Jg. ~7, X[eft 14 I-I. WEICKER: Adsorp~ionschromatographische Un te r suchung yon Serumlipiden anf Kieselgelplatten 763 15. guli 1959

Es werden zum Extinktionssehreiber passende Streifen gesehnitten, welehe die Farbfleeke enthalten. Ein~auehen in e-Bromonaphthali~:t und Paraffin61 im Verhaltnis 1:2 fiir 2 Std. Entfernen der Luftblasen im Exsiccator.

Die Fleeken wurden in einem Zeiss-Extinktions- sehreiber Typ II mit dem Filter Nr. FE~54 gemessen. Das Ger/~t wandelt die Intensitiit der angef&rbten Flecke in eine Konzentrationsknrve urn. Die Flaehe dieser Absorptionsknrve wird ptanimetriert. Wit benutzten hierzn ein Ott-Planimeter. Die Gr6Be der Flaehe ist der Konzentration direkt proportional. Die zu der gemessenen Flaehe geh6rende Konzen- tration entnimmt man einer Eiehkurve. Die quanti- tative Auswertung der FIeeken kann auch ohne Be- spr/ihen bzw. Anfarben, sondern dureh Eluieren (6) erfolgen: Die Flecken werden drench einen Test- Fleeken lokalisiert, ausgesehnittcn nnd mit Hilfe eines Mikrosoxhlets eluiert; im Eluat bildet man mit e-Nitroso-fl-naphthoI (4) einen Farbstoff, dessen Absorption spektralphotometriseh bestimmt wird (1).

Zusammen/assung. In der vorliegenden Arbeit beriehteten wir zusammenfassend fiber quantitative papierchromatographisehe Bestimmungen von 5-Hy- droxytryptophan, 5-IIydroxytryptamin und 5-Hydro- xyindotessigsaure. Die entsprechenden LaufmitteI und tie R/-Werte ffir jede Substanz werden mitgeteilt. Es ergaben sieh gewisse Gesetzmagigkei~en zwischen den Laufmitteln bei basisehem nnd saurem Charak~er und den R/-Werten der versehiedenen Substanzen. Bei basischen Laufmitteln waren die RFWerte bei 5-I-Iydroxytryptophan und 5-Hydroxyindolessigsaure niedrig und bei sauren Laufmitteln grog. Bei sauren Lanfmitteln waren die RF~'erte yon 5-Itydroxy-

tryptophan und 5-I-Iydroxytryptamin Mei~ und bei 5-IIydroxyindolessigsaure groB. Diese Ergebnisse lassen sich erklaren dureh Bildung yon Salzen mit den Amino- bzw. Carboxylgt~appen der Substanzen. Die gebildeten Salze haben eine geringere Wanderungs- gesehwindigkeit. Nach Darstellung der verschiedenen Anfarbungsmethoden nnd Auswertung der angefarb- ten Fleeke werden die entsprechenden Eichkurven miggeteilt.

mm~l iiiii 7 - 7

/00

dO

d0

4~

20

Y /0 /5 2o 25y Abb. 3. Sulianils~iure. Standardkurven der aus Sulfanils~ure gebildeten Farbstoffe mit 5-'~y4roxytryptophan, 5-Hy4roxytryp~amin and 5-~[ydroxy- indolessigs~iure. Ordin.~te: Oberfl~ehe in mink Abszisse: aufge~ragene Substanzmenge in ),. 1 5-]tydroxytryptophan, 2 5-Hydroxytryptamin,

3 5-ttydroxyindolessigs~iur e

Literatnr. ~ CAnCASO~A, A., J . C ~ v o s - N A v A ~ n o u F .U~TE~AI¢~SC~ZD~: Klin. Wschr . 37, 253 (1959). - -

J~Bso~, J . B . : Lancet 19~5, 1009. - - ~ H a ~ s o ~ , A., and F. S ~ : Lancet 1955, 1359. - - ~ S z o ~ D S ~ , A., I t . W ~ s s - ~ c ~ and S. U D E ~ a ~ n ~ D : J . Amcr. med. Ass. 159, 359 (1955). - - ~ L ~ ¢ ~ , H., u. J . KX¢~: Klin. Wschr . 84, 237 (1956). - - ~ CaAW~O~D, T. B. B., and A. S. O v T s e ~ o o a ~ : Brit. J . Ph~rmacol . 6, 8 (1951).

ADSORPTIONSCItROMATOGRAPHISCHE UNTERSUCHUNG V 0 ~ ~ SERUMLIPIDEN AUF KIESELGELPLATTEN

Von H. W ~ m x ~

Aus tier ~iedizinischen Univ.-Poliklinik ~eidetberg (Direktor: Prof. Dr. meal. It. P~esS-~)

Der Darstellung mug vorausgesehiekt werden, dab sie bei der Ffille yon Problemen, die sieh bei der ehro- matogr~phisehen Anftrennung der Serumgesamtlipide ergeben, nut den Charakter einer vorlanfigen Mittei- lung haben soll. Da jedoeh das Anwendungsgebiet tier hier zu besebreibenden Dfinnsehiehtehromatographie ffir die Untersuehung yon Serumlipiden, Gewebs- lipiden und Organextrakten eine viel~seitige Anwen- dung finden wird, soll die Methodik nnd die bis jetzt sehon zu iiberblickenden Versuehsergebnisse kurz publiziert werden. Obwohl die papierehromatographi- sehe Untersuehungsteehnik yon wasserl6sliehen Sub- stanzen und vor allem yon Aminosauren im kIinisehen Labor sieh einer allgemeinen Beliebtheit erfreut, so ist die ehromatographisehe Trennung yon Lipoid- substanzen vorwiegend bioehemisehen Speziatlabora- torien vorbehalten, da die papierchromatographisehe Aufarbeitung dieser Snbstanzen in der Regel teehniseh relativ sehwierig ist. Von ST~L 1 wurde vor kurzem eine Methodik der Dfinnsehiehtehromatographie auf Kieselgetplatten zur Auftrennung komplizierter Stoff- gemisehe, wie gtherisehe 01e, Tri- und Polyterpene, Steroide, aromatisehe Kohlenwasserstoife, Fettfarb- stoffe, u. a. publiziert. In der Pharmazie wird sie mit

gutem Erfolg angewandt. Nach unseren Versuchs- erfahrungen eignet sie sieh aueh zur adsorptions- chromatographisehen Trennung der Serumlipide, Neu- tralfette nnd Fetts/~nren. Die Saulenehroma~ographie nnter Bevorzugung von Alumininmoxyds£uren, die in der pr~parativen Aufarbeitung yon Lipoidsnbstanzen seit langem eine unentbehrliehe Methode ist, arbeitet naeh demselben Adsorptionsprinzip2. Die verteilungs- ehromatographisehe Auftrennung wasserunl6slieher oder sehwer 15slieher Stoffgemisehe anf Papier maehte hingegen lange erhebliehe Sehwierigkeiten. F/it die Steroidhormone ist jetzt dutch die Zweiphasen- ehromatographie mit impragnierten Papieren eine be- Iriedigende L6sung gefnnden. Hierbei erhalt man je naeh Auswahl des Impragnierungsmittels a-6 oder L6- snngsmittels eine Trennung dutch Adsorption oder Verteilung in 2 Phasen. Es kann hier aueh mit der Kombination beider Prinzipien gearbeitet werden. Bei der Verteilungstechnik erfolgt die Trennung entgegen der iibliehen Chromatographie auf Papier dutch Ver- teilung zwisehen stationar organiseher und mobil wasserl6slieher Phase oder umgekehrt. Die Auswahl der L6sungsmittel hangt unter anderem yon der Polari- tat der zu trennenden Substanzen ab. In der bier

764 It. WEIeKEg: Adsorptionschrom~tographische Untersuchung yon Serumlipiden auf Kieselgelplatten Klinisehe Woehensehrift

besehriebenen Teehnik 1, v ist diese Kombinationsehro- matographie nieht erforderlich, da versehiedene Lipoid- 15sungsmittel in einer befriedigenden Weiss dureh anf- steigende Adsorption die Lipide auf der Kieselgelschieht

Chol.-Ester

Chol.

Fetts/furen

Lecithin

1 2 3 g 5 6 7

Abb. 1. ~Jbersiehtschromatogramm von Serumgesamtlipiden auf Kiesel- gelplatte, Sehichtdicke 250m/~. LSsungsmittel: Propanol-Ammoniak 2:1 30 mm, Chloroform-Benzol 3:2 100 ram, danach Drehung um 180 ° auf- steigend Tetrachlorkohlenstoff 40 mm. Entwicklung mi t Antimontrichlorid bei 110 ° 10 rain. Auftrag: 6 mm ~ Gesamtlipid naeh Lipidextraktion LSsung der Lipide in Chloroform. Gesamtlipidmenge 800rag-%, Cholestexin 180 rag-%, Lecithin 200 rag-%. 1 Serumlipid, 2 Serumlipi4 (Cholesterin 200 mg~ %, Lecithin 220 rag-% ), 3 l~einlecithin-l¢Ierck 500 rag-%, 4 ice ton- anreicherung yon Serum 1, 5 acetonunl0sliche Lipide yon Serum 1, 6 Aceton-

anreicherung Serum 2, 7 acetonunl6slfehe Lipide 'yon Serum g. Anfnahmetechnik 1:1 bei normalem nurchlicht

ehromatographieren. Das Verfahren ist ftir pharma- zeutische Fragestellungen techniseh gut ausgearbeitet und jederzeit reproduzierbar, so dab es dutch Auswahl geeigneter L6sungsmittel und EntwicMungsverfahren

Chol.- Ester

Chol.

Lecithin

8 7 6 5 d 3 2 1

Abb. 2. r~bersichtschromatogramm mit demselben Auftrag wie in Abb. 1. Aus auf- nahmetechnischen Grttnden bei Atfflichtphotographie im UV-Licht Wellenl~inge 865 m~, ist die Beschriftung der einzelnen untersuchten Snbstanzeu in rfiekl~ufiger

t~eihenfolge zu lesen. Zusiitzlieher Auftrag yon 200 mg-%igem Cholesterin in Stellung 8

aueh auf dem Sektor der Serumlipoide und Serumfette iibertragen werden konnte.

Mit tIilfe einer im Handel befindliehen Grund- ausr~istung k6nnen in sehr zeitsparendem Arbeitsgang die Kieselgelplatten hergestellt werden. Einzelheiten der Zubereitung sind aus der Darstellung yon STALL 1 ZU ersehen. Die mit einer Sehiehtdieke von 250 m/~ Kieselgel gleichm/~Big bestrichenen Glasplatten sind naeh 30 rain Trocknungsvorgang bei 100 ° ffir die Auf-

tragung yon jeweils 8 Substanzen oder Substanz- gemisehen verwendungsf/ihig. In der Aufarbeittmg der Serumlipide war ein L6sungsmittel oder sine Kom- bination mehrerer L6sungsmittel erfordertich, in dem sieh die Lipide zun/iehst in einem Untersuehungsgang einmal weitgehend lokalisieren liel~en, ehe man mit speziellen LSsungsmitteln sich der feineren Auftren- nung der einzelnen Stoffklassen, wie Cholesterin, Phosphatide, Fetts/~uren und Neutralfetten zuwenden konnte. Nach lJberprfifung zahlreieher organiseher L6sungsmittel, wie Chloroform, Methylchlorid, Benzol, Methanol, ~thanol, Aeeton, Itexan, Propanol, Butanol sowie der Verwendung vielseitiger Kombinationen die- ser einzelnen LSsungsmittel mit untersehiedliehen Misehnngsverhaltnissen, erseheint uns flit das Gesamt- lipidspektrum in der adsorptiven Chromatographie bis jetzt folgendor Arbeitsgang am vorteilhaftesten:

Man 1/~Bt die Kieselgelplatten zun~chst bis zu einer SteighShe des LSsungsmittels yon 30 ram, gerechnet yon der Auftragsstelle der Substanzen, in Propanol: Ammoniak 2 : 1 stehen. Die Chromatographiekammer muB hierzu mindestens 2 Std vor Arbeitsbeginn mit dem LSsungsmittel beschiekt werden. Die Propanol- ammoniakmisehung darf nieht alter als 3 Tags sein, da sonst die Ammoniakkonzentration deutlieh ab- sinkt. Nachdem das Propanol-Ammoniak vollkommen verdunstet ist, fiberfiihrt man die Platte in Chloro- form-Benzol in einem Mischungsverhaltnis yon 3:2 und ehromatographiert aufsteigend, bis die LSsungs- mittelfront die t00 mm-Marke erreieht hat. Diese bei- den Vorg~nge dauern etwa 40--60 rain. Danaeh kippt man die Platte um 1800 und ehromatographiert riick- 1/~ufig ebenfatls aufsteigend in Tetraehlorkohlenstoff.

Antimontriehlorid hat sich yon allen untersnchten Substanzen, wie Antimonpentaehlorid, starken S/~uren und Ammoninmmolybdat am besten zur Sichtbar-

maehung der getrennten Substanzen bewahrt. Naeh l0 rain Erhitzen bei l l0 ° stellen sich die Cholesterine, ihre Esterverbindungen, einzelne Fettsguren, Lecithin, Carotin und zahlreiehe andere noch nieht identifizierte Lipoidsub- stanzen dar. AuBerdem zeigen diese Stoffe naeh Verwendung yon Antimontriehlorid eine sehr deutliehe Fluoreszenz bei langwelligem UV-Licht. Cholesterin, Cholesterinester, Loci- thin und einige Fetts/iuren konnten mit unter- sehiedlieh intensiv grau-violetter bis rot- violetter Farbung bis jetzt lokalisiert werden. Das Carotin gibt vor dem Erhitzen deutlieh kornblumenblaue Spots. Die FarbtSnung ist yon Stoffgruppe und Konzentration desselben abh/ingig. Die Auftragsmenge, die ffir die Serumgesamtlipide erforderlich ist, liegt etwas hSher als bei der Chromatographic yon Einzel- substanzen, da man hier aueh noch niedrige Lipidkonzentrationen erfassen will. Sis be- tri~gt 6 mmS.

Bei der Festlegung der RFWerte der Einzel- substanzen sind immer die RrWerte der mitlaufenden Testfarbstoffe Buttergelb, Sudanrot und Indophenol mit zu bezeiehnen, da man hierdureh die untersehied- liehe Eiutionsfghigkeit der versehiedenen L6sungs- mittel der Elutropenreihe definieren kann. (Abb. 1, 2).

Die Serumlipidextraktion wird zweekm/~Bigerweise naeh der v o n S C t I M I D T V. EL1VI]ilNDORF 8 besehriebenen Modifikation des Soxhletverfahrens durehgefiihrt, da

Jgg.37,JuliHeft195914 H . WEICKEt¢: A d s o r p t i o n s c h r o m a t o g r a p h i s c h e U n t e r s u c h u n g y o n S e r u m l i p i d e n a u f K i e s e l g e l p l a t t e n 765

die quantitative und qualitative Lipidextraktion besser ist als mit der iibliehen ~therMkoholextraktion nach BLOO~ oder der nichtmodifizierten Soxhletmethode. Der Vorteil dieses Ger£tes besteht darin, dab die Lipide sich auBerhalb des zu extrahierenden EiweiBkuchens in einem zweiten Glasgef£B sammeln. Auf den zu extrahierenden EiweiBknchen tropft st£ndig das vollkommen lipidfreie kondensierte LSsungs- mittel. Als Extraktionsmittel wird Chloroform- Ather, Athanol imVerh£1tnis 3 : 1 : 1 vorgeschlagen und hat sich auch bei unseren Nachuntersuchun- gen als vorteilhaft bew£hrt. Die Lipidausbeute ist nach Beschreibung des Verfassers zwischen 95 und 98 % im Gegensatz zu einer Lipidausbeute mit anderen Extraktionsverfahren yon 70--85%. Die Angaben werden auch dadurch glaubhaft, da man bei der chromatographischen Darstellung des Lipoidspektrums nach der modifizierten Soxhlet- methode noch eine !~eihe yon Substanzen er- kennen kann, die bei der einfachen Lipidextrak- tion mit Ather-Alkohol nicht naehweisbar sind (Abb. a).

In der vergleichenden Beurteilung der Serum- lipidverh/iltnisse bei einzelnen Krs~nkheitsbildern ist die Gesamtauftrennung in der hier ange- gebenen LSsungsmittelkombination, die ftir EinzeL substanzen, wie freies Cholesterin, Cholesterinester, Phosphatide, Carotin und Fetts/~uren, aueh quan- titative l)bersehlagswerte ergibt, unentbehrlich. Zur quantitativen Beurteilung ist die gezielte Chromatographie mit entsweehender Auswahl yon L6sungsmitteln unter Umstgnden vorzuziehen.

Cholesterin. Die R/-Werte des Cholesterins sind bei den bier untersuehten LSsungsmitteln im Propanol am grSBten und waren 100 mm e n t spreehend den R/-Werten yon 100 mm fiir Butter- gelb, Sudanrot, Indophenol. Da bei diesem L6sungsmitte] das Cholesterin jedoeh etwa in der HShe der LSsungsmittelfront liegt, eignet sich ein Chloroformbenzolgemiseh yon 3:2 besser, da hier das Cholesterin in der Mitre des Chrcmatogrammes naehweisbar ist. Die/?/-Werte liegen bei 50 mm und entspreehen den R/-Werten der Tcstfarb- stoffe Buttergelb 80 ram, Sudanrot 50 mm, Indo- phenol 15 mm. Die Siehtbarmachung ist mit Anti- monpentaehlorid bei Zimmertemperatur und mit AntimontrieMorid naeh 10 rain Erhitzen bei 110 ° sehr gut m6glieh. Der Farbton ist bei Antimon- pentaehlorid grau-braun, bei Antimontriehtorid blau-violett. Die Intensit/it und Gr613e des Flecks entsprieht der Konzentration des Cholesterins. Eine geihe yon Farbstoffindieatoren, wie Methyl- rot, Methylorange: Kresylgriin und starken Sguren erm6glichcn ebenfalls eine Cholesterinanf£rbung, jedoch Mind diese Entwiekler, die aueh andere Lipidsubstanzen, wie Cholesterinester, Fetts£uren usw. siehtbar maehen, weniger zur quantitati- yen Beurteilung geeignet. Bei einer Auftrags- menge yon 2--3 mm s ist eine 10 mg-%iRe LSsung noch bei normalem Lieht siehtbar. Im UV-Lieht sind sogar noch LSsnngen yon 5 mg-% bei derselben Auftrags- menge zn erkennen. Das Cholesterin zeigt dabei einen roten Kern mit gelbem Rand. Die l~;otf£rbung nimmt mit fallender Konzen~ration ab. Konzentrations- untersehiede yon 25--30 mg-% sind naeh FleckgrSBe und Intensit~t noeh zu unterseheiden (Abb. 4).

Cholesterinester. Diese sehr polaren Cholesterin- verbindungen ---unabhgngig davon, mit welehen Fett- s/~nren das Cholesterin verestert ist - - liegen bei allen L6sungsmitteln der Elutropenreihe yon Benzol bis Methanol in der L6sungsmittelfront. Mit Tetrachlor-

ChoI.- Ester

nieht identi-

>fizierte Lipide

Chol.

1 2 3 ~ 5 6 7 8

Abb. 3. ~bersiehtsehromatogramm yon Serumlipid, Cholesterin- und Cholesterin- Leeithin-LSsungen. LSsungsmi~teh Chloroform-Benzol 3:2. Entwiekler: Anti- montriehlorid bei 110 ° 10 rain. Aufnahmetechnik: VV-Auflicht 365 m/~. 1 Chole- sterin-Leeithin-L6sung 200 rag-% aa, 2 Cholesterin-Leeithiu 200:500 n:g-%. Auftragsmenge 6 ram 3, 3 Normalserum naeh Soxhletextrak~ion, Auftragsmenge 4 mm a; 4 Normalserum naeh Soxhletextraktion, Auftragsmenge 6 m m ~: 5 Gesamt- lipidextraktion naehBnooR aus demselben Serum, Auftragsmenge 5 mmZ; 6 Normalserum naeh 8oxhletextraktion, Auftragsmenge, 4 mm~; 7 Normalserum naeh Soxhletextraktion Auftragsmenge 6 lam~; 8 Gesamtlipid naeh BL00a aus

demselben Serum, Auftragsmenge 6 Inln a

Chol- Ester

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Abb. 4. l~'bersich¢schromatogramm yon CholesterinlSsungen untersehiedlicher Konzentrationen. LOsungsmittei: Chloroform-Benzol 4:1, Ent.wickler: An~ilaon- trichlorid bei 110 a 10 rain, 1 Farbstofftest, 2 Cholesterin 250 mg-%, 3 Chole- sterin 200 tag- %, 4 Cholesterin 150 rag- %, 5 Cholesterin 1O0 rag- %, 6 Chotesterin

50 rag-%, 7 Cholesterin 25 rag-%, 8 Normalserum nach Soxhletextraktioa, 9 Gesam~Iipid nach BI~OOR. Auftragsmenge 6 mnV

kohlenstoff hingegen lassen sich die Estergemische entsprechend ihrer unterschiedlichen Polarit£t ansein- anderziehen, die fibrigen Sernmlipidsubstanzen blei- ben nahe dem Star tpunkt zuriiek. Die Cholesterin- ester sind quantitativ ebenfalls mit Antimontriehlorid bei nat/irlichem Lieht und langwelligem UV-Licht als Fluoreseenz naehweisbar. Die oben erw£hnten Indi- eatorfarben, vor allem Methylrot, Methylorange geben

Chole- sterin

766 H. WEIKER: Adsorptionschromatographische Untersuchung yon Serumlipiden auf Kieselgelpla~tten Kliaisehe Wochensehrift

deutliche rote oder gelbe Esterflecken. In der Differen- zierung der Cholesterinester des Serums verwendet man am besten die oben beschriebene Kombinations- methode mit rfickl~ufiger aufsteigender Tetraehlor-

Chol.- Stearat

Chol.- Oleat

Chol .- Eutyra t

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Abb. 5. Chromatogra13hische Trennung versehiedener Cholesterinester. L6sungsmittel: Tetrachlorkohlenstoff. Entwickler: Autimon~richlorid. 1 Farbs~offtest, 2 Cho]esterin-Lecithin 200 rag-% ig an, 3 Normalscrum n~ch Soxhletextraktion, 4 Acetonausfiillung aus Normalserum nach Soxhlet- extraktion, 5 Aeetonfiltrat dieses Gesumtiipides, 6 Aeetona~xsfiillung, 7 Acetonfiltrat eines zwei~en Serums, 8 Es~ergemisch m~s Chotesterinstear~t-

Oleat-Butyrat 200 mg-% aa

kohlenstoffchromatographie. Zur genaueren Beurtei- lung und quanti tat iven Auswertung arbeitet man zwei- dimensional, tI ierbei t rennt man in der ersten Ebene mit Propanol :Ammoniak 2 : 1, anschliei3end Chloro-

ChoL- Ester

Chol,- Verun- reini- gung

Chole- sterin- frei

Lecithin

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Abb. 6. t)bersichtschrematogramm yon CholesterinlSsung mit Lecithinzusatz, Serumlipiden un4 Lecithinl6sungen verschiedener Konzentrationen. L6sungs- mi~tel: Chloroform-Eenzol 3: 2 ~ Propanol-Anmmniak 2:1. Entwiekler: Anti- montrichlorid. 1 Farbstofftest, 2 Cholesterin-Lecithin 200 rag-% an, 3 Normal- serum naeh Soxhletextraktion, 4 Gesamttipid nach BLOOR, 5 Lecithin

400 mg-%ig, 6 Lecithin 300mg-%ig, 7 Lecithin 200mg-%ig, 8 Lecithin 100 mg-%ig, 9 Lecithin 50 mg-%ig. Auftragsmenge 6 mm ~

form-Benzol 3:2 und verwendet bei der zweiten Dimen- sion Tetraehlorkohlenstoff. I s t man nur an einer genauen Auftrennung der Estergemische allcin inter- essiert, dann chrornatogra~phiert man in reinem Tetra- chlorkohlenstoff und benutzt hierzu am besten eine fibers&ttigte Kammer . Hier finder man bei dem Chole- sterinstearat die hSehsten G/-Werte yon etwa 50 ram, ibm folgen das Cholesterinoleat mit einem R/-Wert

von 45 m m und das Butyra t mit einem R/-Wert yon 30 mm. Die t~F-Werte der Testfarbstoffe Buttergelb, Sudanrot und Indophenol liegen zwischen 20 und 5 m m (Abb. 5).

Phosphatide. Von den Serumphosphatiden konnten wir bisher lediglich das Lecithin nachweisen, da uns andere reine Vergleichsphosphatide noeh nicht zur Ver- f/igung standen. In der Elutropenreihe wandert das Lecithin mi t dem Cholesterin zusammen und hat die- selben R/-Werte. Die Kombinat ion yon l~ropanol - Amlnoniak ira Verh£1tnis 2 : 1 mit einer Anfangs- trennung bis zu 30 m m und anschlieSender Chromato- graphie in Chloroform-Benzol 3 : 2 erlaubt eine Auf- trennung beider Substanzen. Das Cholesterin wird durch das Propanot beschleunigt, dureh die Verwen- dung yon Ammoniak wird da~s Lecithin aus dem Chole- sterinverband herausgelSst. Die VergleichslSsungen Lecithin ex eve zeigten nebcn dem Lecithin noch eine kleine Restmenge yon Cholesterin. ~ a c h Aeeton- umf&tlung war diese Resteholesterinmenge zu entfernen. Mit Antimontrichlorid ist in normalem und UV-Licht das Lecithin sichtbar zu machen und Konzentrations- unterschiede yon 50 rag- % sind noch zu unterseheiden. Die R/-Werte liegen bei den bier vorgesehlagenen LSsungsmittelkombinationen zwischen 20--25 mm bei einem Buttergelb-R/-V~Tert yon 80 m m (Abb. 6).

~'ettsi~uren. Die bis jetzt untersuchten Fetts'~uren (01s&ure, Stearinsi~ure, Butters£ure, Palmitins&ure) konnten ebenfalts in der hier beschriebenen Kombi- nationslSsung getrennt werden. Die 01saure zeigt nach Entwicklung mit Antimontrichlorid bei I-Iitze eine grau-violette Anf/~rbung nnd ergibt im langwelli- gen UV-Licht eine deutliche Fluorescenz. Die anderen Fettsauren sind mit Antimontrichlorid weder bei

normalem noch bei UV-Licht zu erkennen. Mit Indieatorfarben fiir das pH-Bereich yon 4-6 sind die Fetts~uren nachweisbar und zeigen bei 01s/~ure mit Methylrot eine deutlich rote Anf&rbung~ eben- falls ergibt die Butters~,ure trod Steaxins/~ure, sowie Palmitinsgure etwas schw&chere rote Farbflecken. Die R/-Werte ]iegen fiir die 01s/ture bei 30 ram, f/ir Butters/iure bei 30 m m und ffir Stearinsgure bei 25 mm. Neben Methylrot kann man auch Methylorange und Eosinrot zum Nachweis der Fettsguren verwenden.

Da das Antimontrichlorid als Carotinnaehweis ursprtinglich verwandt wurde, war es nicht erstaun- lich, dab auch mit den bier beschriebenen chromato- gr&phischen Untersuchungen und Entwieklungs- ver~ahren deutlieh blaue Carotinflecken im Lipid- spektrum zu erkennel~ sind. Bei der LSsungs- mittelkombination, wie oben beschrieben, liegen sie etwa 3 - -5 m m oberhalb des Startpunktes. Auch bei Tetrachlorkohlenstoff ist keine wesentliche Wanderung des Carotins zu erkennen. Hingegen kann man mit Propanol und Chloroform-Benzol eine gute Abtrennung des Carotins yon den benachbarten Substanzen erreichen. Es gelingt sogar, die Auf-

trennung versehiedener Carotine mi t gut meBbaren unterschiedlichen R/-Werten.

Ergebnisse. Die yon STAm~ 1 publizierte Methode der Adsorptionschromatographie auf Kieselgelplatten 1/iBt sich naeh der hier besehriebenen Arbeitsteehnik fiir adsorptionsehromatographische Trennungen yon Serumlipidsubstanzen und Gewebslipiden bei geringem Arbeitsaufwand gut im klinisehen Labor durehfiihren.

Jg. 37, ]~eft 14 H . WEIeKEI~: Adsorptionsehromatogra.phisehe Unt, ersuehung yon Serumlipiden a,ff Kieselgelplatten 767 15. Juli 1959

Die Verwendung yon KombinationslSsungsmitteln, yon denen sick naeh unseren Erfahrungen die Kombi- nation Propanol-Ammoniak im Verh£1tnis 2:1, an- sehlieBend Chloroform-Benzol 3:2 und riiekl£ufig Tetraehlorkohlenstoff am gfinstigsten yon alien mlter- suehten LSsungsmitteln nnd LSsungsmittelkombina- tionen erwiesen hat, erlaubt, auf einer Platte das Ge- samtspektrnm weitgehend darzustellen. Die Siehtbar- maehung mit Antimontriehlorid in normalem Lieht und Fluoreseenz be/langwelligem UV-Liehtl/kgt Chole~ sterin, Cholesterinester, Fettsguren, Phosphatide, Carotin und zahlreiehe noeh nieht identifizierte Stoffe erkennen. Die qnantitative A bsehgtzung der Einzel- substanzen ist dabei m6g- //~ l/oh. Zur exakteren Anf- trennung und besseren quanti tat iven Auswertung S~ wird man danach zu spe- 8: ziellen LSsungsmitteln oder 7:

tier zweidimensionalen At- ~ beitsweise/ibergehen. Hier- s# bei wird in der Auswahl der L6sungsmittel die Po- ~ : - larit/kt der zu trennenden :0 Snbstanzen den ersten rich- 20 tungsweisenden Anhalt ge- n - ben. In Tetraehlorkohten- stoff waren die stark po- laren CholesteNnester anf

/~rbsto::/esle L/p/de

tell gegenfiber der S/kulenehromatographie besteht dar- in, dab man nur kleine Ausgangsmengen benStigt und in kurzer Z e i t / i b e r s i e h t l i e h e Chromatogramme erh/ktt.

Z u s a m m e n / a s s u n g . Es wird sin adsorptJonsehro- matographisehes Untersuehnngsverfahren auf Kiesel- gelplatten zur Auftrennung yon Serumgesamtlipiden besehrieben. Da diese yon E. STAHL besehriebene Metho- dik in pharmazeutisehen Fragestetlungen zur Auftren- nung £theriseher 01e und anderer komplizierter Sub- stanzgemisehe mit gutem Erfolg angewandt wird, war es naheliegend, dab das Verfahren sich aueh znr ehro- matographisehen Trennnng yon Serumlipiden eignen

Farbe/norm. l ichl ~ V Lick/s~s rat, Ant/~o/ztrl'~J/ori'o: lie/hi/re/ Pluorescenz /0' //0 ° l~sun#smitte/:,~/ez

(hlor"o@rm : Benzoll 3 : /

o L?utter#e/b ~ Choi But/r~t rolVlbletl rot + ~e/b 2 + #

e ~ £hol. O/e::/ ,,

CkoI, Slearat UauYiolett ~' + " + " Tetr~ch]~rkok/enst,~

o Sodazro l polep ](enn ~el'eS Cho/ rol//iblell " + ~,~/ber P~::d

~-O/sdure.. bluu ~'ur Erkitzen + "blau

~:ai~i/izsOu:e . $ " I £te~zr///~o:/re -"---~/': + # :

- olndophenol ~ Lecifhin ~:~un + we/B

/ / Grund untersehiedlieher R/-Werte gut zu differen- zieren. In diesem L6sungs- mittel bleihen dis /ibrigen Lipide am Star tpunkt haften. Alle Substanzen nahe dem Star tpnnkt beider Ubersiehtsehromatographie mit der oben besehriebenen L6snngsmittelkombination hin- gegen sind mi t LSsungsmittetn, be/ denen die stark polaren Ester mit der LSsungsmittelfront wandem, besser zu trennen, t i ler seheint das Chloroform oder Methylehlorid das LSsungsmittel der ~ra, M. Neben dem Antimontriehlorid, das fiir normales Licht und Fluo- reseenzlieht be /UV-Lieh t langwellig 365 m~e ats Uni- versalentwiekler bezeiehnet werden kann, haben sieh f/Jr die l~etts/kuren besonders die Indieatorfarben, wie lVIethylrot, Methylorange u . a . bewikhrt. Die unter- suehten Einzelsubstanzen sind dureh die Rt-Werte vergleiehend mi t den R/-Werten der mitlanfenden Farbstoffteste Sudanrot, Buttergelb nnd Indophenol, ihre Eigenfarbe in Normalbeleuehtung und UV-Lieht zu eharakterisieren. Der geringe Arbeitsaufwand, die kleine Auftragsmenge yon 6 mm ~ fiir Snbstanzgemisehe und 3mm ~ fiir Einzel~substanzen, die Naehweisffi.hig- keit yon 5--10 y pro Substanz und die Differenzierung unterschiedlieher Konzentrationen lassen erwarten, dab die Methode eine branehbare Erg/knzung f/it a]le Untersuehungen anf dem Gebiete der Lipide wird. Da man nieht nut Serumlipide, sondern aueh Gewebs- stiieke, Gef/kgwandexeisionen nnd Organpunktate be/ der kleinen Ansgangsmenge teehnisch relativ einfaeh aufarbeiten kann, sh~d siehertieh eine I~eihe yon Frage- stellungen unter dieser neuen methodisehen Voraus- setzung zu 16sen. Der LTbergang zur prgparat iven Ar- beitsweise auf die S/kulenehromatographie maeht keine Sehwierigkeiten, da die D/innsehiehtehromatographie ebenfalls anf dem Adsorptionsprinzip beruht. Der Vor-

Abb. 7. Schematische Dars~ellung des Obersichtschromatogramms. LOsungsmitteI: Propanol-Ammoniak 2:1 30 ram, Chloroform-Benzol 3:1 100 ram, Tetraehlorkohlens~off rfckl~ufig 40 ram.

Eatwickler: Antimongrichtorid I0 rain bei 110 ~

kSnnte. Unter Verwendung einer L6snngsmittel- kombination ans Propanol-Ammoniak 2 : 1 , Chloro- form-Benzol 3 : 2 und Tetraehlorkohlenstoff kann man ein ~bers ichtsehromatogramm der Serumgesamtlipide erhalten. Die Differenzierung der Einzelsubstanzen erfolgt dann mit speziellen L6snngsmitteln, wie Chloro- form, Tetraehlorkohlenstoff, Methylehlorid. Der Vorteil der Methodik besteht darin, dab man be/kleinen Auf- tragsmengen Substanzgemisehe differenzieren kann, be/denen einzelne Snbstanzen noch in e/net Menge yon 10--20 y mit Antimontriehlorid naeh Erhitzen anf 1 I0 ° im normalen Lieht und im UV-Lieht als Fluoreseenz naehweisbar sind. Durch Rf-Werte, Farbe und Nuores- eensverhatten konnten bis jetzt das Cholesterin, die Chosterinester, das Lecithin, Carotin und einige Fett- sguren chromatographisch eharakterisiert werden. Konzentrationsuntersehiede yon 25--50 rag-% sind dabei ffir das Cholesterin, Cholesterinester und das Lecithin noeh deutlich zu unterseheiden. Es ist anzu- nehmen, dab unter diesen teehnisehen Voraussetznn- gen zahlreiehe Fragestellungen auf dem Gebiet der Serum-, GefaB- und Gewebslipide erfolgverspreehend untersueht werden k6nnen.

Literatur. 1 STAm~, E.: Chem.-Zgg 82 (I958). - - ~ ZEC~- ~EISTE~, L., u .L.v. CnoLNOKY I Die chromatographische Adsorptionsmethode, 2. Aufl. Wien: Springer 1938. - - a ZAF- ~n:aogi, A.: Recent Progr. Hormone Res. 8, 51 (1933). Zit. naeh R. NE~.~, A. Wettstein, Helv. chim. Aeta 34, 2278 (1951). - - 4 HOFF~_~NN, I-t., U. I-I. J. STA~DINGE~: Bioehem. Z. ~2~, 230 (1951). --5N~HE~, I~., u. A. WET~ST]~: Helv. ehim. Aeta 34, 2278 (1951). - - ~ NE~,~, g., u. A. WETTS~EIN: ttelv. ehim. Aeta 35, 277 (1952). - - 7 S~Atm, E. • Parfiimerie u. Kos- metik 13t}, 9 (1958). - - s Scm~iDm v. EL~I~DO~V, E. : Z. ges. exp. Med. 130, 142 (1958).