromatographischen Verfahrens... 32
4. Entwicklung eines ionenaustauschchromatographischen Verfahrens zur Bestim-
mung von PSP-Toxinen
4.1 Wahl der stationären und mobilen Phase
Zur routinemäßigen Quantifizierung von PSP-Toxinen existieren eine Reihe von HPLC-
Methoden, die alle auf den Zusatz von Ionenpaarbildnern und der Trennung an C18-Umkehr-
phasen basieren (vgl. Kap. 1.2.2.1). Da sich eine hohe Konzentration an nichtflüchtigen Alkyl-
sulfonsäuren und Phosphat im Eluenten als nachteilig für die elektrochemische Oxidation und
die direkte Kopplung der HPLC mit der Massenspektrometrie erwies, sollte für die HPLC-
Bestimmung der PSP-Toxine nicht auf die Ionenpaarchromatographie zurückgegriffen werden.
Allerdings gelingt bei Verzicht auf Ionenpaarbildner im Eluenten die chromatographische Tren-
nung der PSP-Toxine mit den üblichen Umkehrphasen und auch mit Cyano-, Phenyl- und Diol-
phasen sowie an Aminophasen nicht 127,155.
Aufgrund des ionischen Charakters der PSP-Toxine bietet sich ihre Trennung mit Hilfe von
Ionenaustauschermaterialien an. In bisherigen Arbeiten kamen dabei fast ausschließlich schwa-
che Kationenaustauscher (PRP-X-200, Hamilton) auf Polystyren-Divinylbenzen Basis zur
Anwendung. Aber auch hiermit gelang die vollständige Trennung der PSP-Toxine, insbesondere
von GTX2/GTX3, nicht 131,152. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde bei den eigenen Untersuchun-
gen hauptsächlich mit starken Ionenaustauschern gearbeitet, um mit breiteren Variations-
möglichkeiten innerhalb des pH-Wertes bessere Trennungen zu erreichen. Am leistungsfähigsten
erwiesen sich die Säulen Source 15S PE100/4.6 (starker Kationenaustauscher) sowie Source 15Q
PE100/4.6 (starker Anionenaustauscher) der Firma Pharmacia Biotech auf Polystyren-
Divinylbenzen-Basis. Das 15 µm-Material gewährleistet eine gute Auflösung bei gleichzeitiger
Robustheit und Belastbarkeit, so daß die Säulen ihr Trennverhalten über längere Zeit beibehal-
ten.
Für eine optimale Trennung wurden jeweils zwei der relativ kurzen Säulen miteinander verbun-
den. Es wurde dabei sowohl mit Kationenaustauschern als auch mit Anionenaustauschern gear-
beitet, um neben den positiv geladenen Carbamoyl- und Decarbamoyltoxinen auch die neutralen
bzw. negativ geladenen C-Toxine zu erfassen. Letztere standen, da nicht als kommerzielle
Toxinstandards erhältlich, in Form eines C-Toxine enthaltenden Algenextraktes (Alexandrium fundyense CCMP 1719) zur Verfügung.
Als Puffersubstanz im wäßrigen Eluenten wurde zunächst Ammoniumacetat gewählt, dessen
Pufferwirkung im Bereich von pH 4 bis pH 9 liegt, wobei die PSP-Toxine in unterschiedlich
protonierter Form vorliegen. Anschließend wurden weitere Puffersubstanzen getestet.
4. Entwicklung eines ionenaustauschchromatographischen Verfahrens... 33
4.2 Einfluß verschiedener Elutionsbedingungen auf die Toxintrennung
Die Ionenaustauschchromatographie bietet zahlreiche Möglichkeiten, das Retentionsverhalten
der zu trennenden Verbindungen durch die Änderung der Zusammensetzung der mobilen Phase
zu beeinflussen. Dies geschieht durch
• die Art des Puffers,
• die Konzentration der Pufferlösung (Ionenstärke),
• die Variation des pH-Wertes des Eluenten,
• die Art des organischen Modifiers,
• die Konzentration des organischen Modifiers,
• die Verwendung eines Gradientenprogrammes.
4.2.1 Variation der Pufferstärke
Bei der Ionenaustauschchromatographie führt eine Erhöhung der Pufferkonzentration zu einer
Verkürzung der Retentionszeiten, wobei gleichzeitig schärfere Peaks erhalten werden. In Anleh-
nung an die Arbeiten von Hummert et al. und Kirschbaum et al., die hohe Konzentrationen an
Puffersalzen zur Elution der PSP-Toxine benötigten (500 mmol/L Ammoniumformiat bzw.
250 mmol/L Ammoniumacetat), wurde eine ähnlich hohe Ionenstärke gewählt und schrittweise
abgesenkt 131,152. Abb. 12 verdeutlicht diesen Effekt am Beispiel der Elution von GTX2/GTX3
und STX. Hierbei zeigte sich, daß die erforderliche Ionenstärke zur Elution der einfach und
zweifach positiv geladenen PSP-Toxine um eine Zehnerpotenz divergiert. Pufferkonzentrationen
von 10 mmol/L und weniger lieferten keine reproduzierbaren Retentionszeiten und Peakformen
mehr.
1.
STX
4. Entwicklung eines ionenaustauschchromatographischen Verfahrens... 34
2.
Abb. 12: Einfluß der Pufferkonzentration bei pH 6,9 auf die Elution von 1. STX und 2. GTX2/GTX3 (GTX2/GTX3-Standard enthält Spuren dcGTX2/dcGTX3, vorderer Peak) 1. A = 450 mmol/L Ammoniumacetat, B = 350 mmol/L, C = 300 mmol/L, D = 250 mmol/L 2. A = 150 mmol/L Ammoniumacetat, B = 50 mmol/L, C = 20 mmol/L
Zur optimalen Retention von C-Toxinen auf dem Anionenaustauscher war eine niedrigere
Pufferkonzentration von 20-50 mmol/L Ammoniumacetat erforderlich (Elution nach 10-25 min),
wobei C2 im Vergleich zu C1 eine deutlich stärkere Affinität zur stationären Phase aufwies.
4.2.2 Variation der Art des Puffers
Die Substitution von Ammoniumacetat durch Ammoniumformiat ergab sowohl auf dem
Anionenaustauscher als auch auf dem Kationenaustauscher Verlängerungen der Retentions-
zeiten. Während jedoch die Nachweisempfindlichkeit der PSP-Toxine mit Formiat bei chemi-
scher Oxidation im Vergleich zu Acetat bis um das Doppelte höher lag, traten Probleme auf,
wenn die PSP-Toxine elektrochemisch oxidiert wurden (Schwankungen der Stromstärke,
beschleunigte Belegung der Elektrodenoberfläche).
Trifluoressigsäure zeigte als starke, fast vollständig dissoziierte Säure bei ihrer Verwendung als
Elutionsmittel auf Anionenaustauschern die stärkste Elutionskraft (Abb. 13). Sie besitzt jedoch
im neutralen pH-Bereich keine Pufferwirkung, so daß eine schlechte Reproduzierbarkeit bei der
Injektion von Extrakten mit hoher Ionenstärke resultierte.
GTX2/GTX3
4. Entwicklung eines ionenaustauschchromatographischen Verfahrens... 35
1.
2.
Abb. 13: Einfluß der Pufferart auf die Elution von 1. STX und 2. C1/C2 (kleinerer Peak C1) bei
pH 6,9 1. A = 300 mmol/L Ammoniumacetat, B = 300 mmol/L Ammoniumformiat
C = 300 mmol/L Trifluoressigsäure 2. A = 35 mmol/L Ammoniumacetat, B = 35 mmol/L Ammoniumformiat
C = 35 mmol/L Trifluoressigsäure
4.2.3 Variation des pH-Wertes
Mit dem pH-stabilen Säulenmaterial wurde das Elutionsverhalten der PSP-Toxine von pH 2,5 bis
9,5 untersucht. Eine signifikante Verlängerung der Retentionszeit trat beim Kationenaustauscher
bei niedrigen pH-Werten nicht auf, aber schon bei pH-Werten <6 kam es zu einem starken Ver-
lust an Detektionsempfindlichkeit (durch Inhibierung der Öffnung des Ketonringes). Für pH-
Werte zwischen 7 und 8 ergab sich eine leichte Zunahme der Sensitivität, jedoch zeigten sich bei
Neo bereits Doppelpeaks. Erst bei pH-Werten >9 verringerten sich die Retentionszeiten für die
positiv geladenen PSP-Toxine auf dem Kationenaustauschermaterial deutlich (Abb. 14/1.).
STX
C1/C2
4. Entwicklung eines ionenaustauschchromatographischen Verfahrens... 36
1.
2.
Abb. 14: Einfluß des pH-Wertes auf die Elution von 1. STX mit 300 mmol/L Ammoniumacetat
und 2. C1/C2 mit 20 mmol/L Ammoniumacetat 1. A = pH 6,9; B = pH 4,5; C = pH 8,5; D = pH 9,5 2. A = pH 6,9; B = pH 4,5; C = pH 8,5
Hingegen beschleunigten niedrige pH-Werte die Elution der C-Toxine auf Anionenaustauscher-
materialien (allerdings nur bis herab zu pH 4,5), während pH-Werte >8 hier in einer deutlichen
Retentionszeitverlängerung für C1 und C2 resultierten (Abb. 14/2.).
Im Gegensatz zu Ammoniumformiat und Ammoniumacetat weist Trifluoressigsäure in wäßriger
Lösung einen sehr niedrigen pH-Wert (pH 1,7) auf. Bei diesem niedrigen pH-Wert fand auf
Anionenaustauschern keine Retention von PSP-Toxinen statt, während auf Kationenaustauschern
für die Elution der stärker basischen Toxine ähnlich hohe Konzentrationen von Trifluoressig-
säure wie für Ammoniumacetat und Ammoniumformiat erforderlich waren.
STX
C1/C2
4. Entwicklung eines ionenaustauschchromatographischen Verfahrens... 37
4.2.4 Einfluß organischer Modifier
Zum Erreichen einer besseren Trennleistung werden in der Chromatographie häufig Acetonitril
(ACN) oder Methanol als Modifier eingesetzt. 1.
2.
Abb. 15: Einfluß von Acetonitril bei pH 6,9 auf die Elution von 1. STX und 2. C1/C2 1. A = 250 mmol/L Ammoniumacetat, 30% Acetonitril (v:v) B = 250 mmol/L Ammoniumacetat, 0% Acetonitril 2. A = 10 mmol/L Ammoniumacetat, 30% Acetonitril (v:v)
B = 10 mmol/L Ammoniumacetat, 0% Acetonitril (keine Elution von C2 nach 60 min) Nach Hummert wird beim Übergang von reinem Formiatpuffer (500 mmol/L, pH 6,5) auf
Formiatpuffer/ACN = 50/50 die Retentionszeit von STX auf einer PRP-X-200 Säule mehr als
verdoppelt 152. Die mit Acetonitril bewirkte Änderung der Polarität der mobilen Phase führte hier
jedoch zu einer beschleunigten Elution der PSP-Toxine auf Ionenaustauschermaterialien (Abb.
15). Aber im Hinblick auf eine massenspektrometrische Detektion könnte durch Substitution von
Puffer durch ACN eine zu hohe Pufferkonzentration im Eluenten (Ionisierungssupression) ver-
mieden werden.
STX
C1/C2
C1/C2
4. Entwicklung eines ionenaustauschchromatographischen Verfahrens... 38
Zur Aufrechterhaltung der Stabilität des eingesetzten Säulenmaterials war die Verwendung von
Acetonitril auf anteilig 30% begrenzt, und diese Konzentration führte zu einer Halbierung der
Retentionszeiten für PSP-Toxine. C2 eluierte bereits bei 10 mmol/L Ammoniumacetat.
Die Elutionskraft von Methanol ist im Vergleich zu Acetonitril zwar geringer, das Säulen-
material ließ jedoch eine fast vollständige Substitution von Wasser durch Methanol zu. Ein ho-
hes Mischungsverhältnis zugunsten von Methanol (75:25) verringerte signifikant die Retentions-
zeiten (Halbierung für Neo, dcSTX, STX), resultierte aber in einer Verschlechterung der Trenn-
leistung (z.B. für GTX1/GTX4) und der Peakform, in einem starken Druckanstieg im gesamten
System sowie in einer schnellen Belegung der Elektrodenoberfläche in der elektrochemischen
Zelle.
4.2.5 Optimierung der Trennleistung durch Gradientenelution
In natürlich kontaminierten Proben liegen oft komplexe PSP-Toxingemische von bis zu 12
Einzelsubstanzen mit unterschiedlicher Polarität vor, wodurch eine Gradientenelution unum-
gänglich wird.
Aufgrund der sehr unterschiedlich starken Affinität von einfach und zweifach positiv geladenen
PSP-Toxinen zur stationären Phase lag es nahe, mit Hilfe eines Pufferstärkegradienten zu
eluieren. Da es nicht gelang, sowohl anionische als auch kationische PSP-Toxine auf einem
Säulenmaterial zu trennen, wurde versucht, durch Kombination beider Austauschermaterialien
die chromatographische Trennung aller PSP-Toxine in einem Run zu erreichen. Mit der Kopp-
lung eines Anionen- und zweier Kationenaustauscher in Reihe wurde die optimale Variante
gefunden, wobei die Reihenfolge von An- und Kationenaustauschern eine Rolle spielte.
Der optimale Pufferstärkegradient erstreckt sich über 25 Minuten linear von 20 mmol/L bis
450 mmol/L Ammoniumacetat (Tab. 6). Ein nur schwacher Anstieg des Gradienten war für die
Trennung der Gonyautoxine unerläßlich, und ein sich an die GTX-Trennung anschließender
steilerer Gradient hätte zu starker Basisliniendrift im Elutionsbereich von Neo/dcSTX/STX
geführt. Auch war ein pH-Gradient wegen auftretender Sensitivitätsverschlechterung und Basis-
liniendrift zu vermeiden.
4. Entwicklung eines ionenaustauschchromatographischen Verfahrens... 39
Tab. 6: Chromatographische Bedingungen der neu entwickelten HPLC-Methode auf Basis von Ionenaustauschern zur Bestimmung von PSP-Toxinen
Stationäre Phase: 1x Source 15Q PE 4.6/100 (Nr. 71-5002-31) 2x Source 15S PE 4.6/100 (Nr. 71-5002-32) 15 µm Korngröße, Polystyren-Divinylbenzen-Polymer (Pharmacia Biotech) Eluent A: 20 mmol/L Ammoniumacetat, pH 6,9 Eluent B: 450 mmol/L Ammoniumacetat, pH 6,9 Flow: 0,8 mL/min Gradient: Zeit (min) Eluent A (%) Eluent B (%) 0 100 0 5 100 0 30 0 100 38 0 100 39 100 0 65 100 0 Post-column Derivatisierung: elektrochemisch, +1,05 V Detektion: Fluoreszenzdetektion bei Ex.: 330 nm, Em.: 395 nm
Das Chromatogramm in Abb. 16 zeigt die Elutionsfolge der am häufigsten vorkommenden PSP-
Toxine. Die Dauer eines Runs beträgt inklusive der Equilibrierungszeit 65 min.
Abb. 16: HPLC-Chromatogramm der Alge Alexandrium fundyense, dotiert mit einem PSP-Standardgemisch
4. Entwicklung eines ionenaustauschchromatographischen Verfahrens... 40
4.3 Detektion
Die einfache Zusammensetzung der mobilen Phase sowie der unkomplizierte Gradient eröffne-
ten bei der Nachsäulenderivatisierung die Möglichkeit, die chemische Oxidation der PSP-Toxine
durch eine elektrochemische Oxidation zu substituieren und hierzu einen elektrochemischen
Detektor einzusetzen (ELCD).
Zur Gewährleistung eines nahezu vollständigen Stoffumsatzes ist ein nach dem coulometrischen
Prinzip arbeitender ELCD verwendet worden. Der Coulochem II der Firma ESA diente in den
vorliegenden Untersuchungen lediglich als Potentiostat, wobei die elektrochemische Oxidation
in einer „Guard cell“ stattfand. Diese besitzt im Vergleich zur Arbeitselektrode einer analy-
tischen Zelle eine größere Elektrodenoberfläche, die einen höheren Stoffumsatz ermöglicht und
gleichzeitig aufgrund größerer Poren weniger anfällig gegen Belegungen ist.
Die Messung der elektrochemisch erhaltenen Oxidationsprodukte der PSP-Toxine erfolgt im
Fluoreszenzdetektor bei Wellenlängen von 330 nm (Ex.) und 395 nm (Em.). Die Detektion mit
dem Fluoreszenzdetektor hat gegenüber der direkten Detektion mit dem ELCD den Vorteil einer
höheren Nachweisempfindlichkeit und Selektivität.
Die Wahl des angelegten Potentials ist als Kompromiß aus möglichst langer Lebensdauer der
„Guard cell“ und ausreichender Nachweisempfindlichkeit zu werten. Die Oxidation der PSP-
Toxine findet ab +0,8 V statt, jedoch resultiert bei einer weiteren Erhöhung des Oxidationspoten-
tials eine höhere Nachweisempfindlichkeit. Die Festlegung auf +1,05 V ergibt sich aus einer bei
diesem Potential mit der chemischen Derivatisierung vergleichbaren Empfindlichkeit. (Tab. 7).
Die unterschiedliche Elutionskraft von Ammoniumacetat und Ammoniumformiat wird durch das
Gradientenprogramm und die Kopplung von An- und Kationenaustauschern weitestgehend aus-
geglichen, jedoch sollte der Acetatpuffer für die elektrochemische und der Formiatpuffer für die
chemische Oxidation bevorzugt werden.
Die Verwendung von 30% Acetonitril im Eluenten ermöglicht eine deutliche Verminderung der
Pufferkonzentration. Sie führt jedoch bei der fluorimetrischen Detektion zu einer Basislinien-
drift. Da dieses Problem bei der massenspektrometrischen Detektion nicht auftritt, sollte beim
Betreiben der LC/MS-Kopplung zur PSP-Bestimmung der ACN-haltige Eluent eingesetzt wer-
den (vgl. Kap. 5.3).
4. Entwicklung eines ionenaustauschchromatographischen Verfahrens... 41
4.4 Linearität und Reproduzierbarkeit der Fluoreszenzdetektion
Zur Kontrolle der Linearität und Reproduzierbarkeit der Fluoreszenzdetektion nach elektro-
chemischer Oxidation wurden 5 verschiedene Konzentrationen der als Standardlösungen verfüg-
baren PSP-Toxine je 3 mal in die HPLC-Apparatur injiziert. Die Detektionsgrenze (LOD) wurde
durch zweimalige Injektion der Toxinmenge bestätigt, die einem Signal-Rausch-Verhältnis von
3:1 im Chromatogramm des geringsten Kalibrationspunktes entsprach.
Die erhaltenen Ergebnisse ergaben eine gute Linearität bei guter Reproduzierbarkeit, wobei die
erreichten Nachweisgrenzen vergleichbar mit konventionellen HPLC-Verfahren, basierend auf
der Ionenpaarchromatographie mit chemischer Oxidation und Fluoreszenzdetektion, waren (Tab.
7 und 8).
Entsprechend der chemischen Oxidation zeigten auch die elektrochemischen Oxidationsprodukte
der N-1-OH-Toxine eine über 10fach geringere Fluoreszenzsensitivität als die STX-Analoga.
Tab. 7: LODs (S/N = 3:1) bei elektrochemischer Oxidation im Vergleich zur chemischen Oxida-tion einer konventionellen HPLC-Methode
Limit of detection (LOD, pg pro Injektion) Toxin
Chemische Oxidation 153 Elektrochemische Oxidation
GTX1 247 800 GTX2 10 10 GTX3 17 20 GTX4 218 550 Neo 800 600
dcSTX 16 20 STX 7 30
Tab. 8: Linearität der Fluoreszenzdetektion nach elektrochemischer Oxidation (5 Kalibrierpunkte pro Toxin)
Toxin Kalibrierbereich
Min – Max (ng) Kalibrierkurve
(y = mx+n) Korrelations- koeffizient r2
Rel. Standardabw. Min – Max (%)*
GTX1 3,450 – 15,500 28976 x + 0 0,937794 0,7 – 6,0 GTX2 0,600 – 4,800 2376510 x + 0 0,995834 1,7 – 3,4 GTX3 0,145 – 1,160 2864030 x + 0 0,994521 1,9 – 4,3 GTX4 1,720 – 6,100 46144 x + 0 0,964935 4,7 – 8,9 Neo 7,000 – 56,000 36891 x + 0 0,999620 2,0 – 4,5
dcSTX 0,500 – 4,000 2261770 x + 0 0,996341 1,1 – 4,2 STX 0,700 – 5,600 954390 x + 0 0,996337 0,7 – 2,7
* Die rel. Standardabweichung wurde für jeden Kalibrierpunkt ermittelt.
4. Entwicklung eines ionenaustauschchromatographischen Verfahrens... 42
4.5 Anwendbarkeit des entwickelten HPLC-Verfahrens zur PSP-Bestimmung aus
komplexen Matrizes 4.5.1 Methodenvergleich bei der Bestimmung von PSP-Toxinen aus marinen Organismen
Die Leistungsfähigkeit der entwickelten Methode zur PSP-Bestimmung wurde bei der Unter-
suchung toxischer Algenproben und kontaminierter Muscheln im Rahmen von Forschungs-
projekten und Routineuntersuchungen offenbar. Stellvertretend für die Vielzahl von Messungen
sollen an dieser Stelle die Ergebnisse eines Vergleichs zwischen der im Rahmen dieser Arbeit
optimierten Thielert-Methode (ionenpaarchromatographische Trennung und Fluoreszenz-
detektion nach chemischer Oxidation) und des neu entwickelten Verfahrens (Ionenaustausch-
chromatographie mit elektrochemischer Oxidation und Fluoreszenzdetektion) vorgestellt wer-
den.
Bei dem analysierten Untersuchungsmaterial handelte es sich um 7 Algenproben auf Filtern
(„A“) und 12 Muschelproben („M“), die aus verschiedenen Forschungsprojekten stammten und
unter Berücksichtigung eines möglichst breiten Konzentrations- und Toxinspektrums für die
vorliegende Untersuchung zusammengestellt worden waren.
Die Bedingungen für die Probenaufbereitung nach dem Protokoll von Hummert et al. waren für
beide Verfahren identisch 156. Es wurde mit jeder Methode eine Doppelbestimmung der Essig-
säureextrakte der Proben durchgeführt und die Mittelwerte dieser Ergebnisse (in ng Toxin/µL
Extrakt) für den Vergleich und die statistische Auswertung herangezogen (Tab. 9 sowie Abb. 17
und 18). Die Herkunft der verwendeten Proben sowie die Ergebnisse aller Messungen sind im
Anhang aufgeführt.
Tab. 9: Korrelationskoeffizienten für den Vergleich der optimierten Thielert-Methode mit der neu
entwickelten PSP-Methode (alle Proben sowie aufgeteilt in Algen- und Muschelproben)
STX Neo GTX2 GTX3 GTX1 GTX4 dcGTX2/3 PSP STXeq
Gesamt Algenproben
Muschelproben
0,9538
0,9996
0,9304
0,9983
0,9999
0,9959
0,9940
0,9997
0,9908
0,9916
0,9989
0,9816
0,9911
0,9999
0,9867
0,9950
0,9999
0,8918
0,9758
0,9995
0,9588
0,9976
0,9996
0,9899
0,9978
0,9997
0,9884
4. Entwicklung eines ionenaustauschchromatographischen Verfahrens... 43
Abb. 17: Korrelation der Gesamt-PSP-Gehalte, gemessen mit der optimierten Thielert- und der neu
entwickelten Methode Abb. 18: Korrelation der Gehalte an Neo, gemessen mit der optimierten Thielert- und der neu ent-
wickelten Methode
Anhand der Korrelationskoeffizienten der einzelnen, direkt quantifizierbaren PSP-Toxine zeigte
sich sowohl bei Muschelproben als auch bei der Analyse toxischer Algen eine sehr gute Über-
einstimmung zwischen beiden Methoden. Die niedrigeren Koeffizienten der Muschelextrakte
waren auf den störenden Einfluß von Matrixbestandteilen, insbesondere auf die früh eluierenden
Gonyautoxine, zurückzuführen. STX zeigte nur in einer Muschelprobe voneinander abweichende
Werte, während für GTX3 die beste Korrelation bei höheren Konzentrationen beobachtet wurde.
Bei den Gesamt-PSP-Gehalten (in ng PSP/µL und ng STXeq/µL) war ebenfalls eine gute Über-
einstimmung beider Meßreihen gegeben.
Die mit der neuen Methode erhaltenen PSP-Gehalte aus komplexen Matrizes sind also mit den
Werten vergleichbar, die bei Anwendung der etablierten ionenpaarchromatographischen Verfah-
ren resultieren.
y = 1,0816x-0,065 r2 = 0,9976
y = 0,9693x+0,0048r2 = 0,9983
4. Entwicklung eines ionenaustauschchromatographischen Verfahrens... 44
4.5.2 Gewinnung von PSP-Toxinen aus kontaminiertem biologischen Material
Die Applikation der Ionenaustauschchromatographie eröffnet auch die Möglichkeit der Gewin-
nung einzelner PSP-Toxine aus kontaminiertem biologischen Material. Die Voraussetzungen
dafür wurden durch den Einsatz von ausschließlich flüchtige Substanzen enthaltender Eluenten
sowie die vollständige chromatographische Trennung aller relevanten PSP-Toxine geschaffen.
Im Rahmen dieser Arbeit gelang bereits die Fraktionierung von Einzelsubstanzen aus PSP-
Standardgemischen und biologischen Proben. Die Fraktionen wurden anschließend in einer
leistungsfähigen Vakuumzentrifuge (SpeedvacR, Fa. ThermoLifeSciences) konzentriert, wobei
auch Ammoniumacetat entfernt wurde. Durch das schonende Abdampfen des Lösungsmittels im
Vakuum blieben die einzelnen PSP-Toxine nahezu verlustfrei erhalten. Im dargestellten Beispiel
(Tab. 10) wurden die Toxinrückstände aus 1 mL eingedampfter Pufferlösung in 100 µL (Kon-
zentrationsfaktor 10) bzw. 300 µL (Konzentrationsfaktor 3,3) 0,03 N Essigsäure aufgenommen.
Tab. 10: Wiederfindungsraten und relative Standardabweichungen von in Ammoniumacetat ein-
gedampften Lösungen von Toxinstandards (3fach-Wiederholung)
Toxin Kontrollstandard % SD %*
Konzentrationsfaktor 3,3 % SD %
STX 100 2,5 92,3 93,0 91,4 ∅ 92,2 1,7 Neo 100 2,1 93,5 94,3 85,9 ∅ 91,2 5,1 GTX2 100 4,2 86,7 92,7 82,5 ∅ 87,3 5,4 GTX3 100 3,2 143,9 138,0 166,7 ∅ 149,5 9,3 dcGTX2 100 2,3 89,4 72,4 66,7 ∅ 76,2 11,8 dcGTX3 100 7,6 139,9 136,3 137,6 ∅ 137,9 1,8 GTX1 100 12,9 85,6 86,4 79,1 ∅ 83,7 4,8 GTX4 100 2,5 130,0 121,6 152,1 ∅ 134,6 13,8
∅ 106,6
Toxin Kontrollstandard % SD %
Konzentrationsfaktor 10 % SD %
STX 100 2,5 89,8 85,1 77,7 ∅ 84,2 6,5 Neo 100 2,1 85,6 80,5 88,7 ∅ 84,9 4,4 GTX2 100 4,2 86,1 79,8 76,3 ∅ 80,7 5,6 GTX3 100 3,2 143,4 154,0 146,8 ∅ 148,1 3,4 dcGTX2 100 2,3 77,3 68,0 66,5 ∅ 70,6 8,3 dcGTX3 100 7,6 124,8 130,5 135,2 ∅ 130,2 4,0 GTX1 100 12,9 87,6 73,7 72,8 ∅ 78,0 10,3 GTX4 100 2,5 136,7 126,8 133,8 ∅ 132,4 8,2 ∅ 101,4 * SD % = relative Standardabweichung
4. Entwicklung eines ionenaustauschchromatographischen Verfahrens... 45
Zu beachten waren jedoch die durch Milieuänderungen (neutraler pH-Wert, Vakuum, Vorhan-
densein zusätzlicher Ionen) bedingten Toxinumwandlungen. Diese Bedingungen reichten aus,
um das in den Toxinstandardlösungen (schwach saurer pH-Wert) vorliegende stabile Gleich-
gewicht von 3:1 zwischen den Toxinepimeren GTX2/GTX3, GTX1/GTX4 und
dcGTX2/dcGTX3 zugunsten der thermodynamisch instabileren β-Epimere zu verschieben (neue
Epimerenverhältnisse: 2,5:1 bis 2,0:1) 58,157. Zersetzungen, die sich in zusätzlichen Peaks
bemerkbar machen würden, wurden nicht beobachtet, wie anhand der Eindampfung von Einzel-
standardlösungen überprüft werden konnte. Allerdings ist zu erwarten, daß die Ausgangswerte
der Epimerengleichgewichte in 0,03 N Essigsäure nach einer gewissen Zeit wieder erreicht wer-
den.
Diese Beobachtungen bzgl. einer geänderten Keto-Enol-Gleichgewichtseinstellung wurden an-
schließend genutzt, die durch das Fehlen von Einzelstandards bisher nicht bestätigte Vermutung
über die Elutionsfolge der Decarbamoylgonyautoxine 2 und 3 bei der (mod.) Thielert-Methode
zu verifizieren.
Im Vergleich zur Ionenaustauschchromatographie eluieren die (Decarbamoyl-)Gonyautoxine bei
der (mod.) Thielert-Methode anders, d.h. es findet ein „Wechsel“ der Elutionsfolge zwischen
α- und β- Epimeren statt: 1. (β) GTX4, 2. (α) GTX1, 3./4. dcGTX2/dcGTX3, 5. (α) GTX2,
6. (β) GTX3. Da sich bei der Vakuumeindampfung der PSP-Toxine in Ammoniumacetatlösung
das Epimerengleichgewicht zugunsten der β-Epimere verschiebt, konnten anhand der Größen-
veränderungen der dcGTX-Peaks bei der Aufkonzentrierung eines verdünnten GTX2/GTX3
Standards (welcher geringe Mengen dcGTXs enthielt) dcGTX2 und dcGTX3 bestimmten Peaks
in den Chromatogrammen eindeutig zugeordnet werden: (α) dcGTX2 eluiert demnach bei der
Thielert-Methode vor (β) dcGTX3.
Die Gewinnung von „reinen“ Fraktionen und ihre problemlose Konzentration mittels Vakuum-
evaporation bieten sich für eine wirtschaftliche Gewinnung von PSP-Standardlösungen im
präparativen Maßstab an. Derzeit wird das upscaling durch die Verwendung (semi-)präparativer
Säulen im Rahmen einer Diplomarbeit optimiert und sowohl bei der Gewinnung von PSP-
Einzelsubstanzen als auch bei der Isolierung von unbekannten Verbindungen bzw. noch nicht
identifizierten PSP-Metaboliten bereits erfolgreich durchgeführt. Damit bildet die im (semi-)
präparativen Maßstab betriebene Ionenaustauschchromatographie die Basis, die Struktur von
durch Fraktionssammlung isolierten Substanzen mit Hilfe leistungsfähiger, moderner Analysen-
verfahren, wie MS-MS und NMR, aufzuklären.
4. Entwicklung eines ionenaustauschchromatographischen Verfahrens... 46
4.6 Diskussion der Ergebnisse
Im Hinblick auf die angestrebte HPLC-Trennung möglichst aller PSP-Toxine mittels einfacher,
kostengünstiger und MS-kompatibler Eluentensysteme bei Vermeidung der angeführten Nach-
teile der HPLC-Methoden mit post-column Derivatisierung versprach der Einsatz der Ionen-
austauschchromatographie die größte Aussicht auf Erfolg, insbesondere da in den letzten Jahren
erhebliche Fortschritte bei der Entwicklung leistungsfähiger Austauschermaterialien erzielt wur-
den.
Die Wahl fiel auf die Polymerphasen Source 15S und Source 15Q (Fa. Pharmacia Biotech), die
sich durch die weitgehende Trennung aller in kontaminiertem Probenmaterial relevanten PSP-
Toxine und eine hohe Belastbarkeit auszeichnen, jedoch auch durch höhere Anschaffungskosten
gekennzeichnet sind.
Die Optimierung des Eluenten zur Trennung der PSP-Toxine sowohl an Anionen- als auch an
Kationenaustauschern erfolgte über die Abstimmung verschiedener, Retention und Auflösung
beeinflussender Parameter. Dazu zählen die Art und die Konzentration der Puffersubstanzen
(Ionenstärke), der pH-Wert des Eluenten sowie die Art und die Konzentration der organischen
Modifier.
Mit Ammoniumacetat als alleinigem Bestandteil der wäßrigen mobilen Phase und einem
einfachen linearen Gradienten können sowohl N-Sulfocarbamoyl- als auch Carbamoyl- und
Decarbamoyltoxine mit einer Kombination aus Anionen- und Kationenaustauschern in einem
chromatographischen Lauf von vertretbarer Dauer getrennt werden. Die Elutionsfolge ist (mit
Ausnahme des Wechsels zwischen GTX1 und GTX4) identisch mit der modifizierten Thielert-
Methode, jedoch können zusätzlich auch C1 und C2 im gleichen Run bestimmt werden. Die
Quantifizierung der N-Sulfocarbamoyltoxine sollte jedoch wegen des Fehlens von Standard-
lösungen über ihre indirekte Messung nach der salzsauren Hydrolyse des Essigsäureextraktes
erfolgen.
Durch die Verwendung eines einfachen Eluentensystems konnte die aufwendige und störanfälli-
ge chemische Oxidation in einer Nachsäulenderivatisierungseinheit durch eine elektrochemische
Oxidation mit Hilfe eines ELCD ersetzt werden. Dadurch wird der Verbrauch an Chemikalien
deutlich reduziert, eine Verdünnung der eluierten Toxine, die zur Bandenverbreiterung führt,
vermieden und das Grundrauschen der Basislinie wegen des Fehlens der Pulsation zusätzlicher
Pumpen signifikant verringert.
Die entwickelte HPLC-Methode mit elektrochemischer Oxidation und nachfolgender Fluores-
zenzdetektion der derivatisierten PSP-Toxine konnte erfolgreich zur Bestimmung von PSP-
4. Entwicklung eines ionenaustauschchromatographischen Verfahrens... 47
Toxinen in unterschiedlichen Matrizes eingesetzt werden. Dabei erwiesen sich die Trennleistung
der Ionenaustauschersäulen und die Nachweisempfindlichkeit des Verfahrens als ausreichend,
um im Rahmen der Lebensmittelüberwachung PSP-Toxine schnell und eindeutig nachzuweisen
und Studien über den Verbleib der PSP-Toxine in der marinen Nahrungskette sowie über ihre
Metabolisierungsprozesse durchzuführen.
Erhöhte Aufmerksamkeit muß jedoch der Pflege der elektrochemischen Zelle gewidmet werden.
Während die Analyse von Extrakten aus Algenzellen einen hohen Probendurchsatz erlaubten,
führte die routinemäßige Untersuchung von Muschelproben zu einer schnellen Belegung der
Elektrodenoberfläche und damit zu Druckanstieg und Verlust an Sensitivität. Das macht eine
tägliche Reinigung der Zelle mit Methanol erforderlich. Bei stärkerer Kontamination ist die
Regeneration der Zelle durch Spülen mit 6 N HNO3 notwendig, um die optimalen Bedingungen
für die elektrochemische Oxidation der PSP-Toxine wiederherzustellen.
Als Nachteil erweist sich, daß Vorsäulen mit gleichem Ionenaustauschermaterial zur Verlänge-
rung der Lebensdauer der analytischen Säulen nicht kommerziell erhältlich sind. Als Alternative
zur kostenintensiven Eigenherstellung bzw. zum häufigen Spülen der Säulen mit NaCl bietet sich
der Einsatz von leicht austauschbaren und preiswerten C18 Guardfritten mit kleinerer Poren-
größe (5 µm, Fa. Phenomenex) an, wodurch unerwünschte Matrixbestandteile von der stationä-
ren Phase und der elektrochemischen Zelle zurückgehalten werden.
Die Verwendung einer elektrochemische Zelle vereinfacht den Ausschluß falsch positiver
Ergebnisse, denn die von der HPLC-Säule eluierten PSP-Toxine können sowohl underivatisiert
(Oxidationspotential = 0) als auch in oxidierter Form (Oxidationspotential = 1,05 V) zum
Fluoreszenzdetektor gelangen und so von natürlich fluoreszierenden Verbindungen unter-
schieden werden. Dieses Vorgehen erschließt zusätzlich die Möglichkeit, PSP-Toxine und weite-
re Substanzen, die von Interesse sind, aus kontaminiertem biologischen Material nach der
HPLC-Trennung mit Hilfe eines Fraktionssammlers underivatisiert für die Herstellung von
Toxinstandards oder für weitere Untersuchungen zu gewinnen.
Allerdings beruht der entscheidende Vorteil des neu entwickelten chromatographischen Systems
auf Ionenaustauscherbasis gegenüber den etablierten Verfahren der Ionenpaarchromatographie
darauf, daß die Ionenaustauschchromatographie ideal für eine Kopplung mit einem Massen-
spektrometer geeignet ist.
5. Der Einsatz der Ionenaustauschchromatographie in der Kopplung LC/MS 48
5. Der Einsatz der Ionenaustauschchromatographie in der Kopplung LC/MS
Die Ionenaustauschchromatographie erlaubt den Verzicht auf nichtflüchtige Puffersubstanzen
und Ionenpaarbildner, und dadurch ergibt sich neben der Vereinfachung der Nachsäulen-
derivatisierung durch eine elektrochemische Oxidation auch die Möglichkeit des Einsatzes eines
Massenspektrometers als weiteren selektiven Detektor.
Mit dem für die Kopplung LC/MS tauglichen Eluenten, der nur Ammoniumacetat enthält, kön-
nen die Ergebnisse fluoreszenzspektrometrischer Detektion zusätzlich mit Hilfe der Massen-
spektrometrie abgesichert werden.
5.1 Einführende Untersuchungen zur massenspektrometrischen Detektion von PSP-
Toxinen
Die Versuche wurden an einem Single-Quadrupol-Massenspektrometer (PE/Sciex API 150EX)
durchgeführt. Die Kopplung der HPLC-Apparatur an das Massenspektrometer erfolgte mittels
Atmospheric Pressure Ionisation (API) mit einem Elektrospray-Interface (ESI).
Zunächst erfolgte die Überprüfung der Ionisierbarkeit aller als Standardlösungen verfügbaren
PSP-Toxine mittels „flow injection analysis“ (FIA) direkt in das Elektrospray-Interface des
Massenspektrometers. Da die Mehrzahl der PSP-Toxine bei neutralem pH-Wert eine positive
Nettoladung aufweist, wurde der positive Ionisierungsmodus gewählt.
Zur Optimierung der Ionisierungsbedingungen (Ionisierungsspannung, Orifice-Spannung, Ring-
Spannung, Temperatur des Stickstofföns etc.) wurde das HPLC-System ohne stationäre Phase an
das ESI des Massenspektrometers gekoppelt und die Analyten direkt in die mobile Phase
injiziert. Die ermittelten optimalen Ionisierungsparameter sind in Tab. 11 dargestellt.
Tab. 11: Ionisierungsparameter für die massenspektrometrische Detektion von PSP-Toxinen
Parameter Wert Parameter Wert
Ionisierungsspannung
5200 V
NEB
14 rel. E. Ring-Spannung 160 V CUR 10 rel. E. Orifice-Spannung
10 V Temperatur N2 400°C
5. Der Einsatz der Ionenaustauschchromatographie in der Kopplung LC/MS 49
Die gewählte Temperatur des Nebulizergases von 400°C hat keinen Einfluß auf die Stabilität der
PSP-Toxine, da die Temperatur der Lösungsmitteltröpfchen aufgrund der Abkühlung durch
Verdampfung 50°C nicht übersteigt. Sie ist jedoch für die möglichst vollständige Desolvation
des wäßrigen Eluates unerläßlich.
m/z, amu
200 300 400 500
Inte
nsity
, cps
0
2e+5
4e+5
6e+5
8e+5
300.2Saxitoxin(M+H)+
6.95e5 cps
279.2 329.2394.2 459.3
231.1214.1
175.1158.1
138.1200.1
+Q1: 0.18 min from 08.02.02 PSP EJ 10
m/z, amu
260 280 300 320 340 360 380 400 420
Inte
nsity
, cps
0
2e+4
4e+4
6e+4
8e+4
1e+5316.2
GTX2
(M-SO3+H)+
GTX3
(M+H)+
396.2
279.2271.2 298.2
361.2
8.30e4 cps+Q1: 2.49 min from 08.02.02 PSP EJ 109
Abb. 19: Massenspektren von STX, GTX2 und GTX3 (nach „flow injection analysis“)
Anhand der im Scan-Mode aufgenommenen Massenspektren (Abb. 19) zeigte sich, daß alle
PSP-Metaboliten einfach geladen detektiert werden. Bei einigen Toxinen (N-Sulfocarbamoyl-
und Carbamoyltoxine) kommt es jedoch zur Abspaltung der OSO3--Gruppe am R2 bzw. R3
(Tab. 12). Hingegen traten Dehydratisierungen [M-H2O]+ und Acetatanlagerungen [M+Ac]+
nicht auf, und es wurden auch keine Natriumaddukte [M+Na]+ beobachtet 115,145,158.
5. Der Einsatz der Ionenaustauschchromatographie in der Kopplung LC/MS 50
Tab. 12: Massenspektrometrische Detektion der PSP-Toxine
Toxin Detektiertes Molekül
Massenzahl m/z
Toxin Detektiertes Molekül
Massenzahl m/z
STX
[M+H]+
300,1
dcGTX2
[M+H]+
352,1 dcSTX [M+H]+ 257,1 dcGTX3 [M+H]+ 352,1 Neo [M+H]+ 316,1 C1 [M-SO3+H]+ 396,2 GTX1 [M-SO3+H]+ 332,1 C2 [M-SO3+H]+ 396,2 GTX2 [M-SO3+H]+ 316,1 C3 [M+H]+ 492,3 GTX3 [M+H]+ 396,2 C4 [M+H]+ 492,3 GTX4 [M+H]+ 412,2
Die Ionisierungsparameter wurden stets so gewählt, daß eine Fragmentierung möglichst aller
Moleküle von GTX2, GTX1, C1 und C2 auftrat. Die OSO3--Abspaltung scheint bei GTX2 und
GTX1 leichter stattzufinden als bei GTX3 und GTX4. Wahrscheinlich hat die relative Stabilität
dieser [M-SO3+H]+ Produkte ihre Ursache in der α-Stellung der 11-Hydroxysulfatgruppe, die
eine stabilisierende Wechselwirkung mit dem ähnlich orientierten Guanidino-Kation erlaubt 115,151. Die zur Detektion herangezogenen Massenzahlen der C-Toxine wurden durch Injektion
von Algenextrakten, die hohe Konzentrationen an diesen Toxinen aufwiesen, ermittelt.
Mit der Applikation des neu entwickelten HPLC-Trennverfahrens findet ein Gradient mit relativ
hoher Ionenstärkedifferenz in der massenspektrometrischen Detektion Anwendung. Da die
Konzentration an Puffersalzen in der mobilen Phase Einfluß auf das Ionisierungsverhalten hat
und hohe Pufferkonzentrationen die Ionisierung unterdrücken, ist ihr Effekt bei der Festlegung
der Arbeitsbedingungen für das Erreichen einer hohen Nachweisempfindlichkeit von großer
Bedeutung. Es wurden die Peakflächen bei Ammoniumacetatkonzentrationen von 450 mmol/L
bis 5 mmol/L durch Injektion ohne Säule ermittelt und ein Anstieg der Empfindlichkeit, insbe-
sondere ab Puffersalzkonzentrationen von <50 mmol/L, festgestellt (Abb. 20).
Abb. 20: Abhängigkeit der Signalintensität von der Pufferkonzentration (13,4 ng GTX1 bzw. 15,0
ng dcSTX injiziert)
5. Der Einsatz der Ionenaustauschchromatographie in der Kopplung LC/MS 51
5.2 Applikation der entwickelten HPLC-Trennmethode in der Massenspektrometrie
Für den Betrieb der LC/MS-Kopplung wurden die chromatographischen Bedingungen (HPLC-
Säulen, mobile Phase, Gradient) zunächst von der neuen HPLC/FLD-Methode übernommen.
Nach Injektion eines PSP-Mischstandards wurden unter Beibehaltung der Flußrate die PSP-
Toxine weiterhin gut getrennt, jedoch war die Nachweisempfindlichkeit im Massenspektrometer
nur gering. Außerdem trat bei der Retentionszeit von STX im TIC-Chromatogramm (Totalionen-
strom, Summe der Massenspuren aller detektierten PSP-Toxine) ein größerer Interferenzpeak
auf, der später auch bei Messungen von Proben beobachtet wurde. Die Analyse der einzelnen
Massenspuren (SIM-Mode, Single Ion Monitoring) ergab für diesen Peak die Massenzahl
m/z = 316, so daß die Detektion von Neo, dcSTX und STX nicht beeinträchtigt wurde (Abb. 21).
Abb. 21: LC/MS-Chromatogramm einer PSP-Mischstandardlösung im TIC-Mode (oben); GTX2,
Neo und STX extrahiert (SIM-Mode)
5. Der Einsatz der Ionenaustauschchromatographie in der Kopplung LC/MS 52
Die Quantifizierung der PSP-Toxine bereitet aufgrund der geringeren Empfindlichkeit der MS-
Detektion im Vergleich zur Fluoreszenzdetektion und der kleineren Peakhöhen im LC/MS-
Chromatogramm Schwierigkeiten. Werden aber aus diesen Chromatogrammen nur die Massen-
spuren der einzelnen PSP-Toxine extrahiert, so ist eine eindeutige Identifizierung und Quantifi-
zierung der Toxine im Bereich lebensmittelrechtlich relevanter PSP-Konzentrationen möglich.
Auch können größere Injektionsvolumina (bis zu 100 µL) die mangelnde Sensitivität der MS-
Detektion zumindest teilweise ausgleichen, zumal keine durch die höhere Ionenstärke größerer
Injektionsvolumina hervorgerufenen Retentionszeitverschiebungen auftreten.
Bei längerer Betriebsdauer der LC/MS-Kopplung traten Probleme im Bereich der Einlaß-
kapillare des Interfaces (unregelmäßiges Spray) auf, und die hohe Temperatur des parallel zum
Eluat strömenden Nebulizergases führte an kritischen Punkten zur Auskristallisation von
Ammoniumacetat. Zur Stabilisierung des Elektrosprays wurde deshalb ein geringes Splitverhält-
nis der mobilen Phase im T-Stück vor dem ESI von 3:1 (Abfall:transferierte Menge) gewählt, so
daß ca. 200 µL Eluat/min in das ESI gelangten.
5.3 Modifizierung der LC/MS-Methode
5.3.1 Substitution des Puffersalzes
Auf der Suche nach Möglichkeiten, die Ionisierung und damit die Empfindlichkeit der Detektion
zu verbessern, wurde Ammoniumacetat durch Ammoniumformiat unter Beibehaltung des
Gradienten ersetzt (vgl. Kap. 4.2.2 und 4.3). Die Injektion einzelner PSP-Toxine offenbarte
jedoch eine um das 2-3fache geringere Sensitivität für fast alle PSP-Verbindungen (Abb. 22).
Abb. 22: Einfluß der Pufferart auf die Signalintensität bei gleicher injizierter Toxinmenge A = Ammoniumacetat B = Ammoniumformiat
5. Der Einsatz der Ionenaustauschchromatographie in der Kopplung LC/MS 53
Weiterhin wurde der Einfluß von Trifluoressigsäure als MS-gängiges Elutionsmittel auf die
Detektionsempfindlichkeit getestet. Da die Elution der PSP-Toxine auf den Ionenaustauschern
nur bei vergleichsweise hoher TFA-Konzentration erfolgte (vgl. Kap. 4.2.2), war auch dadurch
eine Sensitivitätssteigerung (selbst bei niedrigem pH-Wert und ohne die Zugabe von NH4+-
Ionen) nicht zu erreichen.
5.3.2 Verwendung organischer Modifier
Bereits im Kapitel zur Entwicklung des HPLC-Verfahrens war auf die hohe Elutionskraft von
Acetonitril bei Verwendung von Ionenaustauschern hingewiesen worden (vgl. Kap. 4.2.4). Der
Anteil von ACN in der mobilen Phase war jedoch auf 30% begrenzt, so daß lediglich eine
Halbierung der zur Trennung notwendigen hohen Pufferstärke erfolgte. Aber die Erhöhung des
organischen Anteils im Eluenten hat prinzipiell positive Auswirkungen auf die Ionisierung von
Analyten im ESI-Verfahren 144.
Abb. 23: Einfluß von Acetonitril auf die Signalintensität bei gleicher injizierter Toxinmenge
A = mobile Phase mit 30% ACN (vgl. Tab. 13) B = mobile Phase ohne ACN (vgl. Tab. 6)
Wasser besitzt einen hohen Siedepunkt und eine sehr hohe Verdampfungsenthalpie. Dadurch
kommt es bei der Vernebelung zur Bildung großer Tröpfchen, deren Desolvation im API meist
unvollständig bleibt. Organische, unpolarere Lösungsmittel, wie Acetonitril, gehen dagegen auf-
grund ihres wesentlich niedrigeren Siedepunktes und geringeren Oberflächenspannung leichter
und schneller in die Gasphase über. Die Verdampfung der Eluattröpfchen und die Ionisierung
sind vollständiger, d.h. der Anteil des Analyten, der durch ungenügend verdampfte Lösungs-
mittel für die Messung verloren geht, ist geringer 143. Die Erhöhung des organischen Anteils auf
5. Der Einsatz der Ionenaustauschchromatographie in der Kopplung LC/MS 54
30% brachte in unserem Fall zwar keine empfindlichere massenspektrometrische Detektion der
PSP-Toxine, dafür eine deutliche Verbesserung des Sprayverhaltens des Eluats an der Einlaß-
kapillare mit sich (Abb. 23).
Die im Hinblick auf den Einsatz des Massenspektrometers vorgenommenen Änderungen der
chromatographischen Bedingungen betrafen aber nur die Zusammensetzung der mobilen Phase,
während das Gradientenprogramm und die Flußraten ohne Beeinträchtigung der Toxintrennung
beibehalten werden konnten (Tab. 13).
Tab. 13: Chromatographische Bedingungen für die Bestimmung von PSP-Toxinen mittels MS-
Detektion
Stationäre Phase: 1x Source 15Q PE 4.6/100 (Nr. 71-5002-31) 2x Source 15S PE 4.6/100 (Nr. 71-5002-32) Eluent A: 10 mmol/L Ammoniumacetat, pH 6,9, 30% Acetontril (v:v) Eluent B: 250 mmol/L Ammoniumacetat, pH 6,9, 30% Acetonitril (v:v) Gradient: Zeit (min) Eluent A (%) Eluent B (%) Flow (mL/min) 0 100 0 0,8 5 100 0 0,8 30 0 100 0,8 38 0 100 0,8 39 100 0 0,8 65 100 0 0,8
Um weiterhin die gewünschte, möglichst vollständige Abspaltung von OSO3
- bei GTX1, GTX2,
C1 und C2 zu erreichen, war durch die veränderte Zusammensetzung der mobilen Phase eine
Neueinstellung der Ionisierungsparameter unumgänglich (Tab. 14).
Tab. 14: Ionisierungsparameter für die massenspektrometrische Detektion von PSP-Toxinen bei
30% Acetonitril im Eluenten
Parameter Wert Parameter Wert
Ionisierungsspannung
5200 V
NEB
12 rel. E. Ring-Spannung 160 V CUR 9 rel. E. Orifice-Spannung
10 V Temperatur N2 250°C
5. Der Einsatz der Ionenaustauschchromatographie in der Kopplung LC/MS 55
5.4 Linearität und Nachweisempfindlichkeit der MS-Detektion
Zur Überprüfung der Linearität der MS-Detektion wurden 5 unterschiedlich konzentrierte PSP-Toxinstandardgemische (GTX1-GTX4, Neo, STX) bzw. Einzelstandards (dcSTX) je zweimal in die HPLC-Apparatur injiziert, wobei die MS-Detektion aus den oben beschriebenen Gründen im SIM-Mode erfolgte. Die empfindlichsten Signale wurden für STX erhalten, und am unempfindlichsten wurde Neo detektiert. Diese Rangfolge der Nachweisempfindlichkeit entspricht im wesentlichen der der Fluoreszenzdetektion, jedoch sind die Unterschiede der LODs zwischen den einzelnen PSP-Toxinen bei der MS-Detektion deutlich geringer. Für alle 7 PSP-Toxine ergab sich aber eine gute Linearität innerhalb der analysierten Konzentrationen (Tab. 15). Die in der Literatur zitierten Nachweisgrenzen von PSP-Toxinen im Massenspektrometer wur-den hauptsächlich nach FIA ermittelt und sind dadurch nicht zum direkten Vergleich geeignet. Die auf diese Weise erhaltenen Werte bewegen sich im Bereich 10-30 pg STX/µL und damit auf einem deutlich niedrigeren Level 115,147.
Tab. 15: Linearität und LODs (S/N = 3:1) der MS-Detektion von PSP-Toxinen (5 Kalibrierpunkte)
Toxin Kalibrierbereich Min – Max (ng)
Kalibrierkurve y = mx+n
Korrelations- koeffizient r2
LODs (ng pro Injektion)
GTX1
1,0 – 33,5
61508 x + 0
0,9936
1,0 GTX2 1,5 – 54,0 114890 x + 0 0,9992 1,5 GTX3 0,5 – 13,0 160160 x + 0 0,9981 0,5 GTX4 1,5 – 14,5 30174 x + 0 0,9999 1,5 Neo 2,0 – 64,0 96729 x + 0 0,9995 2,0
dcSTX 1,0 – 7,0 56299 x + 0 0,9980 1,0 STX 0,5 – 64,0 396710 x + 0 0,9987 0,5
5.5 Anwendung der entwickelten LC/MS-Kopplung Der Einsatz der LC/MS-Kopplung bei der Analyse von PSP-Toxinen aus biologischem Proben-material verlief sehr zufriedenstellend. Abb. 24 zeigt das TIC-Chromatogramm eines C-toxin-reichen Algenextraktes, der mit PSP-Standardlösungen angereichert wurde, und in Abb. 25 ist das TIC-Chromatogramm einer Muschelprobe (Mytilus chilensis, Fjord Aysen, Chile XI, 2000) dargestellt. Für die Messungen wurden 50 µL bzw. 100 µL Extrakt injiziert. Der im Vergleich zur Fluoreszenzdetektion und im Verhältnis zu den übrigen gemessenen PSP-Toxinen signifikant höhere Peak für STX ist auf die Überlagerung mit dem oben beschriebenen Interferenzpeak mit m/z = 316 zurückzuführen. Die Quantifizierung von STX über die Massenspur von m/z = 300,1 wurde dadurch aber nicht beeinträchtigt.
5. Der Einsatz der Ionenaustauschchromatographie in der Kopplung LC/MS 56
1.
2.
Abb. 24: HPLC/Fluoreszenz/MS-Bestimmung von PSP-Toxinen (Standardgemisch): C1, C2, GTX1 (34,4 ng), GTX4 (17,8 ng), dcGTX2/3, GTX2 (57,4 ng), GTX3 (20,8 ng), Neo (69,6 ng), dcSTX (50,0 ng), STX (79,8 ng). 1. Fluoreszenz-Chromatogramm 2. TIC-Chromatogramm
5. Der Einsatz der Ionenaustauschchromatographie in der Kopplung LC/MS 57
1.
2.
Abb. 25: HPLC/FLD/MS-Bestimmung von PSP-Toxinen in Muscheln (Mytilus chilensis) 1. Fluoreszenz-Chromatogramm 2. TIC-Chromatogramm
5. Der Einsatz der Ionenaustauschchromatographie in der Kopplung LC/MS 58
Die Vermeidung der chemischen Oxidation mit nichtflüchtigen Reagenzien ermöglichte nun
auch die Parallelschaltung zweier selektiver und empfindlicher Detektoren, d.h. die Detektion
konnte sowohl mit dem Fluoreszenzdetektor als auch mit dem Massenspektrometer erfolgen.
Dadurch wurde die parallele Messung von Proben nach der chromatographischen Trennung
möglich (Abb. 26).
Abb. 26: HPLC-System mit Ionenaustauschersäulen und paralleler MS-Detektion bzw. elektro-chemischer Oxidation mit Fluoreszenzdetektion und optionalem Fraktionssammler
Der vor dem ESI-Interface geteilte Fluß wird zu einem Teil direkt in das Massenspektrometer
und zum anderen Teil zunächst in die elektrochemische Zelle zur Derivatisierung und danach
zum Fluoreszenzdetektor geleitet. Die veränderte Kapillarlänge nach dem Split als auch der von
der elektrochemischen Zelle und dem Fluoreszenzdetektor verursachte Gegendruck (ca. 5-7 bar)
verringerten das Splitverhältnis von 3:1 auf ca. 2:1, wodurch sich das in das MS transferierte
Eluatvolumen auf bis zu 270 µL/min erhöhte, das jedoch vom ESI-Interface problemlos aufge-
nommen werden konnte. Die daraus resultierenden Verringerungen von Flußrate und Analyt-
konzentration bei der Fluoreszenzdetektion führten aber nicht zu einer Peakverbreiterung, und
sie waren für zuverlässige Ergebnisse ausreichend, da die Injektionsvolumina zum Ausgleich der
niedrigeren Sensitivität der MS-Messung bewußt hoch angesetzt wurden.
5. Der Einsatz der Ionenaustauschchromatographie in der Kopplung LC/MS 59
Unerläßlich für eine gute Reproduzierbarkeit der bei Einsatz der HPLC/FLD/MS-Kopplung
erhaltenen Ergebnisse ist die sorgfältige Wartung der elektrochemischen Zelle. Die Belegung der
Elektrodenoberfläche ist in einem hohen Maße auch mit einem Druckanstieg in der Zelle (wegen
des Durchflusses der mobilen Phase durch porösen Graphit) verbunden. So sollte eine tägliche
Regeneration der Zelle (durch Spülen mit Methanol oder bei stärkerer Verschmutzung durch
Spülen mit 6 N Salpetersäure) vorgenommen werden, um weiterhin optimale Meßbedingungen
zu gewährleisten.
Elektrochemische Zelle und Fluoreszenzdetektor können aber auch vor den MS-Split geschaltet
werden. Dann muß für die MS-Detektion lediglich die elektrochemische Zelle ausgeschaltet
werden (Oxidationspotential = 0), um die PSP-Toxine underivatisiert in das Massenspektrometer
zu überführen. Eine parallele Erfassung der PSP-Toxine ist in diesem Fall jedoch nicht möglich.
Die Fluoreszenzdetektion der PSP-Toxine erfolgt in einem zweiten Run.
Unabhängig vom jeweiligen Meßaufbau ist jedoch mit der MS-Absicherung der durch Fluores-
zenzdetektion erhaltenen Ergebnisse die eindeutige und genaue Bestimmung von PSP-Toxinen
im Rahmen der lebensmittelrechtlichen Überwachung problemlos möglich.
5.6 Entwicklung einer schnellen Screening-Methode
Das breite Spektrum der bei der PSP-Bestimmung zur Verfügung stehenden Massenzahlen
führte zu der Überlegung, die Meßdauer eines Runs unter Inkaufnahme des Verlustes an Trenn-
leistung zu verkürzen und dadurch eine schnelle Screening-Methode für Routineanalysen in der
Lebensmittelüberwachung bereitzustellen.
Bei einer Pufferkonzentration von 250 mmol/L Ammoniumacetat und 30% Acetonitril erfolgt
unter isokratischen Bedingungen (Flußrate 0,8 mL/min) eine sehr schnelle Elution der Toxine,
wobei gleichzeitig schärfere und für spät eluierende PSP-Toxine (Neo) auch höhere Peaks im
Vergleich zu Messungen mit einem Gradienten erhalten werden. Allerdings findet unter diesen
chromatographischen Bedingungen eine Trennung lediglich zwischen einfach und zweifach
positiv geladenen PSP-Toxinen statt. GTX2 und Neo, die bei gleicher Massenzahl (m/z = 316)
detektiert werden, können somit getrennt erfaßt werden (Abb. 27 und 28). Wichtig ist eine voll-
zählige Fragmentierung von GTX1 und GTX2 gegenüber GTX3 und GTX4, da die jeweiligen
Epimere eine unterschiedliche Toxizität aufweisen. Die Fragmentierung von GTX2 und GTX1
sollte deshalb vor Meßbeginn durch Injektion einer PSP-Standardlösung überprüft und
gegebenenfalls durch Optimierung der Ionisierungsparameter erfolgen.
5. Der Einsatz der Ionenaustauschchromatographie in der Kopplung LC/MS 60
N-Sulfocarbamoyltoxine können mit dieser Screening-Methode nicht gemessen werden und
stören die Erfassung der Carbamoyltoxine mit gleicher Massenzahl (z.B. GTX3). In der Lebens-
mittelkontrolle spielen aber B- und C-Toxine keine Rolle, denn sie werden bei der Proben-
aufarbeitung durch Erhitzen mit Salzsäure in die korrespondierenden Carbamoyltoxine umge-
wandelt 90. Damit entfällt auch die chromatographische Trennung der anionischen PSP-Toxine,
so daß die stationäre Phase nur noch aus den Kationenaustauschern besteht. Der Zeitraum bis zur
vollständigen Elution der lebensmittelrechtlich relevanten PSP-Toxine, d.h. die Dauer des Meß-
vorgangs, beträgt bei diesem Bestimmungsverfahren nur noch 15 Minuten. Allerdings muß zur
eindeutigen Identifizierung der PSP-Toxine ausschließlich im SIM-Mode gearbeitet werden.
Abb. 27: Bestimmung von PSP-Toxinen aus einer Standardlösung unter Anwendung der LC/MS-
Screening-Methode (SIM-Mode)
5. Der Einsatz der Ionenaustauschchromatographie in der Kopplung LC/MS 61
Abb. 28: Bestimmung von PSP-Toxinen aus einer Muschelprobe unter Anwendung der LC/MS-
Screening-Methode (TIC- und SIM-Mode)
5. Der Einsatz der Ionenaustauschchromatographie in der Kopplung LC/MS 62
5.7 Diskussion der Ergebnisse
Aus den nach Einsatz der Ionenaustauschchromatographie in Verbindung mit der Massen-
spektrometrie erhaltenen Ergebnissen wird ersichtlich, daß mit diesem neuen HPLC-Verfahren
nicht nur PSP-Standardlösungen analysiert werden können, sondern PSP-Toxine auch aus
kontaminiertem biologischen Material bestimmbar sind, wobei mit dem Fluoreszenzdetektor
(nach elektrochemischer Oxidation) und dem Massenspektrometer die Detektion parallel erfolgt.
Mit Hilfe der HPLC/FLD/MS-Kopplung können einzelne PSP-Toxine eindeutig identifiziert,
Metabolisierungsprozesse innerhalb der marinen Nahrungskette untersucht und sichere Kontrol-
len von Meeresfrüchten in der Lebensmittelüberwachung durchgeführt werden. Allerdings ist der
alleinige Einsatz der Massenspektrometrie durch eine im Vergleich zu konventionellen HPLC-
Verfahren mit Fluoreszenzdetektion deutlich geringere Sensitivität, die im hohen Wasser- und
Elektrolytanteil des Eluenten begründet ist, auf die Untersuchung von höher kontaminiertem
Probenmaterial begrenzt. Die chemische Natur der PSP-Toxine und die Säulenstabilität lassen
diesbezüglich nur einen engen Spielraum zur Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit zu,
jedoch kann durch höhere Injektionsmengen (bis zu 100 µL) dieser Nachteil teilweise ausgegli-
chen werden. Da noch ca. 2 ng Toxin pro Injektion detektierbar sind, ist die Nachweisempfind-
lichkeit des Verfahrens als ausreichend für seinen Einsatz in der Lebensmittelkontrolle zu bewer-
ten, zumal durch die Parallelschaltung eines Fluoreszenzdetektors die zusätzliche Absicherung
der Ergebnisse möglich ist.
Aufgrund der Möglichkeit, chromatographisch nicht getrennte PSP-Toxine bei der MS-
Detektion durch Messung im SIM-Mode hochselektiv zu bestimmen, konnte eine schnelle
Screening-Methode für Routineanalysen entwickelt werden. Die chromatographische Trennung
beschränkt sich hierbei auf Toxine mit gleicher Massenzahl. Dadurch kann die Rundauer stark
verkürzt werden, und bei ausschließlicher MS-Detektion ist ein sehr hoher Probendurchsatz ge-
währleistet. Diese sogenannte „Kurzrun-Methode“ ist durch den Einsatz von nur zwei Kationen-
austauschersäulen auch kostengünstiger.
6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen... 63
6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen in
kommerziell genutzten Muschel- und Schneckenarten der Nordsee
6.1 Einleitung
PSP-Toxine sind potente Neurotoxine, die von toxischen Stämmen bestimmter Dinoflagellaten-
Arten produziert werden. Der Transfer dieser Toxine in die marine Nahrungskette führt zu
Problemen für die Muschelindustrie und zur Gefährdung der Konsumenten von Schalentieren.
Dem Verständnis der Interaktionen zwischen Algen und Schalentieren, d.h. zwischen PSP-
Toxinen und der marinen Umwelt, kommt deshalb besondere Bedeutung zu, wobei vor allem die
Akkumulation und Metabolisierung der PSP-Toxine in den Speicherorganismen im Mittelpunkt
der Untersuchungen stehen.
Zwar existieren bereits viele ökophysiologische Studien, welche die Toxinanreicherung und
Toxinumwandlung in verschiedenen Meerestieren beschreiben, jedoch gibt es nur wenige Arbei-
ten über Detoxifikationswege und Exkretionsmechanismen. Auch wurden die meisten kommer-
ziell genutzte Muschelarten diesbezüglich bisher noch nicht näher untersucht.
Diese Versäumnisse wiegen schwer, denn die Ergebnisse solcher Grundlagenforschungen kom-
men den betroffenen Wirtschaftszweigen und damit dem Verbraucher direkt zugute. So können
z.B., wenn die Toxinanreicherung, welche von der jeweiligen Muschelart abhängig ist, bekannt
ist, artspezifische Detoxifikationszeiten berücksichtigt und bisher unbekannte Quellen für
Intoxikationen (neue Spezies, neue Regionen) aufgedeckt werden. Auch sind Aussagen über die
gefahrlose Nutzung einzelner Organe (Muskelfleisch, Gonaden) nach der PSP-Kontamination
ganzer Tiere möglich. Die Identifizierung weiterer, bisher nicht beachteter PSP-Metaboliten ist
ebenfalls von Interesse, wie die erst kürzlich erfolgte Entdeckung der Deoxycarbamoyl-Derivate
in australischen Dinoflagellaten zeigt. Allerdings wurden diese Erkenntnisse erst gewonnen,
nachdem qualitativ neue analytische Meßverfahren zur Verfügung standen.
Eine bewährte Methodik bei zahlreichen Laborstudien stellen in vivo Fütterungsexperimente dar,
bei denen verschiedenen Muschel- oder Schneckenarten unter gleichen kontrollierten Bedingun-
gen bzw. den natürlichen Bedingungen nachempfundenen Gegebenheiten definierte Algen-
spezies als Nahrung angeboten werden. An die Fütterung schließt sich, je nach Untersuchungs-
gegenstand, eine mehr oder weniger lange Entgiftungsphase an. Danach soll die Analyse ganzer
oder in einzelne Kompartimente zerlegter Tiere zu bestimmten Zeitpunkten Aufschluß über den
Toxintransfer und die Kinetik der Toxinkonversion unter Berücksichtigung allgemeiner und art-
spezifischer Charakteristika und individueller Streubreiten geben.
6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen... 64
Im Gegensatz zu den in vivo Studien sind in der Literatur nur wenige in vitro Experimente zitiert,
bei denen z.B. ganze Muscheln bzw. nur einzelne Organe nach Homogenisation mit PSP-
haltigen Algenextrakten oder einzelnen PSP-Toxinen geimpft und inkubiert wurden. Nach einem
festgelegten Zeitraum werden die danach aufgetretenen Veränderungen im Toxinprofil analy-
tisch erfaßt. Durch diese Vorgehensweise werden gewebespezifische Metabolisierungen, die
nicht das Ergebnis des Toxintransfers zwischen den Organen sind, meßbar. Der Einfluß der
Toxinakkumulation, inklusive schwankender Filtrationsraten und Toxingehalte der aufgenom-
menen Algenzellen, sowie der Einfluß der Toxinexkretion auf das PSP-Profil werden bei in vitro
Experimenten ebenfalls ausgeschlossen.
Beide Formen der Versuchsdurchführung gelangten bei den Untersuchungen im Rahmen dieser
Arbeit zum Einsatz. Es war dabei das Ziel, die Akkumulation, Biotransformation und Detoxifi-
kation von PSP-Toxinen in bisher kaum untersuchten Schnecken- und Muschelarten der Nordsee
zu erforschen. Die Durchführung dieser Studien erfolgte am Alfred-Wegener-Institut auf Helgo-
land im Frühjahr und Sommer 2001.
Im in vivo Fütterungsversuch sollten vor allem die artspezifische Toxinaufnahme und die zu
erwartenden Toxizitäten, die Mechanismen der Entgiftung sowie die Verteilung der Toxine im
Organismus meßtechnisch verfolgt werden. Außerdem sollten Ausmaß und Art der Änderungen
des PSP-Profils in den einzelnen Muschelarten, d.h. welche PSP-Toxine besonderen Anteil an
der jeweiligen Gesamtkontamination haben, gemessen werden, um Hinweise auf art- und
gewebespezifische Metabolisierungsaktivitäten zu erhalten.
Bei den in vitro Experimenten standen dagegen die Erfassung der Metabolisierungsleistungen
einzelner Organe sowie die Charakterisierung der spezies- und gewebespezifischen Umwand-
lungsprozesse der PSP-Toxine im Vordergrund.
6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen... 65
6.2 In vivo Fütterungsversuch
6.2.1 Versuchsdurchführung
6.2.1.1 Wahl der Algen- und Muschelspezies
Mit Alexandrium fundyense CCMP 1719 wurde ein Algenstamm gewählt, der in den europä-
ischen Gewässern des Atlantiks Verbreitung findet und sich leicht kultivieren läßt. Das Toxin-
spektrum ist vor allem durch hohe Konzentrationen an C1, C2, GTX4 und Neo gekennzeichnet,
während GTX3, GTX1, GTX2, B1/B2, dcGTX2/3 und STX nur in geringen Mengen vorhanden
sind.
Als Untersuchungsobjekte wurden die Pazifische Auster (Crassostrea gigas), die Herzmuschel
(Cardium edule), die Miesmuschel (Mytilus edulis) und die Gemeine Strandschnecke (Littorina
littorea) verwendet.
Von der Pazifischen Auster werden jährlich ca. 3,9 Mio t weltweit erzeugt, davon 85 t in
Deutschland 159. Trotz ihres hohen wirtschaftlichen Nutzens gibt es nur wenige Untersuchungen
bzgl. der Kontamination mit PSP-Toxinen unter kontrollierten experimentellen Bedingungen.
Die Herzmuschel ist eine in Nord- und Ostsee dominant vorkommende Muschelart, deren wirt-
schaftliche Bedeutung jedoch weitaus geringer ist als die der Auster (Erzeugung 130 t weltweit) 159,160. Obwohl einige, im Rahmen von Monitoring-Programmen gezogene Proben PSP-Toxine
enthielten, fanden noch keine PSP-Toxine betreffende Studien mit Herzmuscheln statt 161.
Mit der Strandschnecke gelangte eine ebenfalls herbivore, jedoch „grasende“ Art zur Unter-
suchung. Sie fällt in ihrer Größe und Anzahl besonders um Helgoland auf und stellt dort eine
traditionelle kulinarische Spezialität („Hölker“) dar 160.
Die Miesmuschel ist bzgl. der Akkumulation von PSP-Toxinen am besten erforscht, und sie ist
die wirtschaftlich bedeutendste (weltweite Erzeugung ca. 1,7 Mio t) Muschelart 42,159. Die Mies-
muschel wurde bei den Untersuchungen als Vergleichsmodell herangezogen, um die Ergebnisse
(Ausmaß und Geschwindigkeit der Metabolisierungsvorgänge) für die übrigen Spezies besser
beurteilen und einordnen zu können.
Die Herzmuscheln stammten aus dem Watt vor der Wilhelmshavener Küste, während die
Schnecken und Miesmuscheln vor Helgoland gefangen wurden. Die Austern stellte ein Aqua-
kultur-Betrieb auf Sylt zur Verfügung. Alle Individuen waren vorher nicht mit PSP-Toxinen
bzw. toxischen Algen in Berührung gekommen. Es wurden jeweils ca. 50 Tiere annähernd
gleicher Größe gesammelt und zur Akklimatisierung ein bis zwei Wochen unter Versuchs-
bedingungen gehältert.
6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen... 66
6.2.1.2 Kultivierung der Algenspezies
Die Algenkultur wurde in einem F/2 Kulturmedium angesetzt und bei 15 °C sowie einem
12h/12h Licht/Dunkel-Regime (2500 ± 200 Lux) inkubiert162. Von dieser Batchkultur wurden
nacheinander Isolate in mehreren 10 Liter Bottichen hergestellt und nach jeweils 2-3 Wochen,
bei Erreichen einer Zellzahl von 3000-6000 Zellen pro mL, die benötigte Algenmenge zur
Fütterung entnommen.
6.2.1.3 Fütterungsregime und Entnahme der Schalentiere
Austern, Miesmuscheln, Herzmuscheln und Strandschnecken wurden in einem 150 L Becken mit
ca. 135 L ungefiltertem, 16°C warmen Seewasser, in dem ein Sprudler für die notwendige Sauer-
stoffzufuhr und Wasserbewegung sorgte, eingesetzt. Dabei wurden die einzelnen Arten in
getrennten Gruppen angeordnet. Alle 2 Tage erfolgte ein Wasserwechsel mit ungefiltertem, von
der Nordsee zugeleitetem Seewasser und die Zufütterung mit Alexandrium fundyense. Es wurde
die Algenmenge aus den Kultivierungsgefäßen zugesetzt, die zu einer Zelldichte von ca.
100 Zellen pro mL im Versuchsbecken führte. Dies entsprach natürlichen Algenblüten von
Alexandrium sp. in der Nordsee, wie sie auf Forschungsfahrten von Mitarbeitern der Jenaer
Arbeitsgruppe beobachtet wurden. Die mit dem ungefilterten Seewasser zugeführten untoxischen
Algen dienten insbesondere den Muschelarten mit hoher Sensitivität gegenüber PSP-Toxinen als
Stimulation zur Nahrungsaufnahme und wurden alle 4 Tage durch 1 Liter Feinplankton aus
Netzproben (Netzdichte 20 µm) ergänzt.
Für die Ermittlung der dem Versuchsbecken zuzugebenden Menge des toxischen Algenisolates
wurden jeweils 10 mL für die Zellzahlbestimmung (vgl. Anhang) und für die Überprüfung des
PSP-Gehaltes und des Toxinprofils der Algenkultur mittels HPLC aus den Kulturansätzen ent-
nommen (Dreifachanalyse).
Die Intoxikation der Schalentiere mit Alexandrium fundyense fand über einen Zeitraum von
6 Wochen statt, wobei alle 7 Tage 5 Individuen jeder Art zur Analyse auf PSP-Toxine entnom-
men wurden.
An die Fütterung mit Alexandrium fundyense schloß sich eine Entgiftungsphase über 2 Monate
an, in der die Fütterung mit untoxischen Algen (Seewasserzufuhr und Feinplankton aus der
Netzprobe alle 48 h) erfolgte und die Muscheln und Schnecken 14tägig zur Toxinanalyse
(jeweils 3 Individuen) entnommen wurden.
6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen... 67
6.2.1.4 PSP-Toxinanalyse der Muschel- und Schneckenproben
Die entnommenen Muscheln und Schnecken wurden sofort in einzelne Kompartimente zerlegt:
die Austern in Hepatopankreas, Mantel, Kiemen, Adduktor, Gonaden und den verbleibenden
Rest; die Strandschnecken in Darmgewebe, Muskelgewebe und Rest; die Herzmuscheln in
Hepatopankreas, Fuß, Rest sowie die Miesmuscheln in Hepatopankreas, Mantel, Kiemen,
Adduktoren, Fuß, Gonaden und Rest. Der als Rest bezeichnete Teil enthielt bei Austern und
Miesmuscheln alle weiteren nicht zugeordneten Organe sowie den Hepatopankreas umgebendes
Gewebe. Bei den Herzmuscheln und Strandschnecken wurden mit dem Rest alle inneren Organe
erfaßt. Die separierten Teile wurden mit Seewasser gespült, gewogen und bis zur Analyse bei
minus 20°C tiefgefroren.
Aus Gründen eines vertretbaren Arbeits- und Zeitaufwandes wurden die Kompartimente von
Individuen einer Art aus den Fütterungswochen 1-5 sowie aus der Entgiftungsphase gepoolt. Die
Variation des PSP-Gehaltes und -Profils zwischen Individuen einer Art wurde exemplarisch
durch die Einzelanalyse der Individuen nach der 6. Fütterungswoche ermittelt.
Die Bestimmung der PSP-Toxine aus den Algen- und Muschelproben fand auf zwei HPLC-
Anlagen statt, wobei sowohl die optimierte Methode nach Thielert als auch die neu entwickelte
HPLC-Methode auf Basis der Ionenaustauschchromatographie zum Einsatz kamen. Die Proben-
aufarbeitung erfolgte nach dem Protokoll von Hummert et al. 156.
6.2.2 Ergebnisse und Diskussion
6.2.2.1 Toxizität und Toxinprofil von Alexandrium fundyense
Die zur Fütterung verwendeten Alexandrium-Zellen wiesen eine mittlere Toxizität von 23 ± 5 pg
STXeq/Zelle und einen Toxingehalt von 41 ± 13 pg PSP/Zelle (Mittelwert ± SD, n = 22) auf. Als
Haupttoxinkomponenten traten Neo (15,3% ± 1,7)1, GTX4 (37,6% ± 4,5), C1 (8,3% ± 2,4) und
C2 (32,0% ± 4,3) hervor, die zusammen mehr als 93% des Gesamt-PSP-Gehaltes bildeten.
Daneben wurden geringe Mengen an GTX3 (3,0% ± 1,8), GTX2 (0,2% ± 0,1), GTX1 (2,2% ±
1,1), STX (0,4% ± 0,4), dcGTX2/3 (0,2% ± 0,2) und B1/B2 (0,8% ± 0,5) nachgewiesen. Das
charakteristische Toxinmuster blieb während des gesamten Versuches stabil, die größeren
1 Die prozentualen Anteile der einzelnen PSP-Toxine am Gesamttoxingehalt sind im Fütterungsversuch als Masse% angegeben, um hervorzuheben, in welchem Maße die jeweiligen Toxine zur Gesamtbelastung (angegeben in µg PSP/100g) beitrugen.
6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen... 68
Schwankungen von GTX1/GTX4 und C1/C2 glichen sich innerhalb einer Sammelperiode wieder
aus (Abb. 29).
Abb. 29: Mittleres Toxinprofil von A. fundyense (links), Entwicklung des Toxinprofils von A.
fundyense während der Fütterung (rechts)
6.2.2.2 Speziesspezifische Toxinaufnahme
Alle Spezies (M. edulis, C. gigas, C. edule, L. littorea) akkumulierten während der Fütterungs-
periode signifikante Mengen an PSP–Toxinen. Die höchsten Toxingehalte wurden in C. edule
gefunden, in einem deutlichen Abstand folgten M. edulis und C. gigas. L. littorea wies nur ge-
ringe PSP–Kontaminationen auf. Dabei konnte in allen Kompartimenten (außer im Muskel von
L. littorea) PSP–Toxine nachgewiesen werden, wobei erwartungsgemäß das Verdauungsgewebe
die höchsten und das Muskelgewebe (Fuß, Adduktor) die geringsten Toxingehalte aufwies.
Die Unterschiede in der Toxinaufnahme waren hauptsächlich auf die Art der Algenaufnahme,
speziesspezifische physiologische Faktoren, die in unterschiedlichen Ingestions- und Assimila-
tionsraten resultierten, sowie auf Differenzen bzgl. der Sensitivität gegenüber toxinhaltigen
Algen zurückzuführen 42.
Bivalvia sind für ihre unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber PSP-Toxinen bekannt, wobei
Mytilus sp. als hochresistent gilt und demzufolge in kürzester Zeit extrem hohe Toxinmengen
aufnehmen kann 163,164. Crassostrea sp. gehören dagegen zu den sensitiven Arten, die durch
Abwehrmechanismen (z.B. Flucht, Schließen der Schalen, Einschränkung der Filterleistung) die
Exposition gegenüber toxischen Algenzellen reduzieren 41,165. Deshalb kann die Toxizität von
Crassostrea sp. im Vergleich zu den am gleichen Ort gesammelten Mytilus-Exemplaren um ein
Vielfaches niedriger sein. Im Fütterungsbecken reagierten einige Austernindividuen nach Zuga-
be von A. fundyense mit sofortigem Schließen der Schalen, die sie erst nach ca. 1-2 Stunden
wieder öffneten. Eine Sensibilität von C. edule gegenüber toxischen Algen wurde in der Literatur
bisher nicht beschrieben. Ihre relativ hohe Toxinakkumulation, ohne sichtbare adverse
STX Neo GTX1/GTX4 GTX2/GTX3 dcGTX2/3 B1/B2 C1/C2
STX0,4%
GTX1/GTX439,8%GTX2/GTX3
3,2%
C1/C240,3%
dcGTX2/30,2%
Neo15,3%
B1/B20,8%
Tage
0 10 20 30 40
% A
ntei
l
0
20
40
60
6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen... 69
Reaktionen auf toxische Alexandrium-Zellen, deutet jedoch auf eine gewisse STX-Resistenz hin.
Allerdings traten bei C. edule während der Fütterungszeit Todesfälle auf.1
6.2.2.3 Akkumulation und Verteilung der PSP-Toxine im Organismus
Während der gesamten Fütterungsphase war der PSP-Gehalt in C. edule signifikant höher als in
den übrigen Spezies, wobei der Abstand mit der Zeit stetig zunahm. Obwohl die Toxifikations-
raten in den ersten 2 Wochen relativ gering waren und erst später deutlich anstiegen, wurde der
gesetzliche Grenzwert von 80 µg PSP/100g bereits nach 7 Tagen mit 171 µg PSP/100g2 über-
schritten. Nach Ende der Algenzufuhr wurden Werte von 1066 µg PSP/100g gemessen, was eine
13fache Höchstmengenüberschreitung bedeutete. Somit lagen die Werte für C. edule 4-6fach
über dem Toxingehalt in M. edulis und C. gigas, wobei zu berücksichtigen ist, daß nur wenige
Zellen mit nur mittlerer Zelltoxizität bei C. edule bereits zur Anreicherung hoher Toxinmengen
in geringer Biomasse (ca. 1 g) führten. Bei ad libitum Verzehr hochtoxischer Algenzellen wür-
den bei C. edule u.U. extreme PSP-Gehalte nachweisbar werden.
M. edulis überschritt erst ab der 2. Woche den Grenzwert (159 µg PSP/100g). Im weiteren Ver-
lauf der Algenzufütterung kam es zunächst zu keinem weiteren Anstieg des PSP-Gehaltes und
der Toxizität, und teilweise sanken die Werte wieder unter den Grenzwert von 80 µg PSP/100g.
Erst in der letzten Woche trat eine weitere signifikante Zunahme der Kontamination bis zum
2-3fachen der zulässigen Höchstmenge auf (263 µg PSP/100g).
Von Feldstudien ist bekannt, daß C. gigas deutlich langsamer PSP–Toxine akkumuliert und
deshalb am gleichen Ort erst mehrere Wochen später als Mytilus edulis toxisch wird166-168. Hier
verlief die Kontamination ebenfalls langsam und relativ linear (1. bis 5. Woche Anstieg um ca.
60%). Die gesundheitliche Unbedenklichkeit war erst ab der 3. Woche (91 µg PSP/100g) nicht
mehr gegeben. Das Toxifikationsmaximum lag, wie auch bei M. edulis und C. edule, in der
6. Woche (140 µg PSP/100g). Die durchschnittliche Gesamtintoxikation der Austern betrug
damit etwas mehr als die Hälfte als die von M. edulis. Aus Literaturdaten ist eine meist 2-3fache,
1 Als Folge der Verluste an C. edule konnte ihre Detoxifikation nur bis zur 6. Woche (3. Analysenpunkt) verfolgt werden. 2 Der Grenzwert kann sich sowohl auf den Toxingehalt in µg PSP/100g als auch auf die Toxizität in µg STXeq/100g beziehen, wobei letzterer Wert häufig bevorzugt wird. Die Entscheidung für µg PSP/100g ist auf die angewandte Probenaufarbeitung zurückzuführen, die die Erfassung aller individuellen PSP-Toxine berücksichtigt. Die kalkulier-ten STXeq-Werte würden hier aufgrund des hohen Anteils an mindertoxischen N-Sulfocarbamoyltoxinen deutlich niedriger ausfallen als bei der Probenaufarbeitung in der Lebensmittelüberwachung (Tab. 3), da hier diese Toxine nicht berücksichtigt (AOAC-Vorschrift), sondern größtenteils in die höhertoxischen Carbamoyltoxine umwandelt werden.
6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen... 70
oft jedoch auch eine über 10fache Divergenz bzgl. der Kontamination beider Spezies 169-171
bekannt. C. gigas ist offensichtlich in der Lage, während sogenannter „Mischblüten“ (bestehend
aus toxischen und untoxischen Algenspezies) höhere Mengen an PSP-Toxinen zu akkumulieren.
Todesfälle durch Austernverzehr sind jedoch bisher nicht bekannt.
Im Gegensatz zu den filtrierenden Arten M. edulis, C. gigas und C. edule konsumiert L. littorea
Alexandrium-Zellen nicht direkt, sondern abgestorbene oder ins Sediment gesunkene Zellen
werden beim „Grasen“ mit aufgenommen. Schnecken sind zudem sehr mobil und halten sich oft
Stunden bis Tage außerhalb des Wassers auf, so daß die Aufnahme von toxischen Algenzellen
nicht kontinuierlich und innerhalb der Population sehr unterschiedlich erfolgt. Die PSP-Gehalte
schwankten in diesen Mollusken während der Fütterungsperiode um das 10fache. Grundsätzlich
wurden jedoch nur geringe PSP-Kontaminationen festgestellt. Der höchste PSP-Gehalt wurde
mit 73 µg PSP/100g in der 5. Woche gefunden. Damit wäre L. littorea zu jedem Zeitpunkt
verkehrsfähig gewesen. Es ist aber noch in weiteren Untersuchungen zu klären, ob die Schnecke
bei einer deutlich höheren Zelldichte und Zelltoxizität von A. fundyense signifikant mehr PSP-
Toxine akkumuliert oder die Flucht ergreift, denn andere Mollusken mit vergleichbarer Lebens-
weise, wie z.B. Haliotis tuberculata, können hochtoxisch werden und sind Ursache vieler PSP-
Vergiftungen 6,150,172.
Die Veränderungen der Gesamttoxingehalte während der Fütterung und der Entgiftung sind für
alle untersuchten Spezies in Abb. 30 dargestellt.
Abb. 30: Gesamt-PSP-Gehalte während der Fütterung und der Entgiftung (E), rechts: vergrößerte
Darstellung und gesetzlicher Grenzwert Die Gesamttoxizität und der Gesamt-PSP-Gehalt waren in allen Muschel- und Schneckenarten
durch die Toxizität und den Toxingehalt des Verdauungsgewebes geprägt, da hier der sofortige
und unmittelbare Kontakt mit den toxischen Algenzellen erfolgte. In den ersten 2 Wochen der
Zeit
1.Wo
2.Wo
3.Wo
4.Wo
5.Wo
6.Wo
2.Wo (
E)
4.Wo (
E)
6.Wo (
E)
8.Wo (
E)
µg P
SP
/100
g
0
200
400
600
800
1000
1200
Zeit
1.Wo
2.Wo
3.Wo
4.Wo
5.Wo
6.Wo
2.Wo (
E)
4.Wo (
E)
6.Wo (
E)
8.Wo (
E)
µg P
SP/
100g
0
50
100
150
200
250
300
M. edulis C. gigas C. edule L. littorea 80 µg PSP/100g
6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen... 71
Toxinaufnahme betrug der Toxinanteil des Hepatopankreas (HP) am Gesamttoxingehalt in
M. edulis und C. gigas über 70%, während der Hepatopankreas nur 15% des Muschelgewichtes
ausmachte (Abb. 32 und Tab. 16). Bis Ende der 6wöchigen Fütterungszeit sank jedoch, trotz
weiterer Toxinaufnahme, der HP-Anteil am Gesamt-PSP-Gehalt bei beiden Spezies (durch den
Toxintransfer in umliegende Gewebe) auf 60%. Hingegen wies das Verdauungsgewebe von
C. edule und L. littorea während der gesamten Algenaufnahme einen konstanten Toxinanteil von
80% bzw. fast 100% auf.
Tab. 16: Anteil der einzelnen Muschel- und Schneckengewebe am Gesamtgewicht HP Rest Kiemen Mantel Gonaden Adduktor Fuß M. edulis 15% 17% 9% 32% 9% 15% 3% C. gigas 15% 18% 20% 24% 7% 16% C. edule 20% 59% 21% L. littorea 38% 19% 43%
Im HP aller Muschelarten war von der 1. bis 6. Woche eine signifikante Überschreitung des
gesetzlichen Grenzwertes zu beobachten, wobei C. edule nach 6 Wochen mit 4482 µg PSP/100g
die höchste Toxinkontamination zeigte. In M. edulis wurden 1355 µg PSP/100g, in C. gigas
445 µg PSP/100g und in L. littorea 171 µg PSP/100g (5. Woche) nachgewiesen. Der Hepato-
pankreas war somit immer 3-5fach toxischer als der Gesamtorganismus.
C. edule wies im Vergleich zu den anderen Spezies auch in den übrigen Kompartimenten eine
deutlich höhere Toxinspeicherung auf, die zur hohen Gesamttoxizität beitrug (Abb. 31). Der Rest
überschritt die Unbedenklichkeitsgrenze ab der 2. Woche und enthielt am Ende der Fütterung
(linearer Kontaminationsverlauf bis 5. Woche) mit 318 µg PSP/100g die doppelte PSP-Toxin-
menge wie der von M. edulis (186 µg PSP/100g) und C. gigas (123 µg PSP/100g). Sogar der
PSP-Gehalt des Cardium-Fußes lag nach exponentiell verlaufender Kontaminationskurve ober-
halb von 80 µg PSP/100g, während bei L. littorea im Rest nur Toxinspuren zu finden waren und
der Muskel vollkommen untoxisch blieb.
Die Zunahme der Toxizität im Verdauungsgewebe war demzufolge mit einer Zunahme der
Toxizität in den anderen Kompartimenten verbunden. Insbesondere der HP von C. gigas zeigte
einen effizienten Toxintransfer in die umliegenden Gewebe, denn sein Anteil an der PSP-
Kontamination des gesamten Organismus nahm im Vergleich zu den anderen Spezies am
6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen... 72
schnellsten ab. Auf der anderen Seite lagen die Intoxikationen von Mantel, Kiemen und Gonaden
der Auster in der Kontaminationsphase (bis 5. Woche) sogar leicht über denen der entsprechen-
den Mytilus-Gewebe. Die Toxizitätsmaxima von Mantel und Kiemen traten dabei bereits in der
3. und 4. Fütterungswoche auf, wobei lediglich in den Kiemen der Grenzwert von 80 µg
PSP/100g in der 4. Woche überschritten wurde. Die übrigen Gewebe, außer dem Rest und dem
HP, blieben bei der Auster verkehrsfähig. In M. edulis wurde zwar in der 6. Woche ein PSP-
Gehalt von ca. 100 µg PSP/100g in Kiemen, Mantel und Gonaden erreicht, aber nur in den
Gonaden und im Mantel war (neben dem HP) diese höhere Belastung gegenüber der Auster
signifikant (t-Test, α = 0,05)1.
Den größten Anteil am Gesamt-PSP-Gehalt in M. edulis und C. gigas hatten in der 6. Woche
vom Nichtverdauungsgewebe jeweils der Rest und der Mantel (11-13%, Abb. 32).
Der Adduktor von C. gigas wies noch einen Anteil von 3-4% an der Gesamtkontamination auf,
während der Anteil des Fußes von C. edule und M. edulis weniger als 2% betrug. Das Muskel-
gewebe zeigte sich damit erwartungsgemäß als wenig effizienter Toxinspeicher, dessen Toxin-
belastung mit <5% am Gesamtgehalt um mehr als eine Größenordnung unterhalb der des HP-
Gewebes und, mit Ausnahme von C. edule, auch im verkehrsfähigen Bereich lag 47,173.
Damit ergab sich für alle Spezies folgende übereinstimmende Rangfolge bzgl. der PSP-
Kontamination am Ende der Fütterungsperiode: HP >> Rest > Kiemen, Mantel, Gonaden > Ad-
duktoren > Fuß. Die PSP-Gehalte der einzelnen Kompartimente sind in Abb. 31 dargestellt.
Alle untersuchten Muscheln und Schnecken dienen der menschlichen Ernährung und werden
ohne Schale als ganze Tiere verzehrt. Dabei ist das Entfernen des Verdauungsgewebes unüblich
und würde bei höherer PSP-Kontamination die Verkehrsfähigkeit nicht gewährleisten (Ausnah-
me: L. littorea).
1 Diese t-Tests sowie alle nachfolgenden statistischen Tests wurden mit Hilfe des Statistikprogrammes SPSS 10.0 für Windows durchgeführt.
6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen... 73
HP Rest Fuß
Zeit
1.Wo
2.Wo
3.Wo
4.Wo
5.Wo
6.Wo
2.Wo (
E)
4.Wo (E
)
6.Wo (E
)
µg P
SP
/100
g H
P
0
1000
2000
3000
4000
5000
µg P
SP
/100
g so
nstig
e G
eweb
e
0
50
100
150
200
250
300
350C. edule
Zeit
1.Wo
2.Wo
3.Wo
4.Wo
5.Wo
6.Wo
2.Wo (
E)
4.Wo (
E)
6.Wo (
E)
µg P
SP/1
00g
HP
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
µg P
SP
/100
g so
nstig
e G
eweb
e
0
5
10
15
20
25
30L. littorea
Abb. 31: PSP-Gehalte der einzelnen Muschel- und Schneckengewebe
Zeit
1.Wo
2.Wo
3.Wo
4.Wo
5.Wo
6.Wo
2.Wo (E
)
4.Wo (E
)
6.Wo (E
)
8.Wo (E
)
µg P
SP
/100
g H
P
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
µg P
SP
/100
g so
nstig
e G
eweb
e
020406080100120140160180200
M. edulis
Zeit
1.Wo
2.Wo
3.Wo
4.Wo
5.Wo
6.Wo
2.Wo (E
)
4.Wo (E
)
6.Wo (E
)
8.Wo (E
)
µg P
SP
/100
g H
P
0
100
200
300
400
500
µg P
SP
/100
g so
nstig
e G
eweb
e0
20
40
60
80
100
120
140C. gigas
HP Rest Kiemen Mantel Gonaden Adduktor Fuß 80 µg PSP/100g
HP Rest Kiemen Mantel Gonaden Adduktor 80 µg PSP/100g
HP Rest Fuß 80 µg PSP/100g
6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen... 74
6.2.2.4 Detoxifikation
An die Fütterung der Muscheln und Schnecken mit Alexandrium fundyense schloß sich eine
zweimonatige Entgiftungsphase an. Im allgemeinen werden Muscheln in schnell entgiftende
(Unterschreitung der tolerierbaren PSP-Höchstmenge nach mehreren Tagen bis Wochen) und
langsam entgiftende Spezies (Entgiftung Monate bis Jahre andauernd) eingeteilt 42. Zu den
Langzeitspeicherern von PSP-Toxinen zählen z.B. Saxidomus giganteus, Placopecten magella-
nicus und Spisula solidissima 174-176. M. edulis ist als Kurzzeitspeicherer bekannt und auch
C. gigas wurde in Feldbeobachtungen als relativ rasch detoxifizierend charakterisiert 42,167. Die
Dauer der Entgiftung von PSP-Toxinen ist jedoch nicht nur speziesspezifisch, sondern auch von
biologischen Faktoren, der Stärke der Bindung der Toxine an das jeweilige Gewebe und von der
Ausgangstoxizität abhängig 177-179.
Im Fütterungsversuch waren M. edulis und C. gigas bei moderater Toxinbelastung am Ende der
Fütterung bereits innerhalb von 14 Tagen (erster Analysenpunkt) wieder verkehrsfähig (M. edu-lis: 78 µg PSP/100g, C. gigas: 46 µg PSP/100g), während dies bei C. edule nach 6 Wochen
Entgiftung noch nicht der Fall war. Hingegen fielen die ohnehin geringen PSP-Gehalte von
L. littorea weiterhin kontinuierlich ab (Abb. 31). In der 8. Entgiftungswoche wurde die Analyse
der Schnecke aufgrund der sehr niedrigen Gesamtkontamination nicht mehr durchgeführt.
Die Detoxifikation von Muscheln ist im allgemeinen durch 2 Phasen gekennzeichnet. In der
meist kurzen Initialphase wird der Darminhalt, der ganze und nicht absorbierte Algenzellen
sowie nicht assimilierte Toxine enthält, abgegeben. In einer zweiten Phase folgt dann ein länger
andauernder Prozeß der Entfernung der an das Gewebe gebundenen oder inkorporierten PSP-
Toxine. Deshalb resultiert eine exponentiell abfallende Detoxifikationskurve 178,180.
Bei der ersten Analyse nach Beginn der Entgiftung (14 Tage) war somit bereits die zweite
Detoxifikationsphase eingetreten.
Unabhängig davon zeigte C. edule die höchste Detoxifikationsrate mit einem Toxinverlust von
83% in den ersten zwei Wochen, gefolgt von M. edulis mit 70% und C. gigas mit 68%. Während
bei C. edule die Dekontamination anschließend einige Wochen stagnierte, setzte sie sich bei den
anderen Muschelspezies fort. Am Ende der Versuchsdauer war jedoch keine der analysierten
Muscheln vollständig toxinfrei. Folgende Entgiftungsmechanismen werden diskutiert: 42,181
• Rücktransport der PSP-Toxine in das Verdauungsgewebe und Exkretion in gelöster Form
• Verluste durch Lecks im Gewebe,
• Diffusion von PSP-Toxinen von der Gewebeoberfläche in das Wasser,
• Inaktivierung oder Abbau zu untoxischen Komponenten.
6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen... 75
Zeit
1.Wo
2.Wo
3.Wo
4.Wo
5.Wo
6.Wo
2.Wo (
E)
4.Wo (
E)
6.Wo (
E)
8.Wo (
E)
Ant
eil %
0
20
40
60
80C. gigas
Die Entgiftung war mit einem fortschreitenden Toxintransfer durch die Gewebe verbunden, so
daß die PSP-Verteilung im Gesamtorganismus nach Fütterungsende starken Änderungen unter-
worfen war. Am Ende der Fütterungsperiode war der HP-Anteil an der Gesamtkontamination mit
60% (Miesmuschel, Auster), 80% (Herzmuschel) und 90% (Strandschnecke) relativ hoch. Die
schnelle Ausscheidung des toxischen Darminhalts und der Transfer in umliegende Gewebe ließ
eine beschleunigte Toxinabgabe aus dem Verdauungsgewebe erwarten. Bei C. edule und
C. gigas blieb jedoch der HP-Anteil noch bis 1½ Monate auf diesem hohen Niveau bevor er bei
C. edule auf 19% und bei C. gigas auf 37% sank. Der HP von M. edulis enthielt, zugunsten der
umliegenden Gewebe Rest und Mantel, bereits nach ca. 3 Wochen Entgiftung nur noch 50% der
PSP-Toxine (Abb. 32).
Abb. 32: Prozentualer Anteil der einzelnen Kompartimente am Gesamt-PSP-Gehalt der Tiere wäh-
rend der gesamten Versuchsdauer (E = Entgiftungsperiode) Der Toxintransfer während der Detoxifikation ist oft mit einem erneuten Toxizitätsanstieg im
Zielgewebe verbunden. Fuß und Rest von C. edule zeigten deutlich diese verstärkte Toxin-
aufnahme, die bis zum Ende des Versuches anhielt. Dabei stiegen sowohl der PSP-Gehalt als
Zeit
1.Wo
2.Wo
3.Wo
4.Wo
5.Wo
6.Wo
2.Wo (
E)
4.Wo (
E)
6.Wo (
E)
Ant
eil %
0
20
40
60
80
100
120L. littorea
HP/Darm Rest
Kiemen Mantel
Gonaden Adduktor
Fuß
Zeit
1.Wo
2.Wo
3.Wo
4.Wo
5.Wo
6.Wo
2.Wo (
E)
4.Wo (
E)
6.Wo (
E)
8.Wo (
E)
Ant
eil %
0
20
40
60
80
100M. edulis
Zeit
1.Wo
2.Wo
3.Wo
4.Wo
5.Wo
6.Wo
2.Wo (
E)
4.Wo (
E)
6.Wo (
E)
Ant
eil %
0
20
40
60
80
100C. edule
Zeit
1.Wo
2.Wo
3.Wo
4.Wo
5.Wo
6.Wo
2.Wo (
E)
4.Wo (
E)
6.Wo (
E)
8.Wo (
E)
Ant
eil %
0
20
40
60
80
100M. edulis
6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen... 76
auch die Toxizität um das 2 bis 3fache an, wobei der Rest mit 90 µg PSP/100g den Grenzwert
erneut überschritt.
Die nonintestinalen Kompartimente von M. edulis offenbarten nach starker Toxinabnahme inner-
halb der ersten Entgiftungstage ebenfalls eine stagnierende Entgiftung oder einen geringfügigen
Anstieg des PSP-Gehaltes bzw. der Toxizität, jedoch weit unterhalb des Grenzwertes. Bei Crass-
ostrea-Geweben konnte ein solcher Verlauf der Detoxifikation nicht beobachtet werden.
Unabhängig vom Toxintransfer war der Hepatopankreas aber stets das Gewebe mit der höchsten
Konzentration an PSP-Toxinen.
In L. littorea sank die Kontamination im Verdauungsgewebe kontinuierlich, während Rest und
Muskel toxinfrei waren. Hingegen waren alle Kompartimente von M. edulis, C. gigas und
C. edule bis zum Ende der Dekontaminationsphase mit PSP-Toxinen belastet.
6.2.2.5 Änderungen der PSP-Profile
Während der Fütterungsperiode reflektierten die Muscheln in ihren Geweben weitestgehend das
PSP-Toxinprofil der zugeführten Alge A. fundyense, d.h. es dominierten Neo, GTX1/4 und
C1/C2 (Abb. 33, 34). Die Toxinmuster waren offensichtlich von einer Balance zwischen der
ständigen Aufnahme von PSP-Toxinen mit konstantem Verhältnis zueinander und möglichen
Toxinumwandlungen charakterisiert, wobei letztere durch die permanente Aufnahme zunächst
maskiert wurden. Kennzeichnend waren jedoch leichte Veränderungen bei den Toxinverhältnis-
sen, die später während der Detoxifikation zunahmen und zu gravierenden Änderungen im
Toxinmuster der Muschelkompartimente führten. So waren Neo und GTX1/4 bereits kurze Zeit
nach der Fütterung mit A. fundyense in vielen Geweben durch Verlust und/oder Umwandlung zu
den N-1-H-Toxinen (STX, GTX2, GTX3) nicht mehr nachzuweisen. Eine Ausnahme bildeten
die Verdauungsgewebe, in denen aufgrund der höheren Gesamtkontamination die weniger
fluoreszenzaktiven N-1-OH-Toxine erst später (M. edulis, C. gigas nach der 6. Entgiftungs-
woche; C. edule, L. littorea nach der 4. Entgiftungswoche) unter ihre Detektionsgrenze sanken.
Im Gegenzug stieg der relative Anteil von STX und GTX2/3 an. Bereits bis zur 6. Fütterungs-
woche war von diesen Toxinen eine Zunahme im PSP-Profil der Mollusken im Vergleich zu
A. fundyense zu verzeichnen (α = 0,05, STX signifikant für alle Gewebe außer Fuß von C. edule
sowie Mantel, Gonaden von M. edulis; GTX2/3 sigifikant für HP und Rest aller Spezies)1. Gegen
Ende der Dekontaminationsphase dominierten in allen Tierarten STX (bis zu 22%, Max.:
Adduktoren von M. edulis) und GTX2/3 (bis zu 35%, Max.: Gonaden von C. gigas), neben
C1/C2. 1 Student-Newman-Keuls-Test
6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen... 77
Abb. 33: PSP-Profile der Einzelgewebe von M. edulis und C. gigas exemplarisch für die 3. und 6. Fütterungswoche und die 2. und 6. Entgiftungswoche (E = Entgiftung)
M. edulis 2. Wo (E)
0
20
40
60
80
100
120
A.fund.
HP Rest Kie Man Gon Add Fuß
Gewebe
Ante
il %
C2C1GTX3GTX2GTX4GTX1NeoSTX
C. gigas 2. Wo (E)
0
20
40
60
80
100
120
A.fund.
HP Rest Kie Man Gon Add
Gewebe
Ante
il %
C2C1GTX3GTX2GTX4GTX1NeoSTX
M. edulis 6. Wo (E)
0
20
40
60
80
100
120
A.fund.
HP Rest Kie Man Gon Add Fuß
Gewebe
Ante
il %
C2C1GTX3GTX2GTX4GTX1NeoSTX
C. gigas 6. Wo (E)
0
20
40
60
80
100
120
A.fund.
HP Rest Kie Man Gon Add
Gewebe
Ante
il %
C2C1GTX3GTX2GTX4GTX1NeoSTX
C. gigas 3. Wo
0
20
40
60
80
100
120
A.fund.
HP Rest Kie Man Gon Add
Gewebe
Ante
il %
C2C1GTX3GTX2GTX4GTX1NeoSTX
M. edulis 3. Wo
0
20
40
60
80
100
120
A.fund.
HP Rest Kie Man Gon Add Fuß
Gewebe
Ante
il %
C2C1GTX3GTX2GTX4GTX1NeoSTX
M. edulis 6. Wo
0
20
40
60
80
100
120
A.fund.
HP Rest Kie Man Gon Add Fuß
Gewebe
Ante
il %
C2C1GTX3GTX2GTX4GTX1NeoSTX
C. gigas 6. Wo
0
20
40
60
80
100
120
A.fund.
HP Rest Kie Man Gon Add
Gewebe
Ante
il %
C2C1GTX3GTX2GTX4GTX1NeoSTX
6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen... 78
Abb. 34: PSP-Profile der Einzelgewebe von C. edule und L. littorea exemplarisch für die 3. und 6. Fütterungswoche und die 2. und 6. Entgiftungswoche (E = Entgiftung)
C. edule 3. Wo
0
20
40
60
80
100
120
A. fund. HP Rest Fuß
Gewebe
Ante
il %
C2C1GTX3GTX2GTX4GTX1NeoSTX
L. littorea 3. Wo
0
20
40
60
80
100
120
A. fund. Darm Rest
Gewebe
Ante
il %
C2C1GTX3GTX2GTX4GTX1NeoSTX
C. edule 2. Wo (E)
0
20
40
60
80
100
120
A. fund. HP Rest Fuß
Gewebe
Ante
il %
C2C1GTX3GTX2GTX4GTX1NeoSTX
L. littorea 2. Wo (E)
0
20
40
60
80
100
120
A. fund. Darm
Gewebe
Ante
il %
C2C1GTX3GTX2GTX4GTX1NeoSTX
C. edule 6. Wo (E)
0
20
40
60
80
100
120
A. fund. HP Rest Fuß
Gewebe
Ante
il %
C2C1GTX3GTX2GTX4GTX1NeoSTX
L. littorea 6. Wo (E)
0
20
40
60
80
100
120
A. fund. Darm
Gewebe
Ante
il %
C2C1GTX3GTX2GTX4GTX1NeoSTX
L. littorea 6.Wo
0
20
40
60
80
100
120
A. fund. Darm Rest
Gewebe
Ante
il %
C2C1GTX3GTX2GTX4GTX1NeoSTX
C. edule 6.Wo
0
20
40
60
80
100
120
A. fund. HP Rest Fuß
Gewebe
Ante
il %
C2C1GTX3GTX2GTX4GTX1NeoSTX
6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen... 79
Interessanterweise wiesen alle Kompartimente der Muscheln und teilweise der Schnecke
während der gesamten Versuchsdauer, d.h. auch während der Entgiftungsphase, einen hohen
Anteil an den mindertoxischen N-Sulfocarbamoyltoxinen von meist >30% an der Gesamt-
kontamination auf, obwohl diese Toxine Ausgangspunkt verschiedener Metabolisierungswege in
Schalentieren sind (hydrolytische und enzymatische Umwandlung zu (dc-)Carbamaten). Offen-
bar laufen solche Transformationen nicht nur langsam ab, sondern die C-Toxine scheinen auch
stabiler gegenüber einem Abbau zu sein als einige Carbamoyltoxine. Das Verhältnis Carbamoyl-
toxine zu N-Sulfocarbamoyltoxine, welches oftmals zur Abschätzung des Zeitpunktes der letzten
PSP-Toxinaufnahme in Muscheln herangezogen wird, sollte deshalb in Monitoring-Programmen
mit Vorsicht interpretiert oder durch weitere Parameter (z.B. durch das Epimerenverhältnis)
untermauert werden.
Änderungen der Epimerenverhältnisse zugunsten der thermodynamisch stabileren α-Epimere
(C1, GTX1, GTX2) traten ubiquitär schon während der Fütterungsperiode auf, obwohl ein
Verhältnis von >1 in den Muscheln erst in der Detoxifikationsphase bobachtet wurde. Im
Verdauungsgewebe und in den meisten anderen Geweben wurde das stabile Gleichgewicht von
3:1 am Ende der Dekontamination zwischen GTX2 und GTX3 sowie C1 und C2 erreicht
(Ausnahmen: C. edule Fuß [C1:C2 1,4:1], Rest [C1:C2 1,5:1; GTX2:GTX3 1,8:1]; M. edulis
Kiemen und Fuß [GTX2:GTX3 1,4:1 bzw. 1,7:1], Gonaden und Adduktoren [C1:C2 2:1]).
Die B-Toxine und dcGTX2/3 spielten in der Gesamtkontamination mit PSP-Toxinen nur eine
untergeordnete Rolle. Die in einigen Kompartimenten (6. Entgiftungswoche: C. gigas HP;
C. edule HP, Rest; M. edulis Fuß, Adduktoren) beobachtete relative Zunahme von dcGTX2/3
kann der Anreicherung dieser Toxine, die in den Alexandrium-Zellen in Spuren gebildet wurden,
oder ihrer vergleichsweise hohen chemischen Stabilität zugeordnet werden. Eine Neubildung
von Decarbamoyltoxinen (z.B. dcSTX) ist auf nur wenige Muschelspezies, wie z.B. Mactra chinensis, Peronida venulosa und Protothaca staminea, begrenzt und wurde im vorliegenden
Versuch nicht festgestellt 65,182.
Die beobachteten Veränderungen waren jedoch nicht in allen Geweben und Spezies gleichen
Ausmaßes. So bildete das Verdauungsgewebe von M. edulis und C. gigas sowie der Rest von
C. edule mit dem Absinken des relativen Anteils von C-Toxinen unterhalb des der Fütterungs-
alge eine Ausnahme zwischen den hohen N-Sulfocarbamoyltoxinkontaminationen anderer
Gewebe (insbesondere der des Muskelgewebes der Muscheln, 6. Wo). Auf der anderen Seite
stieg die Dominanz der C-Toxine in einigen Geweben bis zur 6. Entgiftungswoche auf Werte
>60% (C. edule HP, C. gigas Mantel), z.T. auch >70% (C. edule Fuß, C. gigas Adduktor) an.
Diese Beobachtung resultiert möglicherweise auch aus einer selektiven Retention beim Transfer
der PSP-Toxine in die einzelnen Gewebe. So nahm zwar der PSP-Gehalt im Fuß der Herz-
6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen... 80
muschel während der Entgiftung wieder zu (von 14 auf 38 µg PSP/100g), nicht aber die Toxizi-
tät (Abfall von 4 auf 2 µg STXeq/100g).
Die Verdauungsgewebe zeigten die schnellsten Epimerisierungen, während sie in den meisten
Muskelgeweben (M. edulis, C. edule) langsamer abliefen. Auf der anderen Seite wurde mit
zunehmender Entgiftungsdauer in Übereinstimmung mit allgemeinen Literaturdaten im Muskel-
gewebe von M. edulis und C. gigas die höchste (relative) Anreicherung von STX gefunden (bis
>30%, 8. Entgiftungswoche) 163,183,184.
L. littorea spiegelte zu keinem Zeitpunkt das Toxinprofil von A. fundyense wider. Das in der
Alge reichlich produzierte Neo konnte in der Schnecke nicht nachgewiesen werden, GTX1/4
jedoch noch während der Entgiftungsphase. Am Ende der Dekontamination charakterisierten,
wie auch bei den Muscheln, STX, GTX2/3 und C1/C2 die Gesamt-PSP-Belastung.
In Feldstudien und in kontrollierten Fütterungsexperimenten mit toxischen Alexandrium-Zellen
haben bereits frühere Arbeiten demonstriert, daß die Toxinprofile von Muscheln signifikante
Unterschiede im Vergleich zu dem Toxinprofil der Fütterungsalge aufweisen können 171,175,185,186. Dabei sind die Toxinmuster speziesspezifisch, gewebespezifisch und zeitabhängig.
Als Ursachen für diese Unterschiede sind eine selektive Retention oder Elimination individueller
PSP-Toxine in den einzelnen Kompartimenten sowie die Umwandlung von Toxinen als Ergebnis
metabolischer Prozesse, einschließlich enzymatischer Umwandlungen und physikalisch-
chemischer Vorgänge (vgl. Kap. 1.1.1.2 und 6.3.2.1) zu nennen.
Insgesamt ist es schwierig, die einzelnen metabolischen Vorgänge voneinander zu trennen,
manche Biotransformationen laufen außerdem so kurzzeitig ab, daß sie in den Sammelinter-
vallen (1-2 Wochen) meßtechnisch nicht erfaßt werden konnten. Da auch der Einfluß der Akku-
mulation neuer PSP-Toxine in den einzelnen Organen, der Verlust als auch der chemische
Abbau einzelner Toxine auf die Entwicklung des Toxinprofils nicht klar von den Umwandlungs-
prozessen abgetrennt und nur spekulativ eingeschätzt werden könnte, lag der Schwerpunkt im
vorliegenden Versuch auf einer beschreibenden Darstellung der Verhältnisse der Einzeltoxine
bzw. ihres Anteils an der Gesamtkontamination, wie sie auch bei lebensmittelchemischen Unter-
suchungen erfolgt.
Eine genaue Analyse der charakteristischen Biotransformationsvorgänge in verschiedenen
Schalentieren wurde im nachfolgenden Inkubationsversuch unternommen.
Trotz Schwierigkeiten bei der Erfassung biochemischer Abläufe ist eine Charakterisierung der
Biotransformationsaktivität der einzelnen Molluskenarten anhand des Ausmaßes und der
Geschwindigkeit der Änderungen in den Toxinmustern gegenüber A. fundyense möglich.
6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen... 81
Im vorliegenden Fütterungsversuch waren während der Algenzugabe und größtenteils auch
während der Detoxifikation keine gravierenden Unterschiede zwischen den Toxinprofilen der
Muschelarten, sondern offenbar miteinander vergleichbare Biotransformationskapazitäten bei
M. edulis, C. gigas und C. edule festzustellen. Im Gegensatz zu den Muscheln war im Toxin-
spektrum der Schnecke L. littorea keine gerichtete Entwicklung der Toxinverhältnisse zu erken-
nen. Das PSP-Profil war durch eine sporadische Aufnahme von Algenzellen geprägt, wodurch
sich die Biotransformationsvorgänge, einschließlich Verlust und chemischer Abbau der PSP-
Toxine, zeitlich und individuell überlagerten.
Die Verdauungsgewebe aller Mollusken und der Rest von C. edule zeigten sich als besonders
aktive Kompartimente bzgl. der PSP-Umwandlung. Bedingt sind diese gewebespezifischen
Differenzen hauptsächlich durch das unterschiedliche Vorkommen von Reduktanden und eine
charakteristische Enzymausstattung.
Oshima unternahm eine Klassifizierung der Muschelarten nach ihren Metabolismusraten für
PSP-Toxine, bei der für M. edulis und C. gigas eine nur gering ausgeprägte Toxintransformation
postuliert wurde 66,187. In den vorliegenden Untersuchungen wurde dies bestätigt. Da die unter-
suchten Muschelarten das Toxinprofil der PSP-verursachenden Algenspezies relativ lange reflek-
tierten, können ihre PSP-Profile für retrospektive Aussagen zu Algenblüten, d.h. zum Vorkom-
men bestimmter Dinoflagellaten zu einer bestimmten Zeit in einer Region, herangezogen wer-
den.
6.2.2.6 Individuelle Variabilitäten
Die gesammelten Individuen der 6. Fütterungswoche (n = 5) wurden einzeln analysiert, um
intrapopulative Schwankungen zu ermitteln. Eine inverse Beziehung zwischen PSP-Gehalt und
Variation, wie in der Literatur oftmals erwähnt, ließ sich dabei nicht feststellen 176,188. Die
Schwankungen der Gesamttoxingehalte waren bei M. edulis (176-303 µg PSP/100g), %SD =
22%), bei C. edule (714-1309 µg PSP/100g, %SD = 24%) und unerwartet auch bei L. littorea
(33-60 µg PSP/100g, %SD = 23%) nicht sehr ausgeprägt. C. gigas zeigte dagegen eine große
Variabilität, denn neben nahezu untoxische Individuen waren relativ hoch mit PSP-Toxinen be-
lastete Tiere zu finden, von denen einige sogar den durchschnittlichen PSP-Gehalt von M. edulis
überschritten (7-351 µg PSP/100g, %SD = 92%, Abb. 35). Offenbar ist das Abwehrverhalten
PSP-sensitiver Muschelarten (wie die Auster) individuell sehr unterschiedlich ausgeprägt.
Weitere Ursachen für die Variabilität zwischen Individuen einer Spezies am gleichen Ort sind
neben biologischen Faktoren wie Alter, Größe und Reproduktionsstatus 47,173
6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen... 82
• die physiologische Kondition,
• genotypische Differenzen, die nicht nur die Sensitivität, sondern auch die Bindungs-
kapazität und die Biotransformation von PSP-Toxinen beeinflussen,
• die ungleichmäßige Verteilung der toxischen Algen im Wasser (horizontal, vertikal),
• eine mikrogeographische Variation der Individuen in der Exposition zu toxischen Zellen.
Abb. 35: Variationen der Gesamt-PSP-Gehalte der untersuchten Spezies (links) und der Toxinge-
halte der einzelnen Kompartimente am Bsp. von M. edulis (rechts) in der 6. Fütterungs-woche —— Median, ----- Mittelwert
Die PSP-Gehalte einzelner Kompartimente variierten in ähnlichen Größenordnungen wie der
Gesamttoxingehalt der jeweiligen Spezies, wobei das Muskelgewebe (Adduktoren, Fuß) bei
allen Spezies zu höheren Schwankungen tendierte. So wurden auch in diesen eher gering belaste-
ten Kompartimenten Höchstmengenüberschreitungen festgestellt: C. gigas: 112 µg PSP/100g
Adduktor, M. edulis: 91 µg PSP/100g Adduktor, 106 µg PSP/100g Fuß, C. edule: 319 µg
PSP/100g Fuß.
Hinsichtlich der Variationen einzelner PSP-Toxine lagen die Werte in den einzelnen Geweben
von 6% bis über 100% relative Standardabweichung, wobei die Einzeltoxine in der Auster am
stärksten schwankten.
Insgesamt stimmen die beobachteten Schwankungsbreiten innerhalb der Gesamt-PSP-Gehalte
und der PSP-Profile, die auch das Resultat individueller Metabolismusleistungen sind, mit
verfügbaren Literaturdaten überein und weisen auf die Wichtigkeit einer umfassenden und reprä-
sentativen Probennahme von Schalentieren im Hinblick auf die Kontrolle von Lebensmitteln
mariner Herkunft auf Algentoxine hin 173,188,189.
Gewebe
HP Rest Kie Man Gon Add Fuß Gesamt
HP
(µg
PS
P/10
0g)
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
wei
tere
Org
ane
(µg
PS
P/1
00g)
0
50
100
150
200
250
300
350
Spezies
M.edulis C.gigas C.edule L.littorea
µg P
SP
/100
g
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen... 83
6.3 In vitro Inkubationsversuch
6.3.1 Versuchsdurchführung
Von 10 wirtschaftlich genutzten oder im Rahmen von Monitoring-Programmen relevanten
Muschelarten (Mytilus edulis, Crassostrea gigas, Cardium edule, Arctica islandica, Ensis ensis,
Modiolus modiolus, Mactra stultorum, Pecten maximus) und Schneckenarten (Buccinum
undatum, Littorina littorea) der Nordsee wurde jeweils der Verdauungstrakt (außer P. maximus,
bei B. undatum der Hepatopankreas [HP] sowie der Mitteldarm [MD]) und das Muskelgewebe
als Beispiele für Gewebe mit unterschiedlicher metabolischer Aktivität bzw. Enzymausstattung
separiert. Nach Zugabe von PBS-Puffer (Phosphate buffer salin) zur Stabilisierung (Verdau-
ungsgewebe/Puffer 1:1, Muskelgewebe/Puffer 1:2, jeweils im Massenverhältnis)1 wurden die
Gewebe homogenisiert (Zerstörung der Zellstruktur und Freisetzung von Enzymen) und das
Homogenisat im Verhältnis 10:1 mit einem hochkonzentrierten Extrakt von Alexandrium
fundyense CCMP 1719 versetzt. Dabei wurden Toxinkonzentrationen von ca. 34,4 nmol PSP/g
Verdauungsgewebe (VG) und 51,5 nmol PSP/g Muskelgewebe (MG) erreicht.
Die Hälfte des gut durchmischten Ansatzes wurde 48 Stunden bei 16 °C inkubiert. Der andere
Teil wurde sofort zentrifugiert, der Überstand filtriert und zur PSP-Toxinanalyse in die HPLC-
Apparatur injiziert (= T0).
Nach 48 Stunden erfolgten erneut die Zentrifugation, Filtration und PSP-Bestimmung des
Homogenisates (= T48). Die Inkubationsdauer von 48 Stunden stellte einen Kompromiß
zwischen der möglichst vollständigen Erfassung der metabolischen Aktivität der Mollusken und
dem Beginn von Bakterienwachstum mit den dadurch bewirkten Toxinumwandlungen dar.
Während der Versuchsvorbereitung und vor den HPLC-Bestimmungen wurden die Proben mit
Eis gekühlt, um eine Enzyminaktivierung durch Erwärmung des Substrates während des Homo-
genisierens zu vermeiden und die Enzymaktivität außerhalb der geplanten Inkubationszeit auf
einem Minimum zu halten. Eine wirksame Enzyminaktivierung vor den T0 und T48 Messungen,
z.B. durch kurzes Erhitzen oder Zugabe chemischer Inhibitoren, war nicht möglich, da uner-
wünschte Toxinumwandlungen und Artefaktbildungen auftraten.
Der detaillierte Versuchsablauf sowie die Einzelergebnisse sind im Anhang dargestellt.
1 Aufgrund der festeren und zäheren Konsistenz wurde das Muskelgewebe mit einem höheren Flüssigkeitsanteil versetzt, um die weitere Probenvorbereitung zu erleichtern.
6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen... 84
6.3.2 Ergebnisse und Diskussion
Während des in vitro Versuches konnten gewebe- und speziesspezifische Umwandlungs-
prozesse, die bereits nach 48 Stunden (T48) zu signifikanten Änderungen des PSP-Profils im
Vergleich zur inkubierten Alge Alexandrium fundyense (GTX4 48,3 mol%, C2 23,4 mol%, Neo
20,2 mol%, C1 5,1 mol%, GTX1 1,6 mol%, GTX3 0,6 mol%, B1/B2 0,5 mol%, STX, GTX2
und dcGTX2/3 je 0,1 mol%) führten, nachgewiesen werden. Die Veränderungen wurden durch
reduktive Transformationen, Epimerisierungen und hydrolytische Abspaltungen funktioneller
Gruppen hervorgerufen, jedoch ist auch hier die Trennung einzelner biochemischer Vorgänge
mit Schwierigkeiten behaftet.
6.3.2.1 Metabolisierung der PSP-Toxine
Reduktive Umwandlungsprozesse
Bei den reduktiven Umwandlungen handelt es sich um Transformationen zwischen Carbamoyl-
toxinen, die durch natürlich vorkommende Reduktanden, wie z.B. Cystein und Glutathion, und
durch in den Muscheln vorhandenen Bakterien (enzymatisch) ausgelöst werden. Sie sind durch
eine Entfernung der Sulfatgruppe am C11-Atom, bei der STX aus GTX2/3 und Neo aus GTX1/4
entstehen, als auch durch eine Abspaltung der N-1-OH-Gruppe an GTX1/4 und Neo, wobei
GTX2/3 bzw. STX resultieren, gekennzeichnet 173,173,190,191,191 .
Ein Abfall im Gehalt der N-1-OH-Toxine bei gleichzeitiger deutlicher Zunahme von GTX2/3
und STX wurde besonders im Verdauungsgewebe von L. littorea, B. undatum (HP) und A. islan-dica deutlich (Abb. 36). Der Verlust an Neo und GTX1/4 betrug hier 90% gegenüber T0 bzw.
waren diese Toxine in L. littorea überhaupt nicht mehr nachweisbar. STX und GTX3 entwickel-
ten sich in L. littorea, B. undatum (HP) und A. islandica zu Haupttoxinen, während A. islandica
auch die stärkste GTX2-Anreicherung aller Spezies zeigte.
Neben Umwandlungsprozessen unterlagen Neo und GTX1/4 bevorzugt einem chemischen
Abbau, der vor allem im Verdauungsgewebe von C. edule (-86% GTX1/4, -85% Neo gegenüber
T0) und E. ensis (-47% GTX1/4, -42% Neo) offensichtlich wurde, da hier keine dement-
sprechende Zunahme der N-1-H Toxine zu verzeichnen war. Ein chemischer Abbau (insbes. von
GTX1/4) ist auch bei A. islandica, L. littorea, B. undatum und anderen Spezies bzw. Geweben
nicht auszuschließen, da der Verlust dieser Toxine die Zunahme von GTX2/3 und STX oftmals
überstieg und die GTX2/3-Neubildung auch einer Hydrolyse der C-Toxine zugeschrieben
werden kann.
6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen... 85
Abb. 36: Absolute Änderungen im Gehalt von GTX1-4, Neo, STX im Verdauungsgewebe (links) undim Muskelgewebe (rechts)
Spezies
M. edul.
M. mod.
C. gigas
A. islan.
L. litto
r.
C. edul.
E. ens.
B. und. (M
D)
B. und. (H
P)
M. stult.
nmol
PS
P/g
Ver
dauu
ngsg
eweb
e
0
5
10
15
20
25 GTX4GTX1
T0
T48
Spezies
M. edul.
M. mod.
C. gigas
A. islan.
L. litto
r.
C. edul.
E. ens.
B. und.
P. max.
M. stult.
nmol
PS
P/g
Mus
kelg
eweb
e
0
5
10
15
20
25
30 GTX4GTX1
T0
T48
Spezies
M. edul.
M. mod.
C. gigas
A. islan.
L. litto
r.
C. edul.
E. ens.
B. und. (M
D)
B. und. (H
P)
M. stult.
nmol
PS
P/g
Ver
dauu
ngsg
eweb
e
0
2
4
6
8
10
12 GTX3GTX2
T0
T48
Spezies
M. edul.
M. mod.
C. gigas
A. islan.
L. litto
r.
C. edul.
E. ens.
B. und. (M
D)
B. und. (H
P)
M. stult.
nmol
PS
P/g
Ver
dauu
ngsg
eweb
e
0
2
4
6
8
10 Neo_T0 Neo_T48
Spezies
M. edul.
M. mod.
C. gigas
A. islan.
L. litto
r.
C. edul.
E. ens.
B. und. (M
D)
B. und. (H
P)
M. stult.
nmol
PS
P/g
Ver
dauu
ngsg
eweb
e
0
1
2
3
4
5
6 STX_T0 STX_T48
Spezies
M. edul.
M. mod.
C. gigas
A. islan.
L. litto
r.
C. edul.
E. ens.
B. und.
P. max.
M. stult.
nmol
PS
P/g
Mus
kelg
eweb
e
0
2
4
6
8
10
12 Neo_T0 Neo_T48
Spezies
M. edul.
M. mod.
C. gigas
A. islan.
L. litto
r.
C. edul.
E. ens.
B. und.
P. max.
M. stult.
nmol
PS
P/g
Mus
kelg
eweb
e
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0 GTX3GTX2
T0
T48
Spezies
M. edul.
M. mod.
C. gigas
A. islan.
L. litto
r.
C. edul.
E. ens.
B. und.
P. max.
M. stult.
nmol
PS
P/g
Mus
kelg
eweb
e
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4 STX_T0 STX_T48
6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen... 86
Insgesamt konnten reduktive Prozesse bei nahezu allen Mollusken und Geweben beobachtet
werden. So nahm die GTX1/4-Konzentration in allen Homogenisaten ab (Ausnahme: B. unda-tum [HP], A. islandica [MG]) und die GTX2/3-Konzentration zu, wobei das Verdauungsgewebe
aktiver als das Muskelgewebe einzuschätzen ist. Die durchschnittliche Zunahme von GTX2/3
betrug im Verdauungsgewebe (ohne die Extremwerte von L. littorea, A. islandica, B. undatum,
C. edule, E. ensis) 119%, im MG dagegen nur 37% und auch Neo zeigte überwiegend im VG
Verluste. Auf der anderen Seite verzeichnete STX in allen Geweben (Ausnahme: L. littorea
[MG]) einen Zuwachs. Beim Verdauungsgewebe fand dieser konsequenterweise stärker als im
Muskelgewebe statt, in welchem STX einen Anteil von 0,6 mol% am Gesamttoxingehalt auch
nach 48 h Inkubation nicht überstieg.
Die Ergebnisse lassen auch darauf schließen, daß, wie aus in vivo Untersuchungen bekannt, die
Reduktion am N1-Atom leichter erfolgt als die OSO3- -Abspaltung am C11-Atom 190.
Hydrolytische Abspaltungen
Bei der Hydrolyse wird die N-Sulfo-Gruppe am N21-Atom aufgrund ihrer Instabilität bei
neutralem bis saurem pH-Wert nichtenzymatisch abgespalten. Dabei entstehen im Gewebe von
Meerestieren aus den gering toxischen B- und C-Toxinen die korrespondierenden, stärker toxi-
schen Carbamoyltoxine 65,192.
Mit auffälligen Abnahmen im C-Toxingehalt nach 48 h Inkubation hoben sich im vorliegenden
Versuch nur L. littorea (VG), C. edule (VG, MG), B. undatum (HP) und teilweise A. islandica
(MG, VG) hervor. In B. undatum (HP), A. islandica (VG) und L. littorea (MG) war dabei die
Neubildung von GT2/3 höher als C-Toxine metabolisiert wurden, womit die Reduktion von
GTX1/4 zu GTX2/3 in diesen Geweben bestätigt wurde (Abb. 37). In L. littorea (VG), C. edule
(VG, MG) sowie in A. islandica (MG) überstieg die Abnahme an C1 und C2 eine mögliche
Hydrolyse zu den Gonyautoxinen, was auf einen chemischen Abbau schließen läßt. Insbesondere
L. littorea (VG) zeigte von allen Spezies mit –88% den stärksten Verlust, vor allem auch von C1,
dem keine Zunahme von GTX2 gegenüberstand. Der C-Toxingehalt von C. edule (VG) blieb
trotz deutlichen Verlustes (-28%) auf hohem Niveau, so daß das Toxinprofil nach 48 h
Inkubation mit 66 mol% von diesen Toxinen dominiert wurde.
Bis auf L. littorea (VG) erwiesen sich die C-Toxine, wie schon im Fütterungsversuch, als relativ
persistent, und die hydrolytische Abspaltung der N-Sulfo-Gruppe wurde damit erneut als lang-
samer Prozeß bestätigt.
6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen... 87
Abb. 37: Absolute Änderungen im Gehalt von GTX2, GTX3, C1, C2 im Verdauungsgewebe
(links) und im Muskelgewebe (rechts)
Die B-Toxine waren im Algenextrakt gegenüber den C-Toxinen in vergleichsweise geringer
Menge vorhanden. Ihre Metabolisierung würde deshalb zu weniger deutlichen Veränderungen
im Toxinmuster führen und leicht durch andere Toxinumwandlungen überlagert werden.
Möglicherweise kann jedoch mit ihrer hydrolytischen Transformation die Neubildung von Neo
in einigen Geweben (Muskelgewebe von A. islandica, M. edulis, C. gigas) begründet werden.
Epimerisierungen
Bei allen PSP-Toxinen mit 11-Hydroxysulfat-Gruppen werden nach ihrer Aufnahme in Mu-
scheln Änderungen der Epimeren-Verhältnisse durch eine mögliche thermodynamische Equi-
librierung beobachtet, wobei die vorrangig in toxischen Dinoflagellaten gebildeten β-Epimere in
die stabileren α-Epimere umgewandelt werden. Die Einstellung des stabilen Gleichgewichtes
von 3:1 (α:β) wird in vivo innerhalb von 2-5 Wochen erreicht und im allgemeinen durch hohe
Temperatur und hohen pH-Wert beschleunigt 65,175,177.
Spezies
M. edul.
M. mod.
C. gigas
A. islan.
L. litto
r.
C. edul.
E. ens.
B. und. (M
D)
B. und. (H
P)
M. stult.
nmol
PS
P/g
Ver
dauu
ngsg
eweb
e
0
2
4
6
8
10
12 GTX3GTX2
T0
T48
Spezies
M. edul.
M. mod.
C. gigas
A. islan.
L. litto
r.
C. edul.
E. ens.
B. und. (M
D)
B. und. (H
P)
M. stult.
nmol
PS
P/g
Ver
dauu
ngsg
eweb
e
02
468
10121416
18 C2C1
T0T48
Spezies
M. edul.
M. mod.
C. gigas
A. islan.
L. litto
r.
C. edul.
E. ens.
B. und.
P. max.
M. stult.
nmol
PS
P/g
Mus
kelg
eweb
e
0
5
10
15
20
25 C2C1
T0T48
Spezies
M. edul.
M. mod.
C. gigas
A. islan.
L. litto
r.
C. edul.
E. ens.
B. und.
P. max.
M. stult.
nmol
PS
P/g
Mus
kelg
eweb
e
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0 GTX3GTX2
T0
T48
6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen... 88
Im vorliegenden Versuch traten sowohl im Verdauungsgewebe als auch im Muskelgewebe deut-
liche Epimerisierungen auf. Besonders umfangreich liefen sie im Muskelgewebe von L. littorea
(GTX1:GTX4 1,1:1 [A. fundyense 1:30,1]; GTX2:GTX3 1,4:1 [A. fundyense 1:12,2]; C1:C2
1,8:1 [A. fundyense 1:4,6]), P. maximus (GTX2:GTX3 1:1,3; C1:C2 1,8:1) und B. undatum
(GTX1:GTX4 1:1,9; GTX2:GTX3 1:1,3) sowie im Verdauungsgewebe von M. edulis
(GTX1:GTX4 1:2,5; GTX2:GTX3 1:1,8; C1:C2 1,3:1), B. undatum (MD: GTX1:GTX4 3,5:1;
GTX2:GTX3 1:1,6; C1:C2 1,3:1; HP: GTX1:GTX4 8,0:1) und L. littorea (C1:C2 3,5:1) ab. Es
wurde jedoch von keiner Spezies innerhalb der 48 h Inkubation das stabile Gleichgewicht von
3:1 (α:β) erreicht (Ausnahme: GTX1:GTX4 bei B. undatum MD, HP), und nur bei der Schnecke
L. littorea (MG) und teilweise zwischen C1 und C2 konnte ein Verhältnis von >1 für die
α-Epimere festgestellt werden (Abb. 36, 37).
C. edule zeichnete sich in beiden Geweben durch die geringste Keto-Enol Gleichgewichtsein-
stellung aus. Da jedoch rein thermodynamisch kontrollierte Vorgänge zwischen PSP-Toxinen
mit gleicher Geschwindigkeit ablaufen müßten, kann der Einfluß von gewebe- und artspezi-
fischen Enzymen in diesem Zusammenhang nicht ausgeschlossen werden.
Die Umwandlung der β-Epimere zu ihren korrespondierenden α-Epimeren überlagerte oftmals
die parallelen Reduktions- und Hydrolysevorgänge. So z.B. nahm GTX1 in vielen Geweben zu
oder blieb konstant, obwohl der GTX1/4-Gehalt drastisch gesunken war (z.B. VG von A. islan-
dica, M. edulis, E. ensis). Auf der anderen Seite wirkten die einzelnen biochemischen Reaktio-
nen auch synergistisch, wie anhand der starken Neubildung von GTX2 in A. islandica (VG)
deutlich wurde.
Enzymatische Toxinumwandlungen
Die enzymatische Umwandlung von N-Sulfocarbamoyl- und Carbamoyltoxinen zu den jeweili-
gen Decarbamoyltoxinen ist bei den Muscheln auf nur wenige Spezies begrenzt, während sie bei
Schnecken häufiger beobachtet wird 65,172,182,193. Hydrolysen mittels Carbamoylasen sind dabei
hoch substratspezifisch und laufen vorrangig im Verdauungsgewebe ab 113.
Die Bildung von dcSTX ließ sich in keinem Homogenisat feststellen, obwohl eine enzymatische
Decarbamoylierung bei Mactra chinensis, verwandt mit der hier verwendeten Mactra stultorum,
postuliert wurde, und auch dcGTX2/3 wurde nur vereinzelt in geringen Mengen (z.B. im
Muskelgewebe der Schnecken) gebildet.
6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen... 89
6.3.2.2 Entwicklung der PSP-Profile
Insgesamt war die Biotransformation von PSP-Toxinen im Verdauungsgewebe intensiver als im
Muskelgewebe, und sie hatte bei den beiden Schneckenarten (mit sowohl herbivorer [L. littorea]
als auch carnivorer [B. undatum] Lebensweise) eine stärkere Ausprägung als bei Muscheln.
Die differenzierten Toxinumwandlungen schlugen sich in einer breiten Vielfalt charakteristischer
Toxinprofile nieder (Abb. 38, 39). So reflektierten das Muskelgewebe der Muscheln und einige
Verdauungsgewebe (z.B. das von M. edulis und C. gigas) auch nach 48 h Inkubation die PSP-
Verteilung des zugesetzten Algenextraktes, wobei Neo, GTX4, C1, C2 und GTX1 dominierten.
Epimerisierungen am C11-Atom und auch Verluste an GTX1/4 kennzeichneten die gering-
fügigen Unterschiede.
Abb. 38: Toxinprofile von A. fundyense und vom Muskelgewebe einiger Mollusken nach 48 h Inkubation (Angaben in mol%)
Die Vielfalt der erhaltenen Toxinprofile lag dagegen im Verdauungsgewebe höher, und bei der
Schnecke B. undatum wurden zudem die gravierenden Unterschiede in der metabolischen Kapa-
zität zwischen einzelnen Abschnitten des Verdauungsapparates auf interessante Weise deutlich.
Während am Ende der Inkubationszeit durch reduktive Umwandlungen GTX3 (36,2 mol%), C2
(23,7 mol%) und STX (22,3 mol%) den Hauptteil der PSP-Toxine im Hepatopankreas bestimm-
A. fundyenseSTX
0,1%Neo
20,2%
dcGTX2/30,1%
B1/B20,5%
GTX448,3%
C223,4%
GTX11,6%
C15,1%
GTX30,6%
GTX20,1%
M. edulisSTX
0,2%Neo
18,0%
GTX111,5%
GTX432,1%
GTX30,6%
C1 18,5%
C217,0%
dcGTX2/30,2%
B1/B21,6%
GTX20,3%
C. gigasSTX
0,1%Neo
19,6%
GTX19,5%
GTX433,2%
C1 15,9%
C220,1%
B1/B20,5%
dcGTX2/30,2%
GTX20,2%
GTX30,7%
L. littoreaSTX
1,1%Neo
13,9%
GTX119,0%
GTX416,9%
C1 26,8%
C215,3%
dcGTX2/32,5%
B1/B22,4%
GTX30,9%
GTX21,2%
6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen... 90
B. undatum (HP)
GTX336,2%
C1 4,6%
C223,7%
GTX15,3%
B1/B20,7%
dcGTX2/33,0%
GTX40,7%
GTX21,2%
Neo2,3%
STX22,3%
ten, dominierten im Mitteldarm nach starken Epimerisierungen GTX1 (39,5 mol%), C1 (16,1
mol%), C2 (12,4 mol%) und GTX4 (11,4 mol%).
Die auffälligsten Veränderungen gegenüber dem PSP-Profil von A. fundyense ergaben sich
neben B. undatum (HP) auch in L. littorea (VG), A. islandica (VG) und C. edule (VG). Bis auf
das letztgenannte Gewebe war das jeweilige Toxinspektrum durch die stabilen PSP-Derivate
GTX2, GTX3 und STX charakterisiert.
Abb. 39: Toxinprofile von A. fundyense und vom Verdauungsgewebe einiger Mollusken nach 48 h Inkubation (Angaben in mol%)
A. fundyenseSTX
0,1%Neo
20,2%
dcGTX2/30,1%
B1/B20,5%
GTX448,3%
C223,4%
GTX11,6%
C15,1%
GTX30,6%
GTX20,1%
C. edule
C1 27,6%
C238,8%
STX0,7%
dcGTX2/30,5%Neo
7,8%GTX13,1%
GTX415,2%
GTX20,9%
GTX32,3%
B1/B23,1%
M. modiolusSTX
1,2%
GTX440,8%
GTX31,5%
C1 15,0%
C217,9%
Neo16,7%
B1/B20,3%
dcGTX2/30,6%
GTX15,3%
GTX20,7%
L. littorea
STX42,6%
GTX26,4%
GTX337,5%
C1 7,8%
C22,2%
B1/B21,5%
dcGTX2/32,0%
B. undatum (MD)STX
4,3%Neo
8,1%
dcGTX2/31,7%
B1/B20,3%
GTX139,5%GTX4
11,4%GTX22,4%
GTX33,7%
C1 16,2%
C212,4%
6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen... 91
6.3.2.3 Entwicklung der Gesamt-PSP-Gehalte
Bei Betrachtung der Entwicklung der PSP-Gehalte der einzelnen Gewebe während der Inkuba-
tion fällt auf, daß sich insbesondere bei den Spezies mit den größten Änderungen im Toxinprofil
signifikante Abnahmen der Gesamttoxizität (nmol STXeq/g) und des Gesamt-PSP-Gehaltes
(nmol PSP/g, Abb. 40) gegenüber T0 ergaben.
Offenbar waren einige Spezies bzw. Gewebe in der Lage, sehr schnell PSP-Toxine abzubauen
und/oder in weniger toxische PSP-Toxine zu konvertieren. Diese rasche Entgiftung ging dabei
vor allem zu Lasten der sehr toxischen Derivate Neo, GTX1 und GTX4.
Abb. 40: Veränderung des Gesamt-PSP-Gehaltes während der Inkubation in Abhängigkeit von der
Tierspezies (links: Verdauungsgewebe, rechts: Muskelgewebe)
Ähnliche Beobachtungen machte bereits Shimizu bei einem in vitro Experiment mit Muskel-
geweben von Placopecten magellanicus, die mehr als 50% ihrer Toxizität innerhalb von 3 Tagen
verloren 194.
Spezies mit einer weniger ausgeprägten Biotransformation, wie M. edulis, M. modiolus und
C. gigas zeigten dagegen kaum eine Abnahme des Toxingehaltes und der Toxizität, andererseits
kam es auch vereinzelt zu einer Zunahme im Vergleich zu T0. Hierbei könnte eine Rolle spielen,
daß zugesetzte PSP-Toxine sofort an Proteine der Gewebe gebunden wurden. Dadurch wurden
sie bei der T0-Analyse (ohne Säureaufschluß durchgeführt) nicht erfaßt. Dagegen könnte nach
48 h Inkubationszeit die Bindung der PSP-Toxine unter Enzymeinfluß teilweise wieder gelockert
sein, so daß bei der T48-Analyse höhere Werte gefunden wurden.
Bis zu den Startanalysen (T0) kam es bereits zu Änderungen im PSP-Profil einiger Mollusken
gegenüber dem von A. fundyense. Das liegt möglicherweise in der Schnelligkeit einiger enzyma-
SpeziesM. e
dul.
M. mod.
C. giga
s
A. islan.
L. litto
r.
C. edul.
E. ens.
B. und.
(H)
B. und
. (M)
M. stult.
nmol
/g V
erda
uung
sgew
ebe
0
10
20
30
40
50
60 T0 T48
SpeziesM. e
dul.
M. mod.
C. giga
s
A. islan.
L. litto
r.
C. edul.
E. ens.
B. und
.
P. max
.
M. stult.
nmol
/g M
uske
lgew
ebe
0
10
20
30
40
50
60
70 T0 T48
6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen... 92
tischer und chemischer Reaktionen begründet, die innerhalb weniger Minuten ablaufen können.
Auch ist es möglich, daß die oben angesprochene anfängliche Bindung der PSP-Toxine an
Proteine selektiv für bestimmte Derivate erfolgte. Im Blindversuch (A. fundyense plus PBS-
Puffer 1:1) waren nach 20 min (Zeit für die Aufarbeitung des Homogenisats zur HPLC-Analyse)
noch keine Veränderungen sichtbar.
Die differenzierte Entwicklung des Toxinprofils während der Inkubation beweist die spezies-
spezifische und gewebespezifische Metabolisierung von PSP-Toxinen unabhängig von Absorp-
tionseffizienz, Sensitivität und Bindungskapazität. Einige Transformationsprozesse, darunter vor
allem die reduktiven Vorgänge, sind jedoch auch auf mit den Mollusken assoziierte Bakterien
zurückzuführen 190,195. Da jedes Gewebe eine spezifische Mikroflora besitzt (im HP mehr als im
MG), ist ihr Einfluß als charakteristisch zu beurteilen. Eine bakterielle Fremdkontamination mit
Auswirkungen auf den Toxinkatabolismus ist natürlich nicht auszuschließen, jedoch deuten die
breitgefächerten Veränderungen im Toxinprofil auf eine nur minimale und zufällige Fremd-
kontamination hin.
In der Literatur werden nur wenige in vitro Experimente zu PSP-Toxinen erwähnt 65,190,194,196. In
den dort dargestellten Versuchen, durchgeführt mit gleichen und anderen Spezies, wurde meist
bei höherer Temperatur und über längere Zeit inkubiert. Teilweise wurden Bakterizide zugesetzt,
die jedoch auch molluskenspezifische Mikroorganismen hemmen bzw. es wurden Bakterien und
Enzyme isoliert und mit einzelnen PSP-Toxinen inkubiert. Insofern sind die Ergebnisse der vor-
liegenden Arbeit nur eingeschränkt mit den Literaturdaten vergleichbar. Dennoch werden diese
im wesentlichen bestätigt sowie an wichtigen Punkten ergänzt.
Shimizu postulierte für Muskelgewebe das Vorhandensein großer Mengen an Enzymen, die an
Redoxreaktionen und damit besonders an der Abspaltung der Sulfat-Gruppe beteiligt sind 194.
Bei den vorliegenden Versuchen konnte dieses Postulat wegen der beobachteten vergleichsweise
geringen Zunahmen an STX, GTX2/3 experimentell nicht untermauert werden.
Bei den Experimenten mit isolierten Bakterien und Enzymen waren die PSP-Toxinumwand-
lungen (vor allem Reduktionen) in Isolaten aus dem Verdauungsgewebe, im Gegensatz zu denen
aus dem übrigen Gewebe, schon nach wenigen Stunden abgeschlossen, wobei C11-β-Epimere
schneller als die entsprechenden α-Epimere metabolisiert wurden 113,190,196. Außerdem wurde
behauptet, daß die in den Geweben vorhandenen Bakterien mittels Sulfotransferasen z.B.
Gonyautoxine in ihre korrespondierenden C-Toxine „rückführen“ 190. Damit könnte der hier in
6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen... 93
vielen Geweben beobachtete, meist gleichbleibende und teilweise sogar ansteigende Gehalt der
N-Sulfocarbamoyltoxine gegenüber T0 ebenfalls erklärt werden.
Oshima publizierte hingegen, daß beide reduktiven Umwandlungsprozesse (N-1-OH- und C11-
OSO3-–Abspaltung) bei 30 °C innerhalb von 24 Stunden auch ohne bakterielle Beteiligung ab-
laufen 65.
Für vier Gewebe (2x HP, 2x MG) von vier Spezies (M. edulis, M. modiolus, C. gigas, L. littorea)
wurden 3 Inkubationsexperimente parallel durchgeführt, um die Reproduzierbarkeit der Ergeb-
nisse und die Schwankungsbreite der Toxinanalysen stellvertretend für die übrigen Homogenisa-
te abschätzen zu können. Dabei unterschieden sich die Schwankungsbreiten der T0-Werte nicht
signifikant von denen der T48-Werte (t-Test, α = 0,05, Ausnahme: MG von M. modiolus, der
größere Schwankungsbreiten für die T0-Werte zeigte). Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse
war sowohl für das Muskel- als auch für das Verdauungsgewebe als gut zu bewerten. Meist
lagen die relativen Standardabweichungen der Einzeltoxine unter 15%, bei 60% der Analysen
sogar unter 10%.
Nicht zu unterschätzen ist, daß im jeweiligen Homogenisat eine Vielzahl von Einzelindividuen
verarbeitet wurde. Interessant wäre in weiteren Experimenten die Inkubation von PSP-Toxinen
mit Geweben von Einzelindividuen in einer größeren Anzahl paralleler Ansätze zu untersuchen,
um Erkenntnisse hinsichtlich der individuellen Biotransformationskapazität zu erhalten.
6.4 Schlußfolgerungen und Ausblick
C. gigas, C. edule und die Schnecke L. littorea sind bereits bei einer moderat toxischen Misch-
algenblüte fähig, PSP-Toxine zu akkumulieren und kommen somit für den Toxintransfer in der
marinen Nahrungskette in Frage. Es zeigte sich aber, daß L. littorea nach PSP-Exposition und
Entfernung des Darmabschnittes keine Gefahr für den Verbraucher darstellt, während C. edule
sehr effektiv PSP-Toxine speichert. Unabhängig davon sollte für beide Spezies das Verhalten
gegenüber hochtoxischen Monoblüten untersucht werden.
C. gigas erreicht bei moderat toxischen Mischblüten Toxinbelastungen in ähnlicher Größen-
ordnung wie M. edulis, was aber aufgrund einer für C. gigas nachgewiesenen Sensibilität gegen-
über PSP-Toxinen nicht auf hochtoxische Monoblüten übertragbar ist. Innerhalb von wenigen
Wochen wurde, in Abhängigkeit von der Ausgangstoxizität, die Verkehrsfähigkeit von M. edulis,
C. gigas, C. edule und L. littorea wieder erreicht, die deshalb zu den Kurzzeitspeicherern gezählt
werden müssen.
6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen... 94
Die Kapazität der Muscheln zur Metabolisierung von PSP-Toxinen ist als relativ gering einzu-
schätzen, da signifikante Veränderungen gegenüber dem Toxinmuster der Algen erst während
der Detoxifikation deutlich wurden. Der Gehalt an PSP-Toxinen in den Muscheln und Schnek-
ken war insgesamt zu niedrig, um ihr tatsächliches Potential zur Biotransformation zu verfolgen.
Trotz Ähnlichkeiten bei den Toxinprofilen deuteten sich auch Unterschiede in der Metabolisie-
rung von PSP-Toxinen zwischen den Spezies und den einzelnen Geweben an. Außerdem wurde
ein ausgeprägter, speziesspezifischer, von der Versuchsdauer abhängiger Toxintransfer, insbe-
sondere vom Verdauungsgewebe in das umliegende Gewebe, festgestellt. Auch ergaben die
Untersuchungen, daß die Entfernung besonders belasteter Gewebe (z.B. Hepatopankreas) keine
absolute Sicherheit für den Verbraucher gewährleistet.
In weiterführenden in vivo Experimenten sollten C. gigas, C. edule und L. littorea in getrennten
Behältnissen mit toxischen Algen in höherer Zahl gefüttert werden, um genauere Analysen der
aufgenommenen Algenmengen durchführen zu können und neue Erkenntnisse bzgl. zu erwar-
tender Toxizitäten und der Metabolisierungsleistung bei höherer PSP-Belastung zu gewinnen.
Dabei könnten Individuen einer Spezies auch während bzw. gegen Ende der Entgiftung auf eine
Entwicklung ihrer intrapopulativen Variationen hin untersucht und gleichzeitig auf speziesspezi-
fische Unterschiede überprüft werden.
In in vitro Experimenten wurde die Metabolisierung der PSP-Toxine in einzelnen Geweben (Verdauungsgewebe, Muskelgewebe) speziesabhängig direkt, d.h. ohne Berücksichtigung von Toxintransfer und Akkumulationskinetik, ermittelt. Dabei wurde beim Muskelgewebe, welches bei durchschnittlichen Algenblüten oft nur gering kontaminiert ist, nach Zugabe großer Mengen an PSP-Toxinen das eigentliche Potential der Biotransformation deutlich. Es wurde nicht nur im Hepatopankreas eine hohe Transformationsaktivität aufgrund der hohen Konzentration an Verdauungsenzymen erwartet, sondern auch im stoffwechselaktiven Muskel-gewebe. Die Inkubationsexperimente ergaben jedoch nur bei den marinen Schnecken signifikan-te Änderungen im PSP-Profil des Muskelgewebes nach 48 h, wobei diese Schnecken auch im Verdauungsgewebe die höchsten Biotransformationskapazitäten aufwiesen. So kann beispiels-weise das Fehlen von Neo bei L. littorea im Fütterungsexperiment mit dem Ergebnis des in vitro Versuches erklärt werden. Der beim in vivo Versuch miteinander vergleichbare, gering ausgeprägte Toxinmetabolismus in M. edulis und C. gigas wurde mit den geringen Metabolisierungsraten der PSP-Toxine in beiden Spezies während der Inkubation bestätigt. Hingegen konnten auch hier bei C. edule die schwache Epimerisierungsleistung und im Hepatopankreas hohe Gehalte an N-Sulfocarbamoyltoxinen nachgewiesen werden. Beim Fütterungsversuch schien vom HP der selektive Transfer von
6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen... 95
C-Toxinen in den Fuß auszugehen. Desweiteren zeigte sich in beiden Versuchsanordnungen bei einem Großteil der Gewebe eine hohe Persistenz der C-Toxine im Vergleich zu den Carbamoyl-toxinen. Die Rolle der Mikroflora im Verdauungsgewebe und in anderen Kompartimenten der Mollusken bei der Umwandlung und bei dem Abbau von PSP-Toxinen zu nichttoxischen Derivaten ist noch nicht ausreichend erforscht. Hierzu sind weitere in vitro Experimente notwendig, z.B. eine Parallelinkubation von Molluskenhomogenisaten mit und ohne Bakterizide, um gewebeeigene Metabolisierungen von denen unter Mitwirkung von Bakterien erfolgenden abzugrenzen. Eben-falls durchgeführt werden sollten aerobe und anaerobe Versuchsansätze und die Inkubation mit einzelnen PSP-Toxinen. Um die zeitliche Abfolge der Umwandlungsprozesse besser zu doku-mentieren, sind die Zeitabstände der Toxinanalysen während der Inkubation zu verkürzen. Die Experimente im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden durchgeführt, um weitere und genauere Daten bzgl. der Akkumulation und Biotransformation der von Dinoflagellaten produ-zierten PSP-Toxine in Schalen- und Krustentieren zu gewinnen. Diese Daten, bisher nur unzu-reichend vorhanden, sind eine wichtige Hilfe bei der Abschätzung zu erwartender Toxizitäten einzelner Muschel- und Schneckenarten und bilden die Grundlage für Entscheidungen im Hinblick auf den Schutz des Verbrauchers vor gesundheitlichen Gefährdungen durch Algen-toxine in Lebensmitteln mariner Herkunft.
III Zusammenfassung 96
III ZUSAMMENFASSUNG
Als Paralytic Shellfish Poisoning (PSP) -Toxine werden eine Gruppe potenter Neurotoxine, die
von marinen Dinoflagellaten und einigen Cyanophyceen produziert werden, bezeichnet. Mit der
Aufnahme toxischer Algen, z.B. durch filternde Muscheln, können sich PSP-Toxine in der mari-
nen Nahrungskette anreichern, so daß es zu Vergiftungen nach Verzehr von mit PSP-Toxinen
kontaminierten Schalentieren kommen kann. Zur Bestimmung von PSP-Toxinen aus Krusten-
und Schalentieren wurden deshalb sowohl Bioassays und biochemische als auch physikalisch-
chemische Nachweisverfahren entwickelt.
Bioassays (z.B. der Maus-Bioassay) sind schnell und einfach durchführbar, jedoch erlauben sie
keine Aussagen zum Vorkommen einzelner PSP-Toxine bzw. zur chemischen Struktur.
Mit biochemischen Methoden können Toxine spezifisch bestimmt werden, jedoch kommt es
häufig zu Kreuzreaktionen bzw. einige toxikologisch relevante PSP-Toxine werden mit diesen
Verfahren (ELISA, Voltage-clamp-Verfahren) nicht erfaßt.
Hingegen gestatten chromatographische Verfahren - unabhängig davon, ob eine Vorsäulen- oder
Nachsäulenderivatisierung erfolgt - den selektiven und empfindlichen Nachweis von in Bio-
materialien nebeneinander vorliegenden PSP-Toxinen.
Zur HPLC-Bestimmung von PSP-Toxinen werden gegenwärtig ionenpaarchromatographische
Methoden mit oxidativer post-column Derivatisierung und anschließender Fluoreszenzdetektion
eingesetzt. Als nachteilig erweist sich hierbei die störanfällige chemische Nachsäulenderivatisie-
rung, die zusätzliche Chemikalien und einen hohen apparativen Aufwand erfordert. Außerdem
verhindern die kostenintensiven Ionenpaarbildner und der Phosphatpuffer im Eluenten die Kopp-
lung der HPLC-Apparatur an das Massenspektrometer.
Vor diesem Hintergrund war es das Ziel der vorliegenden Arbeit, ein HPLC-Verfahren zur
Bestimmung von PSP-Toxinen zu entwickeln, bei dem durch die Verwendung flüchtiger
Substanzen im Eluenten die chemische Derivatisierung durch eine elektrochemische Oxidation
ersetzt werden kann und die Kopplung der HPLC-Apparatur an ein Massenspektrometer möglich
ist. Allerdings mußte zunächst die in Jena bereits in der Routineanalytik eingesetzte ionenpaar-
chromatographische HPLC-Methode hinsichtlich Trennleistung und Reproduzierbarkeit opti-
miert werden.
III Zusammenfassung 97
Leistungsfähige Analysenverfahren, die die Erfassung einzelner Toxine und ihrer Metaboliten
gestatten, sind essentiell für das Verständnis der Biochemie der PSP-Toxine sowie ihrer Inter-
aktion in der Umwelt. Außerdem sind profunde Kenntnisse über den Verbleib von PSP-Toxinen
in der Nahrungskette Grundlage für die Entwicklung effektiver Monitoring-Programme zum
Schutz der Konsumenten vor Vergiftungen durch PSP-kontaminierte Lebensmittel mariner
Herkunft. Deshalb waren Studien zur Anreicherung und Metabolisierung von PSP-Toxinen in
Krusten- und Schalentieren durchzuführen, um neue Erkenntnisse bzgl. der für bestimmte
Spezies charakteristischen Transformationsprozesse zu gewinnen.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden anhand von in vivo Fütterungsstudien und von in
vitro Inkubationsexperimenten die Akkumulation, Detoxifikation und Biotransformation von
PSP-Toxinen in verschiedenen kommerziell genutzten Muschel- und Schneckenarten der Nord-
see untersucht. Mit diesem Vorgehen konnten sowohl chemisch-analytische Aspekte im Zusam-
menhang mit PSP-Toxinen als auch die Bedeutung dieser Algentoxine in der marinen Umwelt
miteinander verknüpft und gleichzeitig die Praxistauglichkeit des optimierten bzw. neu entwik-
kelten HPLC-Verfahrens überprüft werden.
Das optimierte HPLC-Verfahren zur PSP-Bestimmung basiert auf der ionenpaarchromato-
graphischen Methode von Thielert et al., das bereits von Yu et al. hinsichtlich einer Trennung
von GTX1 und GTX4 unter Inkaufnahme nicht reproduzierbarer Retentionszeiten und längerer
chromatographischer Runs modifiziert wurde. Nach Erhöhung der Effizienz der Equilibrierung
der zur Toxintrennung eingesetzten RP-C18 Säule und einem veränderten Gradientenprogramm
resultierte eine robuste HPLC-Methode für die Routineanalytik von PSP-Toxinen auf der Basis
der Ionenpaarchromatographie.
Bei der Entwicklung des neuen HPLC-Verfahrens zur Bestimmung von PSP-Toxinen wurde auf
das Prinzip der Ionenaustauschchromatographie zurückgegriffen, um eine Kopplung mit dem
Massenspektrometer zu ermöglichen. Dabei gelang die Trennung von anionischen und kationi-
schen PSP-Toxinen durch die Verbindung einer starken Anionenaustauschersäule mit zwei
starken Kationenaustauschersäulen und einem ausschließlich Ammoniumacetat enthaltenden
wäßrigen Eluenten. Die Optimierung der Elutionsbedingungen erfolgte durch Abstimmung der
Ammoniumacetatkonzentration und des pH-Wertes des Eluenten sowie durch Variation des
organischen Modifiers.
III Zusammenfassung 98
Nach Vereinfachung der chromatographischen Bedingungen konnte die mit Oxidationslösungen
durchgeführte Nachsäulenderivatisierung durch eine elektrochemische Oxidation in der „Guard
cell“ eines elektrochemischen Detektors erfolgen. Die Leistungsfähigkeit dieses neuen HPLC-
Verfahrens wurde im Rahmen von vergleichenden Messungen PSP-belasteter Algen und
Muscheln überprüft, wobei das Probenmaterial zusätzlich mit der optimierten HPLC-Methode
auf Basis der Ionenpaarchromatographie analysiert wurde.
Die ausschließliche Verwendung von Ammoniumacetat im wäßrigen Eluenten ermöglichte nicht
nur eine einfachere und preiswertere PSP-Bestimmung, sondern aufgrund der Volatilität der
mobilen Phase auch den Einsatz der LC/MS-Kopplung, jedoch wirkte sich hierbei zunächst die
hohe Ionenkonzentration des Puffers nachteilig auf die Nachweisempfindlichkeit der massen-
spektrometrischen Detektion aus. Allerdings konnte durch teilweise Substitution des Ammo-
niumacetates mit Acetonitril und durch höhere Injektionsmengen die geringere Nachweis-
empfindlichkeit der MS-Detektion ausgeglichen werden, so daß jetzt auch PSP-Konzentrationen
unterhalb der gesetzlich zulässigen Höchstmenge an PSP-Toxinen in Lebensmitteln eindeutig
mit Hilfe der Massenspektrometrie bestimmt werden können.
Durch den Verzicht auf die chemische Derivatisierung wurde die Kopplung HPLC/FLD/MS
möglich. Dabei wird das von der Säule kommende Eluat über einen Split geleitet, und die
underivatisierten PSP-Toxine gelangen sowohl direkt in das Massenspektrometer als auch über
eine elektrochemische Zelle in den Fluoreszenzdetektor. Die parallele Messung von Proben mit
unterschiedlichen Detektoren garantiert eine hohe Zuverlässigkeit bei der Identifizierung der
jeweils zu analysierenden einzelnen PSP-Toxine.
Aufgrund der unterschiedlichen Toxizität der einzelnen PSP-Toxine müssen alle in einer Probe
vorhandenen PSP-Toxine eindeutig bestimmt werden, um die Gesamttoxizität möglichst exakt
berechnen zu können. Mit dem Massenspektrometer ist nicht nur eine eindeutige Identifizierung
und Quantifizierung der PSP-Toxine möglich, sondern es können auch Aussagen zur Struktur
von Substanzen gemacht werden, die als bisher nicht näher identifizierte Peaks in den Chromato-
grammen auftauchen
Ein weiterer Vorteil der massenspektrometrischen Detektion besteht darin, daß die chromato-
graphische Trennung nur für PSP-Toxine notwendig ist, die bei gleicher Massenzahl detektiert
werden. Dadurch kann durch isokratische Elutionsbedingungen und Verzicht auf den Anionen-
austauscher (die Messung von N-Sulfocarbamoyltoxinen ist für die Lebensmittelüberwachung
nicht erforderlich) die zur PSP-Bestimmung notwendige Analysenzeit signifikant verkürzt
III Zusammenfassung 99
werden, und gleichzeitig steht ein schnelles (Runzeit = 15 Minuten) HPLC-Verfahren mit MS-
Detektion für PSP-Analysen im Rahmen von Monitoring-Programmen und zur Lebensmittel-
kontrolle zur Verfügung.
Für jede Methode zur PSP-Bestimmung ist die Verfügbarkeit einzelner PSP-Toxine als reine
Standardsubstanzen essentiell. Durch die einfache Zusammensetzung der mobilen Phase und die
ausschließliche Verwendung flüchtiger Puffersubstanzen ist das neue HPLC-Verfahren auch zur
Gewinnung von PSP-Standardlösungen geeignet. Mit dem upscaling der chromatographischen
Trennung unter Verwendung präparativer Ionenaustauschersäulen wurde bereits begonnen.
Im in vivo Fütterungsexperiment wurden zum menschlichen Verzehr geeignete Muschel-
(Miesmuscheln, Austern, Herzmuscheln) und Schneckenarten (Strandschnecken) bzgl. der
Akkumulation von PSP-Toxinen sowie der Toxinumwandlungsaktivität untersucht. Während
einer sechswöchigen Fütterungsphase mit PSP-produzierenden Alexandrium fundyense-Zellen
und einer achtwöchigen Entgiftungsperiode wurde die Kontamination mit PSP-Toxinen sowie
die Detoxifikation verfolgt. Alle Spezies konnten als Speicherorganismen für PSP-Toxine und
damit als potentielle Verursacher von PSP-Vergiftungen identifiziert werden.
Nach Simulation einer moderat toxischen Mischblüte akkumulierten Herzmuscheln besonders
große Mengen an PSP-Toxinen. Miesmuscheln und Austern speicherten weniger und wiesen
Toxizitäten auf niedrigerem Niveau, jedoch deutlich über dem gesetzlichen Grenzwert auf.
Strandschnecken akkumulierten nur geringe Toxinmengen, wobei das Muskelgewebe untoxisch
blieb.
Erwartungsgemäß zeigte das Verdauungsgewebe bei allen Tieren die höchste und das Muskel-
gewebe die niedrigste PSP-Kontamination, jedoch erfolgte ein Toxintransfer zwischen den
Geweben. Bei Austern erfolgte er am schnellsten.
Die Detoxifikationsdauer war von der Initialtoxizität der Gewebe abhängig, jedoch konnten alle
untersuchten Spezies als schnell detoxifizierend charakterisiert werden, da sie innerhalb von
wenigen Wochen entgifteten.
Muscheln zeigten eine miteinander vergleichbare moderate Kapazität hinsichtlich der Toxin-
biotransformation. Metabolisierungen der PSP-Toxine wurden insbesondere nach Beendigung
der Fütterung mit toxischen Algen deutlich. Bei den Strandschnecken waren aufgrund einer nur
sporadischen Nahrungsaufnahme keine charakteristischen Veränderungen im Toxinprofil er-
kennbar.
III Zusammenfassung 100
Die Ergebnisse der Analysen von Einzeltieren zeigten, daß starke Unterschiede im Toxingehalt
zwischen Individuen gleicher Gebiete und Individuen, die unter gleichen Bedingungen PSP-
haltige Algen aufnehmen, auftreten können.
Bei den in vitro Inkubationsexperimenten wurde von 10 verschiedenen, zum Verzehr tauglichen
Muschel- und Schneckenarten (inklusive der beim Fütterungsversuch eingesetzten Spezies) das
Muskel- und Verdauungsgewebe mit einem PSP-haltigen Extrakt von Alexandrium fundyense
über einen Zeitraum von 48 Stunden inkubiert. Dabei konnten nach Analyse der Veränderungen
der PSP-Profile die speziesspezifischen und gewebespezifischen Metabolisierungen erfaßt wer-
den.
Insgesamt wurden in Schnecken und in den meisten Verdauungsgeweben besonders starke
Aktivitäten bei der Umwandlung von PSP-Toxinen beobachtet. So waren Reduktionsvorgänge
hauptsächlich hier zu beobachten. Hingegen fanden Umwandlungen von N-Sulfocarbamoyl-
toxinen zu ihren korrespondierenden Carbamoyltoxinen nur in begrenztem Umfang statt.
Speziell die C-Toxine blieben länger als einige Carbamoyltoxine in den Geweben nachweisbar.
Epimerisierungen erfolgten sowohl im Muskel- als auch im Verdauungsgewebe, während
Decarbamoylierungen kaum auftraten.
Spezies mit hohen Biotransformationskapazitäten verzeichneten nach 48 Stunden eine signifi-
kante Reduktion des PSP-Gehaltes und der Toxizität. Damit verfügen diese Organismen über
einen effektiven Entgiftungsmechanismus, dessen Grundlage die Umwandlung der aus Algen
stammenden PSP-Toxine in weniger toxische und/oder besser ausscheidbare Metabolite bildet.
Der Einsatz der optimierten und der neu entwickelten HPLC-Methode bewährte sich bei der
Durchführung dieser biologischen Studien. Dabei konnte die neue HPLC-Methode mit Fluores-
zenzdetektion problemlos für die Analytik von Algenextrakten eingesetzt werden, jedoch erwies
sich eine zusätzlich MS-Absicherung der nach Fluoreszenzdetektion erhaltenen Ergebnisse
speziell bei der Analyse von Extrakten aus Muscheln als unbedingt notwendig.
Somit ist zu konstatieren, daß die Optimierung des HPLC/FLD-Verfahrens auf der Basis der
Ionenpaarchromatographie und die Entwicklung eines neuen HPLC/FLD/MS-Verfahrens auf der
Basis der Ionenaustauschchromatographie dazu führten, daß PSP-Toxine aus marinen Organis-
men schnell, empfindlich und eindeutig nachgewiesen werden können.
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V Anhang 115
V ANHANG
1. Geräte und Materialien
Pumpe: Gradientenpumpe LC-10Atvp, Shimadzu, Deutschland
Autosampler: SIL-10A Autosampler, Shimadzu, Deutschland
Säulenofen: CTO-10AC Säulenofen, Shimadzu, Deutschland
Pumpen für die LC-6A Pumpe, Shimadzu, Deutschland Nachsäulenderivatisierung: LC-9A Pumpe, Shimadzu, Deutschland
Reaktionseinheit: CRX 400 Post-column Reactor, Pickering Laboratories, USA
Elektrochemisches ESA Colouchem Detektor 5100A als Potentiostat mit Oxidationssystem: Guard Zelle 5020, ESA, USA
Detektor: RF-10AxL Fluoreszenzdetektor, Shimadzu, Deutschland
Interface: SCL-10Avp System Controller, Shimadzu, Deutschland
Datenauswertung: Class-vp 5.3 Software, Shimadzu, Deutschland
LC-MS: PE Series 200 Gradientenpumpe mit PE Series 200 Autosampler, single quadrupole API 165 PE Sciex Mass Spectrometer, API/ESI Turbo Ionspray Interface, Perkin-Elmer, Deutschland
HPLC-Säulen: Source 15S PE 4.6/100 (Kationenaustauscher) Source 15Q PE 4.6/100 (Anionenaustauscher) Pharmacia Biotech, Schweden
Vakuumzentrifuge: Speedvac SPD121P, ThermoLifeSciences, Großbritannien
Mikroskop: Axiovert 135, Zeiss, Deutschland
2. PSP-Toxinstandards
STX, NEO, GTX1-4: National Research Council, Marine Analytical Chemistry inkl. dcGTX2/3 Standards Program (NRC-PSP-1B, NRC-PSP-1C)
dcSTX: Europäische Kommission (BCR, The Community Bureau of Reference, Brussels), Standard vom Ringversuch von 1995-1996
C-Toxine: Extrakt von Alexandrium fundyense (CCMP 1719), kultiviert von G. Gerdts, Helgoland, Deutschland Extrakt von Alexandrium sp. (BAH-ME 220), isoliert von M. Delgado, Vigo, Spanien
V Anhang 116
3. Chemikalien
Acetonitril: Art.No. 8142, J.T. Baker, Niederlande
Ammoniumacetat: Art.No. 169880010, Arcos Organics, Belgien
Ammoniumformiat: Art.No. 5093.1, Roth, Deutschland
Ammoniaklösung: 25%, Art.No. 1.05432.1011, Merck, Deutschland
Essigsäure: 100%, Art.No. 1.00063, Merck, Deutschland
Methanol: Art.No. 7342.1, Roth, Deutschland
Oktansulfonsäure: Na-Salz, Art.No. O-8380, Sigma-Aldrich, Deutschland
Perjodsäure: Art.No. 8.22288.0100, Merck-Schuchardt, Deutschland
Phosphorsäure: 85% (ortho), Art.No. 1.00573.1000
PBS-Puffer: Phosphate buffer salin (Phosphat gepuffert in NaCl-Puffer)
Salpetersäure 65%, Art.No. 1.00456.2500, Merck, Deutschland
Tetrahydrofuran: Art.No. 9441, J.T. Baker, Niederlande
Trifluoressigsäure: 99,8%, Art.No. 34957, Sigma-Aldrich, Deutschland
Wasser: HPLC-Qualität, gereinigt mit Millipore-Q RG Ultra Pure Water System, Millipore, USA
4. Allgemeine Probenaufarbeitung nach Hummert
Direkte Bestimmung der Carbamoyl- und Decarbamoyltoxine
- 0,5 bis 1,0 g homogenisierte Muschel (Ultra Turrax) bzw. 1 Algenfilter jeweils mit 1 mL
0,03 N CH3COOH versetzen, gut durchmischen
- Probe mit Ultraschall behandeln: 1 min Ultraschallstab oder 10 min Ultraschallbad
- Probe 15 min zentrifugieren (14000 rpm)
- Überstand filtrieren (0,22 µm Nylonfilter), fertig zur Injektion
Indirekte Bestimmung der N-Sulfocarbamoyltoxine
- 300 µL vom fertigen Essigsäureextrakt abnehmen und mit 74 µL 1 M HCl versetzen
(Reacti-Vial), gut durchmischen
- 15 min im Heizblock bei 90°C erhitzen, danach auf Raumtemperatur abkühlen lassen
- Extrakt mit 150 µL 1 M CH3COONa neutralisieren, fertig zur Injektion
V Anhang 117
5. Methodenvergleich (Kapitel 4.5.1)
Herkunft der Proben:
Proben-Nr. Spezies Herkunft
M1 Crassostrea gigas, HP Fütterungsversuch 6.Woche M2 Mytilus edulis, HP Fütterungsversuch 6.Woche M3 Mytilus edulis, HP Fütterungsversuch 2. Woche (Entgiftung) M4 Mytilus edulis, HP Fütterungsversuch 1. Woche M5 Cardium edule, Rest Fütterungsversuch 6.Woche M6 Cardium edule, HP Inkubationsversuch M7 Crassostrea gigas, HP Fütterungsversuch 2.Woche M8 Modiolus modiolus, MG Inkubationsversuch M9 Pecten maximus, HP schottische Ostküste M10 Pecten maximus, HP schottische Ostküste M11 Cardium edule, HP Fütterungsversuch 2. Woche (Entgiftung) M12 Pecten maximus, HP schottische Ostküste A1 Alexandrium fundyense (CCMP1719) Fütterungsversuch A2 Alexandrium lusitanicum (AL8T) Dr. A. Beran, Laboratorio di Biologia,
Trieste, Italien A3 Alexandrium lusitanicum (AL1V) Dr. A. Beran, Italien A4 Alexandrium lusitanicum (AL5T) Dr. A. Beran, Italien A5 Alexandrium lusitanicum (AL9T) Dr. A. Beran, Italien A6 Gymnodinium catenatum (M34Y) Dr. J. Guzman, CIBNOR, Mexiko A7 Alexandrium fundyense (CCMP1719) Inkubationsversuch
V Anhang 118
Tab. 17: Einzelergebnisse des Vergleichs zwischen der optimierten Thielert- und der neu entwickelten HPLC-Methode (in ng/µL Probenextrakt)
M1 STX Neo GTX2 GTX3 GTX1 GTX4 dcGTX2/3 Gesamt mod. Thielert
0.162 0.165 0.164
0.609 0.626 0.618
0.297 0.301 0.299
0.167 0.168 0.168
1.056 1.030 1.043
0.673 0.727 0.700
0.029 0.028 0.029
2.993 3.045 3.019
neu entw. Methode
0.154 0.158 0.156
0.605 0.622 0.614
0.332 0.307 0.320
0.194 0.159 0.177
1.043 1.099 1.071
0.908 0.931 0.920
0.024 0.025 0.025
3.260 3.301 3.280
M2 STX Neo GTX2 GTX3 GTX1 GTX4 dcGTX2/3 Gesamt mod. Thielert
0.092 0.096 0.094
0.477 0.477 0.477
0.213 0.213 0.213
0.096 0.097 0.097
1.026 0.987 1.007
0.888 0.736 0.812
0.060 0.057 0.059
2.852 2.663 2.758
neu entw. Methode
0.093 0.089 0.091
0.471 0.469 0.470
0.232 0.229 0.231
0.112 0.101 0.107
1.016 0.994 1.005
1.004 0.983 0.994
0.022 0.026 0.024
2.950 2.891 2.921
M3 STX Neo GTX2 GTX3 GTX1 GTX4 dcGTX2/3 Gesamt mod. Thielert
0.097 0.095 0.096
0.157 0.153 0.155
0.238 0.229 0.234
0.081 0.078 0.080
0.468 0.372 0.420
0.448 0.504 0.476
0.027 0.030 0.029
1.516 1.461 1.489
neu entw. Methode
0.090 0.089 0.090
0.137 0.132 0.135
0.252 0.306 0.279
0.098 0.103 0.101
0.423 0.413 0.418
0.479 0.449 0.464
0.034 0.029 0.032
1.513 1.521 1.517
M4 STX Neo GTX2 GTX3 GTX1 GTX4 dcGTX2/3 Gesamt mod. Thielert
0.019 0.019 0.019
0.101 0.100 0.101
0.049 0.046 0.048
0.038 0.037 0.038
0.174 0.157 0.166
0.461 0.426 0.444
0,008 0,010 0.009
0.850 0.795 0.823
neu entw. Methode
0.020 0.018 0.019
0.092 0.070 0.081
0.042 0.057 0.050
0.047 0.055 0.051
0.153 0.186 0.170
0.172 0.178 0.175
0,010 0,016 0.013
0.536 0.580 0.558
M5 STX Neo GTX2 GTX3 GTX1 GTX4 dcGTX2/3 Gesamt mod. Thielert
0.027 0.028 0.028
0.180 0.193 0.187
0.088 0.088 0.088
0.063 0.065 0.064
0.218 0.212 0.215
0.410 0.496 0.453
0,012 0,010
0.0011
0.998 1.092 1.045
neu entw. Methode
0.026 0.022 0.024
0.182 0.137 0.160
0.088 0.074 0.081
0.058 0.045 0.052
0.278 0.256 0.267
0.718 0.464 0.591
0,005 0,023 0.014
1.355 1.021 1.188
M6 STX Neo GTX2 GTX3 GTX1 GTX4 dcGTX2/3 Gesamt mod. Thielert
0.020 0.020 0.020
0.722 0.747 0.735
0.060 0.061 0.061
0.022 0.020 0.021
1.084 1.152 1.118
0.648 0.660 0.654
0.128 0.124 0.126
2.684 2.784 2.734
neu entw. Methode
0.018 0.018 0.018
0.734 0.854 0.794
0.070 0.074 0.073
0.025 0.025 0.025
1.323 1.497 1.410
n.n.q. 1.241 1.241
n.n.q. 0.160 0.160
2.170 3.869 3.020
V Anhang 119
M7 STX Neo GTX2 GTX3 GTX1 GTX4 dcGTX2/3 Gesamt mod. Thielert
0.050 0.051 0.051
0.119 0.102 0.111
0.053 0.052 0.053
0.051 0.050 0.051
0.165 0.151 0.158
0.136 0.125 0.131
0.010 0.010 0.010
0.584 0.541 0.563
neu entw. Methode
0.047 0.050 0.049
0.125 0.125 0.125
0.050 0.063 0.057
0.065 0.074 0.070
0.151 0.163 0.157
0.210 0.212 0.211
n.n.q. 0.011 0.011
0.648 0.698 0.673
M8 STX Neo GTX2 GTX3 GTX1 GTX4 dcGTX2/3 Gesamt mod. Thielert
0.016 0.016 0.016
0.805 0.806 0.806
0.048 0.044 0.046
0.010 0.011 0.011
1.329 1.323 1.326
0.548 0.536 0.542
0.284 0.286 0.285
3.040 3.022 3.031
neu entw. Methode
0.014 0.014 0.014
0.784 0.795 0.790
0.055 n.n.q. 0.055
0.013 0.009 0.011
1.477 1.388 1.433
0.513 0.575 0.544
n.n.q. 0.218 0.218
2.856 2.999 2.928
M9 STX Neo GTX2 GTX3 GTX1 GTX4 dcGTX2/3 Gesamt mod. Thielert
0.116 0.113 0.115
n.n.q.
0.125 0.122 0.124
0.071 0.072 0.072
0 0
0.000
0 0
0.000
0.013 0.009 0.011
0.325 0.316 0.321
neu entw. Methode
0.118 0.119 0.119
0 0
0.000
0.145 0.180 0.163
0.074 0.071 0.073
0 0
0.000
0 0
0.000
0 0
0.000
0.337 0.370 0.354
M10 STX Neo GTX2 GTX3 GTX1 GTX4 dcGTX2/3 Gesamt mod. Thielert
0.148 0.146 0.147
n.n.q.
0.147 0.142 0.145
0.094 0.092 0.093
0.106 0.110 0.108
0.115 0.097 0.106
0.015 0.037 0.026
0.625 0.624 0.625
neu entw. Methode
0.147 0.163 0.155
n.n.q.
0.169 0.196 0.183
0.107 0.113 0.110
0.232 0.257 0.245
0.109 0.118 0.114
n.n.q.
0.764 0.847 0.806
M11 STX Neo GTX2 GTX3 GTX1 GTX4 dcGTX2/3 Gesamt mod. Thielert
0.019 0.020 0.020
0 0
0.000
0.055 0.056 0.056
0.031 0.031 0.031
0.079 n.n.q. 0.079
0.086 n.n.q. 0.086
0 0
0.000
0.270 0.107 0.189
neu entw. Methode
0.019 0.016 0.018
0 0
0.000
0.052 0.052 0.052
0.028 0.029 0.029
0.089 0.078 0.084
0.100 0.066 0.083
0 0
0.000
0.288 0.241 0.265
M12 STX Neo GTX2 GTX3 GTX1 GTX4 dcGTX2/3 Gesamt mod. Thielert
0.135 0.131 0.133
0.035 0.041 0.038
0.021 0.022 0.022
0.015 0.015 0.015
0.413 0.369 0.391
0.238 0.286 0.262
0.014 0.024 0.019
0.871 0.888 0.880
neu entw. Methode
0.226 0.224 0.225
0.079 0.081 0.080
0.023 0.011 0.017
0.010 0.021 0.016
0.289 0.344 0.317
n.n.q.
n.n.q.
0.627 0.681 0.654
A1 STX Neo GTX2 GTX3 GTX1 GTX4 dcGTX2/3 Gesamt mod. Thielert
0 0
0.000
0.227 0.226 0.227
0.005 0.006 0.006
0.026 0.024 0.025
0.090 0.092 0.091
0.615 0.582 0.599
0.016 0.017 0.017
0.979 0.947 0.963
V Anhang 120
neu entw. Methode
0 0
0.000
0.226 0.192 0.209
0.005 0.005 0.005
0.024 0.021 0.023
0.107 0.097 0.102
0.620 0.590 0.605
0.020 n.n.q. 0.020
1.002 0.905 0.954
A2 STX Neo GTX2 GTX3 GTX1 GTX4 dcGTX2/3 Gesamt mod. Thielert
0 0
0.000
0 0
0.000
0.232 0.230 0.231
0.087 0.083 0.085
0.096 0.079 0.088
0.072 0.079 0.076
0 0
0.000
0.487 0.471 0.479
neu entw. Methode
0 0
0.000
0 0
0.000
0.235 0.227 0.231
0.089 0.083 0.086
0.102 0.092 0.097
0.092 0.105 0.099
0 0
0.000
0.518 0.507 0.513
A3 STX Neo GTX2 GTX3 GTX1 GTX4 dcGTX2/3 Gesamt mod. Thielert
0 0
0.000
0 0
0.000
0.614 0.583 0.599
0.234 0.222 0.228
1.589 1.520 1.555
1.062 0.937 1.000
0.015 0.016 0.016
3.514 3.278 3.396
neu entw. Methode
0 0
0.000
0 0
0.000
0.605 0.586 0.596
0.258 0.248 0.253
1.591 1.530 1.561
1.090 1.049 1.070
0 0
0.000
3.544 3.413 3.479
A4 STX Neo GTX2 GTX3 GTX1 GTX4 dcGTX2/3 Gesamt mod. Thielert
0 0
0.000
0 0
0.000
0.239 0.228 0.234
0.084 0.081 0.083
0.077 n.n.q. 0.077
n.n.q.
0 0
0.000
0.400 0.309 0.355
neu entw. Methode
0 0
0.000
0 0
0.000
0.229 0.212 0.221
0.086 0.082 0.084
0.081 n.n.q. 0.081
n.n.q.
0 0
0.000
0.396 0.294 0.345
A5 STX Neo GTX2 GTX3 GTX1 GTX4 dcGTX2/3 Gesamt mod. Thielert
0 0
0.000
0 0
0.000
0.032 0.034 0.033
0.021 0.026 0.024
0 0
0.000
0 0
0.000
0 0
0.000
0.053 0.060 0.057
neu entw. Methode
0 0
0.000
0 0
0.000
0.048 0.029 0.039
0.026 0.021 0.024
0 0
0.000
0 0
0.000
0 0
0.000
0.074 0.050 0.062
A6 STX Neo GTX2 GTX3 GTX1 GTX4 dcGTX2/3 Gesamt mod. Thielert
0.013 0.016 0.015
0 0
0.000
0 0
0.000
0 0
0.000
0 0
0.000
0 0
0.000
0.487 0.481 0.484
0.500 0.497 0.499
neu entw. Methode
0.014 0.013 0.014
0 0
0.000
0 0
0.000
0 0
0.000
0 0
0.000
0 0
0.000
0.326 0.307 0.317
0.340 0.320 0.330
A7 STX Neo GTX2 GTX3 GTX1 GTX4 dcGTX2/3 Gesamt mod. Thielert
0.006 0.006 0.006
1.729 1.735 1.732
0.005 0.005 0.005
0.083 0.068 0.076
0.354 0.352 0.353
6.142 5.918 6.030
0.021 0.004 0.013
8.340 8.088 8.214
neu entw. Methode
0.009 0.002 0.006
1.653 1.648 1.651
0.006 0.009 0.008
0.076 0.073 0.075
0.387 0.334 0.361
6.990 6.650 6.775
0.003 0.005 0.004
9.124 8.721 8.923
n.n.q. = nachweisbar, nicht quantifizierbar
V Anhang 121
6. Fütterungsversuch (Kapitel 6.2)
Untersuchte Muschel- und Schneckenarten:
Trivialname Lateinischer Name Größe (MW ± SD) Gewicht (MW ± SD)
Miesmuschel Mytilus edulis (6,3 ± 0,3) cm (7,4 ± 0,9) g n = 42
Pazifische Auster Crassostrea gigas (9,2 ± 0,6) cm (6,0 ± 1,6) g n = 42
Herzmuschel Cardium edule (2,1 ± 0,2) cm (0,5 ± 0,2) g n = 39
Strandschnecke Littorina littorea (2,6 ± 0,3) cm (1,2 ± 0,4) g n = 39
Zellzahlbestimmung von der Alexandrium fundyense-Kultur:
- Kulturprobe (10 mL) mit 2 bis 3 Tropfen Lugol´scher Lösung fixieren
- 3 mL der fixierten Kulturprobe in Sedimentationskammern (Uthermöhl-Kammern)
pipettieren und mit einem Deckglas abdecken
- 2 Stunden absedimentieren lassen
- Zählung mit Hilfe eines Invers-Mikroskopes (Axiovert 135 von Zeiss) bei einer
Vergrößerung von 10^10
- Für statistische Auswertung müssen mindestens 50 Individuen gezählt werden, hierfür
gibt es zwei Methoden:
1. Bei geringer Individuenzahl wird der ganze Boden ausgezählt.
2. Bei hoher Individuenzahl werden lediglich 1- 4 Streifen ausgezählt bis die 50
Individuen gezählt wurden. Das Ergebnis wird dann auf 3 mL hochgerechnet.
PSP-Bestimmung von der Alexandrium fundyense-Kultur:
10 mL der Kulturprobe wurden auf Filterpapier (Membranfilter, Fa. Waterman) aufgebracht und
nach 4. aufgearbeitet.
V Anhang 122
Tab. 18: Gesamt-PSP-Gehalte und Gesamttoxizitäten der im Fütterungsversuch verwende- ten Mollusken (in µg/100g Gewebe)
* 6. Woche: Mittelwerte von n=5
Tab. 19: PSP-Gehalte und Toxizitäten der Verdauungsgewebe der im Fütterungsversuch verwendeten Mollusken (in µg/100g Gewebe)
* Mittelwerte
Tab. 20: PSP-Gehalte und Toxizitäten der Reste der im Fütterungsversuch verwendeten Mollusken (in µg/100g Gewebe)
* Mittelwerte
M. edulis C. gigas C. edule L. littoreaPSP STXeq PSP STXeq PSP STXeq PSP STXeq
1.Wo 67,026 34,095 64,256 37,791 171,045 109,403 36,161 29,9112.Wo 159,131 87,269 70,599 39,843 184,000 113,625 17,500 11,1213.Wo 70,000 46,581 91,243 62,767 308,077 171,731 61,987 51,2184.Wo 143,459 83,183 99,937 69,877 571,395 309,535 7,568 2,0545.Wo 127,910 70,966 102,430 62,772 636,066 333,529 73,190 59,5096.Wo* 263,363 147,488 140,208 77,369 1065,747 530,160 46,361 19,5312.Wo (E) 77,569 35,412 45,706 24,859 177,308 83,846 35,949 24,5574.Wo (E) 58,023 28,686 20,860 8,001 187,813 95,313 17,935 12,6096.Wo (E) 17,687 7,540 12,451 5,597 90,000 31,304 9,605 2,8958.Wo (E) 11,162 4,326 4,936 1,838
M. edulis C. gigas C. edule L. littoreaPSP STXeq PSP STXeq PSP STXeq PSP STXeq
1.Wo 203,00 105,00 141,00 90,00 734,00 469,00 81,00 67,002.Wo 690,00 378,00 249,00 139,00 729,00 443,00 32,00 20,003.Wo 217,00 144,00 225,00 151,00 973,00 547,00 146,00 121,004.Wo 436,00 257,00 213,00 139,00 2554,00 1339,00 19,00 5,005.Wo 584,00 333,00 220,40 146,00 2127,75 1076,00 171,00 138,506.Wo* 1354,80 801,80 445,20 264,40 4481,75 2169,00 132,80 56,202.Wo (E) 441,00 216,00 165,00 112,00 806,00 328,00 105,00 72,004.Wo (E) 313,00 171,00 92,00 40,00 442,00 226,00 47,00 33,006.Wo (E) 44,00 21,00 57,00 30,00 193,00 41,00 26,00 7,008.Wo (E) 21,00 9,00 13,00 5,00
M. edulis C. gigas C. edule L. littoreaPSP STXeq PSP STXeq PSP STXeq PSP STXeq
1.Wo 36,00 20,00 28,00 13,00 54,00 36,00 0,00 0,002.Wo 102,00 62,00 33,00 18,00 81,00 57,00 1,00 1,003.Wo 77,00 53,00 59,00 41,00 108,00 75,00 1,00 0,004.Wo 103,00 60,00 80,00 59,00 120,00 77,00 3,00 1,005.Wo 91,50 59,25 63,20 41,00 155,50 102,00 27,25 21,506.Wo* 185,80 92,00 122,80 53,20 317,75 195,25 6,80 2,402.Wo (E) 44,00 19,00 25,00 8,00 32,00 16,00 0,00 0,004.Wo (E) 54,00 22,00 17,00 5,00 64,00 35,00 0,00 0,006.Wo (E) 27,00 12,00 6,00 2,00 90,00 35,00 0,00 0,008.Wo (E) 18,00 7,00 6,00 2,00
V Anhang 123
Tab. 21: PSP-Gehalte und Toxizitäten der Kiemen der im Fütterungsversuch verwendeten Mollusken (in µg/100g Gewebe)
* Mittelwerte
Tab. 22: PSP-Gehalte und Toxizitäten der Mantelgewebe der im Fütterungsversuch verwendeten Mollusken (in µg/100g Gewebe)
* Mittelwerte ** Messungen mit Fehlern behaftet, nicht genügend Probenmaterial für weitere Analysen vorhanden
Tab. 23: PSP-Gehalte und Toxizitäten der Gonaden der im Fütterungsversuch verwendeten Mollusken (in µg/100g Gewebe)
* Mittelwerte
M. edulis C. gigasPSP STXeq PSP STXeq
1.Wo 11,00 4,00 20,00 7,002.Wo 46,00 28,00 29,00 18,003.Wo 52,00 38,00 67,00 50,004.Wo 56,00 34,00 86,00 68,005.Wo 56,75 36,00 48,60 30,406.Wo* 109,00 61,40 68,40 37,202.Wo (E) 19,00 10,00 24,00 8,004.Wo (E) 23,00 8,00 11,00 2,006.Wo (E) 10,00 6,00 7,00 2,008.Wo (E) 5,00 2,00 4,00 1,00
M. edulis C. gigasPSP STXeq PSP STXeq
1.Wo 20,00 13,00 31,00 18,002.Wo 47,00 27,00 24,00 15,003.Wo 45,00 29,00 51,00 38,004.Wo 52,00 28,00 60,00 41,005.Wo 49,25 27,75 57,60 34,406.Wo* 110,20 52,80 53,00 25,002.Wo (E) 23,00 10,00 24,00 8,004.Wo (E) 25,00 13,00 8,00 2,006.Wo (E) 7,00 2,00 6,00 1,008.Wo (E) ** ** 3,00 1,00
M. edulis C. gigasPSP STXeq PSP STXeq
1.Wo 7,00 2,00 24,00 11,002.Wo 42,00 22,00 22,00 14,003.Wo 28,00 17,00 45,00 28,004.Wo 46,00 24,00 53,00 27,005.Wo 31,25 19,75 63,20 40,006.Wo* 103,80 54,80 45,40 20,002.Wo (E) 26,00 7,00 17,00 8,004.Wo (E) 32,00 16,00 16,00 8,006.Wo (E) 12,00 4,00 8,00 3,008.Wo (E) 11,00 4,00 4,00 1,00
V Anhang 124
Tab. 24: PSP-Gehalte und Toxizitäten der Adduktoren der im Fütterungsversuch verwendeten Mollusken (in µg/100g Gewebe)
* Mittelwerte
Tab. 25: PSP-Gehalte und Toxizitäten der Fußgewebe der im Fütterungsversuch verwendeten Mollusken (in µg/100g Gewebe)
* Messungen der 8. Wo (E) mit Fehlern behaftet, nicht genügend Probenmaterial für weitere Analysen vorhanden ** Mittelwerte
Tab. 26: Prozentuale Anteile der einzelnen PSP-Toxine im Hepatopankreas von M. edulis (in Masse%)
* Mittelwerte
M. edulis C. gigasPSP STXeq PSP STXeq
1.Wo 7,00 2,00 17,00 8,002.Wo 14,00 1,00 6,00 0,003.Wo 32,00 20,00 27,00 15,004.Wo 39,00 22,00 28,00 15,005.Wo 36,75 22,50 27,00 14,406.Wo* 66,60 30,60 43,20 18,402.Wo (E) 15,00 6,00 10,00 2,004.Wo (E) 15,00 7,00 5,00 1,006.Wo (E) 5,00 1,00 3,00 1,008.Wo (E) 4,00 1,00 2,00 1,00
M. edulis * C. edule L. littoreaPSP STXeq PSP STXeq PSP STXeq
1.Wo 6,00 2,00 22,00 8,00 0,00 0,002.Wo 11,00 2,00 26,00 10,00 0,00 0,003.Wo 21,00 13,00 42,00 17,00 0,00 0,004.Wo 25,00 13,00 90,00 46,00 0,00 0,005.Wo 44,60 28,00 132,50 71,50 0,00 0,006.Wo** 56,40 26,20 219,25 63,75 0,00 0,002.Wo (E) 15,00 6,00 14,00 4,00 0,00 0,004.Wo (E) 12,00 3,00 32,00 5,00 0,00 0,006.Wo (E) 6,00 3,00 38,00 2,00 0,00 0,00
STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C21.Wo 1,85 10,76 2,54 4,17 6,88 27,41 2,92 6,37 14,47 22,632.Wo 1,60 10,88 1,82 3,68 9,44 29,99 3,52 4,33 16,64 18,103.Wo 2,57 16,87 3,35 0,74 8,14 35,62 3,93 4,01 11,33 13,444.Wo 2,95 8,56 0,45 1,04 23,02 20,11 6,25 5,14 16,03 16,455.Wo 3,47 10,28 0,62 1,02 21,83 20,91 5,21 4,66 14,45 17,556.Wo* 2,28 8,33 0,54 4,07 11,29 35,79 4,46 3,13 17,06 13,042.Wo (E) 4,78 9,32 1,36 3,74 15,79 10,64 11,68 4,95 27,63 10,114.Wo (E) 7,42 5,86 2,37 3,82 11,74 20,43 15,07 4,70 21,94 6,656.Wo (E) 9,15 13,55 6,93 1,96 5,47 6,28 15,15 4,48 28,77 8,268.Wo (E) 23,23 0 0 0 0 0 29,34 8,42 36,62 2,39
V Anhang 125
Tab. 27: Prozentuale Anteile der einzelnen PSP-Toxine im Rest von M. edulis (in Masse%)
* Mittelwerte
Tab. 28: Prozentuale Anteile der einzelnen PSP-Toxine in den Kiemen von M. edulis (in Masse%)
* Mittelwerte
Tab. 29: Prozentuale Anteile der einzelnen PSP-Toxine im Mantel von M. edulis (in Masse%)
* Mittelwerte
STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C21.Wo 1,40 11,70 0,00 0,79 13,70 24,74 2,16 6,80 10,59 28,122.Wo 0,86 8,56 0,00 3,00 18,22 32,49 1,60 4,54 8,28 22,453.Wo 1,14 5,47 0,00 0,84 32,47 32,33 1,67 2,93 9,46 13,694.Wo 1,35 6,42 0,27 3,92 18,03 31,84 2,79 3,34 14,83 17,215.Wo 1,66 12,32 1,73 0,28 20,00 31,23 1,92 2,43 10,78 17,656.Wo* 2,14 11,71 0,17 1,40 13,34 19,42 3,52 3,32 17,86 27,122.Wo (E) 7,71 18,67 4,58 2,15 0,00 0,00 15,15 8,16 33,56 10,024.Wo (E) 9,20 17,12 3,13 0,89 0,00 0,00 15,46 6,46 29,37 18,376.Wo (E) 11,46 15,26 3,69 1,42 0,00 0,00 17,10 7,42 29,74 13,918.Wo (E) 19,64 0,00 0,00 2,32 0,00 0,00 19,52 9,38 35,73 13,41
STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C21.Wo 1,82 8,84 0,00 0,00 21,19 31,40 2,96 4,90 7,79 21,102.Wo 0,15 1,91 0,00 1,82 31,18 24,53 1,22 4,68 10,64 23,873.Wo 0,38 11,19 0,00 0,58 14,82 39,27 1,27 2,75 11,84 17,904.Wo 0,84 9,79 0,00 0,00 16,15 23,54 2,92 6,14 14,16 26,465.Wo 1,51 16,94 0,31 2,15 13,25 25,16 1,05 2,46 13,33 23,846.Wo* 0,95 14,69 0,51 1,28 9,04 21,74 1,65 2,40 17,32 30,422.Wo (E) 4,84 25,45 5,79 0,00 0,00 0,00 8,14 5,67 23,95 26,164.Wo (E) 2,71 8,74 0,81 4,37 14,46 27,22 2,40 1,93 23,55 13,816.Wo (E) 15,66 0,00 3,92 4,19 0,00 0,00 19,44 8,53 33,99 14,27
STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C21.Wo 2,10 23,95 0,00 0,00 0,00 0,00 2,10 10,40 20,63 40,822.Wo 0,73 19,08 0,00 0,00 23,30 14,88 0,71 4,95 11,49 24,863.Wo 0,66 14,72 0,00 0,00 8,91 43,95 1,03 2,86 10,80 17,074.Wo 1,16 16,89 1,45 0,80 7,22 35,61 1,40 3,15 10,27 22,055.Wo 1,37 15,33 0,77 2,16 21,62 23,85 1,35 2,59 11,42 19,546.Wo* 1,25 15,45 0,56 0,46 9,57 30,85 1,56 2,76 11,17 26,362.Wo (E) 5,45 33,90 3,27 0,00 0,00 0,00 9,42 6,65 17,13 24,184.Wo (E) 6,51 14,30 4,16 2,03 0,00 0,00 12,27 6,39 28,93 25,416.Wo (E) 12,86 26,71 3,60 0,00 0,00 0,00 15,47 9,17 20,14 12,058.Wo (E) 19,60 0,00 1,42 0,00 0,00 0,00 23,61 17,17 31,19 7,01
V Anhang 126
Tab. 30: Prozentuale Anteile der einzelnen PSP-Toxine in den Gonaden von M. edulis (in Masse%)
* Mittelwerte
Tab. 31: Prozentuale Anteile der einzelnen PSP-Toxine in den Adduktoren von M. edulis (in Masse%)
* Mittelwerte
Tab. 32: Prozentuale Anteile der einzelnen PSP-Toxine im Fuß von M. edulis (in Masse%)
* Mittelwerte
STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C21.Wo 1,38 19,72 0,00 0,00 0,00 0,00 8,28 10,76 14,76 45,102.Wo 0,45 8,61 0,00 0,00 20,26 22,52 0,94 4,47 16,21 26,543.Wo 0,34 12,86 0,00 0,68 9,24 37,07 1,35 2,84 11,75 23,874.Wo 0,59 10,84 0,00 0,00 13,17 28,56 1,00 2,37 18,38 25,095.Wo 2,37 21,58 1,58 1,26 7,91 13,57 1,85 3,60 18,21 28,076.Wo* 0,85 11,63 0,49 0,72 16,08 23,53 1,91 2,35 16,65 25,802.Wo (E) 2,45 16,64 3,71 1,71 0,00 0,00 5,65 4,38 31,95 33,514.Wo (E) 4,12 7,06 2,40 1,85 15,24 21,92 4,50 2,07 24,64 16,206.Wo (E) 12,67 0,00 5,85 0,00 0,00 0,00 21,82 9,14 34,80 15,728.Wo (E) 14,78 0,00 7,36 0,00 0,00 0,00 20,26 6,88 34,00 16,72
STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C21.Wo 1,05 17,47 0,00 0,00 0,00 0,00 4,60 11,83 24,18 40,872.Wo 0,00 0,00 0,00 1,37 0,00 0,00 3,81 9,00 37,65 48,173.Wo 0,28 9,01 0,00 0,57 28,01 28,39 1,39 2,27 13,05 17,034.Wo 0,75 11,62 0,00 2,48 18,15 25,97 1,76 2,28 16,71 20,285.Wo 1,49 18,97 0,44 0,92 9,95 29,66 1,54 2,10 12,54 22,396.Wo* 1,17 16,70 0,36 0,54 11,00 16,01 2,27 2,44 20,03 29,492.Wo (E) 3,92 20,22 0,00 1,63 0,00 0,00 9,23 9,96 33,01 22,034.Wo (E) 5,14 28,47 6,83 0,00 0,00 0,00 10,46 6,17 26,18 16,756.Wo (E) 14,97 0,00 6,24 0,00 0,00 0,00 17,46 5,20 31,39 24,748.Wo (E) 15,01 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 17,15 8,58 39,18 20,08
STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C21.Wo 1,61 19,35 0,00 0,00 0,00 0,00 5,32 13,55 18,87 41,302.Wo 0,57 7,31 0,00 0,00 0,00 0,00 1,97 8,95 28,82 52,383.Wo 0,35 12,25 0,00 2,71 25,06 22,31 1,68 3,22 10,32 22,104.Wo 1,34 23,24 0,00 0,38 9,73 12,19 2,44 2,90 23,09 24,695.Wo 1,62 17,20 0,35 2,70 5,43 20,85 2,52 2,33 18,13 28,876.Wo* 1,09 11,97 0,00 4,68 4,22 11,27 1,89 1,32 26,83 36,732.Wo (E) 7,32 17,35 6,14 0,00 0,00 0,00 11,39 6,61 24,66 26,534.Wo (E) 10,77 0,00 5,80 2,87 0,00 0,00 16,36 8,53 33,64 22,036.Wo (E) 21,99 0,00 12,16 0,00 0,00 0,00 18,44 11,07 26,09 10,25
V Anhang 127
Tab. 33: Prozentuale Anteile der einzelnen PSP-Toxine im Hepatopankreas von C. gigas (in Masse%)
* Mittelwerte
Tab. 34: Prozentuale Anteile der einzelnen PSP-Toxine im Rest von C. gigas (in Masse%)
* Mittelwerte
Tab. 35: Prozentuale Anteile der einzelnen PSP-Toxine in den Kiemen von C. gigas (in Masse%)
* Mittelwerte
STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C21.Wo 1,11 12,14 0,00 2,65 7,29 42,87 1,64 4,31 9,79 18,202.Wo 4,51 11,08 3,55 6,51 7,85 27,00 3,15 6,42 11,07 18,863.Wo 2,64 16,82 2,81 0,69 11,64 33,21 3,69 3,94 10,02 14,544.Wo 4,21 15,05 0,71 1,61 23,01 22,16 5,62 3,61 12,55 11,475.Wo 3,79 14,25 0,79 1,21 27,45 18,53 5,22 4,04 14,18 10,546.Wo* 3,36 13,69 2,38 1,35 18,22 25,68 4,19 3,57 15,31 12,262.Wo (E) 5,02 7,52 4,00 2,09 43,08 11,08 6,78 2,61 13,50 4,324.Wo (E) 7,62 6,07 9,97 5,84 7,94 11,62 13,11 2,95 28,36 6,526.Wo (E) 7,02 4,33 8,35 2,30 12,03 23,10 12,06 2,14 22,85 5,828.Wo (E) 16,22 0,00 0,00 2,87 0,00 0,00 28,14 8,30 34,36 10,11
STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C21.Wo 0,90 8,97 0,03 3,99 15,55 26,49 1,58 5,84 9,10 27,552.Wo 0,74 9,85 4,49 2,61 19,19 24,14 1,16 3,22 8,73 25,873.Wo 0,56 8,49 0,00 0,93 13,22 49,42 2,10 2,97 7,51 14,804.Wo 1,44 14,46 0,00 0,56 20,15 39,41 3,40 2,52 7,42 10,645.Wo 6,29 11,84 2,34 2,20 21,31 18,12 4,42 4,49 11,82 17,176.Wo* 1,38 13,73 0,56 1,14 10,07 17,42 2,32 3,40 17,87 32,122.Wo (E) 6,40 15,19 4,28 2,87 0,00 0,00 8,56 4,62 30,19 27,894.Wo (E) 12,14 0,00 1,66 3,53 0,00 0,00 19,65 8,66 38,30 16,066.Wo (E) 16,53 0,00 0,00 8,03 0,00 0,00 23,92 0,00 34,99 16,538.Wo (E) 15,62 0,00 0,00 2,46 0,00 0,00 14,51 0,00 40,47 26,94
STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C21.Wo 0,00 25,59 0,09 0,00 0,00 0,00 0,00 10,85 20,14 43,332.Wo 0,52 11,22 6,17 0,00 24,38 27,47 0,52 2,82 5,16 21,743.Wo 2,23 10,65 3,73 0,00 9,58 55,29 1,10 1,64 6,81 8,974.Wo 0,82 10,06 2,81 0,00 9,32 62,95 1,21 1,68 3,60 7,555.Wo 2,02 10,19 3,94 1,65 25,45 24,59 2,36 3,29 11,61 14,906.Wo* 1,68 15,35 0,56 0,87 7,74 21,04 1,91 2,58 16,63 31,642.Wo (E) 3,93 19,16 0,00 0,00 0,00 0,00 5,24 4,01 31,27 36,394.Wo (E) 8,80 0,00 0,91 0,00 0,00 0,00 16,06 5,81 41,56 26,866.Wo (E) 8,45 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 26,00 8,85 39,00 17,708.Wo (E) 16,66 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 15,04 0,00 55,14 13,16
V Anhang 128
Tab. 36: Prozentuale Anteile der einzelnen PSP-Toxine im Mantel von C. gigas (in Masse%)
* Mittelwerte
Tab. 37: Prozentuale Anteile der einzelnen PSP-Toxine in den Gonaden von C. gigas (in Masse%)
* Mittelwerte Tab. 38: Prozentuale Anteile der einzelnen PSP-Toxine im Adduktor von C. gigas
(in Masse%)
* Mittelwerte
STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C21.Wo 0,60 14,12 0,06 0,00 21,96 21,54 1,07 5,04 12,19 23,422.Wo 1,06 11,99 0,00 0,00 20,62 25,00 0,34 4,51 8,33 28,153.Wo 1,07 21,57 1,20 0,00 10,42 40,29 1,18 2,64 8,03 13,604.Wo 1,01 17,45 1,32 0,00 8,81 42,51 1,11 2,14 7,53 18,125.Wo 1,93 11,14 1,53 0,58 14,05 29,55 2,02 3,36 15,04 20,806.Wo* 1,09 14,64 0,50 0,43 9,11 20,72 1,29 1,84 16,97 33,412.Wo (E) 4,11 20,51 0,00 0,00 0,00 0,00 6,67 5,85 29,32 33,544.Wo (E) 9,49 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 18,65 8,83 40,95 22,086.Wo (E) 6,98 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 21,12 4,10 44,51 23,298.Wo (E) 18,48 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 29,06 9,85 35,22 7,39
STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C21.Wo 0,00 31,93 0,09 0,00 0,00 0,00 3,22 7,98 9,57 47,212.Wo 0,39 13,18 1,72 0,00 24,13 25,55 0,99 3,42 6,96 23,663.Wo 0,85 7,80 0,00 3,03 23,28 32,02 1,44 2,56 8,76 20,264.Wo 1,37 12,75 0,00 0,19 18,27 31,92 1,62 2,71 14,10 17,075.Wo 2,83 10,83 0,96 0,42 13,87 31,22 2,68 3,40 13,29 20,506.Wo* 1,47 16,50 0,11 0,75 6,65 13,90 2,30 3,28 19,22 35,822.Wo (E) 4,11 34,34 8,44 0,00 0,00 0,00 8,61 3,59 20,09 20,824.Wo (E) 8,41 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 17,54 11,45 52,86 9,746.Wo (E) 17,38 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 35,01 0,00 36,96 10,658.Wo (E) 18,18 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 15,31 9,09 50,96 6,46
STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C21.Wo 0,00 27,71 2,11 0,00 0,00 0,00 3,61 8,02 19,70 38,852.Wo 2,23 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 5,21 34,82 57,743.Wo 0,66 10,13 0,00 0,00 11,64 33,25 2,24 3,07 17,08 21,934.Wo 1,57 9,10 0,00 0,31 26,82 17,54 1,85 2,38 20,26 20,175.Wo 2,87 17,25 0,20 2,26 8,62 19,97 3,41 3,59 18,92 22,916.Wo* 1,37 13,82 0,00 0,15 5,96 11,18 2,46 2,87 28,15 34,062.Wo (E) 8,80 0,00 0,00 8,14 0,00 0,00 11,99 2,25 33,71 35,114.Wo (E) 12,33 0,00 0,00 9,42 0,00 0,00 10,27 0,00 40,41 27,576.Wo (E) 17,99 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 82,01 0,008.Wo (E) 31,82 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 68,18 0,00
V Anhang 129
Tab. 39: Prozentuale Anteile der einzelnen PSP-Toxine im Hepatopankreas von C. edule (in Masse%)
* Mittelwerte
Tab. 40: Prozentuale Anteile der einzelnen PSP-Toxine im Rest von C. edule (in Masse%)
* Mittelwerte
Tab. 41: Prozentuale Anteile der einzelnen PSP-Toxine im Fuß von C. edule (in Masse%)
* Mittelwerte
STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C21.Wo 1,28 12,76 0,67 3,16 7,44 39,88 1,90 5,97 11,07 15,872.Wo 1,58 14,23 0,84 1,53 9,94 32,10 2,93 5,07 14,93 16,853.Wo 2,50 10,28 0,21 1,25 14,77 23,98 5,21 6,21 17,72 17,874.Wo 1,81 8,13 0,12 0,73 12,00 28,44 4,86 4,29 19,69 19,935.Wo 2,12 8,70 0,36 0,80 9,77 27,11 5,52 4,63 19,15 21,846.Wo* 1,68 9,90 0,50 1,80 9,30 23,95 4,24 4,14 21,12 23,372.Wo (E) 4,17 4,20 1,37 1,61 12,62 9,74 10,75 7,76 30,52 17,264.Wo (E) 2,34 2,77 2,12 1,94 12,14 22,46 13,43 4,64 28,72 9,446.Wo (E) 5,24 2,55 2,88 1,80 0,00 0,00 16,27 5,47 49,88 15,91
STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C21.Wo 1,39 21,45 0,18 0,00 12,91 20,35 3,98 12,80 6,22 20,722.Wo 2,28 20,03 1,41 0,75 16,20 27,37 3,73 5,94 8,62 13,673.Wo 4,33 26,66 1,34 0,26 8,39 21,66 5,52 7,40 9,01 15,434.Wo 4,43 15,49 0,93 1,93 13,19 26,80 5,43 5,22 11,00 15,585.Wo 4,91 13,32 0,75 2,84 14,41 28,90 4,66 5,50 9,85 14,866.Wo* 5,47 17,55 1,15 1,39 9,01 22,82 6,60 6,14 12,66 17,212.Wo (E) 9,11 20,78 3,67 1,92 0,00 0,00 8,14 11,40 25,90 19,084.Wo (E) 12,40 21,48 4,83 1,64 0,00 0,00 17,06 13,24 17,08 12,276.Wo (E) 11,79 12,36 4,48 8,27 0,00 0,00 13,41 7,78 26,31 15,60
STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C21.Wo 0,00 25,75 0,39 0,00 0,00 0,00 1,91 7,42 16,23 48,302.Wo 1,38 17,07 0,00 0,92 0,00 0,00 4,23 8,01 22,92 45,473.Wo 0,98 6,66 0,00 4,12 8,00 23,74 1,25 2,77 21,50 30,984.Wo 0,86 7,45 0,00 0,40 12,12 31,85 1,76 2,11 17,03 26,425.Wo 1,01 9,93 0,48 0,94 12,83 30,70 1,49 2,84 17,56 22,226.Wo* 0,38 4,40 0,96 0,32 7,62 14,77 2,63 3,48 19,12 46,322.Wo (E) 11,96 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 14,36 15,07 31,82 26,794.Wo (E) 7,79 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 11,93 2,90 46,89 30,496.Wo (E) 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 10,37 0,00 53,00 36,63
V Anhang 130
Tab. 42: Prozentuale Anteile der einzelnen PSP-Toxine im Verdauungsgewebe von L. littorea (in Masse%)
* Mittelwerte
Tab. 43: Prozentuale Anteile der einzelnen PSP-Toxine im Rest von L. littorea (in Masse%)
* Mittelwerte
7. Inkubationsversuch (Kapitel 6.3)
Gewinnung des konzentrierten Algenextraktes:
Die Kultivierung erfolgte im F/2 Medium in 4 x 10 L Glaskolben. Durch Zentrifugation wurden
die Algenzellen konzentriert und in 25 mL 0,03 N Essigsäure aufgenommen. Anschließend
wurden die Zellen auf Eis gekühlt mittels Ultraschall (Stab, 60 Watt, 1 min) aufgeschlossen und
der Extrakt bis zu seiner Verwendung bei –20°C tiefgefroren.
STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C21.Wo 1,16 0,00 1,01 0,00 56,75 27,88 4,77 3,36 0,29 4,782.Wo 1,66 1,28 12,62 5,84 12,85 44,39 6,09 3,06 6,56 5,653.Wo 1,09 0,00 2,38 0,19 76,45 10,75 2,58 1,80 2,34 2,424.Wo 6,00 0,00 18,88 7,79 0,00 0,00 16,86 13,96 21,77 14,745.Wo 4,47 0,00 1,31 3,35 62,29 10,93 4,26 3,39 4,34 5,666.Wo* 7,07 0,00 5,53 8,92 14,48 8,71 14,50 7,63 18,17 15,002.Wo (E) 4,56 0,00 3,78 6,30 33,98 26,62 10,66 4,73 5,97 3,404.Wo (E) 4,64 0,00 1,16 6,35 24,66 36,89 10,19 5,88 8,48 1,756.Wo (E) 6,85 0,00 0,40 18,75 0,00 0,00 23,11 10,37 25,56 14,96
STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C21.Wo 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,002.Wo 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 86,75 0,00 13,25 0,003.Wo 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 43,75 56,254.Wo 9,87 0,00 0,00 5,33 0,00 0,00 3,47 17,07 53,33 10,935.Wo 3,17 0,00 6,59 0,69 16,89 57,15 6,08 2,69 3,20 3,546.Wo* 8,24 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 33,57 15,11 21,65 21,422.Wo (E) 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,004.Wo (E) 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,006.Wo (E) 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
V Anhang 131
Verwendete Muschel- und Schneckenarten:
• Miesmuschel - Mytilus edulis • Pazifische Auster - Crassostrea gigas • Herzmuschel - Cardium edule • Wellhornschnecke - Buccinum undatum • Strandschnecke - Littorina littorea • Pferdemuschel - Modiolus modiolus • Trogmuschel - Mactra stultorum • Schwertmuschel - Ensis ensis • Islandmuschel - Arctica islandica • Jakobsmuschel - Pecten maximus
M. edulis, B. undatum, L. littorea, M. modiolus, M. stultorum, E. ensis und A. islandica wurden
vor der Küste Helgolands gesammelt.
C. gigas stammte aus einer Aquakultur aus Sylt.
C. edule wurde im Watt vor Wilhelmshaven gesammelt.
P. maximus stammte aus schottischen Küstengewässern.
Versuchsdurchführung:
Separieren, ca. 1-2 g Gewebe ↓ Zufügen von PBS-Puffer (Verhältnis 1:1 für Verdauungsgewebe, m:m Gewebe:Puffer) (Verhältnis 1:2 für Muskelgewebe, m:m Gewebe:Puffer) ↓ Homogenisieren, ca. 1 min ↓ Einwiegen, 1,8 mg Gewebe + 0,2 mg konz. Algenextrakt (= Verd. 1:10) ↓ Durchmischen ↓ T0 ¬ T48 Zentrifugieren ← 48 h bei 16°C inkubieren 15 min, 14000 rpm ↓ Filtrieren, 0,22 µm Nylonfilter ↓ Injektion in die HPLC-Apparatur und Hydrolyse ⇒ Die Proben wurden während der gesamten Vorbereitung auf Eis gekühlt.
V Anhang 132
Tab. 44: Gehalte der einzelnen PSP-Toxine im Verdauungsgewebe zu Beginn und am Ende der Inkubation (nmol Toxin/g Gewebe)
M. edulis VG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,025 5,293 0,095 0,545 1,068 15,438 0,022 0,209 2,788 8,444 33,927 T48 0,218 5,103 0,212 0,648 3,709 9,446 0,215 0,387 7,457 5,641 33,036 M. modiolus VG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,053 6,858 0,156 0,187 1,090 17,342 0,043 0,318 2,998 10,015 39,060 T48 0,442 6,081 0,200 0,118 1,925 14,837 0,238 0,553 5,439 6,496 36,328 C. gigas VG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,060 4,658 0,257 1,659 1,310 12,389 0,066 0,243 2,560 7,791 30,992 T48 0,686 4,453 0,426 0,779 2,104 8,027 0,331 0,759 5,404 6,294 29,263 A. islandica VG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 1,343 6,610 0,120 1,283 0,922 15,640 0,308 2,099 4,155 10,992 43,471 T48 5,273 0,645 0,377 0,842 1,163 2,679 3,238 7,372 7,253 6,199 35,041 L. littorea VG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,532 4,986 0,309 0,168 5,858 9,297 0,412 0,650 3,431 4,305 29,948 T48 3,958 0,000 0,190 0,147 0,000 0,000 0,592 3,483 0,723 0,206 9,298 C. edule VG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,050 8,357 0,037 0,466 1,654 21,399 0,064 0,341 3,557 12,199 48,123 T48 0,120 1,344 0,080 0,533 0,534 2,607 0,151 0,401 4,741 6,660 17,171 E. ensis VG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,143 4,463 0,491 0,538 0,559 9,819 0,059 0,276 2,173 7,382 25,903 T48 0,462 2,609 0,448 1,047 1,148 4,362 0,306 0,697 4,807 5,019 20,903 B. undatum VG-MD STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,046 5,044 0,337 0,176 0,704 15,437 0,041 0,238 3,769 7,759 33,550 T48 1,732 3,277 0,705 0,113 15,959 4,613 0,971 1,513 6,515 5,015 40,414 B. undatum VG-HP STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,052 5,347 0,481 0,465 1,646 14,093 0,118 0,334 3,211 10,128 35,876 T48 5,423 0,568 0,726 0,176 1,299 0,163 0,300 8,813 1,125 5,768 24,361 M.stultorum VG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,053 6,641 0,094 0,931 0,998 19,004 0,035 0,295 2,744 9,987 40,782 T48 1,484 5,279 0,203 0,218 2,470 13,294 0,499 1,165 6,539 6,693 37,845
V Anhang 133
Tab. 45: Gehalte der einzelnen PSP-Toxine im Muskelgewebe zu Beginn und am Ende der Inkubation (nmol Toxin/g Gewebe)
M. edulis MG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,043 9,651 0,051 1,327 2,701 22,497 0,037 0,381 4,529 15,359 56,577 T48 0,089 9,725 0,111 0,900 6,240 17,371 0,159 0,303 10,006 9,198 54,101 M. modiolus MG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,042 7,662 0,047 2,593 1,284 16,664 0,032 0,296 4,139 11,384 44,144 T48 0,082 7,164 0,105 1,786 4,346 9,527 0,162 0,312 9,108 8,134 40,727 C. gigas MG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,037 8,073 0,048 0,933 2,216 17,384 0,038 0,287 4,197 11,324 44,537 T48 0,055 8,365 0,096 0,197 4,066 14,154 0,102 0,283 6,782 8,582 42,682 A. islandica MG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,061 9,312 0,041 2,924 1,583 20,719 0,066 0,376 5,189 16,616 56,886 T48 0,143 10,671 0,106 0,000 7,192 20,357 0,165 0,397 9,020 10,765 58,817 L. littorea MG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 1,256 8,054 0,117 1,166 2,225 19,372 0,062 0,414 4,299 13,812 50,777 T48 0,467 5,907 1,047 1,037 8,057 7,164 0,528 0,390 11,371 6,486 42,452 C. edule MG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,060 6,529 0,046 0,434 1,691 17,733 0,051 0,284 3,504 10,442 40,772 T48 0,070 5,748 0,080 0,111 0,980 11,273 0,092 0,306 3,990 6,022 28,672 E. ensis MG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,030 5,739 0,035 0,805 0,733 15,905 0,021 0,157 3,076 8,824 35,324 T48 0,179 5,808 0,085 1,239 2,374 9,937 0,093 0,197 6,284 5,011 31,206 B. undatum MG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,028 7,961 0,092 0,245 1,257 21,128 0,037 0,281 3,843 11,164 46,036 T48 0,159 7,002 0,417 1,635 5,549 10,478 0,201 0,270 11,662 8,373 45,747 P. maximus MG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,037 5,233 0,025 1,115 1,235 14,083 0,037 0,209 3,522 6,949 32,445 T48 0,047 5,461 0,082 1,003 3,019 7,544 0,111 0,146 6,794 3,702 27,909 M.stultorum MG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,021 8,646 0,057 2,561 1,039 19,333 0,035 0,329 3,938 8,779 44,737 T48 0,082 8,466 0,180 2,696 3,899 9,943 0,143 0,374 6,800 6,943 39,528
V Anhang 134
Tab. 46: Einzelwerte der mehrfach wiederholten Inkubationsansätze (nmol Toxin/g Gewebe)
M. edulis VG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,021 5,719 0,051 0,513 0,778 16,360 0,021 0,232 3,404 10,343 37,442 0,033 5,017 0,181 0,683 1,259 14,837 0,018 0,195 2,286 7,714 32,223 0,023 5,144 0,055 0,438 1,166 15,117 0,025 0,199 2,674 7,274 32,116 T48 0,163 5,071 0,145 0,552 3,607 11,066 0,200 0,387 7,819 5,789 34,800 0,203 4,723 0,254 0,512 3,770 8,475 0,226 0,398 7,479 5,534 31,575 0,289 5,514 0,238 0,880 3,751 8,798 0,218 0,377 7,073 5,599 32,737 C. gigas VG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,056 4,589 0,229 1,574 1,326 12,656 0,075 0,245 2,225 6,517 29,492 0,035 4,852 0,273 1,720 1,428 12,538 0,079 0,248 2,614 8,572 32,358 0,088 4,533 0,269 1,682 1,176 11,972 0,043 0,236 2,842 8,283 31,124 T48 0,734 4,182 0,406 0,879 1,874 7,473 0,348 0,790 5,187 7,663 29,536 0,768 4,452 0,451 1,090 2,225 8,313 0,359 0,829 5,929 5,933 30,349 0,557 4,726 0,422 0,368 2,213 8,296 0,287 0,658 5,096 5,287 27,911 M. modiolus MG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,047 7,830 0,048 1,759 1,051 16,432 0,035 0,277 4,118 10,777 42,374 0,040 6,886 0,040 3,484 1,186 15,939 0,029 0,269 3,494 9,997 41,365 0,040 8,270 0,053 2,537 1,615 17,621 0,034 0,341 4,805 13,377 48,692 T48 0,070 7,102 0,106 2,036 4,038 9,694 0,155 0,302 9,048 8,478 41,028 0,089 6,787 0,101 1,872 4,308 9,928 0,169 0,335 9,360 8,138 41,086 0,087 7,602 0,108 1,450 4,692 8,958 0,162 0,300 8,917 7,787 40,065 L. littorea MG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 1,157 8,352 0,108 1,314 2,020 16,857 0,054 0,374 4,020 14,110 48,367 1,265 9,218 0,141 0,692 2,515 18,945 0,067 0,421 4,459 13,562 51,285 1,347 6,591 0,104 1,493 2,140 22,313 0,066 0,448 4,417 13,763 52,681 T48 0,596 5,462 1,142 0,604 8,172 7,579 0,741 0,525 12,115 7,146 44,082 0,396 6,242 1,114 1,350 8,213 7,481 0,483 0,350 11,926 6,983 44,539 0,408 6,019 0,885 1,157 7,785 6,432 0,360 0,295 10,072 5,329 38,741
Danksagung
Mein Dank gilt Prof. Dr. Bernd Luckas, der mich für seine Forschungen begeistert und mir mit
der Überlassung dieses interessanten und vielseitigen Themas großes Vertrauen erwiesen hat.
Seine großzügige Unterstützung und die vielfältigen Anregungen waren von hohem Wert bei der
Verwirklichung dieser Arbeit. Hervorheben möchte ich auch seine Unterstützung, mit der er mir
die Forschungsaufenthalte in Schottland und auf Helgoland sowie die Teilnahme an wichtigen
nationalen und internationalen Fachtagungen ermöglichte.
Herrn Dr. Christian Hummert danke ich für seine außerordentlich engagierte und motivierende
Betreuung während der ersten zwei Jahre. Die Zusammenarbeit mit ihm hat mir großen Spaß
gemacht und den Fortgang der Arbeiten stark vorangebracht. Ebenso möchte ich Dr. Bernd
Christian für die anregenden und kritischen Diskussionen, insbesondere bei der Fertigstellung
der Dissertation, danken.
Für die ständige Hilfsbereitschaft und das gute Arbeitsklima sei außerdem allen ehemaligen und
derzeitigen Kollegen des Lehrbereiches gedankt: Katrin Reinhardt, Elke Stoll, Sebastian
Kastrup, Michael Reichelt, Marion Weichbrodt, Walter Vetter, Elena Winter, Alexander Rühl,
Jens Dahlmann, Steffen Ruppe und Trinh Phoung Lien.
Frau Dr. Susan Gallacher und ihrer Arbeitgruppe danke ich für die überaus freundliche Auf-
nahme und die fruchtbare Zusammenarbeit am FRS Marine Laboratory in Aberdeen, welches
mir einen unvergeßlichen Aufenthalt in Schottland ermöglichte.
Dr. Gunnar Gerdts und den Mitarbeitern des Alfred-Wegener-Institutes Bremerhaven, Außen-
stelle Helgoland, möchte ich meinen Dank für ihre Unterstützung bei der Durchführung meiner
biologischen Studien aussprechen, ebenso wie den Bewohnern des „Hacki“-Hauses, die Helgo-
land für mich zu einem schönen Aufenthalt werden ließen.
Mein größter Dank gilt aber meiner Familie und meinem Freund Klaus, die mir Kraft und Zuver-
sicht gegeben haben, diese Aufgabe zu Ende zu führen. Insbesondere meinem Bruder Ralf danke
ich für seine seelische und moralische Unterstützung, auch wenn er letztendlich das „Rennen“
für sich entscheiden konnte.
Ich danke dem Freistaat Thüringen für die finanzielle Unterstützung im Rahmen des Landes-
graduiertenstipendiums, ohne dem diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre.
Selbständigkeitserklärung
Hiermit erkläre ich, daß ich die vorliegende Arbeit selbständig und nur unter Verwendung der
angegebenen Hilfsmittel und Literatur angefertigt habe.
Elke Jaime Jena, 02.02.2003
Erklärung zur Bewerbung
Hiermit erkläre ich, daß ich mich mit der vorliegenden Arbeit an keiner anderen Hochschule um
den akademischen Grad doctor rerum naturalium (Dr.rer.nat.) beworben habe und daß ich weder
früher noch gegenwärtig die Eröffnung eines Verfahrens zum Erwerb des o.g. akademischen
Grades an einer anderen Hochschule beantragt habe.
Elke Jaime Jena, 02.02.2003
Lebenslauf
Name: Elke Jaime
Geburtsdatum/-ort: 27.05.1975 in Dresden
Familienstand: ledig
Anschrift: Mühltal 24
07743 Jena
Schulausbildung
09/1981 - 07/1991 Besuch der Polytechnischen Oberschule in Dresden
08/1991 - 09/1993 Besuch des Gymnasiums „Dresden-Klotzsche“
Erlangung der Allgemeinen Hochschulreife
Studium
10/1993 - 03/1998 Studium der Ernährungswissenschaften an der Friedrich-Schiller-
Universität Jena
Diplomarbeit zum Thema „Zum Vorkommen von PSP-Toxinen in marinen
Organismen aus dem Seegebiet der Orkney-Inseln“ am Lehrstuhl für
Lebensmittelchemie (Prof. Dr. B. Luckas)
03/1998 Abschluß als Diplom - Ernährungswissenschaftlerin
Postgraduale Ausbildung
06/1998 - 10/2000 Wissenschaftliche Mitarbeiterin am Lehrstuhl für Lebensmittelchemie
(Prof. Dr. B. Luckas) an der Biologisch-Pharmazeutischen-Fakultät der
FSU Jena
06/1998 Beginn der Arbeiten an der Dissertation am Lehrstuhl für Lebensmittel-
chemie
05/2000 - 12/2000 Forschungsaufenthalt am FRS Marine Laboratory in Aberdeen, Schottland
11/2000 - 03/2003 Stipendiatin des Freistaates Thüringen (Landesgraduiertenstipendium)
04/2001 - 08/2001 Forschungsaufenthalt am Alfred-Wegener-Institut für Polar- und Meeres-
forschung Bremerhaven (Außenstelle Helgoland)
Elke Jaime