12. Vorlesung WS 2005/06Softwarewerkzeuge der Bioinformatik1 V12 Bioinformatik-Tools für HT Proteinanalyse traditionelle Ansätze: reduktionistisch; finde

12. Vorlesung WS 2005/06

Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 1

V12 Bioinformatik-Tools für HT Proteinanalyse

traditionelle Ansätze: reduktionistisch; finde einzelne Gene und die kodierten

Proteinprodukte, die einen beobachteten Phänotyp definieren.

Oft werden hierdurch komplexe Systeme zu stark vereinfacht.

Hoch-Durchsatzmethoden: parallele Untersuchung vieler gleichzeitiger Vorgänge

omics-Welt: Genomics, Proteomics, Metabolomics, Transcriptomics ...



Wie soll man das Proteom untersuchen?

Proteomics zerfällt

derzeit in 2 Bereiche

Expression Proteomics- katalogisiere alle Proteine in

einer Probe- differentielle Expression:

Unterschied zwischen mehreren Proben

Cell-map Proteomics- Protein-Protein Wechselwirkung- Protein-Liganden Wechselwirkung- zelluläre Lokalisation



Expressions-Proteomik

Das zelluläre Proteom enthält 10.000ende von Proteinen,

deren Konzentrationen mehr als 106 fach verschieden sind.

Prof. Walter (UdS)



Technologien in Proteomics

Separation von Proteinen- 2-D gel Elektrophorese- Flüssig-Chromatographie- Affinitäts-Chromatographie

Annotation einzelner Proteine- Massenspektroskopie- kombinierte HPLC und MS- Protein-Quantifizierung mit MS

Protein-Chips



Proteinanalyse auf einer proteomischen Skala

Phizicky et al. Nature 422, 208 (200)



Analytische versus funktionelle Protein-Microarrays

(a) analytische Microarrays:

beobachte Proteinexpression und

klinische Diagnostik. Vergleiche

Proteinproben zweier biologischer

Zustände, wobei die Protein

entweder mit einem grünen oder

mit einem roten Farbstoff gelabelt

werden. Wenn eine Farbe

überwiegt, liegt das Protein

vornehmlich in dem

entsprechenden Zustand vor.


(b) funktionelle Microarrays: visualisieren Proteinaktivität, -bindung oder

posttranslationelle Modifikationen. Auch geeignet um Substrat- oder Inhibitor-

bindung an Enzyme zu messen und zur Konstruktion biologischer Netzwerke.




Yeast Two-Hybrid Methoden

(a) die DNA-bindende und die

Aktivierungsdomänen (Kreise)

sind an die Protein X und Y

fusioniert. Genexpression des

Reporters beginnt.

(b) Standard-2YH-Suche von X

gegen eine komplexe Bibliothek von

zufälligen, mit Y fusionierten Peptid-

Schnipseln.

(c) 2YH-Array. Screene X gegen

komplette Satz von ORFs.




Fluoreszenz entdeckt posttranslationelle Modifikationen

(c) Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer

(FRET) zwischen grünem GFP und Farb-

stoffmolekül nur wenn gelbes Protein – ein

Antikörper gegen phosphorylierte Tyrosin-reste -

an rotes Protein gebunden ist. FRET ist stark

distanzabhängig, Detektion bis 6 nm Abstand.

Bindung (rechts) führt zu schnellerem Abfall der

Fluoreszenz (unten).

(b) In vivo Beispiel. Farbkodierung des Gewebes

gemäss Fluoreszenzdauer des GFP-Signals

wieviel phosphoryliertes Tyrosin besitzt rotes

Protein?

(a) cDNA-Scan. Jeder Punkt enthält Zellen, bei

denen GFP an unterschiedliche (rote) Proteine

fusioniert ist.



Disease Proteomics

Hanash, Nature 422, 226

- entdecke veränderte Proteinexpression nicht nur in Zellen bzw. Geweben,

sondern auch in Subzellulären Strukturen, in Proteinkomplexen und in

biologischen Flüssigkeiten

- entwickle neue Biomarker für Diagnose und Früherkennung von Krankheiten

- identifiziere neue Targets für Therapieansätze

- beschleunige die Entwicklung von Medikamenten



Zweidimensionale Gelelektrophorese (2D PAGE)

2D Polyacrylamid-Gel für ein Biopsie-

Probe mit menschlicher Leber.

In x-Richtung – nichtlinearer pH-

Gradient - geschieht eine Auftrennung

nach dem isoelektrischen Punkt

(bei welchem pH ist die Ladung des

Proteins neutral?).

In y-Richtung geschieht durch Variation

des Anteils an Polyacrylamid eine

Trennung nach der molekularen Masse.

Problem: man kann nur Proteine

visualisieren, die relativ häufig

vorkommen. Banks et al. Lancet 356, 1749 (2000)



Annotation von 2D-Gelen: mühsam

Banks et al. Lancet 356, 1749 (2000)



Fallstudie: Expressions-Proteomik

Die Balken 1-6 stammen von Kardiomyopathie-diagnostizierten Rindern, 7-12

von gesunden Rindern. 13-16 sind Rinder, die selbst klinisch normal sind, aber

von kranken Rindern abstammen (nur SPP 943 ist deutlich abgesenkt).

Banks et al. Lancet 356, 1749 (2000)

Proteine des

Rinderherzen:

welche Proteine sind

im Herzen von

Rindern mit einer

vererbten

Kardiomyopathie

reduziert?



(Bio)informatische Aufgaben bei Analyse von 2D-Gelen

Zwei Gele stimmen oft in Grösse,

Kontrast, Auftrennung in x- und

y-Richtung nicht überein.

Darüberhinaus treten Unterschied

als Folge der experimentellen

Bedingungen auf.

Der Vergleich zweier Gele erfordert

daher oft Methoden der Bildbearbeitung,

z.B. mit dem Programm Flicker

http://www-lecb.ncifcrf.gov/flicker/

Eine Laplace-Transformation

verbessert die Übereinstimmung

zwischen dem linken und rechten

Gel erheblich in (b) gegenüber (a). Lemkin PF, Electrophoresis, 18, 461-470 (1997)



Fraktionierung der Probe vor 2D PAGE-Analyse

Hanash, Nature 422, 226 (2003)

Oft gibt es das Problem, dass die Proteineigen-

schaften über einen sehr grossen Bereich

variieren.

Lösung: konzentriere auf Teil der Proteine.

z.B. (a) versehe die ansonsten schwer detek-

tierbaren Proteine an der Membranoberfläche

mit einem Biotin ‚Anker‘ (tag).

Auftrennung in 2D-Gel. Erkenne die markierten

Proteine mit Avidin. Identifikation mit MS.

(b) Getrennte Visualisierung der markierten

Proteine (oben) gegenüber der Darstellung

des gesamten Zell-Lysats (unten).

Dies erlaubte die Identifikation neuer Proteine

auf der Oberfläche von Krebszellen.



Einsatz von 2D PAGE-Analyse in medizinischer Diagnose


Die Probleme von 2D Gelen sind,

dass die Methode nicht für grosse Mengen an Proben (HTS) geeignet ist

und relative grosse Probenmengen benötigt.

Die Analyse von klinischen Proben wird durch die Heterogenität des Gewebes

kompliziert.



Direkte Visualisierung der Protein-Verteilung mit MS

Ein gefrorener Schnitt durch

ein Rattengehirn wird mit

einem MALDI MS-Gerät

abgetastet.

Hier: je 15 Spektren für 74

75 Punkte, gleichzeitige

Aufnahme aller Massen.

Visualisiere den Schnitt

getrennt für verschiedene

Verhältnisse von Masse und

Ladung (jeweils oben rechts

gezeigt).

z.B. ist die Proteindichte für

m/z=6844 recht gering.


Ziel: vergleiche gesundes und krankes Gewebe.

Aufgabe: Bildverarbeitung



Functional Proteomics

Konstruktion eines fluoreszenten Liganden für Serin-Hydrolasen.

(b) Messe die Fluoreszenz in gesunden und Krebszellen.

Identifiziere einen Cluster von Protease-Lipasen und Esterasen, deren

Anteil in Krebslinien aus verschiedenen Geweben unterschiedlich ist.




Proteomik mit MS

Aebersold, Mann, Nature 422, 198 (200)



Proteomics mit Massenspektroskopie (MS)

(1) Aufreinigung (SDS-PAGE).

Banden ausschneiden.

(2) Problem: Gesamtmasse eines

Proteins ist nicht aussagekräftig.

Daher Trypsin (Protease)-Verdau

Peptidschnipsel unterschiedlicher Länge,

diese sind charakteristisch für Protein.

(3) MS-Analyse in Vakuum

(4) Detektion der Massenintensität bei

vorgegebenem Verhältnis von Masse m

und Ladung z.

(5) Weitere Auftrennung der einzelnen

Peptidschnipsel in zweitem MS-Schritt.

Teilweise Sequenzierung möglich.

Aufgabe: Annotation des Proteins aus

Sequenz-Datenbank. Tyers, Mann, Nature 422, 193 (2003)



Sequenzdiversität in der Zelle: Analyse mit MS

Organismus kodiert über das

Genom viele Isoformen.

Identifikation der Proteine durch

Datenbanksuche um die Lücken

der exp. Daten zu füllen.

Sequenz-Datenbanken enthalten

jedoch keine komplette

Information über die natürlich

auftretende Sequenzdiversität.

Rappsilber, Mann, TIBS, 27, 74 (2002)



Iterativer Zyklus in Systems Biology

Tyers, Mann, Nature 422, 193 (2003)



Structural Proteomics

Sali, Glaeser, Earnest, Baumeister, Nature 422, 216 (2003)

Ungerichtete Diffusion aller Proteine ist keine geeignete Organisationsform

von biologischen Zellen.

Stattdessen übernehmen stabile oder transient gebildete Proteinkomplexe

viele wichtige zelluläre Funktionen.



bekannte Proteinstrukturen

Sali et al. Nature 422, 216 (2003)

PDZ Domäne CheA Aquaporin

Ribosom

Grosse Proteine und Proteinkomplexe sind

in der PDB-Datenbank unterrepräsentiert.

Es wird geschätzt, dass jeder Proteinkomplex

für Hefe ca. 7.5 Proteine enthält.



Struktur grosser Komplexe: Kombination von EM + X-ray

Bioinformatik: docke atomare X-ray Struktur von Tubulin (3.5 Å Auflösung)

in 8Å-EM-Struktur eines Microtubulis.




Einzel-Partikel-Analyse mit EM

(a) Komplexe von ca. 44 Tripeptidyl-Peptidase II Molekülen auf einer

Oberfläche. Das Bild zeigt verschiedene gemittelte Ansichten von Komplexen,

die jeweils die gleiche Orientierung haben ( Bildverarbeitung).

(b) 3D-Rekonstruktion des TPP II-Komplexes bei 3.3 nm Auflösung.

Verschiedene Blickrichtungen.




Information über Makromolekülkomplexe

‚Subunit structure‘ : atomare

Auflösung < 3 Å

‘Subunit shape’ : mittlere

Auflösung > 3 Å

‘Subunit contact’: Kenntnis über

direkte Kontakte zwischen Unter-

einheiten

‘Subunit proximity’: Untereinheiten

müssen nicht in direktem Kontakt

stehen.

graue Boxen kennzeichnet grosse

experimentelle Schwierigkeiten.




Hybrid-Methoden für Makromolekulare Komplexe

Structural Bioinformatics

(a) Integration

verschiedener Protein-

Elemente zu einem

Komplex.

(b) Teilweise atomares

Modell des gesamten

Hefe-Ribosoms durch

Fits von atomaren

Modellen für rRNA und

Proteinmodellen in eine

EM-Elektronen-dichte-

Mappe des 80S

Ribosoms.




Elektronen-Tomographie

(a) Vom Objekt (Mitte) gestreute

Elektronen werden in einem Halbkreis

aufgefangen. Ausserdem wird das Objekt

in kleinen Schritten gedreht.

(b) Rekonstruktion (Mathematik):

Rück-Projektion der bei verschiedenen

Drehwinkeln aufgenommenen Streuinfor-

mationen.

Die Überlagerung ergibt ein Tomogramm.




Science Fiction: “Interaktom” einer Zelle

links: ein Tomogramm einer Zelle stellt im Prinzip ein räumliches Bild des

gesamten Proteoms einer Zelle dar. Allerdings ist die Auflösung begrenzt.

Versuche dann, die „Templates“ einzelner Proteine so anzuordnen, dass

sich eine optimale Übereinstimmung mit dem linken Bild ergibt.




Software-Tools der Systems Biology:werden natürlich derzeit intensiv entwickelt



GeneMAPP

Fettsäure-Abbau-Pfad.

Jede Box stellt ein Gen dar.

Farbkodierung analog zu

Genexpressionsdaten.

Rot bedeutet > 1.2 fach

grössere Expression in

Mäusen mit Kardio-

myopathie.

Blau bedeutet > 1.2 fach

geringere Expression.



Visualisierung von Protein-Wechselwirkungen

Darstellung von 14.000

Wechselwirkungen.

Stark vernetzte Komplexe

sind am Rand gezeigt.




Fazit: Bioinformatik verbindet Genomics und Proteomics

Bioinformatik bzw. Computational Biology wird ultimativ ein integriertes Bild

des biologischen Systems erlauben.


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