Anleitung zum Pflanzenphysiologisches Praktikum für Anfänger

Anleitung zum

Pflanzenphysiologisches Praktikum für Anfänger

zuletzt überarbeitet von

Claus Buschmann, Manfred Focke, Verena Geuting, Daniela Kobbe,

Michael Pacher, Rebecca Wurz

Oktober 2005

Botanisches Institut II Universität Karlsruhe

1

Inhalt

Allgemeiner Teil • Literatur • Protokolle • Sicherheit • Umweltschutz • Grundlagen

1. Photosynthese und Wasserhaushalt 1.1 Extraktion von Blattfarbstoffen 1.2 Dünnschichtchromatographie (DC) von Chlorophyllen und Carotinoiden 1.3 Absorptionsspektren von Blättern und Blattfarbstoffextrakten 1.4 Chlorophyllfluoreszenz 1.5 photosynthetische Sauerstoffentwicklung 1.6 Assimilationsstärke in Blättern 1.7 Diurnaler Säurerhythmus der Crassulaceen (CAM) 1.8 Saugspannung von Kartoffelzylindern 1.9 Transpiration 2. Enzyme 2.1 Nachweis einiger Enzyme im Kartoffelpresssaft 2.2 Messung des Spektrums von NAD+ und NADH 2.3 Isolierung und Nachweis enzymatischer Aktivität von Amylase aus Weizen-Körnern 3. Molekularbiologie 3.1 Isolierung, Verdau und elektrophoretische Trennung von DNA 3.2 Demonstration von Membraneigenschaften 4. Naturstoffe und Phytohormone 4.1 Bestimmung des Gesamtflavonolgehaltes von Laubblättern 4.2 Umfärbung eines Anthocyan-Extraktes 4.3 Artübergreifende Wirkung von Phytohormonen 4.4 Keimungshemmung von Apfelkernen durch Abscisinsäure 4.5 Wirkung von Gibberellin A3 auf die Sprossachsenstreckung 5. Transformation 5.1 Sterilisation und Aussaat von Tabak-Samen 5.2 Tabak-Inokulation mit Agrobacterium tumefaciens 5.3 Histochemischer Nachweis der Transformation: X-Gluc-Färbung

2

• Literatur Lehrbücher - Heß D: Pflanzenphysiologie. Ulmer, Stuttgart 1999 - Heldt H-W: Pflanzenbiochemie. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 2003 - Knippers R: Molekulare Genetik. Thieme, Stuttgart 2001 - Kull U: Grundriß der Allgemeinen Botanik. Spektrum, Heidelberg 2000 - Libbert E: Lehrbuch der Pflanzenphysiologie. G Fischer, Stuttgart 1993 - Lüttge U, Kluge M, Bauer G: Botanik. Wiley-VCH, Weinheim 2002 - Munk K: Grundstudium Biologie: Biochemie, Zellbiologie, Ökologie, Evolution.

Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 2000 - Nultsch W: Allgemeine Botanik. Thieme, Stuttgart 2001 - Richter G: Stoffwechselphysiologie der Pflanzen. Thieme, Stuttgart 1998 - Richter G: Biochemie der Pflanzen. Thieme, Stuttgart 1996 - Schopfer P, Brennicke A: Pflanzenphysiologie. Springer, Berlin 1999 - Sitte P, Weiler EW, Kadereit JW, Bresinsky A, Körner C: Strasburger Lehrbuch der

Botanik (35. Aufl.). Spektrum, Heidelberg 2002 - Taiz L, Zeiger E: Physiologie der Pflanzen, Spektrum, Heidelberg 2000 - Wild A: Pflanzenphysiologie in Fragen und Antworten. Quelle & Meyer, Wiebelsheim

2003 • Allgemeines Das Pflanzenphysiologische Praktikum für Anfänger ist Teil des Modul 5 (Physiologie und Molekularbiologie der Pflanzen). Es setzt sich aus 5 Fachgebieten zusammen: 1. Photosynthese und Wasserhaushalt, 2. Enzyme, 3. Molekularbiologie, 4. Stoffwechsel, 5. Transformation. Zu diesem Modul gehört auch die Vorlesung "Allgemeine Biologie II", in deren Botanik-Teil der im Praktikum behandelte Stoff enthalten ist. Das Endergebnis des Praktikums geht mit 7 Creditpoints (6 für das Praktikum + 1 für die Vorlesung) in die Vordiplomsnote ein, eine mündliche Vordiplomsprüfung gibt es nach der neuen Prüfungsordnung vom 5. Juli 2004 nicht mehr. Die genauen Grundlagen entnehmen Sie bitte der Prüfungsordnung (http://www.chem-bio.uni-karlsruhe.de /Fakultaet/PO_Bio_05072004.pdf). • Tests/Abschlussklausur Zu jedem Fachgebiet wird ein etwa 10 minütiger Test geschrieben. Die Tests können insgesamt bis zu 10 zusätzliche Pluspunkte bei der Abschlussklausur bringen, wenn bei dieser Klausur über 50% der Punkte erreicht wurden. Die Abschlussklausur findet am letzten Praktikumstag statt. Für jedes Fachgebiet werden jeweils maximal 12 Punkte vergeben. Außerdem werden 40 Punkte für Fragen aus dem Botanik-Teil der Vorlesung "Allgemeine Biologie II" vergeben.

3

• Protokolle/Datenblätter Protokolle bzw. Datenblätter sollen einen durchgeführten Versuch dokumentieren. Jeder Teilnehmer muss zu jedem Teilgebiet ein Protokoll bzw. Datenblatt erstellen. Form Die Protokolle können mit Hand, Schreibmaschine oder PC-Drucker geschrieben werden. Protokolle, deren Texte sich auf einem Speichermedium (z.B. Diskette) speichern lassen, müssen den vom Protokollanten unterschriebenen Zusatz tragen:

Dieses Protokoll wurde von mir selbständig erstellt. Karlsruhe, den (Datum, Unterschrift)

Inhalt Sie sollen enthalten: - die Originalmesswerte - die vollständigen Rechenschritte (so dass die Berechnung nachvollziehbar ist) - das Endergebnis und kurze Schlussfolgerung (keine Einführung, keine Diskussion) Abgabe Die Protokolle müssen spätestens eine Woche (in Ausnahmefällen nach Absprache mit dem Betreuer: + 1 Tag) nach dem bei einem Betreuer abgeschlossenen Praktikumsteil vorgelegt werden (Regal im Treppenhaus). Wird dieser Zeitpunkt nicht eingehalten, so werden die Ergebnisse des Tests zu diesem Praktikumsteil auf Null gesetzt. Korrigierte Protokolle müssen drei Tage nach dem nächsten Praktikumstermin abgegeben werden, ansonsten werden auch hier die Ergebnisse des Tests zu diesem Praktikumsteil auf Null gesetzt. Zur Abschlussklausur wird nur der zugelassen, der alle Protokolle abgegeben hat. für das Praktikum sind mitzubringen auf jeden Fall: Laborkittel (aus Baumwolle, Kunststoffe sind brenn- und elektrostatisch aufladbar) Schutzbrille Spatel Schreibutensilien (Papier, Kugelschreiber oder Bleistift) wasserfester Filzstift (zum Markieren von Gläsern) (Sind Laborkittel, Schutzbrille oder Spatel nicht vorhanden, so wird der Praktikumsteilnehmer aus Sicherheitsgründen vom Praktikum ausgeschlossen. Der Tag gilt als Fehltag.)

4

und möglichst: Lineal Schere Pinzette Taschenrechner rückwärts zählende Stoppuhr oder Uhr mit Sekundenanzeige Taschen und Anoraks/Mäntel Taschen und Anoraks oder Mäntel können nicht in den Praktikumsraum mitgenommen werden. Dafür muss der Seminarraum (607.4) genutzt werden. Aus Sicherheitsgründen lassen Sie keine Wertgegenstände (Geld, Ausweise...) im Seminarraum. • Sicherheit Tragen Sie zu ihrer eigenen Sicherheit und zur Sicherheit der anderen Prak-tikumsteilnehmer/innen bei. Personenschutz geht vor Sachschutz Jeder ist – im Rahmen seiner Möglichkeiten – zur Hilfeleistung verpflichtet. Im wesentlichen gelten die für ein chemisches Labor üblichen Maßnahmen (siehe dazu die Ihnen spätestens bei der Vorbesprechung ausgehändigte Broschüre: "Sicheres Arbeiten in chemischen Laboratorien"). Umgang mit Gefahrstoffen Gefahrstoffe sind Stoffe, die Vergiftungen und Reizungen auslösen, wenn sie in den menschlichen Körper (über das Einatmen in die Lunge, über Resorption durch die Haut sowie über die Schleimhäute und den Verdauungstrakt) gelangen oder, die Feuer, Gesundheits- oder Umweltschäden hervorrufen können. Bei Vergiftungen, Reizungen, Feuer und Gesundheitsschäden unterscheidet man verschiedene Gefährlichkeitsgrade, denen ein Gefahrensymbol und ein Kürzel zugeordnet ist, das auf dem Behälter aufgebracht sein muß: a) Vergiftung: mindergiftig (Xn), giftig (T), sehr giftig (T+) b) Reizung: ätzend (C), reizend (Xi) c) Feuer: brandfördernd (O), leichtentzündlich (F), hochentzündlich (F+), explosionsgefährlich (E) d) Gesundheitsschäden: krebserzeugend, fruchtschädigend, erbgutverändernd e) Umweltschäden: umweltbelastend

5

Neben den Gefahrsymbolen sind auf den Chemikalienbehältern Hinweise auf besondere Gefahren und Sicherheitsratschläge in Form von Codenummern angegeben: R-Sätze für Hinweise auf Gefahren und S-Sätze für Sicherheitsratschläge Die genaue Bedeutung der R- und S-Sätze sind im Praktikumsraum ausgehängt. Hier einige Beispiele: R11 leichtentzündlich (z.B. Aceton und Ethanol) R34 verursacht Verätzungen (z.B. Salzsäure) R35 verursacht schwere Verätzungen (z.B. Kaliumhydroxid) R37 reizt die Atmungsorgane (z.B. Salzsäure) S2 darf nicht in die Hände von Kindern gelangen (z.B. Kaliumhydroxid und Salzsäure) S7 Behälter dicht geschlossen halten (z.B. Ethanol) S9 Behälter an einem gut belüfteten Ort aufbewahren (z.B. Aceton) S16 von Zündquellen fernhalten - nicht rauchen (z.B. Aceton und Ethanol) S23.2 Dampf nicht einatmen (z.B. Aceton) S26 bei Berührung mit den Augen gründlich mit Wasser abspülen und Arzt

konsultieren (z.B. Kaliumhydroxid, und Salzsäure) S33 Maßnahmen gegen elektrostatische Aufladungen treffen (z.B. Aceton) S37/39 bei Arbeiten geeignete Schutzhandschuhe und Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen (z. B. Kaliumhydroxid) Der Umgang mit Stoffen, deren Ungefährlichkeit nicht zweifelsfrei feststeht, hat so zu erfolgen wie der mit Gefahrstoffen. Zu bedenken ist, dass Gefahrstoffe im Verlauf einer chemischen Reaktionen auch erst entstehen können. Für alle Chemikalien gilt: - Lösungen müssen zu jeder Zeit identifiziert werden können. Das bedeutet: alle

Lösungen müssen beschriftet sein und andere, alte Beschriftungen müssen entfernt werden.

- Die Waagen sind immer sauber zu halten. Verschüttete Chemikalien müssen aufgewischt (nicht nur mit Pinsel von der Waagschale entfernt) werden. Benutzte Wägetiegel müssen entsorgt werden.

Um Gesundheits- und Umweltschäden auszuschließen, sind beim Umgang mit gasförmigen, flüssigen oder festen (auch staubförmigen) Gefahrstoffen besondere Verhaltensregeln und Schutzvorschriften einzuhalten. - Mit Gefahrstoffen darf erst dann umgegangen werden, wenn die Gefahren bekannt

und Sicherheitsmaßnahmen getroffen sind (dazu sind die Gefahren- und Sicherheitsratschläge (R- und S-Sätze) auf den Etiketten beachten).

- Das Einatmen von Dämpfen und Stäuben sowie der Kontakt von Gefahrstoffen mit Haut und Augen sind zu vermeiden.

- Beim offenen Umgang mit gasförmigen, staubförmigen Gefahrstoffen oder Ge-fahrstoffen, die einen hohen Dampfdruck besitzen, ist grundsätzlich unter dem Abzug zu arbeiten.

6

- Tragen Sie bei chemischen Experimenten einen Laborkittel aus Baumwolle (schwer entflammbar und nicht elektrostatisch aufladbar).

- Im Labor darf nur festes, geschlossenes und trittsicheres Schuhwerk getragen werden.

- In folgenden Fällen muss eine Schutzbrille getragen werden: Arbeiten am Rotationsverdampfer Arbeiten mit kochenden Substanzen Arbeiten mit konzentrierten Säuren und Laugen Arbeiten mit UV-Strahlung (UV-Schutzbrille) Brillenträger müssen eine optisch korrigierte Schutzbrille oder aber eine Überbrille

nach W DIN 2 über der eigenen Brille tragen. - Zum Pipettieren immer eine Pipettierhilfe verwenden. - Zum Umfüllen Spatel bzw. Trichter verwenden. - Beachten Sie besonders das Verletzungsrisiko allgemein bei Reinigungs- und

Aufräumarbeiten und insbesondere bei Glasbruch - Informieren Sie sich über Erste-Hilfe-Maßnahmen (z.B. am Poster im Praktikumsraum) - Das Essen, Trinken und Rauchen sowie das Auftragen von Kosmetika im Labor ist

untersagt. - Es gilt ein absolutes Alkoholverbot. - Schutz- und Sicherheits-Einrichtungen sind in jedem Fall zu nutzen. Notdusche: in Raum 605 direkt neben dem Praktikumsraum Feuerlöscher: an der Eingangstür zum Praktikumsraum (Raum 606) Verhalten in Gefahrensituationen Bei größeren technischen Störungen (z.B. Wasserrohrbruch, Gasgeruch) ist sofort die Störungsstelle der Universität zu benachrichtigen:

Störungsstelle: Telefon 3011 Tag und Nacht, von allen Telefonapparaten innerhalb der Universität Karlsruhe

Beim Auftreten gefährlicher Situationen, z.B. Feuer, Austreten gasförmiger Schadstoffe, Auslaufen von gefährlichen Flüssigkeiten, sind die folgenden Anweisungen einzuhalten: - Ruhe bewahren und überstürztes, unüberlegtes Handeln vermeiden - denken Sie an den eigenen Schutz - verletzte Personen aus dem Gefahrenbereich bringen - andere Mitarbeiter einschalten und ggf. Erste Hilfe leisten (siehe unten) - gefährliche Versuche abstellen, Gas, Strom, und ggf. Wasser abstellen (Kühlwasser

muss aber weiterlaufen!) - laufende Experimente abbrechen, bei Experimenten im Abzug Abzugsscheibe bei

laufendem Abzug absenken - bei Feuer: sofort mit Brandbekämpfung beginnen Feuerlöscher im Praktikumsraum und direkt daneben (Raum 605): bei flächenbegrenztem Brand, stoßweise löschen Notdusche im Raum 605 (direkt neben dem Praktikumsraum): bei Brand von Personen, Wasser laufen lassen) falls der Brand nicht gelöscht werden kann: Fenster schließen, Labor verlassen und

Labortür schließen, Fluchtweg über Treppenhaus oder Außentreppen (Ausgang über Toiletten rechts und links vom Fahrstuhl bzw. auf der dem Fahrstuhl gegenüberliegenden Seite), bei Brand nie den Fahrstuhl benutzen!

7

- andere möglicherweise gefährdete Personen warnen (z.B. auch in den anderen Etagen), ggf. zum Verlassen der Räume auffordern

- Wird das Gebäude oder ein Teil davon evakuiert, ist der offizielle Sammelpunkt: Platz vor dem Audimax

Notruf für Notarzt, Feuer und Polizei: Telefon: 3333 Tag und Nacht, von allen Telefonapparaten innerhalb der Universität Karlsruhe

- Geben Sie bei einem NOTRUF folgende Punkte durch: Wo: Chemieturm I, Geb. Nr. 30.43, 6. OG, Botanik II Fritz-Haber-Weg 4 Was: z.B. Feuer, Verätzung, Sturz... Verletzungen: Art und Ort am Körper Vergiftung: Giftstoff und Aufnahmeweg Wieviele Verletzte: Anzahl Wer Name des Meldenden danach warten (niemals auflegen, bevor der Notdienst das Gespräch beendet hat; es

können weitere, wichtige Fragen zu beantworten sein) falls möglich außerdem sofort Arbeitsmedizinischen Dienst der Universität informieren:

Dr. Bestler und Frau Dr. Elste (Tel. 4313) (allerdings nicht immer erreichbar) Nach Unfällen mit Gefahrstoffen, die Langzeitschäden auslösen können, oder die zu Unwohlsein oder Hautreaktionen geführt haben, ist ein „Durchgangsarzt“ aufzusuchen. Unfälle in der Universität und auch auf dem Weg dorthin sind für Studenten und Universitätsmitarbeiter Arbeitsunfälle, die nicht von der normalen Krankenversicherung getragen werden. Deshalb muss bei leichten Verletzungen ein zugelassener „Durchgangsarzt“ aufgesucht werden (möglichst zusammen mit einer Begleitperson): - Nächster Arzt, wenn ohne Krankentransport möglich, immer in Begleitung eines

Unverletzen 1) bei ausschließlich Augenverletzungen: nächster erreichbarer Augenarzt z.B. Dr. Hyppa, Essenweinstraße 6 (vorher anrufen, Telefon 69 74 56)

siehe Lageplan:

8

nur bei Augenverletzungen

Tel.: 69 74 56

Dr. HyppaEssenweinstr. 6

2) bei ausschließlich Hals-, Nasen- und Ohrenverletzungen: nächster erreichbarer

Hals-Nasen-Ohren-Arzt 3) bei allen anderen Verletzungen einer der folgenden zugelassenen Ärzte bzw.

Krankenhäuser:

Ärzte (vorher anrufen) Dr. Goos, Arzt für Chirurgie/Unfallchirurgie, Karlsruhe-Durlach,

Grötzinger Str. 14, Telefon 4 14 40 Dr. Janosovits, Arzt für Chirurgie, Karlsruhe, Amalienstr. 33 Telefon: 2 81 90 Dr. Kuntz, Arzt für Chirurgie/Unfallchirurgie, Karlsruhe, Peter- und Paul-

Platz 3, Telefon 55 32 82 Dr. Westenberger, Arzt für Chirurgie, Karlsruhe, Weinbrennerstr. 7, Telefon: 84 13 84

Kliniken (ständig erreichbar, Anruf vorher nicht nötig) Diakonissenkrankenhaus, Karlsruhe-Rüppurr, Diakonissenstr. 28 Paracelsus-Klinik, Karlsruhe-Durlach, Raihenwiesenstr. 15-17 Städtisches Klinikum, Karlsruhe, Moltkestr. 90 St. Vincentius-Krankenhäuser, Karlsruhe, Südendstr. 32

- Nach dem Unfall ist dem Studentenwerk (Versicherungsträger) eine Meldung zu

machen. Grundsätze der richtigen Erste-Hilfe-Leistung - Bei allen Hilfeleistungen auf die eigene Sicherheit achten! - So schnell wie möglich einen notwendigen NOTRUF tätigen (siehe oben). - Personen aus dem Gefahrenbereich bergen und an die frische Luft bringen. - Kleiderbrände löschen. - Notduschen nutzen; mit Chemikalien verschmutzte Kleidung vorher entfernen, notfalls

bis auf die Haut ausziehen; mit Wasser und Seife reinigen.

9

- Bei Augenverätzungen beide Augen von der Nasenwurzel her bei gespreizten Augenlidern 10 Minuten oder länger nach außen hin spülen, damit die verätzende Substanz nicht über das unverletzte Auge läuft.

- Verletzte nicht allein lassen und ggf. ihnen gut zureden - Wenn möglich: Atmung und Kreislauf prüfen und überwachen. - Bei auftretendem Schock Beine nur leicht (max. 10 cm) über Herzhöhe mit entlasteten

Gelenken lagern. - Bei Bewusstlosigkeit und vorhandener Atmung in die stabile Seitenlage bringen - Bei Atemstillstand sofort mit der Mund-zu-Nase-Beatmung beginnen (evtl. eigene

Vergiftungsgefahr beachten) - Bei Herzstillstand: Herz-Lungen-Wiederbelebung durch ausgebildete Personen - Blutungen stillen, Verbände anlegen, dabei Einmalhandschuhe benutzen. - Informationen für den Arzt sicherstellen (welcher Gefahrstoff, Betriebsanweisung,

welche Menge, Erbrochenes sicherstellen) - dafür sorgen, dass der eintreffende Notdienst den Verletzten sofort findet (an der

Straße warten) • Umweltschutz Erstes und oberstes Gebot ist die Abfallvermeidung. Verwenden Sie möglichst geringe Mengen an Chemikalien. Der Weiterverwendung und der Wiederaufbereitung, z.B. von Lösungsmitteln, ist immer Vorzug vor der Entsorgung zu geben. Um eine Wiederverwendung oder eine umweltfreundliche Aufarbeitung und Lagerung zu ermöglichen soll Abfall nach folgenden Kategorien getrennt gesammelt und entsorgt werden: Papier und Karton Definition: - normales Papier oder Karton (trocken und nicht beschichtet) - außer: beschichtete, gewachste Papiere, Kohlepapier und verunreinigtes oder nasses

Papier (Müll/Feuchtmüll) - außer: Papier mit chemischen Stoffen wie Filterpapiere usw. (Sonderabfall) - außer: Kartons mit "Grünem Punkt" (Wertstoffe) Entsorgen: - normales Papier und Karton in Papierkorb geben Wertstoffe Definition: - alle Kunststoffe (z.B.: Behälter, Folien, Magnetbänder), Metalle (z.B. Blechdosen),

Holz und Verpackungen mit dem "Grünen Punkt". - außer: Styropor, Glasverpackung (getrennt sammeln, siehe unten) Sammeln: - Wertstoffe soweit erforderlich reinigen Entsorgen: - Wertstoffe in die dafür vorgesehenen roten Kunststoffbehälter oder in die Wert-

stoffcontainer vor dem Chemieturm geben

10

Müll/Feuchtmüll Definition: Kehricht, leere Kugelschreiberminen, Kohlepapier, beschichtete Papiere, ver-

unreinigtes oder nasses Papiere, Pflanzenreste Entsorgen: - in die Laborabfallbehälter geben Glas Definition: - Glasflaschen, Glasbehälter, Glasgeräte und Glasbruch - außer: Chemikalienflaschen, die nicht gereinigt werden können (Sonderabfall wie der

Flascheninhalt) Sammeln: - Glas reinigen - bei leeren Flaschen für Chemikalien bzw. Gefahrstoffe Etiketten und Gefahr-

stoffsymbole entfernen Entsorgung: - in die jeweiligen Behälter im Praktikumsraum geben (getrennt nach Normalglas und

hochschmelzendes Glas, wie z.B. Bechergläser und Erlenmeyerkolben) Sonderabfall Definition - organische Lösungsmittel (brennbar, ohne zu großen Wasseranteil) Sammeln: - Lösungsmittel getrennt nach a) halogenfrei b) halogenhaltig c) etherhaltig Entsorgung: - in die jeweiligen Behälter im Praktikumsraum geben • Grundlagen Licht / Strahlung Strahlung ist durch ihre Wellenlänge und durch ihre Energie bestimmt: Zunehmende Wellenlänge (λ) bedeutet abnehmende Energie (E):

E = h . ν oder E = h . c / λ

E = Energie [J] h = Planck'sches Wirkungsquantum = 6,626 . 10-34 J s ν = Frequenz [s-1] c = Lichtgeschwindigkeit = 299.792.458 m s-1 λ = Wellenlänge [m]

(h und c sind Konstanten, somit ist die Energie E umgekehrt proportional zur Wellenlänge λ.)

11

Absorptionsmessung zur quantitativen Bestimmung Die Absorption wird im Spektralphotometer bestimmt, indem man die Strahlung misst, die durch die Probe dringt (Transmission). Die Anzeige und Aufzeichnung erfolgt dann meist als Extinktion, eine dimensionslose Größe, die nach dem Lambert-Beer Gesetz proportional zur Stoffkonzentration ist (siehe unten).

Die Konzentration eines Stoffes kann quantitativ bestimmt werden, wenn der Extinktionskoeffizient bekannt ist. Extinktionskoeffizienten gelten jeweils

• für eine Substanz, • für einer Wellenlänge und • für ein Lösungsmittel

und sind in der Literatur zu finden (siehe z.B. hier unter Auswertung). Lambert-Beer-Gesetz:

Ext = ε . c . d = log (I0 . I-1) = - log (0,01 . T%) Ext = Extinktion [dimensionslos] ε = molarer Extinktionskoeffizient [l . mol-1 . cm-1] c = molare Konzentration [mol . l-1] d = Schichtdicke der Probe [cm] (gewöhnlich 1 cm) I0 = Intensität des Messlichtes vor der Probe I = Intensität des Messlichtes nach der Probe T% = Transmission [%] = Durchlässigkeit für Messlicht Statt des molaren Extinktionskoeffizienten ε kann man auch den spezifischen Extinktionskoeffizienten α mit der Dimension [l . g-1 . cm-1] finden. Wird der spezifische Extinktionskoeffizient α eingesetzt, so erhält man die Konzentration c in g pro Liter.

Ext = α . c . d Ext = Extinktion [dimensionslos] α = spezifischer Extinktionskoeffizient [l . g-1 . cm-1] c = Konzentration [g . l-1] d = Schichtdicke der Probe [cm] (gewöhnlich 1 cm) Molarer und spezifischer Extinktionskoeffizient hängen über das Molekulargewicht MG zusammen:

α = ε / MG Polarität Steigende Polarität hat man bei folgenden Molekülcharakteristika: unpolar = lipophil (fettliebend) Kohlenwasserstoffe -CH V Hydroxylgruppen -OH zunehmend polarer Aldehydgruppen -CHO V Ketogruppen -CO V Carboxylgruppen -COOH polar = hydrophil (wasserliebend) Ionen X+ oder X-

12

Entscheidend für die Polarität eines Moleküls ist die Zahl und Polaritätsstärke der verschiedenen polaren und/oder unpolaren Gruppen. So ist Aceton (CH3-CO-CH3) z.B. insgesamt polar, da es neben der stark polaren CO-Gruppe auch zwei unpolare Methyl- (CH3)-Gruppen hat. pH-Wert Unter dem pH-Wert versteht man den negativen dekadischen Logarithmus der molaren H+-Ionen-Konzentration: pH = - log (Mol H+ . l-1) Die H+-Ionen-Konzentration errechnet sich somit: Mol H+ . l-1 = 10-pH Um die Differenz von H+-Konzentrationen berechnen zu können, müssen die beiden pH-Werte in die molaren H+-Konzentrationen als Zahl ohne Exponenten umgeformt werden. Dazu verwendet man die umgekehrte Logarithmentafel. Hier ein Beispiel für pH 4,7:

pH = 4,7 entspricht 10-4,7 Mol H+ . l-1 man formt die Zahl 10-4,7 zunächst um in eine Zahl mit der nächst höheren

Zehnerpotenz (hier: 10-5) und eine Zahl mit Exponenten kleiner 1 (hier 100,3), mit der multipliziert (Addition der Exponenten) sich die ursprüngliche Zahl ergibt, es gilt: 100,3 . 10-5 = 10(0,3 - 5) = 10-4,7

dann ermittelt man für die Zahl mit Exponenten kleiner 1 die entsprechende Zahl ohne Exponenten (in unserem Beispiel gilt: 0,30 = log 1,995 oder 100,3 = 1,995)

dann ist: 10-4,7 Mol H+ . l-1 = 1,995 . 10-5 oder 0,00001995 Mol H+ . l-1 oder 19,95 µMol H+ . l-1

Messgenauigkeit Messergebnisse müssen mit ausreichend guter Genauigkeit angegeben werden. Dies gilt sowohl nach oben als auch nach unten. Meist lässt sich ein Messergebnis mit 3 Zahlenwerten ausdrücken, z.B.

134000 13400 1340 134 13,4 1,34 0,134

(Ein Messergebnis 134,146341463415 ist unsinnig genau, auch wenn es das Rechenprogramm so angeben sollte. In der Physik wird eine solche Zahlenangabe als Fehler gewertet. Sie würden auch nicht bei einer Strecke von 134 m die Zentimeter und Millimeter noch angeben, auch wenn sie messbar sind.) Man sollte mit allen Kommastellen rechnen, am Ende das Ergebnis aber runden, (z.B.: 2750 / 20,5 = exakt: 134,146341463415, gerundet: = 134).

13

Lösungen herstellen/verdünnen [Getting the right solution takes concentration] Die Molarität einer Lösung ist die Anzahl Mole des gelösten Stoffes in 1 l Lösung. Um eine molare Lösung herzustellen, braucht man die Angabe des Molekulargewichts (= Molekularmasse). Die einzuwiegende Substanzmasse (m) berechnet sich:

m = n . M . V Abkürzungen:

c Molare Konzentration mol . l-1

V Volumen der Lösung l

n molare Stoffmenge mol

m Masse (der einzuwiegen-den Substanz) g

M Molekularmasse (=Molekulargewicht) g . mol-1

es gilt allgemein: c = n . V-1 und m = n . M

Beispiel für 120 ml einer 0,1 molaren Lösung NaCl (Molekulargewicht: M = 58,5): 1 molar (1 Mol / l) = 58,5 g in 1 l (n = 1, V = 1) 0,1 molar (0,1 Mol/ l) = 5,85 g in 1 l (oder 1000 ml) (n = 0,1, V = 1) oder pro 1 ml: = 5,85 g / 1000 = 0,00585 g in 1 ml = 5,85 g . 0,001 = 0,00585 g in 1 ml (n = 0,1, V = 0,001)

120 ml 0,1 molar: 0,1 . 58,5 . 0,120 = 0,702 g (n = 0,1, M = 58,5, V = 0,120) Eine exakte Lösung stellt man so her: - eingewogene Substanz in Messkolben, Erlenmeyer, Becherglas einfüllen - etwas Lösungsmittel dazugeben - in Lösung bringen (evtl. dazu erhitzen) - umrühren (um homogene Konzentration zu erreichen) - mit Lösungsmittel auf das Endvolumen auffüllen (dazu eventuell vorher quantitativ in

einen Messkolben oder Messzylinder umfüllen damit die Ablesegenauigkeit optimal ist) (das angegebene Volumen ist nicht das Volumen des hinzuzufügenden Lösungsmittel sondern das Endvolumen der fertigen Lösung) - nochmal umrühren Um zu berechnen wie Lösungen mit %-Angaben mit Wasser verdünnt werden können, eignet sich das Mischungskreuz:

14

% der 1. vorhan- denen Lösung

% der 2. vorhan- denen Lösung

Differenzen bilden

Anteil der 1. Lösung zum Mischen

Anteil der 2. Lösung zum Mischen

% der gewünschten Lösung

Beispiel: eine 30 %ige Säure soll mit Wasser zu einer 10 %igen Säure verdünnt werden:

10 %

30 %

0 %

10 Teile Säure

20 Teile Wasser30 - 10

10-0

Präfix (= Vorsatz zur Bezeichnung von Vielfachen und Teilen) Faktor Bezeichnung Abkürzung Kürzel1018 Trillion Exa- E 1015 Billiarde Peta- P 1012 Billion Tera- T 109 Milliarde Giga- G 106 Million Mega- M 103 Tausend Kilo- k 10-3 Tausendstel Milli- m 10-6 Millionstel Mikro- µ 10-9 Milliardstel Nano- n 10-12 Billionstel Piko- p 10-15 Billiardstel Femto- f 10-18 Trillionstel Atto- a nicht der SI-Norm entsprechen: 102 Hundert Hekto- h 10 Zehn Deka- da 10-1 Zehntel Dezi- d 10-2 Hundertstel Zenti- c

15

Berechnung der Zentrifugalkraft (g-Zahl) Die zum Sedimentieren aufgewendete Kraft wird nicht nur durch die Umdrehungszahl des Rotors der Zentrifuge bestimmt sondern auch durch den Radius des Rotors. Für eine Zentrifuge gibt es oft mehrere verschiedene Rotoren. Je größer der Radius des Rotors um so größer ist die Zentrifugalkraft, die als ein Vielfaches der Erdbeschleunigung g ausgedrückt wird. Ist die Zentrifugalkraft bekannt, kann man mit jeder genügend schnellen Zentrifuge arbeiten. Ist dagegen nur die Umdrehungszahl (Upm) bekannt, muss der Rotorradius mit angegeben sein damit die richtige Zentrifugalkraft eingestellt werden kann.

RFZ = x2 . r . g-1

oder vereinfacht RFZ = 11,2 . (UpM/1000)2 . r RFZ = relative Zentrifugalkraft (Vielfaches der Erdbeschleunigung g) x = Winkelgeschwindigkeit = 2π . n . 60-1 r = mittlerer Radius des Rotors in m g = Erdbeschleunigung = 9,81 m . s

-2

n = Drehfrequenz = Anzahl der Umdrehungen pro min = UpM

1. Photosynthese und Wasserhaushalt Literatur zum Thema Photosynthese - Buschmann C, Grumbach KH: Physiologie der Photosynthese. Springer, Berlin 1985 - Gregory RPF: Biochemistry of photosynthesis. John Wiley, Chichester 1989 - Häder D-P (Hrsg): Photosynthese, Thieme, Stuttgart 1999 - Hall DO, Krishna R: Photosynthesis. Cambridge University Press, Cambridge 1999 - Heldt H-W: Pflanzenbiochemie. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 2003 - Heß D: Pflanzenphysiologie. Ulmer, Stuttgart 1999 - Kunsch K: Autotrophie der Organismen. G Fischer, Stuttgart 1989 - Lawlor DW: Photosynthese. Thieme, Stuttgart 1990 - Libbert E: Lehrbuch der Pflanzenphysiologie. G Fischer, Stuttgart 1993 - Lichtenthaler HK, Pfister K: Praktikum der Photosynthese. Quelle und Meyer,

Heidelberg 1978 - Lüttge U, Kluge M, Bauer G: Botanik. Wiley-VCH, Weinheim 2002 - Richter G: Stoffwechselphysiologie der Pflanzen. Thieme, Stuttgart 1997 - Richter G: Biochemie der Pflanzen. Thieme, Stuttgart 1996 - Schopfer P, Brennicke A: Pflanzenphysiologie. Springer, Berlin 1999 - Sitte P, Weiler EW, Kadereit JW, Bresinsky A, Körner C: Strasburger Lehrbuch der

Botanik (35. Aufl.). Spektrum, Heidelberg 2002 - Tevini M, Häder D-P: Allgemeine Photobiologie. Thieme, Stuttgart 1985 CD - Bereiter-Hahn J: Die Zelle - Leben aus Licht und Luft - Chloroplast und Photosynthese.

Quelle und Meyer, Wiesbaden 1999 Literatur zum Thema Wasserhaushalt - Kutschera U: Prinzipien der Pflanzenphysiologie. Spektrum, Heidelberg 2002 - Libbert E: Lehrbuch der Pflanzenphysiologie. G Fischer, Stuttgart 1993 - Nultsch W: Allgemeine Botanik. Thieme, Stuttgart 2001 - Richter G: Stoffwechselphysiologie der Pflanzen. G Thieme, Stuttgart 1997 - Sitte P, Weiler EW, Kadereit JW, Bresinsky A, Körner C. Strasburger Lehrbuch der

Botanik (35. Aufl.). Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 2002 und für Interessierte zur Vertiefung: - Larcher W: Ökophysiologie der Pflanzen. UTB, Stuttgart 1994 [Kapitel 4: Der Wasserhaushalt] - Lösch R: Wasserhaushalt der Pflanzen. Quelle & Meyer, Wiebelsheim 2003 - von Willert DJ, Matyssek R, Herppich W: Experimentelle Pflanzenökologie. G Thieme,

Stuttgart 1995 1.1 Extraktion von Blattfarbstoffen Mit polaren organischen Lösungsmitteln (z.B. Aceton, H3C-CO-CH3) lassen sich die Blattfarbstoffe Chlorophylle und Carotinoide extrahieren. Aceton mischt sich gut mit Wasser, dem Hauptbestandteil von Blattgewebe (60 - 90%) und kann trotzdem die eher

unpolaren Blattfarbstoffe lösen. Nach der Extraktion mit Aceton werden die Farbstoffe in einem Scheidetrichter in unpolares Petrolbenzin (Gemisch aus Kohlenwasserstoffen mit definiertem Siedepunkt) übergeführt, dies ist für die spätere Dünnschichtchromatographie erforderlich. Beim Ausschütteln des Extraktes wird halbgesättigte NaCl-Lösung zugesetzt, um die Aceton-Phase stärker polar zu machen und damit besser von der Petrolbenzin-Phase trennen zu können. Man wäscht den Petrolbenzinextrakt mehrmals mit NaCl-Lösung, um alle Acetonreste zu entfernen. Schließlich setzt man wasserfreies Na2SO4 zu, um das in der Petrolbenzin-Phase verbliebene Wasser zu entfernen. Die Na2SO4-Kristalle binden Wasser als Kristallwasser (Na2SO4 geht nicht in Lösung, es bleibt kristallin). Nur der wasserfreie Petrolbenzin-Extrakt lassen sich die Farbstoffe in der Dünnschichtchromatographie gut trennen. Außerdem sind die Blattfarbstoffe in wasserfreiem Petrolbenzin wesentlich länger haltbar als in Aceton, das immer Wasser (evtl. aus der Luft) enthält. Literatur - Lichtenthaler HK, Pfister K: Praktikum der Photosynthese. Quelle und Meyer,

Heidelberg 1978, S. 80-81 - Buschmann C, Grumbach KH: Physiologie der Photosynthese. Springer, Berlin 1985, S.

34-35 Untersuchungsmaterial grüne Blätter Geräte Mörser Saugflasche Wasserstrahlpumpe Büchnertrichter mit Filterpapier Scheidetrichter Rundkolben Rotationsverdampfer Chemikalien Aceton Petrolbenzin (Siedepunkt: 50 bis 70° C, Merck-Nr. 910) halbgesättigte NaCl-Lösung Na2SO4 (wasserfrei) Durchführung Aceton-Rohextrakt herstellen: Blätter im Mörser mit wenig Aceton verreiben Blatthomogenat über Büchnertrichter mit Unterdruck (Wasserstrahlpumpe) abfiltrieren filtrierten Extrakt in den Scheidetrichter überführen Farbstoffe in Petrolbenzin überführen: mit ca. 30 ml Petrolbenzin überschichten (Das Petrolbenzin sollte vorsichtig an der Wand entlang eingefüllt werden. Sonst bilden

sich an der Grenze zwischen den beiden Phasen Schlieren oder Emulsionen, die die Trennung der Phasen erschweren.)

Scheidetrichter schwenken ca. 30 ml halbgesättigte NaCl-Lösung zugeben und Scheidetrichter schwenken untere Phase ablassen Acetonreste aus Petrolbenzinextrakt entfernen: dreimal hintereinander: ca. 30 ml halbgesättigte NaCl-Lösung oder auch Leitungswasser zugeben Scheidetrichter schwenken untere Phase ablassen Wasserreste aus Petrolbenzinextrakt entfernen: 1 volle Spatelspitze wasserfreies Na2SO4 zugeben heftig schütteln (Stopfen auf dem Scheidetrichter von Zeit zu Zeit lüften) Extrakt konzentrieren: Extrakt über obere Öffnung in Rundkolben einfüllen am Rotationsverdampfer (Unterdruck 400 mbar) bei 40° C fast bis zur Trockene einengen Auswertung Beschreiben Sie die Farben des Extraktes und der einzelnen Phasen beim Ausschütteln im Scheidetrichter. 1.2 Dünnschichtchromatographie (DC) von Chlorophyllen und Carotinoiden Chlorophylle und Carotinoide können aus einem wasserfreien Extrakt auf mit Kieselgel beschichteten Glasplatten chromatographisch aufgetrennt werden (Dünnschichtchromatographie = DC). Die unterschiedliche Polarität der Moleküle, die sich aus ihrer verschiedenen chemischen Struktur ergibt, beeinflusst die Löslichkeit im Laufmittel und die Anheftungsstärke an die Kieselgelschicht der Platte und somit die Laufstrecke. Bei dieser Art der Dünnschichtchromatographie nimmt die Laufstrecke der Substanzen mit zunehmender Polariät ab.

ß- und α-Carotin haben keine polaren Atome, ihre Laufstrecke ist daher am längsten. ß- und α-Carotin unterscheiden sich nur durch die Lage einer Doppelbindung (Abb. 1.1). Diese verändert aber nicht die Polarität des Moleküls und daher ist die Laufstrecke für α- und ß-Carotin gleich. Aus anderen Analysen weiß man, dass α-Carotin immer nur in wesentlich kleineren Mengen vorhanden ist als ß-Carotin. Chlorophylle haben die polaren N-Atome und laufen daher unter α- und ß-Carotin. Phäophytin ist ein Abbauprodukt von Chlorophyll, bei dem das zentrale Magnesiumatom durch Säure entfernt ist. Daher ist Phäophytin unpolarer als Chlorophyll und läuft über dem Chlorophyll. In den Pflanzenzellen findet man eventuell größere Mengen von Säure in den Vakuolen, deren Inhalt mit den Chlorophyllen bei intakten Zellen nicht in Kontakt kommt, die aber falls vorhanden beim Extrahieren freigesetzt werden und teilweise Phäophytin bilden können. Chlorophyll a hat eine Methylgruppe an der Stelle, an der Chlorophyll b einen Aldehydrest hat. Somit ist Chlorophyll a unpolarer als Chlorophyll b und hat eine längere Laufstrecke. Die unter den Chlorophyllen laufenden Carotinoide besitzen alle mindestens

Abb. 1.1: Strukturformeln der Chlorophylle und Carotinoide.

Chlorophyll b

zwei O-Atome. Es sind also Xanthophylle (xantho = gelb, phyll = Blatt), d.h. sauerstoffhaltige Carotinoide im Gegensatz zu den nicht sauerstoffhaltigen Carotinen, (Carotinoide = Xanthophylle + Carotine). Je kürzer die Laufstrecke der Xanthophylle ist um so mehr O-Atome sind im Molekül vorhanden bzw. in um so polareren Gruppen befindet sich das O-Atom. In der Biosynthese leiten sich Lutein und Lutein-5,6-epoxid von α-Carotin ab, Zeaxanthin, Antheraxanthin, Violaxanthin und Neoxanthin von ß-Carotin. Die Lage der Doppelbindung, die α- und ß-Carotin unterscheidet, bleibt bei der Biosynthese bis zur Anlagerung von 3 O-Atomen erhalten. Da die Lage der Doppelbindung die Polarität nicht verändert (siehe oben für α- und ß-Carotin), findet man Lutein und Zeaxanthin (2 O-Atome) sowie Antheraxanthin und Lutein-5,6-epoxid (3 O-Atome) jeweils mit gleicher Laufstrecke. Neoxanthin, das wie Violaxanthin 4 O-Atome besitzt, hat die kürzeste Laufstrecke, d.h. die höchste Polarität, da es ein O-Atom in der polareren OH-Gruppe hat statt wie beim Violaxanthin in der weniger polaren Epoxidgruppe.

Die für eine Substanz spezifische Laufstrecke wird als Rf-Wert (Rf =

Retentionfaktor, Werte zwischen 0: minimale Laufstrecke und 1: maximale Laufstrecke) angegeben:

Rf-Wert = Laufstrecke Substanz / Laufstrecke Laufmittelgemisch Um bestmögliche Trennung zu erreichen, sollte die Gasphase der Trennkammer mit dem Laufmittelgemisch gesättigt sein. Dazu werden schon vor Beginn der Trennung zwei Chromatographieplatten in die Kammer gestellt, die sich mit dem Laufmittel voll saugen. Während der Trennung darf die Kammer nicht geöffnet werden. Da die isolierten Farbstoffe lichtempfindlich sind, wird die Chromatographie im Dunkeln durchgeführt. Man erhält die Extrakte der getrennten Farbstoffe, indem man die mit den Farbstoffen getränkte Kieselgelschicht mit einem Spatel von der Glasplatte abkratzt und mit Aceton in Glasfritten eluiert. Literatur - Lichtenthaler HK, Pfister K: Praktikum der Photosynthese. Quelle und Meyer,


35-40 Untersuchungsmaterial Blattfarbstoffextrakt (aus Versuch 1.1) Geräte Kieselgelplatte (Typ 60 Merck-Nr. 5721) 0,5 ml-Pipette Chromatographietrennkammer 2 Chromatographieplatten (zur Kammersättigung) Saugflasche Wasserstrahlpumpe Glasfritten Reagenzgläser

Chemikalien Petrolbenzin (Siedepunkt: 50 bis 70° C, Merck-Nr. 910) 1,4-Dioxan (Merck-Nr. 9671) gesundheitsschädlicher Stoff !!!

(Vorsicht, siehe Betriebsanweisung) 2-Propanol (Merck-Nr. 9634)

B E T R I E B S A N W E I S U N G gem. Par. 20 GefStoffV

Universität Karlsruhe (TH) Institut f. Botanik II mindergiftig

Xn

Gefahrstoffbezeichnung 1,4-Dioxan Summenformel: C4H8O2 Aggregatzustand: flüssig MAK 50 ml/m3 WGK 2

Lagerung: Dicht verschlossen, an gut belüftetem Ort, von Zünd- und Wärmequellen entfernt, bei Zimmertemperatur (empfohlen +15 bis +25°C)

Gefahren für Mensch und Umwelt Gefahrensymbol: T R-Sätze: 11, 19, 36/37, 40 Leichtentzündlich, kann explosionsfähige Peroxide bilden, reizt die Augen, reizt die Atmungsorgane, irreversibler Schaden möglich. S-Sätze: 16, 36/37 Von Zündquellen fernhalten - nicht rauchen, bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung tragen, geeignete Schutzhandschuhe tragen.

Schutzmaßnahmen und Verhaltensregeln

Augenschutz: persönliche Schutzbrille ist zu tragen Handschutz: Handschuhe tragen Andere: Schutzkleidung (Labormantel) tragen Arbeitshygiene: Beschmutzte Kleidung sofort wechseln. Nach Arbeitsende Hände waschen

Verhalten im Gefahrfall Brand: Löschmittel Wasser, CO2, Schaum, Pulver Verschütten: kleinere Mengen mit Papiertuch aufnehmen und entsorgen. Betroffene Zone nach völliger Beseitigung des Materials mit Wasser reinigen. Beim Verschütten größerer Mengen: Dr. Buschmann benachrichtigen. Gefährliche Reaktionen: brennbar, Dämpfe schwerer als Luft, mit Luft Bildung explosionsfähiger Gemische möglich.

Erste Hilfe

Einatmen: Frischluft, bei Atemstillstand künstliche Beatmung, ggfs. Sauerstoffgabe Augen: unter viel fließendem Wasser ausspülen Haut: mit reichlich Wasser abwaschen, beschmutzte Kleidung entfernen Verschlucken: Mund mit genügend Wasser ausspülen. generell: bei Unwohlsein: Arzt aufsuchen Ersthelfer: Dr. Buschmann, Dr. Focke, Frau Zeiler Betriebsarzt: Dr. Bestler, Dr. Elste (Tel. 4313)

Sachgerechte Entsorgung Entsorgungshinweise allg. zu etherhaltigen Lösungsmitteln. Durchführung Chromatographiekammer ins Dunkle (Laborschrank) stellen 2 Platten an die Ränder der Chromatographiekammer hineinstellen (Kammersättigung) folgendes Laufmittel in die Chromatographiekammer einfüllen: 70 ml Petrolbenzin 30 ml Dioxan 10 ml 2-Propanol mit 0,5 ml-Pipette Blattfarbstoffextrakt (Versuch 1.1) auf die Dünnschichtplatte auftragen (bandförmig, ca. 2 cm vom unteren Rand, rechts und links ca. 1 cm freilassen) Glasplatte in die Trennkammer stellen nach ca. 45 - 60 min Platte herausnehmen sofort Laufstrecke des Laufmittels markieren (das Laufmittel verdunstet) Laufstrecken des Laufmittels und der einzelnen Substanzen ausmessen Man findet folgende Farbstoffe (in Klammern: Farbstoffe an gleicher Stelle jedoch mit wesentlich geringerer Konzentration): Laufmittelfront β-Carotin (α-Carotin) gelb evtl. Phäophytin grau Chlorophyll a blaugrün Chlorophyll b grün Lutein (Zeaxanthin) gelb evtl. Antheraxanthin und Lutein 5,6-epoxid gelb Violaxanthin gelb Neoxanthin gelb Start Einzelkomponenten mit einem Spatel von der Platte auf ein Papier abgekratzten Kieselgelteile in eine Glasfritte überführen Aceton zugeben bei Unterdruck (Wasserstrahlpumpe) in ein Reagenzglas eluieren

Auswertung Beschreiben Sie die Farben und bestimmen Sie den Rf-Wert der einzelnen Banden. 1.3 Absorptionsspektren von Blättern und Blattfarbstoffextrakten Absorptionsspektren sind ein wesentliches Charakteristikum und Unterscheidungsmerkmal für einen Stoff, da sie von der chemischen Struktur des Stoffes bestimmt werden. Mit einem Absorptionsspektrum wird die Strahlungsdurchlässigkeit einer Probe in unterschiedlichen Spektralbereichen gemessen. Die Spektralbereiche sind durch ihre Wellenlänge und durch ihre Energie bestimmt: Zunehmende Wellenlänge (λ) bedeutet abnehmende Energie (E).

Absorptionsspektren spiegeln also die Zusammensetzung der Energie wider, die von einem Stoff aufgenommen wird. Farbstoffmoleküle haben meist mindestens 7 konjugierte Doppelbindungen (abwechselnd Einfach- und Doppelbindungen, so dass die Unterschiede zwischen Einfach- und Doppelbindung "verschmieren"). Mit mindestens 7 konjugierten Doppelbindungen nimmt ein Molekül Teile der Energie auf, die dem sichtbaren Bereich der Strahlung entsprechen (400 bis 700 nm). Wenn aber ein Teil der sichtbaren Strahlung (Weißlicht zusammengesetzt aus den Farben blau, grün, gelb und rot) absorbiert wird, so sehen wir den Stoff als Farbstoff, da er die übrige, nicht absorbierte sichtbare Strahlung (Farbteile des Weißlichts) reflektiert. Stoffe mit weniger als 7 konjugierten Doppelbindungen absorbieren Strahlung mit höherer Energie als der des sichtbaren Bereiches. So absorbiert z.B. Benzol (3 konjugierte Doppelbindungen) im UV, das höhere Energie und kürzere Wellenlänge besitzt als sichtbare Strahlung. Benzol ist farblos, weil es im sichtbaren Spektralbereich nicht absorbiert.

Chlorophylle und Carotinoide sind bei intakten Blättern ausschließlich in den Chlorophyll-Protein-Komplexen der Chloroplasten enthalten. Die nicht kovalente Bindung an Proteine verschiebt das Absorptionsmaximum zu längeren Wellenlängen. Die Vielzahl von verschiedenen Komplexen und optische Effekte an den Zellwänden und Zellorganellen (Reflexion, Brechung, Lichtstreuung) führen zu einer Verbreiterung der Banden des Absorptionsspektrums. Durch Extraktion mit Aceton wird die Bindung zu den Proteinen zerstört, Proteine koagulieren und es verbleiben nur die gelösten Farbstoffe.

Bei einem Extrakt (ohne Trübung) hat das Licht, das nicht absorbiert wird und aus dem Extrakt wieder austritt, die gleiche Richtung wie das eingestrahlte Licht. Bei einem Blatt dagegen wird ein Teil des Lichts seitlich abgelenkt, der daher nicht den Detektor (Photomultiplier) erreicht. Dadurch wird eine höhere Absorption vorgetäuscht. Um eine Absorptionsmessung von intakten Blättern überhaupt zu ermöglichen, kann man in den Vergleichsstrahlengang eine lichtstreuende Probe ohne Farbstoffe (z.B. ein dünnes weißes Papier) geben.

Zur quantitativen Messung von Blattfarbstoffen sollte der Extrakt keinerlei Trübungen enthalten. Partikel, wie z.B. koagulierte Proteine, erhöhen die Lichtstreuung und verfälschen damit die Absorptionsmessung. Sie müssen vor einer Messung durch Filtrieren entfernt werden. Blattextrakte ohne Trübung haben bei 750 nm einen Extinktionswert von Null. Eine geringe Trübung kann korrigiert werden, in dem man die Extinktion bei 750 nm als Nullbezug nimmt. Dazu subtrahiert man von den Extinktionswerten, die in die Gleichung zur Bestimmung der Farbstoffkonzentration eingesetzt werden, jeweils den Extinktionswert bei 750 nm.

Aus der Konzentration der Blattfarbstoffe kann man auf den Gesundheitszustand einer Pflanze, auf die Art der Photosynthese und die Lichtverhältnisse während des

Wachstums der Pflanze schließen. Im allgemeinen findet man bei gesunden Pflanzen hohe Chlorophyllgehalte. Das Chlorophyll-zu-Carotinoid-Verhältnisse (a+b)/(x+c) ist bei grünen Blättern bei etwa 4 - 5. Gelbe (meist kranke) Blätter haben niedrigere Werte für (a+b)/(x+c). Das Chlorophyll a/b-Verhältnis liegt im Schnitt bei etwa 3. Bei Sonnenblättern (in der Sonne ausgetriebene Blätter) findet man höhere a/b-Werte als bei Schattenblättern (im Schatten ausgetriebenen Blättern). Bei C4-Pflanzen sind die a/b-Werte höher als bei C3-Pflanzen. Unterschiede im a/b-Verhältnis ergeben sich, wenn die "Antenne" des Photosyntheseapparates unterschiedlich aufgebaut ist. Da Chlorophyll b ausschließlich im "Light-harvesting"-Komplex vorkommt, der das Licht sammelt, findet man dort, wo dies weniger benötigt wird, d.h. an helleren Standorten (Sonnenblätter, C4-Pflanzen) weniger Chlorophyll b und somit einen höheren a/b-Wert.

Die Absorption wird im Spektralphotometer bestimmt, indem man das Licht mißt, das durch die Probe dringt (Transmission). Die Anzeige und Aufzeichnung erfolgt dann meist als Extinktion, eine dimensionslose Größe, die nach dem Lambert-Beer Gesetz proportional zur Farbstoffkonzentration ist. Literatur - Buschmann C, Grumbach KH: Physiologie der Photosynthese. Springer, Berlin 1985,

S. 40-44 - Lichtenthaler HK, Pfister K: Praktikum der Photosynthese. Quelle und Meyer,

Heidelberg 1978, S. 102-106 Untersuchungsmaterial grünes Blatt isolierte Chlorophylle und Carotinoide (Versuch 1.1) Geräte Spektralphotometer dünnes weißes Papier (z.B. Kleenex oder eine Schicht Papiertaschentuch) Mörser Filter Filterpapier 5 ml-Messkolben Glasküvetten Chemikalien Aceton Durchführung Absorptionsspektrum des intakten Blattes von 750 bis 400 nm messen (einmal ohne Referenz, einmal mit Kleenex/Papiertaschentuch als Referenz) Absorptionsspektrum eines Acetonextrakts aller Blattfarbstoffe Rechteck (ca. 2 x 2 cm) aus dem Blatt schneiden (genaue Maße notieren: zur

Flächenberechnung) Blattstück mit wenig Aceton in einem Mörser verreiben Extrakt in ein 5 ml-Messkolben abfiltrieren mit Aceton auf 5 ml auffüllen

von 750 bis 400 nm messen (Referenz: Aceton) Absorptionsspektren der über DC isolierten Blattfarbstoffe von 750 bis 400 nm messen (Referenz: Aceton) Auswertung Man beschreibt die Unterschiede zwischen den Absorptionsspektren des Blattes und des Blattextraktes. Man bestimmt bei allen Spektren die Position der Absorptionsmaxima. Beim Absorptionsspektrum des Blattextraktes mißt man die Extinktion bei 750, 661,6, 644,8 und 470 nm. Der Extinktionswert bei 750 nm wird als Nullpunkt verwendet, d.h. wenn die Extinktion nicht gleich Null ist, muss der Wert bei 750 nm jeweils von den anderen Werten abgezogen werden. Man berechnet die Konzentrationen für Chlorophyll a, Chlorophyll b und für die Carotinoide nach folgender Formel (Lichtenthaler): ca = 11,24 Ext661,6 - 2,04 Ext644,8 cb = 20,13 Ext644,8 - 4,19 Ext661,6 cx+c = (1000 Ext470 - 1,90 ca - 63,14 cb) / 214 ca = Konzentration von Chlorophyll a [µg . ml-1] cb = Konzentration von Chlorophyll b [µg . ml-1] cx+c = Konzentration aller Carotinoide = Xanthophylle und Carotine [µg . ml-1] Ext661,6 = Extinktion bei 661,6 nm (Absorptionsmaximum von Chlorophyll a) Ext644,8 = Extinktion bei 644,8 nm (Absorptionsmaximum von Chlorophyll b) Ext470 = Extinktion bei 470 nm (hohe Absorption von Carotinoiden, geringe Absorption von Chlorophyllen) Die Konzentration der Farbstoffe wird in mg . m-2 errechnet. Zusätzlich wird das Verhältnis Chlorophyll a/b und das Verhältnis Chlorophylle zu Carotinoiden (a+b)/(x+c) berechnet. 1.4 Chlorophyllfluoreszenz Chlorophylle geben nach Absorption von Licht ein dunkelrotes Fluoreszenzlicht ab. Wie bei allen fluoreszierenden Substanzen ist beim Chlorophyll das Fluoreszenzmaximum etwas langwelliger als das Absorptionsmaximum ("Stokes shift"). Wie in der Absorption liegt auch in der Fluoreszenz das Maximum von Chlorophyll a etwas langwelliger als das von Chlorophyll b. Bei Blättern strahlt allerdings nur Chlorophyll a Fluoreszenz ab. Chlorophyll b überträgt die durch Absorption aufgenommene Energie vollständig auf Chlorophyll a, so dass bei einem Blatt keine Chlorophyll b-Fluoreszenz messbar ist. Bei hoher Chlorophyllkonzentration sieht man weniger Fluoreszenz als bei niedriger. Zum einen bewirkt die hohe Absorption, dass weniger Licht in tiefere Lagen vordringt, zum anderen wird die Fluoreszenz, die evtl. in tieferen Schichten entsteht, beim Passieren der grünen oberen Schichten reabsorbiert. Reabsorption findet statt, da sich Fluoreszenzspektrum und Absorptionsspektrum von Chlorophyll überschneiden. Da unser Auge in dem Überschneidungsbereich (knapp unter 700 nm) gerade noch empfindlich ist, vermindert sich die sichtbare Fluoreszenz besonders stark, wenn bei hohen Chlorophyllkonzentrationen die Fluoreszenz aus tieferen Schichten nach außen dringen muss ehe sie sichtbar ist.

Fluoreszenz und Photosyntheseaktivität eines Blattes sind in etwa umgekehrt proportional, d.h. bei hoher Photosyntheseaktivität ist mit geringer Fluoreszenz zu rechnen und umgekehrt. Ein zuvor abgedunkeltes Blatt, gibt bei Belichtung eine starke Fluoreszenz ab, da zunächst die Photosyntheseaktivität gering ist. Mit andauernder Belichtung nimmt die Photosynthese zu (Induktion der Photosynthese), gleichzeitig sinkt die Fluoreszenz ab. Diese Induktionskinetik der Chlorophyllfluoreszenz wird nach H. Kautsky, der sie schon in den 30er Jahren eingehend untersuchte, auch Kautsky-Kinetik oder Kautsky-Effekt genannt. Literatur - Lichtenthaler HK, Pfister K: Praktikum der Photosynthese. Quelle und Meyer,


100-103 Untersuchungsmaterial konzentrierter und verdünnter Extrakt eines grünen Blattes grüne Blätter Geräte UV-Lampe und Projektor Blaufilter (Corning: 9782) Rotfilter (Schott, Mainz: RG 665) schwarzes Tuch Durchführung in einem abgedunkelten Raum betrachtet man die Fluoreszenz mit bloßem Auge: A) unter UV-Bestrahlung: Extrakte bzw. grünes Blatt B) unter Weißlicht (Projektor): Extrakte C) unter Blaulicht (Projektor mit Blaufilter): Extrakte D) unter Blaulicht, betrachtet durch Rotfilter vor dem Auge: D1) Extrakte D2) Blatt, zur Hälfte mit schwarzem Tuch abgedunkelt D3) Blatt, schwarzes Tuch abgenommen ca. 5 min nach Beginn der Belichtung Auswertung Beschreiben Sie die Farbe und Intensität der Fluoreszenz, die Sie bei den einzelnen Versuchsteilen sehen. 1.5 photosynthetische Sauerstoffentwicklung Die Abhängigkeit der Photosynthese von der angebotenen CO2-Konzentration, der Lichtintensität und der Lichtqualität (Lichtfarbe) wird am Beispiel der Sauerstoffentwicklung bei der Wasserpflanze Elodea canadensis (Kanadische Wasserpest) untersucht. Der von Elodea im Verlauf der Photosynthese freigesetzte Sauerstoff wird unter Wasser aufgefangen. Das Gasvolumen des Sauerstoffs wird mit der Audusbürette bestimmt. Die Audusbürette (siehe Abb. 1.2) besteht aus einem durchbrochenen Glaskolben zur

Aufnahme der Pflanze. Dieser Kolben geht in eine graduierte Kapillare (ursprünglich eine 1 ml-Pipette) über, an der das gebildete Gasvolumen abgelesen wird. Literatur - Lichtenthaler HK, Pfister K: Praktikum der Photosynthese. Quelle und Meyer,

Heidelberg 1978, S. 112-116 Untersuchungsmaterial Grüne Sprosse von Elodea canadensis (Kanadische Wasserpest)

Abb. 1.2. Audusbürette mit Spross von Elodea. Pfeile bezeichnen Stelle des Schlauches, an der gedrückt werden muss, um die Sauerstoffblase in das Kapillarrohr aufsteigen zu lassen.

Geräte 2 Audusbüretten 2 100 ml-Messzylinder 10 ml-Pipette mit Pipettierhilfe 4 Schlauchklemmen 2 Lichtquellen (Projektor und Concentra-Strahler) Wärmefilter (Chromatographie-Kammer mit Wasser) 2 Stative mit Klemmen Farbfilter für Rotlicht: roter Glasfilter (Transmission > 640 nm; Nr. 2, Fa. Schott, Mainz) Farbfilter für Grünlicht: grüner Plastikfilter (Transmissionsmaximum bei 508 nm;

Fa. Mazzuccheli, Italien) und blauer Glasfilter (Transmissionsmaximum bei 455 nm; BG 38, Fa. Schott, Mainz)

Chemikalien 260 ml 0,1 M Natriumhydrogencarbonat-Lösung (M = 84 g . mol-1) 130 ml 0,5 M Natriumhydrogencarbonat-Lösung (M = 84 g . mol-1) Durchführung

Untergruppe A (Abhängigkeit der O2-Entwicklung

von der CO2-Konzentration):

Untergruppe B (Abhängigkeit der O2-Entwicklung

von der Lichtintensität und der Lichtfarbe) Aufbau der Audusbürette-Apparaturen

für beide Gruppen: Intakte Sprosse von Elodea mit der

abgeschnittenen Spitze nach oben in den Auffangkolben der Audusbürette

schieben (Abb. 1.2)

Herstellen der Natriumhydrogencarbonat- Lösungen für beide Gruppen

Messzylinder mit dest. Wasser füllen Messzylinder mit 0,1 M NaHCO3 füllen untere Schlauchklemme schließen

graduierte Kapillare durch Saugen mit der Pipette am oberen Gummischlauch vollständig mit Mediumlösung füllen obere Schlauchklemme schließen

untere Schlauchklemme schließen graduierte Kapillare durch Saugen mit der

Pipette am oberen Gummischlauch vollständig mit Mediumlösung füllen obere Schlauchklemme schließen

Weißlicht: Concentra-Strahler, davor wassergefüllte

Chromatographiekammer (als Wärmefilter)

Weißlicht 100 µMol Quanten . m-2 . s-1: Projektor im Abstand von 1,40 m

(Abstand Linsenende - Messzylinder) 3 mal nach 5 min Belichtung ablesen(1) und danach Sauerstoffblase aus dem

graduierten Bereich entfernen (2)

3 mal nach 5 min Belichtung ablesen(1) und danach Sauerstoffblase aus dem

graduierten Bereich entfernen (2) 0,1 M NaHCO3-Lösung:

(dest. Wasser gegen 0,1 M NaHCO3-Lösung austauschen)

Weißlicht 1000 µMol Quanten . m-2 . s-1: Projektor im Abstand von 40 cm





0,5 M NaHCO3-Lösung: (0,1 M NaHCO3-Lösung gegen

0,5 M NaHCO3-Lösung austauschen)

Rotlicht 100 µMol Quanten . m-2 . s-1: Projektor im Abstand von 70 cm




graduierten Bereich entfernen (2) Grünlicht 100 µMol Quanten . m-2 . s-1:

Projektor im Abstand von 50 cm (Abstand Linsenende - Messzylinder)


graduierten Bereich entfernen (2) (1) Ablesen: Die entstandenen Sauerstoffblasen werden in die Kapillare gesaugt. Dazu drückt man den

oberen Schlauch vorsichtig (siehe Pfeile in Abb. 1.2) und lässt anschließend wieder los, so dass eine Sauerstoffblase im graduierten Bereich bleibt. Ein kleiner Teilstrich im graduierten Bereich entspricht 10 µl.

(2) Sauerstoffblase aus dem graduierten Bereich entfernen: am oberen Schlauch kräftiger drücken und wieder loslassen

Auswertung Die O2-Entwicklung wird in µMol O2 . s-1 berechnet (bei 22°C und 0,1013 MPa (= 1 atm): 1 µMol O2 = 24,2 µl O2). Die Ergebnisse werden gemittelt und die Ergebnisse der Untergruppe A als Diagramm dargestellt. 1.6 Assimilationsstärke in Blättern Die bei der Photosynthese entstehenden Zucker, die nicht direkt für Biosynthesen verwendet werden, können als Stärke im Chloroplasten gespeichert oder als Saccharose zu anderen Blättern, zu Wurzeln oder zum Stamm abtransportiert werden. Stärke eignet sich besonders als Speicherstoff, weil sie im Gegensatz zu kleinen Zuckermolekülen osmotisch nur wenig aktiv ist. Gespeicherte Stärke kann bei Bedarf (z.B. nachts oder tagsüber bei unzureichender Photosynthese) wieder zu Zuckern umgesetzt werden. In den weißen Teilen panaschierter Blätter sind keine Chloroplasten zur Stärkebiosynthese und auch sonst wird keine Stärke gespeichert. Stärke setzt sich aus vielen Glucosemolekülen zusammen, die kettenförmig, schraubig gewunden (Amylose) oder verzweigt (Amylopektin) sind. Stärke ist mit Lugols-Reagenz (Jod/Kaliumjodidlösung) spezifisch nachweisbar. Es tritt Blau- bis Schwarzfärbung auf, wenn Jod in die schraubig gewundenen Amyloseketten eingelagert wird (schwache Rotfärbung beim verzweigten Amylopektin). Der Stärkenachweis kann direkt am Blatt ausgeführt werden. Um die Färbung deutlich sichtbar zu machen, müssen vorher die Blattfarbstoffe durch Kochen in Ethanol aus dem Blatt herausgelöst werden. Literatur - Lichtenthaler HK, Pfister K: Praktikum der Photosynthese. Quelle und Meyer,

Heidelberg 1978, S. 116-117

- Buschmann C, Grumbach KH: Physiologie der Photosynthese. Springer, Berlin 1985, S. 142

- Kunsch K: Autotrophie der Organismen. G Fischer, Stuttgart 1989 Untersuchungsmaterial Panaschiertes Blatt von Geranium zonale (Sorte „Happy Thought“) Geräte 300 ml-Weithalserlenmeyerkolben Glasstab Heizplatte Petrischale Chemikalien Ethanol Lugols-Reagenz (1 g KJ in 3 ml Wasser lösen, dann 0,5 g Jod zugeben und mit Wasser

auf 150 ml auffüllen) Durchführung Blatt von der Pflanze abtrennen Blatt in Erlenmeyerkolben geben und mit Ethanol übergießen (Glasstab gegen

Siedeverzug) auf einer Heizplatte kochen bis das Blatt entfärbt ist oder bis das Blatt zerfällt Ethanol abgießen (nicht halogenierter Lösungsmittelrest) Blatt in eine Petrischale geben und mit Jodlösung übergießen Auswertung Beschreiben Sie die Farbe und Farbverteilung der Blätter vor und nach Behandlung mit Lugols-Reagenz. 1.7 Diurnaler Säurerhythmus der Crassulaceen (CAM) Crassulaceen und andere Sukkulenten nehmen (im Gegensatz zu den übrigen Pflanzen) CO2 nachts auf. Dieses CO2 wird durch das Enzym PEP-Carboxylase an Phosphoenolpyruvat (PEP) gebunden, dabei bildet sich Oxalacetat, das später zu Malat reduziert wird. Malat, das Salz der Äpfelsäure, wird nachts in den Vakuolen gespeichert und führt zu einer Ansäuerung des Blattgewebes. Tagsüber wird das Malat wieder aus den Vakuolen herausgeholt. Aus diesem Malat wird dann mit dem Enzym PEP-Carboxylase in einer Umkehrreaktion wieder CO2 und Pyruvat freigesetzt. Das freigesetzte CO2 wird dann (wie bei allen Pflanzen im Licht) im Calvin-Zyklus durch das Enzym RubP-Carboxylase an Ribulose-1,5-bisphosphat (RubP) gebunden. Durch den Malatabbau nimmt der Säuregrad des Blattgewebes wieder ab (diurnaler Säurerhythmus = Änderung des Säuregehaltes im Verlauf eines Tages). Die Entsäuerung des Blattgewebes am Tage ist nicht sehr hoch, da in der Vakuole außer Malat noch andere Salze von Pflanzensäuren enthalten sind, die nicht am diurnalen Säurerhythmus beteiligt sind. Eine wichtige Rolle beim Zustandekommen dieser pH-Werte spielen die Temperaturoptima der PEP-Carboxylase (tiefere Temperatur) und der RubP-Carboxylase (höhere Temperatur). Die PEP-

Carboxylase, die nachts das CO2 an Phosphoenolpyruvat bindet, ist an einem Serinrest durch eine Kinase phosphoryliert. Die PEP-Carboxylase, die tagsüber Malat in Pyruvat und CO2 umsetzt ist an dem Serinrest durch eine Phosphatase dephosphoryliert.

Pflanzen, die diesen Crassulaceen-Säure-Stoffwechsel besitzen, werden CAM-Pflanzen genannt (CAM = Crassulacean Acid Metabolism). Sie sind an heiße Standorte angepaßt, da sie tagsüber die Spaltöffnungen geschlossen halten und dadurch keinen Wasserverlust durch Transpiration erleiden. Bei CAM-Pflanzen erfolgt morgens das Schließen der Stomata durch die standortbedingte, zunächst hohe Wasserabgabe und die dadurch verursachte Erniedrigung des internen Blatt-Wassergehalts. Dieser Mechanismus des Stomataschluss bei Wassermangel ist wie bei anderen Pflanzen dominant gegenüber den Mechanismen der Stomataöffnung bei Licht und CO2-Mangel (CO2-Abnahme bei laufender Photosynthese). In der Nacht öffnen die CAM-Pflanzen (im Gegensatz zu den C3- und C4-Pflanzen) die Stomata, da durch die Aktivierung der CO2-Aufnahme über das Enzym PEP-Carboxylase ein CO2-Mangel entsteht. Als Versuchsobjekte dienen Blätter die zuvor 24 Stunden lang im Licht bei Raumtemperatur oder im Dunkeln bei niedrigen Temperaturen gehalten wurden: Licht und Raumtemperatur: Dies entspricht den Verhältnissen an einem heißen Tag am

natürlichen Standort. Die Spaltöffnungen sind geschlossen. Das für den Calvin-Zyklus intern benötigte CO2 wird durch den Abbau von Malat innerhalb der Zelle gewonnen.

Dunkelheit und niedrige Temperatur: Diese Situation entspricht in der Natur kühlen Nächten. CO2-Fixierung an Phosphoenolpyruvat erfolgt bei voll geöffneten Spaltöffnungen.

Um die Differenz der H+-Konzentrationen berechnen zu können, müssen die beiden pH-Werte in die molaren H+-Konzentrationen als Zahl ohne Exponenten umgeformt werden. Literatur - Lichtenthaler HK, Pfister K: Praktikum der Photosynthese. Quelle und Meyer,


100-103 - Kunsch K: Autotrophie der Organismen. G Fischer, Stuttgart 1989 Untersuchungsmaterial Blätter von Kalanchoe daigremontaina Geräte Alufolie und Plastikbox Lichtquelle (bei Raumtemperatur) Kühlschrank 2 Mörser pH-Meter Durchführung 1 Tag vor dem Praktikum: 2 Blätter von einer Kalanchoe-Pflanze abtrennen

ein Blatt mit Alufolie einwickeln (Abdunkelung) und in Kühlschrank legen,

ein Blatt in durchsichtigen Behälter (Schutz vor Austrocknung) legen und bei Raumtemperatur belichten

am Praktikumstag: Blätter abwiegen (Frischgewicht) jedes Blatt in einen Mörser geben jeweils so viel destilliertes Wasser zugeben, dass man ein Volumen erhält, das beide

Blatthomogenate dasselbe Verhältnis Wasser/Blattgewebe haben (z.B. Frischgewicht: 12 g und 12,5 g, Wasser 12 ml bzw. 12,5 ml)

pH-Wert mit dem pH-Meter messen

Auswertung Der pH-Wert der Proben wird notiert. Berechnen Sie, wieviel Mol H+-Ionen in den beiden Blättern enthalten waren (µMol H+ . (g Frischgewicht)-1) und um wieviel µMol sich die H+-Ionen-Konzentration zwischen Tag und Nacht unterscheidet. 1.8 Saugspannung von Kartoffelzylindern Die Stabilität von Pflanzen wird wesentlich durch die Turgeszenz der einzelnen Zellen bewirkt. Durch die osmotische Aktivität der in der Zelle gelösten Substanzen nimmt die Zelle so lange Wasser auf wie es die Zellwand zulässt. Der Wassersog in die Zelle (Saugspannung S) ist also gleich der osmotische Aktivität der in der Zelle gelösten Stoffe (osmotisches Potential π) minus der Stärke der Zellwand gegen die sich ein Wanddruck aufbaut (Wanddruck PV): S = π – PV. In einer intakten Zelle herrscht durch das Wasser in der Zelle ein Druck auf die äußere Zellwand, der Bestandteil des Turgordruckes ist. Heute findet man in der Literatur eher den Begriff Wasserpotential Ψ anstelle der Saugspannung (gleicher Zahlenwert mit umgekehrtem Vorzeichen). Das Wasserpotential ist ein Maß für die effektive Verfügbarkeit des Wassers in Pflanzen, Boden, Lösungen oder Luft, oder einfacher: für die Wassersättigung. Das osmotische Potential (π) ist abhängig von der Konzentration der osmotisch aktiven Substanz und der Temperatur. Es wird wie folgt definiert:

π = c ⋅ R ⋅ T

π = osmotisches Potential in MPa

c = Konzentration in Mol ⋅ l-1

R = Universelle Gaskonstante für ideale Gase (= 0,08314 MPa . l . mol-1 . K-1) T = absolute Temperatur in Kelvin [K] (0°C = 273,15 K bzw. 20°C = 293,15 K)

Bei diesem Versuch werden gleich große Kartoffelstücke in unterschiedlich stark konzentrierte Zuckerlösungen gelegt. Bei der osmotischen Wasseraufnahme oder -abgabe kommt es zur Längen- und Gewichtsänderung des Gewebes. In der Lösung, deren osmotischer Wert (π) der Saugspannung des Gewebes entspricht, erfolgt keine Längen- oder Gewichtsänderung. Untersuchungsmaterial 3 große Kartoffelknollen Geräte Korkbohrer, Reagenzgläser, Messer, Lineal, 10ml-Pipetten, saugfähiges Papier, Feinwaage Chemikalien 30 ml 1 M Saccharose-Lösung (M = 342,3 g ⋅ mol-1) Durchführung Aus dicken Kartoffelknollen werden mit einem Korkbohrer von 10 mm Durchmesser 10 möglichst lange Kartoffelzylinder ausgestanzt und auf gleiche Länge gebracht (ca. 35 – 45 mm). Die Kartoffelzylinder werden einzeln gewogen und in die Reagenzgläser gegeben. 10 Reagenzgläser werden mit unterschiedlich konzentrierter Saccharose-Lösung befüllt:

Saccharose-Konzentration

0 M

0,1 M

0,15 M

0,2 M

0,25 M

0,3 M

0,35 M

0,4 M

0,5 M

0,6 M

1 M Saccharose-Lösung

0 ml 1 ml 1,5 ml 2 ml 2,5 ml 3 ml 3,5 ml 4 ml 5 ml 6 ml

Wasser 10 ml 9 ml 8,5 ml 8 ml 7,5 ml 7 ml 6,5 ml 6 ml 5 ml 4 ml Auswertung Nach 3 Stunden wird die Längen- und Gewichtsveränderung der mit saugfähigem Papier abgetrockneten Kartoffelzylinder gemessen. Die Werte werden in Prozent (Ausgangsgewicht bzw. – länge = 100%) gegen das osmotische Potential der Lösungen aufgetragen. Bestimmen Sie die Saugspannung in den Kartoffelzylindern (= osmotisches Potential der Lösung, bei der keine Längen- oder Gewichtszunahme stattfindet).

1.9 Transpiration Die Pflanze gibt Wasser sowohl in gasförmiger (Transpiration) als auch in flüssiger Form (Guttation) ab. Bei der Transpiration unterscheidet man zwischen der regulierbaren stomatären und der nicht-regulierbaren cuticulären Transpiration. Bei völlig geschlossenen Stomata, wenn nur eine cuticuläre Wasserabgabe an den die Blätter umgebenden Luftraum möglich ist, kommt die cuticuläre Transpiration auf Raten von 0,3 (Sukkulente) bis 6 % (Kräuter u. Gräser) der Umsatzmengen, die bei maximaler, nicht durch stomatäre Regelung beeinträchtigter Transpiration gemessen werden können. Die treibende Kraft der Transpiration ist der bestehende Wasserpotentialgradient zwischen den Blattmesophyllzellen und der umgebenden Atmosphäre. Der Vorgang der Transpiration ist somit passiv. Mit Hilfe eines Potometers kann die Transpiration volumetrisch (Volumen abgegebenes Wasser) gemessen werden. Mit Hilfe der Waage erfolgt die Transpirationsmessung über den Massenverlust (gravimetrisch). Untersuchungsmaterial 2 etwa gleich große Zweige mit Astdurchmesser ca. 8 mm (passend für Gummistopfen) im Winter: Eibe (Taxus baccata) im Sommer: Platane (Platanus spec.) o.ä. 2 Topfpflanze Tabak (Nicotiana tabacum) Geräte Potometer, 2 Büretten, Stative, Muffen, Klemmen, oberschalige Waage, Toilettenpapier, 2 Plastiktüten, Fön, Faden Durchführung 1. Der Zweig wird unter Wasser abgeschnitten, in den Stopfen eingeführt und eventuell

mit Fett gut abgedichtet. Dann setzt man den Zweig in das wassergefüllte U-Rohr (Potometer). Die Versuchsapparatur wird fertig aufgebaut und die Bürette bis zur Marke „0“ mit Wasser aufgefüllt. Die Transpiration der Zweige wird unter folgenden Bedingungen untersucht:

Abb. 1.3:

a) 1 Stunde Zimmertemperatur bei normaler Luftfeuchtigkeit, dann 1 Stunde Zimmertemperatur und erhöhte Luftfeuchtigkeit (Pflanze mit nassem Toilettenpapier umwickeln). Wasserstand alle 15 min ablesen.

b) 1 Stunden Zimmertemperatur und

normale Luftfeuchtigkeit, dann 1 Stunden mit bewegter Luft (Fön). Der Wasserstand in der Bürette wird alle 15 min abgelesen.

2. Die Töpfe der Tabakpflanze werden in eine Plastiktüte gestellt und unterhalb der Blätter

mit einem Faden zugebunden, um die direkte Wasserabgabe aus dem Topf zu vermeiden. Die Transpiration der Tabakpflanzen wird unter folgenden Bedingungen untersucht:

a) 2 Stunden Zimmertemperatur bei normaler Luftfeuchtigkeit b) 1 Stunde Zimmertemperatur bei normaler Luftfeuchtigkeit, dann 1 Stunde mit

bewegter Luft (Fön).

Die Tabakpflanzen werden alle 15 min gewogen. Der Wasserverlust der Tabakpflanze wird als Gewichtsverlust abgelesen und protokolliert.

Auswertung Bei beiden Versuchsteilen wird der Wasserverlust gegen die Zeit aufgetragen.

am 2. Versuchtag: Kartoffeln mitbringenDatum:Gruppe-Nr.:

Versuch 1.1 Name:.....................................a) vor dem Umfüllen in den Scheidtrichter

Farbe des Extraktsb) nach Zugabe von Petrolbenzin

Farbe der oberen PhaseFarbe der unter Phase

c) nach Zugabe von NaCl-LösungFarbe der oberen PhaseFarbe der unter Phase

d) nach Zugabe von Na2SO4

Farbe des Extrakts

Versuch 1.2 Versuchspflanze:

FarbeLaufstrecke in cm Rf-Wert

Laufmittelfront xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxß-Carotin (α-Carotin)

PhäophytinChlorophyll aChlorophyll b

Lutein (Zeaxanthin)Luteinepox.+Antherax.

ViolaxanthinNeoxanthin

Versuch 1.4 FluoreszenzFarbe Intensität

a) UV-Bestrahlung konz. Blattextraktverd. Blattextrakt

intaktes Blattb) unter Weißlicht (Projektor) konz. Blattextrakt

verd. Blattextraktc) unter Blaulicht (Projektor mit Blaufilter)

konz. Blattextraktverd. Blattextrakt

d) unter Blaulicht, betrachtet durch Rotfilter vor dem Auge:konz. Blattextraktverd. Blattextrakt

intaktes Blattintaktes Blatt (nach Dunkel)

intaktes Blatt (nach Licht)

Versuch 1.3Absorptionsmaxima

a) grünes Blatt ohne Referenzblauer Spektralbereich nm

roter Spektralbereich nm

b) grünes Blatt mit Papier als Referenzblauer Spektralbereich nm


c) Acetonextrakt grünes Blattblauer Spektralbereich nm


ExtinktionExtinktion bei 750 nm

Extinktion bei 661,6 nmExtinktion bei 644,8 nm

Extinktion bei 470 nmBlattfläche/Aceton-Volumen

Blattfläche cm2

Aceton-Volumen mlBlattfarbstoff-Konzentration im ExtraktChlorophyll a µg/mlChlorophyll b µg/ml

Carotinoide µg/mlBlattfarbstoff-Konzentration im BlattChlorophyll a mg/m2

Chlorophyll b mg/m2

Carotinoide mg/m2

Chlorophyll a/b(a+b)/(x+c)

d) isolierte Blattfarbstoffe (nach Dünnschichtchromatographie)Absorptionsmaxima in nm

1. 2.Chlorophyll aChlorophyll b

1. 2. 3.ß-Carotin

LuteinViolaxanthinNeoxanthin

Versuch 1.5

µl O2 (in 5 min Licht)

1. 2. 3.

Mittelwert in µl pro 5 min Licht

0 m NaHCO3 (= dest. Wasser)0,1 m NaHCO3

0,5 m NaHCO3

Weißlicht (100 µMol m-2 s-1)Weißlicht (1000 µMol m-2 s-1)

Rotlicht (100 µMol m-2 s-1)Grünlicht (100 µMol m-2 s-1)

Versuch 1.6

Blatt nach dem Kochen in Ethanol Farbeehemals weiße Stellenehemals grüne Stellen

Blatt nach dem Einlegen in Lugols-Reagenz Farbeehemals weiße Stellenehemals grüne Stellen

Versuch 1.7 FrischgewichtBlatt im Dunkeln und Kalten (Nachtzustand) g

Blatt im Licht und Warmen (Tagzustand) gpH-Wert

Blatt im Dunkeln und Kalten (Nachtzustand)Blatt im Licht und Warmen (Tagzustand)

µMol H+/g FrischgewichtBlatt im Dunkeln und Kalten (Nachtzustand)

Blatt im Licht und Warmen (Tagzustand)Differenz Nacht-Tag µMol H+/g Frischgewicht

Unterschied zwischen Tag- und Nachtzustand

Versuch 1.8

Konzen-tration der Saccha-

rose-Lösung in Mol/l

Osmot. Druck in

MPa (bei 23°C)

Anfangs-gewicht in

g

Gewicht nach 3 h

in g

Gewicht nach 3 h in % des

Ausgangs-werts

Länge nach 3 h

in mm

Länge nach 3 h in % des

Ausgangs-werts

0,000,100,150,200,250,300,350,400,500,60

Anfangslänge in cm:

Osmotischer Wert Kartoffelknolle: MPa(Gewicht/Längenveränderung = 0)

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

50

0 2 4 6 8 10 12 14

osmotischer Wert in MPa

Gew

icht

/Län

ge-Ä

nder

ung

in %

Versuch 1.9a) Potometer Pflanze:

Wasser-abgabe

in ml (seit

Anfang)

Wasser-abgabe

in ml (seit

Anfang)normale Luftfeuchte normale LuftfeuchteAnfang: Anfang:15 min 15 min30 min 30 min45 min 45 min60 min 60 minerhöhte Luftfeuchtigk mit Fön15 min 15 min Grafik:30 min 30 min Werte45 min 45 min gegen60 min 60 min Zeit

a) Gewichtsbestimmung Pflanze: Tabak

Topf-gewicht

in g

Topf-gewicht

in gnormale Luftfeuchte normale LuftfeuchteAnfang: Anfang:15 min 15 min30 min 30 min45 min 45 min60 min 60 min

mit Fön75 min 15 min Grafik:90 min 30 min Werte105 min 45 min gegen120 min 60 min Zeit

37

2. Enzyme Literatur - Heldt H-W: Pflanzenbiochemie. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 2003 - Voet D, Voet JG, Pratt CW: Biochemie. Wiley-VHC, Weinheim 2002 - Munk K: Grundstudium Biologie: Biochemie, Zellbiologie, Ökologie, Evolution. Spektrum

Akademischer Verlag, Heidelberg 2000 - Bisswanger H: Enzymkinetik. Theorie und Methoden. Wiley-VHC, Weinheim 2000 (nur

für sehr Interessierte) - Richter G: Stoffwechselphysiologie der Pflanzen. Thieme, Stuttgart 1997 - Kindl H: Biochemie der Pflanzen. Springer, Berlin 1991 - Suelter CH: Experimentelle Enzymologie. Gustav Fischer, Stuttgart 1990 Bitte bereiten Sie sich zu Hause auf diesen Praktikumstag vor, in dem Sie sich überlegen, was Sie im Praktikum einwiegen bzw. aufbauen und beschriften müssen. Sie werden in zwei Dreiergruppen parallel arbeiten aber können die zu verwendenden Lösungen gemeinsam ansetzen. Lerninhalt In der Theorie werden u.a. die folgenden Themen besprochen: Aminosäuren, Peptidbindung, Proteinbiosynthese in der pflanzlichen Zelle, Proteinstruktur, Denaturierung, Coenzyme, Cofaktoren, NAD+/NADP+, Aufbau und Funktion eines Photometers, Lambert-Beersches Gesetz, Theorie der enzymatischen Katalyse, Michaelis-Menten Gleichung, chemischer Aufbau der Stärke, Amylasen, Mobilisierung der Stärke im Gramineenendosperm, Enzymkinetik. Vorgehensweise Am ersten Versuchstag werden die Versuche 2.1 und 2.2 durchgeführt, am zweiten Versuchstag der Versuch 2.3. Unbedingt mitbringen: Spatel und wasserfesten Filzstift zur Beschriftung von Laborgläsern, Laborkittel und Schutzbrille 2.1 Nachweis einiger Enzyme im Kartoffelpresssaft Enzyme sind Biokatalysatoren, die aus einem Aminosäureteil und evtl. aus einem Nicht-Aminosäureanteil (z.B. Metallionen, prosthetische Gruppen) bestehen können. Enzyme beschleunigen den Ablauf von chemischen Reaktionen so stark, dass Leben/ Stoffwechsel unter physiologischen Bedingungen überhaupt erst möglich ist. Eine spezielle, definierte räumliche Struktur des Enzymproteins ist eine Grundvoraussetzung für die Katalysewirkung. Eine Veränderung dieser Konformation, z.B. durch Hitzedenaturierung, führt zum Verlust der Wirksamkeit. Ebenso können so genannte Inhibitoren (= Hemmstoffe) am Enzym angreifen und es außer Funktion setzen.

38

An einigen im Kartoffelpresssaft vorkommenden Enzymen (Katalase, Phenolase, Phosphatase) soll im Versuch folgendes nachgewiesen werden: - die von ihnen katalysierten Reaktionen (Reaktions- und Substratspezifität)

- die Inaktivierung der Enzyme durch Hitze

- die "Vergiftung" der Enzyme mit einem Hemmstoff

schematische Darstellung der zu messenden Enzymreaktionen:

OH+ 1/ O2 2 + H2O

OH

O

O

Phenoloxidase

Katalase2 H O22

O

OHHO

O

H2O3PO OPO3H2

O O

+ 2 H3PO4+ 2 H2O

Phosphatase

Phenolphthaleinphosphat(im Alkalischen: farblos)

Phenolphthalein(im Alkalischen: rot)

39

Untersuchungsmaterial 2 Kartoffelknollen mittlerer Größe Geräte Reagenzglasständer mit 12 Reagenzgläsern, Pipetten, Mixer, Zentrifuge Chemikalien * einige Kristalle NaCN, einige Kristalle Thioharnstoff, NaOH-Lösung, Eisensulfat * anzusetzen ist: Bitte rechnen Sie anhand der durchzuführenden Reaktionen aus, welche Volumina Sie benötigen und überlegen Sie sich, welche Volumina Sie herstellen wollen, und wie Sie dafür vorgehen müssen. Bitte Besprechung zuerst in der Gruppe dann mit dem Betreuer. (Wenn nicht anders angegeben sind % = Gewichtsprozente) Benötigte

Menge für 1 Gruppe

Herzu-stellende Menge

Hinweis Vorgehen

3% H2O2-Lösung H2O2-Stammlösung ist 35 %ig

1% Brenzkatechin-Lösung

o-Diphenol; Feststoff

1% Hydrochinon-Lösung

p-Diphenol; Feststoff

0,5% Phenolphthalein-bisphosphat-Lösung

Feststoff

Durchführung Aus den Kartoffelknollen wird ein Kartoffelpresssaft wie folgt hergestellt:

1. Kartoffeln gut waschen, klein schneiden und in den Mixer geben. 2. Destilliertes Wasser zufügen, bis die Stücke gerade bedeckt sind. 3. Die Kartoffelstücke im Mixer homogenisieren. (Was passiert?) 4. Das Homogenat wird durch vierfach gelegten Mull filtriert und das so erhaltene

Filtrat bei 10 000 Upm 10 Minuten zentrifugiert. 5. Den klaren Überstand halbieren und einen Teil 5 min lang kochen, filtrieren und

abkühlen lassen.

Die zwölf Reagenzgläser (R1 bis R12) werden nach dem folgenden Schema beschickt. Inhibitoren (NaCN, Thioharnstoff) bitte vor dem jeweiligen Substrat zum Presssaft geben, da sonst die enzymatische Reaktion bereits läuft. Die Reihenfolge der Zugabe ist also:

1. Presssaft (= Enzymquelle) 2. Inhibitor 3. Substrat

40

Katalase: R1 R2 R3 Frischer Presssaft 1 ml - 1 ml Gekochter Presssaft - 1 ml - NaCN - - Spatelspitze H2O2 -Lösung 5 ml 5 ml 5 ml Phosphatase:

R4 R5 Frischer Presssaft 2 ml -

Gekochter Presssaft - 2 ml Phenolpthaleinbis-P 2 ml 2 ml

Phenolase: R6 R7 R8 R9 R10 Frischer Presssaft

2 ml - 2 ml - 2 ml

Gekochter Presssaft

- 2 ml - 2 ml -

Thioharnstoff - - - - SpatelspitzeBrenzkatechin 5 ml 5 ml - - 5 ml Hydrochinon - - 5 ml 5 ml - Blindwerte:

R11 R12 Frischer Presssaft 2 ml -

Gekochter Presssaft - 2 ml dest. Wasser 5 ml 5 ml

Zum Nachweis der Phosphatase-Reaktion wird nach der Inkubation von Enzym und Substrat der Ansatz R4 mit NaOH-Lösung so alkalisch gemacht, dass eine stabile Rosafärbung zustande kommt (dabei die Zahl der benötigten Tropfen NaOH zählen). Dieselbe Zahl Tropfen wird zu Ansatz R5 gegeben. Zum Nachweis der enzymatischen Reaktion in R1 wird zu R2 Eisensulfat gegeben und dadurch eine Schwermetallkatalsye ausgelöst. Auswertung Beschreiben und erklären Sie die beobachteten Reaktionen. Anmerkung: Da die Zentrifugationsgefäße hohen Kräften ausgesetzt werden, müssen sie sorgfältig behandelt werden. Ausserdem ist es wichtig die Gefäße für die Zentrifugation an der Waage auszutarieren.

40

2.2 Messung des Spektrums von NAD + und NADH NAD+-Reduktion: Grundlage für den optischen Test NAD+ (= Nicotinamidadenindinukleotid) und NADP+ (= Nicotinamidadenindinukleo-tidphosphat) sind Substrate vieler Oxidoreduktasen (Enzyme, die Redoxreaktionen katalysieren). NAD+ und NADP+ sind die oxidierten Formen. NADH und NADPH sind die reduzierten Formen.

Quelle: Campbell, Biologie, S. 179

NAD+ vermittelt Oxidationsreaktionen (d.h. NAD+ wird reduziert = Elektronenaufnahme), wie sie z.B. in der Glycolyse und dem Citratzyklus vorkommen (katabole Reaktionen). In den meisten Fällen werden bei Oxidationsreaktionen im Zellstoffwechsel die Elektronen nicht direkt auf Sauerstoff übertragen, sondern zunächst auf NAD+. Der Pyridinring übernimmt vom Substrat ein Proton mit seinen zwei Bindungselektronen. Das Substrat gibt ein Proton ab in Lösung (→ Schreibweise: NADH + H+). NADP+ wird u.a. in den Chloroplasten durch den photosynthetischen Elektronentransport (an den Thylakoidmembranen) reduziert. In einer zweiten Reaktion, die durch ein anderes Enzym katalysiert wird, werden die "verbrauchten" Coenzyme wieder regeneriert: NADH gibt seine Elektronen in die At-mungskette der Mitochondrien und wird dadurch wieder oxidiert. NADPH ist im Gegensatz zu NADH für biologische Reduktionen, wie sie z.B. bei der Fettsäurebiosynthese oder dem reduktiven Pentosephosphatzyklus (= Calvin-Zyklus) auftreten, zuständig (anabole Reaktionen) und wird bei Abgabe seiner Elektronen wieder zu NADP+ oxidiert. Die Regeneration der oxidierten Formen ist wichtig, damit die Redoxreaktionen, bei denen sie beteiligt sind, weiter ablaufen können. Stehen sie als Cosubstrate nicht mehr zur Verfügung, können diese Stoffwechselreaktionen nicht mehr ablaufen (Beispiel: Gärung als Mittel zur Rückgewinnung von NAD+ unter anaeroben Bedingungen).

41

Da NAD+ und NADP+ als Cosubstrate bei sehr vielen enzymatischen Redoxreaktionen auftreten, hat der sog. optische Test nach Warburg für die Enzymatik große Bedeutung. NAD+ und NADP+ besitzen ein Absorptionsmaximum um 260 nm (Adeninbande). Die Reduktion führt zu einem weiteren Maximum bei 340 nm. Die Extinktionszunahme bei 340 nm ist der Menge an gebildetem NADH bzw. NADPH proportional. Auf dieser Tatsache beruht der von Otto Warburg entwickelte so genannte optische Test zum Nachweis enzymatischer Redoxreaktionen. Substrat und Coenzym werden in stöchiometrischem Verhältnis umgesetzt, d.h. mit der Messung der molaren Menge an umgesetztem Coenzym kann man gleichzeitig die Menge an umgesetztem Substrat bestimmen. Die Reduktion von NAD+ gelingt auch auf chemischem Weg mit Kaliumborhydrid oder Natriumdithionit in gepufferter Lösung. Dies soll im Versuch durch Vergleich der Spektren vor und nach der Reduktion demonstriert werden. Untersuchungsmaterial Lösung von NAD+ in Phosphatpuffer Geräte Reagenzglas, Spektralphotometer, UV-durchlässige Küvetten, Spatel Chemikalien NAD+-Lösung (5 mg in 50 ml Kaliumphosphatpuffer) Kaliumphosphatpuffer (KH2PO4 / K2HPO4 150 mM, pH 7,5),

NAD+-Lösung und Phosphatpuffer werden gestellt Kaliumborhydrid (KBH4) Durchführung Für die photometrische Bestimmung werden 1,5 ml der NAD+-Lösung mit 3,5 ml Phos-phatpuffer verdünnt. Ein Teil dieser Lösung wird in eine Küvette gefüllt und das UV-Spektrum zwischen 230 nm und 400 nm an einem Spektralphotometer aufgenommen. Anschließend wird die NAD+-Lösung mit einer kleinen Spatelspitze pulverförmigen KBH4 versetzt. Sobald nach längerem Rühren auf einem Magnetrührer keine Gasblasen mehr auftreten, ist die Reaktion abgeschlossen. Nun wird ein Teil der Lösung wieder in die Küvette zurückgegeben und erneut das Spektrum zwischen 230 nm und 400 nm registriert. Auswertung Die aufgenommenen Spektren sind zu vergleichen. Welche Maxima treten vor und nach der Reduktion auf?

42

Berechnung der Ausgangsmenge an NAD+. Mit Hilfe der Unterschiede der Extinktionswerte bei 340 nm ist die Menge des gebildeten NADH in mg / ml über das Lambeert-Beer´sche Gesetz zu berechnen und mit der Ausgangsmenge an NAD+ zu vergleichen:

ε = 6,22 . 103 [l . mol-1 . cm-1], Molekulargewicht von NADH: M = 665 g/mol Geben Sie an, wie viel Prozent des eingesetzten NAD+ zu NADH umgewandelt wurde. 2.3 Isolierung und Nachweis enzymatischer Aktivität von Amylase aus

Weizenkörnern 2.3.1 Albuminisolierung und -fällung Methoden zur Isolierung von Proteinen aus Gewebe Proteine können in der Pflanze löslich oder membrangebunden vorliegen. Dementsprechend muss die Isolationsmethode gewählt werden. Ein Protein muss im Extraktionsmittel löslich sein. Dies hängt u.a. vom pH-Wert und von der Ionenstärke des verwendeten Mediums, sowie bei membrangebundenen Proteinen von der Zugabe eines geeigneten Detergenz, ab. Werden diese Faktoren entsprechend gewählt, so geht aus dem vorliegenden Gesamtprotein eine ganz bestimmte Fraktion in Lösung, da sich die einzelnen Proteine in ihrem Lösungsverhalten unterscheiden. Viele Proteine sind schon in destilliertem Wasser löslich wie z.B. die Albumine, niedermolekulare (MG = 40.000 bis 80.000 g/mol) Sphäroproteine, zu denen viele Enzyme und pflanzliche Speicherproteine gehören. Andere sind mit verdünnten Neutralsalzlösungen extrahierbar. Diese als Globuline bezeichneten hochmolekularen (MG = 300.000 bis 400.000 g/mol) Eiweißmoleküle sind ebenfalls häufig Enzyme. Aus dem erhaltenen Rohextrakt muss das Protein nun isoliert und gereinigt werden. In der modernen Proteinchemie stehen dazu viele Möglichkeiten zur Auswahl, z.B. Elek-trophorese oder verschiedene chromatographische Methoden (z.B. Ionenaustausch-chromatographie, Gelfiltration, Affinitätschromatographie). Ein einfaches Verfahren zur Proteinisolierung stellt die Fällung oder Präzipitation dar. Diese findet im Praktikum Anwendung. Im Allgemeinen kommt es dabei zu einer Verminderung der Hydratation des Proteins. Im gelösten Zustand stellen die Eiweißmoleküle polyvalente Ionen (amphotere Elektrolyte) dar, an die Wasserdipole angelagert sind. Durch Säuren oder konz. Salzlösungen (z.B. Ammoniumsulfat) kann diese Hydrathülle stark vermindert werden. Die amphoteren Makromoleküle verbinden sich dann zu größeren, wasserunlöslichen Aggregaten und fallen aus der Lösung aus. Wird die ursprüngliche Ionenstärke wieder hergestellt, so lässt sich die Fällung rückgängig machen. Alle Arbeitsschritte sollten bei tiefen Temperaturen (0 bis 5° C) durchgeführt werden, um eine irreversible Schädigung der Proteine zu vermeiden.

43

Untersuchungsmaterial trockene Weizenkörner, 3-Tage-alte Weizenkeimlinge (d.h. in Wasser gequollen) Geräte Filterpapier, kleine Reibschale mit Pistill, Kaffeemühle, Zentrifuge, Zentrifugenbecher, Bechergläser, Glasstab Chemikalien auszuzählen sind: jeweils 100 trockene und gekeimte Samen herzustellen sind: ml gesättigte Ammoniumsulfat-Lösung (wann ist eine Lösung gesättigt?), ml Extraktionslösung 3 mM CaCl2-Lösung (110 mg CaCl2 • 2 H2O auf 250 ml H2O) Bitte rechnen Sie aus, welche Volumina der Lösungen für eine Gruppe benötigt werden und überlegen Sie sich, welche Menge sie herstellen und wie Sie dazu vorgehen (Besprechung in Ihrer Gruppe und mit Ihrem Betreuer) Durchführung 100 trockene Weizenkörner werden in einer Kaffeemühle fein zermahlen. Das Samen-mehl möglichst vollständig in ein Becherglas überführen und nach untenstehendem Ar-beitsschema weiter behandeln. Von 100 gekeimten Weizenkörnern Würzelchen und Keimsprosse entfernen. Das weiche Endospermgewebe im Mörser wie folgt weiterbe-arbeiten. Alle Schritte auf Eis durchführen: 1 a) trockene Körner (gemahlen) mit 50 ml Extraktionsmedium 10 min lang extrahieren b) angekeimte Körner mit wenig Extraktionsmedium im Mörser zerreiben und

mehrmals nachspülen, Endvolumen 50 ml

a +b jeweils wie folgt getrennt weiterverarbeiten: 2) Filtration durch Mull 3) Filtrat zentrifugieren 15 min ca. 10 000 Upm 4) 100 ml gesättigte Ammoniumsulfatlösung zu Überstand geben und unter Rühren Ausfällung beobachten 5) Zentrifugieren, 15 min ca. 10.000 Upm 6) Bodensatz in je 50 ml Extraktionsmedium aufnehmen und vollständig in Lösung bringen, diese Lösungen dienen als Enzymquelle zur Bestimmung der Amylase-Aktivität (s.u.)

44

2.3.2 Messung der Amylase-Aktivität: Unterschied zwischen gekeimten und ungekeimten Körnern

Physiologie der Keimung von Gramineensamen Zu den Albuminen, die aus keimenden Getreidesamen isoliert werden können, gehört auch α-Amylase mit einer Teilchenmasse von 41 kDa (ß-Amylase besitzt eine ca. 5-fach höhere Molmasse und steht damit den Globulinen näher). Ungefähr 50% des bei der Keimung neu gebildeten Proteins besteht aus α-Amylase. Sie spaltet die α-glycosidischen 1,4-Verbindungen innerhalb eines Stärkemoleküls (Endoenzym). Die β-Amylase liegt im ruhenden Samen als inaktive Vorstufe vor und wird mit Beginn der Keimung aktiviert. Sie spaltet vom nicht reduzierenden Ende her Maltose-Einheiten ab (Exoenzym). Die keimungsspezifische Aktivitätszunahme von α-Amylase ist in den Albuminextrakten nach Fällung mit Ammoniumsulfat nachweisbar. Einheiten der Enzymmenge Unter sättigenden Substratkonzentrationen ist die Enzymaktivität ein Maß für die Enzymmenge, d.h. die Reaktionsgeschwindigkeit ist unabhängig von der Substratkonzentration und nur noch abhängig von der Enzymkonzentration. Legt man alle die Reaktion beeinflussenden Faktoren fest (Temperatur, pH, Ionenkonzentration), so kann man die Reaktionsgeschwindigkeit als Maß für die Enzymmenge nehmen. Die Einheit Katal besagt, dass unter Standardbedingungen (Standardtemperatur = 25° C usw.) 1 mol Substrat pro Sekunde umgesetzt wird. Beim Katal werden zwar die SI-Einheiten Mol und s benutzt, doch ist in der Praxis ein Katal eine viel zu große Enzymmenge. Deshalb wird auch heute noch die Einheit IU (für International Unit) verwendet. 1 IU ist die Enzymmenge, die unter Standardbedingungen 1µMol Substrat pro Minute umsetzt. Für den Versuch 2.3.2 ist die errechnete Einheit µg abgebaute Stärke pro Sekunde (warum kann man hier nicht mit Mol arbeiten?). Unter der spezifischen Enzymaktivität versteht man die Enzymmenge (z.B. in Units) geteilt durch die Proteinmenge in der Probe. In sehr unreinen Enzympräparationen beobachtet man eine geringe spezifische Aktivität, die mit jedem Reinigungsschritt zunehmen sollte (Stichwort Enzymreinigungstabellen). Untersuchungsmaterial Albuminlösungen aus ruhenden und keimenden Weizenkörnern, s.o. Geräte Photometer, Küvetten, 20 Reagenzgläser, Reagenzglasgestell, Wasserbad, Pipetten, Eppendorfpipette für 1 ml, Stoppuhr (selber mitbringen)

45

Chemikalien Lösliche Stärke CaCl2 . 2 H2O Jod Kaliumjodid (KJ) 0,05 M HCl anzusetzen: Substratlösung: 100 ml 0,2 %ige Stärkelösung + 5 mg CaCl2 . 2 H2O salzsaures Jodreagenz (häufig noch von Vorgängergruppe vorhanden):

Jod-Lösung (2 g KJ werden in 3 bis 4 ml Wasser gelöst, dann wird 1 g Jod zugegeben und mit Wasser auf 300 ml aufgefüllt) mit 0,05 M HCl 1:5 verdünnen.

Durchführung 1. jedes Reagenzglas mit 1 ml Albuminlösung beschicken.

Die mit Albuminlösung gefüllten Reagenzgläser sowie die Stärkelösung stehen zur Temperierung im Wasserbad (ca. 40°C).

2. Starten der Reaktion durch Zugabe von 1 ml Stärkelösung. Messen der Zeit mit einer

Stoppuhr. Es werden zwei Messreihen mit jeweils 3 Inkubationszeiten (Dreifachansätze) durchgeführt: a.) mit Albuminlösung aus gekeimten Körnern: 3 x 0 s *, 3 x 10 s, 3 x 20 s b.) mit Albuminlösung aus ungekeimten Körnern: 3 x 0 s *, 3 x 10 s, 3 x 20 s

*Für den Null-Sekunden-Wert werden die Schritte 2. und 3. in ihrer

Reihenfolge vertauscht! 3. Stoppen der Reaktion mit Zugabe von 1 ml saurer Jod-Lösung. 4. Verdünnen mit 10 ml Wasser und gut mischen (Messbarkeit im Photometer). Herstellen des Leerwerts: 1ml H2O + 1 ml Albuminextrakt + 1 ml Jod-Lösung. + 10 ml H2O Nach 5 min: Messung der Extinktion im Photometer bei 620 nm gegen den jeweiligen

Leerwert. Auswertung Aus den Messwerten der je 3 Parallelmessungen soll ein Mittelwert gebildet werden. Die Extinktion in Abhängigkeit von der Zeit ist graphisch darzustellen. Ist die Abnahme der Extinktion während der ersten 20 s linear?

46

Berechnen der Reaktionsgeschwingigkeiten in µg / s: Zum Zeitpunkt t = 0 enthält jeder Ansatz 1 ml einer 0,2%igen Stärkelösung. Das sind 0,002 g oder 2000 µg. Die Extinktion ist der Stärkekonzentration proportional. Fällt die Extinktion während ∆t um x% (der Anfangsextinktion) ab, so wurden x% der Stärke abgebaut (der ∆t-Wert zwischen den Zeitpunkten 0 und 10 s ist 10 s, der ∆t-Wert zwischen den Zeitpunkten 10 s und 20 s ist ebenfalls 10 s). Die Reaktionsgeschwindigkeit ist der Quotient aus der Menge abgebauter Stärke in µg und der Zeitspanne ∆t in s.

Erstellen Sie eine zusammenfassende Tabelle mit den Spalten Zeitpunkt t, Extinktion E, ∆t, ∆E, "verbliebene Stärke", "Stärke abgebaut in ∆t", Reaktionsgeschwindigkeit [µg / s]! Wie stark unterscheiden sich die Amylaseaktivitäten aus ungekeimten und gekeimten Körnern? 2.3.3 Zeitlicher Verlauf einer enzymatischen Reaktion Theorie der Enzymkinetik Wie chemische Reaktionen können auch enzymatisch katalysierte Reaktionen in ihrem zeitlichen Verlauf untersucht werden (Reaktionskinetik) und daraus Rückschlüsse über deren Ablauf gezogen werden. Die Geschwindigkeit v der Enzymreaktion kann als Substratabnahme (-d[S] / dt) oder Produktzunahme (d[P] / dt) gemessen werden. Der Verlauf der Reaktion kann so dargestellt werden:

E + S ↔ ES-Komplex → P + E Die erste Teilreaktion ist die Bildung des Enzym-Substrat-Komplexes (ES-Komplex). Sie führt zu Beginn einer Reaktion schnell zu einem Gleichgewicht zwischen [E], [S] und [ES]. Die zweite Teilreaktion (ES → P + E) verläuft langsamer als die erste, weil hierbei die chemische Reaktion stattfindet. Die langsamere Teilreaktion ist geschwin-digkeitsbestimmend für die Gesamtreaktion: v = k • [ES] (k = Geschwindigkeitskonstante der zweiten Teilreaktion). Dies ist zumindest die Grundvoraussetzung bei der Verwendung der Michaelis-Menten Gleichung (nicht für alle Enzyme stimmt diese Annahme). Bei hohen Substratkonzentrationen (Substratsättigung) treffen freie Enzymmoleküle sehr schnell wieder mit einem Substratmolekül zusammen. Es sind also immer maximal viele ES-Komplexe vorhanden (anders ausgedrückt: praktisch alle Enzymmoleküle liegen im ES-Komplex vor und nicht als freies Enzymmolekül E) und die Reaktionsgeschwindigkeit bleibt konstant maximal (Vmax), bis die Substratkonzentration weit geringer als sättigend ist. Man spricht von einer Kinetik 0ter Ordnung, weil [S] mit der Potenz 0 in die Geschwindigkeitsgleichung eingeht. Im Konzentrationsbereich unter

47

der Sättigung geht die bis dahin lineare Kinetik in eine nicht-lineare Kinetik erster Ordnung über ([S] geht in die Geschwindigkeitsgleichung als [S]1 ein): Die Reaktionsgeschwindigkeit ist von der momentanen Substratkonzentration abhängig, weil die wenigen Substratmoleküle nun sehr selten mit freien Enzymmolekülen zusammentreffen. Eine typische Reaktionskinetik ([S] gegen t aufgetragen) zeigt wie aus diesem Modell zu erwarten einen linearen Anfangsbereich und dann ein Abflachen. Untersuchungsmaterial Albuminlösung aus angekeimten Körnern Durchführung Messung von Zeitwerten: s.o. Die Reaktionskinetik wird bei ca. 0°C (auf Eis) durchgeführt. Für die Bestimmung müssen alle Lösungen (Albumin- und Stärkelösung) die entsprechende Temperatur haben, d.h. sie werden auf Eis gelagert. 10 ml Stärkelösung werden zu 10 ml Enzymlösung gegeben (Reaktionsstart) und nach 0 s, 30 s, 60 s, 90 s, 120 s, 150 s und 180 s jeweils 2 ml in ein Reagenzglas mit bereits vorgelegter saurer Jod-Lösung (1 ml) pipettiert. Messung der Amylase-Aktivität wie oben. Bedenken Sie, dass Sie auch hier einen Leerwert brauchen. Auswertung Der Reaktionsverlauf ist graphisch darzustellen, wobei die Extinktion (y-Achse) gegen die Reaktionszeit (x-Achse) aufzutragen ist. Der Kurvenverlauf soll diskutiert werden. Die bei den unterschiedlichen Temperaturen (im Wasserbad und auf Eis) erhaltenen Kinetiken sind miteinander zu vergleichen.

Abb. 2.1 Verlaufskurven einer einfachen Enzymreaktion (Voet: Lehrbuch der Biochemie, S. 347)

1

3. Molekularbiologie Literatur:

- H.W. Heldt: Pflanzenbiochemie, 2. Auflage, Spektrum Akademischer Verlag - C. Mülhardt: Der Experimentator: Molekularbiologie/ Genomics, 3.

Auflage, Spektrum Akademischer Verlag (Methodenbuch) - H. Rehm, F. Hammar: Biochemie light, 2. Auflage, Verlag Harri Deutsch - R. Knippers: Molekulare Genetik, 8. Auflage, Thieme Verlag - B.B. Buchanan, W. Gruissem, R.L. Jones: Biochemistry&Molecular Biology

of Plants, 1.Auflage Darüber solltet ihr am Ende des Praktikums Bescheid wissen:

Nukleinsäuren: Struktur, Vorkommen, Funktion Genom, Transkriptom, Proteom Protein: Struktur, Funktion Membranen: Struktur, Funktion

Molekularbiologie ist ein Teilgebiet der Biologie, die sich mit der Struktur und Funktion biologischer Makromoleküle (Nukleinsäuren, Proteine) beschäftigt. Nach Monod ist das Ziel der Molekularbiologie die Interpretation der wesentlichen Eigenschaften der Organismen aufgrund ihrer molekularen Strukturen. Grenzgebiete der Molekularbiologie sind Biochemie, Biophysik, Bioinformatik, Genetik, u.a. Im Gegensatz zu eher klassischen Ansätzen wird in der Molekularbiologie besonderen Wert auf die informationstragenden Moleküle gelegt. Wurde früher das statistische Verhalten vieler Moleküle analysiert, so rückten in der Molekularbiologie eher einzelne Moleküle (z.B. DNA) in den Vordergrund, deren Analyse mehr Informationen über die kausalen Zusammenhänge des Lebens versprechen (1 DNA-Molekül ist wichtiger, als 10000 Glukose-Moleküle). Allerdings ist auch die Molekularbiologie eine sich noch entwickelnde Wissenschaft. Das Leben kann durch verschiedene Merkmale definiert werden. Diese Merkmale werden euch im Laufe des Praktikums mehrmals begegnen:

- Selbstvermehrung (Weitergabe von genetischer Information) - Stoffwechsel - Wachstum und Entwicklung (Differenzierung) - Aufnahme und Reaktion auf Umweltreize - Entwicklung der Arten im Sinne von Evolution (dies setzt Veränderungen der

Erbinformation durch Mutation und Rekombination voraus) - Abgrenzung nach Innen und Außen durch Kompartimentierung (Membranen)

Ein Dogma der Molekularbiologie geht von folgendem Schema aus: Dabei haben verschiedene Komponenten verschiedene Aufgaben: DNA (Konservierung der Erbinformation), RNA (Übermittlung der Information), Proteine (Funktion).

DNA

DNA

Replikation

TranskriptionRNA Protein

Translation

2

Die Gesamtheit der DNA in einer Zelle wird als Genom bezeichnet. Die Genomgrößen, genauer das Kerngenom, kann zwischen verschiedenen Organismen stark unterschiedlich sein: Anzahl Basenpaare (=bp)/haploides Genom

Kerngenom Plastidengenom (Plastom)

Mitochondriengenom mtDNA (=Chondriom)

A. thaliana 157 Mbp 156 kbp 370 kbp Zea mays 3900 Mbp 136 kbp 570 kbp Vicia faba 14500 Mbp 120 kbp 290 kbp H. sapiens 2800 Mbp 17 kbp 3.1 Isolierung von Plastiden-DNA aus Arabidopsis thaliana/ Restriktionsverdau/ elektrophoretische Trennung der Plastiden-DNA aus Arabidopsis und Lambda-Phagen Im Praktikum wollen wir das Genom des Phagen λ und das Plastom von Arabidopsis miteinander vergleichen. Die DNA wird durch Elektrophorese aufgetrennt und dadurch einer Längenbestimmung zugänglich. (Faustformel: 1 Nukleotid hat ein Molekulargewicht von 333, ein Basenpaar dementsprechend 666. Beispiel: λ-DNA 48502 bp 1 µg = 0,03 pmol). Da genomische/ plastidäre DNA zu groß ist, um durch normale Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt zu werden, muß solche DNA durch Restriktionsenzyme geschnitten werden. Restriktionsendonukleasen schneiden DNA an spezifischen Erkennungssequenzen. Im Praktikum verwenden wir: EcoRI: 5`...G AATT C...3` …G AATTC... 3`...C TTAA G...5` ...CTTAA G... HindIII: 5`...A AGCT T...3` ...A AGCTT... 3`...T TCGA A...5` ...TTCGA A... Im λ-Genom gibt es folgende Schnittstellen: EcoRI: 21226, 26104, 31747, 39168, 44972 HindIII: 23130, 25157, 27479, 36895, 37459, 37584, 44141 Berechnet die Längen der entstehenden Restriktionsfragmente. Skizziert die Fragmente der DNA des Phagen im Gel. Wie sieht die verdaute, bzw. unverdaute Plastiden-DNA aus? Warum? Das Pflanzenmaterial (ca. 2-3 Wochen alt) sollte frisch geerntet und möglichst bald homogenisiert werden. 1-2 Tage vor der Ernte sollten die Pflanzen im Dunkeln aufbewahrt werden, damit die in den Plastiden gespeicherte Stärke abgebaut wird, welche sich nachteilig auf die Intaktheit der Plastiden auswirkt.

3

Puffer: (immer frisch herstellen aus den Stammlösungen)

Isolationspuffer 12,8 g Sorbit 1,6 ml 0,25 M HEPES/KOH pH 7,8 80 µl 1 M KCl 80µl 0,1 M EDTA mit Aqua dest. auf 200 ml auffüllen

2fach Resuspensionspuffer 12 g Sorbit 1,6 ml HEPES/KOH pH 7,8 80 µl 1 M KCl 80µl 0,1 M EDTA mit Aqua dest. auf 100 ml auffüllen

40% Percoll-Kissen

12 ml 2x Resuspensionspuffer 9,6 ml 100% Percoll 2,4 ml Aqua dest.

1fach Resuspensionspuffer

100 ml (50 ml 2xResuspensionspuffer + 50 ml Aqua dest.) Vorbereitung:

• Eis holen • Mixer-Becher in Tiefkühlschrank stellen • Ausschwingzentrifuge (Hettich) mit Falcon-Einsätzen vorkühlen • Puffer und Percoll-Kissen fertig stellen und auf Eis stellen • Auffangbehälter, Mull-Tuch (4-lagig) und Trichter auf Eis, ebenso die 50 ml

Röhrchen (Falcons) • Spritzen mit Percoll-Kissen aufziehen (je 10 ml)

Alle Gefäße, die mit den Plastiden in Berührung kommen nicht mit Spülmittel (Detergenz) auswaschen, da die Plastiden durch Detergenz-Reste sonst kaputt gehen!! Plastiden-Isolierung:

• Ernte der Arabidopsis-Pflanzen (Stängel abschneiden und verwerfen, Blätter sammeln und kleinschneiden, abwiegen)

• Blattmaterial mit 200 ml Isolationspuffer in Mixer geben und mit 3-4 Stößen jeweils 2-3 s homogenisieren (Mixer nicht zu lange betreiben, damit Plastiden nicht kaputt gehen)

• Durch 4 Lagen Mull filtrieren, dabei Handschuhe tragen • Filtrat auf 4 Falcons verteilen und mit ca. 5 ml Percoll-Kissen/Falcon unterschichten • 4 min. 4000 rpm • Überstand komplett verwerfen (Überstand komplett abgießen, dabei Röhrchen

kopfüber halten, nicht zurückdrehen, Röhrchen mit Pinzette und Küchenpapier auswischen)

• Alle Pellets zusammen in 30 ml Resuspensionspuffer aufnehmen und in einem Falcon abzentrifugieren , 4 min. 4000 rpm, Überstand abgießen

4

• Pellet in 1 ml Resuspensionspuffer aufnehmen und in 2ml-Eppi überführen • Ca. 60 s Stärke absetzen lassen (auf Eis) • Überstand (Plastiden und Kerne) abziehen und in neues Eppi überführen,

abzentrifugieren

Isolierung der Plastiden-DNA:

• Plastiden-Pellet in 600 µl TE-Puffer resuspendieren • + 60 µl 10% CTAB, Endkonzentration 1% (CTAB=Detergenz, schließt

Membranen auf) • + 600 µl Phenol !!!! ABZUG !!!! HANDSCHUHE !!!! GIFTIG !!!

(Phenol fällt Proteine) • mischen, kurz abzentrifugieren • obere, wässrige Phase abnehmen und in neues 2ml-Eppi überführen (Rest:

Phenol+Proteine) • + 600 µl Chloroform, vortexen (um Phenol zu entfernen) • obere, wässrige Phase in neues 2ml-Eppi (2x) • + 1/10 Volumen Natrium-Acetat (NaAc) -> 60 µl • + 2,5 faches Volumen Ethanol (absolut) -> 1500 µl • 1h bei –20°C DNA fällen • 30 min. bei 15000 rpm abzentrifugieren • mit 70% EtOH waschen (~7000 rpm, 5 min.) • EtOH abnehmen und DNA-Pellet trocknen lassen • Pellet in 40 µl Aqua dest. aufnehmen

Restriktionsverdau: Plastiden-DNA mit HindIII verdauen Phagen-DNA (λ) mit HindIII und EcoRI verdauen Ansatz Plastiden-DNA: Ansätze λ-DNA: 25,5 µl DNA µl Aqua dest. 3 µl 10x Puffer R+ 6 µl DNA 1,5 µl HindIII 3 µl Puffer R+/Puffer für EcoRI ∑ 30 µl 1,5 µl HindIII / EcoRI Σ 30 µl Bei 37°C, 20-30 min. verdauen. Agarose-Gel: Wir arbeiten mit einem 0,8%igen Agarose-Gel (trennt DNA-Fragmente in einem Bereich von 1-15 kbp auf). Als Gel- und Laufpuffer verwenden wir TBE-Puffer (Tris-Borat-EDTA). 10x TBE: 1 g NaOH (MG=40) 108 g Tris (Base) (MG=121,1) 55 g Borsäure (MG=61,38) 7,4 g EDTA, Dinatriumsalz (MG=372,24) Gel- und Laufpuffer werden als 1x Puffer verwendet!

5

Berechnet die Menge an Agarose, die ihr für ein 0,8%iges Agarose-Gel (in 40 ml 1x TBE-Puffer) abwiegen müsst.

• Agarose abwiegen und in Erlenmeyer-Kolben geben • + 40 ml 1x TBE (mit Deckelchen lose verschließen!!!) • Agarose in Mikrowelle lösen, dazu kurz aufkochen lassen !!!Vorsicht, Heiß!!! • Agarose-Lösung auf Magnetrührer auf ca. 55°C abkühlen lassen (~20 min.) • Gelträger abkleben • Wenn Agarose abgekühlt, Gel gießen (mit Kamm) • Nach dem Erstarren (~30 min.) Klebestreifen entfernen, Kamm ziehen, Gel in

Gelkammer legen und mit 1x TBE-Puffer überschichten

Zu allen Verdau-Ansätzen (30 µl) µl 10x Probenpuffer geben (Berechnen wie viel!). Phagen-DNA (unverdaut) 5 µl + 5 µl Aqua dest. + µl Probenpuffer. Plastiden-DNA (unverdaut) 10 µl + µl Probenpuffer.

• Gel laden und bei 100V 1h laufen lassen • Färben des Gels mit Ethidiumbromid (~ 20 min.) !!!Durch den Betreuer!!! • ~ 10 min. entfärben • Gel entwickeln

Probenpuffer: in 100 ml sind 0,25 g Bromphenol-Blau, 0,25 g Xylen-Cyanol, 50 g Saccharose, 1 ml 1M Tris pH 8. 3.2 Demonstration von Membraneigenschaften Nur durch die Abgrenzung (Kompartimentierung) nach innen und außen ist Leben überhaupt möglich. Während Prokaryoten eine ziemlich simple Kompartimentierung aufzeigen, ist es ein Merkmal von Eukaryoten (also auch von Pflanzen), dass dort viele Kompartimente vorhanden sind. So würden wertvolle Stoffe (Ionen, Aminosäuren, usw.) ohne Membranen so schnell ins Außenmedium diffundieren, dass die Zelle diese Verluste nicht kompensieren könnte. Verschiedene gegenläufige Stoffwechselvorgänge können durch Membranen in verschiedenen Organellen gehalten werden. Außerdem sind Prozesse wie Photosynthese oder Atmung unbedingt an das Vorhandensein von Membranen gebunden. In diesem Versuch wollen wir demonstrieren, dass ab einer bestimmten Temperatur die Membranen zerstört werden, d.h. die selektive Permeabilität verloren geht. Wo liegt diese Temperatur? Informiert euch über die Bausteine verschiedener Membranen. Pflanzliche Zellmembranen, z.B. Tonoplast und Plasmalemmma sind aus Lipiden und Proteinen aufgebaute Elementarmembranen. Eingelagerte Transportproteine sorgen für einen kontrollierten Stoffaustausch vieler verschiedener Stoffe. Die Aufnahme in die Vakuole ist bei einigen Stoffen jedoch irreversibel. Der Tonoplast fungiert dabei als Permeabilitätsschranke für gelöste Vakuoleninhaltsstoffe (z.B. Anthocyane, Betalaine). Durch physikalisch-chemische Zerstörung der Membranstruktur können Vakuoleninhaltsstoffe nach außen treten. Untersuchungsmaterial:

6

Mitzubringen ist am zweiten Versuchstag: eine frische Knolle der Roten Rübe (Beta vulgaris, ssp. rapacea, var. conditiva) Geräte: Messer, Korkbohrer, Bechergläser, Mikrowellengerät, 9 Reagenzgläser, Lineal, Photometer, Thermometer Durchführung:

• Es werden 9 Reagenzgläser mit 10 ml destilliertem Wasser gefüllt.

• Aus einer Roten Rübe werden 9 gleich große, zylinderförmige Stücke (Länge: 20mm) ausgestanzt und mehrmals mit frischem Leitungswasser gespült, bis kein Farbstoff mehr austritt.

• Für die Temperaturbehandlung wird Leitungswasser in einem Becherglas auf eine

Temperatur von 100°C erhitzt (Mikrowelle). Dann wird eine Rübenstück genau 1 min. lang in das Becherglas gegeben und dort bei 100°C inkubiert.

• Danach wird das Rübenstück in ein mit destilliertem Wasser gefülltes Reagenzglas

gegeben und nach 15 min. aus der nun gefärbten Lösung genommen.

• Mit einem Thermometer wird das Abkühlen des Wassers verfolgt.

• Die nächsten Rübenstücke gibt man für genau 1 min. in das Becherglas, wenn die folgenden Temperaturen erreicht sind:

75°C, 70°C, 65°C, 60°C, 55°C, 50°C, 45°C.

• Das neunte Rübenstück dient als Kontrolle und wird bei Zimmertemperatur ebenso behandelt, wie die acht vorhergehenden Stücke.

• Von den gefärbten Lösungen werden anschließend die Extinktionen im

Absorptionsmaximum des roten Farbstoffs bei 538 nm bestimmt. Auswertung: Die gemessene Extinktion wird in einem Diagramm gegen die Temperatur aufgetragen. Wo liegt der Temperaturbereich, bei dem der Tonoplast und das Plasmalemma zerstört werden?

4 NATURSTOFFE UND PHYTOHORMONE

4.1 NATURSTOFFE

4.1.1 VERSUCH 1: BESTIMMUNG DES GESAMTFLAVONOLGEHALTES VON LAUBBLÄTTERN

Flavonole gehören zur Naturstoffgruppe der Flavonoide. Sie kommen in Laub- und Blütenblättern vor und sind dort in den Vakuolen der Epidermiszellen lokalisiert. Durch ihr Absorptionsmaximum im UV-Bereich zusammen mit ihrer oberflächennahen Lokalisation, wirken Flavonole als wichtige Schirmpigmente, die Pflanzen vor zu hoher UV-Strahlung schützen. An verschiedenen Standorten von Pflanzen, wie z.B. Wiesen, Wald, Alleen oder Hochgebirge sind die Pflanzen unterschiedlichster UV-Einstrahlung ausgesetzt; in diesem Experiment soll festgestellt werden, ob sich die UV-Exposition am natürlichen Standort einer Pflanze an deren Flavonol-Gehalt bemerkbar macht. Die photometrische Bestimmung der Flavonole erfolgt nicht in ihrem Absorptionsmaximum bei ca. 350 nm, da in diesem Bereich auch anwesende Zimtsäuren absorbieren. Stattdessen wird durch Zugabe von AlCl3 eine Verschiebung des Absorptionsmaximums der Flavonole zu 405 nm erreicht (bathochromer Shift).

Material

Laubblätter von Ficus und Rhododendron (im botanischen Garten erhältlich) 0,25 mM Rutin-Lösung (Rutin: M = 665 g mol-1) 5%ige ethanolische AlCl3-Lösung (AlCl3 unter dem Abzug langsam in eisgekühltes Ethanol einrühren) Ethanol p.A.

Bitte mitbringen: 10 Laubblätter von Ficus und 5 von Rhododendron aus dem botanischen Garten

Durchführung

A. Flavonole aus Laubblättern extrahieren:

1. Mit einem Korkbohrer (Durchmesser 1 cm) Stanzstücke aus Blättern von Rhododendron und Ficus ausstechen:

15 Stück von Rhododendron und 30 Stück von Ficus 2. Die Stanzstücke werden jeweils auf drei Bechergläser aufgeteilt und zu jedem

Becherglas 15 ml H2O demin. gegeben 3. Die Bechergläser in einem Sandbad auf der Heizplatte zum Kochen bringen 4. 15 min kochen lassen (Flavonole gehen in Lösung) 5. Stanzstücke mit einer Pinzette und möglichst ohne Flavonolverlust entfernen 6. Extrakte auf ca. 1 ml einengen (nicht eintrocknen lassen!) 7. 8 ml Ethanol zugeben 8. Lösung in 10 ml-Messkölbchen filtrieren

cE

=ε

9. Jeweils 3 Tropfen 5% AlCl3-Lösung zugeben (Pasteurpipette), mischen und 10 min stehen lassen

10. Mit einer Pasteurpipette Ethanol bis zur 10-ml-Marke auffüllen 11. Die Extinktion bei 405 nm messen

B. Rutin-Eichkurve:

Meßkölbchen 1 2 3 4 5 Leerwert

ml 0,25 mM Rutin 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 0,0

AlCl3 3 Tropfen 3 Tropfen 3 Tropfen 3Tropfen 3 Tropfen 3 Tropfen

1. In 5 ml-Messkölbchen ca. 1 ml Ethanol vorlegen 2. Die oben angegebene Menge Rutin-Lösung dazugeben 3. Mit einer Pasteurpipette jeweils 3 Tropfen 5% AlCl3-Lösung zugeben und 10 min bei

Raumtemperatur stehen lassen 4. Mit Ethanol auf 5 ml auffüllen 5. Extinktion bei 405 nm messen

Auswertung

1. Erstellen einer Rutin-Eichgerade: a. Entweder auf Millimeterpapier; lineare Regression berechnen b. oder am Computer (Achtung: lineare Regression berechnen; keine Trendlinie

einzeichnen) 2. Berechnung des Flavonolgehaltes in µg/cm2 3. Diskussion der unterschiedlichen Ergebnisse für Ficus und Rhododendron. Gesetzmäßigkeiten von Lambert-Beer:

ε = molarer Extinktionskoeffizient (abhängig von der zu untersuchenden Substanz, der Wellenlänge und dem

Lösungsmittel) c = Konzentration der Lösung d = Dicke der Küvette, normalerweise 1 cm

durch Umformen erhält man:

und da d = 1 cm und

dcIIE ••== ε0log

dcE•

=εεEc =

Becherglas pro eStanzstück der Anzahl••= 2rA π

Vnc = VcMm ••=

Weitere nützliche Gesetzmäßigkeiten:

2rA •= π

Fläche der Stanzstücke:

; und zum Umrechnen von mol/l in µg: 4.1.2 VERSUCH 2: UMFÄRBUNG EINES ANTHOCYAN-EXTRAKTES

Wie die Flavonole gehören Anthocyane zur Gruppe der Flavonoide, die eine große und vielfältige Familie innerhalb der Naturstoffe darstellen. Sie kommen in vielen Blüten und Früchten vor und geben ihnen eine rote, violette, blaue oder blauschwarze Färbung. Anthocyane absorbieren Licht im Wellenbereich zwischen 270 und 290 nm und zwischen 465 und 560 nm. Ihre natürliche Färbung wird durch Seitengruppen, dem pH-Wert und der Komplexierung von Metallionen beeinflusst. Durch die Abhängigkeit des Farbtons vom pH-Wert können Anthocyane als Indikatoren für Säuren und Basen wirken. Zwar finden in Pflanzen keine Farbumschläge statt, da sie einen relativ konstanten pH-Wert haben, bei isolierte Anthocyan-Extrakte kann jedoch durch Zugabe von Säure bzw. Base eine deutlich Farbänderung hervorgerufen werden. In diesem Experiment soll die pH-Wert-Abhängigkeit der Anthocyan-Farbe am Beispiel eines Rotkohl-Extraktes demonstriert werden.

Untersuchungsmaterial

Rotkohl (anthocyanhaltig) KOH 5%ige ethanolische AICI3-Lösung (AICI3 unter dem Abzug langsam in eisgekühltes Ethanol einrühren)

Durchführung

- Rotkohl mit etwas Wasser zermörsern - abfiltrieren und mit dem pH-Meter den pH-Wert bestimmen - Farbe des Extraktes notieren - einige Milliliter AlCl3-Lösung zugeben - Farbe notieren - tropfenweise KOH zugeben und bei Farbänderungen den pH-Wert bestimmen

Auswertung

Geben Sie die Farbe des Extraktes beim jeweiligen pH-Wert an. Diskutieren Sie die Farbumschläge.

Mais Weizen/Gerste

4.2 Phytohormone

4.2.1 VERSUCH 3: ARTÜBERGREIFENDE WIRKUNG VON PHYTOHORMONEN

Haben Hormone aus verschiedenen Pflanzenarten untereinander eine ähnliche Wirkung oder wirken die Substanzen artspezifisch? Diese Frage lässt sich beantworten, indem man die Koleoptilspitzen verschiedener Poaceen-Arten wechselseitig vertauscht und einige Tage später das Wuchsverhalten der einzelnen Kombinationen beobachtet.

Material

Mais-, Reis- und Gersten-/ Weizenkeimlinge, Rasierklingen, 1% Agar, Spatel

Bitte mitbringen: Rasierklingen

Durchführung

1. An jeweils 4 Keimlingen von Mais, Gerste und Weizen mit einer Rasierklinge die Koleoptilspitzen 1 cm breit abschneiden (die Keimlinge sollen etwa 3 cm groß sein)

2. Die Koleoptilspitzen mit 1% Agar wieder ankleben: eine Spitze wird wieder auf den Keimling der gleichen Art geklebt, und zwei Spitzen werden auf die beiden anderen Arten verteilt eine Spitze kann verworfen werden, die Schnittfläche am Keimling jedoch ebenfalls mit 1% Agar bestreichen ein Keimling bleibt unversehrt

3. Die Keimlinge 1 Woche in feuchtwarmem Klima im Dunkeln weiterkultivieren 4. Auf diese Weise von jeder Art zwei Ansätze herstellen

Auswertung

Beschreiben Sie das Wachstumsverhalten der verschiedenen Ansätze und diskutieren Sie die Ergebnisse ausführlich.

Reis

4.2.2 VERSUCH 4: KEIMUNGSHEMMUNG VON APFELKERNEN DURCH ABSCISINSÄURE

Sicherlich hat der ein oder andere schon einmal versucht, Apfelkerne auskeimen zu lassen, in dem er sie auf feuchter Watte ausgelegt hat. Das kleine Apfelbäumchen lässt jedoch sehr lange auf sich warten, denn frische Apfelkerne keimen auf diese Weise praktisch nicht. Schuld daran sind keimungshemmende Stoffe, die sich in bestimmten Teilen des Apfelkerns befinden. Als Hemmstoffe sind neben der Abscisinsäure auch Sekundärmetabolite beteiligt, wie z.B. das blausäurehaltige Glycosid Amygdalin. Es gilt nun herauszufinden welcher Teil oder welche Teile des Apfelkerns für die Keimungshemmung verantwortlich sind.

Material frische Apfelkerne aus reifen Früchten, Petrischalen mit MS-Agar, Petrischalen mit MS-Agar + 10-4 M Abscisinsäure

Bitte mitbringen: 2 reife Äpfel, spitze Pinzetten und Skalpell

Durchführung Bei fünf Apfelkernen wird die braune Samenschale entfernt, dabei darf das dünne hellbraune Endospermhäutchen nicht mit abgezogen werden. Bei 10 Kernen wird die Samenschale und das Endospermhäutchen mit einer Pinzette entfernt. Fünf Apfelkerne bleiben in natürlichem Zustand. Die Apfelkerne werden in Petrischalen auf MS -Agarplatten ausgelegt. Pro Platte:

a) 5 Kerne in natürlichem Zustand auf MS-Agar b) 5 Kerne nach Entfernung der Samenschale auf MS-Agar c) 5 Kerne nach Abpräparation von Samenschale und Endospermhäutchen auf

MS-Agar d) wie c) jedoch auf MS-Agar mit 10-4 M ABA

Auswertung Beschreiben Sie den Entwicklungszustande der unterschiedlichen Ansätze nach einer Woche und diskutieren Sie die Ergebnisse. 4.2.3 VERSUCH 5: WIRKUNG VON GIBBERELLIN A3 AUF DIE SPROSSACHSENSTRECKUNG BEI

DER ERBSENSORTE „KLEINE RHEINLÄNDERIN“

Bei der Erbsensorte „Kleine Rheinländerin“ handelt es sich um eine Zwergmutante, die aufgrund einer Ein-Gen-Mutation innerhalb des Gibberellin-Synthesewegs in ihrem Längenwachstum blockiert wird. Durch diese Mutation wird der Syntheseschritt von Geranylgeranyl-pyrophosphat zu Kauren, ein wichtiges Intermediat in der Gibberellin-Synthese, verhindert. Durch exogen applizierte Gibberellinsäure soll der Gibberellinmangel ausgeglichen und dadurch eine Zunahme des Längenwachstums gefördert werden.

Außerdem soll festgestellt werden, ob das Längenwachstum von der GA3-Konzentration abhängig ist.

Material Keimlinge der Erbsensorte „Kleine Rheinländerin“; GA3-Stocklösung 2 µg/µl, Markierungsstäbchen, Pasteurpipetten GA3: 2*10-3µg/µl 0,02 µg/µl 0,2 µg/µl

Durchführung 1. Bei 14 Tage alten Jungpflanzen wird die Länge des Sprosses vom 2. Knoten bis zur

Endknospe gemessen (Achtung: Fiederblättchen und deren Ranken können die Endknospe überragen; nicht mit der Endknospe verwechseln)

2. In die Achsel des ersten Laubblattes (3.Knoten) und zwischen die Blätter der Endknospe werden jeweils einige Wattefasern gezogen (vorsichtig; das Gewebe nicht verletzen)

3. Mit einer Pipette in die Blattachseln und zwischen die Blätter der Endknospe jeweils ein Tropfen Gibberellin-Lösung pipettieren

4. Es werden für jede Gibberellin-Konzentration fünf Pflanzen verwendet. 5. Nach 24 h erfolgt eine neue Gabe der Gibberellin-Lösung 6. Die Pflanzen werden bis zum nächsten Praktikumstag weiter kultiviert. Auswertung Bei allen vier Ansätzen wird die Länge des Sprosses vom 2. Knoten bis zur Endknospe vor und nach der Behandlung mit Gibberellinsäure gemessen. Berechnen Sie die prozentuale Zunahme des Längenwachstums nach einer Woche Wichtig: Alle unter „Bitte mitbringen“ aufgeführten Materialien werden am ersten Praktikumstag benötigt. Alle mitzubringenden Materialien sind als Ergänzung zur allgemeinen Laborausstattung zu verstehen. Das Vorhandensein der Grundausstattung (Labormantel,

Schutzbrille, Spatel, Schreibzeug, Taschenrechner....) ist Vorraussetzung zur Teilnahme am Praktikum.

5 Transformation 5.1 Theorie Agrobacterium tumefaciens (Familie Rhizobiaceae)

ist ein phytopathogenes Bodenbakterium. Es ist in

der Lage, bei verletzten dikotylen und einigen

monokotylen Pflanzen Tumoren zu induzieren (daher

der Name: griech. agrós: der Boden und lat.

tumefácere: schwellen machen, Abb. 1). Dieses

unkontrollierte Wachstum des Pflanzen-Gewebes

wird durch die Expression von Onkogenen

hervorgerufen, welche vom Bakterium auf einem

kurzen DNA-Stück in die Wirtspflanze transferiert

werden. Dieses transferierte DNA-Molekül wird T-

DNA (T für „Transfer“) genannt und ist Bestandteil

des so genannten Ti-Plasmids (Ti für „Tumor

induzierend“) von Agrobacterium (Abb. 2). Die T-DNA-Sequenz wird durch 25

Basenpaare (bp) lange Nucleotid-Sequenzen flankiert: sie stellen die linke und die

rechte Grenze (LB und RB engl.: Left Border, Right Border) dar. Das Ti-Plasmid

enthält neben der T-DNA eine Virulenz-Region. Diese enthält mehrere vir-Operons,

welche die entsprechenden Vir-Proteine codieren. Viele dieser Proteine sind an dem

Vorgang des T-DNA-Transfers vom Bakterium in die Pflanze beteiligt.

Warum induziert Agrobacterium Tumoren? Die T-DNA enthält neben den für die

Tumorbildung erforderlichen Genen weitere Gene, deren Produkte in Pflanzenzellen

aus Komponenten des Primärstoffwechsels (α-Ketosäuren und Aminosäuren) so

genannte Opine zu bilden vermögen (Abb. 2). Während diese Verbindungen von

Pflanzen nicht verwertet werden können, besitzt Agrobacterium auf dem Ti-Plasmid

Gene, welche für den Opin-Katabolismus essentielle Enzyme codieren. Durch den

Transfer der T-DNA in Pflanzenzellen werden diese also zu unkontrolliertem

Wachstum angeregt und bilden aus pflanzlichen Stoffwechsel-Produkten die

Nährstoffe für die Agrobakterien.

Wie lässt sich Agrobacterium für die Transformation von Pflanzen verwenden?

Agrobacterium tut nichts anderes als Pflanzen mit den von der T-DNA codierten

Genen zu transformieren. Diese gut funktionierende Interaktion zwischen Bakterien

Abb. 1: Zuckerrübe mit Tumor.

Abb. 2: Ti-Plasmid vom Nopalin-Typ aus Agrobakterien. T-DNA: Transfer-DNA; LB: „Left Border“, linke Grenze; RB: „Right Border“, rechte Grenze; ori: Replikations-Startpunkt für Agrobacterium; noc: Nopalin-abbauende Gene; nos: Nopalinsynthese; tmr: Cytokinin-Synthese; tms: Auxin-Synthese; tra: konjugativer Transfer; vir: Virulenz-Region. (Aus Kempken & Kempken, 2000).

LB

und Pflanze kann man sich zu Nutze

machen: die zwischen den Border-

Sequenzen liegenden Gene sind nicht

essentiell – sie können durch andere Gene

und z.B. Selektionsmarker-Gene ersetzt

werden. Letztere verleihen eine Resistenz

gegen bestimmte Antibiotika oder

Herbizide. Man kann also durch

molekulargenetische Techniken Gene

zwischen den Border-Sequenzen

platzieren. Gelangt diese veränderte T-

DNA in Pflanzenzellen, kommt es zur

Expression des eingebrachten Fremd-

Gens. Dies soll im Praktikum untersucht

werden. Zu diesem Zweck wird ein

Agrobakterien-Stamm verwendet, welcher

das Plasmid pCG A5 enthält. Zwischen LB

und RB befindet sich eine Sequenz, welche

einen sehr starken Promotor (35S-Promotor aus dem Blumenkohl-Mosaikvirus, engl.:

Cauliflower Mosaic Virus [CaMV]) vor dem β-Glucuronidase-Gen enthält. Hinter

diesem Gen befindet sich eine Terminator-Sequenz. Gelangt diese modifizierte T-

DNA in die Pflanze, wird das Enzym β-Glucuronidase gebildet, welches

normalerweise in Pflanzen nicht vorkommt. Die Präsenz dieses Enzyms zeigt die

erfolgreiche Transformation an. Seine Aktivität kann durch eine Farb-Reaktion mit 5-

Brom-4-Chlor-3-indolyl-β-D-Glucuronid nachgewiesen werden (Abb. 3).

Abb. 3: Nachweis der β-D-Glucuronidase-Aktivität. Das künstliche Substrat 5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-β-D-Glucuronid (X-GlcA) wird durch das Enzym Glucuroni-dase hydrolysiert. Durch Oxidation (Luftsauerstoff) entsteht ein blauer Indigo-farbstoff. (Aus Kempken & Kempken, 2000). Zellen, in denen das Enzym nach der Transformation exprimiert wurde, werden durch die Färbung blau.

5.2 Durchführung

Überblick

1. Versuchstag: - Inokulation mit Agrobacterium-Stamm mit pCG 5A-Plasmid - Ausbringen der transformierten Pflanzen auf MSH-Platten

2. Versuchstag: - Umsetzen der Pflanzen auf Selektions-Medium

- Ansetzen der X-Gluc-Färbung

3. Versuchstag: - Fortführung der X-Gluc-Färbung & Auswertung

- Sterilisation & Aussaat von Tabak-Samen

Versuchsbedingt sind drei Tage zur Durchführung erforderlich. Der 1. und 3.

Versuchstag ist jeweils – wenn nicht ausdrücklich anders vereinbart – Dienstag

Nachmittag innerhalb der regulären Praktikumszeit. Der 2. Versuchstag ist der

Freitag dazwischen; die Uhrzeit wird am ersten Versuchstag mit dem Betreuer

abgesprochen.

Versuchsziel Tabak-Keimlinge sollen mit Agrobacterium transformiert werden. Anschließend soll

die Anzahl der Transformationsereignisse pro Pflanze bestimmt werden.

Medien

• 6% ige Na-Hypochlorit-Lösung: 1 Volumenanteil 12%ige Stammlösung 1 Volumenanteil ddH2O

• MSH-Platten: 30 g/L Saccharose 4,43 g/L Murashige & Skoog minimales organisches Pulvermedium

► pH 5,8 mit KOH einstellen, mit ddH2O auf 994,5mL auffüllen

8 g/L Plant Agar zugeben, rühren ► autoklavieren 5 mL 6-Benzyladenin-Stammlösung* 0,5 mL 1-Naphtylessigsäure-Stammlösung*

• 6-Benzyladenin-Lösung: 100 mg Benzyladenin 2 mL 0,5 N HCl ► mit ddH2O auf 100 mL auffüllen

(→ Endkonzentration: 100mg/100mL) * sterilfiltrieren, aliquotieren & bei -20°C lagern

• 1-Naphtylessigsäure: 100 mg Naphtylessigsäure 5 mL 10 N KOH ► mit ddH2O auf 100 mL auffüllen

(→ Endkonzentration: 100mg/100mL) * sterilfiltrieren, aliquotieren & bei -20°C lagern

• YEB-Medium: 5 g/L Beef-Extrakt 1 g/L Hefe-Extrakt 5 g/L Pepton 5 g/L Saccharose 493 mg/L MgSO4 autoklavieren, 5 mg/L Rifampicin (Stammlösung: 100mg/mL) 100 mg/L Gentamycin (Stammlös.: 500mg/mL) • 10mM MgSO4-Lösung: 250 µl Stammlösung (2M) pro 50mL ddH2O • Acetosyringon-Lösung: 1 g in 10mL DMSO lösen, sterilfiltrieren • 100mM Na2HPO4: 17,8 g/L Na2HPO4 pH mit H3PO4 auf 7,0 einstellen • 1% X-GlcA: 100mg X-GlcA in 10mL DMF lösen • 5% Natriumazid: 500mg Natriumazid in 10mL ddH2O lösen • X-GlcA-Färbelösung: 46,5 mL 100mM Na2HPO4 (Endkonz.: 93mM) 2,5 mL 1% X-GlcA (Endkonz.: 0,05%) 1 mL 5% Natriumazid (Endkonz.: 0,01%) • Tween 20

Material • Petrischalen • Eppendorf-Gefäße (1,5mL und 2mL) • Zentrifugenröhrchen (Falcons: 15mL und 50mL) • Tabak: Nictotiana tabaccum CV Petite Havanna SR31 • Agrobakterien-Stamm GV3101 mit Plasmid pCG 5A Geräte • Autoklav 5075 ELV (SYSTEC - LAB GmbH, Wettenberg) • Pipetten EPPENDORF Research (variabel) • SimplicityTM Wasseraufbereitungssystem • Reagenzglasmixer Vortex • Reinraumbank Typ HF • Reinraumbank Typ KVF • Zentrifuge HERMLE Z233MK-2, 24x 1,5/2,0-Rotor: 220.87 V05/6 • Zentrifuge HERMLE Z383K, Rotor: 221.08 V01

5.2.1 Sterilisation & Aussaat von Tabak-Samen (3. Versuchstag) • Tabak-Samen mit 1mL 6%iger Natriumhypochlorit-Lösung und einem Tropfen

Tween versetzen

• 20 Minuten bei Raumtemperatur schütteln

• Hypochlorit-Gemisch abpipettieren

• 6x mit 1mL sterilem Wasser waschen

• Samen in Petrischalen mit MS-Medium ausbringen

5.2.2 Tabak-Inokulation mit Agrobacterium tumefaciens (1. Versuchstag) • verwendeter Agrobakterien-Stamm: GV3101 mit Plasmid pCG 5A

• verwendetes Pflanzenmaterial: Nictotiana tabaccum CV Petite Havanna SR31

• 30mL einer Agrobacterium-Übernachtkultur vom YEB-Medium abzentrifugie-

ren (8 Minuten, 4500 Upm, Raumtemperatur)

• Pellet in 25mL 10mM MgSO4 resuspendieren, Zellen erneut abzentrifugieren:

diesen Vorgang nennt man „Waschen der Zellen“ (8 Minuten, 4500 Upm, 4°C)

• Zellen 2 x mit 25mL 10mM MgSO4 waschen

• Zell-Pellet in 10mL MgSO4 resuspendieren

• OD560 messen – mit 10mM MgSO4 auf OD560 = 1 einstellen

• 1/1000 Volumenanteil Acetosyringon (Konzentration: 0,1g/mL) zugeben

• etwa 14 Tage alte Tabak-Keimlinge zugeben und 10 Minuten im Exsikkator mit

Wasserstrahlpumpen-Vakuum inkubieren

• Keimlinge auf sterilem Filterpapier kurz abtrocknen

• Keimlinge einzeln mit sterilen Pinzetten auf MSH-Platten ausbringen

• 3 Tage im Anzuchtsraum inkubieren (16 Stunden Lichtperiode:

Quantenflussdichte 100-120µE·m-2s-1, 22ºC / 8 Stunden Dunkelperiode, 20ºC)

5.2.3 Histochemischer Nachweis der Transformation: X-Gluc-Färbung (2. Versuchstag; i.d.R. Freitag morgens – ca. 25 Minuten, 2 Personen) • Pflanzen aus dem Anzuchtsraum nehmen und mit X-GlcA-Färbelösung

inkubieren:

→ Färbelösung aus Einzelkomponenten herstellen (siehe Medien)

• Pflanzen in ein 50mL Zentrifugengefäß überführen

• Färbelösung zu den transformierten und den nicht-transformierten Pflanzen

(letztere dienen als Kontrolle) geben und bei nur leicht aufgesetztem Deckel

(Farbreaktion erfordert Sauerstoff, s. Abb. 3) 3 Tage bei 37°C inkubieren

• Pflanzen mit 70%igem vergällten Ethanol bei 65°C 2 Stunden behandeln

(dadurch werden die Blattpigmente herausgelöst): Ethanol zwischendurch 1x

wechseln & Gefäße schütteln

• Pflanzen unter dem Binokular betrachten und blaue Punkte/Sektoren zählen

5.3 Auswertung und Protokoll • Betrachtung der mit X-GlucA-Lösung behandelten transformierten und nicht-

transformierten Pflanzen: bei jeweils 30 Pflanzen sollen die blauen

Farbsektoren pro Pflanze ausgezählt werden

• Protokoll: für jeden Ansatz (transfomiert bzw. nicht-transformiert) werden dann

die Summe aller blauen Areale pro Pflanze einander gegenüber gestellt

5.4 Literatur • Gelvin SB. (2003). Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology

behind the “gene-jockeying” tool. Microbiology and Molecular Biology Reviews 67: 16-37

• Heldt HW. Pflanzenbiochemie. (3. Aufl.). Spektrum, Heidelberg 2003 • Kempken F, Kempken R. Gentechnik bei Pflanzen. Chancen und Risiken. (2.

Aufl.) Springer, Berlin 2004 • Sitte P, Weiler EW, Kadereit JW, Bresinsky A, Körner C. Strasburger

Lehrbuch der Botanik (35. Aufl.). Spektrum, Heidelberg 2002 • Zupan J, Muth TR, Draper O, Zambryski PC. (2000). The transfer of DNA

from Agrobacterium tumefaciens into plants: a feast of fundamental insights. Plant Journal 23: 11-28

Documents

Anleitung zum Pflanzenphysiologisches Praktikum für Anfänger