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Analytische Ultrazentrifugation(AUZ)
Alexandra Beusch, Beatrice Lafargue
Methodenseminar, Januar 2007
• Aufbau der Analytischen Ultrazentrifuge
• Sedimentationslauf
(Sedimentationsgeschwindigkeitslauf)
• Gleichgewichtslauf
(Sedimentationsgleichgewichtslauf)
Gliederung
Fragestellung
• Homogenität der Probe
(Sedimentationslauf)
• Sedimentationskoeffizient
(Sedimentationslauf)
• Molekulargewicht (Gleichgewichtslauf)
Analytische Ultrazentrifuge (AUZ)
AUZ: 160 000€; Rotor: 18 000€; Zelle ca. 2 500€
max. 50 000 rpm
Probe: 450 µl
Optische Systeme
Probenkonzentration /-verteilung kann während des Laufes verfolgt werden Absorptionsoptik
Interferenzoptik
Wellenlänge frei wählbar (190-800 nm)
Probe muss Chromophor sein
OD()= 0.5-1.5
Probe muss kein Chromophor sein
Unterschiedliche Brechungsindizes (Probe und Lösungsmittel)
Geringere Empfindlichkeit -> höhere Proteinkonzentration (mind. 1mg/ml)
Schlierenoptik
+
++
Laser 675 nm
Analytische Ultrazentrifuge (AUZ)
Schlitten Absorption
Aufhängung Rotor
Linsensystem Interferenz
Aufhängung Optik
Radiometer
Strahlengang
Sedimentation
Wirkende Kräfte
Experiment
Auswertung
Van Holde Weischet Analyse
Sedimentation
Wie setzt sich der Sedimentationskoeffizient
zusammen?
Sedimentationskoeffizient
Fz = Zentrifugalkraft
mp = Partikelmasse r = radialer Abstand Partikel zu Rotationsachseω = Winkelgeschwindigkeit
Wirkende Kräfte:
pz mrF 2
• Fz ist dem Schwerefeld proportional
• Fz nimmt im Verlauf der Sedimentation zu
Wirkende Kräfte
Sedimentationskoeffizient
Fz = Zentrifugalkraft
Fb = Auftriebskraft
Wirkende Kräfte:
pz mrF 2
LmpLmpLm VmVm 2
~
Lmb mrF 2
• Fb wirkt Fz entgegen
• abhängig von Lösungsmittel
Wirkende Kräfte
mp = Partikelmasse r = radialer Abstand Partikel/Rotationsachseω = Winkelgeschwindigkeit mLm = Masse des verdrängten Lsg.mittelsVp = Teilchenvolumen ρLm = Lösemitteldichte
= partielles spezif. Volumen des Teilchens2
~V
Sedimentationskoeffizient
Fz = Zentrifugalkraft
Fb = Auftriebskraft
Ff = Reibungskraft
Wirkende Kräfte:
pz mrF 2
LmpLmpLm VmVm 2
~
Lmb mrF 2
vfFf
D
Tf
• Ff wirkt Fz entgegen
• f ist abhängig von Form, Größe und Hydratation des Partikels
• Zwischen den drei Kräften stellt sich ein Gleichgewicht ein (< 1 ms)
Wirkende Kräfte
mp = Partikelmasse r = radialer Abstand Partikel/Rotationsachseω = Winkelgeschwindigkeit mLm = Masse des verdrängten Lsg.mittelsVp = Teilchenvolumen ρLm = Lösemitteldichte
= partielles spezif. Volumen des Teilchens v = Geschwindigkeit des Teilchensf = Reibungskoeffizient k = Boltzmann KonstanteT = Temperatur D = Diffusionskoeffizient
2
~V
Sedimentationskoeffizient
Fz = Zentrifugalkraft
Fb = Auftriebskraft
Ff = Reibungskraft
Wirkende Kräfte:
pz mrF 2
LmpLmpLm VmVm 2
~
Lmb mrF 2
0 fbz FFFufFf
Wirkende Kräfte
D
Tf
mp = Partikelmasse r = radialer Abstand Partikel/Rotationsachseω = Winkelgeschwindigkeit mLm = Masse des verdrängten Lsg.mittelsVp = Teilchenvolumen ρLm = Lösemitteldichte
= partielles spezif. Volumen des Teilchens v = Geschwindigkeit des Teilchensf = Reibungskoeffizient k = Boltzmann KonstanteT = Temperatur D = Diffusionskoeffizient
2
~V
Einheit: = 1 S [Svedberg]
Sedimentationskoeffizient
Fz = Zentrifugalkraft
Fb = Auftriebskraft
Ff = Reibungskraft
Wirkende Kräfte:
pz mrF 2
LmpLmpLm VmVm 2
~
Lmb mrF 2
ufFf s
r
u
f
Vm Lmp
22
~1
s1310
Wirkende Kräfte
D
Tf
mp = Partikelmasse r = radialer Abstand Partikel/Rotationsachseω = Winkelgeschwindigkeit mLm = Masse des verdrängten Lsg.mittelsVp = Teilchenvolumen ρLm = Lösemitteldichte
= partielles spezif. Volumen des Teilchens v = Geschwindigkeit des Teilchensf = Reibungskoeffizient k = Boltzmann KonstanteT = Temperatur D = Diffusionskoeffizient
2
~V
Sedimentation
Welche Informationen liefert das Sedimentationsexperiment ?
Sedimentationsexperiment mögliche Erkenntnisse
• Bestimmung des/der Sedimentationskoeffizienten s
• Aussage über Zusammensetzung bzw. Reinheit der Probe (homogen, heterogen)
• Aussage über die partielle Konzentration der einzelnen Komponenten
Sedimentationsexperiment Vorab: Überlegungen
? In welchem Puffer soll Protein/Partikel gelöst sein ?
z.B.: TRIS absorbiert bei 205 nm sehr stark, Phosphatpuffer nicht
? Bei welchen Wellenlängen möchte ich messen ?
z.B.: 280 nm → aromatische AS, 205 nm → Peptidrückgrad
? Bei welcher Geschwindigkeit soll gemessen werden ?
abhängig von MW; so hoch wie möglich, um die Diffusion an der Sedimentationsfront zu minimieren, ABER: es werden für eine gute Auswertung mind. 15-20 Scans für benötigt; im Zweifel mehrere Läufe bei unterschiedl. Geschwindigkeiten
? Wie viele Scans in welchem zeitlichen Abstand?
so viele Scans wie möglich über die komplette Probenzelle in kurzem zeitlichen Abstand
Sedimentationsexperiment Vorbereitungen
Doppelsektorzelle
Reference = Lösungsmittel, 420 µl
Sample = Probe in Lösungsmittel, 400 µl
- unterschiedliche Befüllung wichtig für Messung der Menisken
- sektorförmige Messzelle vermeidet Konvektionen
Zelle zusammenbauen, befüllen und in Rotor einsetzen
Rotor in Zentrifuge einsetzen, Optik einschrauben
Zentrifuge starten und Vakuum ziehen lassen
mind. 30 min bei geringer Geschwindigkeit (ca. 3000 rpm) einlaufen lassen, um konstante Temperatur zu erreichen
Experiment starten
Dauer: ca. 3 – 4 h
Sedimentationslauf Rohdaten
rm = Radius Meniskus rbnd= boundary (Wendestelle der Sedimentationsfront) rb = Radius Boden
Probe
Lösemittel
radiale Verdünnung durch sektorförmige Messzelle
Auswertung Programm: Ultrascan
Auswertungssoftware: Ultrascan (by Borries Demeler and The University of Texas)
1. Editieren des Rohdatensatzes
(Anzeige der Menisken und des Plateaus)
Auswertung Programm: Ultrascan
Auswertungssoftware: Ultrascan (by Borries Demeler and The University of Texas)
1. Editieren des Rohdatensatzes
(Anzeige der Menisken und des Plateaus; Möglichkeit, einzelne Scans zu eliminieren, um Randeffekte („boundary“) auszuschließen)
Auswertung Programm: Ultrascan
Auswertungssoftware: Ultrascan (by Borries Demeler and The University of Texas)
1. Editieren des Rohdatensatzes
(Anzeige der Menisken und des Plateaus; Möglichkeit, einzelne Scans zu eliminieren, um Randeffekte („boundary“) auszuschließen)
2. Auswertung der bearbeiten Daten mit der Enhanced Van Holde-Weischet Analyse (vHWA)
Auswertung vHWA
Noch mal ein bisschen Theorie:
Die Van Holde Weischet Analyse (vHWA)
Auswertung Warum vHWA?
• korrigiert für Diffusionseffekte
• Möglichkeit der besseren Auswertung von heterogenen Proben und Proben mit zwei oder mehr gut voneinander getrennten Komponenten
• Auswertung von Datenpunkten in Zell-Bodennähe und von Scans ohne stabiles Plateau möglich
Warum van Holde Weischet?
Auswertung vHWA
Verbreiterung der Sedimentationsfront (Boundary
Spreading) : Diffusion vs. Heterogentiät
• Partikel unterliegt im Zentrifugalfeld ungerichteter und gerichteter Diffusion
• Ungerichtet: BROWNsche Molekularbewegung
• Gerichtet/wechselseitig: Konzentrationsgefälle an der Sedimentationsfront
• führt zu einer Verbreiterung der Sedimentationsfront = Vortäuschung breiter S-Verteilung; allerdings überwiegt mit vorschreitender Zeit die Sedimentation die Diffusion
Auswertung vHWA
Boundary Spreading: Diffusion vs. Heterogenität
Probe mit nur einer einzigen sedimentierenden Komponente
Auswertung vHWA
Boundary Spreading: Diffusion vs. Heterogenität
Probe mit mehreren Komponenten
Auswertung vHWA
Boundary Spreading: Diffusion vs. Heterogenität
Auswertung vHWA
Berechnung der apperenten Sedimentationskoeffizienten
Auswertung vHWA
Extrapolationsplot
Auswertung vHWA
Distributionsplot
Auswertung vHWA: Originaldaten
Gleichgewichtslauf
am Beispiel eines Einkomponentensystems
Gleichgewichtslauf
Konzentrationsreihe
Probenmeniskus
Lösungsmittelmeniskus 3x identische Probe100µl
3x identischer Puffer120 µl
Gleichgewichtslauf
6 000 rpm
8 000 rpm
10 000 rpm
0 h
Diffusion Sedimentation
Im Gleichgewicht kein netto-Stofftransport
Gleichgewicht ist abhängig von…
Diffusion Sedimentation
• Molekulargewicht
• Pufferviskosität
• Länge der Flüssigkeitssäule
• Temperatur
• WinkelgeschwindigkeitMeniskus: darf kein Protein enthalten,
Aber auch keine vollständige Sedimentation!
Gleichgewichtslauf
MP =Molekulargewicht Protein = partielles spezif. Volumen des Teilchens R = allg. Gaskonstante = [8.31 J/(K*mol)] ρLM = LösemitteldichteT = Temperatur ω = Winkelgeschwindigkeitr = Abstand Partikel-Rotationsachse c = Konzentration
PV~
)(
)(ln
)~
1(
222 rd
cd
V
TRM
LMP
P
Gleichgewichtslauf- lineare Auswertung
Ergebnis: 147 - 377 kDa
MP = Molekulargewicht Protein = partielles spezif. Volumen des Teilchens R = allg. Gaskonstante = [8.31 J/(K*mol)] ρLM = LösemitteldichteT = Temperatur ω = Winkelgeschwindigkeitr = Abstand Partikel-Rotationsachse c = Konzentration
PV~
2
2
)~
1(ln
2
rTR
VMc LMPP
Gleichgewichtslauf- Global Fit
BTR
rrVMA LMP
erc
2
)()~
1()ln( 20
22
)(
MP = Molekulargewicht Protein = partielles spezif. Volumen des Teilchens R = allg. Gaskonstante = [8.31 J/(K*mol)] ρLM = LösemitteldichteT = Temperatur ω = Winkelgeschwindigkeitr = Abstand Partikel-Rotationsachse c(r) = Konzentration am Punkt rA = Amplitude B = Baseline
PV~
)(
)(ln
)~
1(
222 rd
cd
V
TRM
LMP
P
= Parameter können „freigegeben“ werden
Gleichgewichtslauf- Global Fit
Gleichgewichtslauf- Global Fit
******************************************************************************************* Global Equilibrium Analysis *******************************************************************************************
Data Report for Project "SampleFit"Fitted Model: 1-Component, Ideal
Parameters for this model:
Molecular Weight for component 1: 5.085e+05 dalton (fitted)Partial Specific Volume for component 1 (at 20ºC): 7.200e-01 ccm/g (fixed)
Global Fitting Statistics:
Variance: 3.0158e-05Standard Deviation: 5.4916e-03Number of floated Parameters: 13Number of Datasets: 6Number of Datapoints: 1225Number of Degrees of Freedom: 1212Number of Runs: 243 (61.277 %, corrected)Expected Number of Runs: 198 (corrected)Run Variance: 9.837e+01 (corrected)
According to these statistical tests, this model is a good candidate for the experimental data.This fit is recommended for Monte Carlo Analysis.
Detailed Information for fitted Scans:
• Gleichgewichtslauf:
stationärer Zustand => Molekulargewicht mit hoher
Genauigkeit
• Sedimentationslauf:
Informationen über Sedimentationskoeffizient,
Reinheit und Zusammensetzung der Probe
Zusammenfassung
Vorteile
• Hydrodynamische Methode:
Proteine in Lösung; kein Kontakt mit Trägermaterialien
• Gemische können analysiert werden
• Kein/kaum Probenverlust
• Absolutmethode: keine Kalibrierung– Masse– Größe – Dichte
Literatur
www.beckmancoulter.comwww.nanolytics.de
Software
http://www.ultrascan.uthscsa.edu/