Arbeitsanweisungen zur Durchführungdes DNA-Fingerprinting-Experiments

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1. Ansetzen der Restriktion

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Tubes enthalten bereits 10 µl der jeweiligen DNA von: grün (Tatort: TO), blau, orange, violett, rot und gelb (Verdächtige: V1 - V5)

1.1 Beschriften der Tubes

DNA [µl] 10 10 10 10 10

TO V 1 V 2 V 3 V 4 V5

10

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Beschriftung

Tubes enthalten bereits 10 µl der jeweiligen DNA von: grün (Tatort: TO), blau, orange, violett, rot und gelb (Verdächtige: V1 – V5)

1.2 Zugabe von 10 µl Enzymmix

Enzymmix (E)

[µl]

10 10 10 10 10 10

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TO V 1 V 2 V 3 V 4 V5

2. Restriktionsverdau

Modell:

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20 Minuten bei 37 oC im Thermoblock

3. Während des Restriktionsverdaus Elektrophorese vorbereiten

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3.1 Vorbereiten der Kammer

Einsetzen des Schlittens, der Metallkeile und des Kamms in die

Elektrophoresekammer7

3.2 Herstellen des Agarosegels (0,8%)

• 0,24 g Agarose (AG) + 30 ml TAE-Puffer (1x)

• Gemisch in der Mikrowelle kurz aufkochen, umschwenken und erneut kurz zum Kochen bringen

Gel muss schlierenfrei sein!

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3.3 Befüllen der Gelkammer

• Gel auf ca. 55 oC abkühlen lassen (Handrückentest) und gießen

Achtung:

Kammer bis zum Erstarren des Gels nicht mehr bewegen

Abb.: Gießen des Agarose- gels in die Kammer

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• Nach Erstarren des Gels,Metallkeile entfernen

• Gel mit ca. 270 ml TAE-Puffer (1x) überschichten

• Kamm ziehen

Achtung: die Taschen müssen frei von Luftblasen sein 10

3.3 Befüllen der Gelkammer

4. Vorbereiten des Längenstandards

• Zu 10 µl Längen-standard (M) werden 10 µl Ladepuffer (LP) pipettiert

Inhalt (20 µl) gut ver-mischen

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M

5. Zugabe des Ladepuffers

• In die Tubes TO und V1 – V5 werden jeweils 10 µl Ladepuffer (LP) pipettiert

• Inhalt (30 µl) gut ver-mischen

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10 µl10 µl10 µl

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6. Füllen der Geltaschen

Spuren: von links nach rechts

Linke Randspur bleibt frei

Reihenfolge beachten!!!

Je 20 µl der Proben TO und V1 – V5bzw. 20 µl Längen-standard (M) in jeweils eine Geltasche pipettieren

6. Füllen der Geltaschen

Achtung:Geltasche darf dabei nicht durchstoßen werden

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7. Gelelektrophorese

Verschließen der Elektrophorese-kammer:

Kathode (-) naheden Geltaschen

Anode (+) gegenüber

Spannung: 180 V

Modell:

8. Färben der DNA

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• Entnahme des Gelschlittens aus der Elektrophoresekammer

• Gel in Färbeschale überführen und mit 100 ml Färbelösung (50x) für 2 Minuten färben

• Färbelösung abgießen(kann wieder verwendet werden)

• Entfärben des Gels durch zweimaliges Wässern in 45 oC warmen Wasser

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TO V1 V2 V3 V4 V5 M

9. Ergebnis der Gelelektrophorese

Wer ist der Täter ?