Untersuchung von verschiedenen

Capsicum-Arten auf ihre Capsaicinoid-

Zusammensetzung

Abschlussbericht

Projektarbeit

Chemietechnikerkurs 2007

Leverkusen

von

Sebastian Lachmuth und Christine Fütterer

Langenfeld

2010

2

Inhalt

1. EINLEITUNG ..............................................................................................3

2. AUFGABENSTELLUNG UND ZIELE ........................................................3

3. EXPERIMENTELLER TEIL ........................................................................4

3.1 Auswahl der Chilisorten .....................................................................................................4

3.2 Hitzestabilität des Extraktes ...............................................................................................4

3.3 Zusammensetzung im Extraktionsverlauf ..........................................................................4

3.4 Extraktion ...........................................................................................................................5

3.5 Reinigungsversuche............................................................................................................5

3.6 Überprüfung der HPLC-Methode.......................................................................................6

3.7 HPLC-Analyse....................................................................................................................6

3.8 Gustatorische Untersuchung...............................................................................................7

4. AUSWERTUNG UND INTERPRETATION DER ERGEBNISSE................8

4.1 Hitzestabilität des Extraktes ...............................................................................................8

4.2 Zusammensetzung im Extraktionsverlauf ..........................................................................8

4.3 Reinigungsversuche............................................................................................................9

4.4 Überprüfung der HPLC-Methode.......................................................................................9

4.5 HPLC-Analyse der Extrakte ...............................................................................................9

4.6 Gustatorische Untersuchung.............................................................................................10

4.7 Zusammenhang zwischen HPLC-Analyse und gustatorischer Untersuchung..................12

5. ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK ...............................................12

6. LITERATURVERZEICHNIS .....................................................................13

7. ANHANG ..................................................................................................13

3

1. Einleitung Capsaicinoide sind Scharfstoffe, die ausschließlich in Gewächsen der Gattung Capsicum gebildet werden. Die Gattung Capsicum gehört zu der Familie der Nachtschattengewächse (Solanaceae) und teilt sich in mehrere Arten wie C. annuum und C. baccatum auf, denen die verschiedenen Sorten wie Peperoni, Tabasco und Jalapeno zugeordnet werden (s. Anhang S.13, Abbildung 4). Es gibt weltweit ca. 50 verschiedene Capsicum Arten, wobei sechs kommerziell genutzt werden. Im Rahmen dieser Arbeit werden einige bekannte Sorten hinsichtlich ihrer Capsaicinoid-Zusammensetzung untersucht. [1][3]

Die Capsaicinoide sind geruchlos, farblos, nährwert- und bis auf die Schärfe geschmacksfrei. In natürlich vorkommenden Mengen sind sie nicht toxisch, verursachen aber im Mundraum ein scharfes Brennen. Dabei werden sie nicht über die Geschmacksknospen sondern durch Schmerzrezeptoren wahrgenommen, die sich im Mund, Nase und Magen befinden. Werden diese Rezeptoren angeregt, setzen sie Neurotransmitter frei, die einen Schmerzimpuls an das Gehirn senden. [4]

Die Struktur der Capsaicinoide leitet sich von Vanillylamin ab. Sie unterscheiden sich lediglich in den angehängten Fettsäureresten. Die am häufigsten vorkommenden Capsaicinoide sind Capsaicin (C), Dihydrocapsaicin (DC) und Nordihydrocapsaicin (NC). Sie machen zusammen mehr als 95% der in den Schoten enthaltenen Capsaicinoide aus. In Abbildung 5 (s. Anhang S.14) sind die Strukturformeln der drei häufigsten Capsaicinoide dargestellt. [1][2]

Im weiteren Verlauf des Berichts werden die Derivate mit ihren oben genannten Abkürzungen bezeichnet.

Der Capsaicinoidgehalt sowie die Zusammensetzung variieren sehr stark bei verschiedenen Chilisorten. Dies ist einer der Gründe, weshalb Schoten unterschiedlicher Sorten sensorisch unterschiedlich wahrgenommen werden. Dabei können Geschmacksnoten, Schärfedauer und Lokalität der Wirkung variieren. [2]

2. Aufgabenstellung und Ziele In der vorliegenden Projektarbeit werden Früchte verschiedener Chilisorten auf die Zusammensetzung der Capsaicinoide untersucht (s. Anhang S.13, Liste1). Die Schoten werden extrahiert und der Extrakt mittels HPLC analysiert. Dabei werden die Ergebnisse halbquantitativ ausgewertet. Von besonderem Interesse ist es, welchen Anteil die drei am häufigsten vorkommenden Derivate C, DC und NC an der gesamten Capsaicionid-Mischung ausmachen und in welchem Verhältnis sie zueinander stehen. Es besteht die Vermutung, dass Früchte unterschiedlicher Chiliarten sich in der Zusammensetzung unterscheiden und verschiedene Sorten innerhalb einer Art eine Ähnlichkeit aufweisen. Des Weiteren soll untersucht werden, ob die Zusammensetzung der Capsaicinoide einen Einfluss auf die Wahrnehmung der Schärfe haben. Im Idealfall kann jedem Derivat des Capsaicins eine bestimmte Wirkung zugewiesen werden. Für die Untersuchung des Schärfeempfindens wird ein Geschmackstest mit mehreren freiwilligen Probanden durchgeführt.

4

3. Experimenteller Teil

3.1 Auswahl der Chilisorten

Um ein möglichst breites Spektrum an unterschiedlichen Capsaicinoid-Zusammensetzungen zu bekommen, werden die Chiliproben so ausgewählt, dass von jeder gängigen Art mindestens eine Sorte vorliegt. Von der jeweiligen Art wird die am weitesten verbreitete Sorte ausgewählt. Des Weiteren werden bei zwei Arten – Habanero und Jalapeno – je zwei verschiedene Sorten untersucht, um der These über die gleiche Zusammensetzung bei gleicher Art nachzugehen. Außerdem wird eine weitere Sorte – Aji Picante – mit HPLC untersucht, die nicht eindeutig einer Art zugeordnet werden konnte. Damit wird angestrebt eine Zugehörigkeit zu einer Art festzustellen oder einzugrenzen. Im Anhang werden die ausgewählten Sorten mit der zugehörigen Art aufgelistet (s. Anhang S.13, Liste 1).

3.2 Hitzestabilität des Extraktes

Verwendete Geräte: 250 mL-Rundkolben mit Stopfen 100 mL-Rundkolben Intensivkühler Heizpilz

Chemikalien: je 200 mL Ethanol, absolut

Im Verlauf der Projektarbeit werden die Capsaicinoid-Gemische heiß extrahiert. Um sicher zu stellen, dass die Capsaicinoide bei Hitze stabil sind, wird zum Vergleich eine Kaltextraktion durchgeführt. Dazu wird eine Probe mit 100 mL Ethanol vermengt und 14 Tage stehen gelassen. Zum Vergleich wird anschließend ein Teil des Kaltextrakts 1,5 Stunden unter Rückfluss gekocht. Die Proben vor und nach dem Kochen werden mittels HPLC auf die Zusammensetzung untersucht und verglichen.

3.3 Zusammensetzung im Extraktionsverlauf

Grundprinzip einer Soxhlet-Extraktion

• Lösemittel verdampft im Rundkolben

• Lösemittel kondensiert im Rückflusskühler und tropft auf das Extraktionsgut

• Farb- und Aromastoffe werden gelöst

• Extrakt läuft zurück in den Vorlagekolben

• Anreicherung des Extrakts im Vorlagekolben

• Neues Lösemittel wird ständig nachgeliefert

Vorteil: effektive Extraktion bei wenig

Lösemittelverbrauch

Abbildung 1: Aufbau einer Soxhlet-Apparatur und Grundprinzip einer Soxhlet-Extraktion

5

Im Verlauf der Projektarbeit werden die Capsaicinoid-Gemische mittels Soxhlet-Extraktion gewonnen. Der Aufbau der Soxhlet-Apparatur sowie das Grundprinzip sind in Abbildung 1 dargestellt.

Verwendete Geräte: 100 mL-Mehrhalskolben 100 mL Soxhlet-Aufsatz mit Hülse Intensivkühler Reduzierstück mit Septum Spritze mit 20 cm-Kanüle (0,2 mm Durchmesser), Ölbad Julabo-Temperaturregler

Chemikalien: je 150 mL Ethanol, absolut

Um die maximal notwendige Extraktionszeit zu ermitteln, werden die Veränderungen der Zusammensetzung des Extrakts im Verlauf der Extraktion untersucht. Von besonderem Interesse ist die Frage, nach welcher Dauer ein Extrakt mit konstanter Zusammensetzung der Capsaicinoide vorliegt. Dazu werden Proben während des Extraktionsverlaufs für eine HPLC-Analyse entnommen. Die Probenahme erfolgt immer nach einem Überlauf des Extraktes im Soxhlet-Aufsatz – anfangs nach jedem Überlauf, später in größeren Abständen (s. Anhang S.16, Tabelle 2). Um eine fortwährende Extraktion zu gewährleisten, werden die Proben mittels einer Kanüle durch das Septum gezogen. Die Chiliprobe wird zwei Stunden unter Rückfluss extrahiert.

3.4 Extraktion

Verwendete Geräte: 250 mL-Rundkolben 100 mL Soxhlet-Aufsatz mit Hülse Intensivkühler Heizpilz ggf. Rotationsverdampfer

Chemikalien: je 200 mL Ethanol, absolut

Die verschiedenen Chiliproben werden mittels einer Soxhlet-Apparatur extrahiert. Dazu werden jeweils ca. 40 g der Probe in die Extraktionshülse eingewogen und in die Apparatur gegeben. Es wird 1,5 Stunden nach dem Beginn des Siedevorgangs mit 200 mL Ethanol unter Rückfluss extrahiert. Anschließend werden die Extrakte durch einen Papierfilter filtriert und in Glasflaschen aufbewahrt.

Erste Analysen der Extrakte führen zu der Erkenntnis, dass einige Proben zu gering konzentriert sind, um genaue Ergebnisse zu erzielen. Die betroffenen Proben werden deshalb eingedampft. Dazu werden die Proben in einen Rotationsverdampfer gegeben und bei 150 mbar und 60°C etwa 20 min eingeengt. Anschließend werden die Extrakte durch einen Papierfilter filtriert.

3.5 Reinigungsversuche

Verwendete Geräte: 500 mL-Scheidetrichter 100 mL-Erlenmeyerkolben Ceran-Kochfeld

Chemikalien: je 200 mL Ethanol, absolut 50 mL n-Hexan Aktivkohle

6

Um die Extrakte von eventuellen Verunreinigungen zu befreien, werden verschiedene Reinigungsversuche durchgeführt.

a) Ausschütteln des Extraktes mit n-Hexan

Laut Literatur sind Capsaicinoide in n-Hexan schlecht löslich [5]. Aus diesem Grund wird versucht, das ethanolische Extrakt mit Hexan auszuschütteln und so die Verunreinigungen zu entfernen. Zu 200 mL Extrakt werden 50 mL Hexan gegeben. Anschließend sollte das Gemisch im Scheidetrichter geschüttelt und die Hexanphase abgetrennt werden.

b) Adsorption der Verunreinigungen mit A-Kohle

Zu 50 mL Extrakt werden 0,5 g A-Kohle gegeben. Das Gemisch wird aufgekocht und nach Abkühlen durch einen Papierfilter filtriert. Das Gemisch wird vor und nach der Aktivkohle-Reinigung mittels HPLC analysiert.

3.6 Überprüfung der HPLC-Methode

Um die Stabilität und eventuelle Schwankungen der HPLC-Analyse einzuschätzen, wird eine Probe mehrmals gemessen. Als Probe dient der Extrakt der grünen Jalapeno, welcher im Verlauf der Projektarbeit gewonnen wurde. Es werden fünf Analysen der Probe an drei verschiedenen Tagen durchgeführt, wobei die Analyse jeweils ein-, zwei- bzw. dreimal wiederholt wird. Die erhaltenen Ergebnisse werden anschließend statistisch ausgewertet. Es wird die Standardabweichung und die relative Standardabweichung für die Stoffmengenanteile der Capsaicinoide ermittelt und die Zuverlässigkeit der HPLC-Methode beurteilt.

3.7 HPLC-Analyse

Die Extrakte werden zunächst unverdünnt analysiert. Wenn die Extrakte zu gering konzentriert sind, müssen sie – wie im Kapitel 3.4 bereits beschrieben – eingeengt werden. Die eingeengten und filtrierten Proben werden ebenfalls unverdünnt gemessen. Falls die Notwendigkeit besteht, die Proben zu verdünnen, sollte abs. Ethanol verwendet werden. Für eine Analyse werden ca. 2 mL des Extrakts durch einen Spritzenvorfilter (0,4 µm) in ein Vial überführt und mit folgender Methode mittels HPLC bestimmt.

Säule: Phenylharz, 250 mm x 4 mm, 5 µm Eluenten: A: Milliporwasser, angesäuert (0,1% H3PO4) B: Acetonitril Eluentenverhältnis: 63% Eluent A, 37% Eluent B Temperatur: 40°C Flussgeschw.: 1 mL/min Detektor: UV/VIS- Diodenarray Wellenlänge: 280 nm Injektionsvolumen: 20 µL

Die Intensitäten der drei Substanzen bei der Wellenlänge 280 nm sind identisch und proportional zu der Konzentration der Probe. Die UV-Aktivität wird vor allem durch den Vanillylrest verursacht, der Einfluss des enthaltenen Fettsäurerests kann vernachlässigt werden [1]. Die Capsaicinoide haben bei 280 nm ein Absorptionsmaximum. In Abbildung 6 (s. Anhang S.14) ist ein 3D-Spektrum dargestellt, das einen Ausschnitt aus dem Chromatogramm der drei Komponenten zeigt.

7

Anfangs werden die Eluenten isokratisch gefahren. Um die Analysendauer zu verkürzen, wird die Methode so optimiert, dass die organischen Komponenten schneller von der Säule gespült werden.

Es ergibt sich folgender Gradient:

0 min 63% Eluent A, 37% Eluent B 20 min 63% Eluent A, 37% Eluent B 21 min 0% Eluent A, 100% Eluent B 23 min 0% Eluent A, 100% Eluent B 25 min 63% Eluent A, 37% Eluent B 29 min 63% Eluent A, 37% Eluent B

Um die Peaks der drei Capsaicinoide zu identifizieren, wird ein Standard, der die Komponenten C, DC und NC enthält, analysiert und die Retentionszeiten bestimmt. In Abbildung 7 (s. Anhang S.14) ist ein Beispiel für ein Chromatogramm dargestellt. Die Zuordnung der Peaks kann einerseits anhand der Größe erfolgen, denn die Zusammensetzung des Standards ist bekannt. Er enthält ca. 4% NC, sodass der kleinste Peak dieser Komponente zugehörig ist, 62% C mit dem größten Peak und 34% DC mit dem dritten Peak. Zum anderen kann die Reihenfolge der Komponenten aus der Literatur entnommen werden. In der Abbildung 2 ist ein Ausschnitt aus dem Patent [5] zu sehen, worin die Reihenfolge der Capsaicin-Derivate aufgeklärt wird.

Abbildung 2: Ausschnitt aus U.S. Patent No. 5.955.631; mit (1) Capsaicin,

(2) Nordihydrocapsaicin und (4) Dihydrocapsaicin sowie weiteren Derivaten

3.8 Gustatorische1 Untersuchung

Um die geschmackliche Wahrnehmung der Proben zu untersuchen, werden die verschiedenen Chilisorten von mehreren Personen getestet. Die Versuchspersonen sind eine zufällige Auswahl aus Freundes- und Bekanntenkreis sowie Mitgliedern eines Chiliforums. Die Freiwilligen sind im Alter zwischen 18 und 40 Jahren und überwiegend männlich.

Vor dem Geschmackstest wird ein Fragebogen ausgearbeitet (s. Anhang S.15, Abbildung 8), anhand dessen man die Chilis untereinander vergleichen soll. Die Probanden sollen entscheiden, wie stark Eigenschaften wie „kratzend“, „beißend“ oder „lange anhaltend“ ausgeprägt sind und in welcher Region die Schärfe

1 Gustatorisch: den Geschmackssinn betreffend

30

40

50

60

70

80

90

100

0 5 10 15 20 25 30

Retentionszeit [min]

Eluent B [%]

8

hauptsächlich empfunden wird (z.B. Zunge, Hals). Die Ausprägung soll auf einer Skala von 1 „schwach ausgeprägt“ bis 5 „stark ausgeprägt“ eingeordnet werden.

4. Auswertung und Interpretation der Ergebnisse

4.1 Hitzestabilität des Extraktes

Die Analyse des Kaltextrakts und der anschließend gekochten Probe wies keine Unterschiede in der Zusammensetzung auf. Sowohl die Peakflächen als auch die Verhältnisse waren identisch (s. Anhang S.15, Tabelle 1). Somit ist experimentell bewiesen, dass das Capsaicinoid-Gemisch hitzestabil ist und die verwendete Methode zur Extraktion keinen nachteiligen Einfluss auf die Zusammensetzung hat.

4.2 Zusammensetzung im Extraktionsverlauf

Bei der HPLC-Analyse der Extrakte wird ein weiterer Peak zwischen NC und C detektiert. Das entsprechende Chromatogramm ist in Abbildung 9 (s. Anhang S.16) dargestellt. Bei diesem handelt es sich wahrscheinlich um Nordihydrocapsaicin II. Wie man in Abbildung 3 sieht, ist die Struktur sehr ähnlich zu der des Nordihydrocapsaicins (NC). Bei identischer Kettenlänge des Fettsäurerestes sitzt lediglich die abgezweigte Methylgruppe an einer anderen Position [1]. Aufgrund der Ähnlichkeit von NC und NCII im Strukturaufbau ist eine vergleichbare Retentionszeit zu erwarten.

Abbildung 3: Struktur von Nordihydrocapsaicin (NC) und Nordihydrocapsaicin II (NC II)

In Tabelle 2 (s. Anhang S.16) ist der zeitliche Verlauf der Extraktion dargestellt. Von besonderem Interesse für weitere Auswertungen, ist die Tatsache, dass ca. 1,5 Stunden Kochen unter Rückfluss einer Probe nach dem 8. Überlauf entspricht.

In Diagramm 3 (s. Anhang S.17) ist die Gesamtfläche der Derivate dargestellt. Man erkennt, dass sich nach dem zweiten Überlauf Capsaicinoide in dem Extrakt anreichern. Die Zunahme der Konzentration wird im Laufe der Extraktion immer geringer, so dass nach 1,5 Stunden bzw. nach dem 8. Überlauf eine ausreichende Menge an Capsaicinoid vorliegt. Theoretisch würde auch eine Extraktionszeit von einer Stunde ausreichen, da aber vorher nicht bekannt ist, welche Menge an Capsaicinoiden die Chiliprobe enthält, ist es besser länger zu extrahieren, um anschließend die Möglichkeit zu haben, die Probe zu verdünnen.

9

In Diagramm 4 (s. Anhang S.17) sieht man, wie sich das Extrakt hinsichtlich der Zusammensetzung der Capsaicinoide verändert. Zunächst ändern sich die Anteile dahingehend, dass sich die Komponente NCII anreichert. Nach dem 3. Überlauf ist die Zusammensetzung des Extraktes jedoch stabil und ändert sich nicht wesentlich.

4.3 Reinigungsversuche

a) Ausschütteln des Extraktes mit n-Hexan

Ethanol und n-Hexan mischen sich vollständig, somit kann n-Hexan nicht zum Entfernen von Verunreinigungen verwendet werden. Laut Literatur (s. Anhang S.18, Abbildung 10) ist Ethanol mit allen gängigen Lösemitteln vollständig mischbar. Auch Mischbarkeitsversuche mit Methanol als Alternative zu Ethanol und Kohlenwasserstoffen wie n-Hexan, n-Heptan, n-Octan und Cyclohexan brachten keine zufriedenstellenden Ergebnisse. Alle getesteten Kohlenwasserstoffe haben mit Methanol zwar zwei Phasen ausgebildet, waren aber zumindest teilweise mischbar. Da der Einfluss einer solchen Reinigung auf die Zusammensetzung des Capsaicinoid-Gemischs unklar ist, wird von dieser abgesehen.

b) Adsorption der Verunreinigungen mit A-Kohle

Das Extrakt war nach der A-Kohle Behandlung klar und farblos. Die HPLC Analyse zeigt eine gleichmäßige Abnahme aller Komponenten um ca. 50%. Auch die Verunreinigungen nehmen im gleichen Verhältnis ab, sind aber noch vorhanden.

Da die Verunreinigungen die HPLC-Analyse nicht stören (siehe Abschnitt 4.5), wird bei weiteren Extraktionen keine Reinigung durchgeführt.

4.4 Überprüfung der HPLC-Methode

In der Tabelle 3 (s. Anhang S.19) sind die HPLC-Ergebnisse der wiederholten Analyse dargestellt. Die Standardabweichung der Stoffmengenanteile beträgt je nach Komponente 0,7-1,0%. Es ergeben sich folgende relative Standardabweichungen für die Komponenten: NC hat eine relative Standardabweichung von 7,0%, für C beträgt sie 1,8%, und für DC 2,5%. Die großen Unterschiede können damit erklärt werden, dass die Komponente C den größten Anteil von etwa 54% im Gemisch ausmacht und deshalb einer großen Peakfläche entspricht. Die Schwankungen der Messergebnisse machen bei dem hohen Wert nicht so viel aus, wie z.B. bei NC. Das macht in diesem Fall nur etwa 10% des Capsaicinoid-Gemischs aus. Entsprechend stärker macht sich eine vergleichbare Abweichung der HPLC-Analyse in der Berechnung der relativen Standardabweichung bemerkbar. Im Diagramm 5 (s. Anhang S.19) sind die Analysenergebnisse für jede Komponente mit der dazugehörigen Standard-abweichung dargestellt.

4.5 HPLC-Analyse der Extrakte

In Abbildung 7 (s. Anhang S.14) ist ein Beispiel für ein Chromatogramm dargestellt, welches vom Kaltextrakt mit der optimierten HPLC-Methode aufgenommen wurde. Die polaren als auch die unpolaren Verunreinigungen, die zwangsläufig aus den Proben mit extrahiert werden, erscheinen nicht im Retentionsbereich der untersuchten Capsaicinoide.

Für die HPLC-Analyse werden zunächst die filtrierten Extrakte verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 (s. Anhang S.20) dargestellt. Bei einigen Proben war allerdings die Gesamtkonzentration der Capsaicinoide oder die Konzentration der Komponente NC zu gering, um sie zuverlässig auswerten zu können. Dies wird in

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der entsprechenden Tabelle rot gekennzeichnet. Die betroffenen Proben werden, wie im experimentellen Teil beschrieben, eingeengt und nochmals analysiert. Die neuen Ergebnisse sind in der Tabelle blau gekennzeichnet.

Extraktionszusammensetzung verschiedener Extrakte

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Jalapeno, rot

Jalapeno, grün

Rocoto

Habanero, gelb

Habanero, rot

Tabasco

Lemon Drop

Aji Picante

Stoffmengen

anteil [%]

DC

C

NC

Diagramm 1: Extraktzusammensetzung verschiedener Extrakte

In Diagramm 1 sind die Analysenergebnisse der einzelnen Chiliproben gegenübergestellt. Wie bereits im Vorfeld vermutet, weisen unterschiedliche Chili-Arten unterschiedliche Capsaicinoid-Zusammensetzungen auf. Die Stoffmengenverhältnisse der drei Hauptkomponenten sind je nach Chili-Art sehr unterschiedlich ausgeprägt. Dies wird auch im Vergleich verschiedener Sorten gleicher Art deutlich. Beispielsweise haben rote und gelbe Habanero eine sehr ähnliche Zusammensetzung mit ca. 85% C, 12-14% DC und 0,8-1,3% NC. Auch die Zusammensetzung der grünen und roten Jalapenos ist vergleichbar. Die Jalapeno-Proben enthielten beide ca. 54-56% C, 12-14% DC und 32-35% NC.

Die Sorte Aji Picante konnte im Vorfeld keiner Chiliart zugeordnet werden und wurde ausgewählt in der Hoffnung, dies tun zu können. Das Capsaicinoid-Gemisch zeigt eine ähnliche Zusammensetzung wie die Sorten der Art Capsicum chinense (z.B. Habanero), allerdings mit höherem Anteil der Komponente DC. Außerdem weist die Zusammensetzung ebenfalls Ähnlichkeit zu der Tabasco-Probe auf, die zu der Art Capsicum fuctenscens gehört. Eventuell handelt es sich um eine Kreuzung der beiden Chili-Arten, dies konnte allerdings im Rahmen dieser Arbeit nicht überprüft werden.

4.6 Gustatorische Untersuchung

Bei der Lokalität des Schärfeempfindens werden Mundraum, Zunge, Hals und Lippen aufgezählt. Die Schärfe wird bei den meisten Proben auf der Zunge und im Hals wahrgenommen. Details zu der Auswertung der einzelnen Proben sind in Tabelle 6 (s. Anhang S.21) dargestellt.

Für die Auswertung der einzelnen Eigenschaften werden die Noten der einzelnen Bewertungen summiert und die Eigenschaften für jede Probe anteilig bewertet. Mit dieser Methode wird die Tatsache ausgeglichen, dass an Schärfe gewöhnte Probanden eher niedrige und ungewöhnte eher hohe Noten vergeben haben. Generell

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werden die Proben überwiegend als beißend empfunden. Allerdings betragen die Anteile der Schärfeeigenschaften etwa ein Drittel. Wie man im Diagramm 2 sieht, lässt sich kein signifikanter Unterschied zwischen den einzelnen Proben feststellen. Weitere Details zu der Auswertung der Schärfeeigenschaften können aus Tabelle 7 (s. Anhang S.21) entnommen werden.

Bewertung der Schärfeeigenschaften

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Jalapeno grün

Lemon Drop

Habanero rot

Habanero gelb

Rocoto

Tabasco

Anteile [%]

langanhaltend

kratzend

beißend

Diagramm 2: Anteilige Bewertung der Schärfeeigenschaften von verschiedenen Chiliproben

Für weitere Auswertungen werden drei Bewertungen als Expertenmeinungen klassifiziert. Zum einen werden unsere beiden Bewertungen ausgewählt, weil wir als Projektleiter das Konzept und das Ziel der Untersuchung kennen. Zum anderen wird die Bewertung eines Probanden ausgewählt, der sich besonders viel Mühe gegeben hat, die Proben sorgfältig zu testen. Die Expertenmeinungen werden sowohl untereinander als auch mit den insgesamt erzielten Durchschnittsnoten verglichen. Auch da können keine Schlüsse aus dem Vergleich gezogen werden, da sich die Bewertungen nicht decken.

Aus der Auswertung geht hervor, dass es sehr schwierig ist objektive Ergebnisse zu erhalten, da die geschmackliche Untersuchung auf subjektivem Empfinden beruht. Während der Durchführung sind Faktoren aufgetreten, die vorher nicht bedacht wurden und die das Ergebnis verfälscht haben könnten. Beispielsweise waren die Proben nicht homogen, so dass die Probanden Stückchen mit mehr oder weniger ausgeprägter Schärfe probiert haben. Außerdem waren die Chiliproben unterschiedlich scharf. Im Vergleich zwischen den Chilis hat es deshalb zu Ungenauigkeiten geführt. Die Proben hätten vorher püriert und mit einem Paprikapüree auf ein Schärfe-Niveau gebracht sollen, so dass sie besser untereinander verglichen werden können. Ein weiterer Faktor war die Einnahme der Proben. Es wird nicht darauf geachtet, dass sie immer auf gleiche Weise verköstigt werden. Die Region, in der die Schärfe empfunden wird, ist somit sehr stark davon abhängig, ob der Proband die Probe beispielsweise länger auf der Zunge hatte oder schnell zerkaut und geschluckt hat.

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4.7 Zusammenhang zwischen HPLC-Analyse und gustatorischer Untersuchung

Bei dem Vergleich der HPLC-Ergebnisse und der Verköstigung wird eine allgemeine Tendenz festgestellt. Je größer die gesamte Peakfläche des Capsaicinoid-Gemischs war, desto höher werden die Chiliproben bewertet. Das bedeutet lediglich, dass die geschmackliche Einschätzung der Schärfe mit der analytischen grob übereinstimmt. Eine Schlussfolgerung von einem linearen Zusammenhang kann gezogen werden, wenn das Bestimmtheitsmaß nahe 1 ist. Dies ist hier allerdings nicht angemessen, da es in diesem Fall nur etwa 0,8 beträgt. Der Zusammenhang zwischen Peakfläche und der Gesamtbewertung ist in Diagramm 6 (s. Anhang S.22) dargestellt.

Leider konnten aus dem Vergleich der Verköstigung und der HPLC-Ergebnisse keine weiteren Schlüsse gezogen werden. Die Vermutung, dass jedem Capsaicin-Derivat eine andere Schärfewirkung zugeordnet werden kann, konnte im Rahmen dieser Projektarbeit nicht bestätigt werden.

5. Zusammenfassung und Ausblick Im Verlauf der Projektarbeit konnten wichtige Erfahrungen gesammelt werden. Die im Vorfeld recherchierten Methoden wurden eingehend erprobt und gegebenenfalls angepasst. Die Soxhlet-Extraktion ist für die Gewinnung der Capsaicinoid-Gemische geeignet, denn die untersuchten Derivate sind hitzestabil. Eine Extraktionszeit von 1,5 Stunden ist optimal, da die Inhaltsstoffe der Proben zu diesem Zeitpunkt größtenteils extrahiert sind und die Anteile der Derivate im Capsaicinoid-Gemisch stabil sind. Bei Verwendung von Ethanol als Lösemittel ist eine Reinigung der Extrakte durch Ausschütteln mit n-Hexan und anderen Lösemitteln nicht umsetzbar, da Ethanol mit gängigen Lösemitteln mischbar ist. Auch eine Aktivkohlereinigung bringt nicht den gewünschten Effekt, da die Verunreinigungen im gleichen Maße wie Capsaicinoide adsorbiert werden. Für die HPLC-Analyse waren die Verunreinigungen nicht störend, da sie nicht im relevanten Bereich eluierten und eine Reinigung deshalb nicht nötig war. Die untersuchten Capsaicin-Derivate ließen sich mit der verwendeten Methode gut und schnell trennen. Die Schwankungen der HPLC-Analyse waren tolerierbar.

Die HPLC-Analyse der Chili-Extrakte zeigte, dass Chilis unterschiedlicher Art eine andere Zusammensetzung der Capsaicinoide haben. Chilis gleicher Art aber unterschiedlicher Sorten weisen Ähnlichkeiten in der Zusammensetzung auf. Damit konnte die im Vorfeld aufgestellte Vermutung bestätigt werden.

Die gustatorische Untersuchung hat nicht zum gewünschten Ergebnis geführt und ist in ihrer Durchführung verbesserungswürdig. Es konnten keine objektiven Erkenntnisse gesammelt werden und damit auch kein Zusammenhang zwischen HPLC-Analysen und gustatorischer Untersuchung hergestellt werden. Den einzelnen Capsaicin-Derivaten konnte leider keine individuelle Schärfeeigenschaft zugeordnet werden.

Die Projektarbeit könnte als Grundlage für weitere Untersuchungen dienen. Zum einen könnten Daten über die Zusammensetzung weiterer Sorten gesammelt werden. Der Aufbau einer Datenbank könnte helfen, unbekannte Chili-Sorten einer Art zuzuordnen.

Des Weiteren könnte die Projektarbeit Ausbildungszwecken dienen. Durch die Verknüpfung verschiedener Labortätigkeiten wie Extraktion und HPLC-Analyse werden Fachkenntnisse anschaulich und praxisnah vermittelt.

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6. Literaturverzeichnis [1] Constanze Hippler - Capsaicinoide in Capsicum-Früchten definierter

Herkunft und ihre Stabilität bei Verarbeitung und Lagerung, Bergische Universität Wuppertal, 2004

[2] Petra Kirschbaum – Capsaicinoide in frischem und verarbeitetem Gewürzpaprika, Bergische Universität Wuppertal, 2002

[3] Harald Zoschke - Das Chili Pepper Buch - Anbau, Rezepte, Wissenswertes, Suncoast Peppers GmbH, Kressbronn, Neuausgabe 2007

[4] Hans-Jörg Behrendt - Vergleichende funktionale Untersuchungen des Hitze-Capsaicin-Rezeptors (TRPV1) und des Kälte-Menthol-Rezeptors (TRPM8) in rekombinanten und nativen Zellsystemen (verwendete Spezies: Mensch, Ratte und Maus), Ruhr-Universität Bochum, 2004

[5] Hisashi Segi, Shuji Yamada, Satoshi Kato, Shoji Murasugi – Method for industrial purification of Capsaicin, United States Patent No. 5.955.631, Gifu-ken, Japan 1999

7. Anhang

Abbildung 4: Botanische Herkunft einiger Chilisorten

Jalapeno, rot*: Capsicum annuum Jalapeno, grün*: Capsicum annuum Tabasco: Capsicum frutescens Lemon Drop: Capsicum baccatum Habanero, gelb: Capsicum chinense Habanero, rot: Capsicum chinense Rocoto: Capsicum pubescens Aji Picante: Art unbekannt

*gleiche Sorte aus zwei verschiedenen Quellen

Liste 1: Zur Untersuchung ausgewählte Sorten mit der zugehörigen Art

Solanaceae

Capsicum

Capsicum annuum

Capsicum frutescens

Capsicum baccatum

Capsicum chinense

Capsicum pubescens

Jalapeno

Tabasco Lemon Drop Habanero

Rocoto Sorte

Art

Gattung

Familie

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Abbildung 5: Strukturformeln der drei häufigsten Capsaicinoide

Abbildung 6: 3D-Spektrum eines Chromatogramms mit einem Capsaicinoid-Gemisch als Eluat

Abbildung 7: Chromatogramm eines Capsaicinoid-Extrakts, hier: Probe aus der

Kaltextraktion einer roten Jalapeno

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Abbildung 8: Ausschnitt aus dem Bewertungsbogen

Tabelle 1: HPLC-Analysenergebnisse eines Kaltextrakts vor und nach dem Kochen

Hitzestabilität des Extraktes

Kaltextrakt Substanz t [min] Area w[%] Nordihydrocapsaicin 13,7 104,9 17,6 Capsaicin 15,2 272,1 45,8 Dihydrocapsaicin 19,3 217,5 36,6

Kaltextrakt nach Kochen Substanz t [min] Area w[%] Nordihydrocapsaicin 13,7 103,4 17,5 Capsaicin 15,3 270,7 45,7 Dihydrocapsaicin 19,3 218,2 36,8

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Abbildung 9: Chromatogramm einer unbekannten Chili-Probe mit vier Peaks von Capsaicin-

Derivaten

Tabelle 2: Zeitprotokoll des Extraktionsverlaufes

Extraktionsverlauf

09:20 Anfangen Heizen 09:35 Temperatur erreicht, anfang sieden 09:50 Temperatur auf 90°C eingestellt 09:55 Kondensadion am Kühler 10:00 Temperatur auf 95°C eingestellt 10:45 Austauschen gegen ein Ölbad 10:50 Anfangen aufzuheizen auf 120°C 11:00 Temperatur erreicht, Rücklauf 11:15 1. Überlauf, Zugabe 25 mL Ethanol, da

nicht genug Badvolumen, Probenahme nach Sieden

11:25 2. Überlauf, Probenahme 11:35 3. Überlauf, Probenahme 11:45 4. Überlauf, Probenahme 11:55 5. Überlauf, Probenahme 12:05 6. Überlauf 12:15 7. Überlauf 12:27 8. Überlauf, Probenahme 12:40 9. Überlauf 12:51 10. Überlauf 13:02 11. Überlauf, Probenahme

17

Anreicherung des Capsaicinoidgemisches im Extrakt

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

1.Überlauf

2.Überlauf

3.Überlauf

4.Überlauf

5.Überlauf

8.Überlauf

11.Überlauf

Gesam

tpeakfläch

e

Diagramm 3: Anreicherung des Capsaicinoid-Gemisches im Extrakt

Extraktzusammensetzung im Verlauf einer Extraktion

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

1. Überlauf

2. Überlauf

3. Überlauf

4. Überlauf

5. Überlauf

8. Überlauf

11. Überlauf

Stoffmen

genanteil [%]

DC

C

NC II

NC

Diagramm 4: Extraktzusammensetzung im Verlauf der Extraktion

18

Abbildung 10: Mischbarkeit einiger wichtiger Lösemittel

19

Tabelle 3: Daten zur Wiederholbarkeit der HPLC-Methode am Beispiel des Extraktes der

grünen Jalapeno

Substanz NC % C % DC % 1.Lauf 14.11.2009 10,5 54,9 34,6

1.Lauf 28.11.2009 9,9 54,3 35,8 2.Lauf 28.11.2009 10,6 54,0 35,4

1.Lauf 09.12.2009 9,5 52,6 34,0 2.Lauf 09.12.2009 9,7 52,7 35,5 3.Lauf 09.12.2009 11,4 52,9 33,7

Mittelwert 10,2 53,6 34,8 Standardabweichung 0,7 1,0 0,9 rel. Stabw. [%] 7,0 1,8 2,5

Schwankungen der HPLC-Analysenergebnisse am Beispiel des Extraktes der grünen Jalapeno

10,2

53,6

34,8

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

Anteile der Komponenten am Capsaicinoidgemisch mit relativer Standardabweichung

Stoffmengenanteil in %

NC

C

DC

Diagramm 5: Schwankung der HPLC-Analysenergebnisse

20

Tabelle 4: HPLC Daten der extrahierten Chiliproben

Substanz t [min] Area κκκκ[%]

Rote Jalapeno NC 13,5 24,7 12,9

C 15,1 106,3 55,5

DC 19,0 60,3 31,5

Grüne Jalapeno NC 14,3 15,6 10,2

C 16,1 85,0 53,6

DC 20,3 57,2 34,8

Rocoto NC 14,3 31,1 22,1

C 16,1 46,7 33,2

DC 20,3 62,7 44,6

Rocoto NC 14,2 427,3 23,1 Wiederholung C 15,8 621,0 33,6

(eingeengt) DC 20,0 799,8 43,3

Habanero Gelb NC 14,0 17,4 1,5

C 16,0 1007,3 86,1

DC 20,3 144,6 12,4

Habanero Gelb NC 13,9 189,3 1,3 Wiederholung C 15,1 12164,7 86,3

(eingeengt) DC 20,1 1739,0 12,3

Habanero Rot NC 0,0 0,0

C 16,0 251,6 83,0

DC 20,2 51,5 17,0

Habanero Rot NC 18,0 0,8

Wiederholung C 16,0 1825,0 85,4

(eingeengt) DC 20,2 294,0 13,8

Tabasco NC 14,3 32,4 4,5

C 16,0 490,1 68,8

DC 20,2 190,1 26,7

Lemon Drop NC 14,3 37,7 5,4

C 16,0 291,0 41,4

DC 20,2 374,5 53,3

Aji Picante NC 14,3 12,5 1,6

C 16,0 606,0 76,4

DC 20,2 174,5 22,0

Aji Picante NC 14,1 24,5 1,2 Wiederholung C 15,8 1550,5 76,7

(eingeengt) DC 20,0 446,3 22,1

21

Tabelle 5: Capsaicinoidverhältnis der Proben

NC % C % DC % Jalapeno, rot 12,9 55,5 31,5

Jalapeno, grün 10,2 53,6 34,8 Rocoto 23,1 33,6 43,3

Habanero, gelb 1,3 86,3 12,3 Habanero, rot 0,8 85,4 13,8

Tabasco 4,5 68,8 26,7

Lemon Drop 5,4 41,4 53,3 Aji Picante 1,2 76,7 22,1

Tabelle 6: Auswertung der Verköstigung: Lokalität, Anzahl der Kreuze der einzelnen Regionen

bei verschiedenen Chili-Proben

Jalapeno grün

Lemon Drop

Habanero rot

Habanero gelb

Rocoto Tabasco

Mundraum 2 0 2 7 1 2

Zunge 13 14 12 12 10 7

Hals 4 8 5 12 3 9

Lokalität

Lippen 0 1 0 1 4 0

Tabelle 7: Auswertung der Verköstigung: Bewertung der Schärfeeigenschaften bei

verschiedenen Chili-Proben

Jalapeno grün

Lemon Drop

Habanero rot

Habanero gelb

Rocoto Tabasco

beißend 1,67 2,17 2,38 3,60 1,59 2,57

kratzend 1,44 1,83 2,25 2,80 1,53 2,14

Durch-

schnitt

langanhaltend 1,50 2,06 2,19 3,73 1,59 2,14

beißend 30 39 38 54 27 36

kratzend 26 33 36 42 26 30

Summe

langanhaltend 27 37 35 56 27 30

beißend 36,1% 35,8% 34,9% 35,5% 33,8% 37,5% kratzend 31,3% 30,3% 33,0% 27,6% 32,5% 31,3%

langanhaltend 32,5% 33,9% 32,1% 36,8% 33,8% 31,3%

22

Zusammenhang zwischen Peakfläche und Gesamtnote

R2 = 0,7987

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

0,00 200,00 400,00 600,00 800,00 1000,00 1200,00 1400,00

Peakfläche

Summe der Durchschnittsnoten

Diagramm 6: Zusammenhang zwischen der gesamten Peakfläche und der Gesamtnote mit

Bestimmtheitsmaß R2