Ältere und neue Versuche zur Herstellung eines trockenen Lyssaimpfstoffes

Aus der Staatlichen Impfanstalt Lind dem Staatlichen Serumpriifungsinstitut in Wien.

Altere und neue Versuehe zur Herstellung e ines t r o e k e n e n Lyssaimpfstoffes.

Von M. Kaiser, Wien.

Mit 7 Abbildtmgen.

I. In den le~tzten Jahren befaBt man sich in verschiedenen biologischen

Laboratorien zunehmend mit der Herstellung yon trockenen biologischen Pr~paraten. Nicht nur deshalb, weft diese Erzeugnisse handlich sind, sondern vorwiegend aus dem Grunde, weft sie voraussichtlich w~hrend einer li~ngeren Zeit ihre biologischen Eigenschaf~en nicht ~ndem.

~ b e r trockene Blatternimpfstoffe ist in diesem Archiv (I, 85; I I , 279, 426, 517) verschiedentlich berichtet worden. Gegenstand der vorliegenden Abhandlung soll die Herstellun!l trockener Imp/sto//e zum Schutze gegen die Lyssa sein. Nur voriibergehend soll auch hier daran erinnert werden, dab $rockene Impfstoffe bis auf den Vater der Impfung Eduard Jenner zuriickreichen, der se ineVacc ine als an Seidenf~den angetrockneten Pusteleiter nach verschiedenen Stellen des Kontinents versandte. Mit

' den 'Aufschwemmungen dieses Eiters sind zahlreiche Impfungen mit bestem Erfolg durchgefiihrt w0rden.

In der Folge bediente man sich wiederholt dieses Verfahrens, um Impfstoffe yon einem Ort zum anderen zu verpflanzen und um sie ak t iv zu erhalten. N~heres darfiber kann in diesem Archly (Bd. I I , S. 279) nachgelesen werden.

An Lyssaimp/sto//en war der Bedaff naturgem~l~ und gliicklicherweise ein wesentlich, geringerer. Voraussetzung fiir die Hersteilung trockener Lyssaimpfstoffe war in erster Linie die Kenntnis yon der Widerstands- kraf$ des Lysuavirus bzw. des Virus fixe gewesen, denn in den Anf/ingen der Lyssaschutzimpfung war die Impfung mi~ abgetStetem V. f.~ noch nicht bekannt.

1 V. f. = Virus fixe. Archiv f. u Bd. III , H. 4.

~74 M. Kaiser:

I n der Fach] i t e ra tu r ~rsehein~ M . P . Van~eer~berghe a~s ~rsver, clef das Lyssavi rus raz~h zu t roeknen versuch~c.

tgr ging yon der Kenntnis bus, da/~ die Troeknung des R/ickenmurkes in Verbindung mit der Einwirkung des Luf$sauerstoffes die Grundlagen fiir das Pavteursche Verfahren der Impfstoffbereitung bilden. Nach 6- -7 Tagen warden die meisten Riickenmarke an der Luft inaktiv. Je diinner die ausge- brei~ete Schicht des Markes ist, desto rascher erfolgt die Trocknung. Auf Fliel~papier ausgebreitetes Virus wird in diinner Sehieh~ in 4 Tagen inaktiv. Trockzleg man eine Probe yon rabisehem H i m sehr ~ e h fiber Sehwefel~ture, so ist die gegroeknete Probe ebenso wirksam wie das frisehe Hirn. Es genagt 4as Troeknen dureh 24 Stunden im Dm~keha. Troekenes H i m kormte in diinner Sehiehg "fber Kal i eaustieum oder Caleiumehlorid mona,telarJg auf- bewahrg warden, obne dag es Sehaden litlb. I m Drmkeha und in versiegelgen oder mi t W a t t e versehlossenen T~ben aufbewahrt , hglt sieh das Virus in seiner urspr/mgliehen S ~ r k e monatelang. Vansteenberghe besag ein Pulver, das 9 Menage naeh der Trepanat ion verimpfg regelm~I3ig am 7. Tage erzeugge~

Aus seinen Beobaehgungen zieht Vansteenberghe bereigs die zul~ssigen Schlfisse fiir die p rak t i sche Nugzanwendung. Leichter Transpor$ auf weite En~fernung, lange Hal~barkeig, leich~es Abwiegen und , E m u i -

g~eren . Einige J a h r e spgger (1908) v e r f f f e n t l i e h ~ Remgwer mi~ 08man

Nouri in derse lben Zeitschrifg (Bd. 64) seine Beobach tungen an get roek-

ne tem V. f . E r konnte fest.stellen, da~ die Wirkung des Eingrocknens der tgtieken-

marke (g.) unger dam Einflul3 der Por in der ~gariottsehen Flasehe, wie sie Pavteur publizierte, die Virulena des N. beeingr~ehgigt, indem am 5. oder 6. Tag die fiber der Pog~asehe aufgeh/~ngten tg. ihre Vr verloren, w/ihrend sieh unter denselben Verh/~ltnissen, also bei 28 ~ aber bei leiehtem Luftzug aufbewahf~e R. noah am 7. und 8., manchmal sogar am 9o Tag virulent zeig~en. ,,L'aegion a~t~nuante de la dessieation ~ l 'aide de ia potasse esg done bien r6elle."

In einem wei~eren Versueh wurde die Poggasehe dureh Schwefels~ure erser das Resul~at war das gteiche. In einem drit~en Versueh brei~e~en die Aui:oren, dem Beispiel Van~teenbe@es Iolgend, Hirnbrei in d/inner Sehiehg aus and groelmegen ihn mit gleichem Erfotg fiber Po~asehe wie fiber Schwefel- s~ure.

Ob die Trocknung fiber Sehwefels~ure oder fiber Po t t asche erfolgt , oder n u t , , a s saul con tac t de Fa i r " , das pulver is ier te R. is t ]edenfatls inak t iv , wenn die Dauer der Trocknung 24 S tunden fibersch~eitet. Es scheint, dab die E r h a l t u n g der Vkulenz vor ahem anderen yon der Rasch. heir des Trocknens abh~ngig ist. ,,On peu t supposer, semble- t - i | , que la dessieat ion, ag lssan t tr~s r a p i d e m e n t sur les cellules nerveuses & l ' in t~r ieur desquelles so t rouve le microbe rabique, ]es r a t a t ine en quelque sorte et. |as t rans forme en une gangue pro tec t r iee au mil ieu de laque]le les germes sont '& l ' ab r i des agents d ' a t tdnua~ ion? ' Die A u to re n warren d a n n die F rage auf, ob es mfg l i eh sei, da raus eine prak t i sehd N u tz a nw e ndung ffir die I m p f m e t h o d e naeh H6gyes zu ziehen und g lauben die F rage vet-

Versuche zur Herstellung eines trockenen Lyssaimpfstoffes. 175

neinen zu miissen. Sic konnten es selbst in den allergfinstigsten Fs niemals beobaehten, dab das getrocknete Markpulver seine Virulenz fiber drei Monate hinaus erhalten h&tte. Die damit subdural geimpfte n Kaninchen gehen mitunter n icht an der klinischen paralyt.ischen W u t zugrunde, sondern infolge einer Kaehexie ohne Paralyse, deren wahre l~atur erst dureh Tierpassagen aufgekl&rt werden kann. Remlinger h~lt es nicht fiir ausgeschlossen, dab diese Erscheinung die Folge einer schw&- cheren Immunisierung ist.

ff-larvey und McKendrick (cir. bei D. L. Harris und L .F . Shackeil, siehe Literatur) bringen in ihrer Arbeit (1911) eine Kurve, die zeigen sell, dab die Infektios{t&t eines rabischen Hirns sehr eng mit dem Gewichts- verlust bei der Trocknung zusammenh&ngt. Sie schliel~en daraus, dal~ in dem troeknenden H i m nicht genfigend Feuchtigkeit zuriiekbleibt, um es infektiSs zu erhalten.

Tats~ehlich liegen die Dinge aber anders, wie Harris und Shac]cel]~ richtig annehmen. Ihre eigenen Versuche bereehtigen die beiden Au~oren zur Oberzeugung, dal3 es die Art der Wasserentziehung is~, welche die Virulenz be elntrs und n,:cht derWasserentzug an sich. "To sta4e it differently, slow dessieeation attenuates and destroys the virus directly by reason of the concentration of salts and other substances which are in solution in the brain and cord. The action is therefore, in essence a ehimieal one."

Ist diese Annahme richtig, daim sind Vansteenberghes und Maries Erfolge und MiBerfolge leieht zu erklKren. Diese Autoren empfehlen, das R. mSglichsf diinn auszustreiehen und rasch unter Vakuum zu bringen. E in rasch einwirkendes Vakuum l&f~t geringe Mengen vofi Wasser frieren, und der Erfolg, der sich damit erzielen l~Bt, ist auf das rasche ~rieren ohne Konzentration der Gewebss~fte zurfickzuffihren. Eine Stfitze bekam diese Annahme dutch den Versueh, vollkommen troekenes Material auf einige Stunden der gewShnliehen Luft auszusetzen. Das Ergebnis war ein vSlliger Verlust der Virulenz. Die yon der Trockensubstanz gierig aufgenommene Feuehtigkeit genfigt voUkommen, um die vorhandenen Salze und andere 15sliche Substanzen in konz. LSsungen zu verwandeln, die das in den Zellen eingesehlossene Virus abzut6ten verm6gen.

Es ist aus den Arbeiten tier genannten Autoren nicht ersichtlieh, ob sic sich in :Lhrer Auffassung fiber die Form des Virustodes yon den Arbeiten der Botaniker Gorlce und Lid]ores beelnflussen liel~en, die bereits friiher {1906, 1907) eine derartige Begriindung fiir den Zelltod beim Erfrieren und Trocknen (siehe Literatur) verSffentlich~ haben.

H. Mie[3ner machte als erster pral~tischen Gebrauch yon der Kenntnis der Hal t '~rkei t des trockenen Virus fixe, das er ffir Tierimpfungen ver- wendete. Sein Impfstoff, den er sp~ter , ,Lyssin" nannte, wurde bei

176 M. Kaiser:

niederer Tempera tu r im Faust-Heimschen App~ra t m6gl iehst schnei l ge t rocknet . Die Versuehe mi t diesem P r e p a r e r ergaben, dal~ es wenigstens einen Monat lang seine volle W i r k s a m k e i t beh/ilt . Mieflner knfipf te a n diese Fes t s te l lung die Hoffnung, dab es ebenso wie mi t fr ischem K a n i n c h e n m a r k auch mi t dem ge t rockne ten ,,Lyssin" gelingen miisse, bei en t sprechender Dosierung und A p p l i k a t i o n einen Sehutz gegen Tollwu~ zu erzeugen. Vor dem frischen V. f. (Kaninchen) zeichne es sich durch groi~e H a l t b a r k e i t und bequeme VersandmSgl ichkei t aus, Auch k6nne man sich yon Lyssin gr613ere Vorrgte anlegen.

Behufs Herstelltmg seines Pr~parats wird das unter iibliehen Vorsichts- raai~nahmen entnomm6ne Hirn-Mark (H.M.) im M6rser rein zerrieben, mi t nieht allzuviel physiologischer Kochsa]zl6sung aufgesehwemmt und auf groI3en Emailsehalen in etwa 1/~ cm hoher Schichr in den Schnellabdampf- appara t gesSellt. Meist gelingt es nach 24 Stmlden, eine troekene Masse yore Boden der Schalen abzukratzen, die im M6rser zu Pulver zerrieben und m zugeschmolzenen R6hrchen attfbewahrt wird. Im Gebrauchsfalle liiBt sich die erforderliehe Menge leicht abwiegen und, mi t physiologischer L6stmg verrieben, injizieren. Zum Erstaunen des Autors, dem offenbar die Versuche der oben angeffihrten Autoren unbekannt waren, hat te das auf die beschriebene Ar t bereitete Pr~parat noch naeh 14 Tagen bis 3 Woehen seine voile Virulenz erhalten, ja es gelang Mieflner sogar, mit einem 7 Wochen lang aufbewahrten Trockenimpfstoff Kaninchen subdural zu infizieren. Bei l~ingerer Aufbewahrung nahm die Virulenz etwas ab, so dab die Versuehstiere erst mach einer verl~ngerten Inkubat ion erkrankten.

In sp~teren Versuchen gemeinsam mi t Kliem und Kap]bvryer (1913) wird neuerlich auf die Vorteile des Pr/iparats aufmerksam g..emaeht und besonders die Notwendigkeit der rasehen Troeknung betont. Uberdies wird auf die Unm6gliehkeit einer nachtr~gliehen bakteriellen Infekt ion hingewiesen.

,,Die naeh 10, 21, 36 und 52 Tagen mi t getrbei~netem Riiekenmark bzw. Gehirn subdural infizierten Kaninehen starben genau so sehnell, als wenn sie mit frischem Material infiziert worden wiiren, trod es scheint hiernach da~u Tollwutvirus durch den Austrocknungsprozel~, soweit die bisherigen Versuehe ein Urteil dar(iber zulassen, nieht gelitten zu haben."

I n einer Mit te i lung aus dem J a h r e 1912 ber ichte te Harris, daft de r Ante i l der Virulenz naeh erfolgter Trocknung 1---2~ des urspri ingl ich vorhandenen Wer te s betrage. I n sp/~teren Unte rsuchungen zeigte es sich nun, da~, je rascher und durchgre i fender das Mater ia l gefroren wird, des to gr63er der Ante f l der nach dem Troeknen verb le ibenden Virulenz sei.

Wi rd Rabiesv i rus in CO~ gefroren und ohne dal~ es au f t au t , ge t rocknet , so k6nnen 3 0 - - 5 0 % der Originalvirulenz erh~l ten bleiben. Ber i ieks icht ig t man den Gewiehtsver lus t yon 6 0 - - 7 0 % beim Trocknen, so en thg l t das t rockene ]~iickenmark soviel v i rulentes Mater ia l wie das frisehe.

Die vom Autor angegebene 5~eth0de ist nicht gerade leieht durehzufShren ~md gelingt sicher nicht beim ersten Versuch. H i m trod Mark werden im Porzellanm6rser unter tropfenweisem Zusatz yon Wasser bis zu einer dicken Paste verrieben. Dann wird CO2-Schnee in geringen Mengen zugesetzt und das Ganze fest verrfihrt. Das Frieren erfolgt sehr rasch und, wenn es komplett,

Versuchc zur Herstel lang eines trockenen Lyssaimpfstoffes. 177

ist, ist das Gemenge spr6d und leicht zu e inem feine*n Pu lve r zu verreiben. W i r d das H . M . m i t flfissiger Luf t verr ieben, so beh~lt es seine originale Infekt ios i t~t . Die A~ffbewahrung des Materials, das vo l lkommen pulver is ier t ist, erfolgt in e inem Seheiblerexsiccator , der halb in eine Salz-Eis-Mischung ge tauch t ist, u m ganz ka l t zu werden. E i n Gefi~B m i t H~SO 4 wird dann i~ber das Pu lve r auf ein Drah tne t z gestellt , so dab die Feueh t igke i t v o m Pu lve r aus zu der ]-I~SO 4 freien Zu t r i t t hat . Das Vakutun soll mindes tens 2 m m Hg bet ragen.

W~hrend der Trocknung soil die T e m p e r a t u r n ieht fiber 15~ steigen.' Das Gef~B muB m a n einige Male im Tag drehen trod schwenken. E in einzelnes H i m t rockne t in 36 bis 48 Stunden. Die I-I~SO4 mul3, wenn m e h r Wasser zu en t fe rnen ist, einige Male gewechsel t we~den. .&us diesem Grunde t a u c h t m a n d~n Exs ieca to r in ein anderes Gef~]~, das eine Salz-Eis-Mischung von - - 1 5 ~ enth~lt , 6ffnet den Exs icca to r l ind t auscb t die Schwefels~ure arts.

Die gu te Pulver i s ie rung bezweekt : 1. E ine bessere Mischung, so dab das Virus besser ver te i l t ist, und 2. eine bessere T r o c k m m g und leichtere U b e r t r a g u n g in kleinere Beh~lter ,

die zugeschmolzen werden k6nnen. Die ~ b e r t r a g t m g in kleine Tuben mu~ in einer v611ig t rockenen Atmosphe re erfolgen, i ndem das Gef~l~ m i t einer G u m m i h a u t abgedich te t wird. I n diese H a u t wird ein Loch gemacht , durch welches die Glas tuben eingeffihrt und geffillt werden. W e n n der Durchmesser der Tuben 4 m m betr~gt , so entspreehen jedem Mil l imeter H6he ungef~hr 2 m g Pulver .

Versuche haben ergeben, dab yon dem get rockneten P u l v e r m a r k n ich t m e h r als a]55 m g n6t ig shad, u m eine Para lyse be im Kan inehen in 6 - - 7 Tagen zu erzeugen. Die D. 1. m. be t rug 1/200 rag. Das Mater ia l mul3te mindes tens dureh 7 Tage berei ts t rocken sein.

I n t roekenem Mater ia l an e inem kfihlen dunklen Ort bei 8 - -10 ~ C, frei yon Feueh t igke i t , aufbewahr t , hiilt s i eh das Virus gu t ; es ver l ier t seine Virnlenz sehr langsam. Es ist nach 142 Tagen v i ru len te r als ein l~ulver naeh 2 Tagen, wenn es nach Pasteur behande l t wurde.

I n e inem dr i t t en Aufsa tz fiber denselben Gegenstand k o m m t D. L . Harris (1913) auf seine Arbe i t m i t Shaclcell zurfiek und betont , dai] Harvey und McKendrick die Infekt ios i t / i t des fiber K 0 t t bei 2 3 ~ ge t rockne ten 1%. in zahlre iehen Versuchen gepri i f t haben. Die M. I . D . yon ]rischem 1%, Kaninchen subdura l verabre ich t , be t rug 0,025 rag. E in 1 Tag altes 1%. ha t als M. I . ]3 .0 ,05 rag, ein 2 Tage altes 1%. ist 8real schw/icher (M. I. D. 0,2 rag), ein 3 Tage al tes 1%. 4 0 m a l schwi~cher (M. I. D. ~ 1 rag), ein 5 Tage altes 1%. 80mal (M. I . D . ~ 2,0 rag), ein 9 Tage altes 1%. ist prakt isch nicht mehr infekti6s.

Viel besser ist es u m das getrocknete 1%. bestell t , wenn m a n es in t rakraniel l e inspri tzt . Es v e r m a g in einer Dosis yon 0,004 mg ein Kan inchen m i t Erfolg zu infizieren und 1)aralysen zu erzeugen. Da 75O/o des Gewichtes des frischen Hi rns be im Troeknen ver lorengehen, entspr icht das einer Menge von 0,025 • ~/a = 0,016 mg. Die M. I. D. ist somit e twa zwei Dr i t t e l jener des fr isehen Materials. l~ach 21 Tagen ver l ier t es die Hfilfte seiner Infektiosit~it, wenn es frei yon Feuch t igke i t in verschlossenen Tuben gehal ten wird. Seine M. I. D. ist also 0,008 mg. N a c h 50 Tagen betr/~gt sie 0,01 mg, nach 100 Tageu 0,02 rag, nach 200 Tagen 0,05 mg, nach 500 Tagen 0,1 mg.

F i i r die Prax is werden 10 m g Mater ia l m i t 10 ccm physiologische L6sung , ,emnlgier t" , die allm~ihlieh zugesetz t werden. Das gibt eine Verdi innung yon 1 nag a u f 1 ccm, yon we]cher aus die b6heren Verdf innungen angelegt werden. 1/1 o ccm der Verdf innung wird in das H i m , nach Behand lung m i t

178 ~L Kaiser:

der Trephine, mit einer feinen Nadel bis auf die Basis oder in den Seiten- ventrikel eingespritzt. So geht nichts verloren. Nach 3 Wochen hat das Trockenmaterial eine Infektiositi~t, die g]eich ist tier des frischen R. Nach 50 Tagen ist es um 25% infekti6ser als dieselbe Menge eines 1 Tag alten R. Nach 200 Tagen ist die Infektiosit/~t gleich jener eines 2'Tage alten R. Nach 500 Tage~ ist e,~ 21/2ma[ so infektiSs wie ein 3 Tage altes R.

Die eben angef i ihr ten Versuche wurden mi t V a k u u m m a t e r i a l gemacht . Eine weitere Probe wurde mi t Mater ia l bei no rma lem Att i vorgenommen. H~ l t man jede Feuch~igkei t gb, so ist kein Unferschied im Virusschwund zu konstatieren~ ob m a n nun mi t oder ohne V a k u u m arbei te t . Die geringste Feuchtiglce~t zerstSrt die In/elctiositdt 8o/ort.

Als einen Vortei l des Trockenvi rus bezeichnet der Autor , daI] das Virus durch das Trocknen soweit geschi~digt ist, daI] es n icht mehr .~nfekti6s ist, aber noch geeignet , An t ik6rpe r und einen gewisse.n Grad yon Immunit /~t zu erzeugen. Derselben Ansicht sind, wie der Autor bemerkt , auch andere Forscher . So meinen Harvey und McKendrick: "The immuniz ing power of a g iven por t ion of rabies cord is a funct ion of the r e m n a n t of rabies virus which is conta ined in t h a t cord ."

I~-ach Auffassung yon .Harris gibt es kein Mit te tding zwischen e inem , l e b e n d e n " oder immunis ie renden und e inem , t o t e n " oder n ich t immuni - s ierenden Sta tus . Alle Mitre1, welehe Keime ab t6 ten , zerst6ren auch ~hre immunis ierende Fs Desha!b ist die beste und sicherstc Methode, Vaeeinen zu pr/~parieren, diejenige, welche die Infektiosit/~t mi t dem ger ingsten Grad an Ver/ inderung der an t igenen Eigenschaf ten zerst6rt .

Remlinger stel l te im J a h r e 1919 lest , dab ein mi t V . f . inficiertes Gehirn, das in Athe r ge taueh t wird, al lm~hlich seine Virulenz verl ier t , die oberfl,!~ehlichen Schichten nach 60 S tunden ira Mittel , die zent ra len nach 120. Diese ~ a d u e l l for t schre i tende Seh~digung durch den :4ther l~St sich leicht nachweisen.

Die av i ru len t gewordenen Hirne s ind imstande , auf andere Tiere ver impf t , ihnen eine , so l ide Immuni t i~t" zu verleihen.

Nach Vorversuchen an Kaninchen und Meerschweinchen sollten gras- fressende Tiere geimpft werden. Vier Ziegen wtu'den fiir diesen Zweck mit t0 ecru einer Aufschwemmung yon Stral]enwuthirn tier in die Naekenmusku- la tur geimpft. 2 davon erhielten nach 24 Stunden den Atherimpfstoff, 2 dienten als Kontrolle. Die Impfung war yon Erfolg begleitet. In weiteren Versuehen wurden noeh 5 Ziegen geimpft, und zwar 2, 3 und 4 Tage post infeetionem. Aueh hier war der Schutz ein entsprechender. RemIinger glanbt das Verfahren f~r Rinder und Pferde empfehlen zu dfirfen, indem man ihnen 2 oder 3 ganze Kanh~ehenhirne einspritzt, die 70--75 Stunden ~mter :4ther gestanden sind. Der genannte Autor m6chte aueh die Aufmerk- samkei~ der praktischen ~%zte auf diese Ar t der Impfung lenken.

Angeregt dureh die .4xbeiten yon Vincent und Fornet, die ~ t h e r ffir die Behand lung yon vi rushal t igen Rohstoffen benutz ten , versuchte

Versuche zur tIerstellung eines trockenen Lyssaimpfstoffes. 179

A~ivisatos (Dtsch. reed. Wschr. 1923, Nr. 9) den Ather fOx die Zubereitung :yon Lyssaimpfstoffen auszunutzen. Er hatte, wie aus seinen Versuchen hervorgeht, nicht, die Absicht, das Virus durch ~ther abzutSten; er betraehtete die virustStende Eigenschaft des ~thers sogar Ms Nach_teil, denn er verwendet das V. f. enthaltende Him des Kamnchens an Stelle des Rfickenmarkes, in dem wegen seines geringen Umfanges das Virus durch den ~ther ,,in wenigen Stunden ganz abgetStet wurde". Bei Verwendung yon Hirn an Stelte yon Mark stent er lest, ,,dab der ~ther je n~ach der Zeit seiner Einwirkung das V. f. gar nicht sch~digt oder nur abschw/~cht oder ganz abtStet". •ach 120stiindiger Einwirkung des .'~thers war das H im nich$ immer virulent, und endlich war das Virus nach 140stiindigem Eintauchen sicher vernichtet.

Alivisatos scheint sich jahrelang mit diesen V~rsuchen beschs zu haben, denn er berichtet, ,da.B in der Zeit der Abwartung der Resultate dieser Experimente" Remlinger (I919) seine Versuche, Ziegen mit V.f. zu behandetn, verSffentlichte.

Es ist begreiflieh, dal~ Alivisatos die yon Remlinger an Tieren unter- nommenen Versuche nicht ohne weiteres an Menschen ausprobieren; sondern erst vorsiehtig tastend vorgehen wollte. Aueh schien es ihm zu gewagt, die Einverleibung des Impfstoffes beim Menschen auf einmal vorzunehmen, wie es Remlinger bei Tieren tut.

Auf Grund seiner Versuche kam Alivisatos zu einer neuen Art der Zubereitung des Impfstoffes fox den Lyssaschutz. , ,~an befreit das Him (Virus fixe) yon seinen H~uten, man wiegt es genau ab und taueht es in sterilisierten (Histologie-) Gl~schen in J~ther ein. Dann verbleibt es, je nach der gewiinschten Wirkung, 84 bis zu 72 Stunden, dann wird es herausgenommen, auf sterilisierten Platten zerkleinert und zur Verdun- stung des ~thers eine Stunde ]ang unter der Glecke gelassen. Nun wird es in Porzellanschalen mit MSrser gut verarbeitet (wobei der Ather ganz entfernt wird) und in KoehsalzlSsung bis zur Verdfinnung 1:20 des urspriingHchen Gewiehtes aufgesehwemmt.":

Weitere Beobachtungen fiber den EinfluI3 des Trocknens verSffentlichte t~emiinger im Jahre 1923. Sie bewiesen ibm die abnehmende Widerstands- kraft des rabischen Virus im Laufe der tiber einige Jahre sich hinziehenden Ver- suche. So wurden die Markproben frfiher (1913) am 6., seltener am 5. oder 7. Tag avirulent, undes gelang nach Injek~ion yon 0,5 cem einer Aufsehwem- mung yon i ccm des R. in 5,0 ecru physiologiseher LSsung niemals, innerhalb dieses Zeitraumes mit dieser Aufschwemmlmg Tiere krank zu maehen. Mit Rfiekenmark, das 4 Tage getrocknet wurde, gelang es in 7 F~llen yon 15, Tiere krank zu maehen; die Versuche mit einem Dreitagemark waren alle positiv.

Die Virulenz schwand in diesen Versuehen (1923) ,,brusquement". ,,Une moelle tuait, oune tuait pas." Wenn es tStete, dann gab es keine Differenzen hinsichtlieh Inkubation und des klinischen Bildes gegentiber der Krankheit, die dureh frisehes Virus erzeugt wird,

180 M. Kaiser:

Die yon Remlinger fiir die veterin/~re Prax i s s tudier te und yon Alivi- satos in die P rophy laxe der menschl ichen W u t f iber t ragende Anwendung von ~ttherisierten Impfs tof fen versuehto Hempt 2 durch ein Rapidver/ahren abzuk i i r zen (1925), wodurch die durch Wochen sich hinziehende Be- hand lung mi t zahlre ichen kleinen Einzeldosen ffir die Impf l inge wesentl ich er t r~gl icher ges ta l t e t werden sollte, und bewegte sich in einer R ich tung , die berei ts yon Schweinburg eingeschlagen wurde.

Es is t in te ressant festzustel len, dab Hempt in dieser seiner e rs ten Arbe i t einen Impfs tof f empfohlen hat , dessen Erreger sich auf der vom Auto r angenommenen , n ich t ganz scharfen Zone zwischen Leben und Tod zu hal ten schienen. , ,Dans le cas de ] ' $ the r , en t re l ' a t t dnua t i on voulue e t la per te complete de la vi rulence il y a un dcart suffisant que pe rme t de res ter dans les l imites de l ' a t t 6nua t i on op t imum, l imites que l 'on ddpasse si facf lement lorsqu' i l s ' ag i t de vaecins phdniquds."

I n e ine r spi~teren Arbe i t (1928) tefl t Hempt mit , dab er zwei Ar ten yon Impfs to f f en , eine schwi~chere ,,Markvaccine" und eine s t~rkere ,,Hirnvaccine", herstel l t , die nach peinl iehster Verre ibung des Rohmate r i a l s in e iner Kochschen K a m m e r durch langsamen t ropfenweisen Zusa tz yon physiologischer LSsung zubere i te t werden, naehdem der Rohs tof f (Hirn, Mark) einer besonderen ,,Abschw~ichungstechnik" unterworfen worden war.

Hirnh~tute und Gef~tl3e werden in einer'sterilen Dunkelkammer entfernt und das Hirn nach ErSffnung der Ventrikel und nach mehreren Einschnit ten in das Mittel- und Kleinhirn sowie nach breiter Aufklappung und mSglichst flacher und gleichmiit3iger Aufrollung der Grol3hirnhemisph~ren auf einem Drahtgestel l in ein zylinderfSrmiges, zur H~lfte mi t Aether depuratus gefiilltcs Standgef~tf3 aus dunklem Glas gebracht, alas nach hermetischem Verschlul~ in den Eiskasten gestellt wird. Die Marke bleiben 72 Stunden, die I-Iimae 96 Stunden unter J~ther und werden dann in dunkle Beh~lter eingelegt, die 30% neutrales Glycerin, 70% aqu. dest. und einen Zusatz yon 1% Phenol enthal ten.

, ,Derartig pr~parierte V.f . -Sor ten erweis, en sich aueh nach subduraler Inokulat ion als voUkommen avirulent (tmterstrichcn yore Referenten), behatten aber t rotzdem ihre volle immunisatorische Wirksamkei t bis zu 40 Tagen, wahrscheinlich auch l~nger."

Angenommen, da2 diese vollkommene Avirulenz den Tatsachen entspricht, ist es nieht ohne weiteres einzusehen, aus welchem Grunde die Verarbeitung in einer , ,Dunkelkamrner" erfolgt, weshalb ,,dunkelgla~uige Beh~lter" ftir die Aufbewahrtmg unter ~ the r und for das Ei~legen in Carbolglycerin verwendet werden, und warum das ganze Verfahren, welches eine vollkommene Avirulenz erzielt, eine ,,AbschwKchungstechnik" genannt wird.

Nach dem bereits oben beschriebenen Verreiben des eingelegten Roh- stoffes wird der Brei im Verhaltnis 1:120 (Mark) und 1:60 (Hirn) verdiinnt,

2 Vergleiche hierzu: A. Hempt, Zwanzigj/ihrige Ergebnisse des abgekiirzten W'utschutzimpfverfahrens beim Menschen. (Arch. Vim~sforsch., Bd. I I I , S. 111, (1943)]. Der Herausgeber.

Versuche zur Hcrstellung eines trockenen Lyssaimpfstoffes. 181

~md es werden grSi~ere BrSckel yon Impfstoff durch Gaze-Watte-Filtration ausgeschaltet.

Von Alivisatos weicht Hempt in einem recht wesentlichen Punkt ab. ~u es den Tatsachen entspricht, dab so groBe Mengen yon Hirnsubstanz (8--10 g), wie sie Alivisatos benutzt, zur Erreichung eines Schutzes gegen Lyssa nicht nStig sind, dab sich vielmehr der gleiche Grad yon Immuni t~t mit geringeren Mengen desselben Impfstoffes erzielen l~I~t, so mug folgerichtig, wie es Hempt annimmt, die bessere Wirksamkeit der :~thervavaccine in einer anderen Eigenschaft gesucht werden als in der Virus- oder Nervensubstanzmenge.

Hempt glaubt, daI3 der Erfolg yon dem Grade der )~therisierung ab- h~tnge: ,,Je intensiver die ~therisierung - - um so hShergradig die Ent- fettung der Him- und Marksubstanz. Die iibrigbleibenden Protein- kSrperbestandteile, die das V.f . enthalten, werden dadurch auI~er- ordentlich hydrophil und geben bei sorgf~ltiger Verreibung und all- mii, hticher Dilution in physiologischer Kochsalzl6sung viel teiner disperse Aufschwemmungen als native oder andere wenig bzw. gar nicht ent- fettete Sorten. Durch die ~therisierung wird demnach die das V.f . enthaltende Nervensubstanz derart physikaliseh aufgeschlossen, da~ sie yon der Subcutis aus leiehter und schneller als andere antirabische Vaccinen aufgesaugt werden kann. Dadurch wird ein beinahe unmittelbar nach der Inokulation einsetzender Impuls zu kr~ftiger und rascher SchutzkSrperbildung gesetzt. Nur so ist es zu erkl~ren, dab wir bereits 14 Tage nach der ersten Einimpfung einer 72stiindigen, ~therisierten Vaccine das Auftreten rabizider Substanzen im Blute der Schutzgeimpften nachweisen konnten, und daI~ man nach Verli~ngerung der Atherisierungs- dauer auf 90 Stunden, schon am 10. Tage nach Beginn der Schutzimpfung bei der Mehrzahl der Behandelten derartige Substanzen finden kann (Pereira), die in vitro das gleiche oder doppelte Quantum einer frischen 1% igen V.f .-Emulsion neutra]isieren kSnnen. :Nach Verli~ngerung der :~therisierungsdauer auf 96 Stunden konnten wir infolgedessen etappen- weise mit der Dosierung heruntergehen. Es sind demnach Ver~nderungen des physikalischen Zustandes, welche die Athervaccine yon anderen antirabischen Impfstoffen unterscheidet und ihre besondere Verwendbar- keit zu einem rapiden Sehutzverfahren hervortreten ls

Es war yon vornherein nicht leicht erkl~rlich, aus welchem Grunde die ~therischen Impfstoffe, die doch nur abgetStetes Virus enbhalten sollten, noch einer weiteren Carbol-Glycerin-Behandlung unterworfen werden muBten. Es mu~te dies offenbar eine yore Autor fiir nStig gehaltene Sicherung gegen die mitunter ungenfigende Wirksamkeit des Athers sein. Tats~,chlich macht Hempt die Bemerkung, dab es ihm ,,wiederholt gelungen sei, mit 24- und 48stiindig &therisierten, manchmal sogar mit 72stiindigen Marken Kaninchen v o n d e r Dura aus zu infizieren.

t82 M. Kaiser.:

Um diese Sorten vol lkommen inoffensiv zu gesta]ten, lassen wir sie deshalb noch zirka 3 Wochen i n Carbol-Glycerin ablagern."

Fiir die in unserer Ansta l t un~ernommenen, sparer zu e rws Versuche waren obige Angaben r iehtunggebend, weshalb n~her auf sic eingegangen werden muBte.

Pereira da Silva ist als Aut0r, der mi t _~thervaecinen arbeitete, bereits vori ibergehend erw~hnt (siehe oben) worden.

Er land, dab die Haltba'rkeit der rabiziden Substanzen im Blute mit der Zahl der Eins~)riczungen der ~thervaccine zunimmt. So waren nach 5 In- jektionen diese Substanzen binnen 42 Tagen aus dem Blute versehwtmden. Nach t0 Injektionen traten sic sofort nach der letzten Einspritzung sehr reich- lich im Blute alff und waren am 105. Tage noch da, in einer dritten Beobach- tung sogar nach 170 Tagen. Spritzt man 20real, so ist dam § Verm6gen noch starker als in den erw~hnten F~llen, wird aber diesen am 127. Tage gleich.

ObwohI zwischen dem Auftreten rabizider Substanzen und der vorhandenen Immunit~tt kein Zusammenhang besteht (Schweinburg), so ist es doch be- deutsam, daI3 im Blute das Auftreten derartiger Substanzen durch die Zahl der Injektionen beeinflul3t werden kann.

I n e i nem gewissen Gegensat~ zu den Ather lymphen steht die ,,Lipo- vaccine" yon Bore/ago Gonsalves (1926), der die fettl6sliehen Substanzen aus seinem Impfstoff n ieht nu r n ieht auszog, sondern ihn sogar mi t phenolisiertem OlivenS1 und L a n o l i n homogenisierte. Wiinschenswert sehien es Botofago, die Beh~ndlung der gef~ihrdeten Person mit einer einzigen Impfung zu erledigen, und dami t die Prophylaxe auf die denkba r

kiirzeste Zeit einzuengen.

Die Vorteile, die damit erzielt wurden, gebe ich wegen des Interesses, das an das gesteci~te Ziel gebunden ist, im Originaltext wieder:

,,Nous pourrons ainsi r6sumer les avantages pr6sent~s par le lipovaecin sur tous les autres vaccins antirabiques:

1 ~ On peut employer avec le lipovaccin, une quantit6 plus grande de virus dans chaque inoculation: l 'innocuit~ est eomplSte.

L'inoculation de 1,5 ~ 2 gr. de substance c~r~brale contenant le virus fixe, l 'huile rendant l 'absorption du virus plus lente, remplacerait une vacci~ na t ion continue par petites doses.

2 o Le virus rabique peut 6tre conserv~ /~ ]a glaci6re pendant trois reels, la substance nerveuse ~tant immerg~e dams l'huile d'olives ph6niqu6e h 0,5 p. 100, sans subir une alt6ration sensible dans sa virulence et sans que s'accroisse le nombre des germes de contamination.

3 o La technique que nous proposons ci-dessous comporte une manipula- tion trSs simple, ce qui est bien important quand on dolt faire un grand nombre d'inoculation~.

40 Le lipovaccin peut servir pour l ' immunisat ion humaine; son emploi simplifie beaucoup le proe~dd actuel, et r6alise une ~conomie de temps et de mat~rie!.

Technique pour la prdparation du lipovaccin antirabique : a) On triture dans un merrier, jusqu'& obtention d 'une p&te bien homogSne,

1 & 2 gr. de substance c6r~brale ou m~dullaire, fraiehe ou conservbe darts l'huile d'olives ph~niqu~e ~ 0,5 p. 100.


b) Cette p~te est additionn~e de 0,5 ~ 1 gr. de lanoline, pure et on homo- g~nsie une fols encore.

c) On ajoute 2,5 ~ 5 c. c. d 'huile d'olives purifi~e et on m~lange bien. La quantit~ de substance inocul~e est variable avec le poids de l 'animal .

Boto/ago seheint an die Anlegung eines subeu tanen Depots y o n Impfs to f f gedach t zu haben, ~hnlich wie wir es heute mi t versch iedenen Impfs tof fen tun, und versuch t zu haben, ihn in gewissermaBen f rak t io - n ie r ten Dosen durch einige Zeit h indurch zur Vi rusabgabe zu veranlassen .

Es is t mi r n ich t gelungen, wei tere Arbe i ten des Autors zu f inden, die s i eh mi t der Anwendt ing seiner Lipovacc ine a m Menschen befal~t h~t ten . Jedenfal~s ist bier ein Weg au/gezeigt, der nochmals beschritten werden 8ollte, bevor er endgi~ltig verlassen wird.

P. Remlinger, S. Palmovitch und J. Bailly pr i i f ten (1931) die Ather- resistenz versehiedener Lyssav i russ t s Sic fanden, dal~ ein e twa 8 g schweres H i m nach 120--125s t i ind igem Aufen tha l t im ~ t h e r in seinen t iefs ten Sehichten av i ru len t ist, ~ e n n m a n 0,5 ccm einer 1% igen Auf- schwemmung einem Kan inchen un te r die Dura spr i tz t . Beim Meer- schweinehen spr i t z t m a n nur 0,2 ccm; das Hi rn wird ers t nach 130--135 S tunden fiir dieses Tier avi ru lent .

Verschiedene S~mme si~gt verschieden (ither/est. So wurde yon Cunningham, Nicolas und Lahiri das .V.f. yon Kasauli als weniger s l e s t gefunden als das V. f. yon Tanger . Nach 8 S tunden kann ein lebendes Virus in d iesem V. f i - S t a m m nicht mehr nachgewiesen werden. D a g e g e n k a n n m a n noch nach 120stfindiger A the rbehand lung indisches StraGen- v i rus im Hi rn naehweisen.

Es wurden ferner vergleichsweise ein V. f. Tanger und drei V. f. yon verschiedenen Ins t i tu ten aus dem Osten Europas (z. B. V), ferner ein V.f . Chisinau, und ein Virus Mal de Caderas aus Paraguay (Roeenbusch) auf ~_therresistenz gepriift. Die Mime wurden gleiehm~i.13ig 72; 96, 120, 144, 1'68, 192 Stunden in ~ t h e r belassen. ]:)ann wurde alas Ammoushorn entnommen, und es wurden Meerschweinchen je 0,2 ecru einer Aufschwemmung 1:50 in NaC1-LSsung durch Cloutage einverleibt. Das Virus B. war nach 168 Stunden, das Virus V nach 144 Stunden noch lebend, die anderen Versuchsst~mme waren noch naeh 120 Stlmden, keines nach 192 Stunden am Leben.

Es mfissen also, angesichts dieser d i f ferenten W i d e r s t a n d s k r a f t der verschiedenen V. f . -Ar ten gegen Ather , die S t~mme daraufh in sehr genau f iberpri i f t werden.

I n einer sehr ausf i ihr l ichen Monographie g ib t NikoIid Milan Auf- schliisse fiber die Hers te l lung des in der Novisader (Neusatzer) Ans t a l t benu tz t en HemTtschen Xtherimpfstoffes .

Wie iiblich, werden d a s Hiru und das Ri ickenmark entnommen, yon H~uten und G e f ~ e n gereinigt, die Kammern erSffnet und die dickeren Gehirnteile, die medulla oblongata und das Kleinhirn horizontal in Scheiben gleicher Dicke geschnitten. Das Ri ickenmark wird quer in Stiickchen v o n 2 bis 3 cm geteilt. Proben fiir die Weiter impfung und die Sterilit~itspriifung

184. M. Kaiser:

werden en tnommen. Die Rohstoffe werden in Glasflaschchen auf ein Metall- oder Porzel lansieb gestellt . Zur X the rbehand lung muf~ chemisch reiner ~_ther benu tz t werden. Die Xtherf laschehen werden auf 96 S t tmden in den Eisschrank gestellt . Nach der Xthe rbehand lung ist a m Boden des Flaschchens tmterha lb d e s Siebes ein aus Blur trod Hi rn l ipo iden bes tehender Bodensa tz zu bemerken, der n ich t aufgewirbel t werden darf, dami t er n ich t in die Vaccine gelangt. Sodann wird der Xthe r abgesaugt , indem m a n die Hi rne aus den Flasehchen ent fern t und auf 1 S tunde un t e r V a k n u m halt . Die Hi rne werden hierauf in StSpselflaschen umgeleer t und die F laschen bis oben mi t einer steri len Mischung yon 50% chemisch re inem Glycerin und 50% aqu. dest. ~mter Zusatz yon 1% Phenol aufgefiillt . I n dieser Mischung ha t das H .M. wenigstens 20 Tage zu liegen, bevor es zur Vaccinebere i tung benu tz t wird. Die F laschen werden in den Eisschrank gestell t . So aufbewahr t ha l t sich die H. M.-Sttbstanz 2 J a h r e lang zur Hers te l lung der Vaccine gebrauchsfahig.

, ,Zur Bere i t tmg des Impfs toffes werden die H i m - bzw. Markst i ickehen nach der He rausnahme aus der Glycer inmischung in physiologischer Koch- salzlSsung gu t gewasehen und in eine wei tere Petr ischale mi t e ingelegtem Sieb gegeben und nochmals eine Stunde lang der J~therrest mi t te ls d*r V a k u u m p u m p e abgesaug t . "

, ,Nun erfolgt die Emulg ie rung der Hi rnsubs tanz in der Kuge lmi ih le . " Porzel lantSpfe yon 5 1 Inha l t werden zu e inem Dr i t t e l m i t Porze l lankagelehen yon 11/2 bis 2 cm D. gefiil l t und in jeden Topf bis zu hSchstens 250 g H i m - substanz gebracht .

,,Die T6pfe trod Kuge ln mfissen gut t rocken sein, da sonst die Emuls ion gr6ber ausfal l t ."

, ,Die Miihlenspindel m i t den T6pfen m u g eine Stunde lang mi t e twa 80 U m k e h r u n g e n in der Minute laufen."

, , J e t z t werden zum Hi rnbre i in jeden Topf 250 ccm steri ler physiologischer Kochsalzl6sung ohne Phenol zugegossen und die T6pfe auf die beschriebene

We i se wieder in die Miihle e ingespannt . D a n n wird diesmal n u t l0 Minuten lang u n d mi t n u t 60 Umdrehm~gen in der Minute l~ufen gelassen. Dutch l~ingere oder schnellere Be ta t igung wiirde s t6rende Schanmbi ldung erzeugt . Die T6pfe werden aus der Miihle gehoben und m i t einer kleinen Spritm' 0,5 cem der Emuls ion zur biologischen Pr i i fung auf Viru]enz und Sterilitfit der Impfstoffser ie en tnommen .

Zur genaueren Ster i l i ta tspr i i fung wird auch m i t der Plat in6se auf Nahr- briihe, N~thragar und anaerob auf .Blutagar ver impf t . Dann wird den T6pfen die berechnete Menge Phenolkochsalzl6sung zugefiigt. Zur Vaccineverdfin- hung wird klar f i l t r ierte, sterilisierte, abgekfihlte physiologische NaC1-L6slmg verwendet . Auf je 1 g Hi rnsubs tanz k o m m e n 13 ccm der Verdi innungs- fliissigkeit. Von der berechneten Menge der Kochsalz l6sung werden 250 ccm fiir j eden Topf beiseite gegeben, dem Res t wird ohne Ri ieksicht auf diesen Abzug soviel Phenol zugegeben, (lab die fert ige Vaccine I ~ derselben entha l t . Nach der Zugabe des Phenols zur kalt~'n Koehsalzl6sung wird kr~iftig geschi i t te l t . "

Beispiel: V . f . -H i rnsubs t anz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 300 g Physiologische NaCl olme Phenol fiir 2 TSpfe . . . . . . . . . . . . . . . . . . 500 ,, Phenolisierte :NaCI-LSsung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3400 ,, lnsgesamt al~ Verdfinnungsfliissigkeit 300 : 13 . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 0 0 . , Phenol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 . ,

l-m I eem lmpf.~toff 0,07~i9 g Him~, in 5 ecru -- 0,3845 g.


Nach Zugabe der L6sungsmitte] wird die Vaccine aus den T6pfen duroh ein Gazefilter abgesaugt. Es wird eine Vaccine A aus Him, die h6chstens ein Viertel des Gewichtes Mark enth~lt, und eine Vaccine B, die nur Mark enthiflt, angefertigt.

Dann wird die Vaccine in Ampullen gefiillt. ,,Die Emulsion setzt sich nach einiger Zeit in Form eines feinen spinn-

gewebeartigen Niedersehlages ohne unterscheidbare gr6~ere Teilehen ab." ,,Entspreehend den fiir Vaccinen allgemeingiiltigen Regeln ist die antirabische Vaccine vor l~ngerer Einwirkung yon Libht und Wiirme zu schtitzen."

,,Nach vollendeter Abfiillung einer Vaccineserie wird die aus der Kugel- miilfle entnommene Vaccine, der nach kein Phenol zugesetzt war, subdural zwei Kaninchen gespritzt. Diese Kaninchen diirfen keine Symptome yon V. f.-Wut aufweisen, d.h. diese Kontrolle hat zu beweisen, daft die Vaccine kein lebendes V. f. enth~lt. Im Laufe der Vaccinegewinnung nach der Methode Hemp~ ist es uns noch hie vorgekommen, dal~ bei diesem Versuch lebendes V. f. in der Vaccine nachweisbar gewesen wi~re."

,,Zur Nachpriifung der Sterilit~t entnimmt unsere Kontrollabteilung yon jeder Serie Proben aus den Ampullen zur erneuten Untersuehung." Au~erdem Pri~ung auf Phenolgehalt. ,,5 bis 6 Tage nach der besehriebenen allseitigen Pri~ung wird die Vaccineserie in den Verkehr gebracht."

,,Die antii~bische ~ther-Phenol-Vaccine naeh Hem/pt hat, wie erwi~hnt, eine festgelegte Verwendungsdauer yon 6 Monaten yore Herstellungstag an gerechnet."

I)ie Vaccine ist abet auch noch dariiber hinaus schutzkr~ftig. ,,])as Er- gebnis" mehrerer Versuche ,,beweist, da~ die Vaccine nach Hempt ihre antigenen Eigensehaften sehr lange bewahrt, bzw. daf die Produkte des abgetSteten V. f. nach der Methode Hemp~ fiber Erwarten stabil slnd und durch verschiedene at~mosphKrische Einfliisse nur sehr langsam ver~ndert werden."

Bei der carbolisierten Vaccine, besonders aber bei den 5real 96 Stunden Atherisierten und nachher noch dutch mindestens 20 Tage in 1 ~/oigem Carbol- glycerin konservierten Gehlrnen, denen unter den strengsten Sterilit/~ts- kautelen zuberelteter Emulsion vor der Einfiillung in Ampullen noch 1% Carbolsiiure zugesetzt wird, wie dies bei der Methode yon Hempt geschieht, ist jede bakterielle Verunreinigung der Vaccine ausgesehlossen."

15 Jahre naeh ihren ersten Versuchen (1919) fiber die Xtherresistenz des V.f . untersuchten Remli~er und BaiUy (1935) versehiedene Virus- st~mme neuerlich auf ihre E igenscha~n und ste]lten im Gegensatz zu der st~ndig abnehmenden Widerstandskraft gegen das Austrocknen eine Zunahme der ~therresistenz lest.

Das Ergebnis war, da~ nach 135-, 140-, 161-, 185-, 200- und 215st~indigem ~theraufenthalt die Verimpfung eines 1/~ ccm einer 1%igen Aufschwemmung, subdural verabreicht, noch immer ein positives Ergebnis erzielte, daft also die abschw~chende Wirkung des ~thers im Jahre 1935 eine zweimal sehw~ehere geworden war als im Jahre 1919.

Biologisch ist es jedenfalls auch sehr interessant, dab sieh die verschiedenen Virusst~mme in sp~teren Passagen besser und weiter ver- diinnen lassen als z. B. im Jahre 1919, ohne unwirksam zu werden.

Aus SchluBfolgerungen ihrer Beobachtungen ffihren die beiden genannten Autoren an: ,,Les instituts qui att~nuent leur virus par l '~her

186 M. Kaiser:

e t peut.~tre par d'autres antiseptiques, risquent eux aussi actuellement de commencer le traitement avec des ~mulsions trop vlrulentes.

T o u s l e s Serviqes antirabiques ont aussi infarct ~ soumettre leur virus ~ des expertises p~riodiques visant son comportement ~ lr de ]a dessiccafion et des autres facteurs d'att~nuation."

Angesichts der statis~ischen Feststellung [MvKendrlck (1935)], dab das Risiko der paralytisehen Komplikationen nach der Behandlung mit lebenden Vaccinen etwa viermal so grog ist wie nach der Behandlung mit ehemisch oder thermlseh abgetSteten, sind die obigen Daten yon besonderer Wiehtigkeit. Aueh weitere statistische Daten sprechen in diesem Sinne [McKendriJr (1939)]. Bei 417181 m i t ,,abgetSteten" impfs toffen behandelten Personen kamen 43 F~lle (~0,01~ yon Impfl~hmungen vor, yon denen 14 tSdlieh verliefen, bei 232888 mit ,,lebenden" Impfstoffen behandelten Impflingen dagegen 82 F~lle ( ~ 0,035~), yon denen 23 tSdlich endeten.

Aus diesen Griinden wird in Insti tuten, die mit ~therisiertem Virus arbeiten, auch besonderer Wert auf die Avirutenz der Vaecinen gelegt.

So beriehtet auch Ni/coZ~ in der Miinehener reed. Wsehr. 1935, S. 1493, erneut: ,,In unserem Falle wurde die Behandlung mit einer antirabisehen Vaccine durchgefiihrt, "die keine Spur eines lebenden Virus fixe enth~lt, sondern nur Zeffallsprodukte dieses abget~tet~n Keimes."

~ e r eine auffallencl lange Resistenz (10 Tage~ einos bei 15~ ~ther gehaltenen Passagegehirns beriehtet Virfla (Ref. B~cker, 1938).

Im Sinne der yon. Hem~ und iViko/id (1. c.) betonten leichteren Resorption seheinen die Versuehe yon H. Javotot, M. Go/son und G . / ~ ~ou (1938) zu spreehen, die m it einer mit ~ther vorbehandelten phenolisierten Lymphe bessere Ergebnisse erzielten als mit einer einfaeh phenollsier~en.

Fiir die Wertigkeit einer mit ~ther his zur Avirulenz behandelten Vaccine ist es ohne Belang, ob auf sic Einfliisse einwirken, die eln lebendes Virus abtSten oder absehw~eh~n kSnnten.

Trotzdem soll hier noch elne Arbeit Pugachs (1939) Erw~hnung linden, der beobachtete, da~ das Tollwu~virus nach ein- oder dreizeitigem Einfrierern (Vaccine naeh _~erm~ mit~l%. Phenol} bis zu 16 Tagen, nach 24stiindigem Einfrleren bis zu 20 Tagen naehweisbar ist. In Vaccinen .m-it 0,5~o Phenol erhielt sich das Virus nach fiinf~gigem Gefrorensein 17 Tage lang. Gegen- fiber den Kontrollen waren die immunisatorischen F~higkeiten der Vaccine mit 1% Phenol unver'~dert, mit 0,5% deu~lich herahgesetzt. Die Virulenz des Virus ist in beiden Gruppen schw~eher als in den Kon~rollen (Verringe- rung der Erkrankungszahlen, Verlfingerung der ]nkubationszeit). Wieder- holtes Frieren und Auf~auen sch~digt alas ~irus in hohem Mal~e. Es wird dringend geraten, bei der Versendung yon Tollwutvaccine das Einfrieren zu vermeiden.

Diese Ratschl~ge kSnnen sich naturgem~ nur auf einen Impfstoff beziehen, der lebendes Virus enthalten soil.


Schliel~lich soll hier noch eine Arbeit Remlingers und Ba~l, Zys aus den |etzten Jahren (1940) Erwiilmung linden, die zwar an und fiir sich nichts Neues bringt, vielmehr alte Erfahruhgen nur best~tigt, die mir aber trotzdem yon Wichtigkeit zu sein scheint, weil sic den scheinbaren Widersprueh zwischen der Annal~ne Pa~urs , da~ das Trocknen die Virulenz abschw/iche, und den eigenen Befunden Remlingers, daft das Trocknen die Virulenz nicht nut nicht schiidige, sondern sogar erhalte, experimentell aufld~rt.

Die beiden Autoren teilten ein Kaninchenriickenmark median in zwei gleiche Teile. Ein Tell wurde in einer Mar~otteschen Flasche yon 1,5 1 auf- gebiingt. Am Boden der Flasche befanden sich nach der Pasteurmethode 150 g Pottasche. Die andere Hiilfte wurde im M6rser rein verrieben, auf eine Glasplatte in dimmer Sehicht aufgetragen und in einem Exsiceator fiber ~tzkalk wassedrei gehalten. Nach einiger Zeit wurde 1 em yon clem R. abgetragen und 0,01 g yon dem Pulver aus dem Vakuum entnommen und in" 2,0 ccm physiologischer L~sung aufgeschwemmt. Dann wurden je 0,3 ccm einem Kaninehen mater die Dura einverleibt. Stets wa~ der Untersehied zwischen den Ergebnlssen der beiden Impfungen sehr deutlivh.

Dem Vakuum ausgesetzt undo getrocknet, hielt sich das Virus, das sonst bei etwa 60 ~ in wenigen Minuten abget6tet wird, auch bei 100 ~ 105 ~ mad selbst bei 110 ~ 2, 3 und 5 Minuten amLeben.

Bereits das sehr primitive Experiment, eine Pattie Mark dem normalen Past~urschen Trockenverfahren zu unterweffen , die andere einem leichten Luftzug bei 23 ~ ansznsetzen, hat also ergeben, dab das erstere Mark am 5. oder 6. Tag bereits avirulent war, w~hrend die zweite Pattie am 7 , 8. und bisweflen am 9. mad 10. Tag noch virulent gefunden wurde.

Verschieden variierte Versuche ergaben regelm~Big die ~berlegenheit der trocken gehaltenen Virnsproben gegenfiber jenen, die Feuchtigkeit 8ufnehmen konnten. Diese .Empfindlichkeit gegen Feuchtigkeit geht sehr welt. Zwei Proben gleichen, rein gepulverten Ansgangsmaterials wurden zu je 0,01 g Pulver in Ampullen abgefiillt. Die einen kamen in weitere Ampullen yon 20 ccm Inhalt, die iiberdies I g ~tzkalk enthielten, die Kontrollen waren ohne Troekenmittel. Die im Trockenen gehaltenen Proben erhielten ihre Virulenz durch lange Zeit, w~hrend die anderen ihre Virulenz eingebiiBt hatten. ,,La perte de virulence des moelles rabiques n'est pas, ainsi qu'fl est classique, ]a consequence d'une action combin~e de la teml~rature de F oxyg~ne de Fair et de ]a dessication. EUe est due au ferment autochtone qui se trouve dad8 les tissus en ggngral. Comme pour tons les ferments, la presence de l 'eau est la premiere con- dition de son activit& La d~shydration de la poudre rabique, sa conser- vation en presence d 'un corps - - tel que la Chaux - - absorbant ! a vapeur d'eau, mettant le virus k Faction de la prot~olyse. Au contraire la resti- tution d'une trace d'humidit~ rend son activit~ k la diastase et celle-ei, d~s lots, ne tarde pas ~ d~truire le virus."

In den Schlufl~tzen heiiSt es im Punkt 2 : ,,Dans les f l~ons de Mariotte de la mSthode pasteurienne ela~ique, ce

n'est pas la dessication qui att~nue le virus rabique mais l'autolyse qui

188 M. Kaiser:

lor~side /t la maturation des viandes. L'att6nuation est en rapport avec le degr6 d e libert~ laiss~e ~ Faction du ferment, action qui, pour s'exercer a besoin d'un peu d'humidit~.

30 Les conditions de r6ussite de l'exp6rience de Van~tenberghe sont la rapidit~ de la dessication, la minceur de la couche de substance nerveuse

d~s~cher et surtout, l'absence complete d,humidit~. Des traces minimes de vapeur d'eau suffisent ~ faire perdre rapidement /L ~ia poudre d6s6ch~e route virulence."

Bei den Versuchen wird nicht angegeben, wie die Temper~tur in den Phiolen gemessen wurdc, die dcr Temperatur 100 ~ 102 ~ 105 ~ uJad 110 ~ ausgcsetzt waren. (Notwendig w~ren Phiolen a u s sehr diinnem Glas, damit die Temperatur sehr rasch angenommen wird.)

II,

Fi~r die eigene~ Arbeiten, auf die nun eingegangen werdon soil, war die yon den verschiedenaten Forschern betonte Beobachtunq richtunggebend, da~ es mit abyet6teten Imp/stoHen eben~o gdi~ge, einen, entspre~henden Lysaaschutz zu verl~ihen wie mit l~benden.

I m gegenwi~rtigon Fall sollte der mit Xther sul[. vorbehandelte Imp[- sto[[ Gegenstand eingehender Untersuchungen sein, wobei es auch zu untersuchen war, ob insbesondere das yon Hemlat angegebene Ver. fahren der Impfstoffbereitung nicht in einigen Punkten ergiinzt werden k6nnte.

I m Laufe dieser Untersuchungen m u f t e der Rohstoff verschiedenen Behandlungen unterworfen werden, weshalb es yon Wichtigkeit war, aus dem vorhandenen Schrifttum, soweit es sich gegenw~rtig i~ber- blicken l~ft, zu erfahren, wie sich verschiedene Einfliisse auf das V.f . bemerkbar machen. Da zeigte es sich vor allem, dal3 der Einfluf des Frierens fiir das Virus belanglos war. Dies ging auch aus ~lteren eigenen Versuchen hervor (siehe Literatur).

Femer war es wichtig, dab die alte Pa~teuzsche Auffassung sowohi durch amerikanische Autoren als auch in der bereits erwithnten Arbeit yon RcmZinger richtiggcstellt wurde, dab n~mlich 'der EinfluB der nach Pasteur geiibten Trocknung sich nicht dadurch schikligend bemerkbar mache, dal~ er dem Rohstoff Feuchtigkeit entzieht, sondern daft es Produkte der Zellnekrobiose sind, welche das Virus abt6ten. V611ige Trockenheit, rasch einwirkend, s c h ~ i g t d a s Virus nicht, wie Remlincjer in verschiedenen Versuchen nachweist und wie es vor ibm schon die oben erw~hnten Amerikaner beschrieben haben. Schlieflich ~weisen auch eigene bereits im Jahre 1940 angestellte Versuche in diese Richtung.

Urn die Trockenheit rasch zu erzielen und alas Gewebe noch vor seinem v611igen Eintrocknen, also w~hrend des beim norma/en Eintrocknen auftretenden Schrumpfens zu schiitzen, erwies sich der yon F/osdorf und Mudd empfohlene Vorgang des ruschen vorhergehenden T/eHr/erens


yon ausschlaggebender Bedeutung, auf die nieht nachdrticklich genug hingewiesen werden kann. 3

Es war schlieltlieh aueh yon Bedeutung, aus dem Sehrifttum zu erfahren, dab der Xther sulfurieus das Virus sieher abzutSten vermag, wenn diese Wirkung aueh yon den friiher angefiihrten Faeharbeitern in versehieden langer Zeit erzielt wurde.

Unter 0bigen Voraussetzungen sind die Arbeiten in der Wiener Staatsimpfanstalt begonnen worden, wobei es insbesondere auf folgende Punkte ankam :

1. Li~l~t sich die ~therbehandlung so durchfiihren, dab das Virus in kiirzerer Zeit absolut sieher abgetStet wird ? Das setzt voraus, dal~ die J(thereinwirkung auf kleinste Partikelchen des Rohstoffes einwirkt, so dab dem Virus h5ehstens eine Eiweil3- oder Lipoidschutzkolloid- wirkung, nicht aber eine rein meehanische zustatten kommt.

2. Wenn as tats/~chlich yon Bedeutung ist, die/itherlSslichen Substanzen aus dem l~ohstoff zu extrahieren, so war zu untersuchen, ob diese Ex- traktion nieht eine griindlichere sein kSnnte als es der Fall ist, wenn der J(ther nur auf Scheiben oder Stiickchen des Rohstoffes einwirken kann.

Ein einheitliches Ver/ahren miiBte es aueh mit sich bringen, dat3 die Xtherresistenz der versehiedenen Virusst/~mme genauer gepriift werden kSnnte, wenn man die ~therbehandlung naeh einem ganz bestimmten, leieht einzuhaltenden Verfahren vornimmt.

3. Sollte versueht werden, das Virus i n Verh/~ltnisse zu bringen, unter denen es sieh nach Analogie mit anderen Virusst~mmen m6gliehst lange unver/~ndert erh/~lt, und sehlieBlich konnte dieser W e g auch eine M6glichkeit bieten, den Impfstoff

4. in eine Form zu bringen, i n der er sieh fiir den dezentralisierten Gebraueh besonders, also besser eignet als in fliissigem Zustand unter st/~ndiger Einwirkung eines Desinfiziens.

Beim Eingehen auf die angefiihrten vier Hauptpunkte wird sieh Gelegenheit geben, versehiedene andere kleine Vorteile des geplanten Ver- fahrens zu erlautern.

Um den Rohstoff Him-Mark (H.M.) in innigsten Kontak t mit dem virusabtf tenden und fettlSsenden Stoff (~ther) zu bringen, geniigte es nieht, ihn in Seheiben oder kleine Stiiekehen zu zersehneiden, diese in den Xther einzulegen und zu warren, bis der erhoffte Erfolg eingetreten ist. Dieser Erfo!g muff ein sehwankender sein, weft die ~therisierung im Laufe der Passagen keine gleichm/~Bige sein kann, wenn der ~ the r nicht immer auf gleieh groBe Stiieke des Rohstoffes einwirkt. Es kann daher auch die ~therresistenz nieht einmal bei Rohstoffen derselben

s Zum ersten Male wurde das Verfahren yon dem Agrikulturehemiker L./~. Shavke//, Am.~Journ. Physiol. 24, 1909, 325, empfohlen.

Areh|v f. Virusforschung, Bd. III , H . 4. 14

190 M. Kaiser:

Herkunft in verschiedenen F/~llen richtig bewertet werden~ geschweige denn, dab diese Resistenz bei Stoffen verschiedener Herkunft oder gar mit Versuchen versehiedener Autoren verglichen werden kann . Das ist n u t m6glieh unter der Voraussetzung einer mSglichs~ gleichartigen Behandlung._

Eine innige Beriihrung zwischen dem Rohstoff und dem virusabt6tenden St0ff ist nur dann erreiehbar, wenn man den Rohstoff vermahlt oder verreibt. Dieses Ziel ist auf zwei Wegen erreichbar.

a) Der Rohstoff wird in feuchtem Zustand naeh genauester Entfernung der Hirnh/~ute und Blutgef/~Be dureh eine sterilisierte Fischerpresse

Abb. 1. ~/~eher-Presse mi~ seitlicher Abb. 2. Schiittelflaschen verschiedener Beschickmng, kann in toto steril!siert Formen aus genaer Glas mit Jenaer Glas-

werden, perlen, linke Form kam~ ohne 8topfen mit Atuminiumkappe zentrifugiert wet-

den. In_halt 50--60 ccm.

durchgepreBt, deren Poren einen Durchmesser yon etwa I m m haben. Dadurch allein schon wird der Rohstoff in feinste Str/s aufgeteflt. Wie sps noch zu erl/~utern sein wird, ist auf die gen~ueste Entfernung yon Gef~tBen und gef/~Bffihrenden H/iuten peinlichst zu achten, well bei naehl~ssiger Arbeit die Qualit/~t (das Aussehen) der Fertigware leidet.

D~s Arbeiten mit der Fiseherpresse gest~ttet ~-- die n6tige Vorsieht vorausgesetzt - - ein vSllig keimfreies PreBgut zu erzie]en, wie es auch fiir die Gewebeziiehtung usw. ben6tigt wird. Erfolgt das Befreien des Rohstoffes in einem sterilen Kasten, so kann man bei der Arbelt jede Verunreinigung sicher aussehlie$en (Abb. 1).

Die dureh den Pressevorgang erzielte Zertrtimmerung des Rohstoffes ermSglieht es aueh, fox die Sterilit/~tspr6fung geeignetere Durchschrdtts-

Versuche zur Herstellung eines trockenen Lyssaimpfsioffes. 191

proben zu erhalten, als es der Fall ist, wenn man da und dort eine Probe aus den Hirnscheiben entnimmt.

Entschliel~t man sich dazu, den Rohstoff feueht zu verarbeiten, (Feuchtes Ver/ahren), so l~Bt man ihn aus der Fischerpresse in ein vorher tariertes, mit Jenaer Glasperlen versehenes Schiittelgef~fl ~allen und entnimmt davon entsprechende Proben ffir die erste Priifung der Sterilit~t. Dann kommt das Sehiittelgef~B in den Tiefkfihlsehrank bis zur Fest- stellung der Sterilit~t. Als Sehfittelgefi~i3e haben sieh nut Behi~lter aus Jenaer Glas bestens bewiihrt (Abb. 2).

Es ist wichtig mitzuteilen, dal3 Perlen aus gewShnliehem Glas sehr bald splittern und daI~ das Schiittelgut dann viel Alkali aufweist. Bei diesen Versuchen zeigte es sieh auch, dal3 Jenaer Glas resistenter gegen Korrosion ist, als es Quarzperlen sind. Die ursprtinglich kristallklar gl~nzenden Quarzperlen waren naeh verhs kurzer Benutzung mat t geworden, w~hrend die Jenaer Perlen gl~nzend blieben.

Nach erfolgter Feststellung des bakteriologischen Prfifungsbefundes der H.M.-Masse fiillt man in das Schfi t telgef~ etwa die f.finffache Menge yon ~ther sulfuricus (wie er fiir die Narkose gebraucht wird) und schfittelt es in einem Schiittelapparat, der im Zbl. Bakteriol. 11~, 547 (1929) beschrieben ist, dureh 8 Stunden. Der Verschlul~ der Schiittelgef~Be erfolgt durch einen eingeschliffenen Glasstopfen, dessen peripherer An- teil mit Apiezonfett bestriehen ist. Dieses Fet t ist gegenw~rtig nicht mehr erh~ltlich, kann aber durch ein anderes Exsiccatorenfett ersetzt werden. Der Stopfen wird dureh eine Kappe vor dem Loekerwerden gesichert. ]~s ist uns auf diese Weise niemals ~ ther entwichen, selbst nach 24stiindigem Schiitteln nieht.

W~hrend des Sehfittelns zerf~llt der bereits weitgehend zerkleinerte Rohstoff in feinste Partikelchen, deren sts abnehmende GrSl3e durch Drehen des SchiittelgefiiBes an der Wand zu sehen und zu kontrollieren ist.

Das/euchre Ver/ahren hat den Nachtefl, dal~ der )i, ther nicht so unmittelbar auf das Rohmaterial einwirkt~ wie es beim trockenen Verfahren der Fall ist, weft etwa 75% der ll.M.-Masse aus Wasser besteht. Wahr- seheinlieh ist aueh die Lipoidextraktion eine andere.

b) Diesen Nachtefl behebt das ,,trockene Ver/ahren". Aus der Fiseherpresse l~Bt man das durchgeprel3te H.M. in eine Petri-

sehale fallen, entnimmt wie bei Verfahren a) Proben fiir die erste bakterio- logische Prfifung, und spatelt die Masse in mSglichst diinner Sehicht aus, ohne den Sehalenrand damit zu beriihren. Eine Petrisehale geniigt fiir das H.M. eines Kaninchens. H a t man V.f . yon mehreren Tieren, so benutzt man mehrere Schalen. Man l~I3t das V. f. sodann dureh Ein- stellen der Sehalen in den Tiefkfihlschrank festffieren und wartet bis zum Abschlui3 der bakteriologischen Prfifung; w~hrend dieser Zeit kSnnen keinerlei autolytische Veranderungen im V. f. vor sich gehen.

14"

192 M. Kaiser:

Abb. ~, In Petrischale gefrorcnes tIM. trocken, zeigt .Schnitte, welche die Trockmlng f6rderm

Die gefrorene Masse wird hierauf mit einem sterilen Skalpell mehrfaeh fiber kreuz und quer durch- schnitten und in einen Trockenturm, der mit Kie- selgel beschiekt ist, eingestellt. Des Durchtrennen der Masse f6rdert das Trocknen wesentlich, wo- yon man s~ch durch den Anblick des Trockengutes sofort fiberzeugen kalm,

An Stelle vieler Worte wird auf die Abb. 3 ver- wiesen, aus der alles N6tige ohne weiteres hervorget i t , Der Trockenturm besteht aus drei fil~ereinander-

gestellten Tassen, die mit Drahtgaze gedeckt sind und Kieselgel enthalten. Er wird vor jeder Benutzung in einer luftdieht schlieBenden Blechbtichse, die eine sp~ter verschlieBbare ~)ffnung zum Entweiehen

der Feuchtigkeit hat, auf etwa 190 ~ dutch 3 Stunden erhitzt und in einen Exsiecator eingestellt, der in Abb. 4 dargestellt ist.

Man saugt mit der 01pumpe bis zu einem Minusdruck von Bruchteilen eines Millimeters Hg ab und iiberl~gt des Ger~t auf 24--48 72 Stunden sich selbst: l~ach dieser Zeit findet man des H.M. zu einer sehau- migen Masse aufgebl{~ht; die aus den Petrischalen unter dem Schutz des bereits erw~hnten

Abb. 4, Kleiner Exsiccator und Trockenturm f[ir Petri- Glaskastens steril entfernt und schalen (6 Kan. HM.) uad drei Kieselgeltassen. in einem GlasmSrser zu rein-

stem Pulver verrieben wird, des mit Hilfe eines weithalsigen Trichters in die Sehfittelflasehe eingeffillt wird.

Beim Trocknen verliert das H.M. tmgef~ihr 75~o seines Feuehtigkeits- gewiehtes. Eine LTbersicht fiber einige solcher Gewichtsdaten aus der letz~en Zeit gibt die folgende Tabelle:

Versuche zu r Hers te l lung eines t rockenen Lyssaimpfstoffes .

H . M . - F e u c h t - u n d T r o e k e n g e w i c h t i n G r a m m .

K a n i n c h e n h i r n u n d -mark .

H.~I. H.M. Tier-Nr. feucht trocken Durchschnitt

209] 2092 2093 2094 2095 2096 2097 2098 2 0 9 9 2100

12,60 12,00 13,50 12,00 12,20 11,00 13,25 13,15 11,25 13,35

3,00 3,05 3,60 2,85 2,95 2,85 3,30 3,32 2,83 3,35

F e u c h t g e w i c h t : 12,43 T r o c k e n g e w i c h t : 3,17 T rockenze i t : 72 S t u n d e n

U b e r das Verh~ilbnis y o n Troeken- zu F e u c h t g e w i e h t v o n K a n i n c h e n - h i r n e n h a t /V. W. Romens]~ in b e s o n d e r e r Ber i i cks i eh t igung de r V . f . - I n f e k t i o n U n t e r s u e h u n g e n anges te l l t .

I n 15 F~l len f a n d er :

N o r m a l h i r n : T r o c k e n s u b s t a n z . . . . . . . 20,83 i N . H . : W a s s e r . . . . . . . . 79,17 N o r m a l m a r k : T r o c k e n s u b s t a n z . . . . . . 31,57 ] N .M. : W a s s e r . . . . . . . . 68,43

D e m g e g e n i i b e r g e b e n H . M . e inen le ich t e r h S h t e n W a s s e r g e h a l t n a c h V. f . - In fek t ion .

N i c h t v ie l ve r s ch i eden d a v o n i s t das E r g e b n i s de r A n a l y s e n y o n R i n d e r - h i r n e n u n d 3~enschenh i rnen .

E i n e r A r b e i t y o n Petrowsky i s t zu e n t n e h m e n , daI~ das Mi t~e lgewicht y o n 4 R i n d e r h i r n e n in 1 0 0 g e r g i b t :

193

Graue Substanz Weil3e Substanz

Wasse r . . . . . . . . . . ": . . . . . . 81,6042 Wasse r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6813508 Fes te Bes t and t e i l e . . . . . . . 18,3958 Fes t e B e s t a n d t e i l e . . . . . . . . 31,6492

E s seien n o c h wei te re D a t e n angef i ih r t , well es n i c h t mSgl ich war , fiir Kaninchen-H.l~CL die e n t s p r e c h e n d e n Z a h l e n zu f i n d e n .

100 g T r o c k e n s u b s t a n z e n t h a l t e n :

A l b u m i n s t o f f e m i t G lu t in : . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Lec i t h in . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Choles te r in u n d Fette. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Cerebr in . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I n wasse r f re iem ~ t h e r unlSsl iche S u b s t a n z . . . . Sa]ze . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

WeiSe Substanz Graue Substanz

55,373 17,240 18,685

0,533 6,714 1,455

24,725 9,905

51,909 9,547 3,342 0,572

W e r d e n g raue m i d weil3e S u b s t a n z g e t r e n n t b e h a n d e l t , so e rgeben die m i t A t h e r u n d Alkohol ex t r a h i e r t e n A n t e i l e , au f 100 g t r ockene S u b s t a n z bezogen :

194 M. Kaiser:

Anteile an I Graue Substanz WeiBe Substanz I

Kalter Alkoholauszug . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i! I 32,824 ~therauszug . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8,310 Warmer Alkoholauszug 2,038 Rfickstand . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56,829

27,829 36,209 10,665 25,297

100 g nichtgetroekneter ttirnsubstanz geben folgende Summe yon Ex- trakten, welche als Trockensubstanz angegeben sind:

Graue Substanz WeLSe Substanz

Summe yon Extrakten . . . . 18,396 Summe yon Extrakten . . . . . 31,649 Wasser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81,604 Wasser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68,351

In tither 16slich sind: Cholesterin, Lecithin, Kephalin (~therlSsliche Monaminomonophospha$ide) und Myeline.

Ober die quanti tat iven Verh~ltnisse der in ~ ther aus Ieuchtem und trockenem Rohstoff extrahierbaren Substanzen konnte ich in der mir zugs Literatur nichts NiLheres finden.

Schrittelt man mit ungefiihr der ffinffachen Menge des durchschnitt- lichen Feuchtgewichtes, also mit 60 ccm ~ther , und li~Bt die Masse 12 bis

48 Stunden absitzen, aode r zentrifugiert man sofort das Schfittelgut 1 Stunde bei 3500--3800 Touren in der groBen Schulmeisterzentrifuge (60 m/sec), so setzen sich die festen, nicht i~therlSsliehen Bestandteile in scharf voneinander getrennten Schichten ab, yon denen die obere eine leichtbewegliehe, schaumartige darstellt, wi~hrend die untere dunk]ere, einen festeren Kuchen bildet, der leicht in toto entfernt werden kann. Es ist anzunehmen, dab dieser Kuchen die spezifiseh schwereren Albumin- und Glutinstoffe enthi~lt (Abb. 5).

Es ist mSglich, daB die oberfli~chliche Schicht mit der Substanz identisch ist, die aus Gehirnscheiben und -stricken ausfiillt, wenn man sie auf einem Sieb in ~ther einlegt. Nach Hempt und Nikoli5 (siehe Literatur) kann

Abb. 5. Tro~ken ~e- diese Substanz als fiberflrissig fiir die Impfstoffbereitung schiitteltes HM. in ~ther zeigt die ausgeschaltet werden. In dieser Hinsieht sind noch Unter- 8chalTe Schichten- suchungen im Gange, weshalb hier nicht ns darauf bildung des Boden-

satzes, eingegangen werden soil. Ffir die Zwecke der Impfstoffgewinnung wird also

das H.M.-Pulver mit 60 ccm ~ther (ffinffache Feuchtigkeitsmenge) dureh 8 Stunden geschrittelt. In Versuchen, fiber die an anderer Stelle berichtet werden soil, wurde festgestellt, dab bereits ein 6stiindiges

4 Fiir die Impfstoffbereitung ist das nieht n6tig.

Versuche zur iterstellung eines trockenen Lyssaimpfstoffes. 195

Schfitteln der rein verteilten Masse 5 mit ~ ther sulf. genfigt, um das Virus ffir Kaninchen nach subduraler Applikation yon 0,1 ccm einer 10%igen Aufschwemmung avirulent zu machen.

Von hier ab iau/en die beiden Ver/ahren, das /euchte und das trockene, wieder gemeinsam. !

Hat man Schfittelgef~Be, die zentrifugiert werden kSnnen, so kann die Atherisierung sofort nach Ablauf yon 8 Stunden unterbrochen werden. Die Gef~Be werden bei holler Tourenzahl ausgeschleudert, was in 1/~ Stunde gelingt (siehe oben). Man finder dann in dem Schiittelgef~B eine Schichten- bildung.

Auf der H.M.-Masse liegt die spezifisch leichteste Schicht obenauf. Sie dfirfte die Hirnsubstanzen mit Ausnahme des Albumins und der Glutinstoffe enthalten. Da sie leichtbeweglich sind, so kSnnen sie yon dem festeren darunterliegenden Kuchen abgesaugt werden, falls sich ihre Entfernung empfiehlt, was ich vorl~ufig noch nicht anzugeben vermag.

Sind der ~ ther u n d die ffir die Impfstoffbereitung iibeffliissigen Bestandtefle des Rohstoffes entfernt, so wird dem Zentrifugat die efforderliche Menge physiologischer KochsalzlSsung zugesetzt, um einen 8- oder 10~/oigen Impfstoff zu erhalten. Berechnet wird die zugesetzte Menge nach dem Feuchtgewicht.

Aus technischen Griinden setzt man jedoch nicht die berechnete Menge zu, sondern nur die tt~lfte (die Aufschwemmung ist dann 20~/o) , weft man in diesem Falle aus den Ampullen, die ffir die Aufnahme des Imp~stoffes bestimmt sind, nur die Hs der Flfissigkeit, die schlieB- lich fiir die /njektion verwendet wird, abzusaugen hat.

Der physiologischen KochsalzlSsung werden 10% einer 10~oigen Gel. sterilis. Merck zugesetzt, die auf 3 Atfi erhitzt worden ist und nicht mehr gerinnen kann.

Behufs grfindlicher Vermengung werden die Schfittelgef~Be n o c h einmal 2--3 Stunden geschfittelt) Die erforderliche Zeit wird am besten nach dem Zustand der Schiittelfliissigkeit bemessen. Enth~lt sie beim feuchten Verfahren noch grSbere Partikelchen, die sich nach dem Ersatz des ~thers durch das Wasser mitunter bflden, so mu]3 so lange weiter- geschiittelt werden, bis diese grSberen Teile vSllig zertriimmert sind. SchlieBlich wird die Fliissigkeit~ samt den Glasperlen auf einen Trichter geschiittet, der eine Gazeeinlage enthi~lt.

Sollte sich beim neuerlichen Schiitteln Schaum gebildet haben, was gelegentlich vorkommt, so spielt dies keine Rolle, well der Schaum beim Durchgang der Fliissigkeit durch die Gaze sofort verschwindet.

V. f. yon Neusatz. Iqachtrag bei der Korrektur. In sp~teren Versuchen hat sich auch ein

10 Minuten langes Schiitteln mit tier Hand als geniigend erwiesen.

196 M. Kaiser:

Sehliel~lieh m6chte ich noch eine dritte Art yon Zubereitung des dtheri. sierten Lyssaimp]stojJes anfiihren, die in der Wiener Anstalt aueh ausprobiert wurde.

Man fiillt die getrocknete:H.~.-Masse in eine Schfittelfiasche, erg~nzt den Inhalt , wie bereits besehrieben, mit ~ ther und schiittelt die efforderliche Zeit. Dann stellt man die Flasehe, deren Glasstopfen durch eine Aluminiumkappe oder einen Zellstoffpfropfen locker versehlossen wird, senkrecht bei der Temperatur yon - -12 - -14 ~ C auf, und wartet, bis sieh das spezifiseh sehwerere Gewebe abgesetzt hat. Aueh hier sieht man sehr sehSn die seharfe Schichtenbildung, die an die MSglichkeit einer gravimetrischen Gewebsanalyse denken l~Bt.

Man saugt nun mit Hilfe der Wasserstrahlpumpe durch eine KapiUare den Ather behufs Regenerierung in eine Vorratsflasche ab und hat dabei noeh die MSglichkeit, die leichtbewegliche oberfliichlichste, aus Lipoiden bestehende Schicht des Sediments mit abzupumpen.

DaB diese Schicht aus solchen Gewebsbestandteilen besteht, sieht man sehr sch6n, wenn man z. B. das Schfittelgut yon den Glasperlen abgiel~t und in einem MeBzylinder sedimentieren l~i~t. Saugt man dann den Ather ab und li~Bt den Bodensatz troeknen, so sieht man eine ganz scharfe Zweiteilung des Sediments, dessen obere Schicht hellbraun oder gelbbraun gef~rbt ist, und in ihrem Aussehen an Wachs oder eingedicktes l~ett erinnert, wfi, hrend der untere Tell, offenbar die Albumin- und Glutinstoffe enthMtend, weiBgrau und kriimelig aussieht. L~l~t man sich einen Mel~zy]inder maehen, dessen unterer Teil abhebbar ist, so kann man das Sediment ann~hernd quanti tat iv entfernen. Zuriickkehrend zu unserem Versuch, lassen wir nach Entnahme des ~thers das Sediment trocknen, was im Thermostaten oder Wasserbad (nichtfiber37~ erfolgen kann. Dann wird die efforderliche Menge physiologischer L6sung aufgefiillt und neuerlich geschiittett, nachdem man die in das Sediment eingebackenen Perlen durch Aufklopfen auf die Tischplatte locker gemacht hat. Man sehfittelt so lange, bis man beim Drehen der Schfittel- flasche an deren W~nden eine genfigend feine Verteilung der ll.M.-Masse feststellen kann. ~ach Umleeren der Aufschwemmung fiber einen Trichter, der die Perlen auff~ngt, in einen Erlenmeyerkolben erh~tt man die 10%ige Anfsehwemmung mit einem m6gliehst beschrankten Gefi~l~- wechse], der ihre Sterilit~t gewahrleistet.

Nunmehr kann das Abffillen der Fliissigkeit in Ampullen erfolgen, wobei man yon Zeit zu Zeit den Erlenmeyerkolben umsehwenkt, um seinen Inhal t vor dem Sedimentieren zu bewahren, was zum Tefl schon dureh den Gelatinezusatz verhindert wird. Ha t man eine masehinelle Abfiillvorrichtung, so geht die Arbeit rasch vonstatten. Andernfalls muir man sich mit einer 10-cem-Spritze behelfen; das Abfiillen mit Biirette kann wegen des Sedimentierens der Aufschwemmung nieht empfohlen werden.

Versuche zur tterstellung eines trockenen Lyssaimpfstoffes. 197

In die Ampullen werden je 2,0 ccm eingefiillt (also ei~e 20%ige Au]- schwemmung! ) .

Man legt die Ampullen ganz schwach geneigt, also nahezu horizontal, in Kohlensgureschnee oder zerstampftes CO~-Eis, und l~I~t sie griindlichst durehfrieren.

Sie kbnnen dann in Drahtkbrbe senkreehtstehend eingefiillt und in den Vakuumkessel eingestellt werden. Zweckmg/~ig stellt man in das Vakuum eine Wanne mit einigen Kilogramm Kieselgel. Lgl3t man die Hochvakuumpumpe, der eine Kiihlfalle vorgescha!tet ist, anlaufen, so werden in wenigen Sekunden Bruchteile eines Millimeters Druek erreicht, und nun lgBt man die Pumpe 12 Stunden laufen, Dann dreht man den Hahn, der zum Kessel fiihrt, ab, schaltet die Pumpe aus und i i be r l~ t das Trockengut der Einwirkung des Kieselgels durch weitere 72 Stunden. Naeh dieser Zeit ist die Aufschwemmung zu einem Kuchen eingetrocknet, der die Form des ausgeftillten Ampullen- teiles angenommen hat, und meist einen Zylinderabschnitt darstellt. Seine Farbe ~ b t Kunde yon der Genauigkeit mi t der die ' GefgBe und H~ute der H.M.- Masse entfernt warden. War diese Ar- beit die gewiinschte, so ist der Kuehen schneeweiB, andernfalls ist er durch die mitgetrockneten Blut- und Mesoderm. -~bb. 6. a = t rockener Pockenimpfstoff, bestandtefle grau, hellbraun bis braun b trockener Lyssaimpfstoff ; beide aus

den Ampul len en tnommen.

gef~rbt. Ich vermag es nicht anzugeben, ob seine Wirksamkeit dadurch irgendwie beeinflul~t wird, halte aber derzeit dieses Aussehen nur flit einen Schbnbeitsfehler (Abb. 6).

~Nunmehr kann das Abschmelzen der Ampullen beginnen, das ein Vakuum nicht erfordert.

Worin besteht nun der Unterschied in den drei beschriebenen Ver- fahren ?

D a s /euchre Verfahren ~therisiert einen /euchten Rohstoff so, wie es (lie Hemptsche Methode rut. In einem Kaninchen-H.M. von 14 g Gewicht sind etwa 10,0 g Wasser enthalten. Der Ather wirkt also auf ein wasser- haltiges Gewebe ein. Ich bin vorl~ufig nieht imstande zu sagen, ob es besser und fin Sinne der erwiinschten Lipoidextraktion (Hempt) vorteil- hafter ist, deft Rohstoff feueht oder trocken zu extrahieren. Ieh weiB aueh nicht, in welchem Falle der Antigentrs dem J~ther besser zu- g~nglich ist im Sinne der Virulizidie, ob in dem feuchten oder im trockenen H.M. Das mfii3te erst ausprobiert werden.

Das trockene Ver/ahren gestat~et die denkba.r feiriste Ver.reibung und Aufsehlieftung, die m6glich ist, well sieh neben der Sehiittelwirkung

198 M. Kaiser:

auch noch die vermahlende auf die troekene Substanz auswirkt. Axbeitet man vom Augenbliek der Entnahme an soweit als m6glich unter Glas, so ist die Gelegenheit zu einer Sekund~rinfektion des Impfstoffes eine /~ul~erst geringe.

Fiir beide 'F~lle ist ein Moment der Infektion in der (iibrigens aueh in der Teehnik der Gewebszfiehtung benutzten) Passage dutch die Fischer- presse gegeben. Ieh halte diese Passage ffir n6tig, weil sie den AufsehheB- proze$ wesentlieh begfinstigt. Es wird dariiber naehzudenken sein, ob man die Presse ein wenig anders konstruieren kSnnte, was wit zum Teil schon (lurch eine seitliehe Ladung ermSglieht haben, die es uns erspart, den Kolben jedesmal zu entfernen, wenn mehr Material vorliegt. Dadurch wird das Ansaugen allenfalls keimhaltiger Laborluft vermieden. Dutch das Einspannen in ein geeignetes Stativ unterbleibt aueh das Berfihren der Presse mit der Hand.

Das feuehte wie alas trockene Verfahren gestatten es, die Xtherisierung zu dosieren, d .h . man k6nnte sie - - so haben wit es wenigstens fiir das derzeitige Neusatzer Virus fixe f e s t g e s t e l l t - bereits naeh 6 Stunden unterbreehen. Ob das einen Vortefl hat, vermag ich nicht anzugeben, jedenfalls kfirzt es die Arbeitszeit ab.

Das z~tletzt geschilderte Ver]ahren lehnt sieh hinsiehtlich der Atherisie- rung an die Hem'ptsche Xtherisierung an; sie dauert l~nger. Naeh dem Schfitteln steht in diesem Falle die H.M.-Masse gew6hnlieh noch fiber Naeht, oder gelegentlich aueh l~nger unter Xther. Hat das einen Vortefl ? Ieh weil3 es nicht. Es scheint mir aber fiir allenfatls w/~hrend der Arbeit hinzugekommene Begleitkeime yon Vortefl zu sein, wenn sie 1/~ngere Zeit einem Desinfiziens ausgesetzt sind.

Auf den ersten Blick mag das gesehflderte Verfahren umst/~ndlieh erscheinen. Das ist abet nicht der Fall, wenn die gegebenen Vorsehriften gewissenhaft beachtet werden.

Die Technik selbst ist eine derartige, dal~ sich bei Anwendung des feuchten Verfahrens der ganze Vorgang in einem einzigen Gef/s der Schtittelflasehe, abspielt, wenn man yon der Fiseherpresse absieht, die unerls ist. Dadurch wird ein vielfaches Hantieren, ein Umleeren in verschiedene GefaSe und damit auch eine bakterieile Verunreinigung vermieden.

Schwierigkeiten bereitet dem Abf/~nger nur d i e entspreehende Ab- saugung, um die eingefrorene Masse troekenzulegen.

Diesbeziiglieh soil aus dem bereits angefiihrten Artikel (1. e.) nur das Wichtigste wiederholt werden, wobei ich mir aueh noeh einige Be- merkungen zu der eben erschienenen Arbeit yon F. Haagen und H.Graele erlauben m6ehte, in der zwei Aufsgtze yon mir fiber denselben Gegenstand angefiihrt sind. In einem dieser Aufs/~tze babe ieh geglaubt, die allm/~hlich im Laufe yon 15 Jahren gesammelten Erfahrungen auf dem Gebiete der


Herstellung yon Trockenimpfstoffen wiedergeben zu sollen, haupt- sgchlich aus dem Grunde, urn jenen Arbeitern, die zum ersten Male damit zu tun haben, Mil~erfolge zu ersparen. •ieht selten wird in Arbeiten, die teehnische Fertigkeiten erfordern, der Stoff so dargestellt, als h~tte sein Verfasser das Ergebnis seiner Versuche einer plStzliehen genialen Eingebung zu verdanken, ohne dab man es merkt, fiber wie viele MiB- erfolge er im Laufe seiner Arbeit gestolpert ist.

Im Laufe dieser historisehen Darstellung der eigenen Versuche und MiBerfolge sind aueh die sehon zur Zeit der Ver6ffentlichung nicht mehr in Gebraueh stehenden Ampullen erwghnt worden, die ein Aufsteigen des Inhaltes nach er- folgtem Tauen verhindern sollten. Das letzte Phiolenmuster, welches auf S. 447 1. e. abgebil- det ist, enthglt die Ein- kerbungen nieht mehr. Diese Einkerbungen waren aueh nieht n6tig, als in grSl~eren K(ilb- ehen 5,0 ccm Fliissig- keit trockengelegt w ur - den, in denen der In- halt naeh Art der Gela- tinerollrShrchen an den Wgnden lamellenartig Abb. 7. a = trockener Pockenimpfstoff, b = trockener Lyssa-

impfstoff; beide in Ampunen. eingetroeknet war.

Herr Haagen wird sich gewil~ erinnern, solehe K61bchen aus dem Jahre 1936 gesehen zu haben, als er vor einigen Jahren der Wiener Staats- Impfanstalt das Vergnfigen seines Besuches schenkte.

Beim Troekenlegen weniger Ampullen hat es niemals derartige Sehwie- rigkeiten, wie das Auftauen des Inhaltes, gegeben. Arbeitet man jedoch mit gr6Beren Mengen, 180--200 Ampullen (derzeit stellen wir 300 auf einmal her, und es steht ein Ger~t vor seiner Fertigstelhing, welches 500 Ampullen in einem Arbeitsgang zu erledigen erlaubt), so kommt es vor, dab in verschiedenen Ampullen der ][nhalt taut. Wir haben lange naeh der Ursaehe gesucht, sind aber erst verhs spiit darauf- gekommen, dal~ die Kglte selbst bei Verwendung yon C02-Sehnee oder gestampftem C02-Eis oder die 12stfindige Einwirkung einer Temperatur yon - -12- -14 ~ C die imZent rum der Ampullenmenge liegenden Ampullen nicht immer so tief abzukiihlen vermag, dab ihr Inhalt beinhart fest- friert. Die naheliegende genauere Besichtigung der tiefgekfihlten Ampullen hgtte Zeit gekostet, die nicht zur Verfiigung stand, wollte man den Kfihl-

200 M. Kaiser:

effekt nieht gefiihrden und die Ampullen nicht mit Kondenseis aus der Zimmerluft beladen. Offenbar ist aus demselben erw~hnten Grunde a uch beim Absaugen der PhioleninhMt in den Ampullen aufgestiegen. Es war nur einem Zufall zuzuschreiben, dab das Tauen gerade in Ampullen beobachtet wurde, die Glucosevirus enthielten.

.4xbeitet man mit geringen 5Iengen yon festgefrorener Fliissigkeit, so kann die Gasballastpumpe yon Gaede der Fa. Leybold ausgezeiehnet ohne KiihlfMle verwendet werden. Unsere Anstalt besitzt seit mehreren Jahren eine derartige Pumpe, die auf S. 429 des Arch. Virusforseh., Bd. II , 1942, abgebflde~ ist. Hat man jedoch viel Wasser abzusaugen, so hat sich uns die Kiihlfalle a.ls ausgezeiehnetes MitteI bew/~hrt, das Wasser abzufangen, bevor es die Pumpe erreicht, und diese zu schonen. 7

Die Kohlensiiurebescha/]ung fiir die KiihlfMle verursacht uns keine Schwierigkeite n. Ein Kilogramm koste$ 56 Pfennig, und es gelingt in einem Dewarschen Gef/iB, das eine Glycerin-Brennspiritus-COs-Mischung enth/~lt, die Temperatur beinahe 8 Tage im offenstehenden GefiiB bei Zimmertemperatur auf - -50- -60 ~ zu erhalten.

Die Herstellung yon Dry.Ice haben Mr im Anfang unserer Arbeiten aueh versucht und dabei einen in den Vereinigten Staaten angefertig~en Apparat benutzt, der aus der auf den Kopf gestellten Bombe CO 2 ent- nahm, durch ein Kupferrohr mit Diise in einen mit Stoff ausgekleideten Kompressor leitete, in dem die expandierte CO~ lest wurde. Die Material- versehwendung (etwa 70--80%) war eine unverh/~ltnism~Big grol3e und erwies sieh angesiehts der angenehmen Beschaffung fester C02 in groBen B16eken als untragbar.

Vorbedingung des Gelingens eines tadellosen Trockenimpfstoffes ist also das v6llige Dutch- und Fest/rieren des sl~iteren Trockengutes. Ist einmsl die Zeit bekannt, die n6tig ist, um unter bestimmten Verh/ilt- nissen eine bestimmte Anzahl yon Ampullen bestimmten Inhaltes so zu ktihlen, dab ihr Inhalt sicher lest gefroren ist, so ist eine weitere Kon- trolle als die der Zeit nieht mehr erforderlich.

Werden nunmehr die Ampullen unter ein entsprechendes Vakuum gesetzt (praktiseh 1--0 ram) und wird dieses Vakuum aufrecht erhalten, so kann der AmpuUeninhalt nicht tauen, er kann also nieht zusammen- klumpen und es bleibt nach Abdampfen des Eises ein sehwammiger Kuchen, der die Vorbedingung fiir die so/ortige Aufl6sbarkeit nach Zu- satz des LSsungsmittels ist.

Es ist nieht zweckm/tl~ig, zwisehen die Pumpe und das Vakuumgefi~g Trockentiirme, wie sie auch von einigen amerikanisehen Autoren vorge- sehlagen wurden, einzusehalten (z. B. Caleiumearbonat, Chlorealeium

7 Es empfiehlt sich, die abgesaugten D/~mpfe vor der Pumpe weilbgehend abzuseheiden, weii sonst die Pumpe unn6tig grol3 gewiihlt werden m~if~t~. Seybolds Liste 30, Gasballastpumpen, S. 2.

Versuche zur Herstellung eines trockenen Lyssaimpfsloffes. 201

Drierite, Phosphorpentoxyd oder Kieselgel u. dgl. m.), weft dadurch ein Widerstand geschaffen wird, der d~s rasche Absaugen verhindert, welches fiix das Gelingen der angestrebten Trockenform wesentlich ist. Es gelingt natfirlich auch auf die eben beanstandete Weise eine feuchte Substanz zu trocknen; ein porSser sehwammiger KSrper lgl3t sich jedoeh auf solehe Art niemals erzielen.

Fi~r die Au/bewahrung des V./.-Trockenimp]stoHe8 ist die Au/recht- erhaltung eines Vakuums in den Amp'allen nicht n6tlg, was auch yon Remlinger (l. e.) festgestellt wurde, l~rigens entsteht ein leichter Unter- druck schon beim Abschmelzen in der Gebl~seflamme, welche die in der Ampull e vorhandene Luft ansaugt.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dab das beschriebene Ver- fahren eine Reihe yon Vorteilen mit sich bringt (denen stets die Annahme zugrunde liegt, dab die Immunisierung mit totem V.f. ebenso gelingt wie mit lebendem, eine Annahme, die nieht den Gegenstand der vorliegenden Versuche bildete):

1. Die weitgehende mechanische AufschlieBung des virushaltigen Impfstoffes in einem virust6tenden Vehikel ermSglicht nich~ nur eine raschere AbtStung des Virus, sondern auch eine grfindlichere Extraktion yon Ballaststoffen. Eine weitergehende Aufschliel3ung des Rohstoffes erleichtert aueh eine sp~tere Auswertung der Vaccinen, fiber deren Sehwierigkeiten M. Nilzoldi im Kap. VI seiner sehr gewissenhaften Besehreibung des Hemptschen Verfahrens (l. c.) mit Recht klagt. Bei der sehr ungleichm~Bigen Verteilung des Virus fiber die verschiedenen Hirnpartien ist es yon grSl3ter Wiehtigkeit, den Rohstoff mSglichst weitgehend zu zerkleinern und eingehendst zu mischen, damit die beschricbenen Ungleichheiten verschwinden. Die minimale GrSBe des Virus verursacht sicher auch dann noeh Differenzen in der Verteilung, aber sie sollen wenigstens teehniseh, soweit als es gegenws tunlich ist, beh0ben werden,

2. Der 'Impfstoff ist frei yon Carbol, das bci selbstverst/indlichem sterilem Arbei ten vollkommen fiberflfissig ist. Etwaige aus der Luft im Laufe: der Verarbeitung in den Impfstoff geratenen Keime werden dureh die -i~herbehandlung abget6tet. Eine Vermehrung sparer hinzugekommener Keime in der H.M.-Masse ist ausgeschlossen, well d i e Aufschwemmtmg sofort tier gekfihl~ wird und spi~ter in der Trockensubstanz eine Vermehrung yon Keimen nicht stattfinden kann.

3. Die Paekung des Impfstoffes ist eine feste, dauerhafte. Die Haltbar- keit als An$igentr/~ger kann derzeit nicht bestimmt werden, keinesfalls kann sie kfirzer sein als die des fliissigen Impfstoffes.

Die Trockensubstanz 15s$ sich sofort nach Zusatz der vorgeschriebenen Menge physiologischer Lfsung und nach wiederholtem Durehziehen

202 M. Kaiser:

durch die Spritze und gibt eine Aufschwemmung, die in keiner Weise der des iibliehen Hemptsehen Impfstoffes naehsteht.

Die Paekung erfolgt in Einzeldosen wie der originale Hemp~sehe Impfstoff und erleiehtert den dezentralisierten Gebraueh.

Schlie$1ieh seien dig einzelnen Phasen des Verfahrens noeh iibersieht- lich zusammengestellt.

1. Griindliches Befreien der H.M..~asse yon H~uten un4 GefaSen unter Glassehutz.

2. Durehpressen der H.M.-Masse dutch eine Fiseherpresse. 3. Entnahme yon Proben fiir Sterilit~tspriifung.

Feuchtes Verfahren: Trockenes Verfahren:

4a. Einfiillen der zerkleinerten 4b. Einftillen der zerkleinerten ll.M.-Masse in ein tariertes Schiittel. tI .~.-Masse in eine sterile Petri- gef/~B, sehale und Ausbreiten in diinner

5a. Feststellung des Feucht- •ettogewichtes.

6a. Abstellen des Schiittel- gef&fles im Tiefkfihlsehrank bis zum Abschlul~ der bakteriologischen Prii- lung.

7a. Auffiillen der fiinffachen Menge yon ~tber sulf. (pro nareosi).

8a. Schtitteln durch 8 Stunden.

9a. Ersatz des Glasstopfens

Schieht. Gewicht feststellen. 5 b. Festfrierenlassen durch

24 Stunden im Tiefkiihlschrank. 6b. Abwarten des Ergebnisses

der Sterflit/s

7 b. Zersehneiden der gefrorenen Masse.

8 b. Einstellen in einen Exsiccator fiber P~O 5 oder Kieselgel im Hoch- vakuum auf 72 Stunden.

9b. Entfernen des Troekengutes dureh eine Metallkappe oder Watte- und Verreiben unter Glassehutz. stopfen.

10a. Zentrifugieren bei hoher 10b. Einfiillen des H.M.-Pulvers Tourenzahl durch 1/~ Stunde. in das Schiittelgefg~,

l l b . Auffiillen der fiinffachen Menge des H.M.-Feuehtgewichtes yon $_ther sulf. (pro narcosi).

12b. Schiitteln durch 8 Stunden. 13b. Ersatz des Glasstopfens

dutch eine Metallkappe oder Watte- stopfen.

14b. Zentrifugieren bei hoher Tourenzahl dutch 1/2 Stunde,

l l a bzw. 15b. Absaugen des Xthers und eventuelles Absaugen der leichtbeweglichen obersten Sedimentschicht.


12a bzw. 16b. Verdunstenlassen des restlichen J~thers im Wasser. bad bei 37 ~

13a bzw. 17b. Aufffillen der Schfittelflasehe mit der ffinffachen Menge des Feuchtgewichtes des H.M. yon aqua dest., das 10~/o einer 10~ Gel. ster. Merck, erhitzt auf 3 Atfi, enth~It.

14a bzw. 18b. Neuerliches Schiitte]n nach Wiedereinsatz des Glas- stopfens bis zur vSlligen Zerkleinerung des Schfittelgutes.

15a bzw. 19b. Umfiillen des Schfittelgutes samt Glasperlen in einen Glastrichter mit Gazefilter, das auch den Schaum beseitigt.

16a bzw. 20b. Abfiillen zu je 2 ccm in sterile Ampullen. 17a bzw. 2 lb . Festes Durchffierenlassen des Ampulleninhaltes im

Tiefkiihlschrank oder fiber C02-Eis. 18a bzw. 22b. Absaugen im t tochvakuum fiber Kieselgel oder i)205. 19a bzw. 23b. Trocknenlassen dutch 72 Stunden. 20a bzw. 24b. Abschmelzen der Ampullen.

Modifiziertes Troekenveffahren.

Punkt 1 bis einschlie/~lich 13b wie oben. Punkt 14c. Aufstellen bei einer Temperatur yon - -12- -14 ~ senkreeht

behufs Sedimentierung des Inha]ts. Punkt 15c. Absaugen des ~thers mit Hilfe der Wasserstrahlpumpe.

P u n k t 16c. Verseh]ieBen der Schfittelfl~che mit Aluminiumkappe oder Zellstoff.

Punkt 17c. Einstellen in Thermostaten bei 37 ~ oder entsprechendes Wasserbad bis zum Trocknen.

Punkt 18c. Aufsehfitte]n der Glasperlen und Einffillen der efforder- lichen Menge yon physiologischer L5sung.

19e. Umleeren in einen Erlenmeyerkolben fiber einen die Glasper]en auffangenden Trichter,

welter wie 20b bis 24b.

Naehtrag bei der Korrektur.

W ~ r e n d der Drucklegung obigen Aufsatzes sind weitere Troeken- versuehe vorgenommen worden, darunter aueh einzelne mit stark durch- bluteten Hirnen.

In unseren bisherigen Versuehen ist stets auf die Entnahme eines grigndlichst entbluteten Rohstoffes vor Eintri t t der Agone geaehtet worden, um eine agonale Invasion yon Keimen in die Blutbahn zu Verhindern. Bezfig]ieh der Verwendung eines derartigen vor der iibliehen ,,TStungs- zeit" enr Rohstoffes verweise ich auf Jam esGordon Cumming, J. infect. Dis. (Am.) 14, 33 (1914).

Offenbar war es in unseren bisherigen Versuehen auch der erw~hn*

204 M. Kaiser :

t e n V o r s i c h t s m a ~ n a h m e zu v e r d a n k e n , d a b d ie I m p f s t o f f e f re i y o n l e b e n -

d e n B a k t e r i e n b l i e b e n .

Stark durchblutete Hirne k o n n t e n j e d o c h a u f d ie b i s h e r b e s c h r i e b e n e

A r t n i c h t v o l l k o m m e n b a k t e r i e n f r e i g e m a c h t w e r d e n . E s i s t d e s h a l b e in

V e r f ~ h r e n i n A ~ s a r b e i t u n g , d a s s u c h d i e s e m M a n g e l a b h f l f t . E s soU n a c h

A b s c h l u ~ d e r V e r s u c h e v e r S f f e n t l i c h t w e r d e n .

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Versuche zu r Hers te l lung eines t rockenen Lyssaimpfstoffes . 205

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Archly L Ytrusforschung, Bd. III, ~. 4. 15

206 M. Kaiser: Versuche zur Herstel lung eines trockenen Ly.ssaimpfstoffes.

contre l ' inoeula t ion sous-dure-m~rienne de v i rus rab ique fixe au m o y e n de ce rveaux trait~s pa r l '~ther. C . r . Soe. Biol. 82, 52 - -54 (1919). - - 53 Rein- linger, P.: Act ion de l '~ther sur le v i rus rabique. Ann. Ins t . Pas teur , Par . 3a, 616--633 (1919). - - ~ Remlinger, P. : Cont r ibu t ion ~ l '~tude de Fac t ion de la dessication sur le v i rus rabique, difference ent re le v i rus f ixe e t le v i rus de rue. C. r. Soc. Biol. 89, 1082 (1923). __55 Remlinger, P . : A quelle tempera- ture faut- i l dess~eher e t conserver moelles rabiques. C. r. Soc. Biol. 98, 19120 (1925). - - 5~ Remlinger, P., S. Palmov~tch et J. Bailly: Act ion de l '~ther sur diverses souches de v i rus rabique. C . r . Soe. Biol. 107, 760--762 (1931}. __ 57 Remlinger, P.: Act iou de la congela t ion sur le v i rus rabique. C . r . Soc. Biol. 116, 407--409 (1934). - - 5~ Remlinger, .P. et J. BaiUy: In f luence des passages de lapin & lapin sur la sensibilit~ du vi rus rabique ~ la dessicat ion et la Glycerine. C. r. Soc. Biol. 118, 1206 (1935). - -59 Remlinger, P.: Inf luence des passages ~ lapin sur la sensibilit~ du v i rus rab ique ~ l '~ther e t k la di lut ion. C. r. Soc. Biol. 119, 29---31 (1935). - - 60 Reml~nger, P. et J. BaiUy: Inf luence des passages de lapin ~ lapin sur la sensibflit~ d e v i rus f ixe & divers agents d ' a t t~nuat ion . Ann. Ins t . Pas teur , Par . 55, 157 (1935). Suppl. I~um. comm~- mora t i f sur la rage 157. - - 61 Reralinger, P. et J. Bailly: La congelat ion des moelles rabiques est-elle appl icable ~ la p ra t ique de la vaccination*. C . r . Soc. Biol. 121, 1614--1616 {1936). ~ ~2 Remlinger, P. et J. BaiUy: Etudes sur la Rage . Monogr. de r I n s t i t u t Pas teur , S. 55ff., Par i s : Masson et Cie. 1 9 3 8 . - 63 Remlinger, P. et J. BaiUy: La dessieat ion n ' a t t e n u e pus le v i rus rabique, elle le conserve. Ann. Inst . Pas teur , Par . 65, 130 (1940). - - ~ Ro- menslci, N . W . : Sur la composi t ion , min~rale du syst~me ne rveux cent ra l chez les lapins duns la rage exp~rimentale . Ann. Ins t . Pas teur , Par . 55, 181 (1935). - - 65 Schni~rer, Jose] u. Hans David: Die Schu tz impfung der Hunde gegen Wut . ~therimlafstoffe, S. 594. - - 6s Schweinburg, F.: Neuere Ergebnisse der Tol lwutforscbung, in Erg . Hyg . usw. 20 (1937). (Daselbst ausfiihrliche Li te ra turangaben. ) ~ 6~ Vansteenberghe, M . P . : Proe~d~ de conservat ion du virus rab ique ~ l '6 ta t sec. C . r . Soc~ Biol. 55, 1646 {1903). __ ss Virga, Ernesto: Sulla v i ru lenza e sulta resis tenza ai va r i agent i di a t t enua t ione del virus rabbico fisso. Gi. Ba t te r . 20, 47 (1938). Ref . Zbl. ges. Hyg . 41, 569 (1938). - - e9 Weisbach, A. : Der Wassergeha l t des Gehima nach Alter , Geschlecht und Krankhe i t . Med. J a h r b . X V L 4.8 11868).

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Ältere und neue Versuche zur Herstellung eines trockenen Lyssaimpfstoffes