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ARBEITSTECHNIKEN IN DER PROTEINCHEMIE
Immunologie
Wichtige Grundbegriffe der Immunologie:
• Antigen: Körperfremdes Agens, welches beim Eindringen in den Organismus eine Immunantwort hervorruft (z.B. Fremdproteine, Bakterien, Viren, div. Makromoleküle)
• Epitop: Jener Molekülteil des Antigens, welcher von einem spezifischen Antikörper erkannt werden kann.
• Hapten: Niedermolekularer Stoff, der erst durch Bindung an ein Makromolekül (z.B. Protein) immunogen wirkt.
• Antikörper: Zusammengesetztes Protein höherer Organismen, das ein bestimmtes Epitop eines Antigens biorecognitiv binden kann und dadurch das Unschädlichmachen des Antigens einleitet (monoklonal, polyklonal: monospezifisch bzw. unspezifisch)
• Avidität eines Antikörpers: Bindungsstärke an das Antigen• Kreuzreaktionen: Unterschiedliche Antigene können ein oder
mehrere gemeinsame Epitope besitzen ® darauf gerichteteAntikörper können mit beiden Antigenen reagieren ® für den Analytiker unerwünscht!!
Immunodiffusion 1
Immunodiffusion 2Ouchterloni Test (zweidimensionale Doppeldiffusion)
A,B,C,D: Antigen Determinanten, Anti AB Serum
Identische Determinanten –verschmolzene Präzipitations-muster
Nichtidentische Determinanten –überkreuzte Zonen
Teilweise identische Determianten –Sporenbildung der Präzipitationszonen
Immunodiffusion 3
Ouchterloni TestEinfluss der relativen Molekülmasse des Antigens auf die Form der
Präzipitationszonen
Masse Antigen A << Masse eines IgG (zB. Humanserum-albumin68 000)
Masse Antigen B ~ Masse des IgG(zB. IgA)
Masse Antigen C >> Masse eines IgG (zB. Hämocyanin ca. 3.106)
Immunodiffusion 4
Radiale Immundiffusion:
Objektträger mit Agar + Antiumanserumalbumin(HSA), Tröge von 4 mm Øwurden mit gleichenMengen der Lösungen derunten angegebenen HSA Konzentrationen gefüllt, 4°C, über Nacht
Diffusionsweite: (hier Äquivalenzpunkt)
Eichkurve zur Bestimmung des Antigens
Immunodiffusion 5Zweidimensionale doppelte Immundiffusion
große Ausführung in Petrischalen:
Hier wird der Einfluss der Antigen-konzentrationen auf die Lage der Präzipitationszonenzwischen den Trögen gezeigt
Antiserum Verdünnungen des Antigens
Häufige Stanzmuster
Immunelektrophorese 1Elektrophorese von Serumproteinen
Blotten des Cellulose-acetatstrips nach dem Entfernen aus dem Einweichbad
Aufbringen der Serumprobenauf die an der „aligning base“ausgerichteten Platte
Laden der Kammer mit den Cellulose-acetatstreifen
Färben und Entfärben der Strips
Immunelektrophorese 2
Diffusion und Präzipitation: 16 – 24 h
Elektrophorese 90 min, 10 V/cm (Trennung der Proteine)
Immunelektrophorese 3Mikroimmunelektrophorese:
a) Stanzmuster im Agar, in die leeren runden Tröge werden die Antigene HSA und HS eingefüllt
b) nach der Elektrophoresegetrennte, aber so nicht nachweisbare Proteine; Agarwird aus den länglichen Trögen entfernt
c) Zugabe der Antiseren in die Tröge, Beginn der Diffusion der Antigen- und Antikörpermoleküle
d) Erwartete Präzipitationszonen
Immunelektrophorese 4
„Raketenelektrophorese“ einer bekannten Verdünnungsreihe von menschlichem Serumalbumin (HSA) und zweier unbekannter Lösungen x und x/2
5 10 15 20 25 x x/2 µg HSA
Radioimmunassay (RIA)
-
NaCH3 SO2 N Cl +
Reaktionen während eines RIA. Der lösliche Antigen/Antikörperkomplex ist das Produkt des 1. Schrittes und Ausgangsprodukt für den 2. Schritt
Chloramin T
KI131
+ +
--
OH CHC
OO
NH2
H2OH2O2+ KOH + OH CH
COO
NH2
I131
Synthese von Iodtyrosin mit dem Lactoperoxidase-Oxidationssystem:
Enzymimmunoassay 1Prinzip des kompetitiven ELISA:
Spezifische Antikörper an Festphase adsorbiert
Zusatz von freiem Antigen und enzymgekuppeltem Antigen, Inkubation, waschen
Bindung des freien und des gekuppelten Antigens
Zusatz des Substrates, Inkubation
Messung der Enzymaktivität
Die unter Standardbedingungen gemessene Aktivität ist der Menge des enzym-gekuppelten Antigens proportional
Enzymimmunoassay 2Indirekter ELISA:
Messung der Enzymaktivität
Die unter Standardbedingungen gemessene Aktivität ist der Menge des spezifischen Antikörpers im Versuchsserum direkt proportional
Spezifisches Antigen an Festphase adsorbiert
Inkubation mit Versuchsserum, in dem man spezifische Antikörper vermutet, waschen
Anheftung spezifischer Antikörpermoleküle
Inkubation mit Anti-immunglobulinserum mit gekoppeltem Enzym, waschen
Bindung des enzymgekoppelten Anti-immunglobulin-Antikörpers
Zusatz des Enzymsubstrats, messen
Enzymimmunoassay 3Sandwich ELISA mit zwei Antikörpern:
Spezifische Antikörper an Festphase adsorbiert
Zusatz der Antigenlösung unbe-kannten Gehalts, Inkubation, waschen
Bindung des spezifischen Antigens
Zusatz des Kupplungsprodukts eines 2. spezifischen AK mit Enzym, Inkubation, waschen
Bindung des enzym-gekoppelten Antikörpers
Zusatz des Enzymsubstrats, messen
Messung der EnzymaktivitätDie unter Standardbedingungen gemessene Aktivität ist der Menge des spezifischen Antigens in der Lösung unbekannten Gehalts proportional
Enzymimmunoassay 4
Hapten-Inhibitionstest