5. Anreicherung und Isolierung Direktisolierung: –meist auf festen Nährböden –Verdünnung einer Probe und Ausbringen verschiedener Verdünnungsstufen –Beispiel:

5. Anreicherung und Isolierung

• Direktisolierung:– meist auf festen Nährböden– Verdünnung einer Probe und Ausbringen

verschiedener Verdünnungsstufen– Beispiel: fluoreszierende Pseudomonaden

• auf Nährboden verschiedene Verdünnungsstufen ausbringen• bei entsprechender Temperatur (ca. 30°C) inkubieren• Auswertung: bei Anregung mit UV 366 nm fluoreszieren

Pseudomonaden Kolonien gelb-grün bis bläulich


• Gewinnung von Reinkulturen:– Ausplattieren:

• vor allem für aerobe Kulturtechniken• Herstellen einer Verdünnungsreihe in

physiologischer (0,9% (w/v)) NaCl Lsg. meist in „10er oder 100er Schritten“


• Gewinnung von Reinkulturen:– Ausplattieren:

• Herstellen von Agarplatten• von der Verdünnungsreihe

wird ein entsprechendes Inokulum (meist 0,1 oder 0,05 ml) auf dem Agar ausgebracht und mittels Drigalski-Spartel verteilt

• Inkubation bei entsprechender Temp.• auf den Agarplatten wachsen, wenn der Abstand

der Kulturen groß genug ist (Verdünnungsstufe (!)) einzelne Kolonien (cfu)






• Gewinnung von Reinkulturen:– Vereinzeln:

• Mittels Impföse wird eine Kultur (cfu) von der Platte genommen und auf eine neue, sterile Agarplatte „überimpft“

• Flächenausstrich, Drei-Ösen-Ausstrich


• Gewinnung von Reinkulturen:• Drei-Ösen-Ausstrich:

– Agarplatte wird inkubiert und auf Wachstum kontrolliertmarkoskopisch:» Habitus: „glattes“ oder „ausgefranstes“ Wachstum» Schleimbildungmikroskopisch:» Form der Zellen: Stäbchen, Kokken, Mischformen» Gram-Färbung: g+, g-

» um von einer Reinkultur ausgehen zu können, muss ein sehr hoher Grad morphologischer Ähnlichkeit deutlich zu erkennen sein

» Endosporen


• Gewinnung von Reinkulturen:• Drei-Ösen-Ausstrich:

» wenn von einer Reinkultur ausgegangen werden kann, wird wiederum auf eine neue Agarplatte überimpft – dichter Ausstrich – oder es kann in ein Flüssigmedium überimpft werden (schnelleres Wachstum)

» wenn die Kultur nicht rein ist, kann erneut ein Drei-Ösen-Ausstrich durchgeführt werden, solange, bis die Kultur „vereinzelt“ werden konnte (Ausnahme: synthroph wachsende MO)


• Gewinnung von Reinkulturen:– bei Anaerobieren:

• es kann nur schwer auf Platten gearbeitet werden (Sauerstoff!!!) – Alternative: Glove-Box





• Schüttelagarkultur:– bei strikten Anaerobiern ev. mit Schwierigkeiten behaftet,

zumindest nicht sehr einfach– für nicht extreme Anaerobier gut anwendbar– Arbeitsweise:

» Anlegen einer Verdünnungsreihe, aber unter anoxischen Bedingungen (unter Sauerstoffabschluss arbeiten, Wasser abkochen, Reduktionsmittel, …)

» Verdünnung meist in Nährboden, mit geringer Agarkonzentration (5 bis 10 g l-1)

» Agar wird bei 45°C bis 50°C weich gehalten und beimpft, geschüttelt, ein entsprechendes Volumen entnommen und weiter überimpft – Verdünnungsreihe

» Agar aushärten und Inkubieren




• Schüttelagarkultur:– Arbeitsweise:

» einzelne Kulturen können mittels Spritze und Kanüle oder ausgezogener Pasteurpipette entnommen werden und z.B. in Flüssigmedium weiterkultiviert werden

» Reinheitskontrolle v.a. mikroskopisch, grundsätzlich aber eher schwierig

Phasenkontrast Epifluoreszenz


• Bestimmung der Zellzahl eines Habitates– Die Gemeinschaft eines Habitats umfasst

meist eine Vielzahl nebeneinander lebender, aber auch toter (geschädigter bzw. nicht mehr vermehrungsfähiger) Zellen

– es wird die Gesamtheit der Zellen bestimmt– dafür notwendig:

• homogene Probe• repräsentative Probe


• Bestimmung der Zellzahl– Probennahme, -handhabung, -aufbewahrung:

• viele Möglichkeiten zur Entnahme – Fachliteratur für Böden, Gewässer, anaerobe Habitate, etc.

• beim Transport muss eine Veränderung der Probe (chemisch, v.a. aber mikrobiologisch) verhindert werden (Kühlung, Fixieren?)

• Flüssigproben werden meist gut geschüttelt um eine homogene Verteilung der MO zu erreichen

• feste bzw. pastöse Proben werden meist mit Wasser/phys. NaCl-Lsg. verdünnt und anschließend geschüttelt

• Lagerung dann meist im Kühlschrank (4°C) oder bei -20°C


• Bestimmung der Zellzahl– Methode: Thoma-Kammer

• Objektträger mit definiertem Volumen und Flächengravur



• Herstellen einer entsprechenden Verdünnung • Thoma-Kammer mit EtOH sehr gründlich reinigen: fettfrei• Deckglas an den Seitensteg pressen, ev. „reiben“ bis das

Deckglas fest sitzt (bunte Ringe), Umdrehen möglich– nur so entspricht das angegebene Volumen dem

tatsächlichen!!!• Suspension gut durchmischen• eine Tropfen Suspension an den Deckglasrand• unter Mikroskop die Zellen zählen: Phasenkontrast• Auswertung:

– Berechnung der ZZ für ausgezähltes Volumen– Hochrechnen auf 1 ml Zellsuspension



• Rechenbeispiel: – Kammer: a = 0,05 mm, h = 0,01 mm (angegeben ist immer

das Kleinquadrat (KG)) – Verdünnungsstufe 1:10 = 10-1

– pro Großquadrat werden 64 Zellen ausgezählt– 64 : 16 = 4 Zellen/KQ– Fläche KQ: 0,05 * 0,05 * 0,01 = 0,000025 mm3

– 1 mm3 = 1 µl– 4 Zellen : 0,000025 = 160 000 = 1,6 * 105 Zellen / µl– 1,6 * 105 Zellen : 10-1 = 1,6 * 106 Zellen / µl; – entspricht 1,6 * 109 Zellen pro ml


• Bestimmung der Zellzahl– Methode: Membranfilter

• bei geringen Zelldichten• Zellsuspension wird (meist mittels Spritze) durch

eine Membranfilter gepresst (spezielle Filterhalter) – für kleine Volumina

• bei großen Volumina über Filterstation• die Zellen werden (meist) angefärbt• Zählung unter dem Mikroskop• Acridin-Orange Färbung• Färbung mit Erythrosin



• Acridin-Orange Färbung:– Aufnahme der in der Suspension enthaltenen Zellen auf ein

Membranfilter 0,2 µm (Spritze)– Eintauchen in verdünnte Acridin-Orange Lsg.– waschen mit A.d.– 10 min einwirken lassen (Penetration der Zellen mit AO)– auf einen Objektträger aufbringen– mit Immersions-Öl überschichten– Deckglas– mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop auszählen– Anregung mit UV– AO interkaliert mit DNA in der Zelle (bindet an Pi des NS), DNA wird

angefärbt– Einzelstr.: orange– Doppelstr.: grün



• Färbung mit Erythrosin– zur Färbung von Plasmaproteinen– hoher Iodanteil, Farbeffekt wird durch Phenol verstärkt– Membranfilter nicht angefärbt

• Vitalfärbung mit Fluorescein– unpolarer, hydrophober Ester- nicht fluoreszierend– geht durch Cytoplasmamembran– wird in der Zelle hydrolysiert - fluoreszierend


• Bestimmung der Keimzahl (cfu)– auch als Lebendzellzahl bezeichnet– es werden nur vermehrungsfähige,

kultivierbare (!!!) MO erfasst– meist makroskopische, daher sehr schnelle

und einfache Auswertung möglich– höherer Zeitaufwand für die Vorbereitung

notwendig– Weiterarbeiten mit kultivierten Organismen

möglich


• Bestimmung der Keimzahl– Methode: cfu Bestimmung

• Arbeitsweise:– Herstellen einer Verdünnungsreihe (vom Habitat

abhängig, meist aber zw. 10-5 und 10-11)– Ausplattieren auf ein geeignetes Medium (Drigalski-

Spartel)» meist 0,1 ml oder 0,05 ml» meist in mehreren Parallelen (3 oder 5)» Medium für Pilze, Bakterien,…» Habitat: Wasser, Boden, Kompost, Schlamm, …» Selektion über Medium



• Arbeitsweise:– Inkubation bei entspr. Temp.

» Boden: 15 °C bis 20 °C» Gletschervorfeld: 10 °C» Gletscher: 4°C

– Bebrütungsdauer:» mehrere Stunden bis mehrere Wochen (meist 1 bis 5

Tage)» Einfluss auf die Kolonien – nicht alle Zellen wachsen gleich

schnell» bei zu kurzen Bebrütungszeiten können Kolonien

übersehen werden» bei zu langer Bebrütungszeit überwachsen Kolonien

andere



• Arbeitsweise:– Auswertung: es werden so genannte cfu – colony

forming units – makroskopisch gezählt und auf einen ml hochgerechnet

– verwendet werden jene Platten, die zw. 10 und 100 cfu aufweisen, hier werden alle Parallelen ausgezählt


Verd: -3

Verd: -4

Verd: -5alle Kollonien

(cfu) zählen und Keimzahl pro ml Ausganssuspens

ion berechnenzw. 10 und

100 cfu



• Arbeitsweise:– Rechenbeispiel:

» es wurden 0,1 ml (100 µl) einer Suspension der Verdünnungsstufe 10-4 ausgespartelt

» Verdünnungsstufe 10-4 ergibt: 14, 20 und 17 cfu je Parallelplatte

» Bildung des Mittelwertes: 17 (Mittelwert darf nur INNERHALB VON PARALLELPLATTEN, nicht aber zwischen Verdünnungsstufen gebildet werden(!!!!))

» Rechnung:17 / 0,1 = 1,7 * 102 / 10-4 = 1,7 * 106 cfu / ml


• Bestimmung der Keimzahl– Methode: Membranfiltertechnik

• wenn niedrige Keimzahlen zu erwarten sind• häufig in der Wasseranalytik eingesetzt• Arbeitsweise:

– spezielle Filtereinheit– am Filter werden MO immobilisiert– verschiedene Filter können verwendet werden, möglichst

mit Gitternetz (Raster)– Filter auf Agarplatte gelegt und inkubiert– Auswertung wie bei cfu Bestimmung, wobei das

Ergebnis für das gesamte filtrierte Volumen gilt


• Membranfiltertechnik


• Bestimmung der Keimzahl– Methode: Membranfiltertechnik

• wenn nach der Bebrütung die Kolonien auf einem weißen Filter zu wenig Kontrast zeigen, können diese auch angefärbt werden:

– Malachitgrün: Filter direkt in der Petrischale mit einer 0,01% Malichtgrün Lsg. überschichten

– ca. 10 sek einwirken lassen– Kolonien bleiben ungefärbt– Filter wird grün– Auszählen wird stark erleichtert (Unterscheidung wird

einfacher)


• Bestimmung der Keimzahl– Methode: Membranfiltertechnik Konservierung

• das Filter kann nach Auswertung getrocknet werden (30 min bei 120°C tötet vegetative Zellen – nicht Endosporen!!!!)

• auf eine Kartonplatte aufgeklebt über Jahre haltbar• häufig in der Lebensmittel- und Wasseranalytik

eingesetzt – Dokumentation!!!


• Bestimmung der „wahrscheinlichsten“ Keimzahl– Methode: most probable number (MPN)

• statistische Methode, die einen Schätzwert über die „wahrscheinlichste Keimzahl“ liefert

• für Proben mit niedrigen Ausgangskeimzahlen: Wasserproben, Lebensmittel, pharmazeutische Produkte

• basierend auf der Verdünnung in einem Nährmedium– meist sehr selektiv, um nur eine bestimmte Gruppe zu

bestimmen: z.B. Coliforme in Lebensmitteln

• wenn eine Trübung nach erfolgter Inkubation feststellbar ist, dann ist diese Probe positiv



• üblicherweise werden die Verdünnungen in mehreren Parallelen angelegt

– in Reagenzgläsern (Eprouvetten): mind. 3, meist 5 Par.– Mikrotiterplatten (96 well Platten: 12 x 8 „Näpfchen“)

• Verdünnung in Dezimalschritten (meist 9 ml Nährlösung plus 1 ml Suspension – 1:10)



• bis zu einer bestimmten Verdünnungsstufe sind sämtliche Röhrchen getrübt (=bewachsen =positiv), d.h. dass in dieser Verdünnungsstufe bereits vor Inkubation mind. 1 lebensfähige Zelle zu finden war

• in darüber liegenden Stufen sind nicht alle Röhrchen positiv• es werden ausgehend von der letzten Verdünnungsstufe, in

der Wachstum sichtbar ist, die darunter liegenden positiven Parallelen gezählt

• Auswertung über Statistiktabellen



• soll eine bestimmt Organismengruppe bei gleichzeitiger Anwesenheit von „Fremdkeimen“ ausgewertet werden, kann beispielsweise nicht die Trübung „gemessen“, sondern auf Basis der Produktion von Säure/Base, Gasen usw. vorgegangen werden

• es können Indikatoren angewendet werden (Sre/Base, Redox, ….)





• Vorraussetzung für die erfolgreiche Anwendung von MPN Methoden:

– homogene Verteilung der Organismen in der Ausgangsprobe (Suspension)

– Zellen liegen möglichst einzeln vor und nicht in Agglomeraten

– Zellen sind nicht oder nur minimal an Partikel gebunden

– theoretisch sollte beim Vorhandensein von nur 1 Zelle in einem Röhrchen eine Trübung beobachtet werden können

• die besten Ergebnis werden erzielt, wenn in einer Verdünnungsreihe 20% aller Röhrchen negativ sind (1,6 Keime in der entsprechenden Verdünnungsstufe)



• Vorteile:– bei schwer auf festen Nährmedien kultivierbaren

Organismen– wenn die Begleitflora nicht oder nur schwer auf

Selektivnährböden gehemmt werden kann– wenn die zu untersuchenden Keime langsam wachsen,

sprich „überwachsen“ werden könnten



• Nachteile:– zeit- und materialintensiv– sind antibiotisch wirksame Substanzen (v.a/ auch

abiotische Faktoren) in der Ausgangssuspension vorhanden kann die Methode nicht angewendet werden – Membranfiltertechnik hier anzuwenden

– die Methode ist bei Verwendung von Dezimalverdünnungen sehr ungenau – besser wären kleiner Verdünnungsschritte


• Bestimmung der Zellmasse– Biomasse-Quantifizierung– in Flüssigmedien– Bestimmung von Zellerträgen in einer statischen oder

auch kontinuierlichen Kultur– meist als Bezugsgröße für Kulturparameter wie

Sauerstoffzehrung, Enzymaktivität, morphologische Phänomene, …

– v.a. für Reinkulturen eingesetzt– in ökologischer Anwendung schwer einsetzbar


• Bestimmung der Zellmasse– Zellmasse bezogen auf das Kulturvolumen –

Zelldichte (z.B. mg/ml oder g/l)– es kann meist nicht zw. lebenden und toten

Zellen differenziert werden– oftmals nicht einmal die Möglichkeit, zw.

biotischen und abiotischen Bestanteilen im Medium zu differenzieren


• Bestimmung der Zellmasse– Feuchtmassebestimmung:

• gravimetrisch• meist durch Zentrifugation, seltener durch Filtration• sehr schnelle Ergebnisse• Wassergehalt der Zellen variabel(!!) –

Vergleichbarkeit• Pathogene (!!)


• Bestimmung der Zellmasse

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/0/0d/Tabletop_centrifuge.jpg

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/f/f5/Centrifuge_with_handwheel_100.jpg


• Bestimmung der Zellmasse– Trockenmassebestimmung:

• sehr häufig eingesetzte, zuverlässige Methode• gravimetrisch• Abtrennung der MO von der Flüssigphase (Medium):

– Zentrifugation:» ev. Waschschritt(e): NaCl, Wasser, …» Tarierwaage (!!)» homogene Suspension (!!)» je nach Rotor 4000 bis 6000 g für Bakt., ca. 3000 für Hefen

– Filtration:» meist in Faltenfiltern

• Trocknung bei 105° C


• Bestimmung der Zellmasse– Trockenmassebestimmung:

• nach 12 bis 24 Stunden abwiegen (mg)• im Exsikkator abkühlen lassen• Berechnung:

– für TM müssen die Leergewichte bekannt sein (tara)

– vom ermittelten Gesamtgewicht zieht man das Leergewicht ab

– Bezug auf FG, oder auf gesamt zentrifugiertes/ filtriertes Volumen

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/5/5f/Exsiccator_hg.jpg


• Trübungsmessung– NL idR klar– beimpfte NL erscheint ab einem bestimmten Zeitpunkt

„trübe“ (Bakt. ca. ab 106 Zellen/ml)– Zellen in der NL streuen das Licht– diese Streuung verringert die Intensität eines

gerichteten Lichtstrahls durch die Lsg.– Abnahme der Lichtintensität zur Zelldichte

proportional– Intensitätsabnahme mittels Photometer gemessen


• Trübungsmessung– eingesetzt für:

• homogene Susp. von Bakterien, Hefen, Sporen• zur Abschätzung/Messung von Wachstum• Gewinnung von Impfkulturen• die Standardisierung von Bakteriensuspensionen• Evaluation von z.B. wachstumshemmenden Stoffen

– nicht für myzelbildende MO– Vorteile:

• schnell• zuverlässig• ohne Schädigung oder Abtötung der untersuchten Zellen


• Trübungsmessung– Photometer

• Gerät zur photoelektrischen Messung von monochromatischen Lichtströmen

• gemessen wird die Extinktion• „Auslöschung“ bei Trübungsmessung aber nicht

durch Absorption des Lichts, sondern durch Streuung


• Trübungsmessung– Photometer


• Trübungsmessung– Photometer:

• Küvetten:– Glas: Borsilicatglas 340 – 2500 nm– Quarzglas: 190 – 2500 nm– Kunststoff: 300 – 750 nm



• Trübungsmessung:– 106 bis 1010 Zellen/ml– Entnahme kurz vor Messung (ev. Kühlung)– homogene Lsg.– Veränderung der Probe vermeiden: Wachstum– Lyse der Zellen - Protoplasten– Je kleiner die Wellenlänge, desto größer die Streuung (=

scheinbare Extinktion)» bei niedrigen Zelldichten ab 420 nm» bei hohen Zelldichten 660 nm

– Medium darf kein Licht absorbieren



• Trübungsmessung:– vor Messung Lsg. gut schütteln– Luftblasen– Referenz– Nullabgleich– Messung durchführen– Zeitintervall – konstanter Wert

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5. Anreicherung und Isolierung Direktisolierung: –meist auf festen Nährböden –Verdünnung einer Probe und Ausbringen verschiedener Verdünnungsstufen –Beispiel: