ATR-FTIR-spektroskopische Untersuchungenvon ... · PDF fileATR-FTIR-spectroscopicanalysis ofmembrane-boundRas Dissertation toobtainthedegree DoctorofNaturalSciences attheFacultyofBiologyandBiotechnology

ATR-FTIR-spektroskopischeUntersuchungen von

membrangebundenem Ras

Dissertation zur Erlangung des Gradeseines Doktors der Naturwissenschaften

der Fakultät für Biologie und Biotechnologiean der Internationalen Graduiertenschule Biowissenschaften

der Ruhr-Universität Bochum

angefertigt amLehrstuhl für Biophysik

vorgelegt von

Jörn Güldenhauptaus Werne

BochumApril 2010

ATR-FTIR-spectroscopic analysisof membrane-bound Ras

Dissertationto obtain the degree

Doctor of Natural Sciencesat the Faculty of Biology and Biotechnology

Ruhr-University Bochum

Department of Biophysics

submitted by

Jörn Güldenhauptfrom Werne, Germany

BochumApril 2010

Erstgutachter: Prof. Dr. Klaus GerwertZweitgutachter: Prof. Dr. Matthias Rögner

Für Jutta

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ERNST JANDL

Dankeschön

Ich danke Herrn Professor Klaus Gerwert für die Vergabe dieses interessanten und her-ausfordernden Themas und für die Unterstützung und die großen Freiheiten bei derAusgestaltung der Arbeit.Herrn Prof. Dr. Matthias Rögner danke ich für die Übernahme des Koreferats.Bei Carsten Kötting bedanke ich mich für viele gute Diskussionen, hilfreiche Anregungenund praktische Tipps sowie für das Korrekturlesen dieser Arbeit.

Bei Herbert Waldmann, Jürgen Kuhlmann, Christine Nowak und besonders bei GemmaTriola bedanke ich mich für die Bereitstellung von lipidiertem Ras.Angela Kallenbach, Philipp Pinkerneil und Frederik Großerüschkamp danke ich für dieÜberlassung von einigen Aliquots Ras und Vergleichsspektren.Für einige interessante Gespräche, hilfreiche Tips und Überlassung von einigen ProbenNoreRBD bedanke ich mich bei Daniel Filchtinski.Ich danke Christoph Pinske für die stets engagierte und gute Zusammenarbeit bei fein-mechanischen Arbeiten und Harald Chorongiewski für die Unterstützung in Sachen Elek-tronik.Auch danke ich Jens Abrigata für die Unterstützung bei den Messungen und SimoneHerrmann für die gute Zusammenarbeit.Yan Suveyzdis danke ich für die Zusammenarbeit beim Rop7-Projekt.Ein großes Danke geht an Sandra Grunitz und Carolin Krumpinski, die immer einenreibungslosen Ablauf von organisatorischen Dingen ermöglichten.Für Hilfestellungen bei meinen sporadischen Proteinaufreinigungen, deren Resultate al-lerdings nicht den Weg in diese Arbeit gefunden haben, möchte ich mich bei FrederikGroßerüschkamp und Konstantin Gavriljuk bedanken.

Bei Tobias Merkendorf und Erik Freier bedanke ich mich für die angenehme Zeit imgemeinsamen Büro und speziell bei Erik für viele hilfreiche Diskussionen, Tipps undAnregungen in technischen Fragen.Für die stets gute Stimmung im Raum 350 und eine hervorragende Zusammenarbeitdanke ich Laven Mavarani, Sarah Jenrich, Philipp Pinkerneil und Anna Shtamm.Für theoretische Unterstützung möchte ich mich bei Steffen Wolf, Henrick te Heesen undbesonders bei Till Rudack bedanken, mit dem die Diskussion über Ras-Membran-Dingestets erfrischend war.Bei Steffen Krätzig möchte ich mich für seinen ungeheuren Einsatz dabei, uns Kaffee-

trinker mit Suchtmitteln zu versorgen und für die vielen Outdoor-Erfahrungsaustauschebedanken.Auch möchte ich allen Grafikkartentestern für ihr Engagement danken, den Roten fürviele erfolgreiche Missionen, den Blauen für ebenso viele Herausforderungen.

Bei allen Mitarbeitern des Lehrstuhls für Biophysik möchte ich mich für das angenehmeArbeitsklima und die gute Zusammenarbeit bedanken.

Ein großes Dankeschön geht an meine Eltern, die mich während der Promotion aberauch während ganzen Studienzeit unterstützt, und mir den Rücken frei gehalten haben.

Ich danke Jutta für Alles - Danke!

Kurzzusammenfassung

Die kleine GTPase Ras ist ein protoonkogenes Protein, das in 20% aller Tumore mu-tiert ist. In vivo ist Ras über einen Lipidanker an die Plasmamembran gebunden underfüllt dort seine zentrale Funktion als molekularer Schalter in zahlreichen Signaltrans-duktionskaskaden. Bislang existieren nur wenige biopysikalische Analysen von Ras inseiner nativen Membranumgebung. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, die ATR-FTIR-spektroskopische Untersuchung von membrangebundenem Ras zu etablieren. Zunächstwurden festkörpergestützte Lipidmembranen auf dem internen Reflektionselement her-gestellt, was die native Immobilisierung von lipidiertem Ras ermöglichte. Das membran-gebundene Protein war mit seinen α-Helices eher senkrecht zur Membran ausgerichtet.Eine Sekundärstrukturanalyse ergab, dass die Membrananbindung nur geringfügige Aus-wirkungen auf die Proteinstruktur hat und ergab Hinweise darauf, dass der Lipidankervorwiegend in β-Sheet-Struktur vorliegt. Mit dem γ-Phosphat-Analogon BeF−3 konntenerstmals Differenzspektren zwischen dem ON- und OFF-Zustand von membrangebun-denem Ras erzeugt werden. Der Vergleich mit Differenzspektren von Ras in Lösungließ auf eine gleiche Konformation der Nukleotidbindetasche von membrangebundenemRas und Ras in Lösung schliessen. Durch Etablierung des Nukleotidaustausches vonmembrangebundenem Ras konnte die intrinsische GTP-Hydrolyse charakterisiert wer-den. Die Kinetik der intrinsischen Hydrolyse und das Hydrolysedifferenzspektrum vonmembrangebundenem Ras wiesen nur geringe Unterschiede zu den in Lösung gemessenenKinetiken und Spektren auf. Dies zeigt, dass weder die Membranimmobilisierung nochdie orientierte Anbindung einen Einfluss auf die Nukleotidbindung und die Hydrolyseak-tivität des Proteins hat. In ersten Protein-Protein-Interaktionsstudien von membrange-bundenem Ras mit dem Effektor NoreRBD wurde keine membraninduzierte Änderungder Affinität festgestellt.Die erfolgreiche Etablierung ATR-FTIR-spektroskopischer Untersuchungen von mem-brangebundenem Ras ermöglicht nun die Bearbeitung einer Vielzahl von interessantenFragestellungen. So könnten z.B. erstmals onkogene Ras-Mutanten differenzspektrosko-pisch charakterisiert werden und der Einfluss von möglicherweise pharmakologisch be-deutsamen small molecules auf den Aktivierungszustand von Ras analysiert werden. Wei-terhin besteht nun die Möglichkeit, die Interaktion von Ras mit Effektoren, GAPs undGEFs in Membrannähe zu untersuchen. Durch Variation der Lipidzusammensetzung undMutationsstudien von putativ membraninteragierenden Residuen können Ursache undbiologische Konsequenzen der spezifischen Membranausrichtung ermittelt werden.

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Abstract

The small GTPase Ras is a proto-oncogenic protein that can be found in 20% of alltumours. In vivo Ras is bound to the plasma membran by a lipid anchor and playsa central role as a molecular switch in numerous signal transduction pathways. Thereare until now only few biophysical analyses of Ras in its native membrane environment.Therefore, the objective of this thesis was to establish the ATR-FTIR-spectroscopicanalysis of membrane-bound Ras. In a first first step solid supported lipid bilayers wereassembled on the internal reflection element, allowing the subsequent immobilisation oflipidated Ras in its native conformation. The protein was bound to the membrane suchthat its α-helices were oriented in a perpendicular angle with respect to the membrane.The analysis of the secondary structure indicated that membrane binding of Ras leadsonly to minor effects on the protein structure. Moreover, the secondary structure analysissuggested that the lipid anchor exists predominantly in a β-sheet conformation. By usingthe γ-phosphate analogue BeF−3 difference spectra of membrane-bound Ras betweenON and OFF state could be obtained for the first time. Since these spectra were verysimilar to difference spectra of Ras in solution one can assume that the conformationof the nucleotide binding pocket of membrane-bound Ras is identical to that of Rasin solution. Establishment of the nucleotide exchange of membrane-bound Ras enabledthe characterisation of its intrinsic GTP hydrolysis. The kinetics and the hydrolysisdifference spectra obtained with membrane-bound Ras were nearly identical to thosemeasured in solution. This shows that neither the membrane immobilisation nor theorientated binding influence the nucleotide binding or the hydrolysis activity. In a firstset of protein-protein interaction experiments with membrane-bound Ras and its effectorNoreRBD membrane-induced changes in the affinity could not be detected.The successfull establishment of ATR-FTIR-spectroscopic analyses of membrane-boundRas now enables the more profound investigation of many interesting questions, e. g., thedifference spectroscopic characterisation of oncogenic Ras mutants and the influence ofputative pharmacologically relevant small molecules on the Ras active state. Moreover,the newly established technique now allows to gain deeper insight into the interactionof Ras with effector molecules, GAPs and GEFs in the vicinity of the membrane. Byvarying the lipid composition and mutation of potentially membrane-interacting residuesthe molecular basis and biological consequence of the specific membrane orientation ofRas could be elucidated.

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Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 61.1 Die GTPase Ras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61.2 Regulation durch Ras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71.3 Schalterfunktion von Ras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91.4 Ras-Isoformen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111.5 Ursache der unterschiedlichen biologischen Wirkung der Ras-Isoformen . . 12

1.5.1 Palmitoylierungszyklus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121.5.2 Nanoclustering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131.5.3 G-Domänenorientierung - novel switch-Modell . . . . . . . . . . . . 141.5.4 Protein-Lipid-Interaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

1.6 Semisynthetisches lipidiertes Ras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171.7 Zielsetzung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

2 Material und Methoden 202.1 Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

2.1.1 Chemikalien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202.1.2 Geräte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212.1.3 Spezielle Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222.1.4 Computerprogramme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222.1.5 Puffer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 232.1.6 Proteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

2.2 Biochemische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 242.2.1 BCA-Proteinkonzentrationsbestimmung . . . . . . . . . . . . . . . 242.2.2 Nukleotidaustausch von Ras in Lösung . . . . . . . . . . . . . . . . 242.2.3 H/D-Pufferaustausch von Proteinen in Lösung . . . . . . . . . . . 262.2.4 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie . . . . . . . . . . . . . . 262.2.5 DLS-Messung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

2

Inhaltsverzeichnis

2.2.6 Vesikelspreitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 272.2.6.1 Vorbereitung des Germanium IRE . . . . . . . . . . . . . 282.2.6.2 Herstellung kleiner unilammelarer Vesikel . . . . . . . . . 282.2.6.3 Ablauf der ATR-FTIR-spektroskopischen Messung der

Vesikelspreitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 282.3 ATR-FTIR-Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

2.3.1 Infrarotspektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 292.3.2 Fourier Transform IR-Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . 302.3.3 Attenuated total reflection FTIR-Spektroskopie . . . . . . . . . . . 322.3.4 Linearpolarisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

2.3.4.1 Orientierte Spektren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 362.3.4.2 Dichroitische Differenzspektren . . . . . . . . . . . . . . . 372.3.4.3 Ordnungsparameter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 372.3.4.4 Oberflächenkonzentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

2.3.5 Polarisatorineffizienz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 402.3.6 Berechnungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

2.4 Neue Messaufbauten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 432.4.1 Ventrobot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 432.4.2 Dichrobot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

2.5 Transmissions FTIR-Spektroskopie von Proteinen in Lösung . . . . . . . . 462.6 Sekundärstrukturanalyse mit FTIR-Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . 46

2.6.1 Grundlagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 462.6.2 Spektrenvorbereitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 492.6.3 Bandenzerlegung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

2.7 Globale Anpassung von 3D-Spektren mit MCR-ALS . . . . . . . . . . . . 50

3 Ergebnisse und Diskussion 543.1 Herstellung einer festkörpergestützten Lipidmembran . . . . . . . . . . . . 54

3.1.1 Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 543.1.2 Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 553.1.3 Vesikelspreitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

3.1.3.1 Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 563.1.3.2 Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

3.1.4 Geschlossenheit des SSLB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 603.1.4.1 Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 603.1.4.2 Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

3

Inhaltsverzeichnis

3.1.5 Planarität des SSLB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 613.1.5.1 Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 613.1.5.2 Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

3.1.6 Quantitative Infomationen über die erzeugten SSLBs . . . . . . . . 633.1.7 Fazit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

3.2 Anbindung von lipidiertem Ras an einen SSLB . . . . . . . . . . . . . . . 673.2.1 Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 673.2.2 Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

3.2.2.1 Spezifität, Assoziation und Dissoziation . . . . . . . . . . 683.2.2.2 Proteinorientierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 723.2.2.3 Oberflächenkonzentration und Belegungsdichte . . . . . . 75

3.2.3 Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 763.2.3.1 Anbindung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 763.2.3.2 Stabilität der Immobilisierung . . . . . . . . . . . . . . . 773.2.3.3 Orientierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 773.2.3.4 Dimerisiert Ras an der Membran? . . . . . . . . . . . . . 79

3.3 Sekundärstruktur von membrangebundenem lipidiertem Ras . . . . . . . . 813.3.1 Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81

3.3.1.1 SSLB-Präparation und Proteinanlagerung . . . . . . . . . 813.3.1.2 Messung von Ras in Lösung . . . . . . . . . . . . . . . . 82

3.3.2 Sekundärstrukturanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 823.3.3 Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 833.3.4 Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

3.4 Differenzspektroskopie an Ras Monolagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 893.4.1 Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 893.4.2 Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 903.4.3 Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91

3.4.3.1 BeF−3 -Differenzspektren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 923.4.3.2 BeF−3 -Titrationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95

3.4.4 Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 973.5 GTP Hydrolyse von membrangebundenem Ras . . . . . . . . . . . . . . . 100

3.5.1 Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1003.5.2 Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1003.5.3 Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104

3.5.3.1 Nukleotidaustausch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1043.5.3.2 Hydrolysespektren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107

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Inhaltsverzeichnis

3.5.3.3 Hydrolysekinetik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1103.5.4 Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111

3.6 Protein-Protein Interaktion von membrangebundenem Ras mit NoreRBD 1143.6.1 Das Ras Effektorprotein Nore1A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1143.6.2 Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1153.6.3 Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1173.6.4 Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1213.6.5 Einfluss der Transportkinetik auf die Anbindungskinetiken . . . . . 1223.6.6 Fazit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124

4 Zusammenfassung und Ausblick 126

5 Literaturverzeichnis 131

Abbildungsverzeichnis 142

Tabellenverzeichnis 144

5

1 Einleitung

1.1 Die GTPase Ras

Das Ras-(Rat Sarcoma)-Protein ist ein Proto-Onkogen, das zur Gruppe der Guaninnu-kleotidbindenden Proteine, der sog. G-Proteine gehört, die an einer Reihe von regula-torischen Prozessen innerhalb der Zelle beteiligt sind. Eine eukaryontische Zelle enthält100–150 verschiedene Arten von G-Proteinen, von denen die meisten entweder zur Grup-pe der heterotrimeren G-Proteine oder zur Gruppe der sog. "kleinen GTPasen"gehören(Vetter und Wittinghofer (2001)).

Heterotrimere G-Proteine bestehen aus drei Untereinheiten (α, β und γ), von denen dieα-Untereinheit nukleotidbindend ist. Die Interaktion der heterotrimeren G-Proteine mitaktivierten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) führt zu einem Austausch vonGDP zu GTP, was zur Dissoziation des Trimers und damit zu weiteren Reaktionen in-nerhalb einer nachgeschalteten Regulationskaskade führt. Heterotrimere G-Proteine sindvorwiegend in Regulationskaskaden eingebunden, die sinnesphysiologische und stoffwech-selregulatorische Vorgänge steuern (Gilman (1987)).

Die Gruppe der kleinen GTPasen umfasst monomere G-Proteine von 20–25 kDa Größe,die eine hohe Primärsequenzhomologie untereinander aufweisen und deren Funktion dieintrazelluläre Singalweiterleitung bzw. -verarbeitung ist (Vetter und Wittinghofer (2001);Herrmann (2003)). Diese Gruppe besteht aus fünf Untergruppen, der Ras-, Rho/Rac-,Rab-, Sar1/Arf- und Ran-Familie. Die Proteine der Ras-Familie sind die Hauptkom-ponenten der intrazellulären Signalweiterleitung und regulieren das Zellwachstum, dieZelldifferenzierung und den programmierten Zelltod (Apoptose). Die Mitglieder derRho/Rac-Familie regulieren das Zytoskelett, die der Rab-Famile und Sar1/Arf-Familieden intrazellulären Vesikeltransport und die GTPasen der Ran-Familie den Kerntrans-port und die Mikrotubulibildung (Takai et al. (2001)). Die erhebliche Bedeutung von Rasbei der Regulation von Zelldifferenzierung, Zellwachstum und Apoptose zeigt sich auch

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1 Einleitung

darin, dass bei ca. 20% aller Tumore Mutationen des Ras-Gens vorliegen (Downward(2003)).

1.2 Regulation durch Ras

Abbildung 1.1: Ras-Regulationszyklus. Ras liegt in zwei Zuständen, dem GTP-gebundenen ON-Zustand und dem GDP-gebundenen OFF-Zustand vor. Nur Ras im ON-Zustand interagiert mit Effek-toren der Signaltransduktionskaskade (siehe Abb. 1.2). Der Übergang zwischen ON- und OFF-Zustandwird von GAPs und GEFs katalysiert, die wiederum durch andere Signale reguliert werden.

Ras ist auf der Innenseite der Cytoplasmamembran lokalisiert und nimmt dort einezentrale Position im Signaltransduktionsnetzwerk ein. Die grundlegende Funktion vonRas innerhalb des Netzwerks ist der Wechsel zwischen dem GTP-gebundenen aktivenZustand (ON) und dem GDP-gebundenen inaktiven Zustand (OFF). Je nach Zustandinteragiert Ras unterschiedlich stark mit Effektorproteinen und beeinflusst so den Infor-mationsfluss innerhalb der Signaltransduktionskaskade (Abb. 1.1). Da das gebundeneGTP nur sehr langsam hydrolysiert und auch der Austausch von GDP zu GTP auf-grund der hochaffinen Bindung kaum abläuft, sind beide Zustände dieses molekularen„Schalters“ sehr stabil. In welchem Zustand sich Ras befindet, wird durch Interaktionmit GAPs (GTPase Activating Proteins) und GEFs (Guanine Nucleotide Exchange Fac-tors) bestimmt, deren Nähe zu Ras wiederum durch externe Signale reguliert wird. DerÜbergang vom ON- in den OFF-Zustand wird durch GAPs katalysiert, die die GTP-Hydrolyse um den Faktor 105 beschleunigen. Die Beschleunigung des Übergangs von

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1 Einleitung

OFF nach ON wird durch GEFs erreicht, indem sie die Affinität von Ras zu Nukleotidenherabsetzen, was zu einem Austausch von GDP zu GTP führt (Abb. 1.1).

In menschlichen Zellen werden mindestens neun verschiedene GEFs und acht verschie-dene GAPs exprimiert, deren Rekrutierung zur Cytoplasmamembran wiederum unter-schiedlich reguliert wird. Von der Gruppe der ca. zwanzig Effektoren von Ras, von deneneinige auch als GAP oder GEF für andere GTPasen wirken, sind die Raf-Kinase und diePI3- (Phosphoinositol-3)-Kinase (PI3K) die bekanntesten Mitglieder.

Abbildung 1.2: Ras-vermittelte Signaltransduktionskaskade. Die Anwesenheit eines Wachstumsfaktorsim extrazellulären Raum beeinflusst über eine Ras-vermittelte Signaltransduktionskaskade die Zellzyklus-regulation und Transkription. Für nähere Erklärungen siehe Text (verändert nach Downward (2003)).

Eine über Ras und Raf verlaufende Signalkaskade beginnt mit der durch Anbindungeines Wachstumsfaktors induzierten Dimerisierung und Autophosphorylierung einer Re-zeptortyrosinkinase (RTK). Dies führt zur Interaktion des Proteins SHC mit den phos-phorylierten Tyrosinen der RTK, was wiederum zur Anbindung des AdapterproteinsGRB2 an den Komplex aus TRK und SHC führt (Abb. 1.2). Durch die Bindung anGRB2 wird das GEF SOS (Son Of Sevenless) in Membrannähe gebracht, wo es denNukleotidaustausch von Ras katalysiert. Die Serin/Threoninkinase Raf wird durch In-teraktion mit dem aktivierten Ras an der Membran immobilisiert und so aktiviert. Dasführt zur Phosphorylierung der Kinase MEK (Mitogen activated kinase/ERK Kinase)

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1 Einleitung

durch Raf, die wiederum die Kinase ERK (Extracellular Regulated Kinase) phosphory-liert, welche in der Folge unter anderem Proteine des Zellkerns phosphoryliert und sodie Transkription beeinflusst (Abb. 1.2, Downward (2003)).

Die Interaktion zwischen Ras und seinen Effektoren wird durch Domänen mit einerstark konservierten Struktur, den sog. Ras-Bindedomänen (RBDs) hervorgerufen. Gene-rell besitzen die RBDs hohe Affinitäten zu Ras, die Bereich von 0,1 bis 10µM liegen.Gleichzeitig weisen sie sehr kurze Komplexlebenszeiten im mittleren Millisekundenbe-reich und sehr hohe Assoziationsratenkonstanten (ca. 10µM−1s−1) auf. Die Interaktionist also sowohl hochdynamisch als auch hochaffin, was bedeutet, dass die RBDs das Rasnie lange besetzen, sondern dass in einem dynamischen Gleichgewicht aller vorhande-nen Ras Interaktionspartner diejenigen RBDs mehr „Ras-Interaktions-Zeit“ bekommen,deren Komplex thermodynamisch stabiler ist (Herrmann (2003)).

1.3 Schalterfunktion von Ras

Der unter 1.2 bereits erwähnte Schaltermechanismus von Ras ist durch große Unterschie-de in der Konformation der Nukleotidbindetasche zwischen GTP- und GDP-gebundenemRas bedingt. Die Nukleotidbindetasche besteht aus drei funktionellen Einheiten, demP-Loop (As. 10–17), SwitchI (As. 32–38) und SwitchII (As. 59–67) (Vetter und Witting-hofer (2001)). Der P-Loop ist in der Nähe der Phosphate des Nukleotids gelegen, undbildet über Aminofunktionen von Seitenketten (K16) und des Proteinrückgrats (As. 13–18) H-Brücken mit dem α- und β-Phosphat aus. Dahingegen wechselwirken die Switch-Regionen vorwiegend mit dem γ-Phosphat des GTP, zu dem die Aminosäuren T35 ausSwitchI und G60 aus SwitchII über ihre Peptid-NH-Gruppen H-Brücken ausbilden. An-dere Residuen der Switch-Regionen interagieren mit dem γ-Phosphat indirekt über einMg2+-Ion oder koordinierende H2O-Moleküle. Die Vielzahl der Kontakte von SwitchIund SwitchII zum γ-Phosphat führt zu einer äußerst stabilen Konformation dieser Be-reiche, wenn Ras GTP-gebunden vorliegt und zu einer sehr flexibelen, unstrukturiertenKonformation im GDP-gebundenen Zustand. Da die Effektoren im Bereich der Switch-regionen mit Ras interagieren, führt die geringe Strukturstabilität im GDP-Zustand zueiner stark verminderten Affinität und ist somit die Ursache der Schalterfunktionalitätvon Ras.

Der Zustandswechsel von ON nach OFF wurde bereits FTIR-spektroskopisch untersuchtund einige der bei dieser Reaktion auftretenden Differenzbanden durch ortspezifische Mu-

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1 Einleitung

Abbildung 1.3: 3D-Struktur von Ras. Gezeigt ist die NMR Struktur des GDP-gebundenen OFF-Zustands von Ras (1CRP, 9 von 20 Modellen, weiss) im Vergleich zu zwei Röntgenstrukturen vomON-Zustand (schwarz, 1QRA(GTP) und 5P21(GppNHp)). Die Strukturelemente P-Loop (rot), SwitchI(grün) und SwitchII (blau) binden die Phosphate des Nukleotids. Die Effektor-bindenden Switch-Bereichesind im OFF-Zustand sehr flexibel, was die Affinität zu Effektoren stark verringert.

tagenese und Isotopenaustausch zugeordnet. So konnte z.B. die Absorptionsfrequenz ei-ner Markerbande des ON-Zustands bei 1689 cm−1 der Carbonyl-Gruppe des in SwitchIgelegenen Threonin 35 zugeordnet werden (Kötting et al. (2007)). Desweiteren konn-ten die Hydrolysedifferenzbanden der Phosphate durch die Verwendung von isotopen-markierten Nukleotiden zugeordnet und anhand der Kinetik ihrer Differenzbanden Auf-schluss über den molekularen Mechanismus der Hydrolyse gewonnen werden (Cepus et al.(1998)). Verschiebungen der Phosphatbanden bei Interaktion mit GAP lassen vermuten,dass es bei der GAP-katalysierten Hydrolyse zu Ladungsverschiebungen vom γ- zumβ-Phosphat kommt (Allin et al. (2001)). Weiterhin gibt es Hinweise darauf, dass derkatalytische Effekt teilweise auch durch die Verdrängung von Wassermolekülen aus derRas-Bindetasche durch den sog. Arginin-Finger des GAPs verursacht wird (Kötting et al.(2008)). Darüberhinaus wurde mit zeitaufgelöster FTIR-Spektroskopie ein bei der GAP-katalysierten Hydrolyse vorkommendes Intermediat charakterisiert, dass aus RasGDPund einem proteingebundenem H2PO−4 -Ion besteht (Kötting et al. (2006)).

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1 Einleitung

1.4 Ras-Isoformen

Es existieren vier Isoformen des Ras-Proteins, H(arvey)-Ras, N(euroblastoma)-Ras, K(ir-sten)-Ras4A und K(irsten)-Ras4B (nachfolgend K-Ras genannt), die mit Ausnahme vonK-Ras4A (einer Splicevariante von K-Ras4B) ubiquitär in gleichem Maße exprimiert wer-den. Die Isoformen haben im Bereich der katalytisch aktiven G-Domäne (As. 1–166) ca.90% Sequenzidentität und auch die basalen Mechanismen der Signaltransduktionskas-kaden sind bei H-Ras, N-Ras und K-Ras gleich. Obwohl in vitro auch die Aktivierungund Deaktivierung durch die gleichen GAPs und GEFs katalysiert wird, wirken K-Rasund H-Ras in der Zelle jedoch unterschiedlich effizient in den verschiedenen Regulations-kaskaden. So wirkt z.B. K-Ras mehr in der Raf-1-vermittelten Kaskade, wohingegen dieAktivierung der PI3-Kinase eher über H-Ras verläuft (Hancock (2003)). Weitere Unter-schiede der Isoformen zeigten sich bei Experimenten mit Knockout-Mäusen, in denensich herausstellte, dass K-Ras-Knockout-Mäuse im Gegensatz zu N-Ras-, H-Ras- undH-Ras/N-Ras-Doppelknockoutmäusen nicht lebensfähig waren (Umanoff et al. (1995);Esteban et al. (2001)).

Abbildung 1.4: Unterschiede der C-Termini von Ras-Isoformen. Die drei Ras-Isoformen H-Ras, N-Rasund K-Ras (hier K-Ras4B) besitzen nahezu identische G-Domänen (As. 1–166) und unterschiedlicheC-terminale sog. hypervariable Regionen (HVR, As. 167–188/189). Der Anker-Bereich der HVRs trägtje nach Isoform unterschiedliche Lipid-Modifikationen (verändert nach Hancock (2003)).

Diese Diskrepanz zwischen nicht zu unterscheidender in vitro-Aktivität und deutlichenin vivo-Unterschieden der Isoformen ist durch den sehr variabelen C-Terminus (HVR,hypervariable Region, As. 167–188/189), innerhalb dessen die Proteine weniger als 15%Sequenzähnlichkeit aufweisen, bedingt (Omerovic und Prior (2009)). Die HVR ist auchder Bereich, über den Ras durch Lipidmodifikationen an der Plasmamembran gebundenist. Die Isoformen sind alle einfach farnesyliert und H- sowie N-Ras tragen zusätzlicheine bzw. zwei Palmitoylmodifikationen (Abb. 1.4). K-Ras hingegen weist einen Bereichpositiv geladener Residuen auf, der über elektrostatische Interaktion zusätzliche Mem-

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1 Einleitung

branaffinität vermittelt. Der Ablauf der posttranslationalen Modifikationen der drei Iso-formen beginnt im Cytoplasma mit der Farnsylierung des Cysteins der C-terminalenErkennungssequenz CAAX durch die Farnesyltransferase (FTase). An der cytosolischenSeite des Endoplasmatischen Retikulums (ER) wird das AAX-Tripeptid durch die En-dopeptidase Rca1 (Ras and a factor converting enzyme) entfernt und anschließend dieCarboxy-Gruppe des Cysteins durch die Methytransferase Icmt (Isoprenylcysteine Car-boxyl Methyltransferase) methyliert. Nach der Methylierung werden N-Ras und H-Rasein- bzw. zweifach palmitoyliert (N-Ras am Cystein C181 und H-Ras an C181 sowieC184). Die palmitoylierten Proteine gelangen über den Golgi-Apparat und den sektreto-rischen Pfad zur Cytoplasmamembran, während das lediglich farnesylierte K-Ras übereine unbekannte, Golgi-unabhägige Route zur Plasmamembran gelangt (Hancock (2003);Omerovic und Prior (2009); Henis et al. (2009)).

Trotz der unterschiedlichen Modifikationen und der unterschiedlichen Routen zur Plas-mamembran ist das Ergebnis – die Plasmamembranlokalisierung – bei allen drei Isofor-men gleich. Wodurch die Isoform-spezifischen Unterschiede hervorgerufen werden, sollim Folgenden kurz dargelegt werden.

1.5 Ursache der unterschiedlichen biologischen Wirkungder Ras-Isoformen

Die unterschiedliche biologische Funktion der Ras-Isoformen ist nach heutigem Kennt-nisstand auf eine unterschiedliche subzelluläre Lokalisation zurückzuführen. Da auch diemit Ras interagierenden Proteine spezifische Lokalisationen aufweisen, ergibt sich so einMuster der räumlichen und zeitlichen Überschneidung von Proteinkonzentrationen, ausder die Isoform-spezifische Signalantwort resultiert. Diese Unterschiede in der Membran-lokalisation sind auf eine Vielzahl von Einflüssen zurückzuführen, über deren jeweiligeAnteile bislang zumeist nur qualitative Daten vorliegen (Omerovic und Prior (2009);Henis et al. (2009)). Einige der Einflussfaktoren dieser kompartimentierten Signalweiter-leitung (compartmentalized signalling) sind im Folgenden aufgeführt.

1.5.1 Palmitoylierungszyklus

Die palmitoylierten Isoformen H-Ras und N-Ras sind nicht konstant an der Plasmamem-bran (PM) immobilisiert, sondern können die Membran durch Depalmitoylierung wieder

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1 Einleitung

verlassen. In fluoreszenzmikrokopischen Studien konnte gezeigt werden, dass ein schnellerAustausch von H-Ras und N-Ras zwischen Plasmamembran und Golgi-Apparat existiertund dass dieser Austausch durch einen Palmitoylierungs/Depalmitoylierungs-Zyklus ver-ursacht wird (Rocks et al. (2005)). Ein Unterschied zwischen den Isoformen zeigt sichin der Kinetik des Übergangs von der PM zum Golgi-Apparat, die bei H-Ras mit einerHalbwertszeit von 6min ca. sechs mal langsamer ist als bei N-Ras mit einer Halbwerts-zeit von 1,1min. Die H-Ras Mutante C184S, die keinen mittleren Lipidanker besitzt undsomit die gleiche Verankerung wie N-Ras aufweisst, hatte auch die gleiche Kinetik wieN-Ras. Dies zeigt, dass die Anzahl der Palmitoylgruppen und weniger die Sequenz desHVR die Kinetik des Wechsels zwischen PM und Golgi-Apparat bestimmt (Rocks et al.(2005)). Das extrazelluläre Signal wird also nicht nur in den plasmamembranständigenSignalkomplexen verarbeitet, sondern auch in Form von aktiviertem Ras mit Isoform-spezifischer Kinetik in das Zellinnere getragen.

1.5.2 Nanoclustering

Mittels Elektronenmikroskopie und Immunogoldmarkierung wurde entdeckt, dass Rasnicht homogen an der Plasmambran verteilt ist, sondern je nach Isoform und ON/OFF-Zustand in Anhäufungen, den sog. Ras-Nanoclustern vorliegt (Prior et al. (2001)). DieseCluster bestehen aus 6–8 Ras-Molekülen, haben einen Radius von mehr als 6 nm und sindmit einer Lebenszeit von ca. 0,5 s sehr transiente Strukturen (Henis et al. (2009)). DieNanocluster sind in cholesterolabhängigen Bereichen der Plasmamembran, den sog. Raftsebenso zu finden, wie in den cholesterolunabhängigen Bereichen (nähere Erklärungen zuRafts finden sich in 1.5.4). So liegen die Nanocluster von inaktivem H-Ras vorwiegendin Raft-Bereichen und die von aktivem H-Ras in Nicht-Raf-Bereichen (Abb. 1.5). BeiN-Ras verhält es sich genau gegensätzlich, wohingegen K-Ras-Nanocluster im aktivenund inaktiven Zustand in Nicht-Raft-Bereichen mit negativ geladenen Lipiden zu findensind (Roy et al. (2005)). Alle sechs Arten von Nanoclustern sind unabhängig voneinanderund überlappen sich nicht.

Zusätzlich zur Abhängigkeit vom Membranzustand wurde für H-Ras und K-Ras im akti-ven Zustand eine Kolokalisation mit den Adapterproteinen Galectin1 (H-Ras) und Galec-tin3 (K-Ras) gefunden (Abb. 1.5). Aktiviertes K-Ras rekrutiert Galectin3 vom Cytosolzur Plasmembran, wo es Bestandteil der K-Ras-Nanoclustern wird. Plasmamembran-ständiges Galectin3 interagiert mit RasGRP4, einem GEF von H-Ras und N-Ras, undkönnte so die Aktivierung dieser Isoformen beeinflussen (Plowman et al. (2008)). Dies

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1 Einleitung

Abbildung 1.5: Lokalisation von Ras-Nanoclustern in unterschiedlichen Membrandomänen. Die Ände-rung des Aktivierungszustands von H-Ras und N-Ras führt zum Wechsel in andere Membrandomänen.K-Ras ist in beiden Aktivierungszuständen in negativ geladenen Membranbereichen lokalisiert, die sichjedoch räumlich unterscheiden. In den Nanoclustern von aktivem H- und K-Ras wurde das Adapterpro-tein Galectin gefunden (verändert nach Plowman et al. (2008)).

zeigt, dass das Nanoclustering durch Steuerung der Lokalisation von Proteinen zu einergekoppelten Signalantwort der Isoformen führen kann. Im Gegensatz zur offensichtlichenBedeutung der Protein-Protein-Interaktionen für die Signalweiterleitung ist der Anteilder Protein-Lipid-Interaktion an der lateralen Segregation weitgehend unbekannt. Dassjedoch H-Ras, das nur am C181 palmitoyliert ist, den Nanoclustering-Phänotyp vonN-Ras aufweisst, lässt vermuten, dass die direkte Interaktion mit der Membran einen zu-sätzlichen Einfluss auf die laterale Segregation der Isoformen hat (Plowman und Hancock(2005)).

1.5.3 G-Domänenorientierung - novel switch-Modell

Nach Entdeckung der Ras-Nanocluster wurden in Zelldifferenzierungsassays der Einflussvon mehreren geladenen Residuen der G-Domäne und der HVR auf die Aktivität vonH-Ras festgestellt. Bei diesen Residuen handelt es sich um D47 und E49 im Loop zwi-

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1 Einleitung

Abbildung 1.6: Modell der Orientierungsänderung der G-Domäne von Ras. Das novel switch-Modellpostuliert eine GTP/GDP-abhängige Ausrichtung der G-Domäne. Im GDP-Zustand sind die α-Helicesvon Ras eher senkrecht zur Membran orientiert, im GTP-Zustand liegen sie parallel zur Membran. Durchdie unterschiedliche Orientierung hat α-Helix 4 nur im GTP-Zustand Kontakt mit der Membran, wäh-rend die C-Term-Residuen (R169 und K170) im GDP-Zustand näher an der Membran sind. In beidenOrientierungen liegen SwitchI (SI) und SwitchII (SII) nicht in Membrannähe (verändert nach Gorfe et al.(2007b)).

schen β-Strand 2 und 3 (L2,3-Residuen), R128 und R135 in α-Helix 4 (H4-Residuen)und R169 und K170 die am Beginn der HVR liegen (C-Term-Residuen). Mutationsstudi-en in in vivo-Experimenten zeigten, dass durch einen Alaninaustausch der H4-ResiduenWachstum und Differenzierung vermindert werden, während ein Alaninaustausch derC-Term-Residuen den gegenteiligen Effekt (verstärktes Wachstum und vermehrte Diffe-renzierung) hat. In diesen Studien konnte jedoch nur der Einfluss der Mutationen aufden Signaloutput der Regulationskaskade und auf die Lokalisation in verschiedenen Mem-brandomänen untersucht werden. Um ein Modell der molekularenWirkung der fraglichenResiduen zu erhalten, haben die Autoren eine in Molekulardynamik-(MD)-Simulationengefundene GTP-GDP-abhängige Orientierung vor dem Hintergrund der in vivo-Dateninterpretiert. In ihrem Modell, das sie als „novel switch“-Modell bezeichnen, ist die Inter-aktion der H4-, L2,3- und C-Term-Residuen mit Lipidkopfgruppen für die Ausrichtungder G-Domäne relativ zur Membran verantwortlich. Als Ursache der Orientierungsab-hängigkeit vom GDP/GTP-Zustand wird diskutiert, dass die Konformationsänderungder Switch-Regionen beim Übergang zwischen OFF- und ON-Zustand eine Strukturän-derung der membranbindenden Regionen hervorruft. Dies könnte zu einer verändertenMembraninteraktion der o.g. Residuen und damit zu einer Orientierungsänderung der G-

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1 Einleitung

Domäne führen. Es wurde postuliert, dass die G-Domäne im GTP-Zustand so ausgerich-tet ist, dass die α-Helices parallel zur Membran liegen und die L2,3- und die H4-ResiduenMembrankontakte ausbilden (Abb. 1.6). Das GDP-gebundene H-Ras wäre laut Modellmit den α-Helices eher aufrecht ausgerichtet, so dass die L2,3- und C-Term-ResiduenKontakt mit der Membran haben.

Die Ausrichtungsänderung der G-Domäne könnte ein regulatorisches Element darstellen,durch das die Interaktion mit GAPs, GEFs und Effektoren allein durch Verdeckung oderPräsentation der Bindestelle moduliert wird. Da eine Orientierungsänderung zu einerveränderten Membraninteraktion führen würde, könnte sie auch die in den Nanoclus-tering-Experimenten detektierten Raft-Abhängigkeiten erklären. Bislang gibt es jedochkeine in vitro-Experimente, die diese aus in vivo- und in silico-Ergebnissen abgeleiteteHypothese stützen oder wiederlegen könnten.

1.5.4 Protein-Lipid-Interaktion

Im Zusammenhang mit dem Nanoclustering von Ras wurde eine Lokalisation von akti-vem N-Ras und inaktivem H-Ras in Lipid-Rafts entdeckt. Lipid-Rafts sind Cholesterol-und Sphingomyelin-haltige Bereiche der Plasmamembran, die Durchmesser von <70 nmbesitzen und im flüssig geordneten (lo, liquid ordered) Phasenzustand vorliegen (Han-cock (2003)). Damit grenzen Rafts sich durch ihren Phasenzustand von den Nicht-Raft-Bereichen der Cytoplasmamembran ab, die im flüssig ungeordneten Phasenzustand (ld,liquid disordered) vorliegen. Da ein Lipidanker je nach Struktur in unterschiedliche Pha-sen inseriert, könnte die laterale Segregation von Ras durch die unterschiedlichen Lipi-danker verursacht sein. In Fluoreszenz- und AFM-Studien zur Phasensegregation vonRas wurde herausgefunden, dass ein semisynthetisches GDP-gebundenes N-Ras (siehe1.6) vorwiegend in lo-Domänen und in der Phasengrenze zwischen lo- und ld-Domänenzu finden ist (Nicolini et al. (2006); Weise et al. (2009b); Vogel et al. (2009)). Zwar stimmtdieser Befund mit den Nanoclustering-Ergebnissen von N-Ras überein, es konnten jedochkeine GTP/GDP-abhängigen Unterschiede der Segregation in die verschiedenen Phasengefunden werden (Weise et al. (2009a)). In NMR-Untersuchungen des Lipidankers vonN-Ras wurde herausgefunden, dass der Anker in einer flexiblen Hufeisen-ähnlichen Struk-tur an der Membran anliegt und die Seitenketten einiger aliphatische Aminosäuren inden hydrophoben Bereich der Membran zeigen (Reuther et al. (2006b)). Einen Anhalts-punkt für eine membraninduzierte strukturelle Änderung der G-Domäne von Ras ist

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1 Einleitung

durch eine NMR-Studie gegeben, in der farnesyliertes H-Ras bei Inkubation mit Vesi-keln eine veränderte Flexibilität des zentralen β-Sheets aufwies (Thapar et al. (2004)).In der gleichen Arbeit wurde mit Fern-UV-Ciculardichoismus-Spektroskopie eine gerin-ge Strukturänderung von farnesyliertem Ras bei Inkubation mit Liposomen beobachtet(Thapar et al. (2004)). Es existieren bislang nur wenige biophysikalische Untersuchungenzur Membranbindung von Ras, da die methodischen Möglichkeiten zur Aufklärung vonProtein-Lipid-Interaktionen noch recht begrenzt sind.

1.6 Semisynthetisches lipidiertes Ras

Abbildung 1.7: Semisynthetisches N-Ras. Natives (A) und semisynthetisches N-Ras (B) unterscheidensich durch eine unterschiedliche Acyl-Gruppe am ersten Cystein (C181) und eine längere Linkerregion.Der Linker des semisynthetischen Ras ist um ein Glycin-Cystein-Dipeptid und die MIC-Kopplungsgruppe(Maleimido-Caproyl-Gruppe) verlängert.

Aufgrund der Vielzahl der möglichen Einflussfaktoren in in vivo-Experimenten ist essehr schwierig, nur einen einzigen Parameter zu variieren und so den jeweiligen Ein-fluss quantitativ zu ermitteln. Daher existiert eine Lücke zwischen den in vivo-Datendes Regulationsnetzwerkes von Ras und der großen Datenmenge der in Lösung gemesse-nen Protein-Protein-Interaktionen. Diese Lücke kann durch biophysikalische Methodengeschlossen werden, die die Rekonstitution von Ras in einer Membranumgebung zusam-men mit den jeweils zu untersuchenden Interaktionspartnern erlauben. Neben der in der

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1 Einleitung

Praxis oftmals schwierigen Rekonstitution der Membranumgebung ist die Zugänglichkeitzu lipidiertem Ras in ausreichenden Mengen ein begrenzender Faktor.

Durch einen neuen Ansatz der Kombination von chemischer Synthese und bakteriellerProteinüberexpression ist es jedoch gelungen, lipidierte Ras-Proteine in hohen Ausbeu-ten herzustellen (Nagele et al. (1998); Bader et al. (2000)). In diesem Verfahren wirddie C-terminale Sequenz der HVR chemisch synthetisiert und direkt nach Addition derCysteine die jeweilige Lipidmodifikationen eingeführt. Zum Schluss der Synthese wirdN-terminal eine Maleimido-Caproyl-Gruppe angefügt, über die das Ankerpeptid im letz-ten Schritt an das C-terminale Cystein von bakteriell exprimiertem Ras gebunden wird(Brunsveld et al. (2006)).

In der vorliegenden Arbeit wurde ein semisynthetisches N-Ras verwendet (HDFar-MIC-N-Ras1-181, Abb. 1.7), das anstatt der nativen Palmitoyl-Gruppe eine chemisch stabilereHexadecyl-Gruppe trägt. Ein weiterer Unterschied zum nativen Protein ist der durchdie eingefügte MIC-Gruppe längere Linker-Bereich. In zellphysiologischen Experimentenwurde gezeigt, dass der längere Linker keinen messbaren Unterschied im Vergleich zumnativen Protein hervorruft (Bader et al. (2000)).

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1 Einleitung

1.7 Zielsetzung

Das zentrale Thema dieser Arbeit war die Untersuchung von membrangebundenem Rasmit ATR-FTIR-Spektroskopie. Hierzu sollte die ATR-Technik so weiterentwickelt wer-den, dass sie die Bearbeitung von biophysikalischen Fragestellungen im Themenfeld derMembraninteraktion von Ras ermöglicht. Zusätzlich sollten die entwickelten Technikenauch auf andere Proteine anwendbar sein, um so die Untersuchung von bislang unzu-gänglichen Fragestellungen zu erlauben.

Über das Protein Ras ist eine Fülle von Informationen bekannt, die größtenteils ausExperimenten in Lösung stammen. Es existieren z.B. hochaufgelöste Strukturen undquantitative Daten der Hydrolyse und der Interaktion mit GAPs, GEFs und Effektoren.Ein neuer Forschungschwerpunkt ist die in vivo-Untersuchung der Ras-vermittelten Re-gulationskaskaden, wobei die in Lösung gewonnenen in vitro-Daten zur Interpretationbenötigt werden. Da die Membranlokalisierung einen großen Einfluss auf die Funktionvon Ras oder seiner Interaktionspartner haben könnte, sollten die vorhandenen in vitro-Daten durch membrangestützte biophysikalische Messungen ergänzt werden.

Das Ziel der Arbeit war die Etablierung einer robusten, nicht denaturierenden Immobi-lisierungsmethode von Proteinen an Membranen, die Etablierung der Differenzspektro-skopie an Proteinmonolagen und die Etablierung der Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen mit ATR-FTIR-Spektroskopie.

Mit diesen Methoden sollten erste Einsichten in die folgenden Themenkomplexe gewon-nen werden:

• Führt die Membrananbindung zu einer Strukturänderung von Ras? Welche Struk-tur besitzt die HVR-Region des membrangebundenen Proteins?

• Hat die G-Domäne von Ras eine bestimmte Orientierung zur Membran? Ändertsich die Orientierung beim Übergang zwischen OFF- und ON-Zustand?

• Ist die Hydrolyseaktivität von Ras durch die Membranbindung beeinflusst?

• Beeinflusst die Membranbindung die Nukleotid-Bindung, unterscheiden sich alsodie Hydrolysedifferenzspektren von membrangebundenem und löslichem Ras?

• Welchen Einfluss hat die Membranimmobilisierung auf die Interaktion mit Effek-toren?

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2 Material und Methoden

2.1 Materialien

2.1.1 Chemikalien

Berylliumdifluorid Apollo Scientific Ltd, Stockport, UKBCA-Lösung Sigma-Aldrich Chemie GmbH, TaufkirchenRinderserumalbumin (BSA) Serva, HeidelbergChloroform Merck, DarmstadtDeuteriumoxid Deutero GmbH, KastellaunDeuteriumchlorid (>99% D) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, DeisenhofenDTT (1,4-Dithiothreitol) Biomol, HamburgEDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) Merck, DarmstadtGDP (Guanosin-5’-diphosphatDinatriumsalz)

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen

GTP (Guanosin-5’-triphosphatDinatriumsalz)

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen

Natriumchlorid Baker, Deventer NLNatriumfluorid Sigma-Aldrich Chemie GmbH, TaufkirchenNatriumhydroxid Sigma-Aldrich Chemie GmbH, TaufkirchenMagnesiumdichlorid Baker, Deventer, NLMES (2-N-Morpholinoethansulfonsäure) Biomol, HamburgPOPC (1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)

Lipoid GmbH, Ludwigshafen

Lysozym Sigma-Aldrich Chemie GmbH, TaufkirchenSalzsäure Baker, Deventer, NLSDS (Natriumdodecylsulfat) Amersham Biosciences, FreiburgTBAB (Tetrabutylammoniumbromid) Merck, DarmstadtTris (Tris-hydroxymethylaminomethan) Biomol, Hamburg

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Allgemein gebräuchliche Laborchemikalien wurden, falls nicht anders vermerkt, von denFirmen Fluka (Neu-Ulm), J. T. Baker (Deventer, NL), Biomol (Hamburg), Merck (Darm-stadt) oder Sigma-Aldrich (München) bezogen.

2.1.2 Geräte

Aquaspec Transmissionseinheit Micro-Biolytics GmbH, Esslingen amNeckar

ATR-Einheit (25 Reflektionen) Specac, Orpington, UKATR-Küvetten Feinmechanikwerkstatt, Fakultät für

Biologie, BochumATR-Küvettentemperiereinheit Feinmechanikwerkstatt, Fakultät für

Biologie, BochumBrutschrank, Kelvitron 1 Heraeus, Bad OeynhausenEppendorf Thermomixer comfort Eppendorf, HamburgFTIR-Spektrometer Tensor 27 Bruker, EttlingenFTIR-Spektrometer IFS 66 Bruker, EttlingenFTIR-Spektrometer Vertex 80v Bruker, EttlingenHPLC-Anlage System Gold Beckmann, MünchenÖl-Bad-Schüttler Modell C76 New Brunswick Scientific, Edison, USParticle Sizer (DLS-Gerät) Malvern, Worchestershire, UKpH-Meter 761 Calimatic Knick, BerlinpH-Einstabmeßkette 423 Mettler-Toledo, SteinbachPlasma Cleaner Harrick Plasma, Ithaca, USASchlauchpumpe REGLO Digital MS-4/8 Ismatec, Wertheim-MondfeldKryostat RC6CP (80V) Lauda, Lauda-KönigshofenUV-VIS Spektrometer Ultrospec 3000pro Amersham, FreiburgUltraschall Gerät Sonifier W-250 D mitHochintensitätsaufsatz Cup Horn

Heinemann, Schwäbisch-Gmünd

Waage BP 310 P Sartorius, GöttingenWaage 2004 MP6 Sartorius, GöttingenWasseraufbereitungsanlage, Milli-Q Plus Millipore, Eschborn

Alle nicht gesondert aufgeführten Geräte entsprechen dem allgemeinen Laborstandard.

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2.1.3 Spezielle Materialien

Germanium ATR Kristall (52 x 20 x 2 mm,45 ° trapezoid)

ACM, Villiers-Saint-Frédéric, FR

Diamantpolierpaste Polymant-P Gerd Sommer, UsingenKRS-5 Polarisator (25mm Apertur) Specac, Orpington, UKMagnetventile EXAK-3, 12V Takasago Electric, JPMikrokonzentratoren 10.000 MWCO Millipore, SchwalbachPumpschlauch Tygon R 3607 Ismatec, Wertheim-MondfeldZebaspin Entsalzungs Säulen Pierce Biotechnology, Rockford, US

2.1.4 Computerprogramme

Active Perl 5.8.8 www.activestate.comals2004 (Matlab Programm) http://www.ub.edu/mcrCorel Draw X4 Corel GmbH, UnterschleissheimGnuplot www.gnuplot.infoJabref 2.5 http://jabref.sourceforge.netKinetics (Matlab Programm) Erik Goormaghtigh (Prof. Erik

Goormaghtigh, ULB Brüssel, BE)Matlab R2006b The MathWorks, Natick, USMicrosoft Office 2003 Microsoft, Redmont, USMikTeX 2.7 http://miktex.orgOpus 6 Bruker, EttlingenOrigin 7.5 OriginLab Corporation, NorthamptonPymol 0.99rc6 http://www.pymol.orgTeXnicCenter http://www.texniccenter.orgVector NTI Suite 9 Informax, Oxford, GBVisual MINTEQ 2.61 http://www.lwr.kth.se/English

/OurSoftware/vminteq/index.html

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2.1.5 Puffer

Puffer A Puffer B10mM Tris-HCl 100mM NaCl5mM MgCl2 in Puffer ApH7,4

Puffer C Puffer D20mM Tris-HCl 50mM MES5mM MgCl2 100mM NaCl1mM DTT 5mM MgCl20,1mM GDP 1mM DTTpH7,4 0,1mM GDP

pH6,5

Puffer NA Puffer NB50mM MES 50mM MES100mM NaCl 100mM NaCl10mM EDTA 5mM MgCl21mM DTT 1mM DTT1mM GTP pH6,5pH6,5

2.1.6 Proteine

Semisynthetisches lipidiertes N-Ras (HDFar-MIC-N-Ras1-181) wurde von Gem-ma Triola bzw. Jürgen Kuhlmann (MPI für physiologische Chemie, Dortmund) zur Ver-fügung gestellt. Der Lipidanker (As. 181 - 188) wurde in der Abteilung von Prof. Her-bert Waldmann (MPI für physiologische Chemie, Dortmund) synthetisiert und über eineMaleimido-Caproyl-Gruppe an das C-terminale Cystein von N-Ras1-181 (Swiss Prot ID:P01111, H. sapiens) ligiert. Diese Ligation und die nachfolgende Aufreinigung, sowie dieExpression und Aufreinigung von N-Ras1-181 wurde von Christine Nowak (MPI für phy-siologische Chemie, Dortmund) wie in Tucker et al. (1986); Kuhn et al. (2001); Nageleet al. (1998) beschrieben durchgeführt.

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H-Ras1-166 wurde von von Angela Kallenbach (LS für Biophysik, Ruhr UniversitätBochum) zur Verfügung gestellt und wie in Tucker et al. (1986) beschrieben exprimiertund aufgereinigt (Swiss Prot ID: P01112, H. sapiens).N-RasStrepHis wurde von Philipp Pinkerneil (LS für Biophysik, Ruhr UniversitätBochum) zur Verfügung gestellt und im Rahmen seiner Diplomarbeit nach Tucker et al.(1986) exprimiert und aufgereinigt (Swiss Prot ID: P01111, H. sapiens). Allerdings wurdehier eine Ni-NTA-Säule anstatt einer Anionentauschersäule verwendet (siehe Pinkerneil(2009)).NoreRBD (Nore1A-RBD, As. 199-358, E217K) wurde von Daniel Filchtinski (LSfür Physikalische Chemie 1, Ruhr Universität Bochum) zur Verfügung gestellt und nachWohlgemuth et al. (2005) exprimiert und aufgereinigt (Swiss Prot ID: Q5EBH1, M. mus-culus). Die Mutation E217K hatte keinen Effekt auf die Interaktion mit Ras (persönlicheMitteilung Daniel Filchtinski), weshalb sie in dieser Arbeit dem Wildtypprotein gleich-gesetzt wird.

2.2 Biochemische Methoden

2.2.1 BCA-Proteinkonzentrationsbestimmung

Zur Bestimmung der Proteinkonzentration wurde die Bicinchoninsäure-Proteinbestim-mung (BCA-Test) nach Smith et al. (1985) durchgeführt.Hierbei wird ausgenutzt, dass Cu2+-Ionen durch die Peptidbindung von Proteinen unddurch bestimmte Aminosäuren (Cystein, Cystin, Tyrosin, Tryptophan) zu Cu+ reduziertwird. Ein Cu+-Ion bindet zwei BCA-Moleküle unter Bildung eines farbigen Komplexes,dessen Konzentration photometrisch durch Messung der Absorption bei 562 nm ermitteltwerden kann.Es wurde ein Probenvolumen von 50µl mit 20µl 4%iger CuSO4-Lösung und 1ml BCA-Lösung versetzt. Nach 30min Inkubation bei 37 °C wurde die E562nm bestimmt. DieProteinkonzentration wurde durch Kalibrierung mit einer Konzentrationsreihe von BSAbestimmt.

2.2.2 Nukleotidaustausch von Ras in Lösung

Ras liegt nach der Aufreinigung im GDP-gebundenen Zustand vor und musste daher fürdie Hydrolysemessungen in Lösung in den GTP-gebundenen Zustand überführt werden.

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Dieser Nukleotidaustausch wurde mittels der EDTA-Methode durchgeführt, in der dieNukleotidaffinität von Ras durch einen EDTA-vermittelten Entzug des an der Nukleotid-bindung beteiligten Mg2+-Ions verringert wird (Tucker et al. (1986); Lenzen et al. (1998)).Hierzu wird RasGDP zusammen mit EDTA und einem Überschuss von GTP inkubiert,so dass sich ein nur vom GDP/GTP-Verhältnis abhängiges Gleichgewicht von RasGDPund RasGTP einstellt. Da Ras ohne Mg2+ kein GTP hydrolysiert, startet die Hydro-lysereaktion erst, wenn das Protein in den Messpuffer überführt wird. Dieser Schrittwurde mit zentrifugierbaren Gelfitrationssäulen (Zebaspin) durchgeführt, wodurch nurein geringer Anteil des GTP vor Messbeginn hydrolysieren konnte.

Puffer NA Puffer NB50mM MES 50mM MES100mM NaCl 100mM NaCl10mM EDTA 5mM MgCl21mM DTT 1mM DTT1mM GTP pH6,5pH6,5

Der Nukleotidaustausch wurde bei RT mit 3mg Protein in 200µl Startvolumen (PufferC) nach folgender Prozedur durchgeführt.

1. 200µl Ras-Lösung + 800µl Puffer NA (Mg2+:EDTA ist 1:10).

2. Mit Ultrafiltrationssäulen (10 kDa MWCO) in 2 Schritten je 500µl auf ein Volumenvon 100µl einkonzentrieren.

3. auf 500µl mit Puffer NA auffüllen und erneut auf ein Volumen von 100µl einkon-zentrieren.

4. 30min bei RT inkubieren (GTP:GDP ist 40:1, also maximal 97,5%iger Austauschmöglich).

5. Während der Inkubation equilibrieren der Gelfiltrationssäule mit Puffer NB nachHerstelleranleitung.

6. Zugabe von 4µl 0,5M MgCl2 und sofortiges Beladen der Säule (Mg2+:EDTA ist2:1, Start der Reaktion).

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7. Elution durch Zentrifugation der Gelfiltrationssäule für 1min bei 2000 rpm.

8. Sofortiges Einsetzen in die FTIR-Messung, Nukleotidbestimmung per HPLC oderEinfrieren in flüssigen Stickstoff und Lagerung bei -80 °C.

2.2.3 H/D-Pufferaustausch von Proteinen in Lösung

Zur Analyse der Sekundärstruktur von Proteinen in Lösung wurden die in H2O-Puffergelagerten Proteine zunächst in D2O-Puffer überführt (H/D-Austausch). Dieser Puffer-wechsel wurde durch mehrmalige Verdünnungs- und Einkonzentrierungsschritte unterVerwendung von deuteriertem Puffer C (pD = 7,8) und Mikrokonzentratoren erreicht.

Es wurden 1,8mg Protein in 100µl Volumen eingesetzt und der Pufferwechsel bei 4 °Cnach folgender Prozedur durchgeführt.

1. 100µl Proteinlösung + 400µl D2O-Puffer wurde im Mikrokonzentrator gemischtund in ca. 5min bei 13000 rpm auf 50µl einkonzentriert.

2. Zugabe von 450µl D2O-Puffer und Einkonzentrierung auf 50µl.

3. Zweimalige Wiederholung von 2. (ergibt einen Verdünnungsfaktor von 1:5000)

4. 10 - 14 h Inkubation vor dem Einsetzen in die FTIR Messung.

Der mit dieser Prozedur erreichte HD-Austausch mit einem Verdünnungsfaktor von 5000führt aufgrund des sich zwischen H2O, HDO und D2O einstellenden Gleichgewichts zueiner Extinktion der δ(H2O)-Biegeschwingung von weniger als 0,001 und kann damitausreichend vollständig angesehen werden.

2.2.4 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

Die Nukleotidbeladung der verwendeten Ras-Proteine (2.2.2) wurde durch Hochleis-tungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit UV-Detektion ermittelt. Hierbei wurdedie Technik der reversed phase chromatography eingesetzt, bei der die Retentionszeit deraufzutrennenden Stoffe anhand ihrer Adsorption an eine hydrophobe Säulenmatrix be-stimmt wird. Die unterschiedliche Adsorption der aufzutrennenden Di- und Triphospatewurde durch Zugabe des Ionenpaar-Reagenz TBAB erreicht, das an Phosphate bindetund so deren Hydrophobizität erhöht.

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Es wurde eine ODS-Hypersil-Säule (5 µm, 250 mm × 5 mm) verwendet, die mit HPLC-Puffer (50mM KH2PO4/K2HPO4, 100mM TBAB, 15% Acetonitril, pH 6,5) bei einerFlussrate von 1,2ml/min betrieben wurde. Es wurden jeweils 2µl Proteinlösung injiziertund die Messung anhand der Extinktion bei 254 nm über eine Messdauer von 7minverfolgt. Der Anteil von GTP (RGTP ) am Gesamtnukleotid wurde durch Integration derPeaks von GDP (AGDP ) bei ca. 2,7min und GTP (AGTP ) bei ca. 3min mit RGTP =AGTP /(AGTP+AGDP ) bestimmt.

2.2.5 DLS-Messung

Die Methode der dynamischen Lichstreuung (DLS, dynamic light scattering) wurde ver-wendet, um Vesikelgrössen und die Homogenität der Grössenverteilung (PDI, Polydi-spersitätsindex) der Vesikel zu bestimmen. Die Methode basiert auf der Abhängigkeitder Diffusionsgeschwindigkeit von der Teilchengrösse. Hierzu wird die Streuung einesLaserstrahls an Teilchen im Probenvolumen zeitabhängig detektiert und anhand derzeitlichen Korrelation der Streuung der translationale Diffusionskoeffizient D berechnet.Mit bekannter Temperatur T unter Einbeziehung der Boltzmann-Konstante k und be-kannter Lösungsviskosität η kann der hydrodynamische Durchmesser d(H) durch dieStokes-Einstein-Gleichung berechnet werden (Gl. 2.1).

d(H) = kT

3πηD (2.1)

Zur Grössenbestimmung der präparierten Vesikel wurden 100µl Vesikellösung mit 400µlPuffer A verdünnt und bei 25 °C in 10 Messreihen vermessen.

2.2.6 Vesikelspreitung

Die Methode der Vesikelspreitung wurde zur Herstellung von festkörpergestützten Li-pidmembranen (SSLB) auf dem internen Reflektionselement (IRE) angewandt. DieseMethode beruht darauf, dass kleine unilammelare Vesikel (SUVs, small unilammelar ve-sicles) beim Kontakt mit hydrophilen Oberflächen platzen und einen Lipidbilayer aufder Oberfläche ausbilden (Raedler et al. (1995); Richter et al. (2006)).

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2.2.6.1 Vorbereitung des Germanium IRE

Vor jeder Vesikelspreitung wurde der Germaniumkristall beidseitig mit Diamantpolier-paste der Partikelgrößen 1, 0,25 und 0,1µm mit einem weichen Papiertuch von Handpoliert, bis der Kristall eine gleichmässig spiegelnde und schlierenfreie Oberfläche aufwies.Nach den einzelnen Polierschritten wurde der Kristall mit A. dest gespült und mit Stick-stoff trockengeblasen. Danach wurde der Kristall zur Hydrophilisierung der Oberfläche10min in konzentrierter Schwefelsäure inkubiert, anschliessend mit A. dest gespült undmit Stickstoff trockengeblasen. Die Hydrophilität der Oberfläche wurde hierbei anhandder Benetzung des Kristalls durch A. dest kontrolliert. Abschliessend wurde der Kristallfür 5min einem Sauerstoffplasma (Plasmacleaner, Luftplasma) ausgesetzt, wobei Restevon organischen Substanzen oxidiert und evaporiert und die Oberfläche zusätzlich hy-drophilisiert werden sollte. Danach wurde der Kristall unverzüglich in die ATR-Küvetteeingebaut und mit dem Ablauf der Vesikelspreitung begonnen.

2.2.6.2 Herstellung kleiner unilammelarer Vesikel

Zur Herstellung kleiner unilammelarer Vesikel (SUV, small unilammelar Vesicles) wur-den 50µl einer 25mg/ml POPC-Stocklösung, gelöst in Chloroform (CHCl3) in einem500µl Reaktionsgefäß im Stickstoffstrom eingedampft. Zur vollständigen Verdampfungdes CHCl3 wurde der Ansatz 1 h bei 20mbar im Vakuum inkubiert. Aus den Lipidfilmenwurde durch Hydratisierung mit 200µl Puffer A und anschliessende Inkubation für 1 hbei 37 °C und 1200 rpm im Thermomixer eine Suspension aus multilammelaren Lipo-somen hergestellt, die bis zur weiteren Benutzung bei -20 °C gelagert wurde. Nach demAuftauen wurde diese Suspension mittels eines Reagenzglasschüttlers stark gemischt undfür 10min bei 4 °C mit Ultraschall behandelt (Cup-Horn-Aufsatz für 500µl Reaktions-gefäße), wodurch SUVs von 30 - 60 nm Durchmesser erzeugt wurden. Von dieser SUV-Suspension wurden direkt nach der Herstellung 100µl in die ATR-Messung (2.2.6.3) und100µl in die DLS-Messungen (2.2.5) eingesetzt.

2.2.6.3 Ablauf der ATR-FTIR-spektroskopischen Messung derVesikelspreitung

Während der Herstellung des SSLB wurden ATR-FTIR-Messungen durchgeführt, so dassInformationen über den Ablauf des Spreitungsprozesses und die Qualität des erzeugten

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SSLB erhalten wurden. Die Messungen wurden, falls nicht anders beschrieben, bei 20 °Cmit den in 2.5 aufgelisteten Spektrometereinstellungen durchgeführt. Alle Puffer warenfiltriert, entgast und auf Raumtemperatur equilibiert. Die Messungen verliefen nachfolgenden Protokoll:

1. Vorbereitung des Germanium-Kristalls (2.2.6.1), Auftauen und Mischen der Lipo-somensuspension (2.2.6.2).

2. Behandlung der Liposomensuspension mit Ultraschall, während sich der Kristallim Plasmacleaner befindet (2.2.6.2).

3. Den Kristall nach der Plasmabehandlung in die ATR-Küvette einbauen, ins Spek-trometer einsetzen und 3min mit Puffer A im Durchfluss spülen. Aufnahme einesReferenzspektrums, Start einer Messung.

4. Durchfluss auf zirkulierend einstellen, 400µl Puffer A in 1,5ml Reaktionsgefäß für2min zirkulieren. Aufnahme eines Referenzspektrums, Start einer Messung.

5. Aufnahme eines Referenzspektrums, Start einer Messung für 120min, Zugabe von100µl Vesikellösung, 60min Inkubation im zirkulierenden Durchflussvolumen.

6. 60min mit Puffer A im Durchfluss spülen.

Nach Beendigung einer Messreihe, die meist aus einer Vesikelspreitung, einer Ras-An-lagerung und veschiedenen Experimenten mit dem angelagerten Ras bestand, wurde dieKüvette einschliesslich Pumpschlauch mit 10ml einer detergenzhaltigen Lösung (Deter-genz:A. dest = 1:10) gespült, danach mit Stickstoff trockengeblasen und mit 10ml A.dest gewaschen. Der Wasch- und Trockenprozess wurde nachfolgend zweimal wiederholt,um die Detergenzreste vollständig zu entfernen.

2.3 ATR-FTIR-Spektroskopie

2.3.1 Infrarotspektroskopie

Die Infrarot-(IR)Spektroskopie ist eine absorptionsspektroskopische Methode, bei der dieProben mit Infrarotstrahlung mit Wellenlängen von 1µm - 1mm bestrahlt werden. DieAbsorption der Infrarotstrahlung führt zur Schwingungsanregung von Molekülen, wobeinur diejenigen Schwingungsmoden angeregt werden, bei denen sich das Dipolmoment des

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Moleküls während der Schwingung ändert. Vereinfacht kann die Absorptionsfrequenz ei-nes zweiatomigen Moleküls anhand des Modells des harmomischen Oszillators nach Gl.2.2 berechnet werden. Dieses Konzept der klassischen Mechanik beschreibt die Abhängig-keit der Frequenz ν von der Federkonstante k (der Bindung) und der reduzierten Massedes Systems µ (Moleküls), wobei sich die reduzierte Masse aus den Einzelmassen m1 undm2 der beteiligten Atome nach Gl. 2.3 berechnet.

ν = 12π ·

√k

µ(2.2)

µ = m1 ·m2m1 +m2

(2.3)

In diesemModell ist das Bindungspotential durch eine Parabel mit äquidistanten Energie-niveaus beschrieben. Da es jedoch bei einer starken Stauchung der Bindung zu einer sehrgrossen Abstossung der Atome und bei einer starken Dehnung zum Bruch der Bindungkommt, ist das Modell nur eine erste Nährung für Bindungen mit geringer Auslenkung.Ein realistischeres Modell, das die abstossenden und dissoziativen Anteile mit einbezieht,ist das Modell des anharmonisches Oszillators.

2.3.2 Fourier Transform IR-Spektroskopie

Abbildung 2.1: Schematischer Aufbau von IR-Spektrometern. A: Dispersives Spektrometer bei demdie spektrale Auflösung durch ein Gitter als dispersives Element erreicht wird. B: Beim Fourier Trans-form Spektrometer wird die spektrale Information durch das Michelson Interferometer generiert, alsInterferogramm aufgezeichnet und durch Fourier-Transformation in ein Spektrum gewandelt.

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Die Fourier-Transform- (FT) IR-Spektroskopie basiert auf der Verwendung eines Michel-son-Interferometers anstatt dispersiver Elemente wie Gitter oder Prismen zur Generie-rung von spektraler Information (Abb. 2.1A). Ein Michelson-Interferometer besteht imwesentlichen aus einem Strahlteiler, sowie einem festen und einem beweglichen Spiegel(Abb. 2.1B). Die IR-Strahlung der thermischen Strahlungsquelle, dem sog. Globar, wirdam Strahlteiler in zwei Teilstrahlen aufgeteilt, von denen einer am festen, der andeream beweglichen Spiegel reflektiert wird. Beide Strahlen werden am Strahlteiler wiedervereint, wobei sie miteinander interferieren, und durch die Probe zum Detektor geführtwerden. Die Interferenz der beiden Teilstrahlen ist hierbei von der Auslenkung des beweg-lichen Spiegels abhängig, wobei je nach Position des Spiegels andere Wellenlängen positivoder negativ interferieren. Die spektrale Information ist daher im spiegelpositionsabhän-gigen Detektorsignal, dem sog. Interferogramm enthalten. Durch Fourier-Transformationdes Interferogramms wird das IR-Spektrum des Detektorsignals, das sog. Einkanalspek-trum berechnet. Aus den Einkanalspektren bei verschiedenen Proben oder Probenzu-ständen lassen sich gemäss dem Lambert-Beerschen Gesetz die Extinktionsspektren bzw.Differenzextinktionsspektren berechnen.

Tabelle 2.5: Messparameter der FTIR-Spektrometer. Die Anzahl der Scans pro Spektrum und derzeitliche Ablauf der Messungen ist bei den jeweiligen Experimenten aufgeführt.

Parameter Tensor27 IFS66 Vertex80V

Abtastrate 20 kHz 160 kHz 80 kHzAufnahmemodus double sided forward backwardAuflösung 2 cm−1

Messbereich 4000 - 900 cm−1

Blende 4 - 5mm (2mm bei Aquaspec-Messungen)Signalverstärkung 2 - 4 (0 bei Aquaspec-Messungen)Phasenauflösung 16 cm−1

Phasenkorrektur MertzZerofilling 4Apodisation Blackman-Harris 3-TermFaltungsgrenze 5266 (15800 cm−1 bei Aquaspec-Messungen)

Fourier-Transform Infrarotspektrometer haben gegenüber dispersiven Geräten folgendeVorteile:

Jaquinot-Vorteil Da bei der Verwendung eines Interferometers anstatt eines Gitters einhöherer Lichtfluss erreicht wird, ist die detektierte Stahlungsintensität höher, waszu einem besseren Signal-Rausch-Verhältnis führt.

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Fellget bzw. Multiplexvorteil-Vorteil Alle Frequenzen werden zugleich gemessen, wasdie Messzeit für ein Spektrum erheblich reduziert.

Connes bzw. Linearitätsvorteil-Vorteil Durch die parallele Verwendung eines Kalibrati-onslasers ist die Position des beweglichen Spiegels sehr genau bestimmbar, was zueiner hohen Wellenzahlgenauigkeit führt.

Die in dieser Arbeit durchgeführten FTIR-Messungen wurden abhängig von der verwen-deten Messtechnik und des benutzten Spektrometers mit den in Tab. 2.5 aufgeführtenParametern durchgeführt.

2.3.3 Attenuated total reflection FTIR-Spektroskopie

Die Technik der abgeschwächten Totalreflektion (ATR) ist eine Art der Probenaufnahme,bei der der Infrarotstrahl innerhalb eines Medium mit hohem Brechnungsindex, deminternen Reflektionselement (IRE), reflektiert wird und die Probe in Kontakt mit demIRE ist. An der Grenzfläche zwischen Probe und IRE, an der die Reflektion stattfindet,überlagern sich die „kommenden“ und die bereits reflektierten Strahlen und erzeugen soeine stehende Welle. Dieses elektromagnetische Feld existiert auch ausserhalb des IREs,wobei seine Intensität E mit steigendem Abstand z von der Oberfläche exponentiellabfällt (Gl. 2.4, Abb. 2.2).

Abbildung 2.2: Schematische Dar-stellung des evaneszenten Feldes. Dasevaneszente Feld an der Oberfläche desIREs wird durch die stehende Welleim Inneren des IREs hevorgerufen.Die Intensität des Feldes nimmt mitwachsendem Abstand von der Oberflächeexponentiell ab. Die Eindringtiefe dp (E= 37%) beträgt bei Verwendung einesGe-IREs, H2O als Medium und einer Fre-quenz von 1140 cm−1 (=̂ 8,8µm) 550 nm(siehe Abbildung). Zu beachten ist, dassdie Wellenlänge vom Brechungsindexabhängt und daher im IRE λIRE = λ/n1= 2,2µm beträgt. (nach Goormaghtighet al. (1999))

E = E0 · e−z/dp (2.4)

32


Die Eindringtiefe dieses sog. evaneszenten Feldes in das Außenmedium, dp (depth ofpenetration) ist von den Brechungsindices des IRE (n1) und des Mediums (n3), demEinstrahlwinkel (θ) und der Wellenlänge (λ) abhängig und ist definiert als der Abstand,bei dem die Amplitude auf ca. 37% abgefallen ist.

dp = λ/n1

2π√

sin2 θ − (n3/n1)2(2.5)

In dieser Arbeit wurden vorwiegend Germanium-IREs (n1 = 4), H2O als Medium (n3 =1,33), und ein Einstrahlwinkel von 45 ° verwendet, was bei einer Frequenz von 1650 cm−1

(=̂ 6,06µm) eine Eindringtiefe dp von 386 nm ergibt.

Die Moleküle der Probe und des Mediums können durch das evaneszente Feld ange-regt werden und somit IR-Strahlung absorbieren. Dies führt dazu, dass die absorbiertenFrequenzen im Spektrum des reflektierten Strahls geringere Intensitäten aufweisen undbildet damit die Grundlage, die ATR-Technik in der Absorptionsspektroskopie zu nut-zen. Die mit ATR-Technik erhaltenen Spektren können aufgrund der Nutzung des eva-neszenten Feldes einige Unterschiede zu den in Transmission aufgenommenen Spektrenaufweisen. Diese Unterschiede sind:

normale Dispersion Für flüssige Proben oder Probenschichten, die dicker als das eva-neszente Feld sind gilt, dass die Eindringtiefe das gemessene Probenvolumen unddamit auch die Höhe der Absorption bestimmt. Da dp bei kleinen Wellenlängengeringer ist, besitzen z.B. Banden bei 1000 cm−1 (10µm, dp = 638 nm) 1,65-fach hö-here Absorptionen als Banden bei 1700 cm−1 (5,9µm, dp = 386 nm). Dieser Effekt,normale Dispersion genannt, ist leicht durch Skalierung mit der wellenlängenab-hängigen Funktion von dp zu korrigieren.

anormale Dispersion Der Brechungsindex einer Probe ist im Bereich ihrer Absorptions-banden nicht konstant, so ist er ist an der höherfrequenten Seite einer Absorptions-bande geringer als auf der niederfrequenten Seite. Da dp bei kleineren Brechungs-indexes des Mediums geringer ist, führt dies zu verzerrten Absorptionsbanden mitvergrössertem niederfrequenten und verkleinertem höherfrequenten Anteil. DieserEffekt lässt sich nur mit Kenntnis des wellenlängenabhängigen Brechungsindex derProbe oder durch die Kramers-Kroning-Transformation korrigieren (Fringeli et al.(2002); Goormaghtigh et al. (1999)).

33


Bei Schichtdicken von > 0,1 × dp und schwach absorbierenden Proben kann nach Harrick(1967) und Fringeli et al. (2002) die thin-film (Dünnfilm-) und weak absorber Approxi-mation verwendet werden. Diese aus den Fresnelschen Gleichungen hergeleitete Vereinfa-chung besagt, dass die Probenabsorptionsbanden unabhängig vom Brechnungsindex derProbe sind. Dies bedeutet, dass Spektren von dünnen Schichten keine Verzerrungen auf-weisen und daher mit Spektren aus Transmissionsmessungen verglichen werden können.Die in dieser Arbeit analysierten Proben wiesen Schichtdicken im Bereich von 10 nm aufund konnten daher mit der Dünnfilm-Approximation ausgewertet werden.

Auch bei der Dünnfilm-Approximation muss jedoch der wellenlängenabhängige Bre-chungsindex des Mediums zur Berechnung verwendet werden, da es bei Überlagerungenvon Absorptionsbanden der Probe (z.B. AmidI) und intensiven Banden des Mediums(z.B. δ(H2O)) dennoch zu Verzerrungen von Probenbanden kommen kann. Diese Verzer-rungen kommen zustande, da die Startintensität E0 des evaneszenten Feldes (Gl. 2.4)eine Funktion der Brechungsindices ist, wie im Folgenden weiter beschrieben wird.

2.3.4 Linearpolarisation

Abbildung 2.3: Zusammenhang zwi-schen der Polarisation des evaneszentenFeldes (Ex, Ey ,Ez) und der Polarisationder eingekoppelten IR-Strahlung (Epp,Evp). Bei einem Einstrahlwinkel θ von45 ° haben sowohl Ex auch Ez Anteileder Intensität von Epp, während Ey nuraus Evp resultiert. Anisotrope Proben(Zylinder in Abb.) weisen eine gleicheAusrichtung in x- und y-Richtung auf.

Die Proben, die mit ATR-FTIR-Spektroskopie untersucht werden, häufig Proteine undLipide, werden zumeist in mehreren Schichten oder einer Monolage auf der IRE Ober-fläche immobilisiert. Innerhalb dieser Schichten besitzen die Probenmoleküle oft eine be-stimmte molekulare Ausrichtung. Da die elektrischen Feldkomponenten des evaneszentenFeldes Ex, Ey und Ez unterschiedliche Intensitäten besitzen, das evaneszente Feld an sichalso polarisiert ist, führt die unterschiedliche molekulare Ausrichtung der absorbierendenDipolmomente zu unterschiedlichen Absorptionsbanden. Die orientierungsabhängige Ab-sorption A ergibt sich durch

A = k⟨(M · E)2⟩ (2.6)

34


wobei k eine Konstante, M (Mx, My, Mz) der Vektor des betrachteten Übergangsdipol-moments und E (Ex, Ey, Ez) die elektrischen Feldvektoren des evaneszenten Feldes ist(Marsh (1999)). Nach der Dünnfilm-Approximation werden die elektrische Feldkompo-nenten Ex, Ey und Ez mit n31 = n3/n1 und n32 = n3/n2 wie folgt berechnet (Harrick(1967); Fringeli et al. (2002)):

Ex = 2 cos θ√

sin2 θ − n231√

1− n231√

(1 + n231) sin2 θ − n2

31(2.7)

Ey = 2 cos θ√1− n2

31(2.8)

Ez = 2 cos θ sin θ − n232√

1− n231√

(1 + n231) sin2 θ − n2

31(2.9)

Im Falle der Dickfilm-Approximation, bei der die Probenschicht sehr viel dicker als dasevanszenten Feld sein muss, können die Feldkomponenten in ähnlicher Weise berechnetwerden, indem nur die Brechungsindices des Kristalls und der Probe berücksichtigt wer-den. Hierbei wird n3 in den Gleichungen 2.7, 2.8 und 2.9 durch n2 substituiert. Allerdingswird für die Auswertung nach der Dickfilm-Approximation wiederum die Kenntnis deswellenlängenabbhängigen Brechnungsindex der Probe benötigt.

Da das evaneszente Feld an sich polarisiert ist, sind die Absorptionsbanden der Proben-spektren aus einem Absorptionsanteil und einem Orientierungsanteil zusammengesetzt.Dies ist bei Verwendung von unpolarisierter IR-Strahlung zunächst ein gravierenderNachteil, eröffnet jedoch bei Verwendung von linearpolarsierter IR-Strahlung die Mög-lichkeit, sowohl das Spektrum als auch die Orientierung des Probenmoleküls zu ermit-teln. Bei der polarisierten ATR-FTIR-Spektroskopie (PATR-FTIR) wird IR-Strahlung,die parallel zum Lot des IREs polarisisiert ist (Epp), und solche die vertikal zum Lotpolarisiert ist (Evp) in das IRE eingekoppelt (Abb. 2.3). Die elektrischen Feldvektorendes evanszenten Feldes setzen sich in unterschiedlichem Maße aus der eingekoppeltenStrahlung zusammen. So baut Strahlung in vp-Richtung nur die Ey-Komponente auf,während die Komponenten Ex und Ez beide aus Epp hervorgehen. Dadurch, dass dieimmobilisierten Moleküle gegenüber dem Lot des IREs rotationssymmetrisch sind, alsoMx und My nicht zu unterscheiden sind, können Orientierungsinformationen aus denEinzelspektren App und Avp extrahiert werden.

35


Es werden im Folgenden drei Möglichkeiten beschrieben, Orientierungsinformationenaus polarisierten Spektren zu extrahieren. Es werden die Berechnung von orientiertenSpektren, von dichroitischen Differenzspektren und Ordnungsparametern beschrieben.

2.3.4.1 Orientierte Spektren

Abbildung 2.4: Orientierte Spektren. Struktur- (a und c) und Orientierungsänderungen (b und d)haben beide Anteil am unpolarisiert gemessenen Spektrum (Aunpol). Die orientierten Spektren enthaltennur spektrale Komponenten der Absorption in xy- und z-Richtung (Ax,y und Az). Das isotrope Spektrum(Aiso) enthält nur das Signal der Strukturänderung. Bei c und d sind die spektralen Anteile der beidenSchwingungsmoden A und E1 im AmidI- und AmidII-Bereich gezeigt (aus Lórenz-Fonfría et al. (2009))

Abb. 2.4 verdeutlicht die Auswirkung von Orientierungsänderungen (b und d) und Struk-turänderungen (a und c) auf die unpolarisiert gemessenen ATR-Spektren (Aunpol, Lórenz-Fonfría et al. (2009)). Durch die Berechnung von Spektren, die ausschliesslich der Ab-sorption in xy- und z-Richtung entsprechen, ist der Orientierungseffekt gut von derAuswirkung der Strukturänderung zu trennen. Demgegenüber ist im Aiso-Spektrum nurInformation über die Strukturänderung enthalten (Abb. 2.4).

Die orientierten Spektren Ax,y, Az und Aiso ergeben sich aus den mit parallel und vertikalpolarisierter Strahlung gemessenen Spektren App(ν) und Avp(ν) und den Feldkomponen-ten Ex,Ey und Ez nach Gl. 2.10, 2.11 und 2.12. Hierbei steht f für die sog. Polarisa-torineffizienz, die nach Gl. 2.20 berechnet wurde, und mit Hilfe derer die Spektren um

36


den technisch bedingt nie 100%igen Polarisationsgrad korrigiert werden (Lórenz-Fonfríaet al. (2009)).

Ax,y = Avp(1− f)−AppfE2y(1− 2f) (2.10)

Az =App(E2

y(1− f) + E2xf)−Avp(E2

x(1− f) + E2yf)

E2yE

2z (1− 2f) (2.11)

Aiso = (Az + 2Ax,y)3 (2.12)

2.3.4.2 Dichroitische Differenzspektren

Als experimentelles dichroitisches Verhältnis Rexp wird der Quotient der Absorption inpp und vp bezeichnet. Für eine isotrope Probe ist dieser Quotient lediglich von denIntensitäten der Feldkomponenten abhängig und wird dann Riso genannt (Gl. 2.13).Mit Kenntnis des Riso kann das dichroitische Differenzspektrum D∗ nach Fringeli et al.(2002) und Bechinger et al. (1999) mittels Gl. 2.14 berechnet werden.

Riso = E2x + E2

z

E2y

(2.13)

D∗ = App −Riso ×Avp (2.14)

Das dichroitische Differenzspektrum entspricht bei isotroper Ausrichtung einer Nullline,bei Ausrichtung parallel zum Lot des IRE besitzt es positive und bei vertikaler Ausrich-tung negative Banden.

2.3.4.3 Ordnungsparameter

Der Ordnungsparameter S ist als ein Maß für die Orientierung in Bezug zu einer Re-ferenzrichtung zu verstehen. Bei paralleler Ausrichtung nimmt S einen Wert von 1 an,bei Ausrichtung in einem Winkel θ von 90 ° ist S -0,5. Bei isotroper Orientierung oderAusrichtung im magischen Winkel von θ = 54,7 ° ist S = 0.

S = 3cosθ − 12 (2.15)

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Der Ordnungsparameter eines Moleküls oder einer Molekülgruppe lässt sich experimen-tell aus dem dichroitischen Verhältnis Rexp mit Kenntnis der elektrischen Feldkomponen-ten Ex, Ey und Ez und des Winkels α zwischen dem Dipolvektor und der Molekülachsebestimmen.

S =2(E2

x −RexpE2y + E2

z )(3 cos2 α− 1)(E2

x −RexpE2y + 2E2

z ) (2.16)

Abbildung 2.5: Verschachteltes Ordnungsparametermodell. Der Winkel β zwischen der Molekülachseund dem Lot des IREs ist die zu ermittelnde Grösse. Die Winkel α, β und γ des Modells entsprechenjeweils einem Ordnungsparameter, das Produkt der Ordnungsparameter entspricht dem experimentellbestimmten Ordnungsparamter (verändert nach Goormaghtigh et al. (1999)).

Aus dem Anhand von Gl. 2.16 ermittelten Ordnungsparameter S kann durch Umformungvon Gl. 2.15 die Molekülausrichtung als Winkel der berücksichtigten Gruppen gegen dieIRE-Normale berechnet werden (Gl. 2.17).

θ = arccos√

2S + 13 (2.17)

Da der Ordnungsparameter eine Ausrichtungsverteilung gegenüber dem Messkoordina-tensystem darstellt, sich zwischen den interessierenden Molekülgruppen und dem IREjedoch zumeist eine Lipidmembran befindet, deren Ordnung auch durch perfekte Anord-nung des Proteins nicht „überboten“ werden kann, wird ein verschachteltes sog. nested

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Modell verwendet (Gl. 2.18, Abb. 2.5, Rothschild und Clark (1979); Goormaghtigh undRuysschaert (1990)).

S = SMembranSStrukturSDipol (2.18)

2.3.4.4 Oberflächenkonzentration

Oft wird in ATR-FTIR-spektroskopischen Experimenten die Probe in situ durch Adsorp-tion an die Oberfläche des IREs präpariert. Das bedeutet, dass die Probenkonzentration,anders als bei Transmissionsexperimenten zunächst nicht bekannt ist. Da jedoch oft erstdie genaue Kenntnis des Probenzustand die Interpretation der Ergebnisse erlaubt, wird inATR-Experimenten die Oberflächenkonzentration der Probe berechnet. Die Oberflächen-konzentration Γ ist als Projektion der Volumenkonzentration innerhalb des evaneszentenFeldes – skaliert mit der abstandsabhängigen Feldstärke (E(z)) – auf die Fläche des IREzu verstehen. Die Berechnung von Γ erfolgt analog zum Lambert-Beerschen Gesetz ausder Extinktion, wobei meist die Bandenfläche (A) verwendet wird, dem Extinktionsko-effizienten und der Schichtdicke (d). Die Schichtdicke eines ATR-Experiments korreliertmit der Eindringtiefe des evaneszenten Feldes multipliziert mit der Anzahl der inter-nen Reflektionen (N). Der Anteil der Eindringtiefe kann hierbei wiederum mit Kenntnisder Brechnungsindices des IREs (n1) und der Probe (n2) und der Feldkomponenten(Ex,Ey,Ez) berechnet werden. Damit lässt sich die Oberflächenkonzentration für eineisotrope Probe nach der Dünnfilm-Approximation nach Gl. 2.19 berechnen (Tatulian(2003)).

Γ = Appn12 cos θnRNε(E2

xE2z ) = Avpn12 cos θ

nRNε(E2y) (2.19)

Die in dieser Arbeit verwendeten Exinktionskoeffizienten, die Anzahl der internen Re-flektionen, sowie alle anderen Parameter sind in Tab. 2.6 aufgelistet. Die Anzahl dereinzuberechnenden Gruppen nR richtet sich danach, worauf sich der jeweilige Extinkti-onskoeffizient bezieht.

Aus der Formel der Oberflächenkonzentration wird deutlich, dass die Schichtdicke ineinem ATR-Experiment durch das Material des IREs, den Einstrahlwinkel und die An-zahl der internen Reflektionen sehr gut definiert ist. Die Schichtdicke der Probe ist beiIR-Messungen mit wässigen Lösungen ein wichtiger Parameter, da H2O im Bereich derAmidI-Bande eine starke Absorption aufweisst, die bei Schichtdicken ab ca. 10µm zur

39


Totalabsorption führt. Jedoch steigt auch das Probensignal linear mit der Anzahl derinternen Reflektionen, und bei der Dickfilm-Konfiguration auch linear mit der Eindring-tiefe, so dass sich ein Optimum zwischen zu wenig Signal und Übersättigung durch dieH2O-Absorption ergibt. Dieses Optimum kann durch die Wahl der o.g. Parameter ineinem ATR-Experiment hervorragend erreicht werden.

2.3.5 Polarisatorineffizienz

Der Polarisationsgrad eines realen Versuchsaufbaus ist abhängig vom verwendeten Po-larisator und der Geometrie des Strahlenganges, und daher niemals 100%ig. Zwar hatder Polarisationsgrad einen Einfluss auf die Berechnung der Oberflächenkonzentration(Gl. 2.19), der Ordnungsparameter (Gl. 2.16), des Riso (Gl. 2.13) und der orientiertenSpektren (Axy, Az und Aiso, Gl. 2.10, 2.11, 2.12), kann aber für den jeweiligen Aufbaubestimmt und zur Korrektur verwendet werden. Nimmt man einen Polarisationsgrad von100% an, ergibt sich für den Riso einer isotrope Probe bei Dickschicht-Approximation einWert von 2. Daher kann aus dem experimentell bestimmten Risoexp, dem Einstrahlwinkelθ und den Brechungsindices von IRE und Medium (n1 und n3) die sog. Polarisatorinef-fizienz bestimmt werden (Lórenz-Fonfría et al. (2009)).

f = n23(Risoexp − 1)− [Risoexp(n2

3 + n21)− 2n2

1] sin2 θ

[Risoexp(n21 − n2

3)− n23] sin2 θ + n2

3(2.20)

Die Polarisatorineffizienz des in dieser Arbeit verwendeten Aufbaus (siehe 2.4) wurdeexperimentell bestimmt. Hierzu wurden für eine komplette Polarisatorumdrehung um360 ° in 1 ° Schritten Absorptionsspektren einer Natriumazidlösung (10mM NaN3 in A.dest) aufgenommen. Anschliessend wurde die N3-Absorptionsbande bei 2049 cm−1 (Abb.2.6A) integriert und das normierte Integral gegen den Winkel aufgetragen (Abb. 2.6B).Der Maximalwert wurde als 0 ° bzw. pp definiert, der Minimalwert bei 90 ° entspricht vp.Damit ergibt sich ein Risoexp von δApp/δAvp = 0,99/0,51 = 1,94 ± 0,01. Mit diesem Wertfür Risoexp, einem θ von 45 ± 2 °, n1 = 4 ± 0,1 und n2 = 1,32 ± 0,06 wurde nach Gl. 2.20eine Polarisatorineffizienz des verwendeten Aufbaus von f = 0,034 ± 0,008 bestimmt.

Da die Polarsatorineffizienz für den jeweiligen Aufbau konstant ist, können nach einma-liger Ermittlung von f die idealen, korrigierten Werte für AppIdeal und AvpIdeal aus den

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Abbildung 2.6: Polarisatorineffizienz des verwendeten Aufbaus. A: Absorptionsspektren von Natriu-mazid (10mM NaN3), das als isotrope Probe verwendet wurde bei 0 ° und 90 ° Polarisation. B: Integraleder N3-Bande aufgetragen gegen den Polarisatorwinkel. Der Winkel mit der grössten Absorption wurdeals 0 ° bzw. pp definiert, der mit der geringsten Absorption entspricht 90 ° bzw. vp.

Messwerten App und Avp berechnet werden. Der Unterschied zwischen den gemessenenund den idealen Werten lag bei 3%.

AppIdeal = (App + fAvpIdeal)/(1− f) (2.21)

AvpIdeal = (Avp + fAppIdeal)/(1− f) (2.22)

2.3.6 Berechnungen

In dieser Arbeit wurden die Dichroitischen Differenzspektren (D∗, 2.3.4.2), Ordnungspa-rameter (S, 2.3.4.3), Oberflächenkonzentrationen (Γ, 2.3.4.4) und Orientierte Spektren(Ax,y, Az, Aiso, 2.3.4.1) mit einem eigens programmierten Perl-Skript berechnet. In die-sem Skript wurden alle o.g. Formeln in Unterroutinen implementiert und je nach Art derBerechnung hintereinander aufgerufen. Im Folgenden wird der Ablauf der verschiedenenBerechnungen erklärt:

D∗ Feldkomponenten mit Gl. 2.7, 2.8 und 2.9 berechnet → Ergebnis zur Berechnungvon Riso in Gl. 2.13 eingesetzt→ f mit Gl. 2.20 berechnet und die Extinktionswertezur Korrektur in Gl. 2.21 und 2.22 eingesetzt→ Korrigierte Extinktionen und Risoin Gl. 2.14 eingesetzt; Berechnung für jeden Extinktionswert des Spektrums mitwellenzahlabhängigem n3; Keine Fehlerrechnung.

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S Feldkomponenten mit Gl. 2.7, 2.8 und 2.9 berechnet → f mit Gl. 2.20 berechnetund integrierte Extinktionen zur Korrektur in Gl. 2.21 und 2.22 eingesetzt →Korrigierte integrierte Extinktionen und Feldkomponenten in Gl. 2.16 eingesetzt;Alle Parameter mit Standardabweichung eingesetzt; Fehlerrechnung mit MonteCarlo Methode.

Γ Feldkomponenten mit Gl. 2.7, 2.8 und 2.9 berechnet → f mit Gl. 2.20 berechnetund integrierte Extinktionen zur Korrektur in Gl. 2.21 und 2.22 eingesetzt →Feldkomponenten und korrigierte integrierte Extinktionen in Gl. 2.19 eingesetzt;Alle Parameter mit Standardabweichung eingesetzt; Fehlerrechnung mit MonteCarlo Methode.

Ax,y, Az, Aiso Feldkomponenten mit Gl. 2.7, 2.8 und 2.9 berechnet→ f mit Gl. 2.20 be-rechnet und integrierte Extinktionen zur Korrektur in Gl. 2.21 und 2.22 eingesetzt→ Feldkomponenten und f in Gl. 2.10, 2.11 und 2.12 eingesetzt; Berechnung fürjeden Extinktionswert des Spektrums mit wellenzahlabhängigem n3; Keine Fehler-rechnung.

Bei der Berechnung von Γ und S wurde eine Fehlerrechnung nach der Monte CarloMethode durchgeführt (Metropolis und Ulam (1949); Lórenz-Fonfría et al. (2009)). Die-se Methode basiert darauf, dass für jede Eingangsgrösse der Berechnung entsprechendihrem Wert und ihrer Standardabweichung normalverteile Zufallswerte, sog. Realisatio-nen generiert werden. Diese Realisationen werden anstatt der Eingangsgrössen in dieBerechnung eingesetzt, wodurch sich nach vielfachem Wiederholen dieser Prozedur eineNormalverteilung der Ergebnisse ergibt. Das Endergebnis der Rechnung entspricht daherdem Mittelwert und der Standardabweichung der berechneten Verteilung. Diese Methodezur Fehlerberechnung erspart das partielle Ableiten des Gleichungssystems und ermög-licht so die flexible Kopplung der einzelnen Unterroutinen. Die Monte Carlo-Methodewurde ebenfalls als eine Unterroutine in das o.g. Perl-Skript implementiert und so ange-wandt, dass zuerst von allen Eingangsgrößen Realisationen berechnet wurden, die dannden jeweiligen Unterroutinen zur Ergebnisberechnung übergeben wurden. Dieser Ablaufwurde 105 mal wiederholt, was auf einem Desktopcomputer (Intel Core 2 Duo, 2,53GHz)ca. eine Sekunde dauerte.

Der verwendete AmidII-Extinktionskoeffizient wurde anhand von BSA- und Lysozymlö-sungen bekannter Konzentrationen durch Transmissionsmessung unter Verwendung derAquaspec-Zelle bestimmt (2.5). Die Konzentrationen der Proteinlösungen wurden zuvoranhand der E280 und publizierten Extinktionskoeffizienten (Venyaminov und Prendergast

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Tabelle 2.6: Verwendete Extinktionskoeffizienten und Brechungsindices

Name Bereich (cm−1) Wert SD Quelle

Extinktionskoeffizienten (cm/mol)

ν(OH) 3760 - 2990 3,47×107 6,94×104 a

ν(CH) 2990 - 2812 1,32×105 1,32×103 b

AmidII 1600 - 1485 9,5×106 2,9×105 c

Brechungsindices

Lipid 1,43 0,14 b

Protein 1,45 0,05 d

Ge-IRE 4000 - 2800 4,035 0,003 e

1800 - 1400 4,012 0,001 e

H2O 3760 - 2990 1,321 0,142 a

2990 - 2812 1,417 0,013 a

1780 - 1705 1,274 0,011 a

1600 - 1485 1,347 0,011 a

a Max und Chapados (2009), berechnet anhand des publizierten H2O-Spektrums und der Extinktionskoeffizienten.

b Tatulian (2003), Die SD wurde mit 1% angenommen.c Der AmidII-Extinktionskoeffizient wurde mit Proteinlösungen be-kannter Konzentrationen selbst ermittelt (siehe Text).

d Reiter et al. (2004)e Frey et al. (2006)

(1997)) bestimmt. Die Schichtdicke der Aquaspec-Zelle wurde anhand der Extinktion derH2O-Biegeschwingung und des publizierten Extinktionskoeffizienten auf 6,8 ± 0,2µm be-stimmt (Max und Chapados (2009)). Weitere in den Berechnungen verwendete Wertewaren die Anzahl der internen Reflektionen des IRE von 12±1. Ein IRE mit den Maßen52×2×20mm und 45 ° hat theoretisch 13 Reflektionen, durch den Silikonspacer fehltjedoch die Fläche von ca. einer Reflektion. Die Anzahl der Residuen (nR) des lipidiertemRas ist 189.

2.4 Neue Messaufbauten

2.4.1 Ventrobot

Das verwendete Durchflusssystem bestand bei Beginn der Arbeit lediglich aus der ATR-Küvette inkl. Schlauch und einer Schlauchpumpe. Um die Reproduzierbarkeit und die

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Abbildung 2.7: Verwendetes Messsystem. Das Durchflusssystem bestand aus der ATR-Küvette, einerSchlauchpumpe (P), der Ventilsteuerung „Ventrobot“ und fünf Reservoiren (A-E). Über Ventrobot wur-den die acht Drei-Wege-Magnetventile des Durchflusssystems angesteuert. Polarisierte Messungen wur-den mit der Polarisatorautomatisierung „Dichrobot“ durchgeführt. Die Pumpe, Ventrobot und Dichrobotwurden über die serielle Schnittstelle aus dem Messprogramm OPUS heraus angesteuert.

Ausfallsicherheit der Experimente zu erhöhen, wurde das automatisiertes Durchfluss-system „Ventrobot“ entwickelt (Abb. 2.7). Ventrobot wird über die serielle Schnittstel-le durch das Messprogramm OPUS angesteuert und ermöglichte es, zuvor unmöglicheMessabläufe zu realisieren, wie z.B. der Wechsel zwischen mehreren Lösungen im Mi-nutentakt über Nacht. Ausserdem ist es mit diesem System möglich, zwei beliebige derfünf ankoppelbaren Lösungen (A - E) im Durchfluss in beliebigen Mischungsverhältnis-sen zu mischen (1% Schritte von 10 - 90%). Die Mischung von zwei Lösungen wirdhierbei durch Pulsweitenmodulation (PWM) mit einer minimalen Öffnungszeit der ver-wendeten Magnetventile von 100ms erreicht. Die Linearität dieses Verfahrens wurde

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durch Mischung einer 10mM NaN3-Lösung mit A. dest nachgewiesen (Abb. 2.8). Des-weiteren kann der Aufbau auch im zirkulierenden, statt im Durchfluss-Modus betriebenwerden, was Proteinanlagerungsexperimente ermöglicht, für die ansonsten einige 100mlProteinlösung gebräucht würden.

Abbildung 2.8: Linearität der Mischung mit Ventrobot mittels Pulsweitenmodulation (PWM). A: Ki-netiken der Bandenfläche der N3-Bande von Natriumazid in A. dest bei verschiedenen Mischungsverhält-nissen. Die Mischung wurde im Durchfluss durch PWM an Ventil 1 (siehe Abb. 2.7) erreicht. B: Ban-denfläche der N3-Bande aufgetragen gegen die eingestellte N3-Konzentration. Die Methode der PWMermöglicht ein über einen großen Mischbereich lineares Mischungsverhältnis.

2.4.2 Dichrobot

Ein weiterer Aufbau, der im Rahmen dieser Arbeit entwickelt wurde, ist eine Polarisator-automatisierung, der sog. „Dichrobot“. Das Gerät fährt einen KRS-5-Goldgitterpolarisatorin den Strahlengang oder aus dem Strahlengang heraus und dreht den Polarisator miteiner Winkelauflösung von 0,25 °. Auch dieser Aufbau wird über die serielle Schnittstelleüber das Messprogramm OPUS angesteuert.

Ventrobot und Dichrobot wurden in der Feinmechanikwerkstatt der Fakultät für Biolo-gie von Christoph Pinske gebaut. Die zur Ansteuerung der Ventile und Schrittmotorennotwendige Elektronik wurde von Harald Chorongiewski (LS für Biophysik, Ruhr Uni-versität Bochum) entworfen und gebaut.

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2.5 Transmissions FTIR-Spektroskopie von Proteinen inLösung

Die Messungen von Proteinen in Lösung wurden mit der Aquaspec-Zelle durchgeführt.Die Aquaspec-Zelle ist eine Durchflusszelle, die aus zwei im Abstand von 6µm verkleb-ten Calciumfluoridfenstern besteht. Der Hohlraum fasst 1µl und kann über eine Hamil-tonspritze beladen werden. Theoretisch lässt sich das interne Volumen der Zelle durchInjektion von 10µl Probenvolumen komplett austauschen. In der Praxis werden jedochmindestens 40µl benötigt, da beim Herausziehen der Spritze oftmals Luft in den vorgela-gerten Filter gerät, die zunächst durch die Zelle gespült werden muss. Die Aquaspec-Zelleist über einen Schlauchanschluss mit einen Kryostaten temperierbar; alle Messungen wur-den bei 20 °C durchgeführt.

Abbildung 2.9: Aquaspec-Zelle. DieDurchflusszelle wird mit einer Hamil-tonspritze beladen. Ein vollständigerFlüssigkeitsaustausch ist mit 10µlVolumen möglich. A: Aquaspec-Zellevon vorne, aus Richtung des Strahlen-gangs B: schematische Seitenansicht derAquaspec-Zelle. (aus Ollesch (2006))

Für die Messungen mit der Durchflusszelle wurden alle Puffer und wenn möglich auchProteinlösungen entgast und die Zelle vor der Messung mindestens 10× mit 50µl Puffergespült.

2.6 Sekundärstrukturanalyse mit FTIR-Spektroskopie

2.6.1 Grundlagen

Infrarotspektren von Proteinen weisen mehrere Banden auf, die charakteristisch für dieAbsorptionen des Proteinrückgrats sind. Diese sog. Amid-Banden (AmidA, AmidB undAmidI - V) resultieren aus unterschiedlichen, gekoppelten Schwingungsmoden der Peptid-gruppe, wobei die grössten Banden die AmidI- und AmidII-Bande sind. Die AmidI-Bande

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liegt zwischen 1700 und 1600 cm−1 und wird zu 76% durch die C=O-Streckschwingung,zu 14% durch die CN-Streckschwingung und zu 10% durch die CCN-Deformations-schwingung verursacht. Die AmidII-Bande, die zwischen 1600 und 1500 cm−1 liegt, wirddurch fünf Schwingungsmoden hervorgerufen, von denen die NH-Biegeschwingung (43%)und die CN-Streckschwingung (29%) den grössten Anteil haben (Krimm und Bandekar(1986)).

Da alle Amid-Banden durch Absorptionen der Peptidgruppe hervorgerufen werden, füh-ren unterschiedliche Sekundärstrukturen zu unterschiedlichen Absorptionsfrequenzen. Inden meisten Publikationen wird jedoch die AmidI-Bande zur Bestimmung von Sekun-därstrukturanteilen analysiert, da sie eine hohe Intensität aufweist und zum größtenTeil nur durch eine Schwingungsmode verursacht ist. Desweiteren ist diese Bande kaumvon Absorptionen der Aminosäureseitenketten überlagert und wenig von unterschiedli-chen Lösungsbedingungen abhängig, was eine vom Probenzustand nahezu unabhängigeAnalyse ermöglicht.

Tabelle 2.7: AmidI-Frequenzen der häufigsten Sekundärstrukturen. Die gezeigten Werte sind Richtwer-te und stammen aus Jackson und Mantsch (1995) sowie Arrondo et al. (1993) und stimmen mit den vonGoormaghtigh et al. (1994b) zusammengestellten Werten ± 3 cm−1 überein.

Sekundärstruktur AmidI-Frequenz / cm−1

Antiparalleles β-Faltblatt 1675 - 1695- Aggregierte SträngeTurns 1660 - 1685α-Helix 1648 - 1660Random Coil 1652 - 1660 (deuteriert: 1640 - 1648)a

β-Sheet 1625 - 1640Aggregierte Stränge 1610 - 1628a Bei Inkubation von Proteinen in deuterierten Puffern tauschen die lösungs-mittelexponierten Gruppen zuerst von H nach D aus.

Die Hauptabsorption der AmidI-Bande wird durch die C=O-Schwingung der Peptid-gruppe hervorgerufen, die ohne Interaktion mit dem Rest des Rückgrats bei ca. 1666 -1670 cm−1 absorbieren würde (Tatulian (2003); Jackson und Mantsch (1995)). Diese Fre-quenz wird durch die Ausbildung der jeweiligen Sekundärstrukturen so moduliert, dasssich die verschiedenen Absorptionsfrequenzen der einzelnen Sekundärstrukturelementeergeben. Den größten Anteil an der niederfrequenten Verschiebung der Bande (z.B. beiHelix und Faltblatt) hat die Kopplung der Übergangsdipolmomente der einzelnen CO-Gruppen (Torii und Tasumi (1992)). Diese Kopplung ist von der räumlichen Nähe unddemWinkel zwischen den CO-Gruppen abhängig und wird zu einem geringen Anteil auch

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durch die H-Brücken und kovalenten Bindungen beeinflusst (Brauner et al. (2005)). Aus-serdem führen H-Brücken zwischen der CO-Gruppe und den Peptid-NH-Gruppen, demLösungsmittel oder anderen H-Brückendonoren zu einer Verringerung der Kraftkonstan-ten der C=O-Bindung und damit zu einer Verschiebung der Absorption zu niedrigerenFrequenzen. Eine Verschiebung der Absorption zu höheren Frequenzen (z. B. bei Turn)kann durch sterische Behinderung der Tautomerie der Peptidgruppe erklärt werden, beider es zu einer zu einer Verschiebung in Richtung reiner C=O-Doppelbindung kommt(Jackson und Mantsch (1995)).

Abbildung 2.10: Schematische Darstellung der Bandenzerlegung. Unterschiedliche Sekundärstruktu-ren besitzen Absorptionsmaxmima bei unterschiedlichen Frequenzen innerhalb der AmidI-Bande. DieAnteile der einzelnen Sekundärstrukturen entsprechen den Flächen der jeweiligen Glockenkurven. DieZuordnung der Sekundärstrukturen zu den Frequenzen der Glockenkurven erfolgt anhand von Literatur-werten (Goormaghtigh et al. (1994b)).

Die Sekundärstrukturabhängigkeit der Absorptionsfrequenz wurde in dieser Arbeit ge-nutzt, um die Sekundärstruktur des Proteins Ras in verschiedenen Probenzuständen zuanalysieren. Die hierzu verwendete Methode der Bandenzerlegung beruht darauf, dieAmidI-Bande in einer least squares-Anpassung durch eine Summe von Glockenkurvenzu beschreiben (Byler und Susi (1986)). Das Ergebnis der Anpassung sind die Positionen(Frequenzen) und Flächen der einzelnen Glockenkurven, wobei anhand der Positionenzusammen mit Literaturwerten jeder Glockenkurve eine Sekundärstruktur zugewiesenwerden kann. Hierbei entspricht die Fläche der Kurven im Verhältnis zur Gesamtfläche

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aller Glockenkurven dem Anteil der einzelnen Sekundärstruktur an der Gesamtsekundär-struktur.

Da die Auswertung mittels Bandenzerlegung erheblich von den Startwerten und cons-traints der Anpassung abhängt, wurde von Goormaghtigh et al. (1994b) eine objektiveMethode der Zerlegung erarbeitet. Diese Methode wurde auch in dieser Arbeit eingesetztund ist im Folgenden ausführlich beschrieben.

2.6.2 Spektrenvorbereitung

Die Prozessierung der Spektren und die nachfolgende Bandenzerlegung wurde mit demProgrammpaket „Kinetics“ (Prof. Erik Goormaghtigh, ULB Brüssel) durchgeführt. DasProgramm basiert auf der Mathematiksoftware-Umgebung Matlab (The Mathworks Inc.)und wurde dem LS für Biophysik von Prof. Goormaghtigh freundlicherweile zur Verfü-gung gestellt. Zunächst wurden die Proteinspektren einer Wasserdampfkorrektur unter-zogen, bei der Dampfspektren benutzt wurden, die an der selben Probe aufgenommenwurden. Die Korrektur wurde mit dem Programm OPUS manuell durchgeführt, wobeidie H2O-Dampfbanden im Bereich von 1800 bis 1700 cm−1 (als Markerregion für den Ge-samtwasserdampf) durch skalierte Subtraktion eliminiert wurden. Anschliessend wurdendie Spektren durch Apodisation mit einer Gauss-Funktion der Halbwertsbreite 4 cm−1

geglättet und ein berechnetes Seitenkettenabsorptionsspektren subtrahiert. Das Seiten-kettenspektrum wurde durch „Kinetics“ anhand von Literaturdaten (Barth (2000)) alsLinearkombination von einzelnen Aminosäurespektren berechnet. Hierzu musste die je-weilige Anzahl der im AmidI- und AmidII-Bereich absorbierenden Aminosäuren, derenDeuterierungsgrad und der pD-Wert des Puffers angegeben werden. Das Seitenketten-spektrum wurde von der Software automatisch anhand der Tyrosin-Ringschwingung beica. 1515 cm−1 auf das Absorptionsspektrum des Proteins skaliert und davon subtrahiert.

2.6.3 Bandenzerlegung

Die Startpositionen für die Bandenzerlegung wurden mittels 2. Ableitung mit zusätz-licher Glättung um 4 cm−1 und durch Fourier-Selbstentfaltung (FSD, Fourier Self De-convolution) ermittelt, wobei die FSD mit Bandenbreiten von 13,6 cm−1 (Lorentz) und30 cm−1 (Gauss) berechnet wurde. Vor der Bandenzerlegung wurden die Spektren zwi-schen 1700 und 1600 cm−1 basislinienkorrigiert und auf eine AmidI-Bandenfläche von

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eins normiert. Als Startpositionen der Zerlegung wurden die Minima der zweiten Ablei-tung sowie die Maxima der Fourier-Selbstentfaltung verwendet. Andere Startwerte wiedie Bandenbreite und das Verhältnis von Lorentz- zu Gauss-Glockenkurve wurden mitLiteraturwerten initialisiert. Die Zerlegung wurde mit vier Banden und unterschiedlichenStartpositionen begonnen. In einem iterativen Verfahren wurde der Startparametersatzder Zerlegung (Position, Bandenbreite, Formfaktor (Gauss-Lorentz-Anteil) und Intensi-tät) so variiert, dass sowohl die Standardabweichung der Anpassungen, als auch die Wur-zel der summierten quadratischen Abweichungen (root mean square deviation, RMSD)zur 3D-Struktur minimiert wurde. Der RMSD-Wert wurde nach

RMSD =

√√√√ 1N

i=1∑i=N

δ2i , (2.23)

mit der Anzahl N der Sekundärstrukturelemente und der Differenz δ zwischen demErgebnis der Bandenzerlegung und der 3D-Struktur berechnet. Die Sekundärstruktu-ranteile der 3D-Struktur wurden mit dem Programm STRIDE (Frishman und Argos(1995)) ermittelt. Der so auf die 3D-Struktur von Ras kalibierte Parametersatz wurdezur Bandenzerlegung der AmidI-Bande des membrangebundenen lipidierten Ras verwen-det. Diese Zerlegung entsprach daher einer Intensitätsanpassung der Komponentenban-den und brachte damit den Vorteil einer direkten Vergleichbarkeit der Sekundärstrukturvon membrangebundenem Ras und Ras in Lösung.

2.7 Globale Anpassung von 3D-Spektren mit MCR-ALS

Die multivariate Kurvenanpassung mit alternating least squares Optimierung (MCR-ALS) wurde in dieser Arbeit verwendet, um Artefakte aus 3D-Differenzspektren zu fil-tern. Da die Differenzsignale von Proteinmonolagen sehr gering sind, haben Störungenwie Basisliniendrifts, Banden des Silikonspacers, Schwankungen der Wasserbandeninten-sität oder der Wasserdampfbanden erhebliche Auswirkungen auf die Differenzspektren.Da jedoch alle diese Störspektren zeitliche Verläufe besitzen, die unabhängig von demVerlauf des jeweiligen Proteindifferenzspektrums sind, können sie durch eine multivaria-te Datenauswertung vom Proteinspektrum getrennt werden. Die Kernidee der multiva-riaten Datenanalyse ist es, einen dreidimensionalen Datensatz z. B. ein zeitaufgelöstes

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Spektrum Dλ,t durch eine Summe von n Produkten von Komponentenspektren Sλ,k undKonzentrationsprofilen Ck,t zu beschreiben (Gl. 2.24, Abb. 2.11, Jaumot et al. (2004)).

Dλ,t =n∑k=1

Ck,tSλ,k +Rλ,t (2.24)

Hierbei ergibt die Multiplikation einer Spektrenkomponente mit ihrem Konzentrations-profil ein 3D-Spektrum, dass nur dieser Komponente entspricht. Bei Subtraktion allerermittelten Komponenten-3D-Spektren von den Rohdaten bleibt somit bei optimalerDatenanpassung nur das 3D-Spektrum des Rauschens (Rλ,t) über. Das Ergebnis einersolchen Auswertung besteht also aus den puren Spektren und Konzentrationsverläufenjeder Einzelreaktion.

Abbildung 2.11: Prinzip der MCR: Die Datenmatrix kann durch die Summe von n Produkten von Kon-zentrationsprofilen und Komponentenspektren und einer Residualmatrix, die das Rauschen der Messungenthält beschrieben werden.

MCR-ALS ist eine sog. soft modeling Methode, da keine physikalischen Modelle der ab-laufenden Reaktionen für die Anpassung vorgegeben werden müssen. Dies ermöglicht dieAnalyse von Daten, deren zugrundeliegenden Reaktionen noch unbekannt sind oder diewie die hier bearbeiteten Störsignale keinen erkennbaren Zusammenhang zu den experi-mentellen Parametern haben. Allerdings sind die berechneten Ergebnisse nicht eindeutigund die Stabilität der Ergebnisse kann nur durch Variation der Startparameter getestetwerden. Es besteht jedoch die Möglichkeit verschiedene Bedingungen (constraints) zusetzen, um den Variationsraum der anzupassenden Parameter zu verkleinern und so zueinem eindeutigeren Ergebnis zu gelangen. Folgende constraints können u.A. angewendetwerden:

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Non-negativity Die Komponentenspektren oder Konzentrationsprofile besitzen keine ne-gativen Werte. Dies gilt z. B. bei Spektren, die gegen einen nicht absorbierendenHintergrund gemessen wurden.

Unimodality Die Komponentenspektren besitzen nur eine Bande bzw. die Konzentrati-onsprofile nur ein Konzentrationsmaximum. Diese Bedingung ist z. B. für Elutions-verläufe von Chromatographien gültig.

Closure Die Summe der Einzelkonzentrationen bleibt während der Reaktion konstant,was z. B. aufgrund der Massenbilanz für geschlossene Systeme gilt.

Da die MCR-ALS-Auswertung mit einer zu grossen Anzahl von Startkomponenten zueiner Überanpassung der Daten führen kann (overfit), wurde die Anpasung mit einerunterschiedlichen Anzahl von Komponenten durchgeführt. Die Ergebnisse der verschie-denen Anpassungen wurden nach folgenden Kriterien beurteilt:

• Die charakteristischen Banden des Proteindifferenzspektrums sollten nur in dem je-weiligen Spektrum vorkommen und nicht durch mehrere Spektren beschrieben sein.Dazu gehört auch, dass die berechneten Spektren keine vorzeichenvertauschten Ko-pien voneinander sein sollten. Hierzu wurden die Spektren jeweils untereinanderund mit bekannten Spektren verglichen.

• Die berechneten Konzentrationsprofile sollten die Differenzextinktionssignale, de-ren Verlauf schon in den Rohdaten zu erkennen waren, zumindest reproduzieren.

• Geringes Rauschen im Proteindifferenzspektrum und in der dazugehörigen Kinetik.

• Statistische Kriterien für eine gelungene Anpassung der Daten sind die Standard-abweichung und das Bestimmtheitsmass (R2) der Anpassung.

Zur MCR-ALS-Auswertung wurde das Matlabprogramm „als2004“ (Jaumot et al. (2005))verwendet und die Auswertung wenn nicht anders beschrieben nach folgendem Schemadurchgeführt:

1. Zusammenstellen einer Rohdatenmatrix, spektrale Regionen mit hohem Rauschan-teil werden verworfen, die Spektren werden einer linearen Basislinienkorrektur odereiner Offset-Korrektur unterzogen.

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2. Extraktion von Differenzextinktionsverläufen bzw. Kinetiken bekannter Bandenvon eindeutig zuzuordnenden Zuständen/Prozessen (z.B. Wasserdampf, Hydroly-se). Diese Verläufe werden als Startkonzentrationsprofile verwendet. Zusätzlich wer-den bis zu sechs Startkonzentrationsprofile aus Zufallszahlen erstellt, die in derAnpassung sukzessive hinzugegeben werden.

3. Es werden keine Constraints gesetzt; die maximale Zahl der Iterationen wird auf500, und das Konvergenz-Kriterium auf 10−7 gesetzt. Die Daten wurden nichtnormiert.

4. Zunächst Berechnung der zu den Startwerten passenden Spektren, indem C nichtvariiert und S mit der least squares-Methode an die Daten D angepasst wird.

5. Fixierung der berechneten Spektren S, Anpassung von C und Berechnung desFehlers zu D

6. Die abwechselnde Anpassung der Spektren und Konzentrationsprofile (Schritt 4und 5) erfolgt, bis der vorgegebene Fehler unterschritten wird oder sich in 20Iteration nicht verringert hat.

7. Falls das Ergebnis nicht die Kriterien für eine gelungene Anpassung erfüllt (s.o.),wird die Anpassung erneut mit einer zusätzlichen Komponente gestartet.

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3 Ergebnisse und Diskussion

3.1 Herstellung einer festkörpergestützten Lipidmembran

3.1.1 Einleitung

Zur ATR-FTIR-Spektroskopischen Untersuchung von membranverankertem Ras musstezuerst ein geeignetes Messsystem etabliert werden, das die Untersuchung des Proteinsin Lipidmembranumgebung ermöglicht. Hierzu wurde die Methode der Vesikelspreitungverwendet, die es ermöglicht, eine festkörpergestützte Lipidmembran auf dem internenReflektionselement (IRE) zu generieren.

Diese Methode beruht darauf, dass kleine unilammelare Vesikel (SUVs, small unilamme-lar vesicles) beim Kontakt mit hydrophilen Oberflächen platzen und einen Lipidbilayerauf der Oberfläche ausbilden. Obwohl diese recht simpel erscheinende Methode seit Mit-te der 1980er Jahre Forschungsgegenstand ist, ist sie noch nicht komplett verstanden(Brian und McConnell (1984), Richter et al. (2006)). Grund dafür ist, dass die Vesikel-spreitung von vielen Parametern beeinflusst wird, deren quantitativer Einfluss zumeistunbekannt ist. Tendenziell führen z.B. kleine Vesikel (kleiner 100 nm Durchmesser), hoheVesikelkonzentrationen (> 100µg/ml Lipid), hydrophile Oberflächen, zweiwertige Katio-nen und negativ geladene Lipide zu einer schnelleren Vesikelspreitung (Reimhult et al.(2006)). Zusätzlich haben auch die Gesamtionenstärke, die Art der zweiwertigen Katio-nen, der Phasenzustand und der Ladungszustand der Lipide einen solchen Einfluss aufden Prozess, daß die Variation in einem der erwähnten Parameter dazu führen kann, dassdie Spreitung nicht, oder nicht vollständig erfolgt. Zwar ist die Vesikelspreitung bis heu-te Gegenstand zahlreicher Untersuchungen mit Rasterkraftmikroskopie (AFM), Ober-flächenplasmonresonanzspektroskopie (SPR) und Schwingquarzmikrowaagen (QCM-D,quartz crystal microbalance dissipation) (Richter et al. (2003); Reimhult et al. (2004);Morigaki und Tawa (2006)), es finden sich jedoch bislang keine ATR-FTIR-Studien zurVesikelspreitung.

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3.1.2 Durchführung

Für die in dieser Arbeit durchgeführen Vesikelspreitungen wurden wie in 2.2.6.2 beschrie-ben SUVs aus Palmitoyloleylphosphatidylcholin (POPC) und hydophilisierte Germanium-IREs verwendet (2.2.6.1). Während der Spreitung wurden in Abständen von 20 s bis1min Infrarotspektren aufgenommen um den Prozess der SSLB-Bildung anhand derKinetiken der Lipidbanden zu verfolgen. Als membranbildendes Lipid wurde POPC ver-wendet, da seine Phasenumwandlungsstemperatur mit -3 °C weit unter Raumtemperaturliegt. Dies stellt sicher, dass sich der SSLB immer in der flüssig-ungeordneten Phase (ld,liquid disordered) befindet, die am ehesten die Fluidität der Plasmamembran nachbil-det. Auf die Nachbildung der lateralen Segregation durch Rafts, die experimentell durchMischung von Lipiden verschiedener Phasenumwandlungsstemperaturen zu erreichen ist,wurde in dieser Arbeit verzichtet. Grund hierfür ist, dass die ATR-FTIR Methode nichtmit lateraler Auflösung misst, und ein solches Experiment daher einen weiteren Versuchs-parameter hinzufügen würde, dessen Einfluss nicht zu detektieren wäre.

In einem weiteren Experiment ging es darum, die Geschlossenheit des Bilayers zu prüfen.Dazu wurde ein SSLB per Vesikelspreitung hergestellt, anschliessend mit Puffer C gespültund nach Aufnahme des Referenzspektrums dem zirkulierenden Durchflusssystem 0,8µMBSA (Bovine Serum Albumin) zugesetzt. Danach wurden für 30min im Abstand von60 s Spektren aufgenommen. Diese Prozedur wurde für das zuvor bilayerbeschichteteIRE genauso wie für ein unbeschichtetes IRE durchgeführt. Um zu gewährleisten, dassdie freie Germaniumoberfläche in den Lücken des SSLB im gleichen Zustand ist wie derunbeschichtete Kristall, wurde dieser für 120min (die Dauer einer Vesikelspreitung) mitPuffer A gespült.

Die Planarität der erzeugten SSLBs wurde durch dichroitische Messungen untersucht.Hierzu wurden Vesikelspreitungen durchgeführt, bei denen linearpolarsierte Spektrenaufgenommen wurden (2.3.4). Während der gesamten Dauer der Vesikelspreitung wur-den im Abstand von jeweils 20 s ein nichtpolarisiertes, ein parallel polarisiertes und einvertikal polarisiertes Spektrum gemessen. Zur Umschaltung der einzelnen Polarisation-richtungen wurde ein selbstentwickelter Aufbau aus dem Messprogramm heraus ange-steuert (2.4). Zum Vergleich wurde zusätzlich eine Vesikelspreitung mit 100mM NaClim Anlagerungspuffer (Puffer B) durchgeführt, bei der aufgrund der hohen Ionenstärkedie Spreitung nicht stattfinden sollte (Seantier und Kasemo (2009)).

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3.1.3 Vesikelspreitung

3.1.3.1 Ergebnisse

Abbildung 3.1: Spektrum eines POPC SSLBs. Positive Banden sind Lipidabsorptionsbanden, ne-gative Absorptionsbanden werden durch die Verdrängung von Wasser durch das adsorbierte Lipidhervorgerufen.

Das Differenzspektrum des angelagerten POPC-SSLBs (Abb. 3.1) weisst zwei Bereichepositiver Banden von 3000 cm−1 bis 2800 cm−1 und von 1750 cm−1 bis ca. 1000 cm−1 auf(Abb. 3.1). Die größten Absorptionsbanden bei 2924 cm−1 und 2853 cm−1 werden von derasymmetrischen (νas(CH2)) und der symmetrischen CH2-Streckschwingung (νs(CH2))des Lipids hervorgerufen. Diese Banden liegen in der Gel-Phase bei 2916 cm−1 und2850 cm−1 und in der ld-Phase bei 2924 cm−1 und 2853 cm−1, was bedeutet, dass sichder präparierte Bilayer in der ld-Phase befindet. Im Bereich kleinerer Wellenzahlen ab-sorbieren die CO-Streckschwingung der Ester-Carbonyl-Gruppe (1737 cm−1), die CH2-Biegeschwingung (1467 cm−1) und die symmetrische und antisymmetrische Phosphat-Streckschwingung (1230 cm−1 und 1087 cm−1). Desweiteren sind im Vesikelspreitungs-spektrum zwei große negative Wasserabsorptionsbanden bei 3356 cm−1 und 1640 cm−1

zu erkennen. Grund für diese negativen Banden ist, dass das Referenzspektrum in wäs-siger Lösung gemessen wurde (PufferA), und dass durch das adsorbierende Lipid eineSchicht von Wassermolekülen verdrängt wird. Da diese Wassermoleküle im Vergleich zum

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Referenzspektrum imMessvolumen fehlen ergibt sich ein negative Wasserbande. Zur Cha-rakterisierung der Versikelspreitung und des generierten bilayers wurden in dieser Arbeitausschliesslich die ν(CH)- und die ν(CO)-Bande des Lipids und die ν(OH)-Wasserbandebei 3360 cm−1 betrachtet.

Abbildung 3.2: Verschiedene Vesikelspreitungen. Der Vergleich verschiedene Vesikelspreitungen zeigt,daß der Prozess aus vier Phasen besteht. Die Transportkinetik-bedingte Adsorption der Vesikel (A), daskooperative Platzen der adsorbierten Vesikel (B), die Anlagerung von Vesikeln an den SSLB (C) und dasWaschen oder Herausspülen der Vesikelsuspension durch Puffer bzw. Abwaschen von lose gebundenenVesikeln (D).

Nach Zugabe der Vesikellösung zum zirkulierenden Messpuffer wurde die Adsorptionder Vesikel anhand der Extinktion der größten Lipidabsorptionsbande (νas(CH2)) bei2924 cm−1 zeitlich verfolgt (Abb. 3.2). Beim Vergleich der Kinetiken verschiedener Mess-reihen ist zu erkennen, dass der Prozess in vier Phasen verläuft. In Phase A steigt dieExtinktion innerhalb von 5min von 0 auf 0,017 - 0,022 an. In Phase B steigt die Ex-tinktion kaum noch an bzw. ist in machen Experimenten nach 8 - 10min um ca. 0,003abgesunken, so dass ein Extinktionsmaximum, der sog. overshoot entsteht. In Phase Cnimmt die Extinktion bei allen Messungen zu, wobei jedoch die Steigung des oftmalslinearen Anstiegs mit 0,001 bis 0,005 pro 30min stark unterschiedlich sein kann. Absch-liessend wird in Phase D das System vom zirkulärem Modus in den Durchspülmodusgeschaltet und die Vesikellösung durch Puffer aus der Messküvette verdrängt. Hierbeistagniert die Extinktion oder verringert sich leicht, um nach mindestens 120min eine

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stabilen Wert von 0,025 - 0,017 zu erreichen.

3.1.3.2 Diskussion

Im Folgenden werden die Ursachen für die in Abb. 3.1 gezeigten Phasen der Vesikelsprei-tung anhand von Literaturdaten erörtet.

Phase A: Adsorption Starker Anstieg der Extinktion bedingt durch die Adsorption vonVesikeln. Ursache hierfür ist die elektrostatische Interaktion zwischen IRE Oberflä-che und Vesikeln, die durch die Kopfgruppenladung der Lipide, den pH-Wert, dieHydrophilität der Germaniumoberfläche und der Konzentration von zweiwertigenKationen moduliert wird (Richter et al. (2006); Reimhult et al. (2003); Seantierund Kasemo (2009)). Die Kinetik des Prozesses ist schneller als die Transportkine-tik des Durchflusssystems, in dem der komplette Austausch der Küvettenvolumensca. 3min benötigt.

Phase B: overshoot Kleiner Signalabfall bedingt durch das Zerplatzen der adsorbier-ten Vesikel. Da die Gesamtoberfläche der adsorbierten Vesikel größer ist als dieOberfläche der resultierenden Membran, müssen Teile der platzenden Vesikel wie-der von der Oberfläche desorbieren. Damit ergibt sich ein Extinktionsmaximum,der sog. overshoot, der auch in anderen Messsystemen beobachtet wurde (Richteret al. (2006); Morigaki und Tawa (2006)). Es konnte gezeigt werden, dass dieserProzess bei schwacher Interaktion zwischen Oberfläche und Vesikeln erst ab einerkritischen Vesikeldichte stattfindet und dass die Vesikel bei starker Interaktion ein-zeln platzen, sobald sie Kontakt zur Oberfläche haben (Abb. 3.3A, B, Richter et al.(2003)). Im letzteren Fall ist kein overshoot zu sehen. Beeinflusst wird diese Phasedurch die elektrostatische Interaktion (s.o.) und zusätzlich durch die Vesikelgröße.Berechnungen von Efremov et al. (2004) zeigen, dass Vesikel, die aus weniger alsca. 1300 Lipiden bestehen (entsprechend ca. 70 nm Durchmesser bei 70Å2/Lipid)keine Lipid-Discs (adsorbierte deformierte Vesikel) bilden können, sondern die Ad-sorption zu sofortigem Spreiten der Vesikel führt.

Phase C: Lipid an Lipid Adsorption Geringer oft linearer Anstieg der Extinktion, ver-ursacht durch die Anlagerung von Vesikeln an den bestehenden SSLB oder diebereits adsorbierten Vesikel (Morigaki und Tawa (2006)). Der hieraus entstehendeExtinktionszuwachs ist nicht linear zur adsorbierten Lipidmasse, da das evaneszen-te Feld exponentiell abfällt (37% bei 386 nm) und die zusätzlich adsorbierten Lipid-

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Moleküle somit mit einem geringeren Faktor in das Spektrum eingehen. Hauptur-sache dieses Effektes ist vermutlich das Vorhandensein von großen Vesikeln mitDurchmessern von > 200 nm. Die Oberfläche solch großer Vesikel ist flach genugum eine maximal große Interaktionsfläche mit dem SSLB bereitzustellen, ohne dasaus der Interaktion die Energie zur Verformung des Vesikels gezogen werden müsste(Efremov et al. (2004)).

Phase D: Waschphase Geringer oder kein Signalabfall. In dieser Phase desorbieren losean den Bilayer adsorbierte Vesikel und werden aus der Messküvette gespült. Der soherstellte bilayer ist länger als 12 h stabil, Änderungen des Puffers können jedochzu weiterer Vesikeldesorption führen, bis sich die Extinktion der νs(CH2)-Bandebei 0,017 - 0,02 stabilisiert.

Abbildung 3.3: Verschiedene Interaktionmodi von Vesikeln mit Oberflächen nach Richter et al. (2006).Vesikel können bei Interaktion mit einer Oberfläche sofort (A) oder erst ab einer kristischen Oberflächen-konzentration spreiten (B). Sie können adsorbieren ohne zu spreiten (C) oder gar nicht an die Oberflächeanbinden (D).

Es zeigte sich, dass der Verlauf der Vesikelspreitung trotz standardisierter Versuchsab-läufe stark von zwei schwer zu kontrolliereden Parametern abhängt. Zum Einen ist diesdie Vesikelgröße und Größenhomogenität, zum anderen ist es die Reinigung und Hydro-philisierung des Germanium-IREs. Um die Vesikelgrößenabhängigkeit zu untersuchen,wurden Experimente mit Vesikeln unterschiedlicher Durchmesser durchgeführt, die mit

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Hilfe eines Extruders hergestellt wurden (Durchgeführt am LS für Biophysik, Diplom-arbeit Philipp Pinkerneil (2009)). Hierbei wurde klar, dass die Vesikelherstellung perExtruder zwar gut und reproduzierbar funktioniert, jedoch im Vergleich zur Ultraschall-Methode sehr viel aufwändiger ist (10min Inkubationszeit vs. 45min Handarbeit).

Für die nachfolgenden Experimente, in denen es um die Adsorption von lipidiertem Rasan den SSLB geht, ist es besonders wichtig, dass der erzeugte Lipidbilayer geschlossenund planar ist.

3.1.4 Geschlossenheit des SSLB

Proteine adsorbieren an vielen Oberflächen und verlieren dabei zumeist irreversibel ihreStruktur. Daher ist es bei der gezielten Immobilisierung von Proteinen besonders wichtig,die Oberfläche derart zu funktionalisieren, dass das Protein nicht denaturiert. Ausserdemsollte die Funktionalisierung möglichst lückenlos sein. Dies ist besonders wichtig, wennder Anteil des in den Lücken denaturierten Proteins zum Messsignal beiträgt und/oderdie Affinität des Proteins für die Lücken höher ist als für die spezifische Immobilisierung.

3.1.4.1 Ergebnisse

Abbildung 3.4: Bilayer-Lückentestdurch Adsorption von BSA. Gezeigt sinddie Extinktionskinetiken des AmidIIAbsorptionsmaximums von BSA. BSAadsorbiert an das Germanium-IRE,jedoch nicht an den POPC bilayer. DerSSLB verdeckt die IRE Oberfläche zumindestens 98%.

Die Inkubation des unbeschichteten Germanium-IREs mit BSA führt zu einem starkenExtinktionsanstieg der Proteinbanden (nicht gezeigt). Die Kinetiken in Abb. 3.4 entspre-chen dem zeitlichen Verlauf des Maximums der Protein AmidII Bande (Emax(AmidIIBSA)bei 1548 cm−1), und damit der an das IRE adsorbierten BSA-Menge. Die Extinktion derBSA-Anbindung auf unbeschichtetem IRE steigt innerhalb der ersten 5min auf 0,009

60


und in den weiteren 26min der Messung annähernd linear auf 0,01 an. Demgegenübernimmt die Exinktion bei Inkubation mit dem SSLB nur gering linear auf ca. 0,0002 zu.

3.1.4.2 Diskussion

In dem mit BSA durchgeführten Lückentest des Bilayers (3.4) zeigte sich, dass dasProtein stark an die Germanium Oberfläche des IREs adsorbiert und eine Extinktionvon 0,01 erreicht wird. Die sehr geringe Anbindung von BSA an den SSLB mit einerExtinktion von 0,0002 lässt den Schluss zu, dass das Protein schwach bzw. gar nicht anPOPC Bilayer anbindet. Dies zeigt, dass die mit dieser Methode hergestellten SSLBs zumindestens 98% geschlossen sind.

3.1.5 Planarität des SSLB

Mit linearpolarsierten ATR-FTIR Messungen ist es möglich Informationen über die Aus-richtung von Übergangsdipolmomenten und damit auch über die Orientierung von ad-sorbierten Molekülen zu erhalten. Dies erfordert eine hohe Probenanisotropie und damitals Grundlage ein planares IRE und einen planaren Bilayer.

3.1.5.1 Ergebnisse

Abbildung 3.5: Lineardichroitische Spektren eines POPC-SSLB. Die Banden der App- und Avp-Spektren weisen eine 1,2 - 1,5-fach unterschiedliche Extinktion auf.

61


Bei Messung der Vesikelspreitung mit Polarisator zeigte sich, dass die erhaltenen Spek-tren (Abb. 3.5) die gleichen Bandenlagen aufweisen wie das POPC-Spektrum einer un-polarisierten Messung (Abb. 3.1). Die Extinktionen bei parallel polarisiert gemessenenSpektren sind jedoch höher als bei vertikal polarisiert gemessenen: Das dichroitische Ver-hältnis (Rexp = Epp/Evp) der wichtigsten Absorptionsbanden liegt bei 1,4 für νas(CH2),1,34 für νs(CH2), 1,2 für ν(CO) und 1,52 für ν(OH).

Abbildung 3.6: Ordungsparameterkinetik einer Vesikelspreitung mit und ohne 100mM NaCl. In derMessung mit NaCl liegen die Ordnungsparameter der CH und CO Gruppen des Lipids nahe bei Null.Dies bedeutet, die Lipide isotrop orientiert sind, sich also kein Bilayer gebildet hat. Zum Vergleich mitden in Abb. 3.2 gezeigten Vesikelspreitungen ist zusätzlich die unpolarisierte Extinktionskinetik derνas(CH2)-Bande gezeigt.

Zur Auswertung der polarisiert gemessenen Kinetiken wurde zunächst für jedes Spek-trum das Integrale der ν(CH) und ν(CO) Bande anhand der in Tab. 2.6 aufgelistetenIntegrationsgrenzen berechnet. Mittels der Integrale wurden die Ordungsparameter derAlkanketten (SCH) und der CO-Gruppen (SCO) des POPC mit Gl. 2.16 und den Pa-ramtern aus Tab. 2.6 wie in Abschnitt 2.3.4.3 beschrieben berechnet. Da die parallelund vertikel polarisierten Messungen mit 20 s Abstand aufgenommen wurden, sind dieIntegrale der App Spektren auf die Messzeitpunkte der Avp Spektren linear interpoliertworden. Abb. 3.6 zeigt die zeitliche Entwicklung von SCH und SCO während der Vesikel-spreitung jeweils mit und ohne NaCl im Puffer. Zum Vergleich mit dem 4 Phasenmodellder Vesikelspreitung (3.1.3.2) ist zusätzlich die Extinktionskinetik der unpolarisiert ge-

62


messenen νas(CH2)-Bande aufgetragen. Die Extinktion der νas(CH2)-Bande weisst in0mM NaCl einen overshoot mit einem Maximum von 0,027 bei 5min auf und verrin-gert sich nach insgesamt 12min bis auf 0,022. Demgegenüber weisst die Anbindung in100mM NaCl keinen overshoot auf, wobei die Extinktion nach 5min bei 0,027 liegt undsich dann geringfüging auf ca. 0,029 bei 14min erhöht. Alle Ordnungsparameter der CH-und CO-Banden mit und ohne NaCl liegen in der ersten Phase der Spreitung (2 - 6min)bei ca. 0 - 0,1. SCH und SCO bleiben unverändert bei 0 - 0,1 für die Kinetiken mit NaCl,wohingegen die Werte für SCO ohne NaCl parallel zur νas(CH2)-Kinetik ohne NaCl auf-0,2 absinken und SCH ohne NaCl spiegelbildlich zur νas(CH2)-Kinetik auf 0,3 ansteigt.

3.1.5.2 Diskussion

Um die Planarität und molekulare Ordnung der SSLBs zu untersuchen, wurden die Ve-sikelspreitungsexperimente mit polarisierter ATR-FTIR durchgeführt. Anhand der Ord-nungsparamterkinetiken der Alkankette (SCH) und der CO-Gruppe ist zu erkennen, dasssich die molekulare Ordnung in den Experimenten ohne NaCl nach dem overshoot er-höht. Dieses ist im Experiment mit 100mM NaCl nicht zu erkennen, denn hier bleibenSCH und SCO nahe bei 0. Diese Beobachtung lässt sich damit erklären, dass nur imExperiment ohne NaCl eine geordnete Struktur, also ein Bilayer entstanden ist, wohin-gegen bei Anwesenheit von NaCl nur die Adsorption von Vesikeln gemessen wurde (Fürweitere Erklärung des Ordnungsparameters siehe 3.1.6).

Anhand der Ordnungsparameterkinetik von Vesikelspreitungen (Abb. 3.6) kann somitzwischen der Ausbildung eines planaren, geordneten Bilayers und der Adsorption vonintakten Vesikeln unterschieden werden. Dies zeigt, dass die polarisierte Messung einezusätzliche unabhängige Messgröße einbringt, durch die geometrische Informationen überdie Probe gewonnen werden können.

3.1.6 Quantitative Infomationen über die erzeugten SSLBs

Zusätzlich zur Berechnung der Ordnungsparameter S erlaubt die dichroitische Messungdie Ermittlung von Oberflächenkonzentrationen Γ (2.3.4.4). Um quantitative Aussagenüber den SSLB im Hinblick auf seine Schichtdicke, die Fläche pro Lipid und die Lipid-oberflächenkonzentration zu erhalten, wurden linearpolarisierte Messungen von 5 Vesi-kelspreitungen zusammen ausgewertet. Hierzu wurden jeweils die letzten drei Spektrenjeder Messreihe analysiert.

63


Tabelle 3.1: Quantitative Informationen über die erzeugten SSLBs. Gezeigt sind Mittelwerte von 5Vesikelspreitungen, die Grundlage für einige der gezeigten Messungen mit lipidiertem N-Ras bildeten.Ausgewertet wurden jeweils die letzten drei Spektren jeder Spreitung.

Gruppe Parameter Einheit pp vpMW SD MW SD

ν(CH) A cm−1 1,34 0,07 0,88 0,04Γ pmol/cm2 381 47 477 54a ng/cm2 290 36 363 41

Fläche/Lipid b Å2 87 10 70 8SCH

c 0,27 0,09

ν(CO) A cm−1 0,312 0,024 0,242 0,013SCO

d -0,16 0,05

ν(OH) A cm−1 -15,3 1,6 -10,4 0,6Γ nmol/cm2 -19,6 4,7 -22,0 2,3

d(H2O-Film) e nm 3,5 0,9 4,0 0,4SOH

f -0,07 0,14a Mit M(POPC) = 760 g/molb Berechnet für einen Bilayerc Mit β = 90 °, SCH gibt den Ordnungsparameter der Alkankette wiederd Mit β = 0 °, SCO entspricht dem Ordnungsparameter des Übergangsdipolmo-ments der CO-Bindung

e Dicke des verdrängten H2O-Films für V(H2O) = 29,92Å3

f Mit β = 0 °

DieWerte für Γ wurden nach Gl. 2.19, mit den Parametern aus Tab. 2.6 berechnet. Hierzuwurde eine Fehlerrechnung nach der Monte Carlo Methode mit jeweills 105 Realisatio-nen pro Parameter durchgeführt. Die integrierten Absorptionswerte (A) und die darausberechneten Primärergebnisse Γ und S für die jeweilligen Banden sind in Tab. 3.1 auf-geführt. Die aus Γ abgeleiteten Grössen Fläche/Lipid und Schichtdicke des verdrängtenWasserfilmes wurden mit M(POPC) = 760 g/mol und einem molekularen Wasservolu-men von 29,92Å3 berechnet.

POPC Oberflächenkonzentrationen Die in dieser Arbeit hergestellten SSLBs weiseneine POPC-Oberflächenkonzentrationen von 381 ± 47 bzw. 477 ± 54 pmol/cm2

für Γpp bzw. Γvp auf. Der Unterschied zwischen Γpp und Γvp ist darauf zurückzu-führen, dass in der Berechnung von einer isotropen Probe ausgegangen wird, derBilayer jedoch eine geordnete Struktur ist. Γpp und Γvp liegen nahe an der vonTatulian (2003) veröffentlichten Oberflächenkonzentration von 460 pmol/cm2 füreinen mit Langmuir-Blodgett (LB) Technik auf einem Germanium-IRE erzeugten

64


POPC Monolayer (230 pmol/cm2 für den Monolayer). Auch Reiter et al. (2002)hat durch Vesikelspreitung von POPC SUVs auf einem per LB-Methode erzeugtenDPPA Monolayer mit 202 pmol/cm2 (404 pmol/cm2 für einen Bilayer) ähnlicheWerte erhalten. Bei Umrechnung der molaren in eine Massenoberflächenkonzentra-tion ergeben sich für Γpp und Γvp Werte von 290 ± 36 und 363 ± 41 ng/cm2. Auchdiese Werte stimmen mit dem von Reimhult et al. (2006) mit SPR ermitteltenWert von 350 ng/cm2 für einen aus POPC-SUVs auf SiO2 erzeugten SSLB überein.Ein weiterer Parameter, der sich aus der Oberflächenkonzentration berechnen läßtist die Fläche, die ein POPC Molekül in dem SSLB einnimmt. Diese Fläche liegtfür die in dieser Arbeit erzeugten SSLBs bei 87 ± 10Å2/Lipid für pp und 70 ±8Å2/Lipid für vp und ist annähernd so groß wie der Literaturwert für DOPC von81Å2 (Rand (1981)).

Molekulare Ordnung Der Ordnungsparameter S gibt die molekulare Ordnung einerStruktur in Bezug auf eine bestimmte Raumrichtung wieder und nimmt Wertevon 1 (perfekt ausgerichtet) bis -0,5 (90 ° zur Referenzrichtung) an. Ein Wert von0 kann hierbei eine komplett isotrope Ausrichtung oder eine Ausrichtung im magi-schen Winkel von 54,7 ° bedeuten. Die erzeugten SSLBs weisen SCH Werte von 0,27± 0,09 für die Alkanketten auf, was zwischen den von Tatulian (2003) und Reiteret al. (2002) gefunden Werten von 0,05 und 0,46 liegt und annähernd den von Seeligund Seelig (1980) publizierten NMR-Ordnungsparamtern von 0,15 - 0,2 (Palmitoyl)und 0,1 (Oleyl) entspricht. Der SCH von 0,27 kann auch als eine mittlere Verkip-pung der Fettsäureketten von ca. 44 ° gegen die Membrannormale interpretiertwerden. Damit lässt man allerdings ausser Acht, dass ein Bilayer in der Membran-mitte sehr viel weniger geordnet ist als in der Nähe der Lipidkopfgruppen (Vogelet al. (2005)) und der SCH somit ein Mittelwert der einzelnen CH-Orientierungendarstellt .

Der Ordnungsparameter der Carbonylfunktionen der Fettsäuren SCO ist -0,16 ±0,05. Vielfach wurde angenommen, daß die CO-Ester-Gruppen von Phospholipi-den im magischen Winkel ausgerichtet sind und damit als isotrope Gruppen an-gesehen werden können. Aufgrund dieser Annahme wurden oftmals die für dieCO-Gruppe ermittelten Rexp Werte dem Risoexp des Experimentes gleichgesetzt.Mittels Festkörper-NMR wurde jedoch gezeigt, daß zwar das sn1 -Carbonyl nahedem magischen Winkel orientiert ist, das sn2 -Carbonyl jedoch eher in Membrane-bene ausgerichtet ist (Braach-Maksvytis und Cornell (1988)). Desweiteren ergabenpolarisierte ATR-FTIR Studien an Multilayer-Filmen von DPPC und DMPC in

65


der ld-Phase für beide CO-Gruppen Ordnungsparameter von -0,18 bis -0,26. DiesesErgebnis spricht deutlich für eine CO-Ausrichtung in Membranebene und stimmtsehr gut mit dem SCO dieser Arbeit überein. Dies bedeutet, dass die CO-Gruppenin den erzeugten SSLBs einen Winkel von 62 ° mit der Membrannormalen bilden.

Bilayer Schichtdicke Die mittlere Schichtdicke des SSLBs wurde anhand des verdräng-ten Wasservolumens berechnet und liegt bei 3,5 ± 0,9 nm für pp und 4,0 ± 0,4 nmfür vp. Ein Vergleich mit den Bilayerdicken, die mit anderen Methoden ermitteltwurden wie z.B. 4 nm (SPR, Morigaki und Tawa (2006)), 4 nm (AFM, Richteret al. (2003)) oder 3,9 nm (MD Simulation, Leekumjorn und Sum (2007)) zeigt,dass es sich bei den SSLB Präparationen nicht um Mono- oder Multilayer, son-dern um Bilayer handelt. Dies wurde auch durch AFM-Untersuchungen der Vesi-kelspreitung auf Germanium-IREs bestätigt (ca. 4 nm Schichtdicke, durchgeführtam LS für Biophysik, Diplomarbeit Laven Mavarani (2009)). Zusätzlich zeigt derfür den Wasserfilm berechnete Ordnungsparamter SOH von -0,07 ± 0,14, dass dieOH-Dipole der Wasserschicht wie erwartet isotrop ausgerichtet sind.

3.1.7 Fazit

Zusammenfassend kann folgendes über den Zustand der in dieser Arbeit mit der Methodeder Vesikelspreitung erzeugten SSLBs festgestellt werden:

Die SSLBs:

• befinden sich im flüssig ungeordneten Phasenzustand

• sind zu mindestens 98% geschlossen

• sind von erwarteter molekularer Ordnung (SCH = 0,27, CO-Gruppe steht in 62 °zur Membrannormalen)

• weisen eine Fläche pro Lipid von 87 bzw. 70Å2 auf

• haben mit 4 nm eine typische Bilayerdicke

und stehen somit als Grundlage für die Untersuchungen von membrangebundenem lipi-diertem Ras Protein zur Verfügung.

66


3.2 Anbindung von lipidiertem Ras an einen SSLB

Nachdem die Herstellung eines SSLBs auf dem IRE als Grundlage für alle weiteren Ex-perimente etabliert wurde (3.1), konnte die Anbindung des lipidierten Ras an den Bilayererfolgen. Da das Protein in vivo über den Farnesyl-Rest zuerst an die Membran des Endo-plasmatischen Retikulums anbindet und erst dort die Palmitoyl-Modifikation erhält, istder Anbindungsprozess des lipidierten Ras an den POPC-Bilayer von artifizieller Natur.Die Beobachtung dieses Prozesses ist jedoch aus den folgenden Gründen von Bedeutung:Einerseits soll aus den Anbindungs- und Abwaschkinetiken die Stabilität der Immobilisie-rung ermittelt und Rückschlüsse über die Ursache der Immobilisierung gewonnen werden.Andererseits soll mit linearpolarisierten Messungen die bislang unbekannte molekulareAusrichtung des immobilisierten Proteins im Bezug zum Bilayer ermittelt werden (1.5.3).Da nachfolgend der Einfluss der Membranverankerung auf die intrinsische Hydrolyse unddie Interaktion mit Effektoren untersucht werden soll, muß zunächst eine grundlegendeCharakterisierung des Anbindungsprozesses und des membrangebundenen Ras erfolgen.

3.2.1 Durchführung

Zur Anbindung von lipidiertem Ras wurde zunächst eine festkörpergestützte Modellmem-bran durch Vesikelspreitung hergestellt (siehe 3.1 und 2.2.6.3), dann ein Pufferwechselzum Puffer C durchgeführt und das Durchflusssystem auf zirkulierend eingestellt. DasMess-System, bestehend aus ATR-Küvette, Schläuchen und Ventilen, hatte hierbei einVolumen von 1,4ml. Das Reservoir, in das die Probe gegeben wurde hatte zusätzlich einVolumen von 0,4ml, so dass sich ein Gesamtsystemvolumen von 1,8ml ergab. Nachdemein Referenzspektrum des SSLBs in Puffer C mit 400 Scans aufgenommen wurde, wurdedas semisynthetische Ras (1.6) in 0,1ml Puffer C hinzugegeben, so dass sich eine Endkon-zentration im System von 5µM ergab. Die Proteinlösung wurde für 10 - 24 h zirkulierendüber die Oberfläche gepumpt, wobei in den ersten 30min minütlich ein Spektrum mit200 Scans, danach für die Dauer der gesamten Anbindung alle 5min ein Spektrum mit400 Scans aufgenommen wurde. Bei den polarisierten Messungen wurden während derAnbindung nacheinander unpolarisierte (Anp), parallel polarisierte (App) und vertikalpolarisierte Spektren (Avp) gemessen. Auch hierbei wurden für 30min Spektren mit 200Scans gemessen, wobei sich bei 43 s pro 200 Scans ein zeitlicher Abstand von 129 s zwi-schen den Spektren gleicher Polarisierung ergab. Danach wurde für die restliche Dauerder Anbindung im 5min Abstand alle drei Spektren mit je 400 Scans gemessen. Nach-

67


dem die AmidII-Bande eine Extinktion von ca. 0,008 - 0,012 erreicht hatte wurde dasSystem in den Durchflussmodus geschaltet und mindestens 1 h mit Puffer C gespült.Danach stand das immobilisierte Protein für weitere Experimente zur Verfügung. DieKontrolle auf spezifische Anbindung über den Lipidanker wurde im Rahmen der in 3.3 be-schriebenen Experimente durchgeführt und fand daher in D2O-Puffer statt. Für weitereInformationen zur Durchführung dieses Experiments siehe Abschnitt 3.3.1.

3.2.2 Ergebnisse

3.2.2.1 Spezifität, Assoziation und Dissoziation

Abbildung 3.7: Spektren der Anbindung von lipidiertem Ras an einen POPC-SSLB nach 30, 60, 120,240 und 480min. Die Spektren wurden gegen den SSLB als Referenz aufgenommen und besitzen daherspektrale Anteile von angebundenem Ras, verdrängtem Wasser und den Differenzsignalen des Lipidbi-layers. Die mit X markierten Banden sind durch den Silikonspacer verursacht, und treten nur in machenMessungen auf.

Nach Zugabe des lipidierten Ras zum zirkulierenden Durchflusssystem kam es zur An-lagerung des Proteins an den Lipidbilayer. Die Spektren der Anlagerung (Abb. 3.7) be-saßen im niederfrequenten Spektralbereich positive Proteinabsorptionsbanden bei 1651(AmidI), 1548 (AmidII) und 1403 cm−1 (AmidIII). Im höherfrequenten Spektralbereichwaren Banden bei 3286 (AmidA), 2966, 2936 und 2975 cm−1 (aliphatische Aminosäure-seitenketten und Lipidanker) zu erkennen. Zusätzlich zu den positiven Proteinabsorpti-onsbanden waren negative Banden bei 3670 - 3100 cm−1 (OH-Streckschwingungsmoden),hervorgerufen durch die Verdrängung von Wasser, sowie Lipiddifferenzbanden bei 2924(νas(CO)), 2854 (νs(CO)) und in geringem Maße auch bei 1740−1 (ν(CO)) zu erkennen.

68


Aus Referenzmessungen ist bekannt, dass es sich bei den Banden bei 1260, 1076, 1021und zum Teil auch 2966 cm−1 um Absorptionsbanden des Silikonspacers handelt (Abb.3.7). Dies ist in Abb. 3.7 auch daran zu erkennen, dass die durch den Spacer verursach-ten Banden im Gegensastz zu den Proteinbanden in den Spektren bei 30 und 60minnoch nicht vorhanden sind. Der Silikonspacer ist als Abdichtungsmaterial in direktemKontakt mit dem IRE, und obwohl er in den Referenzmessungen genauso vorhanden ist,können geringe Temperaturdifferenzen des Durchflusssystems oder eine Lockerung derKüvettenverschraubung zu solchen Artefakten führen (2.4).

Abbildung 3.8: Anbindung von lipidiertemRas an einen SSLB. Aufgetragen ist die Kine-tik der AmidI-Extinktion während der Anlage-rung. Ras ohne Lipidanker (H-Ras1-166) zeigtkeine Anbindung. Diese Messungen wurde imRahmen der in Abschnitt 3.3 beschriebenen Ex-perimente in D2O-Puffer durchgeführt.

Um herauszufinden, ob die Anbindung des Proteins durch den Lipidanker hervorgerufenwurde, wurde zunächst eine Kontrolle mit Ras1-166 (G-Domäne, Ras ohne Lipidanker)durchgeführt. Bei gleichem Messprotokoll wie bei dem lipidierten Protein konnte nachZugabe von Ras1-166 kein Anstieg des AmidI-Signals gemessen werden (Abb. 3.8). Dieszeigt, dass die G-Domäne alleine keine Affinität zur Membran besitzt und dass daslipidierte Ras somit über den Membrananker an den Bilayer gebunden hat. Diese Anbin-dungen wurden in Rahmen der in Abschnitt 3.3 beschriebenen Experimente gemessen,und fanden daher in D2O-Puffer statt.

Die Anbindung von lipidiertem Ras an den POPC-SSLB war ein langsamer Prozess, derin den meisten Messungen über mindestens 10 h verfolgt wurde. Zur Analyse der Prote-inanlagerungskinetik wurde die AmidII-Bande (Abb. 3.7) gewählt, da sie im Gegensatzzur AmidI-Bande nicht von der δ(H2O)-Bande bei 1640 cm−1 überlagert ist. Die AmidII-Bande wurde im Bereich von 1600 - 1485 cm−1 integriert und das Integral gegen dieZeit aufgetragen (Abb. 3.9A, B). Im gesamten Zeitraum der Anbindung stieg die Flächeder AmidII-Bande je nach Experiment auf 0,3 - 0,5 cm−1, entsprechend einer maximalen

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Extinktion der AmidII-Bande von ca. 0,008 - 0,013 bei 1550 cm−1.

Abbildung 3.9: Anbindungen von lipidiertem Ras an einen POPC-SSLB. A: Kinetik einer Ras Anbin-dung (Messung F), gezeigt mit einer monoexponentiellen und einer biexponentiellen Anpassung. DasInset zeigt den jeweiligen residualen Fehler der Anpassung. B: Kinetiken der AmidII-Bandenflächenverschiedener Anbindungen (Die Buchstaben entsprechen den einzelnen Messungen), wobei eine AmidII-Bandenfläche von 0,5 einem AmidII-Bandenmaximum von ca. 0,014 entspricht. C: Die Kinetiken wurdenmono- und biexponentiell angepasst und die Amplituden gegen die zugehörigen Zeitkonstanten der An-passung aufgetragen. Gezeigt sind die Werte zusammen mit der jeweiligen Standardabweichung derAnpassung. Anbindung M wurde nur monoexponentiell angepasst, da eine Anpassung mit zwei Expo-nentialfunktionen zu keiner Verringerung des Fehlers führte.

Die Anbindungskinetiken konnten mit ausreichender Genauigkeit monoexponentiell an-gepasst werden, wobei die Zeitkonstanten der Anlagerung zwischen 250 und 430minlagen (Abb. 3.9C) und keine lineare Abhängigkeit zwischen den Amplituden und Zeit-konstanten zu erkennen war. Eine biexponentielle Anpassung der Kinetiken zeigte jedoch,dass jede Anbindung aus zwei Prozessen bestand (Abb. 3.9A), einem schnellen Prozessmit einer Zeitkonstante von ca. 45min, und einem langsamen Prozess mit einer Zeitkon-stante von 330 - 500min. Der schnellere Prozess wies eine geringere Amplitude von ca.

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0,05 auf und kann durch die langsame Durchmischungskinetik innerhalb des zirkulieren-den Durchflusssystems erklärt werden. Für den zweiten Prozess zeigte sich eine ungefährlineare Abhängigkeit der Amplitude von der Zeitkonstante des Prozesses. Daraus kanngeschlossen werden, dass die adsorbierende Oberfläche in den Experimenten unterschied-lich groß ist. Bei Anlagerung G und D (Abb. 3.9C) war der erzeugte SSLB demnach mitadsorbierten Vesikeln versetzt, die zu einer Vergrößerung der Gesamtfläche des Bilayersführten. Die zweiten Zeitkonstanten der Anbindungen E, F und N repräsentieren somitmit Werten von 330 - 420min die reale Anbindungskinetik des lipidierten Proteins anden SSLB.

Abbildung 3.10: Stabilität der Ras-Membran-Interaktion. Aufgetragen ist die Kinetik der AmidII-Bandenfläche, integriert von 1600 - 1485 cm−1, während der Proteinanlagerung und des Waschvorgangs.Das Inset zeigt einen vergrößerten Ausschnitt der Dissoziationskinetik und deren lineare Anpassung. EineAmidII-Bandenfläche von 0,5 entspricht einem AmidII-Bandenextinktionsmaximum von ca. 0,014.

Um zu prüfen, wie stabil das Protein am Bilayer gebunden ist, wurde die Oberflächebei einem Experiment nach einer 750minütigen Anbindung für 660min mit Puffer Cim Durchfluss gespült. Die resultierende Dissoziationskinetik (Abb. 3.10) konnte jedochnicht sinnvoll exponentiell angepasst werden. Eine lineare Anpassung ergab, dass dieHälfte des Proteins nach 161 h bzw. 6,7 Tagen von der Oberfläche dissoziiert wäre.

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Abbildung 3.11: Polarisierte Spektren der Ras Anbindung an einen SSLB. Gezeigt sind Mittelwerteder letzten zehn Spektren der Assoziation von vier unterschiedlichen Anbindungsexperimenten. Dasdichroitische Differenzspektrum D∗ wurde mit D∗ = App − Riso × Avp berechnet und ist bei isotroperProteinausrichtung eine Nulllinie. Zur Berechnung von D∗ wurde ein konstanter Riso von 1,72 bzw. einwellenzahlabhängiger Riso(ν) verwendet (siehe 2.3.4.2).

3.2.2.2 Proteinorientierung

In weiteren Experimenten wurde die Orientierung des Proteins in Bezug zur Membranuntersucht. Hierzu wurden Anbindungsexperimente wie zuvor beschrieben durchgeführt,jedoch während der Anbindung polarisierte Infrarotspektren aufgenommen. In Abb. 3.11sind die Mittelwertsspektren der jeweils letzten zehn Spektren (je 400 Scans) der Anbin-dungen von vier unabhängigen Experimenten gezeigt. Die AmidI-Bande hat ein Doppel-maximum bei 1652 und 1640 cm−1, wobei die Extinktion bei App bei 1652 und bei Appbei 1548 cm−1 grösser ist. Die AmidII-Bande hat ihr Maximum bei 1548 cm−1 und ei-ne Schulter bei 1518 cm−1, die durch Tyrosinseitenkettenabsorption hervorgerufen wird.Eine negative Absorptionsbande, die nicht in allen Spektren zu finden ist, ist die νs(CO)-Bande bei 1737 cm−1, die durch Verdrängung von lose angelagertem Lipid in der Anfangs-phase der Ras-Anbindung verursacht wird. Die parallel polarisiert gemessenen SpektrenApp besitzen eine ca. 1,7-fach höhere Extinktion als die vertikal polarisiert gemessenen

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Tabelle 3.2: Infrarotabsorption von α-Helices. Literaturwerte und experimentell ermittelte Orientie-rung. Aus den Extinktionen der Spektren in pp und vp bei 1661 cm−1 (AmidI) und 1545 cm−1 (AmidII)wurde der Ordnungsparamter S nach Gl. 2.16 und daraus der mittlere Winkel der Helices nach Gl. 2.17berechnet.

AmidI AmidII

E1 A E1 A

Position / cm−1 a 1662 - 1651 1656 - 1645 1551 1520relative Intensität a 794 700 310 80

α b 38 ° 73 °

E bei ν / cm−1 1661 1545E (1,8 ± 0,2)×10−3 (0,9 ± 0,2)×10−3

S 0,19 ± 0,02 -0,05 ± 0,02θ c 36 ± 2 ° 49 ± 2 °

a nach Goormaghtigh et al. (1994c).b Winkel zwischen Übergangsdipolmoment und α-Helixachse nach Marsh et al.(2000).

c mittlerer Winkel aller α-Helices, skaliert um die Anzahl ihrer Residuen relativzur Membrannormalen.

Spektren Avp (Abb. 3.11). Bei isotrop ausgerichteten Molekülen und einem wellenzahl-unabhängigen Brechungsindex des Mediums (n3) ist der Faktor zwischen App und Avpbei allen Wellenzahlen gleich und entspricht dem isotropen dichroitischen VerhältnisRiso. Das um Riso skalierte Differenzspektrum von App und Avp, das sog. dichroitischeDifferenzspektrum (D∗ = App − Riso × Avp) ist daher für nicht ausgerichtete Proteineeine Nulllinie.

Die dichroitischen Differenzspektren des membrangebundenen Ras weisen jedoch einepositive Differenzbande im AmidI-Bereich und eine negative Differenzbande im AmidII-Bereich auf (Abb. 3.11). Die AmidI-Differenzbande liegt zwischen 1690 und 1630 cm−1

und hat ihr Maximum bei 1661 cm−1, die AmidII-Differenzbande beginnt mit einer stei-len Flanke bei 1560 cm−1, hat ihr Minimum bei 1545 cm−1 und geht bis 1500 cm−1 wiederauf Null zurück. Hervorzuheben ist, dass die Differenzbanden nicht über den gesamtenAmidI- und AmidII-Bereich verlaufen, sondern dass nur bestimmte Bandenbereiche vonNull abweichen. Dies zeigt, dass nur einige Sekundärstrukturpopulationen, nämlich diein diesen Spektralbereichen absorbierenden α-Helices, eine Anisotropie aufweisen. DieAbsorptionsbanden von α-Helices liegen zwischen 1662 und 1645 cm−1 im AmidI- undbei 1551 und 1520 cm−1 im AmidII-Bereich, wobei die Übergangsdipolmomente der Ami-dI Mode eher parallel zu Helixachse, die der AmidII eher senkrecht dazu liegt (Tab. 3.2).Dies bedeutet also, dass die α-Helices des membranverankerten Ras eher in z-Richtung,

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also vertikal zur Membranoberfläche ausgerichtet sind. Da die drei längsten der fünf Heli-ces von Ras zusammen über 70% der Helixresiduen stellen und parallel zueinander liegen,ergeben sich zwei Möglichkeiten der molekularen Orientierung des Proteins. Da der Lipi-danker am C-Terminus des Proteins nahe der letzten Helix liegt, kann eine Orientierung,in welcher der C-Terminus auf der Membran abgewandten Seite liegt, ausgeschlossenwerden (Abb. 3.13). Um die Orientierung der α-Helices quantitativ zu bestimmen, wur-de der Ordnungsparamter für das Maximum der AmidI- und AmidII-Differenzbandeberechnet. Zur Berechnung nach 2.3.4.3 wurde ein Winkel der Übergangsdipolmomentevon 38 ° (AmidI) und 73 °(AmidII)(Tab. 3.2) und ein Ordnungsparamter der Membranvon 0,9 angenommenen (Marsh et al. (2000)). Damit ergaben sich Ordnungsparametervon 0,19 ± 0,02 für die AmidI- und -0,05 ± 0,02 für die AmidII-Differenzbande. Dermittlere Winkel der α-Helices lag somit bei 36 ± 2 ° (AmidI) bzw. 49 ± 2 ° (AmidII),was eindeutig eine aufrechte Ausrichtung der α-Helices belegt. Theoretisch sollten dieWerte der AmidI- und AmidII-Winkel gleich sein. Da jedoch das AmidII-Signal eineprozentuale Abweichung von 40% besitzt und der AmidI-Wert nur 10% Abweichungaufweisst wird im Folgenden nur der AmidI-Wert diskutiert.

Da Riso für H2O als Medium keine Konstante im AmidI- und AmidII-Bereich ist, sondernstark vom Brechungsindex von H2O abhängt, wurden zusätzlich dichroitische Differenz-spektren mit einem wellenzahlabhängigen Riso berechnet, der wiederum nach Gl. 2.13berechnet wurde. Die verbesserte Auswertung ergab jedoch ausser geringen Intensitäts-unterschieden der AmidI-Differenzbande keine Änderungen der Spektren (Abb. 3.11).

Bisher wurde eine liegende Orientierung der G-Domäne angenommen, bei der die Aus-richtung des Proteins durch Interaktion mit der Membran stabilisiert würde (3.13). Beider hier beobachteten aufrechten Orientierung wäre eine solche Stabilisierung nicht mög-lich. Daher wurde zunächst vermutet, dass es sich um eine oberflächenbelegungsabhän-gigen Effekt handelt, bei dem sich das Protein aufgrund sterischer Effekte zum Endeder Anlagerung aufrichtet (Berechung der Oberflächenbelegung siehe unten). Um dieseVermutung zu prüfen, wurden für die gesamte Anbindung dichroitischen Differenzspek-tren berechnet und die Differenzbande bei 1660 cm−1 für jedes Spektrum integriert. DasIntegral wurde zusammen mit dem AmidII-Integral von orientierungskorrigierten Spek-tren (Aiso, zur Berechung siehe 2.3.4.1) gegen die Messzeit aufgetragen (Abb. 3.12). Diemonoexponentielle Anpassung der beiden zuvor normierten Kinetiken ergab ähnlicheZeitkonstanten von 310 ± 7min für die Aiso-Kinetik und 315 ± 7min für die D∗-Kinetik.Dies zeigt, dass die Proteinausrichtung unabhängig von der Oberflächenbeladung ist undsomit durch die Interaktion mit der Membran hervorgerufen sein muss.

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Abbildung 3.12: Kinetik der AmidII-Bandenfläche der Aiso-Spektren und der AmidI-Bandenflächeder D∗-Spektren. Die Kinetiken wurde zur besseren Vergleichbarkeit normiert und monoexponentiellangepasst.

3.2.2.3 Oberflächenkonzentration und Belegungsdichte

Aus den polarisiert gemessenen AmidII-Integralen App und Avp, die einem Anp-Integralvon ca. 0,4 entsprechen, wurde mittels Gl. 2.19 und den in 2.6 aufgelisteten Parame-tern eine Ras-Oberflächenkonzentration von 12,1 ± 1,3 pmol/cm2 für App und 13,2 ±1,4 pmol/cm2 für Avp berechnet. Die theoretisch maximale Oberflächenkonzentration vonRas variiert je nach Annahme der molekularen Fläche von 9 - 10 nm2 in einem Bereichvon 16,6 - 18,5 pmol/cm2. Damit ergibt sich für die Messungen, in denen von einem SSLBohne zusätzliche Vesikelanlagerung ausgegangen werden kann und die AmidII-BandenIntegrale von ca. 0,4 aufweisen (Abb. 3.9A, Messungen E, F und N), eine Oberflächen-belegungen von 65 - 80%. Bei dieser Berechnung muß jedoch beachtet werden, daß sieaufgrund der Abschätzung der molekularen Fläche des Proteins und der mikroskopischenRauheit des IREs (und damit auch des SSLBs) verhältnismäßig ungenau ist.

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3.2.3 Diskussion

3.2.3.1 Anbindung

In diesem Abschnitt wurde die Anbindung des lipidiertem Ras an den POPC-Bilayer imHinblick auf die Kinetik der Assoziation und Stabilität der Bindung, die Oberflächenkon-zentration und die molekulare Ausrichtung des immobilisierten Proteins charakterisiert.Das Protein lagerte sich mit Zeitkonstanten von 330 - 420min an den Bilayer an. Dieseextrem langsame Anbindung kann dadurch erklärt werden, dass der Lipidanker vor demEintauchen in den hydrophoben Membranbereich zunächst die hydrophile Kopfgruppen-schicht der Phospholipide durchdringen muss. Da diese thermodynamische Barriere jehäufer übersprungen wird, desto mehr sich das Protein in Membrannähe aufhält, führtdie geringe elektrostatische Anziehung zwischen G-Domäne und POPC-Bilayer (3.3) zu-sätzlich zu einer Verringerung der Anker-Insertionsereignisse. In einer IRRAS Studiemit dem auch im Rahmen dieser Arbeit verwendeten semisynthetischen N-Ras wurdedie Adsorption an eine Lipidmonolayer untersucht (Meister et al. (2006)). Bei 20mN/mMembrandruck insertierte das Protein bis zu einer Absorption von 0,0012, was bei Kor-rektur um die unterschiedliche Anzahl der Reflektionen mit 0,0144 ähnliche Werte wiein dieser Arbeit ergibt (IRRAS: 1 Reflektion; ATR(diese Arbeit): 12 aktive Reflektio-nen; ergibt 12-fach höheres Sinal). Da jedoch die von Meister et al. (2006) gemessenenSpektren ein zu geringes Signal/Rausch-Verhältnis aufwiesen, konnten die Autoren kei-ne Aussagen über die Sekundärstruktur oder die Orientierung des membrangebundenenProteins machen.

Beim Vergleich der Kinetik einer Anbindung aus der frühen Phase der Arbeit (Abb.3.8) mit den Anbindungen mit optimierter Vesikelspreitung (Abb. 3.9), fällt die beiden neueren Daten langsamere Kinetik auf. Dies könnte zum Einen durch eine grösse-re SSLB-Oberfläche bei den Sekundärstruktur-Experimenten (3.3), also ein SSLB mitaufgelagerten Vesikeln, oder die unterschiedliche Pufferzusammensetztung bedingt sein.In den Sekundärstruktur-Experimenten wurden D2O-Puffer mit einem pD von 7,8 ver-wendet. Da Ras einen berechneten IEP von 5 besitzt hätte es in den D2O-Puffern einenegativere Nettoladung, was die Anbindungskinetik beeinflusst haben könnte.

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3.2.3.2 Stabilität der Immobilisierung

Die Dissoziation des immobilisierten Ras war so langsam, dass unter Annahme einerlinearen Dissoziationskinetik innerhalb von 6,7 Tagen erst 50% des Proteins vom Lipid-bilayer abgelöst worden wäre. Verglichen mit der Halbwertszeit der Membranstabilitäteines Lipopeptids mit Farnesyl- und Palmitoylanker von 3,4 Tagen (Shahinian und Sil-vius (1995)) ist der hier gefundene Wert annähernd zweifach höher, liegt jedoch in dergleichen Größenordnung. Die ennorm hohe Stabilität der Bindung ermöglichte es innachfolgenden Experimenten erstmals, das gebundene Ras differenzspektroskopisch zuuntersuchen, ohne dass das Ablösen des Proteins die Differenzspektren beeinflusste.

3.2.3.3 Orientierung

Aus lineardichroitischen Messungen der Anbindung konnte die Orientierung der G-Do-mäne im Bezug zur Membran bestimmt werden. Als Mass für die Orientierung wurdeder mittlere Winkel zwischen allen α-Helices des Ras-Proteins, jeweils skaliert mit derAnzahl ihrer Residuen, und der Membrannormalen bestimmt (Abb. 3.13B). Der mitt-lere Winkel lag bei 36 °, wobei allerdings beachtet werden muß, dass das Protein zu-sätzlich zu den drei parallel angeordneten Helices zwei senkrecht dazu liegende Helicesbesitzt. Der tatsächliche Winkel muss also kleiner sein als 36 °. Für die Orientierungder G-Domäne ergeben sich für Winkel ≤ 36 ° zwei mögliche Orientierungen: So könnteder C-Terminus entweder auf der membranabgewandten oder der membranzugewand-ten Seite der G-Domäne liegen. Da zwischen der ersten C-terminalen Lipidverankerung(Palmitoyl an C181) und dem C-Terminus der G-Domäne (R169) jedoch nur 14 zusätz-liche Aminosäuren liegen, kann der C-Terminus aus sterischen Gründen nur auf dermembranzugewandten Seite liegen. Eine solche stehende Ausrichtung steht im Wider-spruch zur bisherigen Annahme einer liegenden Orientierung des Proteins (Abb. 3.13A).Die liegende Orientierung war das Resultat von Molekulardynamik- (MD) Simulatio-nen und Modellingstudien, die in der Theoriegruppe des LS für Biophysik durchgeführtwurden (Persönliche Mitteilung Till Rudack) und entspricht der für H-Ras postulier-ten GTP-Orientierung (Gorfe et al. (2007a); Abankwa et al. (2008)). Beim Vergleichder beiden Orientierungen fällt auf, dass die liegende Orientierung mehr Membraninter-aktionsfläche aufweist als die stehende Orientierung, in der das Protein wie ein umge-kehrter Kegel auf der Membran steht. Zudem hätten bei einer stehenden Orientierungsowohl die α-Helix 4 (H4) als auch der loop zwischen β-Strang 2 und 3 (L2,3) keinendirekten Membrankontakt. Für die Residuen D47 und E49 in L2,3 sowie für R128 und

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Abbildung 3.13: Unterschiedliche Ausrichtungen der G-Domäne von Ras im Bezug zur Membran. A:Die bislang favorisierte Orientierung von membrangebundenem N-RasGDP (liegende Ausrichtung) alsResultat von Molekulardynamik- Simulationen und Modellingstudien, die am LS für Biophysik durchge-führt wurden. Diese Orientierung entspricht dem Zustand von H-RasGTP nach Gorfe et al. (2007b). B:Orientierung mit senkrecht zur Membran ausgerichteten α-Helices (36 ° zur Membrannormalen für denMittelwert aller Helices) und zur Membran ausgerichtetem C-Terminus (stehende Ausrichtung). DieseOrientierung geht aus den dichroitischen Messungen dieser Arbeit hervor. Auffällig ist die im Vergleichzur liegenden Orientierung (A) kleinere Membraninteraktionsfläche. C: Mögliche Dimerkonformation inder Aufsicht auf die Membran. Die von Gorfe et al. (2007a) und Abankwa et al. (2008) als für dieMembraninteraktion bedeutsam eingestuften Residuen D47 und E49 im Loop zwischen β-Strang 2 und3 (L2,3) und R128 und R135 in der α-Helix 4 (H4) sind als blaue Kugeln dargestellt. Die bedeutsamenResiduen liegen in diesem Modell direkt gegenüber und könnten somit für die Dimer-Stabilisierung überSalz-Brücken verantwortlich sein. D: Mögliche Dimerkonformation in der Seitenansicht. Für diese Abbil-dung wurde die Ras-GDP-Struktur 4Q21 verwendet und die Membranoberfläche durch weisse Kugelndargestellt.

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R135 in H4 wurde jedoch eine Interaktion mit der Membran postuliert (Gorfe et al.(2007a); Abankwa et al. (2008)). Die Bedeutung dieser und der weiter C-terminal lie-genden Residuen R169 und K170 (C-Term-Residuen) wurde durch Mutationsstudien inPC12-Zelldifferenzierungsassays, durchflusszytometrischen FRET-Messungen und quan-titativem Immunoblotting ermittelt (Gorfe et al. (2007a); Abankwa et al. (2008)). In die-sen Experimenten konnte gezeigt werden, dass eine Alanin-Mutation der H4-Residuenzu weniger, und der C-Term-Residuen zu mehr Wachstum und Differenzierung führt.Allerdings konnte in diesen in vivo Studien lediglich der Einfluss auf den Signaloutputder Regulationskaskade und auf die Lokalisation in verschiedenen Membrandomänenuntersucht werden. Um ein Modell der molekularen Wirkung der fraglichen Residuen zuerhalten, haben die Autoren eine in MD-Simulationen gefundene GTP-GDP-abhängigeOrientierung vor dem Hintergrund der in vivo-Daten interpretiert. In ihrem Modell, dassie als „novel switch“-Modell bezeichnen, ist das GDP-gebundene Ras mit den α-Heliceseher aufrecht ausgerichtet und L2,3 hat zusammen mit den C-Term-Residuen Membran-kontakt. Im GTP-Zustand liegen die α-Helices eher parallel zur Membran und L2,3hat zusammen mit H4 Membrankontakt. Die in vivo nachgewiesene gegensätzliche Wir-kung der C-Term-Residuen (deaktivierend) und der H4-Residuen (aktivierend) wurdedaher durch eine Orientierungsänderung erklärt. Die Aussagekraft der dem Modell zu-grundenliegenden Simulationen kann jedoch angezweifelt werden (u.a. fehlende Statistik,persönliche Mitteilung, Till Rudack und Henrick te Heesen). Da bislang keine biophy-sikalischen Untersuchungen zur Orientierung von membrangebundenem Ras existierten,kann lediglich die Bedeutung der diskutierten Residuen nicht aber ihre Funktion alsgesichert gelten.

3.2.3.4 Dimerisiert Ras an der Membran?

Betrachtet man nun die gesicherte Bedeutung der L2,3 und H4-Residuen zusammen mitder in dieser Arbeit gefundenen aufrechten Orientierung, kommt man zu dem Schluss,dass die L2,3 und H4-Residuen Kontaktstellen eines möglichen Ras-Dimers sein könnten.Bei einem wie in Abb. 3.13C und D gezeigten Dimer würden die kritischen Residuen vonzwei Ras-Proteinen miteinander interagieren und nicht jeweils mit der Membran. Dieskönnte zu einer Stabilisierung der kegeligen Ausrichtung eines Monomers führen, unddie fehlende Membrannähe der L2,3 und H4-Residuen erklären.

Es sind einige Beispiele für homodimerisierende GTPasen bekannt, wobei die Dimerisie-rung oft zu einer Beschleunigung der GTP-Hydrolyse führt. So führt z.B. die Kaliumionen-

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abhängige Dimerisierung des an der t-RNA Prozessierung beteiligten Proteins MnmEzu einer 2000-fachen Beschleunigung seiner GTPase Reaktion (Scrima und Wittinghofer(2006)). Auch bei den GTPasen GBP1, HypB und Septin-2 führt die Dimerisierung zueiner schnelleren Hydrolyse (Gasper et al. (2006); Ghosh et al. (2006)). Alle genanntenProteine dimerisieren bzw. interagieren innerhalb der Switch-Regionen miteinander. ImGegensatz dazu liegt die Switchregion bei dem in dieser Arbeit postulierten membranab-hängigen Ras-Dimer abseits der Dimerisierungsfläche, so dass hier keine Beschleunigungder GTPase Aktivität zu erwarten ist. Tatsächlich konnte in den Experimenten zur int-rinsischen Hydrolyse des membrangebundenen Ras (3.5) kein signifikanter Unterschiedzur Hydrolysekinetik in Lösung festgestellt werden.

Hinweise auf eine membranabhängige Homodimerisierung von Ras erhielt man bereitsim Jahr 2000 in einer Studie, in der die Aktivität der Raf-1 Kinase in Abhängigkeitverschiedener Ras-Zustände untersucht wurde (Inouye et al. (2000)). Hierbei stellte manfest, dass zur Aktivierung von Raf-1 zusätzlich zu RasGTP auch Liposomen vorhandensein müssen. Da die Autoren in crosslinking Experimenten Ras-Dimere an den Liposomengefunden haben, und sich Raf-1 durch artifiziell dimerisiertes Ras-GST auch in Lösungaktivieren liess, gingen sie von einer membranabhängige Homodimerisierung von Rasaus.

In elektronenmikroskopischen Studien von Plasmamembran-Sheets wurden Anhäufun-gen von Ras-Molekülen gefunden, die sog. Nanocluster, die aus 6–8 Ras-Molekülen beste-hen. Die Ursache dieses Clusterings sind noch weitgehend unbekannt, so dass es möglichwäre, das es sich bei den Nanoclustern um mehrere Dimere handelt (Omerovic und Prior(2009)).

In vivo könnte eine transiente Dimerisierung von Ras zu einer verstärkten Interaktionmit Proteinen führen, die zwei Ras-Moleküle binden, wie z.B. dem Austauschfaktor SOS(Son Of Sevenless), der über eine katalytische und eine allosterische Bindestelle verfügt.

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3.3 Sekundärstruktur von membrangebundenemlipidiertem Ras

Nachdem Ras spezifisch über den Lipidanker am SSLB immobilisiert werden konnte(3.2), wurde zunächst untersucht, ob die Membrananbindung strukturelle Änderungendes Ras-Proteins hervorruft. Anhaltspunkte für eine strukturelle Änderung waren durcheine NMR-Studie gegeben, in der farnesyliertes H-Ras bei Inkubation mit Vesikeln eineveränderte Flexibilität des zentralen β-Sheets aufwies (Thapar et al. (2004)). Ausserdemwurde mit Fern-UV-Ciculardichoismus-Spektroskopie eine geringe Strukturänderung beiAnbindung von Ras an Liposomen beobachtet (Thapar et al. (2004)). Die Struktur desfür die Membranbindung verantwortlichen C-Terminus (As. 172 - 188) der auch diebislang noch nicht verstandene unterschiedliche in vivo-Funktion der Ras-Isoformen her-vorruft ist noch weitgehend unbekannt.

Zur Untersuchung des Membraneinflusses auf die Struktur wurde eine Sekundärstruk-turanalyse der AmidI-Bande von membrangebundenem lipidiertem Ras durchgeführt.Zur Reduzierung der Freiheitsgrade der Sekundärstrukturanalyse wurde die Methode ineiner bereits beschriebenen Prozedur (Ollesch et al. (2007)) mit der AmidI-Bande deslöslichen Proteins anhand dessen bekannter 3D-Struktur kalibriert. Anschließend wurdeder ermittelte Kalibrationsparametersatz in der Bandenzerlegung der AmidI-Bande desmembrangebundenen Proteins verwendet.

Die Ergebnisse dieses Abschnitts wurden in Güldenhaupt et al. (2008) bereits vorabveröffentlicht.

3.3.1 Durchführung

3.3.1.1 SSLB-Präparation und Proteinanlagerung

Die ATR-Messungen dieses Abschnittes wurden am Infrarotspektrometer IFS66 durch-geführt, die verwendeten Messparameter finden sich in Tab. 2.5. Der SSLB wurde wie inAbschnitt 3.1 beschrieben mittels Vesikelspreitung von POPC-SUVs auf einem hydrophi-lisierten Germanium IRE präpariert und während der gesamten Messung minütlich einSpektrum mit 256 Scans aufgenommen. Nach Ausbildung des Bilayers wurde die ATR-Küvette mit 10ml deuteriertem Puffer C (pD = 7,8) gespült. Um den Austausch von H2O

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zu D2O mit möglichst wenig D2O-Puffer durchzuführen, wurden drei Verdünnungsschrit-te durchgeführt. In jedem Schritt wurde zuerst 2ml im Durchfluss, dann 1ml zirkulierenddurch die Küvette gepumpt bis sich das Gleichgewicht zwischen H2O, HDO und D2O imgesamten Systemvolumen eingestellt hatte. Dies wurde anhand der Absorptionsbandender Biegeschwingungen von H2O (δ(H2O), 1640 cm−1), HDO (δ(HDO), 1450 cm−1) undD2O (δ(D2O), 1200 cm−1) verfolgt. Nach der dritten Verdünnung sank der Anteil derδ(H2O)-Bande unter die Nachweisgrenze und die Extinktion der HDO-Bande auf unter5×10−4 gemessen gegen den vorherigen Verdünnungszustand. Damit wurde der Aus-tausch als ausreichend angesehen und der SSLB 40 - 60min mit D2O-Puffer inkubiert,bevor das Referenzspektrum für die Proteinanbindung gemessen wurde. Danach wur-de das semisynthetische Ras (HDFar-MIC-N-Ras1-181, 1.6) dem Durchflusssystem auseiner 40,8mg/ml (=̂ 1,94mM) H2O Lösung bis auf eine Endkonzentration von 2,0µMzugegeben. Die hierbei eingebrachten Protonen wurden bei einem Systemvolumen von2ml ca. 1000-fach verdünnt und führten zu geringer Bildung von HDO. Für die gesamteDauer der Proteinanlagerung wurde jede Minute ein Spektrum mit 256 Scans gemessenund nach Erreichen der Sättigung der Proteinanlagerung, frühestens jedoch nach 10 hdie Oberfläche mit frischem D2O-Puffer gespült. Von diesem Zustand wurden nachfol-gend die Spektren für die Sekundärstrukturanalyse gemessen. Bei allen Experimentenmit D2O-Puffern wurden die Reservoirs des Durchflusssystems luftdicht abgeschlossen(Parafilm) um Kontamination mit H2O-Dampf zu vermeiden.

3.3.1.2 Messung von Ras in Lösung

Zur Messung von Ras in Lösung wurde H-Ras1-166 wie in Abschnitt 2.2.3 beschriebenmittels Ultrafiltrationssäulen in deuterierten Puffer C (pD = 7,8) überführt und bei4 °C für 10 - 14 h inkubiert. Von dem somit größtenteils deuterierten Protein wurde einTransmissions-FTIR-Spektrum aufgenommen. Hierbei wurde die Aquaspec-Zelle verwen-det und die Messung wie in Abschnitt 2.5 beschrieben durchgeführt. Ras1-166 wurde ineiner Menge von 1,8mg in 100µl Volumen in den HD-Austausch eingesetzt.

3.3.2 Sekundärstrukturanalyse

Die Spektren von membrangebundenem Ras und Ras1-166 in Lösung wurden wie in Ab-schnitt 2.6.2 beschrieben für die Bandenzerlegung vorbereitet. Danach wurde zunächst

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die AmidI’-Bande des Ras in Lösung in einem iterativen Verfahren (siehe 2.6.3) so ange-passt, dass sowohl die Abweichung zur 3D-Struktur als auch die SD der Anpassung geringwaren. Der durch diese Zerlegung erhaltene Parametersatz wurde zur Bandenzerlegungder AmidI-Bande des membrangebundenen lipidierten Ras verwendet. Diese Zerlegungentsprach daher einer Intensitätsanpassung der Komponentenbanden, was den Vorteileiner direkten Vergleichbarkeit der Sekundärstrukturen von membrangebundenem Rasund Ras in Lösung mit sich brachte.

3.3.3 Ergebnisse

Abbildung 3.14: Seitenkettenkorrekturder Absorptionsspektren von Ras. Einberechnetes Seitenkettenspektrum wurdeanhand der Tyrosin-Bande auf das gemes-sene Spektrum skaliert und anschliessendsubtrahiert. Exemplarisch ist dies für dasSpektrum der Transmissionsmessung vonRas1-166 gezeigt.

Abb. 3.14 zeigt den Amid-Bereich des FTIR-Spektrums von Ras1-166 exemplarisch fürbeide Proteine. Die AmidI’-Bande hat ihr Maximum ca. bei 1640 cm−1, die AmidII-Bande ist durch den HD-Austausch größtenteils zu kleineren Wellenzahlen verschoben,wobei die entsprechende AmidII’-Bande bei 1450 cm−1 und damit außerhalb des dar-gestellen Bereichs liegt. Da einige Absorptionsbanden von Aminosäureseitenketten imAmidI-Bereich liegen, muß die AmidI-Bande vor der Bandenzerlegung um die Seiten-kettenabsorptionen korrigiert werden. Diese Korrektur wurde wie in Abschnitt 2.6.2 be-schrieben durchgeführt und ist in Abb. 3.14 exemplarisch für das Spektrum von Ras1-166gezeigt.

Um die Positionen der Komponentenbanden zu finden, wurden die zweite Ableitungund Fourier-Selbstentfaltung (FSD) berechnet. Hierzu wurden die seitenkettenketten-und basislinienkorrierten und auf eins normierten Spektren verwendet und wie in Ab-schnitt 2.6.3 beschrieben vorgegangen. Für Ras1-166 zeigten sich im Spektrum der zwei-ten Ableitung sieben lokale Minima, die bei 1691,5; 1671,5; 1659,0; 1637,5; 1617,5 und

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1611,5 cm−1 lagen. In dem mit FSD berechneten Spektrum waren an allen Positionender lokalen Minima (außer 1617,5 cm−1) lokale Maxima zu erkennen. Diese Positionendienten als Anhaltspunkte für die Bandenzerlegung.

Abbildung 3.15: Zweite Ableitung undFSD der AmidI’-Bande von Ras. Ge-zeigt sind die seitenketten- und basislini-enkorrigierte und auf eine Fläche von einsnormierte AmidI’-Bande von Ras1-166(schwarz), ihre zweite Ableitung (blau)und ihre Fourier-Selbstentfaltung (FSD,rot, skaliert um 0,4). Anhand der Maxi-ma der FSD und der Minima der zweitenAbleitung können die Positionen der Kom-ponentenbanden ermittelt werden, die alsStartpositionen für die Bandenzerlegungdienen.

Die Bandenzerlegung wurde mit den seitenkettenkorrigierten und geglätteten Spektrenwie in Abschnitt 2.6.3 beschrieben durchgeführt, wobei zunächst nur die AmidI’-Bandevon Ras1-166 zerlegt wurde. Hierbei wurde die Zerlegung auf die Sekundärstrukturanteileder 3D-Struktur von Ras kalibriert, wobei zur Kalibration eine NMR-Struktur des GDP-Zustands von Ras (PDB-ID: 1CRP) verwendet wurde. Zur Kalibration wurde statt einerRöntgenstruktur eine NMR-Struktur verwendet, da die NMR-Struktur ebenso wie dieFTIR-Spektren in Lösung gemessen wurden. Desweiteren besteht die Struktur 1CRP aus20 Strukturmodellen, für die jeweils die Sekundärstrukturanteile einzeln berechnet wur-den und deren Standardabweichungen die Variabilität der Struktur wiedergeben (Tab.3.3). Bei der Kalibrierung der Bandenzerlegung wurde zunächst die AmidI’-Bande desRas1-166 angepasst und für jedes Ergebnis die Standardabweichung (SD) der Anpassungund RMSD-Werte zwischen den Sekundärstrukturanteilen der Zerlegung und denen der3D-Struktur berechnet (Gl. 2.23). Durch Variation der Anzahl und Startposition derKomponentenbanden wurde eine Lösung der Zerlegung gesucht, die sowohl die Datengut beschreibt (niedrige SD) als auch eine geringe Abweichung zur 3D-Struktur aufweist(niedrige RMSD). Um eine Überanpassung der Daten (overfit) zu vermeiden, sollte dieAnzahl der Komponentenbanden möglichst gering sein. Das Ergebnis dieses Optimie-

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rungsprozesses war ein Parametersatz von fünf Komponentenbanden, mit dem die Ban-denzerlegung eine SD von 6,25×10−6 und eine RMSD zwischen IR- und NMR-Daten von1,3% ergab (Tab. 3.3). Die Komponentenbanden wurden anhand ihrer Bandenlagen imVergleich mit Literaturwerten den verschiedenen Sekundärstukturen zugeordnet (Goor-maghtigh et al. (1994a)). Die Bandenlagen waren 1666,6 cm−1 (Turn), 1652,1 cm−1 (α-Helix), 1649,4 cm−1 (α-Helix), 1637,4 cm−1 (random coil) und 1631,6 cm−1 (β-Sheet) undsind in Abb. 3.16 zu sehen. Der Kalibrationsparametersatz bestand neben den Banden-positionen aus den Bandenbreiten und der Bandenform, dem Gauss/Lorentz-Verhältnis.Diese Parameter wurden genau wie auch die Bandenpositionen bei der Anpassung derAmidI’-Bande des membrangebundenen Proteins nicht verändert, so dass die Anpassungnur über Variation die Bandenintensitäten erfolgte.

Abbildung 3.16: Bandenzerlegung derAmidI’-Banden von membrangebundemRas und Ras in Lösung. Gezeigt sinddie seitenketten- und basislinienkorrigier-ten und auf eine Fläche von eins nor-mierten AmidI’-Banden von membrange-bundenem Ras und Ras1-166 in Lösungzusammen mit dem Komponentenbandender Zerlegung.

Die AmidI’-Bande des Ras1-166 in Lösung und des membrangebundenen Ras sind sichsehr ähnlich (Abb. 3.16), weisen aber geringe Unterschiede im α-Helix- (1650 cm−1) undβ-Sheet-Bereich (1630 - 1620 cm−1) auf. Die Zerlegung der beiden AmidI’-Banden ist inAbb. 3.16 dargestellt und die Ergebnisse sind in Tab. 3.3 zusammengefasst.

Zur Fehlerabschätzung der Methode wurden die Sekundärstrukturwerte der 3D-Struk-turen miteinander verglichen (Tab. 3.3). Hierbei zeigte sich eine Variabilität von fast3%-Punkten innerhalb der Random Coil-Werte der NMR Struktur und ein Unterschiedvon 1,3 - 6,1%-Punkten zwischen den Turn bzw. Random Coil Strukturen der NMRund der Röntgenstruktur. Weiterhin lag der Unterschied zwischen der NMR-Struktur

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und der Bandenzerlegung von Ras1-166 zwischen 0,6 und 1,8%-Punkten (Tab. 3.3).Daher wurde der Fehler der Methode auf 3%-Punkte geschätzt. Dieser Fehler beziehtsich jedoch auf die Bestimmung der Absolutwerte der Sekundärstrukturen und nicht aufdie relativen Änderungen zwischen den AmidI’-Banden, die mit grösserer Genauigkeitbestimmt werden können.

Ras1-166 in Lösung und das membrangebundene Ras besitzen eine unterschiedliche Re-siduenanzahl (166 und 188). Daher wurden die Prozentwerte der Bandenzerlegung indie Aminosäureanzahl pro Sekundärstruktur umgerechnet (siehe Tab. 3.3). Geht manvon einer strukturell unveränderten G-Domäne aus, entspricht die Differenz der Amino-säureanzahl pro Sekundärstruktur der Sekundärstruktur des Membranankers. Aus derBandenzerlegung geht hervor, dass das membrangebundene Protein zusätzliche 12As. inβ-Sheet-Struktur, 1As. in Random Coil-Struktur, 6As. in α-Helix-Struktur und 3As. inTurn-Struktur besitzt. Demnach liegt der Anker hauptsächlich in β-Sheet- und α-Helix-Struktur vor.

3.3.4 Diskussion

Die Messungen zeigen, dass die AmidI’-Banden des löslichen und membrangebundenenProteins sehr ähnlich sind und nur graduelle Unterschiede aufweisen. Das lässt vermuten,dass die Struktur der G-Domäne bei Membrananlagerung unverändert bleibt. Wenn mandavon ausgeht, dass die G-Domäne gar keine strukturellen Änderungen durchmacht,können die gemessenen Unterschiede als die Struktur des Ankers aufgefasst werden.

Demnach besteht der Anker aus sechs α-Helixresiduen , 12 β-Sheetresiduen und einerkleinen Anzahl von Random Coil- und Turn-Residuen (Tab. 3.3). Der α-Helixanteilstimmt mit NMR-Untersuchungen überein, in denen eine Verlängerung der C-terminalenα-Helix 5 bis zu As. 172 gemessen wurde (Thapar et al. (2004); Reuther et al. (2006a)).Die geringe Anzahl von Random Coil-Residuen ist für diese als unstrukturiert angenom-mene Sequenz zunächst überraschend. Da der Anker jedoch allein aufgrund der Membran-nähe Kontakte zu Lipidkopfgruppen ausbilden wird, ist eine andere Dynamik der Struk-tur als bei unstrukturierten Peptiden in Lösung zu erwarten. Der hohe β-Sheetanteilvon 12 Residuen deckt sich mit NMR-Untersuchungen der Lipidankers, in eine vorwie-gend hufeisenförmige Struktur des Ankers gefunden wurde, die als β-Sheet-ähnlich, abersehr flexibel eingestuft wurde (Reuther et al. (2006a), persönliche Mitteilung, DanielHuster, Universität Leipzig). Es kann jedoch nicht vollständig ausgeschlossen werden,dass es durch Ausbildung von H-Brücken zwischen den Peptidgruppen des Ankers und

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Tabelle 3.3: Sekundärstruktur von membrangebundenem Ras. Die Sekundärstrukturzusammensetzungeiner Röntgen- und einer NMR-Struktur von H-Ras1-166 sind im Vergleich zu den Ergebnissen der Ban-denzerlegungen von H-Ras in Lösung und membrangebundenem Ras gezeigt. Durch die Kalibrationder Zerlegung von löslichem Ras auf die Werte der NMR-Struktur wurde ein Kalibrationsparameter-satz generiert, der in der Auswertung der mit membrangebundenem Ras gemessene Spektren verwendetwurde. Durch Umrechnung der Prozentwerte in Aminosäuren (As.) und Subtraktion des löslichen vommembrangebundenen Ras ergibt sich bei Annahme einer strukturell unveränderten G-Domäne die Se-kundärstruktur des Ankerpeptides (167-188).

x-raya NMRb Lösungc Membrand Ankere

Sekundärstrukturanteil / %β-sheets 25,9 22,3 ± 1,9 21,0 ± 3 25,1 ± 3 56

random coils 13,3 19,4 ± 2,6 20,0 ± 3 18,1 ± 3 4α-Helices 37,3 35,5 ± 1,1 34,5 ± 3 24,6 ± 3 25

turns 23,5 22,8 ± 2,5 24,6 ± 3 33,3 ± 3 15SD 6,25×10−6 1,45×10−5

Sekundärstrukturanteil / As.β-sheets 43 37 ± 3 35 ± 5 47 ± 6 12

random coils 22 32 ± 4 33 ± 5 34 ± 6 1α-Helices 62 59 ± 2 57 ± 5 63 ± 6 6

turns 39 38 ± 4 41 ± 5 44 ± 6 3a Röntgenstruktur PDB-ID: 4Q21; Ras1-166 (Struktur wurde auf 166 Residuen gekürzt).b NMR-Struktur PDB-ID: 1CRP; Ras1-166, Mittelwert von 20 Modellen.c FTIR-Spektrum, Bandenzerlegung der AmidI’-Bande von Ras1-166, Mittelwert von vier Messungen.d ATR-FTIR-Spektrum, Bandenzerlegung der AmidI’-Bande von membrangebundenem Ras1-188, Mit-telwert von drei Messungen.

e Theoretische Sekundärstrukturzusammensetzung der Ankerregion 167-188As., entspricht der Diffe-renz (Membran - Lösung).

den Kopfgruppen der Membranlipide zu Verschiebungen der AmidI’-Moden kommt, dienicht durch die Sekundärstruktur bedingt sind. In Abb. 3.17 ist ein Modell der Mem-branverankerung von lipidiertem Ras zusammen mit den für den Anker berechnetenStrukturanteilen gezeigt.

Die Messungen in diesem Abschnitt wurden zusätzlich auch mit linearpolarisierter IR-Strahlung durchgeführt, die Auswertung ergab jedoch nur geringe Unterschiede in denSekundärstrukturen (< 1%, Daten nicht gezeigt). Für die in Abschnitt 3.2 gefundeneOrientierung des Proteins würden grössere Unterschiede erwartet, und auch der direkteVergleich der Amid-Banden aus diesen Experimenten und den Experimenten aus Ab-schnitt 3.2 zeigte, dass das Protein hier nicht, bzw. gering ausgerichtet war. Da dieExperimente in diesem Abschnitt in einer frühen Phase der Arbeit durchgeführt wurden,in der die Bilayerherstellung noch nicht optimiert war, könnte die geringere Ausrichtung

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Abbildung 3.17: Sekundärstruktur der Ankerregion von membrangebundenem Ras. Aus der Differenzder Sekundärstrukturen von Ras1-166 in Lösung und dem lipidierten membrangebundenen Ras wur-de unter Annahme einer strukturell unveränderten G-Domäne die Sekundärstruktur der Ankerregionberechnet. Das gezeigte Strukturmodell des membrangebundenen Ras wurde von Till Rudack (LS fürBiophysik, Ruhr-Universität Bochum) anhand von NMR-Daten (Thapar et al. (2004); Reuther et al.(2006a); Kraulis et al. (1994)) erstellt.

durch eine weniger planare Oberfläche hervorgerufen worden sein. Eine weniger planareOberfläche wiederum kann durch die Adsorption einer zweiten Schicht von Vesikeln anden SSLB verursacht sein und würde zu einem geringeren dichroitischen Signal führen.Diese Hypothese wird in den Abschnitten 3.1 und 3.2 eingehend diskutiert, weshalb andieser Stelle auf eine weitere Diskussion verzichtet wird. In einer IRRAS-Studie mit demauch im Rahmen dieser Arbeit eingesetzten semisynthetischen N-Ras wurde bei der Un-tersuchung der Adsorption an einen Lipidmonolayer eine ähnliche AmidI’-Absorptiongefunden. Da die erhaltenen Spektren jedoch ein zu geringes Signal/Rausch-Verhältnisaufwiesen (siehe hierzu auch die Diskussion von Kap. 4.3), konnten die Autoren keineAussage über die Sekundärstruktur des membrangebundenen Ras treffen (Meister et al.,2006).

Im nachfolgenden Abschnitt wird die Etablierung der differenzspektroskopischen Unter-suchung des membrangebundenen Ras beschrieben und die damit erhaltenen Differenz-spektren des Proteins mit denen von Ras in Lösung verglichen.

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3.4 Differenzspektroskopie an Ras Monolagen

3.4.1 Einleitung

Nachdem es gelungen war, das lipidierte Ras spezifisch an einem festkörpergestützten Li-pidbilayer zu immobilisieren (3.2), konnte anhand des Sekundärstrukturvergleiches mitRas in Lösung gezeigt werden, dass die Membranimmobilisierung keine grossen struk-turellen Änderungen hervorruft (3.3). Da jedoch auch geringe Strukturänderungen derNukleotidbindetasche einen bedeutenden Einfluss auf die Funktion haben können, wur-de die Aktivität des Proteins mit einem Ligandenbindungstest untersucht. Hierzu wurdeBeF−3 verwendet, das an Stelle das γ-Phosphats an RasGDP bindet, und so den Konfor-mationswechsel des Proteins vom OFF- in den ON-Zustand bewirkt (Díaz et al. (1997);Kötting et al. (2007)). Der Vergleich des γ-Phosphats einer RasGTP Struktur (PDB-ID: 1QRA) mit dem BeF−3 einer Struktur der GTPase Rap (RapGDP-BeF−3 -RapGAP,PDB-ID: 3BRW) zeigt, dass das γ-P-Atom und das Be-Atom einen ähnlichen Abstandzum β-P-Atom von 2,94Å (Be) und 2,99Å (γ-P) aufweisen. Desweiteren ist die Längeder Be-F Bindungen und die tetraedrische Koordination des Be-Atoms der Geometriedes γ-Phosphats sehr ähnlich. Diese strukturellen Ähnlichkeiten zeigen sich auch in ei-nem annähernd gleichen FTIR-Differenzspektrum des Amid-Bereiches von GTP- undGDP+BeF−3 -gebundenem Ras gegen den GDP-Zustand (Kötting et al. (2007)). Daherkann der RasGDP-BeF−3 -Komplex als Grundzustandsanalogon angesehen werden.

Berylliumfluoride bilden in wässriger Lösung ein Gleichgewicht zwischen den Komplexen[BeF4]2−, [BeF3(H2O)]−, [BeF2(H2O)2]0, [BeF(H2O)3]+ und [Be(H2O)4]2+ aus (Mesmerund Baes (1969)). Aufgrund der stark polarisierenden Wirkung des Be-Atoms kommtes bei pH-Werten größer als 5,8 zur Hydrolyse der koordinierenden H2O-Moleküle, sodass das Berylliumatom zum Teil von OH− komplexiert wird. Bei wässigen Lösungenmit alkalischem pH-Wert und einem geringen Konzentrationsverhältnis von Fluorid zuBeryllium kommt es daher zum Ausfall von unlöslichen Berylliumhydroxiden (Schmidtund Schmidbaur (1998); Schmidbaur (2001)). Da diese pH-Wert-Abhängigkeit bislangnoch nicht quantitativ beschriebenen ist, ist es nicht möglich die Konzentration der mitRas interagierenden Spezies BeF−3 für jeden pH-Wert exakt zu berechnen.

Trotz der Unwägbarkeiten bei der quantitativen Analyse eignet sich BeF−3 gut um denOFF/ON-Zustandswechsel zu induzieren und so den Effekt der Membrananbindung an-hand von Differenzspektren qualitativ zu untersuchen.

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3.4.2 Durchführung

Zunächst wurde ein SSLB wie in Abschnitt 3.1 beschrieben hergestellt, an dem nachfol-gend das lipidierte Ras immobilisiert wurde (siehe 3.2). In den frühen, mit D2O-Pufferdurchgeführten Experimenten wurde Puffer C verwendet, wobei sich nach einigen Stun-den ein weisslicher Niederschlag in den BeFx-Lösungen bildete. Daher wurde anschlies-send zur Aufnahme von BeF−3 -Differenzspektren ein im Vergleich zur Proteinanbindungniedrigerer pH-Wert verwendet, um den Ausfall von Berylliumhydroxiden zu vermeiden.Der Pufferwechsel von Puffer C (pH 7,4) nach Puffer D (pH 6,5) wurde durchgeführt,in dem die Küvette mindestens 30min mit Puffer D gespült und der Pufferaustauschanhand von Differenzspektren verfolgt wurde. Hierzu wurden in drei Spektrenreihen vonje 10min jeweils ein Spektrum pro Minute (200 Scans) gemessen. Die jeweiligen Refe-renzspektren wurden von der mit Puffer C gespülten Oberfläche, der Oberfläche nach10min und nach 20min Inkubation mit Puffer D aufgenommen.

Tabelle 3.4: Messablauf des Berylliumfluorid-Titrationen

Step ta %Ab %B %C %D %E Flowc Tod Scanse tspecf Refg

1 4 100 1 W 1000 1 X2 4 100-x x 1 W 100 13 Schleife → gehe zu Step2 mit anderem x

ReservoirdefinitionenA: Puffer DB: Puffer D; 4mM BeF2; 16mM NaFC:D:E:

a Dauer der Schrittes (min)b %-Anteil der gepumpten Puffer der verschiedenen Reservoirec Flussrate der Schlauchpumpe (ml/min)d Ziel des Duchflussvolumens (W steht für waste, Abfall)e Scans pro Spektrumf Wartezeit zwischen zwei Spektren (s)g X steht für die Messung eines Referenzspektrums

Die Titrationen mit BeF−3 wurden mit einer Lösung von 4mM BeF2 und 16mM NaFin Puffer D durchgeführt, die verschiedenen Konzentrationen mit dem in Abschnitt 2.4beschriebenen Aufbau gemischt und die Messungen nach dem in Tab. 3.4 beschriebenenAblauf durchgeführt. Die Dissoziationskonstante KD des RasGDP-BeF−3 -Komplexes wur-de mit Gl. 3.1 zunächst anhand der Beryllium-Konzentration c(Be) berechnet und erst

90


danach auf die c(BeF−3 ) umgerechnet. Hierbei ist Emax die maximale zu erreichendeExtinktion und E(c(Be)) die Extinktion bei der jeweiligen Beryllium-Konzentration.

E(c(Be)) = c(Be)× EmaxKD + c(Be) (3.1)

3.4.3 Ergebnisse

Abbildung 3.18: Berylliumfluorid induziert den Wechsel vom OFF- in den ON-Zustand. Gezeigt istder AmidI’-Bereich von 1850 - 1500 cm−1. Die Oberfläche wurde abwechselnd 10min mit Puffer und12min mit BeF−3 -haltigem Puffer gespült (Es wurden D2O-Puffer verwendet). Während des Experimentswurden Differenspektren der Ras-Monolage jeweils gegen den vorherigen Pufferzustand gemessen. DieAbsorptionsbande von Thr35, einer charakteristischen Bande des ON-Zustands, liegt bei 1681 cm−1.

Durch Inkubation des membrangebundenen Ras mit BeF−3 -Puffer konnte der Zustand-wechsel vom OFF- in den ON-Zustand induziert und differenzspektroskopisch nachgewie-sen werden (Abb. 3.18). Die erhaltenen Differenzspektren weisen Banden auf, die cha-rakteristisch für den Wechsel vom OFF- in den ON-Zustand sind, wie z.B. die positivedurch Thr35 verursachte Bande bei 1681 cm−1 (Bandenlage in D2O-Puffer, Kötting et al.(2007)). Der Zustandswechsel war vollständig reversibel, so dass bei mehrmaligem Wech-sel zwischen Puffer mit und ohne BeF−3 das gleiche Spektrum gemessen werden konnte.

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Die zeitliche Entwicklung der BeF−3 -Differenzbanden entsprach hierbei der Transportki-netik des Durchflusssystems (kompletter Austausch in 90 s), weshalb die Kinetiken derKomplexbildung und des Komplexzerfalls zeitlich nicht aufgelöst werden konnten.

Abbildung 3.19: Berylliumfluoriddifferenzspektren mit Störungsanteilen. Die Inkubation mit verschie-denen BeF−3 -Konzentrationen in H2O-Puffer führt zu Änderungen der Biegeschwingungsbande von Was-ser (δ(H2O)). Der Phosphatbereich ist oft durch Artefaktbanden des Silikonspacers überlagert.

3.4.3.1 BeF−3 -Differenzspektren

Da Differenzspektren Informationen über die Aktivität und die Struktur von Proteinenbeinhalten, sollte das BeF−3 -Differenzspektrum des membrangebundenen Ras mit einemSpektrum von Ras in Lösung verglichen werden. Für diesen Vergleich musste zunächstein Spektrum mit hoher Signalqualität in H2O gemessen werden. Bei Messung der BeF−3 -Differenzspektren in H2O zeigte sich jedoch, dass die Zunahme der Ionenstärke bei Inku-bation mit BeF−3 zu einer Änderung der δ(H2O)-Bande, und damit zu einer Verzerrungdes AmidI-Bereichs führt (3.19). Desweiteren waren Artefaktbanden im Phosphatbereich(1300 - 1000 cm−1), die durch Absorptionen des Silikonspacers verursacht werden, undeine grosse positive, aus dem Messbereich herausragende Absorptionsbande unterhalbvon 1000 cm−1 zu erkennen.

Um Spektren mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis und ohne Artefaktbanden zu erhalten,wurde eine Titration der Oberfläche mit BeF−3 -Lösungen verschiedener Konzentrationen

92


(0,4 - 3,6mM Be) durchgeführt. Da die KD des RasGDP-BeF−3 -Komplexes im niedrigenmillimolaren Bereich liegt (Díaz et al. (2000), eigene Messungen s.u.), sollte das Protein-differenzsignal eine hyperbolische, mit KD titrierende, und das δ(H2O)-Störungssignal ei-ne lineare Abhängigkeit von der BeF−3 -Konzentration aufweisen. Da die Artefaktbandendes Spacers keinen ursächlichen Zusammenhang mit der BeF−3 -Konzentration haben, be-sitzen alle drei Signale eine unterschiedliche Abhängigkeit von der BeF−3 -Konzentration.Daher konnte zur Trennung der Signale und Berechnung des puren BeF−3 -Differenzspek-trums die Methode der Multivariaten Kurvenanpassung mit alternierender least squaresOptimierung (MCR-ALS) angewendet werden (2.7, 2.7).

Abbildung 3.20: Komponentenspektren der MCR-ALS-Auswertung einer BeF−3 -Titration. Die Aus-wertung mit einer steigenden Anzahl von Startextinktionsprofilen zeigt die sukzessive Aufteiling dereinzelnen Artefaktbanden auf die jeweiligen Komponentenspektren (1-5).

Für die MCR-ALS-Auswertung wurden 24 Spektren aus zwei verschiedenen Titrationsrei-hen verwendet, wobei die unterschiedlichen Konzentrationen in den Titrationsreihen ran-domisiert gemessen wurden. Die Spektren wurden einer Offsetkorrektur zwischen 1820

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- 1800 cm−1 unterzogen und der spektrale Bereich von 2000 - 900 cm−1 in die Anpas-sung eingesetzt. Als Startextinktionsprofil für das OFF/ON-Signal wurde die Differenz-extinktion der positiven Bande bei 1158 cm−1 und der negativen Bande bei 1218 cm−1

verwendet. Für die zusätzlichen zwei bis fünf verwendeten Komponenten wurden normal-verteilten Zufallszahlen (SD = 5×10−6) als Startkomponenten verwendet.

Die Anpassung mit zwei Komponenten ergab zwei Ergebnisspektren, die beide Anteiledes BeF−3 -Differenzspektrums aufwiesen (Abb. 3.20A). Mit einer zusätzlichen Kompo-nente ergab sich ein weiteres Spektrum, dass eine Bande zwischen 1700 und 1600 cm−1

aufweist, die Ähnlichkeiten mit einer δ(H2O)-Bande besitzt (Abb. 3.20B). Das Differenz-signal ist jedoch auch hier auf die Spektren 1 und 2 verteilt. Bei Verwendung von vierKomponenten tritt zusätzlich ein Spektrum auf, dass für das Spacersignal typische Ban-den bei 1260 cm−1 und zwischen 1100 und 1000 cm−1 besitzt. Auch hier ist das OFF/ON-Spektrum über die Komponentenspektren 1 und 2 verteilt (Abb. 3.20C). Durch Hinzu-nahme einer zusätzlichen Komponente trennt sich das OFF/ON-Signal vom Spektrum2 ab, und die AmidII-Differenzbanden von Komponente 1 gewinnen an Intensität. Auchführt die Hinzunahme der fünften Komponente dazu, dass die δ(H2O)-ähnliche Bande inKomponente 3 von einer asymmetrischen Form in eine symmetrische Form übergeht, dienun eher δ(H2O)-Bande entspricht (Abb. 3.20D). Zwar sind auch bei fünf Komponentennoch OFF/ON-Spektrenanteile in anderen Spektren zu finden (4 und 5), diese Spektrenhaben jedoch eine geringere Intensität, was auch an ihrem höheren Rauschen zu erkennenist. Zum Vergleich mit einem in Lösung gemessenen OFF/ON-Differenzspektrum wurdeSpektrum 1 aus Abb. 3.20D einer linearen Basislinienkorrektur mit den Stützpunktre-gionen 2000 - 1980 cm−1 und 1820-1800 cm−1 unterzogen und auf den Maximalwert derDifferenzextinktion der Banden bei 1158 cm−1 und 1137 cm−1 des Startextinktionsprofilsskaliert.

Das mit Transmissions FTIR-Spektroskopie gemessene BeF−3 -Differenzspektrum vonH-Ras1-166 in Lösung wurde von Angela Kallenbach zur Verfügung gestellt. Das Spek-trum wurde mit 0,045 multipliziert um vergleichbare Extinktionen zum Spektrum desmembrangebundenen Ras zu erhalten. Die Spektren weisen überwiegend identische Ban-denpositionen auf, wie z.B. die für den Zustandswechsel von OFF nach ON charakteris-tische Thr35-Bande bei 1690 cm−1. Auch die übrigen Banden des AmidI- und AmidII-Bereichs weisen gleiche Bandenpositionen von 1676, 1664, 1642, 1630, 1581, 1565, 1547,1530 und 1514 cm−1 auf. Auch im Phosphatbereich zwischen 1300 und 1000 cm−1 lie-gen die prominentesten positiven Banden bei 1254 und 1158 cm−1 und die negativenBanden bei 1218 und 1137 cm−1 in beiden Spektren an den gleichen Positionen. Neben

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Abbildung 3.21: BeF−3 -Differenzspektrum von membrangebundenem Ras. Zum Vergleich ist ein BeF−3 -Differenzspektrum von H-Ras1-166 in Lösung gezeigt (gemessen von Angela Kallenbach). Das H-RasSpektrum wurde durch Multiplikation mit 0,045 auf eine ähnliche Differenzextinktion von E(1158 cm−1)- E(1137 cm−1) skaliert. Die Sterne kennzeichnen die grössten Unterschiede zwischen den Spektren.

geringen Intensitätsunterschieden im Amid-Bereich fehlen dem BeF−3 -Differenzspektrumdes membrangebundenen Ras zwei positive Banden bei 1410 und 1258 cm−1 und einenegative Bande bei 1714 cm−1. Desweiteren weist das Spektrum des membrangebunde-nen Proteins eine grosse breite Bande unterhalb von 1030 cm−1 auf, die dem in Lösunggemessenen Spektrum fehlt. Diese Bande könnte durch die Infrarotabsorption von BeF-Spezies verursacht sein, die im Referenzspektrum der ATR-Messung nicht, wohl aberbei der Transmissionsmessung vorhanden sind (Kötting et al. (2007), eigene Messungen,Daten nicht gezeigt).

3.4.3.2 BeF−3 -Titrationen

Aus den Extinktionen der Titrationskurven konnte nach Auftragung gegen die Beryl-liumkonzentration c(Be) anhand von Gl. 3.1 die Dissoziationskonstante KD des Ras-BeF−3 -Komplexes und die maximale Differenzextinktion ∆Emax berechnet werden (Abb.3.22, der KD ist um den Quotient c(Be)/c(BeF−3 ) skaliert, s. u. ). Die KD-Werte im Be-

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Abbildung 3.22: KD-Titration des membrangebundenen Ras mit BeF−3 . Mehrere BeF−3 -Titrationen(1,2 und 3) wurden im Abstand von zwei Tagen an der selben Probe (c) durchgeführt.

zug zu c(Be) liegen bei ca. 1mM, die Werte für ∆Emax variieren je nach Proteinmengeund Aktivität. Die in Abb. 3.22 gezeigten Titrationskurven sind an der selben Probeim Abstand von 0 h (c1), 44 h (c2) und 49 h (c3) aufgenommen worden. Durch einesolche Messung mehrerer Titrationskurven zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach derRas-Membrananlagerung kann die Aktivität des Proteins während der über mehrere Ta-ge verlaufenden Messreihe verfolgt werden. Als Aktivität kann die Grösse des maximalenBeF−3 -Differenzsignals ∆Emax im Verhältnis zur Gesamtproteinmenge aufgefasst werden.Der Quotient der Differenzextinktion (∆Emax), skaliert um die Anzahl der Aminosäuren(n), und der die Gesamtproteinmenge repräsentierende AmidII-Fläche (A(AmidII)) wirdim folgenden als Aktivitätsquotient (QAktBeFx) bezeichnet.

QAktBeFx = (∆Emax × n)/A(AmidII) (3.2)

QAktBeFx ist maximal bei komplett aktivem Protein und minimal bei inaktivem Protein.In Abb. 3.23 sind die Differenzsignale von mehreren Messungen unterschiedlicher Mess-reihen gegen die jeweilige AmidII-Bandenfläche aufgetragen. Bei einer Messreihe, bei derdas Protein von der Oberfläche dissoziiert, und das weiterhin gebundene Protein aktivbleibt, verändert sich der Quotient zwischen ∆Emax und der AmidII-Fläche kaum (a1:QAktBeFx = 0,34 cmAs; a3: QAktBeFx = 0,33 cmAs). Wird das Protein jedoch inaktiverund bleibt gebunden, verringert sich ∆Emax bei gleichbleibender AmidII-Fläche was zu

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einem niedrigeren QAktBeFx führt (c1: QAktBeFx = 0,18 cmAs, c3: QAktBeFx = 0,1 cmAs).Interessanterweise sind die KD-Werte der Messreihe c davon kaum beeinflusst, was zeigt,dass das Protein nicht in halbaktiven Zwischenzuständen vorliegt, sondern entweder ak-tiv oder inaktiv ist.

Abbildung 3.23: Aktivitätstest durch BeF−3 -Titration. Gezeigt sind die KD und ∆Emax-Werte vonmehreren Titrationen (Zahlen) unterschiedlicher Messreihen (Buchstaben), aufgetragen gegen die AmidII-Bande des immobilisierten Ras zum Titrationszeitpunkt. Der Quotient von ∆Emax und AmidII-Flächerepräsentiert die Proteinaktivität, der KD ist völlig unabhängig von der Oberflächenbeladung oderAktivität.

Die BeF−3 -Konzentration ist von der Beryllium- und Fluorkonzentration und vom pH-Wert der Lösung abhängig, wobei sich je nach Konzentrationsverhältnis und pH-Wertverschiedene BeFx(OH−)y-Spezies bilden. Für dieses dynamische Gleichgewicht wurdemit dem Programm Visual MINTEQ (Version 2.61, Gustafsson (2009)) berechnet, inwelchen Konzentrationen die aktive Komponente BeF−3 in den Experimenten vorlag.Bei Konzentrationen von 4mM BeF2 und 16mM NaF ergab sich ein Verhältnis vonc(BeF−3 ):c(Be) von 0,37. Das bedeutet, dass eine KD von 1mM im Bezug auf c(Be) einerKD von 370µM im Bezug auf c(BeF−3 ) entspricht.

3.4.4 Diskussion

In diesem Abschnitt wurde die Etablierung der Differenzspektroskopie an Ras-Monolagenbeschrieben, die aufgrund der geringen immobilisierten Proteinmenge von ca. 100 pmol

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erhebliche Anforderungen an die Stabilität von Probe und Messaufbaus stellt. Es wurdedas γ-Phosphat-Analogon BeF−3 verwendet, um den Einfluss der Membrananbindungvon Ras auf den Zustandswechsel vom OFF- in den ON-Zustand zu untersuchen.

Mit MCR-ALS konnte ein BeF−3 -Differenzspektrum aus den Daten extrahiert werden.Die Differenzspektren von membrangebundenem Ras und Ras in Lösung waren na-hezu identisch. Die Differenzbanden des Phosphatbereichs bei Anlagerung von BeF−3sind bislang noch nicht zugeordnet, da aber die α-Phosphatbande im GDP-Zustandbei 1230 cm−1 und im GTP-Zustand bei 1263 cm−1 liegt, kann angenommen werden,dass es sich bei der Bande bei 1245 cm−1 um eine blauverschobene α-GDP-Bande han-delt (Abb. 3.21, Allin et al. (2001)). Im GDP Zustand liegt die νa(β-PO−2

3 )-Bande bei1139 cm−1 und 1104 cm−1 und im GTP Zustand bei 1219 cm−1 (νa(β-PO−2 )). Die Anla-gerung von BeF−3 führt demnach zu einer zu einer Verstärkung der β-PO−2

3 -Absorptionbei 1104 cm−1 und einer verminderten Absorption bei 1139 cm−1. Desweiteren könntedie positve Bande bei 1157 cm−1 als eine Verschiebung der β-GDP Absorption zu dieserfür γ-GTP charakteristischen Bandenpososition interpretiert werden.

Die im Differenzspektrum des membrangebundenen Ras fehlenden Differenzbanden bei1714 und 1410 cm−1 sind ebenfalls noch nicht zugeordnet. Anhand von Literaturwer-ten lässt sich jedoch vermuten, dass sie durch eine Deprotonierung von Aspartat- oderGlutamat-Carboxylgruppen hervorgerufen wurden (Barth (2000)). Die Deprotonierungkönnte durch eine Änderung des pH-Wertes verursacht worden sein, die durch die Anbin-dung von BeF−3 an das Ras verursacht wurde. Da in wässiger Lösung ein dynamischesGleichgewicht zwischen den verschiedenen BeF-Spezies existiert und die nicht mit F ab-gesättigeten Bindungen des Be je ein H2O oder OH− binden, führt die Bildung vonRas-BeF−3 zur Einstellung eines neuen Gleichgewichts, und kann somit auch den pH-Wertes beeinflussen. Bei einem zu geringen Verhältnis von Fluor zu Beryllium (c(F) <10c(Be)) würde die BeF−3 -Anbindung zu einer Freisetzung von H2O bzw. OH− führen.Dies könnte das Probenvolumen basischer machen und so die Deprotonierung verursa-chen. Dieser Effekt kommt in den ATR-Spektren nicht zum Tragen, da das System imDurchfluss betrieben wird und die Proteinmenge sehr gering ist.

Zusammenfassend konnten anhand der Differenzspektren keine signifikanten Unterschie-de zwischen membrangebundenem Ras und Ras in Lösung erkannt werden. Die gerin-gen Unterschiede im AmidI-Bereich könnten auf Änderungen der Proteinorientierungzurückzuführen sein. Dies könnten jedoch nur kleinere Änderungen sein, da durch ei-ne vollständige Orientierungsänderung um 90 ° eine ca. 10-fach grössere Differenzbande

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zu erwarten wäre (vgl. 3.2). Eine weiterer Grund für die geringfügig unterschiedlichenIntensitäten könnte durch die MCR-ALS-Auswertung bedingt sein, da das OFF/ON-Spektrum geringfügig über zwei Komponentenspektren verteilt war. Eine Verbesserungder Auswertung z.B. über die Vorgabe von bekannten Spektren als Startwerte der Op-timierung könnte zu einer verbesserten Trennung der einzelnen Komponentenspektrenund damit zu einem eindeutigeren OFF/ON-Spektrum führen.

Die Kinetik der BeF−3 -Anlagerung an Ras besitzt Ratenkonstanten von 0,5 - 2 s−1 undkonnte daher aufgrund der langsamen Transportkinetik des Durchflusssystems nicht un-tersucht werden (Kötting et al. (2007); Díaz et al. (1997), zur Transportkinetik siehe3.6.5). Der hier ermittelte KD des RasGDP-BeF−3 -Komplexes von 370µM ist ca. 20-fachgeringer als der für die Mutante RasY32W ermittelte Wert von 8,1mM (Díaz et al.(1997)). Dies kann durch den weniger stabilen ON-Zustand dieser Mutante (PersönlicheMitteilung, Carsten Kötting, LS für Biophysik, Ruhr Universität Bochum), oder in ge-ringem Maße durch Unterschiede in der Berechnung der effektiven BeF−3 -Konzentrationverursacht sein.

Weiterhin konnten durch die wiederholte BeF−3 -Titration innerhalb einer Messreihe Ver-änderungen des Anteils von aktivem zu gebundenem Protein als Verringerung des Akti-vitätsquotienten QAktBeFx identifiziert werden. Zusätzlich konnte in Form des KD eineoberflächenbelegungsunabhängige Größe der Proteinaktivität ermittelt werden.

99


3.5 GTP Hydrolyse von membrangebundenem Ras

3.5.1 Einleitung

Nachdem die Vesikelspreitung zur Generierung eines SSLB etabliert (3.1) und die Anbin-dung von lipidiertem Ras an den Bilayer charakterisiert wurde (3.2), konnten die Sekun-därstruktur und die molekulare Orientierung des membrangebundenen Proteins ermit-telt werden (3.3 und 3.2). Danach konnte durch Verwendung des γ-PhosphatanalogonsBeF−3 die differenzspektroskopische Untersuchung der Ras-Monolage etabliert, und so dieAktivität des Proteins nachgewiesen werden (3.4). Diese Techniken und die dadurch er-möglichten Ergebnisse bildeten die Grundlage für die Untersuchung der GTP-Hydrolysevon membrangebundenem Ras, die in diesem Abschnitt beschrieben wird.

Die Einfluss der Membran auf die GTPase-Aktivität ist bislang noch nicht untersuchtworden, in NMR-Experimenten wurden jedoch gezeigt, dass farnesyliertes vesikelgebun-denes H-Ras eine erhöhte Flexibilität des zentralen β-Sheets, des p-Loops, des Switch1und Switch2, den Helices 1, 3 und 5 und von Loop 2 und 4 aufweist (Thapar et al.(2004)). Diese membraninduzierten Änderungen der Flexibilität könnten einen großenEinfluss auf die Bindung und die intrinsische Hydrolyse von GTP haben. Um diesenEinfluss zu untersuchen, wurde die Kinetik und das Differenzspektrum der Hydrolysevon membrangebundenem Ras mit Ergebnissen von Ras in Lösung verglichen.

Um die GTP Hydrolyse von membrangebundenem Ras zu untersuchen, muss das Pro-tein in den GTP Zustand gebracht werden. Die etablierten Methoden zum Nukleotid-austausch konnten jedoch weder mit dem lipidierten Ras in Lösung, noch mit dem mem-brangebundenem Protein durchgeführt werden. Daher musste zunächst eine Methodeentwickelt werden, die den Nukleotidaustausch in situ, am membrangebundenen Proteinerlaubte.

3.5.2 Durchführung

Zunächst wurde ein SSLB wie in 3.1 beschrieben hergestellt und das semisynthetischeRas wie in 3.2 beschrieben am Lipid-Bilayer immobilisiert. Anschließend wurde dasProtein durch eine differenzspektroskopisch detektierte BeF−3 -Titration wie in 3.4 be-schrieben auf seine Aktivität hin getestet. Danach wurde versucht, mit dem immobi-lisierten Protein einen Nukleotidaustausch durchzuführen. Hierbei lag das Protein im

100


GDP-Zustand vor und sollte in den GTP gebundenen Zustand überführt werden. Hier-zu wurde die EDTA-Methode (Tucker et al. (1986); Lenzen et al. (1998)) als Startpunktder Etablierung gewählt. Diese Methode beruht darauf, dass die Nukleotidaffinität desRas durch einen EDTA-vermittelten Entzug des an der Nukleotidbindung beteiligtenMg2+-Ions verringert wird. Allerdings musste beachtet werden, dass zweiwertige Katio-nen an der Stabilisierung des SSLB beteiligt sind, weshalb der Entzug von Mg2+ zurZerstörung der Membran führen könnte. Außerdem ist nukleotidbefreites Ras nicht sta-bil, was zu einer schnellen Denaturierung des Proteins führen kann. Unter Beachtungdieser Einschränkungen wurden unterschiedliche Konzentrationen, Mischungsverhältnis-se, Einwirkzeiten und Durchflussgeschwindigkeiten von EDTA, MgCl2, GTP und GDPgetestet. In Tab. 3.5 ist der Messablauf gezeigt, mit dem der Nukleotidaustausch unddie nachfolgenden Hydrolysemessungen erfolgreich durchgeführt werden konnten.

Tabelle 3.5: Ablauf des Nukleotidaustausches und der Hydrolysemessung.


1 4 100 1 W 1000 1 X2 5 50 50 1 W 200 163 5 100 1 W 200 164 4 100 1 W 1000 1 X5 x 50 50 1 W 200 165 6 50 50 1 W 200 166 10 100 1 W 200 167 Schleife → gehe zu Step1 mit x=(10,20,40)

ReservoirdefinitionenA: Puffer D ohne GDPB: Puffer D ohne GDP; 4mM BeF2; 16mM NaFC: Puffer D ohne GDP und Mg2+; 20mM EDTAD: Puffer D ohne GDP und Mg2+; 0,1mM GTPE:


Für die Referenzmessung der Hydrolysekinetik von Ras in Lösung wurde ein N-Ras1-181Konstrukt verwendet, das C-terminal einen Strep-Tag und nachfolgend einen His-Tagaufwies (N-Ras1-181StrepHis). Der Nukleotidaustausch von 3mg Protein wurde in 200µl

101


Tabelle 3.6: Messablauf der Hydrolysemessung von N-Ras in Lösung.

Messdauer (min) Scans pro Spektrum Wartezeit zwischen Spektren (s)

30 200 160 400 5120 1000 602880 2000 300

Volumen wie in Abschnitt 2.2.2 beschrieben durchgeführt und die Austauscheffizienzmit HPLC (2.2.4) ermittelt. Danach wurde das Protein entweder direkt in die FTIR-Messung eingesetzt oder in flüssigem Stickstoff schockgeforen und bei -80 °C gelagert.Die FTIR-spektroskopische Hydrolysemessung erfolgte mit der Aquaspec-Zelle wie inAbschnitt 2.5 beschrieben. Hierzu wurden 40µl des GTP-gebundenen Proteins mit einerHamiltonspritze in die Aquaspec-Transmissionszelle injiziert und die Messung gestartet.Vor der Injektion wurde die Aquaspec-Zelle 10× mit 50µl Puffer NB gespült, und kurzdavor ein Hintergrundspektrum mit 2000 Scans aufgenommen. Die Messungen wurdebei 20 ° über 32 h nach dem in Tab. 3.6 gezeigten Messablauf durchgeführt.

Als Vergleichskriterium von differenzspektroskopischen Messungen von Proteinen in ver-schiedenen Probenzuständen (z.B. Transmission vs. ATR) kann der Quotient aus derExtinktion einer Differenzbande und der Gesamtextinktion einer Bande der Probe ge-bildet werden (siehe 3.4.3.2). Beim Vergleich von zwei Proteinen mit unterschiedlicherResiduenanzahl, aber gleicher, das Differenzspektrum erzeugender, aktiver Domäne mussdie AmidII-Bandenfläche pro Aminosäure zur Berechnung verwendet werden. Der Quo-tient (Aktivitätsquotient, QAktHyd) ist maximal bei aktivem Protein und minimal beiinaktivem Protein (siehe hierzu auch 3.4). QAktHyd wurde nach Gl. 3.3 mit der Differenz-extinktion der αGTP- und αGDP-Bande (∆E), der Anzahl von Aminosäuren n und derFläche der AmidII-Bande (A(AmidII)) berechnet und zum Vergleich der Hydrolysemes-sungen verwendet.

QAktHyd = (∆E × n)/A(AmidII) (3.3)

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Abbildung 3.24: Nukleotidaustausch von membrangebundenem Ras. Der Nukleotidaustausch wurdenach dem in Tab. 3.5 beschriebenen Ablaufschema durchgeführt und die Referenzspektren (Ref.) derjeweiligen Phasen in Puffer gemessen. A: Der Austausch wurde anhand von charakteristischen Diffe-renzbanden verfolgt. B: Die einzelnen Phasen des Ablaufs sind farbcodiert dargestellt. Das BeF−3 -Signal(1) zeigt den Gesamtanteil an GDP-gebundenem Ras. Anhand der α-Differenzbande in EDTA+GTP-Puffer (2) lässt sich der Nukleotidaustausch verfolgen, das α-Differenzsignal in Puffer (3) entspricht derZunahme des Anteils von GTP-gebundenem Ras seit dem letzten Referenzspektrum (Ref.).

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3.5.3 Ergebnisse

3.5.3.1 Nukleotidaustausch

Nach Variation einiger den Nukleotidaustausch bestimmender Parameter war es möglichdas GDP des membrangebundenen Ras nach dem in Tab. 3.5 aufgeführten Ablaufsche-ma gegen GTP auszutauschen. Als besonders wichtig hat sich hierbei herausgestellt,dass während der Inkubation mit EDTA immer Nukleotid vorhanden sein muss, da dasProtein sonst irreversibel denaturiert (Daten nicht gezeigt). Diese Denaturierung konntedurch eine starke Zunahme von Banden bei 1623 und 1688 cm−1, die charakteristisch fürProteinaggregate sind, nachgewiesen werden. Die Irreversibilität zeigte sich darin, dasssich von Ras in diesem Zustand auch nach mehrstündiger Inkubation mit GDP keinBeF−3 -Differenzspektrum mehr messen liess. Mit dem optimierten Austauschprotokoll(Tab. 3.5) konnte jedoch innerhalb von 30min ein Differenzspektrum des RasONGTP-und RasOFFGDP-Zustands gemessen werden (Abb. 3.24A). Der zeitliche Verlauf desNukleotidaustausches wurde hierbei anhand der α-Differenzbande von RasONGTP undRasOFFGDP (GTP-Differenzsignal) verfolgt (Abb. 3.24). Als Marker für den Anteilvon GDP-gebundenem Ras wurde vor und nach jedem Nukleotidaustauschschritt einBeF−3 -Differenzspektrum erzeugt. Dabei sollte das Differenzssignal je kleiner sein, destoweniger GDP-gebundenes Ras vorhanden ist. Die BeF−3 -Differenzextinktion verringertesich durch die erste Inkubation mit EDTA+GTP von 4,5×10−4 auf 1,5×10−4. Dies zeigt,dass nach 10min Inkubation bereits 66% des Ras GTP-gebunden waren (Abb. 3.24B),was einem GTP-Differenzsignal von 3,3×10−4 entsprach. Im folgenden Austauschzyklusbei Inkubation mit EDTA+GTP über eine Dauer von 20min veringerte sich das BeF−3 -Differenzsignal von 1,9×10−4 auf 0,7×10−4, und die GTP-Differenzextinktion stieg umzusätzliche 1,4×10−4 an. Ein weiterer 40 minütiger Austausch veringerte das BeF−3 -Differ-enzsignal von 1,2×10−4 auf 0,6×10−4, wobei die GTP-Differenzextinktion um 1,0×10−4

anstieg. Auffällig ist die Erhöhung der BeF−3 -Signals bei den direkt aufeinander folgen-den BeF−3 -Inkubationen. Da die GTP-Differenzextinktion während den 10 minütigenPufferinkubationen unverändert blieb, also kein Hydrolyse ablief, kann die Erhöhungdes BeF−3 -Signals nur dadurch erklärt werden, dass BeF−3 die GTP-Hydrolyse beschleu-nigt. Gemessen am BeF−3 -Signal konnten durch die 70 minütige Inkubation mit ED-TA+GTP insgesamt 87% des membrangebundenen Ras in den GTP-Zustand gebrachtwerden. Dies entspricht einer aufsummierten und um den jeweiligen durch BeF−3 verur-sachten Rückgang korrigierten GTP-Differenzextinktion von 4,8×10−4. In nachfolgendenExperimenten ohne BeF−3 -Test wurde die Kinetik der GTP-Differenzbande während der

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Inkubation mit EDTA+GTP verfolgt und so festgestellt, dass das Protein nach 60minvollständig GTP-gebunden ist (Daten nicht gezeigt).

Nach der Etablierung des Nukleotidaustausches wurde die GTP-Hydrolyse von Ras un-tersucht. Hierzu wurde ein Nukleotidaustausch wie in Tab. 3.5 beschrieben durchgeführt,bei dem die Inkubationszeit mit EDTA+GTP auf 60min verlängert wurde. Es wur-den vier Hydrolyseexperimente an der selben Probe durchgeführt, und die Hydrolyse(Puffer nach EDTA+GTP) über 4 h, 4 h, 12 h und 2 h verfolgt. Da die Differenzsignalesehr geringe Extinktionen von 10−4 - 10−5 aufwiesen, und die Messungen über bis zu12 h verliefen, waren die Einflüsse von Messartefakten recht hoch. Folgende Einflüssekonnten in den Spektren als Störungen erkannt werden: Basislinienverkippungen und -verbiegungen, Wasserdampfbanden, Proteindissoziation vom SSLB, δ(OH2)- und ν(OH)-Differenzbanden von Wasser und Silikonspacerbanden. Zusammen mit dem Hydrolyse-signal sind dies sieben Effekte, die sich alle unterschiedlich auf die Spektren auswirken.Da diese Störsignale jedoch andere Spektren und Zeitverläufe als die Hydrolyse besitzen,wurde die Methode der multivariaten Kurvenanpassung mit alternierender least squaresOptimierung (MCR-ALS) angewandt, um die Störsignale vom Proteinsignal zu trennen(2.7).

Da die Anpassung mit einer zu grossen Anzahl von Komponenten zu einer Überanpas-sung der Daten führen kann (overfit), wurde die MCR-ALS-Auswertung mit einer unter-schiedlichen Anzahl von Komponenten durchgeführt. Die Ergebnisse der Anpassungenwurden nach folgenden Kriterien beurteilt:

• Die charakteristischen Banden jedes Komponentenspektrums sollten nur in demjeweiligen Spektrum vorkommen, d.h. dass z.B. das Hydrolysesignal nicht durchmehrere, sondern nur durch ein Spektrum beschrieben sein sollte. Dazu gehörtauch, dass die Spektren keine vorzeichenvertauschten Kopien voneinander sein soll-ten. Hierzu wurden die Spektren jeweils untereinander und mit bekannten purenSpektren von den o.g. Prozessen verglichen.

• Das Extinktionsprofil des Hydrolysesignals sollte vier absinkende Extinktionen be-schreiben, da dies schon in den Rohdaten zu erkennen war.

• Als weiteres Kriterium für eine gute Anpassung wurde ein geringes Rauschen imHydrolysespektrum und in der Hydrolysekinetik gewertet.

Zusätzlich zu diesen Kriterien wurden die Standardabweichung (SD, zwischen modellier-tem 3D-Spektrum und Rohdaten-3D-Spektrum), der Fehler der Anpassung relativ zum

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Abbildung 3.25: Startwerte für die MCR-ALS Auswertung. Vier Hydrolysereaktionen wurden an der-selben Probe gemessen und die 3D-Spektren global angepasst. Als Startwerte für die Anpassung wurdenkorrigierte Extinktionsverläufe der α(GTP-GDP)-Differenzbande (GTP-Hydrolyse), einer Wasserdampf-bande und der Basislinienverkippung vorgegeben. Vor den jeweiligen Hydrolysemessungen wurde einReferenzspektrum aufgenommen und danach ein Nukleotidaustausch zu GTP (Markierungen 1, 2, 3 und4) wie im Text beschrieben durchgeführt.

Experiment (LoF(exp), Lack of Fit) und zur PCA (LoF(PCA)) und das Bestimmtheits-mass (R2) bei verschiedener Komponentenanzahl verglichen.

Unter Beachtung dieser Kriterien wurde die Anpassung der 3D-Spektren zusammen mitden Extinktionsverläufen der drei offensichtlichsten Prozesse, Hydrolyse (αGTP - αGDP-Differenzbande), Basislinienverkippung (Extinktion bei 2030 cm−1) und Wasserdampf-konzentrationsänderung (Extinktion der Bande bei 1734 cm−1) als Startwerte begonnen(Abb. 3.25). Danach wurde die Anzahl der Startkomponenten schrittweise bis auf sechserhöht, wobei die zusätzlichen drei Komponenten aus normalverteilten Zufallszahlen (SD= 5×10−6) bestanden. Die Extinktionsverläufe, die für die Anpassung verwendet wurden,sind in Abb. 3.25 gezeigt. Die Verläufe der Basislinienverkippung und der Wasserdampf-banden waren unabhängig vom Probensignal und auch in jeder Messung verschieden. Soweisst z.B. Messung 2 die geringsten Basislinienschwankungen auf und nur bei Messung3 ist der Wasserdampfgehalt nicht konstant. Es ergaben sich also in allen vier MessungenStörungssignale mit jeweils unterschiedlichen Verläufen. Dies ermöglichte in der globa-len Auswertung der Daten die Störungen als unabhängige Komponenten zu identifizieren

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und vom Hydrolysesignal zu trennen.

Abbildung 3.26: Exinktionsprofil der MCR-ALS-Auswertung von vier Hydrolysemessungen. Erst abfünf Komponenten bestand das Ergebnis der Anpassung aus vier absinkenden Extinktionsverläufen. DasHydrolyse- und das Basisliniensignal sind deutlich zu erkennen, das Wasserdampfsignal konnte nicht alsEinzelkomponente angepasst werden.

3.5.3.2 Hydrolysespektren

Mit der optimalen Anzahl von fünf Komponenten konnte das Spektrum der intrinsischenHydrolyse von membrangebundenem Ras erfolgreich ermittelt werden. Die Verwendungvon weniger Komponenten führte zu einer Verteilung der Hydrolysebanden auf andereSpektren und zu schlechteren Kinetiken als der Ausgangskinetik (Abb. 3.26). Die Verwen-dung von mehr Komponenten führte zu einem vorzeichenvertauschten und sonst gleichenSpektrenpaar. Der Vergleich der statistischen Werte führte nicht zu einer solch klarenAussage über die optimale Komponentenanzahl, da die Werte zwischen drei und sechsKomponenten beinahe stetig zu (R2, LoF(PCA)) oder abnahmen (SD, LoF(exp)). Dasextrahierte Hydrolysespektrum wurde zur Rekonstruktion der gemessenen Extinktionenmit der Amplitude der monoexponentiellen Anpassung des Extinktionsverlaufes von Hy-drolysemessung 3 multipliziert (3.26). Das Spektrum hat eines hohes Signal-zu-Rauschenund eine αGTP-αGDP-Differenzextinktion, die mit 1,8×10−4 ca. 50 - 100-fach geringerist, als die von in Lösung gemessen Spektren. Das Spektrum wurde mit zwei Hydroly-sespektren von N-Ras in Lösung (N-Ras1-181HisTag, gemessen von Philipp Pinkerneil)

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Abbildung 3.27: Hydrolysedifferenzspektrum von membrangebundenem Ras. Zum Vergleich sind zweiHydrolysespektren von N-Ras1-181 in Lösung (gemessen von Philipp Pinkerneil) und H-Ras1-166 inLösung (gemessen von Frederick Großerüschkamp) gezeigt. Die Spektren wurde auf gleiche α-BandenDifferenzextinktionen skaliert. Hierzu wurde das H-Ras-Spektrum mit einem Faktor von 0,008 und dasN-Ras-Spektrum mit einem Faktor von 0,02 skaliert. Der Stern kennzeichnet den, abgesehen von denIntensitätsunterschieden, einzigen signifikanten Unterschied zwischen den Spektren. Das Spektrum vonH-Ras stammt von einer sehr konzentrierten Probe, was die Detektion von Banden im Wasserabsorp-tionsbereich (höherfrequent als 2500 cm−1) ermöglicht (Abb. 3.28), aber auch zu Totalabsorption imAmidI-Bereich führt.

und H-Ras in Lösung (H-Ras1-166, gemessen von Frederick Großerüschkamp) verglichen,wobei die Spektren von Ras in Lösung um den Faktor 0,016 (H-Ras) und 0,038 (N-Ras)skaliert wurden, um gleiche α-Bandenextinktionen zu erhalten. Dieser Vergleich ergab,dass alle Bandenpositionen an denselben Stellen liegen (Abb. 3.27). Die Position der fürdie Hydrolyse charakteristischen Thr35-Differenzbande (Kötting et al. (2007)) liegt inallen drei Spektren bei 1690 cm−1 und auch die übrigen Bandenlagen des Amid-Bereichssind identisch. Auch die Differenzbanden des Phosphatbereichs (1300 - 1000 cm−1) befin-den sich an den gleichen Frequenzen wie bei den Hydrolysespektren in Lösung. So liegendie α-Banden bei 1263 cm−1 (GTP) und 1237 cm−1 (GDP), die β-Banden bei 1261 cm−1

und 1193 cm−1 und die γ-Banden bei 1144 cm−1 und 1101 cm−1. Der einzige signifikanteUnterschied zwischen den Spektren ist die fehlende negative Pi-Bande (1078 cm−1) desmembrangebundenen Proteins. Grund hierfür ist, dass das bei der Hydrolyse entstehende

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Pi vom Protein dissoziert und bei Transmissionsmessungen im Messvolumen verbleibt,im ATR-Experiment jedoch aus dem evaneszenten Feld diffundiert und aus der Küvettegespült wird. Obwohl die Spektren gleiche Bandenlagen besitzen, ergeben sich für dieBandenintensitäten einige Unterschiede. Die Banden des membrangebundenen Proteinssind im AmidI-Bereich sehr viel intensiver, so ist die Bande bei 1648 cm−1 mehr als 3-malso gross (mit negativem Vorzeichen) als die von N-Ras in Lösung. Hier muss erwähntwerden, dass das H-Ras Spektrum aufgrund einer sehr konzentrierten Probe kein Signalim AmidI-Bereich und wenig Signal im AmidII-Bereich besitzt. Dieses Spektrum zeigtjedoch Absorptionen im höherfrequenten Spektralbereich (> 2200 cm−1), weshalb es alsVergleichspektrum verwendet wird. Ein weiterer Intensitätsunterschied existiert im Phos-phatbereich zwischen 1250 und 1050 cm−1, wo das Spektrum des membrangebundenenRas eine insgesamt höhere Extinktion aufweist.

Abbildung 3.28: Hydrolysedifferenzspektrum von membrangebundenem Ras inklusive des Wasserab-sorptionsbereichs. Zum Vergleich ist ein Hydrolysespektrum von H-Ras1-166 in Lösung (gemessen vonFrederick Großerüschkamp) gezeigt, das um den Faktor 0,008 auf eine gleiche α-Banden Differenzextink-tionen skaliert wurde.

Da die Datenaufnahme der ATR-Messungen über den gesamten zugänglichen Spektralbe-reich von 4000 - 900 cm−1 erfolgte, enthält das Hydrolysespektrum auch den sog. Wasser-bereich (3600 - 2500 cm−1), in dem die Extinktionsänderungen von proteingebundenen

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Wassermolekülen zu beobachten sind. Abb. 3.28 zeigt den kompletten Spektralbereichim Vergleich zu dem in Lösung gemessenen H-Ras-Spektrum, das allerdings nur bis2800 cm−1 reicht. Beide Spektren weisen eine positive, breite und wenig intensive Bandebei ca. 2460 cm−1 und eine negative, sehr breite Bande von ca. 2500 bis 3400 cm−1 auf. ImATR-Spektrum sind noch weitere positive Banden bei 2954, 3206, 3280 und 3500 cm−1

zu erkennen, die innerhalb der breiten negativen Bande liegen. Die Bedeutung dieser Ban-den ist noch unklar, einige mögliche Ursachen könnten Umgebungsänderungen von ali-phatischen Aminosäureseitenketten (2950 - 2850 cm−1), AmidA-Absorptionsänderungen(3280 cm−1), Änderungen der OH-Schwingungen der Phosphate und Änderungen derproteingebundenen Wassermoleküle sein.

3.5.3.3 Hydrolysekinetik

Abbildung 3.29: Hydrolysekinetik von membrangebundenem Ras und Ras in Lösung. Gezeigt ist dienormierte α(GTP-GDP)-Differenzkinetik der Hydrolyse von membrangebundenem Ras (Messung 3 ausAbb. 3.25) und Ras in Lösung zusammen mit ihrer monoexponentiellen Anpassung (rot).

Die Kinetik der GTP-Hydrolyse wurde anhand des Extinktionsverlaufes des in Abb. 3.28gezeigten Hydrolysespektrums analysiert. Der Extinktionsverlauf war das Ergebnis derglobalen Anpassung von vier Messungen (Abb. 3.26). Zur Auswertung der Kinetik wur-de jedoch nur der Extinktionsverlauf von Messung 3 verwendet, da nur diese Messungausreichend lang war, um die Hydrolyse vollständig zu detektieren. Die Kinetik des mem-

110


brangebundenen Ras wurde mit einer Messung von Ras in Lösung (N-Ras1-181StrepHis,3.5.2) verglichen. Diese Messung wurde bei gleicher Temperatur, in gleichem Puffer undmit zu 93% GTP-gebundenem N-Ras wie in 3.5.2 beschrieben durchgeführt.

Abb. 3.29 zeigt den Extinktionsverlauf von membrangebundenem Ras im Vergleich mitder α(GTP-GDP)-Differenzkinetik von Ras in Lösung, jeweils auf eins normiert. Diemonoexponentielle Anpassung der Kinetiken ergab nahezu identische Ratenkonstantenvon (7,3 ± 0,1)×10−5 s−1 für das membrangebundene Ras und (5,0 ± 0,1)×10−5 s−1 fürRas in Lösung. Dies zeigt, dass die intrinsische Hydrolyse nicht bzw. kaum durch dieMembranimmobilisierung beeinflusst ist.

Da die Hydrolysekinetik durch inaktives Ras verfälscht sein könnte, wurde für beideProben der Aktivitätsquotient QAktHyd nach Gl. 3.3 berechnet. Das membrangebunde-ne Ras hatte eine AmidII-Fläche von 0,73 cm−1, eine α-Bandendifferenzextinktion von4,8×10−4 (Abb. 3.24) und besitzt 188As, was einen QAktHyd von 0,123 cmAs ergibt. Daslösliche Protein besaß eine AmidII-Fläche von 0,38 cm−1, eine α-Bandenextinktion von3,5×10−4 und 196As. womit sich ein QAktHyd von 0,182 cmAs berechnet. Dieser 1,5-fachgeringere Aktivitätsquotient kann bedeuten, dass das membrangebundene Ras bereitszu 34% inaktiv ist oder dass der Nukleotidaustausch unvollständiger war als bei Ras inLösung. Da der Unterschied jedoch relativ gering ist, zeigt dieser Vergleich zunächst, dassbeide Proteine in ähnlichen Zuständen vorliegen und dass die Berechnung von QAktHyd

ein gute Möglichkeit zum Vergleich verschiedener Proteinproben bietet.

3.5.4 Diskussion

Im Rahmen der zuvor beschriebenen Experimente konnte der Nukleotidaustausch vonmembrangebundenem Ras etabliert und ein Hydrolysespektrum von hoher Qualität ge-messen werden. Das Spektrum war im AmidI- und AmidII- sowie im Phosphat-bereichbis auf geringe Intensitätsunterschiede identisch zu den in Lösung gemessenen. Auch dieBandenlagen stimmten mit denen von publizierten Hydrolysespektren überein (Köttinget al. (2007, 2008)). Die Ratenkonstanten der intrinsischen Hydrolyse an der Membranund in Lösung unterschieden sich kaum, denn das membrangebundene Ras war lediglichum den Faktor 1,2 schneller. So konnte gezeigt werden, dass die Membranimmobilisie-rung keinen Einfluss auf intrinsische Hydrolyse von Ras hat.

Ein Vorteil der ATR-Technik ist die durch das evaneszente Feld begrenzte Schichtdi-cke. Dies verhindert die in Transmissionsmessungen durch Wasserschichten > 10µm

111


verursachte Totalabsorption und ermöglicht so die gleichzeitige Analyse des AmidI-, desPhosphat- und des Wasserabsorptions-Bereichs. So konnten in dieser Arbeit zum erstenmal Differenzbanden der GTP-Hydrolyse von Ras im Wasserbandenbereich zwischen3700 und 2500 cm−1 gemessen werden (Abb. 3.28). Die Differenzbanden bestehen auszwei breiten positiven Banden bei 3500 und 2460 cm−1, einer sehr breiten negativenBande zwischen 3400 und 2500 cm−1, einer grossen schmalen Bande bei 3280 cm−1 undmehreren kleinen Banden. Ein Erklärungsansatz für dieses Bandenmuster ergibt sichaus den Wasserabsorptionsbanden. Die Absorption von bulk-Wasser liegt bei 3600 cm−1

(νas(OH)) und 3450 cm−1 (νs(OH)) und verschiebt bei Ausbildung von starken H-Brückenin Richtung niederfrequent, wobei sich die Absorptionsbande durch Kopplung mit derUmgebung verbreitert (Pimentel und McCellan (1960)). Demnach könnte die breite nega-tive Bande zwischen 3500 und 2500 cm−1 durch eine Abnahme der H-Brücken zwischenH2O und Ras hervorgerufen sein. Die positive Bande bei 3500 cm−1 entspräche somit derZunahme von bulk-Wasser. Diese Erklärung wird durch die Kenntnis der 3D-Strukturenvon RasONGTP (1QRA) und RasOFFGDP (1CRP) gestützt, da Ras im OFF-Zustanddurch die sehr flexiblen Switch-Regionen dem Solvens eine größere Oberfläche bietet,als im geschlossenen ON-Zustand (Vetter und Wittinghofer (2001)). Eine grössere Ober-fläche führt dabei zu mehr H-Brücken mit H2O und könnte somit die Ursache für dieo.g. Unterschiede in den Banden für bulk- und H-Brücken gebundenes H2O sein. Diewenig intensive positive Bande bei 2460 cm−1 könnte demnach durch die Verstärkungvon H-Brücken einiger weiterhin Ras-gebundener H2O-Moleküle verursacht sein.

Die Intensitätsunterschiede der Hydrolysespektren von membrangebundenem Ras undRas in Lösung könnten durch die in Abschnitt 3.2 beschriebene Orientierung des Proteinsim Bezug zur Membran verursacht sein. So kann das Hydrolysespektrum des membrange-bundenen Ras als ein Summenspektrum von Hydrolyse- und Orientierungsdifferenzspek-trum angesehen werden. Es wurden bereits Orientierungsänderungen von H-Ras beimÜbergang zwischen GTP- und GDP-Zustand postuliert (Gorfe et al. (2007a); Abankwaet al. (2008)), die sich jedoch auf methodisch umstrittene MD-Simulationen stützen (Per-sönliche Mitteilung, Till Rudack und Henrick te Heesen, LS Biophysik, Ruhr UniversitätBochum). Bei diesen Orientierungsänderungen dreht sich die G-Domäne um ca. 90 °, sodass die α-Helices 3, 4 und 5 im GDP-Zustand senkrecht und im GTP-Zustand parallelzur Membran ausgerichtet sind (3.2, 1.5.3). Diese Orientierungsänderung würde zu ei-nem Dichroitischen Differenzspektrum mit einer Maximalextinktionen von 0,002 führen(vgl. Abb. 3.11). Da dies ca. 10-fach mehr ist, als die hier gemessenen Differenzextink-tionen kann davon ausgegangen werden, das in diesen Experimenten keine derart grosse

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Orientierungsänderung stattfand. Allerdings ist auch nicht auszuschliessen, dass in denvorliegenden Experimenten der GTP-GDP-abhängige Orientierungswechsel durch einezu hohe Oberflächenkonzentration oder das Fehlen von negativ geladenen Membranli-piden unmöglich war. Daher ist es in zukünftigen Experimenten geplant, dichroitischeHydrolysespektren in Abhängigkeit von der Oberflächenbeladung und verschiedenen Li-pidzusammensetzungen des SSLBs aufzunehmen.

Zum Vergleich der hier ermittelten Hydrolysekinetiken von Ras liegen nur wenige bei20 °C gemessene Literaturwerte vor. Da jedoch die Temperaturabhängigkeit der Hydroly-sereaktion bereits bekannt ist (Kötting und Gerwert (2004)), wurden einige Literaturwer-te auf 20 ° umgerechnet. Dabei ergaben sich Ratenkonstanten, die zwischen 4,1×10−5 s−1

(Yamasaki et al. (1994)) und 8,4×10−5 s−1 (John et al. (1989)) liegen und somit gut mitden hier ermittelten Werten von 5,0×10−5 s−1 (Lösung) und 7,3×10−5 s−1 (Membran)übereinstimmen.

In dieser Arbeit wurde die Membranimmobiliserung von Ras und der Nukleotidaustauschdes gebundenen Proteins etabliert, was es nun ermöglicht, auch von onkogenen Mutantenwie RasG12V oder Q61-Mutanten GTP-GDP-Differenzspektren zu messen und damitInformationen über den Bindungszustand des Triphosphats und das Verhältnis von OFFzu ON Zustand zu erhalten. Weiterhin ist es nun erstmals möglich, in kurzer Zeit (ca.1h) Differenzspektren zwischen zwei Ras-Zuständen mit jeglicher Nukleotidbeladung z.B.isotopen- oder fluoreszenzmarkierte Nukleotiden zu erhalten. Das ermöglicht es Diffe-renzspektren eine ganzen Reihe von unterschiedlichen Nukleotiden in wenigen Stundenan derselben Probe zu messen und eröffent somit völlig neue Möglichkeiten der FTIR-spektroskopischen Untersuchung von GTPasen.

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3.6 Protein-Protein Interaktion von membrangebundenemRas mit NoreRBD

3.6.1 Das Ras Effektorprotein Nore1A

Das Protein Nore1A (Novel Ras Effector 1A, UniprotID: Q8WWW0-1) ist ein Effektor-protein der GTPase Ras. Nore1A hat eine Länge von 418As., ein molekulare Masse von47,1 kDa und besitzt drei Proteindomänen. In der Nähe des N-Terminus befindet sicheine membranbindende C1-Domäne, auch Cysteinreiche Domäne genannt (CRD, As. 122- 170), die Zinkionen komplexiert und das Second Messenger-Membranlipid Diacylglyce-rol (DAG) bindet (Abb. 3.30). Weiter C-terminal liegt die Ras-bindende Domäne (RBD,As. 274 - 364) und am C-Terminus liegt eine Coiled Coil-Domäne (CC, As. 366 - 413),über die Nore1A mit sich selbst oder anderen Proteinen oligomerisieren kann.

Abbildung 3.30: Domänenaufbau von Nore1A. Nore1A besitzt eine C1-Domäne (Cysteinreiche Do-mäne (CRD) die über Diacylglycerol (DAG) Membranbindung vermittelt, eine Ras-bindende Domäne(RBD) und eine Coiled Coil-Domäne (SARAH-Domäne, Sav/RASSF/Hpo Interaktions Domäne), überdie Nore1A mit anderen Proteinen oligomerisiert. (verändert nach Stieglitz et al. (2008))

Zusätzlich zur Interaktion mit Ras interagiert NoreRBD in vitro auch mit Rap1B, Rap2A,R-Ras, R-Ras2 (TC21) und R-Ras3 (M-Ras) (Wohlgemuth et al. (2005); Ortiz-Vegaet al. (2002); Miertzschke et al. (2007)). Bei Nore1A handelt es sich vermutlich umein Tumorsuppressorprotein, da seine Expression in zahlreichen Tumorzelllinien auf-grund von Promotormethylierungen unterdrückt ist und eine ektopische Expression zueinem verringerten Wachstum führt (Richter et al. (2009)). Die tumorsupprimierendeWirkung wird vermutlich durch Oligomerisierung mit der Serin/Threonin-Kinase MST1und die RasGTP-abhängige Membranlokalisation hervorgerufen. Durch die Membrannä-he kommt es bei MST1 zur Abspaltung einer autoinhibitorischen Proteindomäne durchdie Protease Caspase 3. Das nun katalytisch aktive MST1 gelangt in den Zellkern undlöst dort durch Histon-Phosphorylierung Apoptose aus (de Souza und Lindsay (2004);Richter et al. (2009)).

In diesem Projekt sollte die Möglichkeit etabliert werden, Protein-Protein Interaktionvon membranbebundenen Proteinen mit ATR-FTIR zu untersuchen und quantitativeErgebnisse über die Affinität und Kinetik der Interaktion zu erhalten. Exemplarisch füreine Ras-Effektor-Interaktion sollte die Frage beantwortet werden, inwiefern die Affinität

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und Kinetik der Ras-NoreRBD-Interaktion durch die Membranimmobiliserung von Rasbeeinflusst wird.

3.6.2 Durchführung

Für die Messungen wurde die NoreRDB-Mutante E217K verwendet (Nore1A-RBD, As.199-358, E217K), die von Daniel Filchtinski (Lehrstuhl Physikalische Chemie 1, Fakultätfür Chemie, Ruhr Universität Bochum) zur Verfügung gestellt wurde. Für die MutationE217K wurde kein Effekt auf die Interaktion mit Ras festgestellt (persönliche MitteilungDaniel Filchtinski), weshalb sie im folgenden dem Wildtypprotein gleichgesetzt wird.

Als Grundlage für das NoreRBD-Experiment wurde zuerst ein SSLB durch Vesikelsprei-tung generiert (3.1), das lipidierte N-Ras an der Oberfläche immobilisiert (3.2) unddessen Aktivität durch den BeF−3 induzierten Übergang vom OFF- in den ON-Zustandsichergestellt (3.4).

Das Protein wurde aus einer 0,75µM Stocklösung (Puffer D + BeF−3 ) durch einenMischer im Durchfluss auf 0,1; 0,2; 0,3 und 0,4µM verdünnt und mit 1ml/min für 10mindurch die Küvette gepumpt. Nach der Assoziation erfolgte die Dissoziation durch einen50minütigen Waschschritt mit Puffer D + BeF−3 . Während der NoreRBD-Anbindungund des Waschschrittes wurden im Abstand von 25 s Spektren gegen Puffer D + BeF−3 alsReferenz aufgenommen. Die Messungen wurden nach dem in Tab. 3.7 wie in Abschnitt2.4 beschrieben unter Standard-ATR-Messbedingungen durchgeführt, für die Proben-spektren wurden 100 Scans, für das Referenzspektrum 1000 Scans gemittelt. Vor jederInkubation mit NoreRBD wurde die Oberfläche 5 min mit BeF−3 -freiem Puffer gespültund nach dem Wechsel zum BeF−3 Puffer ein OFF/ON-Differenzspektrum des immo-bilisierten Ras so wie in 3.4 beschrieben aufgenommen. Dies sollte Aufschluss darübergeben, ob immer gleich viel Ras im ON-Zustand für die Interaktion mit NoreRBD zurVerfügung steht.

Die Kinetiken der Assoziation und Dissoziation wurden einzeln exponentiell angepasstund die apparenten Assoziationsraten (kobs) gegen die NoreRBD-Konzentration aufge-tragen. Aus dieser Auftragung wurde die Assoziationsratenkonstante kass durch lineareAnpassung der Daten mit Gl. 3.4 ermittelt (Schuck und Minton (1996)). Mit kass unddem aus der Dissoziation bestimmten Dissoziationsratenkonstante kdiss wurde die Disso-ziationskonstante mit KD(kin) = kdiss / kass berechnet. Zum Vergleich wurde die KD(eq)

aus den Gleichgewichtsextinktionen (Amplituden der monoexponentiellen Anpassung)

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Tabelle 3.7: Messablauf der NoreRBD-Messung


1 4 100 1 W 200 1 X2 3 100 1 W 200 13 3,6 100 1 W 1000 1 X4 10 100-x x 1 W 100 255 50 100 1 W 100 256 Schleife → gehe zu Step1 mit anderem x

ReservoirdefinitionenA: Puffer DB: Puffer D; 4mM BeF2; 16mM NaFC: Puffer D; 4mM BeF2; 16mM NaF; 0,5µM NoreRBDD:E:


der NoreRBD-Anbindungen nach Gl. 3.5 berechnet, wobei Emax dem Extinktionswertbei maximaler Oberflächenabsättigung mit NoreRBD entspricht.

kobs = kass × c(NoreRBD) + kdiss (3.4)

E(c(NoreRBD)) = c(NoreRBD)× EmaxKD(eq) + c(NoreRBD) (3.5)

Zusätzlich zu dieser Art der Auswertung wurden die Assoziationskinetiken mit der sog.integrierten Ratengleichung (Gl. 3.6) global angepasst, wobei sich Werte für kass undkdiss direkt aus der Anpassung ergeben.

E(t, c(NoreRBD)) = Emax × (1− e−(kass(int)×c(NoreRBD)+kdiss(int))(t−t0)) (3.6)

Aus den Ratenkonstanten der integrierten Ratengleichung wurde die Dissoziationskon-stante mit KD(int) = kdiss(int) / kass(int) berechnet.

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Abbildung 3.31: NoreRBD-Anbindung an membrangebundenes Ras. A: 3D-Spektrum der ATR-FTIR-Messung von 2000 - 1000 cm−1. B: Spektren der Assoziation der ersten Anbindung bei 0,3µM NoreRBD.C: Kinetiken der NoreRBD-Assoziation und -Dissoziation. Aufgetragen ist eine gemittelte Extinktion imBereich des Maximums der AmidII-Bande von 1550 - 1545 cm−1.

3.6.3 Ergebnisse

Die vor jeder NoreRBD-Anbindung gemessen Differenzspektren wiesen β-Bandendiffer-enzextinktionen von 2,7×10−4 bei 0,3µM, 2,4×10−4 bei 0,1µM, 2,6×10−4 bei 0,4µMund 2,5×10−4 bei 0,2µM auf. Da in der zuvor durchgeführten Titration mit BeF−3(Daten nicht gezeigt) ein theoretischer Maximalwert der β-Bandendifferenzextinktion(∆Emax) von 3,7×10−4 ermittelt wurde, bedeutet dies, dass ca. 70% des aktivierba-ren membrangebundenen Ras bei den NoreRBD-Anbindungen im ON-Zustand war. DieAmidII-Bandenfläche des immobilisierten Proteins vor Zugabe von NoreRBD lag bei0,264 cm−1 bei 0,3µM, 0,266 cm−1 bei 0,1µM, 0,266 cm−1 bei 0,4µM und 0,27 cm−1 bei0,2µM NoreRBD. Hieraus ergibt sich zusammen mit ∆Emax nach Gl. 3.2 ein QAktBeFx

von 0,26 cmAs. Bei Annahme eines maximalen QAktBeFx von 0,35 cmAs (siehe 3.4.3.2)bedeutet dies, dass ca. 75% des gebundenen Proteins aktiv waren.

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In den Messungen konnte eine konzentrationsabhängige Immobilisierung von NoreRBDan der Oberfläche beobachtet werden. Die Rohdaten der Messungen von allen vierNoreRBD-Konzentrationen wurden mit den Stützpunktregionen 2700 - 2680 cm−1 und1860 - 1850 cm−1 basislinienkorrigiert und sind in Abb. 3.31A im Bereich von 2000 -1000 cm−1 als 3D-Spektrum dargestellt. Die Extinktion der AmidI- und AmidII-Bandendes gebundenen NoreRBD liegt mit 1,5×10−3 deutlich über dem Rauschen von ca.2×10−5 womit sich ein S/N (Signal-Rausch-Verhältnis) von 75 ergibt. Die Amid-Bandenvon verschiedenen Zeitpunkten der Assoziationskinetik unterschieden sich nur in der In-tensitiät, nicht aber in der Form (Daten nicht gezeigt). Dies zeigt, dass während derAnbindung nur ein Prozess zeitlich aufgelöst werden konnte, also keine Orientierungs-änderung oder Umfaltung des anbindenden NoreRBD zu detektieren war. Zur weiterenAnalyse der Protein-Protein Interaktion wurde die Kinetik des Maximums der AmidII-Bande bei 1548 cm−1 (Abb. 3.31B) extrahiert, wobei zur Rauschunterdrückung der Be-reich von 1550 - 1545 cm−1 gemittelt wurde (Abb. 3.31C).

Die AmidII-Extinktionsverläufe (Abb. 3.32) weisen bis ca. 600 s bei allen vier NoreRBD-Konzentrationen einen starken Anstieg auf, wobei die Extinktionen einen minmalen Wertvon 0,9×10−3 bei 0,1µM und einen maximalen Wert von 1,3×10−3 bei 0,4µM aufwei-sen. Auffällig ist, dass das AmidII-Signal bei 0,3 und 0,4µM zwischen 500 und 600 skaum noch ansteigt, sich also das Gleichgewicht zwischen gelöstem und Ras-gebundenemNoreRBD nahezu eingestellt hat. Die Assoziationsphase von 70 - 580 s lies sich monoex-ponentiell angepassen wobei die Anpassung Ratenkonstanten kobs von 4,1×10−3 s−1 bei0,1µM, 5×10−3 s−1 bei 0,2µM, 7,3×10−3 s−1 bei 0,3µM und 8,2×10−3 s−1 bei 0,4µMNoreRBD ergab. Die Assoziationsratenkonstate kass wurde durch eine lineare Regressionder Auftragung der einzelnen kobs-Werte gegen die NoreRBD-Konzentration berechnet(Abb. 3.33A) und ergab einen Wert von (1,47 ± 0,09)×10−2 µM−1s−1. Die Dissoziations-ratenkonstante entspricht dem y-Achsenabschnitt der Regression und liegt bei kdiss(ass)= (2,52 ± 0,26)×10−3 s−1 (Abb. 3.33A). Aus der globalen Anpassung der Assoziations-kinetik mit der integrierten Ratengleichung ergaben sich ähnliche Werte von kass(int) =(1,57 ± 0,07)×10−2 µM−1s−1 und kdiss(int)) = (2,2 ± 0,2)×10−3 s−1.

In der Waschphase, die von 600 - 3600 s dauerte, ging das AmidII-Signal auf unter 2×10−3

bei 0,1 und 0,2µM und auf 6×10−3 bei 0,3 und 0,4µM zurück. Da sich die Dissoziati-onskinetiken nur schlecht monoexponentiell anpassen liessen (Abb. 3.32), wurden zweiExponentialfunktionen benutzt, um die Dissoziationsratenkonstanten zu extrahieren. Dadie Ratenkonstanten in unabhängigen Anpassungen nahe beieinander lagen (Daten nichtgezeigt), konnte eine globale Anpassung der Daten durchgeführt werden. Hierbei wur-

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Abbildung 3.32: Anbindung von NoreRBD an membrangebundenes Ras. Aufgetragen ist die basisli-nienkorrigierte AmidII-Extinktion bei 1547 cm−1 wie in Abb. 3.31C gezeigt. Die Anbindungen wurdennacheinander an demselben Ras-Monolayer durchgeführt, wobei jeweils vor Zumischung von NoreRBDein Referenzspektrum gemessen wurde. Der Zeitpunkt des Referenzspektrums wurde für jede Anbindungals t = 0 gesetzt. Nach 500 - 600 s (grau unterlegte Bereich) ist das Gleichgewicht der Anbindung annä-hernd erreicht. Die Assoziationsphase wurde monoexponentiell und mit einer integrierten Ratengleichung(3.6) global angepasst. Die Dissoziationsphase wurde mono- und biexponentiell angepasst, die Werte derAnpassungen finden sich in Abb. 3.33 und Tab. 3.8. Ras wurde während den Messungen durch BeF−3 -haltigen Puffer im ON-Zustand gehalten und nach jeder Messung durch Spülen mit BeF−3 -freiem Pufferwieder in den OFF-Zustand gebracht.

den die Ratenkonstanten als globale Parameter gesetzt um die Amplituden mit größererGenauigkeit als bei der monoexponentiellen Anpassung bestimmen zu können. Die glo-bale Anpassung ergab Ratenkonstanten von (4,7 ± 0,2)×10−3 s−1 für kdiss1 und (1,1± 0,06)×10−3 s−1 für kdiss2. Um herauszufinden welche der beiden Raten den Prozessdes Komplex-Zerfalls von Ras und NoreRBD wiederspiegelt, wurden die Amplituden bei-der Raten gegen die Konzentration aufgetragen (Abb. 3.33B). Hierbei zeigte sich, dassdie schnellere Rate kdiss1 mit 0,08 - 0,017 die größeren Amplituden und zusätzlich eineKonzentrationsabhängigkeit aufwies. Die Amplituden von kdiss2 waren mit 0,006 - 0,009ca. 10-fach kleiner und bei allen NoreRBD-Konzentrationen annähernd gleich groß. DerUnterschied der Amplituden zeigt, dass der größte Anteil des Ras-NoreRBD-Komplexesmit kdiss1 zerfällt, weshalb es sich hierbei um die gesuchte Dissoziationsratenkonstantehandeln muss. Die langsamere Rate kdiss2 könnte durch andere Prozesse wie z.B. eineschwache Interaktion von NoreRBD mit dem Lipidbilayer zustandkommen.

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Abbildung 3.33: A: Bestimmung von kass und kdiss durch lineare Regression. B: Konzentrationsab-hängige Amplituden der globalen biexponentiellen Anpassung der Dissoziationskinetiken aus Abb. 3.32.C: Bestimmung von KD(eq) über die Anpassung der konzentrationsabhängigen Gleichgewichtsextinktio-nen. Als Gleichgewichtsextinktionen wurden die Amplituden der monoexponentiellen Anpassung derAssoziation (Abb. 3.32) verwendet.

Die Dissoziationskonstante KD der NoreRBD-Interaktion mit membrangebundenen Raswurde auf drei verschiedende Weisen ermittelt. Die einzelnen Anpassungen des Assozia-tion und Dissoziation ergaben einen Wert von KD(kin) =kdiss1/kass = 0,32 ± 0,075µM.Die Anpassung mit der integrierten Ratengleichung ergab KD(int) = kdiss(int)/kass(int) =0,14 ± 0,057µM und die Equilibriumsdissoziationskonstante, die nach Gl. 3.5 berechnetwurde, hatte einen Wert von KD(eq) = 0,2 ± 0,07µM (Abb. 3.33C). Die berechnetenWerte liegen in der gleichen Größenordnung (Tab. 3.8) und weichen lediglich um einenFaktor von 2 voneinander ab.

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Tabelle 3.8: Kinetische und thermodynamische Daten der Interaktion von NoreRDB mit membrange-bundenem Ras. Verschiedene Arten der Auswertung von Assoziations- und Dissoziationskinetiken erge-ben ähnliche Werte für kass, kdiss und kD.

Einzelna Integriertb Gleichgewichtc

kass µM−1s−1 (1,47 ± 0,09)×10−2 (1,57 ± 0,07)×10−2

kdiss s−1 (4,7 ± 0,2)×10−3 (2,2 ± 0,02)×10−3

KD µM 0,32 ± 0,075 0,14 ± 0,057 0,2 ± 0,07a Einzelne Exponentielle Anpassung der Assoziation und Dissoziation.b Anpassung der Assoziation mit integrierter Ratengleichung (Gl. 3.6).c Berechnung des KD nach Gl. 3.5 aus Gleichgewichtsextinktionen.

3.6.4 Diskussion

In diesem Projekt konnte erfolgeich die Interaktion von NoreRBD mit membrangebunde-nem Ras untersucht werden. Aus den Assoziationskinetiken liess sich ein Wert von 0,002für das maximal zu erreichende Nore-AmidII-Signal abschätzen. Dieser Wert kann mitdem theoretisch maximalen Wert verglichen werden, der sich aus der AmidII-Extinktiondes immobilisierten Ras (0,0078), der molekularen Masse beider Proteine (Ras: 21 kDa,NoreRBD: 18 kDa), dem Anteil des ON-Zustandes der aktivierbaren Ras-Moleküle (70%)und dem Anteil des aktiven Ras (75%) berechnen lässt. Für diese theoretisch maximaleAmidII-Bande von NoreRBD lässt ein Wert von 0,0078 × 18 kDa / 21 kDa × 70% × 75%= 0,0035 berechenen, der somit 1,75-fach höher ist, als gemessene Wert. Eine möglicheErklärung für diesen Abweichung ist, dass die Oberfläche des SSLBs zu 60 - 80% mitRas-Proteinen belegt ist (3.2), und daher an vielen der immobilisierten Ras-Moleküleeine Anbindung von NoreRBD sterisch behindert sein könnte. Ein weitere Faktor könntedie grössere Entfernung des NoreRBD zur Oberfläche sein. Für den verwendeten Aufbau(Germanium-IRE, H2O, Probenfilm « dp) eingibt sich nach Gl. 2.5 eine Eindringtiefe(1/e = 37%) von 386 nm. Mit der Eindringtiefe kann die elektrische Feldstärke E(z)abhängig vom Abstand zur Oberfläche nach Gl. 2.4 berechnet werden. Ausgehend voneiner Feldstärke von 1 bei 0 nm ergeben sich somit Werte von 0,988 bei 5 nm und 0,95 bei20 nm. Wenn NoreRBD 20 nm und Ras 5 nm von der Oberfläche entfernt wären, würdedie AmidII-Bande von NoreRBD demnach 3,8% kleiner sein.

Um die gewonnenen Daten auf ihre Konsistenz hin zu prüfen wurden zwei von Schuckund Minton (1996) vorgeschlagene Tests durchgeführt. Zum Einen sollte die kdiss(ass),die aus der Auftragung von kobs gegen c(NoreRBD) durch lineare Regression als y-Achsenabschnitt gewonnen wurde, gleich der kdiss aus der Dissoziation, zumindest je-

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doch positiv sein (Schuck und Minton (1996)). Dieses Kriterium ist hier mit kdiss(ass) =2,52×10−3 s−1 und kdiss = 4,7×10−3s−1 erfüllt. Weiterhin sollte die aus den Kinetikenermittelte KD(kin) und die aus den Gleichgewichtsextinktionen ermittelten KD(eq) dengleichen Wert aufweisen. Auch hierbei ergaben sich für KD(kin) = 0,32µM und KD(eq)

= 0,2µM ähnliche Werte, was für die Validität der Auswertung spricht.

Untersuchungen der Interaktion von NoreRBD mit doppelt palmitoyliertem H-Ras, dasan lipidierten Nanopartikeln gebunden war, ergaben KD-Werte von 0,45µM an der Mem-bran und 0,3µM für die Interaktion in Lösung (Filchtinski et al. (2008)). Diese Wertewurde bei 37 °C gemessen und entsprechen somit den in dieser Arbeit bei 20 °C ermit-telten KD-Werten von 0,32 und 0,2µM im Rahmen der Messgenauigkeit. Ein grosserUnterschied besteht jedoch in den Assoziations- und Dissoziations-Ratenkonstanten, diemit Stopped-Flow-Technik zu kass = 1,5µM−1s−1 und kdiss = 0,15 s−1 bestimmt wurden(Filchtinski et al. (2008)), und dieser Arbeit mit kass = 1,47×10−2 µM−1s−1 und kdiss= 4,7×10−3 s−1 jeweils 100-fach geringer waren. Allerdings haben die Autoren bei derAssoziation einen zusätzlichen 15 - 20-fach langsameren Prozess beobachtet, der eine ähn-lich große Amplitude wie die zur Auswertung verwendete Rate aufwiess. Dies wurde alsdie Interaktion von NoreRBD mit einer zweiten evtl. anders ausgerichteten Populationvon Ras Molekülen diskutiert. Es ist bekannt, dass geringere kass- und kdiss-Werte durchcrowding-Effekte auf der Oberfläche oder Massentransportphenomäne zustande kommenkönnen (Schuck (1996)). Diese Effekte können die Ratenkonstanten zwar um den Faktor10 - 100 verringern, der Quotient KD = kdiss/kass wäre jedoch nicht beeinflusst. Damit er-geben sich für die Verlangsamung der Ratenkonstanten drei Erklärungsansätze. Erstenskönnte eine zu hohe Ras-Oberflächenkonzentration, entsprechend dem crowding-Effekt,die Ursache sein. Zweitens könnte die vermutete Dimersierung des membrangebundenenRas die Nore-RBD-Interaktion beeinflussen und drittens könnte die Systemträgheit desDurchflusssystems die Ursache sein. Der Einfluss der Systemträgheit, die sich aus derGeometrie der Durchflusszelle und der Flussrate ergibt, wurde nachfolgend untersucht.

3.6.5 Einfluss der Transportkinetik auf die Anbindungskinetiken

Die Zeitauflösung von Durchfluss-Messsystemen ist meist durch die Geschwindigkeitdes Flüssigkeitsaustausches bestimmt. In diesen Fällen ist das Messsignal eine Faltungdes Probensignals mit einer sog. Transferfunktion, die die Systemträgheit repräsentiert(Garcia-Celma et al. (2008)). Die Transferfunktion ist hierbei die erste Ableitung derFlüssigkeitsaustauschkinetik, der sog. Transportkinetik.

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Abbildung 3.34: Einfluss der Transferfunktion auf die NoreRBD-Anbindungskinetik. A: Die Trägheitdes Durchflusssystems wurde durch Aufnahme einer Extinktionskinetik von NaN3 bestimmt. Die NaN3-Kinetik wurde durch eine Transportkinetik angepasst. B: Durch Ableitung der Transportkinetiken erge-ben sich die Transferfunktion. C: Zur Simulation der Transporteffekte wurde eine Exponentialfunktionmit der angepassten und einer langsameren Transferfunktion gefaltet. Die Ergebnisse der Faltung wurdenmonoexponentiell angepasst und die erhaltenen Zeitkonstanten mit der Ursprungs-Exponentialfuktionverglichen. D: Kinetiken der NoreRBD-Anbindung dargestellt mit gleicher x-Achsen Skalierung wie dieSimulationen.

Um zu prüfen, wie stark die vorliegenden Ergebnisse durch die Transferfunktion beein-flusst sind, wurde die Extinktionskinetik eines Reportermoleküls beim Einstrom in undbeim Ausstrom aus der ATR-Küvette gemessen (Abb. 3.34A). Als Reportermolekül wur-de Natriumazid (NaN3, 10mM) verwendet, das sich durch eine starke IR-Absorption beiisolierten Bandenlage bei 2049 cm−1 auszeichnet. Die Kinetik repräsentiert demnach diezeitliche Entwicklung der NaN3-Konzentration im evaneszenten Feld, die nur von denEigenschaften des Durchflusssystems, wie z.B. der Flussrate, dem Schlauchdurchmesserund der Schlauchlänge, dem internen Volumen und der Anzahl der durchflossenen Ven-tile und der Küvettengeometrie bestimmt ist. Die so gemessene Transportkinetik wurdedurch eine Gompertz Funktion angepasst (Abb. 3.34A), aus der durch Bildung der ersten

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Ableitung die Transferfunktion (Abb. 3.34B) berechnet wurde.

f(x) = Ae(−e(−k(x−xc))) (3.7)

Die Gompertz-Funktion (Abb. 3.34A, Gl. 3.7) wurde gewählt, weil sie sich gut zur Anpas-sung der Daten eignete und nicht aufgrund eines möglichen zugrundeliegenden Modells.Mit dieser Funktion konnten nachfolgend unterschiedliche Transportkinetiken rauschfreiund mit beliebiger x-Achsenauflösung simuliert werden.

Da die NoreRBD-Anbindungsdaten eine zu geringe Zeitauflösung im Vergleich zu denender Transportkinetik haben, konnten die Daten nicht miteinander entfaltet werden. Umden Einfluss der Transportkinetik auf die exponentiellen Anpassungen trotzdem abzu-schätzen, wurde eine Exponentialfunktion (At = A0e−t/τ mit A0 = 1 und τ = 100 s) mitder ermittelten Transferfunktion und einer langsameren Transferfunktion gefaltet (Abb.3.34C). Praktisch wurde dies durch Anwendung des „convolve“-Befehls des ProgrammesMatlab (R2006b, The MathWorks) erreicht. Bei der monoexponentiellen Anpassung derFaltungsergebnisse zeigte sich, dass die frühen Zeitbereiche stark durch die Faltung de-formiert waren, weshalb Faltung 1 ab 90 s und Faltung 2 ab 180 s angepasst wurde. DieAnpassung ergab Werte für τ von 101 s bei Faltung 1 und 112 s bei Faltung 2, was imVergleich mit der ursprünglichen Exponentialfunktion 1% bzw. 12% langsamer ist. Dieszeigt, dass die Assoziations- und Dissoziationsraten der NoreRBD-Anbindung an dasimmobilisierte Ras durch die Flüssigkeitsaustauschkinetik (Transferfunktion 1) um le-diglich 1% verlangsamt würden (Abb. 3.34D). Daher kann man die Systemträgheit alsUrsache für die langsameren Zeitkonstanten vernachlässigen.

3.6.6 Fazit

In diesem Projekt wurde die quantitative ATR-FTIR-Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen mit membrangebundenem Ras etabliert. Es konnte eine Dissoziationskon-stante von 0,2 bzw. 0,32µM für die Ras-NoreRBD-Interaktion ermittelt werden, wasin Einklang mit bislang veröffentlichten Werten steht. Interessanterweise finden sichbislang keine Publikationen in denen diese Technik so wie in dieser Arbeit, analog zuSPR-Spektroskopie-Biosensorsystemen (z.B. Biacore) verwendet wurde. Dabei besitztdie Technik den großen Vorteil, dass keine Labels wie z.B Trp-Mutanten oder fluoreszie-rende Nukleotide benötigt werden, so wie es bei Stopped Flow Messungen der Fall ist. DieMethode ist derart sensitiv, dass bei einer bimolekularen Interaktion von zwei Proteinen

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der gleichen Größe (z.B. 20 kDa) ab einer Oberflächenbeladung von ca. 1 pmol/cm2 aus-reichend hohe Signalstärken von 1×10−3 erreicht werden, um Bindungsaffinitäten auchbei höheren kass zu bestimmen. Hierzu muss allerdings die Geometrie der Durchfluss-zelle optimiert werden, damit Austauschzeiten von unter einer Sekunde möglich werden.Da bei der ATR-FTIR-Spektroskopie mit spektraler Auslösung gemessen wird, kann imGegensatz zu Biacore auch die Interaktion mit kleineren Molekülen z.B. Peptiden oderPharmaka analysiert werden, insofern sie zur Verschiebung von Absorptionsbanden führt(siehe 3.4). Ein weitere Vorteil, der sich aus der spektralen Auflösung in Kombinationmit lineardichroitischen Messungen ergibt, ist die Möglichkeit Struktur- und Orientie-rungsänderungen der interagierenden Proteine aufzuklären.

125

4 Zusammenfassung und Ausblick

Zunächst wurde die Herstellung festkörpergestützter Lipidmembranen auf dem internenReflektionselement etabliert. Die Charakterisierung dieser aus POPC bestehenden Lipid-membranen ergab, dass es sich um einzelne, lückenlose, planare Doppelmembranen mitder für POPC-Membranen charakteristischen Schichtdicke und Fluidität handelt.

Die Inkubation der erzeugten Membranen mit lipidiertem Ras führte zu einer sehr lang-samen ca. 10 h dauernden Proteinimmobilisierung, nach deren Ende 60–80% der Mem-branoberfläche mit Ras-Proteinen belegt war. Die Untersuchung des Bindungsmoduszeigte, dass das Protein wie im nativen Zustand über den Lipidanker mit der Membraninteragiert. Mit Hilfe der hier durchgeführten Experimente gelang zudem erstmals derNachweis einer orientierten Membranbindung von Ras, bei der der überwiegende Teilseiner α-Helices eher senkrecht zur Membran orientiert ist. In weiterführenden Arbeitenkann jetzt der Einfluss von putativ membraninteragierenden Residuen auf die Orien-tierung von Ras untersucht werden. Auch Membranen unterschiedlicher Ladungs- oderPhasenzustände, die durch Verwendung von unterschiedlichen Lipiden erzeugt werdenkönnen, könnten im Rahmen weiterer Experimente wertvolle Hinweise auf die Ursacheder orientierten Anbindung geben.

Die Sekundärstrukturanalyse des membrangebundenen Ras zeigte, dass die Membranan-bindung nur geringfügige Auswirkungen auf die Proteinstruktur hat. Zudem konntendurch die Sekundärstrukturanalyse Hinweise darauf erhalten werden, daß der Lipidankervorwiegend in β-Sheet-Struktur vorliegt.

Nachdem sowohl Immobilisierung als auch Orientierung und Sekundärstruktur des mem-brangebundenen Ras charakterisiert wurden, wurde zur funktionellen Charakterisierungdes Proteins die Differenzspektroskopie etabliert. Die vorliegenden Ergebnisse sind dieersten bekannten Beschreibungen Liganden-induzierter Differenzspektren von Protein-Monolagen, die ohne Oberflächenverstärkungseffekte gemessen wurden. Durch Inkuba-tion von GDP-gebundenem Ras mit dem γ-Phosphat-Analogon BeF−3 konnten Differenz-spektren zwischen ON- und OFF-Zustand erzeugt werden. Die Spektren wiesen keine

126


signifikanten Unterschiede zu denen von Ras in Lösung auf. Dies lässt auf eine glei-che Konformation der Nukleotidbindetasche von membrangebundenem und löslichemProtein schliessen. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde die Inkubation mit BeF−3 alsAktivitätsnachweis des immobilisierten Proteins genutzt.

Aufbauend auf den differenzspektroskopischen Methoden wurde der Nukleotidaustauschdes membrangebundenen Proteins etabliert und so die Untersuchung der GTP-Hydrolysevon Ras ermöglicht. Die Kinetik der intrinsischen Hydrolyse und das Hydrolysedifferenz-spektrum von membrangebundenem Ras wiesen nur geringe Unterschiede zu den in Lö-sung gemessenen Kinetiken und Spektren auf. Dies zeigt, dass weder die Membranimmo-bilisierung noch die orientierte Anbindung einen Einfluss auf die Nukleotidbindung undHydrolyseaktivität des membrangebundenen Proteins hat. In zukünftigen Experimentenkann der Nukleotidaustausch von membrangebundenem Ras zur differenzspektroskopi-schen Analyse z.B. von onkogenen Ras-Mutanten genutzt werden, die bislang nicht mitFTIR-Spektroskopie untersucht werden konnten. Durch die Verwendung von isotopen-markierten Nukleotiden könnte die Zuordnung aller Phosphatbanden durch Messung amselben immobilisierten Protein erfolgen, und so die probenabhängige Varianz eliminiertwerden. Weiterhin ermöglicht der Nukleotidaustausch die Quantifizierung des ON- zuOFF-Verhältnisses von verschiedenen Mutanten und bei Bindung von unterschiedlichenNukleotiden.Eine Besonderheit der gemessenen Hydrolysespektren ist die hervorragende Signalqua-lität im Bereich der Wasserabsorptionsbanden, wodurch es in zukünftigen Messungenmöglich sein wird, den Einfluss von Wassermolekülen auf die Hydrolyse-Reaktion zuuntersuchen.

In ersten Experimenten zur Protein-Protein-Interaktion von membrangebundenem Rasmit Effektoren zeigte sich, dass die Membranimmobilisierung keinen Einfluss auf dieAffinität zum Effektor NoreRBD hat. Die ATR-Technik wurde hiermit erstmalig analogzu SPR-Spektroskopie-Biosensorsystemen eingesetzt und eröffnet nun die Möglichkeit,andere Interaktionspartner wie Effektoren, GAPs und GEFs, sowie Modulatoren dieserInteraktionen wie small molecules zu untersuchen. Besonders interessant ist in diesemZusammenhang die Analyse des GEF-induzierten Nukleotidaustausches, der bisher inTransmissionsmessungen nicht untersucht werden konnte.

Abschließend ist festzustellen, dass das hier untersuchte membrangebundene Ras einevergleichbare Konformation und Aktivität aufweist wie Ras in Lösung, da wesentlicheParameter wie z.B. die Sekundärstruktur, die intrinsische GTP-Hydrolyse und die Effek-

127


torinteraktion ähnlich sind. Weiterhin wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmals gezeigt,dass das Protein spezifisch ausgerichtet an der Membran gebunden ist.

In dieser Arbeit wurde die ATR-FTIR-spektroskopische Untersuchung von membrange-bundenem Ras erfolgreich etabliert. Diese Methode ermöglicht nun die Bearbeitung einerVielzahl von interessanten Fragestellungen.

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Abkürzungen

Å Ångström, 10−10 mAbb. AbbildungATR Abgeschwächte TotalreflektionAs. AminosäureBeF−3 Beryllium-3-fluoridBeFx BerylliumfluoridBSA Rinderserumalbumin (bovine serum albumin)°C Grad Celsiuscm Zentimetercm−1 Wellenzahlδ Biegeschwingung∆ DifferenzDa DaltonDTT DithiothreitolEDTA EthylendiamintetraessigsäureE. coli Escherichia coliFTIR Fouriertransformiert, InfrarotFWHH Full Width at Half Height, volle Halbwertsbreite einer Bandeg GrammGAP Guanin-Nukleotid-aktivierende ProteinGDP Guanosin-5’-diphosphatGEF Guaninnukleotid-Austausch-FaktorG-Domäne Guanosin-Nukleotid-bindende DomäneG-Protein Guanosin-Nukleotid-bindendes Proteinh StundeIR InfrarotIRE Internes Reflektionselementk Kilo–

129

Abkürzungen

L LiterM molarm Milli–NaN3 NatriumazidNMR Nuclear Magnetic Resonance, KernspinresonanzspektroskopieNTA Nitrilo-Tri-Essigsäureµ Mikro–min Minuten Nano-p Pico-POPC Palmitoyl-Oleyl-PhosphatidylcholinRBD Ras-Binde-DomäneRMSD Root Mean Square Deviation, Wurzel der mittleren quadratischen

Abweichungrpm revolutions per minute, Umdrehungen pro MinuteRT Raumtemperaturs SekundeSUV Small Unilamellar Vesicle, kleiner Vesikel mit einzelner MembranSSLB Solid Supported Lipid Membrane, Festkörper-gestützte Lipid-

membranTab. TabelleTris Tris-hydroxymethyl-aminomethanUV Ultraviolettz. B. zum Beispiel

Für Aminosäuren wurden die üblichen Ein- und Drei-Buchstabenabkürzungen verwen-det.

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141

Abbildungsverzeichnis

1.1 Ras-Regulationszyklus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71.2 Ras-vermittelte Signaltransduktionskaskade . . . . . . . . . . . . . . . . . 81.3 3D-Struktur von Ras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101.4 Unterschiede der C-Termini von Ras-Isoformen . . . . . . . . . . . . . . . 111.5 Lokalisation von Ras-Nanoclustern in unterschiedlichen Membrandomänen 141.6 Modell der Orientierungsänderung der G-Domäne von Ras. . . . . . . . . 151.7 Semisynthetisches N-Ras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

2.1 Schematischer Aufbau von IR-Spektrometern . . . . . . . . . . . . . . . . 302.2 Schematische Darstellung des evaneszenten Feldes . . . . . . . . . . . . . . 322.3 Zusammenhang zwischen der Polarisation des evaneszenten Feldes und

der Polarisation der eingekoppelten IR-Strahlung. . . . . . . . . . . . . . . 342.4 Orientierte Spektren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 362.5 Verschachteltes Ordnungsparametermodell . . . . . . . . . . . . . . . . . . 382.6 Polarisatorineffizienz des verwendeten Aufbaus . . . . . . . . . . . . . . . 412.7 Verwendetes Messsystem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 442.8 Linearität der Mischung mit Ventrobot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 452.9 Aquaspec-Zelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 462.10 Schematische Darstellung der Bandenzerlegung . . . . . . . . . . . . . . . 482.11 Prinzip der MCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

3.1 POPC Spektrum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 563.2 Vesikelspreitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 573.3 Verschiedene Interaktionmodi von Vesikeln mit Oberflächen . . . . . . . . 593.4 BSA Adsorption . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 603.5 Lineardichroitische Spektren einen POPC-SSLB . . . . . . . . . . . . . . . 613.6 Ordnungsparameterkinetik von Vesikelspreitungen . . . . . . . . . . . . . 623.7 Spektren der Anbindung von lipidiertem Ras an einen POPC-SSLB . . . 683.8 Anbindung von lipidiertem Ras an einen SSLB . . . . . . . . . . . . . . . 69

142

Abbildungsverzeichnis

3.9 Anbindungen von lipidiertem Ras an einen SSLB . . . . . . . . . . . . . . 703.10 Stabilität der Ras-Membran-Interaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 713.11 Polarisierte Spektren der Ras Anbindung an einen SSLB . . . . . . . . . . 723.12 Kinetiken von polarisiert gemessenen Ras-Anbindungen . . . . . . . . . . 753.13 Ausrichtungen der G-Domäne im Bezug zur Membran . . . . . . . . . . . 783.14 Seitenkettenkorrektur der Absorptionsspektren von Ras . . . . . . . . . . 833.15 Zweite Ableitung und FSD der AmidI’-Bande von Ras . . . . . . . . . . . 843.16 Bandenzerlegung der AmidI’-Banden von Ras . . . . . . . . . . . . . . . . 853.17 Sekundärstruktur der Ankerregion von membrangebundenem Ras . . . . . 883.18 Berylliumfluorid induziert den Wechsel vom OFF- in den ON-Zustand . . 913.19 Berylliumfluoriddifferenzspektren mit Störungsanteilen . . . . . . . . . . . 923.20 Komponentenspektren der MCR-ALS-Auswertung einer BeF−3 -Titration . 933.21 BeF−3 -Differenzspektrum von membrangebundenem Ras . . . . . . . . . . 953.22 KD-Titration des membrangebundenen Ras mit BeF−3 . . . . . . . . . . . 963.23 Aktivitätstest durch BeF−3 -Titration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 973.24 Nukleotidaustausch von membrangebundenem Ras . . . . . . . . . . . . . 1033.25 Startwerte für die MCR-ALS Auswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1063.26 Exinktionsprofil der MCR-ALS-Auswertung von vier Hydrolysemessungen 1073.27 Hydrolysedifferenzspektrum von membrangebundenem Ras . . . . . . . . 1083.28 Hydrolysedifferenzspektrum von membrangebundenem Ras inklusive des

Wasserabsorptionsbereichs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1093.29 Hydrolysekinetik von membrangebundenem Ras und Ras in Lösung . . . 1103.30 Domänenaufbau von Nore1A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1143.31 NoreRBD-Anbindung an membrangebundenes Ras . . . . . . . . . . . . . 1173.32 Anbindung von NoreRBD verschiedener Konzentrationen an membrange-

bundenes Ras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1193.33 Kinetische Auswertung der NoreRBD- . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1203.34 Einfluss der Transferfunktion auf die NoreRBD-Anbindungskinetik . . . . 123

143

Tabellenverzeichnis

2.5 Messparameter der FTIR-Spektrometer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 312.6 Verwendete Extinktionskoeffizienten und Brechungsindices . . . . . . . . . 432.7 AmidI-Frequenzen der häufigsten Sekundärstrukturen . . . . . . . . . . . 47

3.1 Quantitative Informationen über die erzeugten SSLBs . . . . . . . . . . . 643.2 Infrarotabsorption von α-Helices . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 733.3 Sekundärstruktur von membrangebundenem Ras . . . . . . . . . . . . . . 873.4 Messablauf des Berylliumfluorid-Titrationen . . . . . . . . . . . . . . . . . 903.5 Ablauf des Nukleotidaustauschs und der Hydrolysemessung . . . . . . . . 1013.6 Messablauf der Hydrolysemessung von N-Ras in Lösung . . . . . . . . . . 1023.7 Messablauf der NoreRBD-Messung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1163.8 Kinetische und thermodynamische Daten der Interaktion von NoreRDB

mit membrangebundenem Ras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121

144

Bereits veröffentlichte Teile der Arbeit

Zeitschriftenbeiträge• Güldenhaupt, J., Adigüzel, Y., Kuhlmann, J., Waldmann, H., Kötting, C., and

Gerwert, K. „Secondary structure of lipidated Ras bound to a lipid bilayer“ FEBSJ, 2008, 275(23):5910–5918.

Posterbeiträge

• Yekbun Adigüzel, Jörn Güldenhaupt, Carsten Kötting, Jürgen Kuhlmann, HerbertWaldmann, and Klaus Gerwert, „ATR-FTIR investigation of membrane bound rasprotein“, III. Internationales Symposium des Sonderforschungsbereichs 642, No-vember 2006, Bochum, Deutschland

• Güldenhaupt, J., Adigüzel, Y., Kuhlmann, J., Waldmann, H., Kötting, C., andGerwert, K. „Towards timeresolved ATR-FTIR spectroscopy of membrane boundRas-Protein“, Membrane Interacting Peptides and Proteins, International BunsenDiscussion Meeting, März 2007, Halle(Saale), Deutschland

• Güldenhaupt, J., Adigüzel, Y., Kuhlmann, J., Waldmann, H., Kötting, C., and Ger-wert, K. „ATR-FTIR Spectroscopy of Ras Protein bound to solid supported lipidmembranes“, German Biophysical Society Meeting 2008 - GBSM 2008, Jahresta-gung der Deutschen Gesellschaft für Biophysik, September 2008, Berlin, Deutsch-land

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Lebenslauf

Persönliche Informationen

Geburtsdatum: 07.10.1977Geburtsort: WerneFamilienstand: ledigNationalität: deutschEltern: Klaus Güldenhaupt, Christel Güldenhaupt geb. FeldmannAdresse: Von-Einem-Str. 50, 45130 Essen

Ausbildung

1984–1988 Schiller Grundschule Bergkamen1988–1997 Städtisches Gymnasium Kamen1997–1998 Zivildienst, Biologische Station des Kreis Unna1998–2005 Studium der Biologie, Ruhr-Universität Bochum

Diplomarbeit am Lehrstuhl für Biophysik2005–2006 Betreuungstätigkeit am Lehrstuhl für Biophysik2006–2010 Promotion am Lehrstuhl für Biophysik

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Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbständig verfasst und bei keiner anderenFakultät eingereicht habe und dass ich keine anderen als die angegebenen Hilfsmittelverwendet habe. Es handelt sich bei der heute von mir eingereichten Dissertation umsechs in Wort und Bild völlig übereinstimmende Exemplare.Weiterhin erkläre ich, dass digitale Abbildungen nur die originalen Daten enthalten undin keinem Fall inhaltsverändernde Bildbearbeitung vorgenommen wurde.

Bochum, den 15.04.2010

Documents

ATR-FTIR-spektroskopische Untersuchungenvon ... · PDF fileATR-FTIR-spectroscopicanalysis ofmembrane-boundRas Dissertation toobtainthedegree DoctorofNaturalSciences attheFacultyofBiologyandBiotechnology