Phage-DisplayPhage-Display

Thomas Thomas HaarmannHaarmannAG DietrichAG Dietrich

Methodenseminar Biochemie Methodenseminar Biochemie IIII

20.01. und 10.02.200920.01. und 10.02.2009

ÜbersichtÜbersicht

•• Allgemeine EinführungAllgemeine Einführung

•• Phage M13Phage M13

•• VektorenVektoren

•• BibliothekenBibliotheken

•• SelektionsablaufSelektionsablauf

•• AnwendungsmöglichkeitenAnwendungsmöglichkeiten

Phage-DisplayPhage-Display•• Selektionstechnik, die darauf basiert, dassSelektionstechnik, die darauf basiert, dass

Peptide/Proteine/Antikörper auf der OberflächePeptide/Proteine/Antikörper auf der Oberflächevon von Bakteriophagen Bakteriophagen präsentiert werden.präsentiert werden.

•• Die DNA, die das präsentierteDie DNA, die das präsentiertePeptid/Protein/Antikörper kodiert befindet sichPeptid/Protein/Antikörper kodiert befindet sichinnerhalb desinnerhalb des BakteriophagenBakteriophagen..–– Kopplung von Kopplung von Geno-/PhänotypGeno-/Phänotyp

–– Einfache IdentifikationEinfache Identifikation der selektiertender selektiertenPeptide/Proteine/AntikörperPeptide/Proteine/Antikörper durch durch SequenzierungSequenzierungder kodierenden DNA.der kodierenden DNA.

–– Einfacher Aufbau von zufälligenEinfacher Aufbau von zufälligen BibliothekenBibliothekendurch Klonieren von durch Klonieren von randomisierten randomisierten DNA-DNA-Sequenzen in den Sequenzen in den Phagen-VektorPhagen-Vektor..

Filamentöse BakteriophagenFilamentöse Bakteriophagen•• Genus Genus InovirusInovirus

–– f1,f1, fd fd und M13 sind die bekanntesten (98%und M13 sind die bekanntesten (98%homolog)homolog)

–– benutzen den benutzen den F-Pilus F-Pilus zur Infektionzur Infektion•• Konjugation (horizontaler Gentransfer)Konjugation (horizontaler Gentransfer)

–– spezifisch für spezifisch für E. E. colicoli die das die das F-Plasmid F-Plasmid besitzenbesitzen

AufbauAufbau•• GrößeGröße

–– 6,5 nm6,5 nm im Durchmesserim Durchmesser

–– 930 - 2000 nm Länge (abhängig von der Genomgröße)930 - 2000 nm Länge (abhängig von der Genomgröße)

–– Proteinzylinder umgibtProteinzylinder umgibt und schützt das Genomund schützt das Genom

GenomGenom–– einzelsträngigeseinzelsträngiges, zirkuläres DNA-Molekül, zirkuläres DNA-Molekül (6407 (6407 bpbp))

–– 11 Gene11 Gene

–– gruppiert nach Aufgaben im Lebenszyklusgruppiert nach Aufgaben im Lebenszyklus

Replikation

Capsid-ProteineZusammenbau

5

5

5

5

2700

Kopien

108ZusammenbauXI

405ZusammenbauIV

348ZusammenbauI

32Capsid ProteinIX

33Capsid ProteinVII

112Capsid ProteinVI

406Capsid ProteinIII

50Haupt Capsid ProteinVIII

87Bindung der ssDNAV

111DNA ReplikationX

410DNA ReplikationII

AminosäurenFunktionGen

Funktionen der GeneFunktionen der Gene

Lebenszyklus ILebenszyklus I

•• Bindung des Bindung des Phagen Phagen über über pIII pIII an Fan F++-Pilus-Pilus

•• zurückziehen deszurückziehen des PilusPilus, Bindung an, Bindung an TolA TolA (bakterielles Membranprotein)(bakterielles Membranprotein)

•• Phagen-DNA Phagen-DNA wird in die Bakterienzelle eingeschleustwird in die Bakterienzelle eingeschleust

Lebenszyklus IILebenszyklus II

pII

•• Synthese des Doppelstrangs (bakterielle Enzyme)Synthese des Doppelstrangs (bakterielle Enzyme)

•• Gyrase Gyrase ((TopoisomeraseTopoisomerase) katalysiert die Bildung von ) katalysiert die Bildung von dsDNA dsDNA supercoilssupercoils ((replikativereplikativeForm)Form)

•• ein Strang (-) dient als Vorlage zur Transkription und ein Strang (-) dient als Vorlage zur Transkription und Translation Translation der der PhagenproteinePhagenproteine

•• Amplifikation Amplifikation der DNA unter Mithilfe von der DNA unter Mithilfe von pII pII ((EndonukleaseEndonuklease) und bakteriellen) und bakteriellenEnzymen mittels eines Enzymen mittels eines rolling circlerolling circle MechanismusMechanismus

•• der neue (+)-Strang wird durch der neue (+)-Strang wird durch pV pV davor geschützt, wieder zum Doppelstrangdavor geschützt, wieder zum Doppelstranggemacht zu werden, 78 gemacht zu werden, 78 Nukleotide Nukleotide bilden einen bilden einen Hairpin Hairpin der als Verpackungssignalder als Verpackungssignaldientdient

Lebenszyklus IIILebenszyklus III

Phagenpartikel

•• An der Membran bildetAn der Membran bildetsich ein Komplex aus sich ein Komplex aus pIpI,,pIV pIV und und pXIpXI, der zum, der zumZusammenbau desZusammenbau desPhagen Phagen führtführt

•• Während des Während des nicht-nicht-lytischen lytischen AusschleusensAusschleusensdes des Phagen Phagen wird wird pV pV durchdurchpVIII pVIII ersetzt und dieersetzt und dieCapsid-Proteine Capsid-Proteine werdenwerdenangehängtangehängt

pII

DarstellungsmöglichkeitenDarstellungsmöglichkeiten

•• pVIIIpVIII–– 2700 Kopien2700 Kopien

–– wenn jede Kopie benutzt wird sind nur kurzewenn jede Kopie benutzt wird sind nur kurzePeptide (6-8 Peptide (6-8 aaaa) möglich) möglich

–– Selektion von Bindungspartnern mit hoher Selektion von Bindungspartnern mit hoher AviditätAvidität

•• pIIIpIII–– 5 Kopien5 Kopien

–– geeignet für große Proteinegeeignet für große Proteine

–– Selektion von Bindungspartnern mit hoher AffinitätSelektion von Bindungspartnern mit hoher Affinität

M13-Wildtyp-VektorM13-Wildtyp-Vektor

Was kann dargestellt werden?Was kann dargestellt werden?

Kommerzielle Kommerzielle PhagenbankenPhagenbanken

Phage-Display Selection - Phage-Display Selection - ““BiopanningBiopanning””

Binding toBinding toimmobilised targetimmobilised target

BindingBinding WashingWashing

AmplificationAmplification ElutionElution

Amplification of individual clonesAmplification of individual clones

Test for binding of isolatedTest for binding of isolated

clones using ELISAclones using ELISA

Sequence DNA insert and deduceSequence DNA insert and deduce

sequence of displayed peptidesequence of displayed peptide

PlatingPlating

scFV-LibraryscFV-Library

PhagemidPhagemid

PhagemidePhagemide

•• bakterieller bakterieller ReplikationsursprungReplikationsursprung

•• bakterielles bakterielles ResistenzgenResistenzgen

•• Gen für das Gen für das Peptid-Phage-FusionsproteinPeptid-Phage-Fusionsproteinunter derunter der Kontrolle eines spezifischen,Kontrolle eines spezifischen,induzierbaren induzierbaren PromotorsPromotors

•• viraler Replikationsursprungviraler Replikationsursprung

•• virales virales VerpackungssignalVerpackungssignal

•• helper phagehelper phage (mit nicht-funktionalem(mit nicht-funktionalemVerpackungssignal)Verpackungssignal)

PanningPanning

Selektion HIV-Antikörper spezifische Selektion HIV-Antikörper spezifische PhagenPhagen

Humbert, M; 2005

•• ParamagnetischeParamagnetischeKügelchenKügelchen mit anti-mit anti-human Antikörperhuman Antikörperumhülltumhüllt

•• Zugabe von HIV-Zugabe von HIV-positivempositivemPatientenserumPatientenserum

•• Zugabe der komplettenZugabe der komplettenPhagenbankPhagenbank

•• Bindung der Bindung der PhagenPhagen

•• wegwaschen derwegwaschen derungebundenen ungebundenen PhagenPhagen

Selektion HIV-Antikörper spezifischer Selektion HIV-Antikörper spezifischer PhagenPhagen

•• ParamagnetischeParamagnetischeKügelchen mit anti-Kügelchen mit anti-human Antikörperhuman Antikörperumhülltumhüllt

•• Zugabe von HIV-Zugabe von HIV-negativemnegativem SerumSerum

•• Zugabe der in derZugabe der in derpositiven Selektionpositiven Selektioneluierten Phageneluierten Phagen

•• Bindung derBindung der PhagenPhagen

•• Nicht-gebundene (HIV-Nicht-gebundene (HIV-spezifische) spezifische) Phagen Phagen imimÜberstandÜberstand

Selektion HIV-Antikörper spezifischer Selektion HIV-Antikörper spezifischer PhagenPhagen

•• Amplifikation Amplifikation derderspezifisch gebundenenspezifisch gebundenenPhagenPhagen

•• WeitereWeitereSelektionsrundenSelektionsrunden(insgesamt 3-4)(insgesamt 3-4)

•• AmplifikationAmplifikationindividueller individueller PhagenPhagen

•• Test der Bindung derTest der Bindung derisolierten isolierten Phagen Phagen anandas das Target Target im ELISAim ELISA

•• Sequenzierung Sequenzierung derderpositiven positiven PhagenPhagen

3DEX3DEX•• Antikörper bindenAntikörper binden selten anselten an

lineare Strukturen, sondernlineare Strukturen, sondernmeist an meist an konformelle Epitopekonformelle Epitope

•• Identifizierung solcherIdentifizierung solcherEpitope Epitope ist schwierigist schwierig(Mutationsstudien)(Mutationsstudien)

•• EntwicklungEntwicklung einer Softwareeiner Software(3DEX - 3D (3DEX - 3D EpitopeEpitopeeXplorereXplorer))

•• Suche nach exponiertenSuche nach exponiertenlinearenlinearen Peptidsequenzen inPeptidsequenzen in3D-Strukturen (3D-Strukturen (pdb-Dateienpdb-Dateien))

•• Vergleich mit derVergleich mit derPhagensequenzPhagensequenz

Mirror Image Phage DisplayMirror Image Phage Display

•• natürlich vorkommendenatürlich vorkommende Proteine sindProteine sindaus L-Aminosäuren aufgebautaus L-Aminosäuren aufgebaut

•• für therapeutische Anwendungen sindfür therapeutische Anwendungen sindD-Peptide besser geeignet, da sie imD-Peptide besser geeignet, da sie imKörper nicht so leicht abgebaut werdenKörper nicht so leicht abgebaut werden

•• D-Peptide sind weniger D-Peptide sind weniger immunogenimmunogen

•• Phage Display mitPhage Display mit den den „„SpiegelbildernSpiegelbildern““der L-Peptide, also mit den D-Peptidender L-Peptide, also mit den D-Peptiden

Mirror Image Phage DisplayMirror Image Phage Display

•• Synthese von D-Peptiden ausgehend von den natürlichen L-Synthese von D-Peptiden ausgehend von den natürlichen L-Peptiden alsPeptiden als TargetTarget

•• Selektion von passenden L-PeptidenSelektion von passenden L-Peptiden

•• SyntheseSynthese dieser L-Peptide als D-Peptidedieser L-Peptide als D-Peptide

•• D-Peptide binden dasD-Peptide binden das originale L-Peptidoriginale L-Peptid