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Aus dem Department für Kleintiere und Pferde
der Veterinärmedizinischen Universität Wien
Klinik für Pferde
(Leiterin: Univ.-Prof. Dr. Florien Jenner, PhD, Dipl. ACVS, Dipl. ECVS)
Entwicklung einer Methode zur Feststellung und Analyse von toten Zellen in 2D-
Zellmigrationsassays auf Grundlage des Bildbearbeitungsprogramms Fiji/
ImageJ
Diplomarbeit
Veterinärmedizinische Universität Wien
vorgelegt von
Tobias Bettermann
Wien, im Juli 2019
Betreuerin: Univ.-Prof. Dr.med.vet. Florien Jenner Dipl.ACVS Dipl.ECVS
Co-Betreuerin: Dr.med.vet. Iris Ribitsch PhD.
Co-Betreuer: Michele Fenu MSc.
Inhaltsverzeichnis
1. Abkürzungen ..................................................................................................................... 1
2. Einleitung ........................................................................................................................... 3 3. Literaturrecherche ............................................................................................................ 3
3.1. Relevanz der Zellmigration ............................................................................................. 3
3.2. Zellmigration während der Wundheilung........................................................................ 3
3.2.1. Hämostase-/ Koagulationsphase .................................................................................. 4 3.2.2. Entzündungsphase ....................................................................................................... 6
3.2.3. Proliferationsphase ....................................................................................................... 8
3.2.4. Remodellierungsphase ............................................................................................... 11
3.3. Mechanismen der Zellmigration .................................................................................... 14
3.4. Formen der Zellmigration .............................................................................................. 15 3.5. Unterscheidung von 2D-/ 3D-Zellmigrations- und Invasionsassays ............................. 17
3.6. 2D-Zellmigrationsassays ............................................................................................... 18
3.6.1. Zellentfernungsmethoden .......................................................................................... 19
3.6.2. Zellexklusionsmethoden ............................................................................................ 22 3.7. Fragestellung/ Hypothese .............................................................................................. 26
4. Material und Methode .................................................................................................... 27
4.1. Literaturrecherche ............................................................................................................... 27
4.2. Ursprung der Zellen für die Zellkultur ............................................................................ 27
4.3. Zellgewinnung .................................................................................................................... 28
4.3.1. Isolation von Chondrozyten aus Knorpelgewebe ................................................... 28
4.3.2. Isolation von Tenozyten aus Sehnengewebe .......................................................... 30
4.3.3. Passage und Zellernte ................................................................................................. 30
4.4. Bildung der Zellmonolayer ............................................................................................... 31
4.5. Herstellung der 2D-Zellmigrationsassays ....................................................................... 33
4.6. Vital-Fluoreszenz-Doppelfärbung .................................................................................... 36
4.7. Erfassung der Bilder ........................................................................................................... 37
4.8. Bildbearbeitung und –analyse ........................................................................................... 38
4.9. Entwicklung der Methode ................................................................................................. 39
4.9.1. Kalibrierung ................................................................................................................. 39
4.9.2. Festlegung der Region of interest (ROIs) ................................................................ 39
4.9.3. Zählung der toten Zellen ............................................................................................ 42
4.10. Statistische Analyse ............................................................................................................ 44
5. Ergebnisse ........................................................................................................................ 45
6. Diskussion ........................................................................................................................ 62
7. Zusammenfassung ........................................................................................................... 70
8. Summary .......................................................................................................................... 72 9. Tabellen und Abbildungen ............................................................................................. 73
10. Literaturverzeichnis .................................................................................................... 75
1
1. Abkürzungen
α-SMA α-smooth muscle actin
2D Zweidimensional
3D Dreidimensional
ADP Adenosindiphosphat
DAMPs damage-associated molecular patterns
DMEM Dulbecco's Modified Eagle's medium
EC mikrovaskuläre Endothelzellen
ECIS electric cell impedance sensing
ECM extracellular matrix
EPU epidermal proliferating unit
ERK1/2 Isoformen 1 und 2 der extracellular-signal regulated kinases
FCS fetal calf serum
FDA Fluoreszindiacetat
FGF fibroblast growth factor
H2O2 Wasserstoffperoxid
IFE interfollikulären Epidermis
IFN Interferon
IGF Insulin-like growth factor
IL Interleukin
2
KSC Keratinozyten-Stammzellen
MAPK mitogen-activated protein kinases
MMP Matrix-Metalloproteasen
NdFeB Neodym-Eisen-Bor
PBS phosphate buffered saline
PDGF platelet-derived growth factor
PDMS Polydimethylsiloxan
PF4 platelet factor 4
PI Propidiumiodid
RGB Rot/ Grün/ Blau
ROI region of interest
ROS reactive oxygen species
TA transit amplifying cells
TGF-β transforming growth factor-β
TIMPs tissue inhibitors of metalloproteinases
TNF tumor necrosis factor
VEGF vascular endothelial growth factor
VETERM Veterinary Tissue Engineering and Regenerative Medicine
vWF von Willebrand Faktor
3
2. Einleitung
Dieser Arbeit ging eine Studie über den Vergleich verschiedener 2D-Zellmigrationsassays mit
Vorstellung eines neuen, selbstentwickelten ‚scratching device‘ unter Verwendung von
Magneten voraus. Daraus resultierten die mikroskopischen Aufnahmen der 2D-
Zellmigrationsassays, die dieser Arbeit die Grundlage bieten. Die vorangegangene Studie
wurde durch Forscher des Fachbereichs ‚Veterinary Tissue Engineering and Regenerative
Medicine‘ (VETERM) der Klinik für Pferde an der Veterinärmedizinischen Universität Wien
verfasst. Der Fachbereich VETERM befasst sich in der Forschungsarbeit, neben der
Stammzellerforschung und deren Anwendung, mit Themen wie degenerative
Gelenkserkrankungen und Sehenverletzungen. Darüber hinaus wird das Feld der
Wundheilung und Wundheilungsstörungen beforscht.
Für die Simulation von Wunden in-vitro wurden zahlreiche ‚wound-healing assays‘, ‚scratch
assays‘ oder ‚2D cell migration assays‘ entwickelt und publiziert. Ziel dabei ist es, unter
labortechnisch kontrollierten Bedingungen in-vitro Gegebenheiten zu schaffen, wie man sie
bei realen Wunden vorfindet. Dabei können bei Veränderungen der Rahmenbedingungen oder
beispielsweise Zufügen von Wirkstoffen die Abweichungen der Zellmigration erfasst,
bemessen und auf praxisrelevante Wundbehandlungen übertragen werden. Mehrere
Einflussfaktoren können somit durch die verschiedenen Methoden der Migrationsassays
isoliert betrachtet werden. Zu den Einflussfaktoren, die bei in vivo Wunden eine essentielle
Rolle spielen, gehört die initale Zellschädigung und daraus resultierender Efflux von
Zellinhaltstoffen, die Einfluss auf die folgende Migration angrenzender Zellen haben. Darüber
hinaus stellt die Apoptose von Zellen einen reglementierenden Faktor dar, der für das
erfolgreiche Ineinandergreifen der verschiedenen Phasen der Wundheilung von großer
Bedeutung ist. Aus den genannten Gründen liegt der Fokus dieser Arbeit in der Betrachtung
von ‚wound healing‘ oder auch ‚scratch-assays‘ aus Sicht der Anwendbarkeit für die
Simulation von realen Bedingungen während der Wundheilung mit besonderer
Berücksichtigung von Zellschädigung und Apoptose.
3
3. Literaturrecherche
3.1. Relevanz der Zellmigration
Die Migration von einzelnen Zellen, als auch von multizellulären Einheiten stellt innerhalb
vieler physiologischer, als auch pathologischer Prozesse einen elementaren Bestandteil dar.
Schon während der Embryogenese steuert die Zellmigration zahlreiche Prozesse der
Morphogenese (Friedl und Gilmour 2009, Ridley et al. 2003). Des Weiteren spielt die
Zellmigration in adulten Organismen eine entscheidende Rolle, beispielsweise während der
Gewebereparatur und -regeneration, der Erneuerung von Haut und Darm, der Immunantwort
und der Enzündungsreaktion (Friedl und Weigelin 2008, Ridley et al. 2003). Bei
pathologischen Prozessen, wie z.B. Krebsmetastasierung oder Tumorzellinvasion, sind
ebenfalls Zellen auf die Fähigkeiten der Migration durch umgebendes Gewebe angewiesen,
was essentiell für die weitere Pathogenese ist (Hood und Cheresh 2002).
3.2. Zellmigration während der Wundheilung
Durch das Forschungsgebiet der Wundheilung/-regeneration innerhalb des VETERMs wird
nachfolgend auf die Kernpunkte der Relevanz von Zellmigration während der Wundheilung
eingegangen.
Der Prozess der Wundheilung ist der Versuch des Organismus, nach bewusster oder trauma-
bedingter Verletzung der Haut die verlorene Gewebsintegrität wiederherzustellen bzw.
aufzubauen. Dabei werden zwei Prinzipien der Wiederherstellung der Gewebsintegrität
voneinander unterschieden: Regeneration oder Reparatur (Gurtner et al. 2008).
Die Regeneration beschreibt den Wiederaufbau des verletzten Gewebes durch Zellen des
ursprünglichen Gewebes, so dass das Ersatzgewebe dieselben biologischen Eigenschaften
aufweist wie das originale Gewebe. Dabei ist es essentiell, dass es nach Verletzung des
Gewebes noch eine ausreichende Anzahl an Mitose-fähigen Zellen des ursprünglichen
Gewebes im Wundbereich vorhanden ist. Demgegenüber stellt die Reparatur den Prozess der
Wiederherstellung der Gewebsintegrität durch minderwertiges Narbengewebe dar. Aus
diesem Grund ist die Reparatur eine Hilfsmethode des Organismus, die Gewebsintegrität zu
4
wahren, unter der Prämisse, das ursprüngliche Gewebe durch biologisch minderwertigeres
Ersatzgewebe zu ersetzen (Gurtner et al. 2008).
Der Prozess der Wundheilung wird klassischerweise in drei, sich zeitlich überlappende
Phasen unterteilt, die aber als einzelne Abläufe beschrieben werden, um den komplexen
Prozess vereinfacht darzustellen (Gurtner et al. 2008, Singer und Clark 1999). Zusätzlich
werden in der Literatur die initiale Hämostase und die Formation eines Gerinnsels durch
Thrombozytenaggregation als eigene, vorhergehende Phase beschrieben (Falanga 2005,
Velnar et al. 2009). Demnach folgen auf die (1) Phase der Hämostase und Koagulation, die
(2) akute Entzündungs-, die (3) Proliferations-, und die abschließende (4)
Remodellierungsphase (Gurtner et al. 2008, Velnar et al. 2009).
3.2.1. Hämostase-/ Koagulationsphase
Die Hämostase- und Koagulationsphase beginnt unmittelbar nach Verletzung der Haut bzw.
Untergang der Gewebsintegrität und ist nach wenigen Stunden bereits beendet. Dabei ist diese
kurze Phase essentiell für den Erfolg der anschließenden Phasen. Hämostase beschreibt den
Prozess der Blutstillung, der Ausbildung eines Gerinnsels durch Thrombozytenaggregation
und der anschließenden Auflösung jenes Gerinnsels nach Reparatur des verletzten Gewebes.
Der Prozess der Hämostase läuft unmittelbar nach Verletzung von Gefäßen in vier
Hauptphasen ab. (I) Die initiale Reaktion auf die Gefäßschädigung ist die periphere
Vasokonstriktion. Dabei wird durch die Verletzung der Endothelschicht geschädigter
Gefäßwände eine Kaskade eingeleitet, wo Phospholipide aus den Zellmembranen freigesetzt
werden, die wiederum über den Arachoidonsäurezyklus metabolisiert werden, was zur
peripheren Vasokonstriktion führt (Theoret und Schumacher 2017). Neben der unmittelbaren
Limitierung des Blutverlustes ist die aus der Vasokonstriktion resultierende lokale Hypoxie
und Nährstoffunterversorgung vorteilhaft für die Aktivierung und Migration von
Thrombozyten im Wundbereich. (II) Die Aktivierung von Thrombozyten durch Thrombin
und die Aggregation der Thromboyzten zu einem temporären, lockeren Pfropf an der Stelle
der Gefäßschädigung stellen den nächsten Schritt der Hämostase dar. Fibrinogen ist dabei
hauptverantwortlich für die Thrombozytenaggregation. Thrombozyten aggregieren durch
5
Bindung an freigelegtem Kollagen der geschädigten Endothelschicht verletzter Gefäßwände
(Groot et al. 2012). (III) Zur Steigerung der Stabilität des temporären, lockeren
Thrombozytenpfropfs wird dieser in ein aus Fibrin gebildetes Geflecht eingegliedert, was zur
Bildung eines stabileren Gerinnsels führt. Dieses Gerinnsel wird abhängig von der zellulären
Zusammensetzung als weißer oder roter Thrombus definiert. Der weiße Thrombus besteht aus
dem Fibringeflecht und ausschließlich eingelagerten Thrombozyten, wohingegen der rote
Thrombus neben Thrombozyten auch eingelagerte Erythrozyten aufweist (Batty und Smith
2010, Groot et al. 2012). Relevant ist diese Unterscheidung bei der Therapie von Thromben
durch thrombolytische Wirktoffe, die abhängig von der Zusammensetzung unterschiedliche
Wirkungen hervorrufen (Kirchhof et al. 2003). (IV) Abschließend ist die Auflösung des
Blutgerinnsels essentiell, um die nötige Blutversorgung zur weiteren Gewebsreparatur zu
gewährleisten. Dabei erfolgt die Auflösung des Gerinnsels durch Aktivität des Plasminogen-
Aktivator/Plasmin Systems (Li et al. 2003).
Neben der initialen Blutstillung und Versiegelung der Wunde werden dem
Thrombozytenpfropf/ Blutgerinnsel weitere wichtige Funktionen für die weiteren Phasen der
Wundheilung zugesprochen. Das Gerinnsel dient als provisorische Matrix und Grundgerüst
für Zellen, die in den Wundbereich migrieren. Dabei spielen die aggregierten Thrombozyten
eine essentielle Rolle (Smyth et al. 2009), da die durch die Degranulation der
Thrombozytengranula freigesetzten Mediatoren chemoattraktiv für die Migration zahlreicher
Zelltypen wirken (Blair und Flaumenhaft 2009, Golebiewska und Poole 2015). Der Inhalt der
verschiedenen Thrombozytengranula umfasst mehr als 300 Moleküle, vorrangig
Adenosindiphosphat (ADP) und Neurotransmitter, wie beispielsweise Serotonin
(Golebiewska und Poole 2015). Herauszuheben sind dabei Thrombozyten α-Granula, die
neben den genannten Molekülen vor allem Proteine wie von Willebrand Faktor (vWF),
platelet factor 4 (PF4), Fibrinogen, Faktor V und eine Reihe von Wachstumsfaktoren (z.B.
Insulin-like growth factor (IGF), transforming growth factor-β (TGF-β), vascular endothelial
growth factor (VEGF), platelet-derived growth factor (PDGF) und fibroblast growth factor
(FGF)) beinhalten und bei Degranulation freisetzen (Blair und Flaumenhaft 2009). Neben der
beschriebenen Aufgabe der Hämostase wirken Thrombozyten neben Mastzellen auch als die
6
ersten proinflammatorischen Zellen durch die Degranulation proinflammatorischer
Mediatoren (Herter et al. 2014).
3.2.2. Entzündungsphase
Bereits während der Hämostase- und Koagulationsphase beginnt die Entzündungs- oder auch
Debridementphase. Die Entzündungsphase wird durch die Aktivierung und Migration von
zwei Zelltypen charakterisiert und kann aus diesem Grunde in zwei Phasen unterteilt werden.
Die frühe Entzündungsphase widmet sich der Aktivierung und Diapedese von neutrophilen
Granulozyten, wohingegen die nachfolgende späte Entzündungsphase durch das Auftreten
und Transformation von Monozyten bestimmt wird (Theoret und Schumacher 2017). Neben
der Eliminierung von Zelldebris und Verschmutzung dient die Entzündungsphase, durch
Ausschüttung von Mediatoren der beteiligten Zellen, auch als Vorbereitung für die
nachfolgenden Phasen der Wundheilung. Die Diapedese der neutrophilen Granulozyten aus
umliegenden Blutgefäßen wird durch unterschiedliche Signalwege eingeleitet, wobei
vorwiegend Mediatoren von Thrombozyten und Mastzellen für die Aktivierung, Adhäsion an
das Endothel und die folgende Migration verantwortlich sind (Sadik et al. 2011, Wulff und
Wilgus 2013). Daneben stellen aus verletzten Zellen freigesetzte ‚damage-associated
molecular patterns‘ (DAMPs), Wasserstoffperoxid (H2O2), Lipidmediatoren und Chemokine
wichtige Signalwege zur allgemeinen Rekrutierung von Entzündungszellen und im speziellen
von neutrophilen Granulozyten dar (Rodrigues et al. 2019). Die Migration der neutrophilen
Granulozyten erfolgt bereits nach wenigen Minuten nach dem Trauma und erreicht ihren
Höhepunkt nach ca. 1 – 2 Tagen. Hauptaufgaben der neutrophilen Granulozyten sind dabei,
vor allem bei kontaminierten Wunden, die Eliminierung von Zelldebris und Bakterien durch
Phagozytose und enzymatische Zerstörung oder Freisetzung von Sauerstoffradikalen (Dale et
al. 2008, Martin und Leibovich 2005). Sobald die Wunde von Fremdpartikeln und Bakterien
bereinigt wurde, werden die Migration und die Aktivität der neutrophilen Granulozyten
gestoppt. Die in dem Gewebe verbleibenden Zellen untergehen entweder der Apoptose mit
anschließender Phagozytose durch Gewebsmakrophagen oder werden Bestandteil des
Blutgerinnsels, das in weiterer Folge durch das Plasminogen-Aktivator/Plasmin System
7
abgebaut wird (Li et al. 2003). Das Verschwinden der neutrophilen Granulozyten stellt das
Ende der frühen Entzündungsphase dar.
Die Migration von Monozyten aus umliegenden Gefäßen, deren Differenzierung im
Wundbereich zu Makrophagen, sowie die Rekrutierung der Gewebsmakrophagen im
umliegenden Gewebe stellen die späte Entzündungsphase dar. Makrophagen werden als eine
der wichtigsten Zelltypen bei der Wundheilung angesehen, da sie während jeder Phase
wichtige Funktionen übernehmen (Koh und DiPietro 2011, Lucas et al. 2010). Dazu gehört
die Förderung und Auflösung der Entzündung, die Entfernung von apoptotischen Zellen und
die Unterstützung der späteren Zellproliferation und somit Gewebswiederherstellung (Lucas
et al. 2010). Bereits während der frühen Entzündungsphase führen Makrophagen
verschiedene proinflammatorische Funktionen aus, die die weitere Wundheilung fördern.
Dazu gehört die Phagozytose von apoptotischen Zellen, die Antigenpräsentation und die
Produktion von inflammatorischen Zytokinen (z.B. Interferon (IFN), Interleukin (IL), tumor
necrosis factor (TNF) und transforming growth factor-β (TGF-β)) (Koh und DiPietro 2011).
Im weiteren Verlauf der Wundheilung während der proliferativen Phase ändern sich die
Aufgaben von Makrophagen, indem sie die Proliferation von dermalem, endothelialem und
epithelialem Gewebe durch Freisetzung von Wachstumsfaktoren (z.B. vascular endothelial
growth factor (VEGF) und platelet-derived growth factor (PDGF)) stimulieren, was unter
anderem zur Wiederherstellung der extrazellulären Matrix (ECM), der Angiogenese und
Epithelialisation führt. Während der letzten Phase der Wundheilung, der Remodelingphase,
können Makrophagen zudem durch die Freisetzung von gewebsabbauenden Enzymen
fibrolytisch wirken und so zur Änderung der ECM Zusammensetzung beitragen (Lucas et al.
2010, Sindrilaru und Scharffetter-Kochanek 2013). Aus den beschriebenen Gründen wurden
Makrophagen während der Entzündungsphase als proinflammatorischer M1-Phenotyp und
während den nachfolgenden Phasen als anti-inflammatorischer M2-Phenotyp klassifiziert
(Galli et al. 2011, Martinez et al. 2008, Martinez und Gordon 2014, Novak und Koh 2013).
Die Entzündungsphase endet nach erfolgreicher Bekämpfung einer potentiellen Infektion und
der Gewebsreparatur. Die eingeströmten proinflammatorischen Zellen untergehen daher der
Apoptose, da diese für die weiteren Phasen der Wundheilung nicht mehr benötigt werden. Die
Apoptose (oder auch: programmierter Zelltod) stellt dabei einen universalen Mechanismus
8
zur Entfernung nicht mehr benötigter Zellgruppen dar, ohne eine weitere
Entzündungsreaktion hervorzurufen (Green und Llambi 2015, Greenhalgh 1998). Die
Apoptose stellt zudem über den gesamten Prozess der Wundheilung einen elementaren
Mechanismus dar, da der Erfolg der Wundheilung neben der zeitigen Migration von
unterschiedlichen Zelltypen und deren Wirkung, auch vom zeitigen Verschwinden jener
Zelltypen abhängt (Greenhalgh 1998). Aus diesem Grund ist auch beispielsweise das
maturierte Narbengewebe nahezu azelluär.
3.2.3. Proliferationsphase
Die nächste Phase der Wundheilung ist als proliferative oder Reparationsphase beschrieben.
Hauptziele dieser Phase sind die Wiederherstellung der Epithelbarriere zum Schutz der
Wundoberfläche, der Formation von Granulationsgewebe und der Angiogenese, um in Folge
die Sauerstoff- und Nährstoffversorgung des Gewebes zu gewährleisten. Innerhalb der
Proliferationsphase können drei Vorgänge unterschieden werden: Die Fibroplasie, die
Angiogenese und die Epithelisation.
Charakteristisch für die Fibroplasie ist die Bildung von Granulationsgewebe, welches den
gesamten Wundbereich ausfüllt und aus drei Hauptelementen besteht. Dazu gehört die
Migration von Makrophagen des anti-inflammatorischen M2-Phenotyps und von
Fibroblasten, die unmittelbar proliferieren und neue Bestandteile der ECM synthetisieren und
die Neubildung von Blutgefäßen, um diese metabolisch hochaktive Phase ausreichend mit
Sauerstoff und Nährstoffen zu versorgen (Singer und Clark 1999). Durch die an der
Oberfläche neugebildeten Blutgefäße bekommt das Granulationsgewebe auch sein
charakteristisches, höckeriges Erscheinungsbild. Wie bereits bei den M1-Makrophagen
während der akuten Entzündungsphase spielt auch in der Proliferationsphase die Migration
und Aktivität von M2-Makrophagen eine elementare Rolle, da diese durch Ausschüttung
unterschiedlicher Mediatoren wie Zytokine und Wachstumsfaktoren die Angiogenese
(Leibovich et al. 1987, Willenborg et al. 2012) und Fibroplasie, durch direkte Signale an
umliegende Fibroblasten (Ploeger et al. 2013), stimulieren. Aufgrund dieser unterschiedlichen
Aktivität stellen diese profibrotischen M2-Makrophagen einen anderen Phänotyp dar, der als
9
M2a-Makrophage oder auch Fibrozyt bezeichnet wird (Suga et al. 2014). Neben der
profibrotischen Wirkung der M2a-Makrophagen stimulieren eine Vielzahl von Matrix-
Molekülen, sowie von Entzündungszellen freigesetzte Zytokine und Wachstumsfaktoren die
Proliferation und Migration von Fibroblasten aus unverletztem, umliegendem Gewebe in das
beginnende Granulationsgewebe. Die Migration von Fibroblasten wird dabei durch die
Neubildung von Gefäßen und die Bereinigung der Migrationsroute durch phagozytierenden
Makrophagen begünstigt. Darüber hinaus sind Fibroblasten selbst mit einem proteolytischen
System, bestehend aus verschiedenen Kollagenasen, Gelatinasen und Stromelysin,
ausgestattet, um die Migration durch die ECM in die provisorische Wundmatrix bzw. den
Thrombus zu erleichtern (Sorokin 2010). Sobald Fibroblasten den Wundbereich erreicht
haben, proliferieren sie und zeigen unterschiedliche Funktionen, was der hohen Heterogenität
der verschiedenen Fibroblasten-Subpopulationen geschuldet ist (Fries et al. 1994, Singhal et
al. 2016). Die unterschiedlichen Funktionen von Fibroblasten während der Wundheilung
umfassen neben der Proteinsynthese zum ECM-Aufbau und Organisation in Form von
Kollagenbildung auch die Sekretion von Wachstumsfaktoren und Zytokinen (Fries et al.
1994). Durch die Kollagenbildung der Fibroblasten, wird die provisorische Wundmatrix in
eine kollagenreichere, dehnbarere und belastbarere Matrix umgewandelt. Fibroblasten stellen
die Synthese von Kollagen bei steigendem Kollagengehalt der Matrix schrittweise ein und
gehen daraufhin in Apoptose (Desmoulière et al. 1995) oder formen sich zu Myofibroblasten
um, die Eigenschaften glatter Muskelzellen aufweisen und bei der späteren Wundkontraktion
von Bedeutung sind (Hinz 2010).
Die Neovaskularisation oder Angiogenese ist für den Erfolg der Wundheilung von zentraler
Bedeutung, da sie die Nährstoffversorgung und die Aufrechterhaltung der
Sauerstoffhomöostase gewährleistet, um die Zellproliferation und Gewebsregeneration zu
ermöglichen (Gurtner et al. 2008). Die Aktivierung von lokalen mikrovaskulären
Endothelzellen (ECs) nimmt bei der Angiogenese eine Schlüsselrolle ein. ECs werden im
hypoxischen Wundbereich durch verschiedene Mediatoren aktiviert. Zu den pro-angiogenen
Mediatoren gehören vor allem Wachstumsfaktoren (VEGF, FGF, PDGF-B, TGF-β und
Angiopoetine), die bereits vorwiegend während der Entzündungsphase durch epidermale
Zellen, Makrophagen und das subkutane Fettgewebe freigesetzt werden (Tonnesen et al.
10
2000). Aktivierte ECs durchbrechen anschließend die ECM des Granulationsgewebes,
proliferieren, migrieren, bilden neue Zell-Zell-Verbindungen und verästeln sich, um neue
Kapillare zu bilden (Eilken und Adams 2010).
Bei der Wiederherstellung der Epithelbarriere oder auch Epithelialisation handelt es sich um
einen essentiellen Prozess für das erfolgreiche Verschließen der Wunde. Dabei stellen im
Gewebe verbleibende Keratinozyten-Stammzellen (KSC) einerseits für die stetige Erneuerung
der Haut unter physiologischen Bedingungen und andererseits für die Reparatur der Haut
nach Verletzung die wichtigste Gruppe von Zellen dar. Durch ihre hohe Mitose-Aktivität und
Differenzierung können Keratinozyten-Stammzellen den zellulären Verlust nach Verletzung
der Haut kompensieren. Das Aufkommen der Stammzellen beschränkt sich auf bestimmte
Areale, die ein spezifisches Mikroenvironment aufweisen und als Stammzell-Nischen
bezeichnet werden. Durch Zellabstammungsexperimente konnten diese Nischen in der
interfollikulären Epidermis (IFE), im Bereich des Haarfollikels / Haarbalg und den Talg-
sowie Schweißdrüsen lokalisiert werden (Boehnke et al. 2012, Ohyama 2007, Watt 2014).
Das in der Literatur vorherrschende Modell zur epidermalen Regeneration und Reparatur ist
das ‚epidermal proliferating unit (EPU) model‘ (Mascré et al. 2012). Dabei sind sich langsam
teilende, ältere Stammzellen der IFE von ca. 10 sog. ‚transit amplifying cells (TA)‘ in der
basalen Schicht umgeben. Durch die verzögerte Proliferation der IFE-Stammzellen werden
TA erzeugt, die dann konstant proliferieren und differenzieren (Mackenzie 1970). Aus diesem
Grund stellen nicht alle Zellen der basalen Schicht Stammzellen dar, sodass bei der
physiologischen Hauterneuerung die vorhandenen Stammzellen nicht konstant proliferieren
(Watt 2002).
Für den erfolgreichen Verschluss nach Verletzung der Haut müssen Kerationzyten im Bereich
der Wundränder ihre Adhäsionen über Desmosomen zueinander und zur Basalmembran durch
Hemidesmosomen lösen, um eine sog. migrierende epitheliale Zunge zu bilden (O'Toole
2001). Für die Proliferation und Migration der Kerationozyten ist eine Viehlzahl von
Mediatoren notwendig, um die vollständigen Verschluss der Wundoberfläche zu
gewährleisten. Dazu zählen neben Chemokinen, Zytokinen, Inegrinen, ECM Bestandteilen,
auch ECM abbauende Matrixmetalloproteinasen (MMP) (Pastar et al. 2014). Neben den
MMPs werden zusätzlich weitere ECM abbauende Proteasen für die Proteolyse von
11
Zelldebris und dem fibrinreichen Blutgerinnsel rekrutiert, die an der sich vorwärts
bewegenden epithelialen Zunge wirksam sind (Krampert et al. 2004). Sobald der Defekt
vollständig durch die dünne Epithelschicht geschlossen ist, wird durch Kontaktinhibierung die
weitere Zellmigration durch Expression von Laminin gestoppt und führt zur Adhäsion der
Epithelzellen an die unterliegende Matrix (O'Toole et al. 1997).
3.2.4. Remodellierungsphase
Während unter klinischen Gesichtspunkten der Verschluss von akuten oder chronischen
Wunden als Ende der Wundheilung angesehen wird, kann sich die anschließende
Remodellierung und Gewebereifung über Monate bzw. Jahre hinziehen. Charakteristisch für
die Remodellierungsphase ist die Rückbildung der Neovaskularisation, die in der
Angiogenese etabliert wurde, der periodischen ECM-Synthese und der schrittweisen
Rekonstituierung von Granulationsgewebe hin zu Narbengewebe. Ziel dieser Veränderungen
ist die Gewährleistung der Widerstandskraft, Integrität und Funktion des Ersatzgewebes. Das
Kollagen-III-reiche Granulationsgewebe wird dabei zum großen Teil durch das wertigere
Kollagen I ausgetauscht. Dieser Prozess wird durch die gezeitigt ablaufende Kollagen-I-
Synthese und Kollagen-III-Lyse gewährleistet, worauf die Umstrukturierung der ECM
anschließt (Gurtner et al. 2008).
Neben der späteren Umstrukturierung der ECM/Matrix, stellt die Wundkontraktion einen
essentiellen Teil der Remodellierungsphase da. Ziel der Wundkontraktion ist die Reduzierung
der Wundoberfläche, die durch die Epithelisierung verschlossen werden muss. Bereits
während der zweiten Woche nach Verletzung der Haut werden die Wundränder schrittweise
physikalisch zueinander gezogen. Durch die Reduzierung der zu schließenden
Wundoberfläche trägt die Wundkontraktion ebenso dazu bei, die Widerstandskraft der
Epithelschicht zu erhöhen, da somit eine kleinere Fläche von dem neu entstandenen, fragilen
Epithelium geschlossen werden muss. Die Wundkontraktion wird einer Zellgruppe
zugeschrieben, die Charakteristika von Fibroblasten und glatter Muskelzellen aufweisen und
als Myofibroblasten bezeichnet werden (Hinz 2010, Tomasek et al. 2002). Herausragendes
Merkmal dieser Zellgruppe ist ein stark ausgebildetes ‚α-smooth muscle actin‘ (α-SMA)
mikrofilamentäres System, welches parallel zur Längsachse der Zelle liegt, wobei sich die
12
Zelle selbst parallel zu den Zuglinien der Kontraktion im Wundbereich orientiert (Tomasek et
al. 2002). Durch Verbindungen des α-SMA Systems über Integrine mit Komponenten der
ECM, wie z.B. Fibronectin und Kollagenfibrillen, und der gleichzeitigen interzellulären
Verbindung der Myofibroblasten über ‚gap junctions‘ und Hemidesmosomen wird
sichergestellt, dass die aufgebaute Zugkraft über den Zellverband hinweg auf die ECM
übertragen wird (Hinz und Gabbiani 2003, Tomasek et al. 2002). Im Kontrast dazu können
Myofibroblasten auch ohne ausgebildetem α-SMA System durch γ-Aktin (glatte
Muskelzellen) und α-Aktin (Skelettmuskelzellen) Kontraktionen erzeugen, die ebenfalls zur
Wundkontraktion führen (Tomasek et al. 2013).
Der Prozess der Wundkontraktion kann in drei Phasen unterteilt werden und beginnt mit der
direkt auf die Verletzung der Haut folgenden lag-Phase, wo die Wundränder bis zur zweiten
Woche leicht retrahieren und sich die Fläche der zu verschließenden Wunde sogar
geringgradig vergrößert. Anschließend erfolgen die Phasen der schnellen und der langsamen
Kontraktion, bis die Wunde im Zusammenspiel mit der Epithelisierung vollständig
geschlossen ist (Theoret und Schumacher 2017). Die Aktivität der Myofibroblasten wird
durch eine von drei möglichen Gründen beendet. Zu den Gründen zählen neben der
Kontaktinhibition durch Berühren der Wundränder, der gleichen bzw. erhöhten Spannung des
umliegenden Gewebes gegenüber der von dem α-SMA mikrofilamentären Systems
generierten Zugkraft, auch die v.a. in chronischen Wunden vorkommende zu geringe absolute
Anzahl an Myofibroblasten (Theoret und Schumacher 2017). Sobald die Gewebsintegrität
erfolgreich wiederhergestellt wurde, untergehen Myofibroblasten der Apoptose (Desmoulière
et al. 1995, Hinz und Gabbiani 2003). Ergänzend dazu wird in der Literatur die Fähigkeit der
Rückbildung von Myofibroblasten zum Fibroblasten-Phänotyp diskutiert, da es bei
unzureichender Eliminierung von Myofibroblasten durch Apoptose zu verschiedenen Formen
von Fibrose (z.B. hypertrophischem Narbengewebe) kommen kann (Sarrazy et al. 2011).
Sobald der Prozess der Epithelisierung begonnen hat, erfüllen Myofibroblasten weitere
Funktionen, die für die Remodellierungsphase von Bedeutung sind. Myofibroblasten
innerhalb des Granulationsgewebes synthetisieren MMPs und deren jeweilige Inhibitoren
‚tissue inhibitors of metalloproteinases‘ (TIMPs) (Caley et al. 2015, Visse und Nagase 2003).
MMPs sind für den Abbau von spezifischen Komponenten der ECM verantwortlich und
13
stellen eine essentielle Komponente für die Remodellierung der ECM dar (Caley et al. 2015).
Parallel zur zunehmenden Aktivität der MMPs an der ECM, nimmt die Matrix Synthese stetig
ab, was wiederum den Ersatz von Kollagen III des Granulationsgewebes durch Kollagen I
begünstigt (Darby et al. 2014). Nach der Umstrukturierung der ECM, wird die Aktivität der
MMPs durch TIMPs gehemmt, um weitere den weiteren ECM Abbau zu unterbinden. Dabei
ist die Balance zwischen MMPs und TIMPs von zentraler Bedeutung, da eine Imbalance zu
abnormaler ECM Zusammensetzung und sogar zu chronischen Wunden führen kann
(Telgenhoff und Shroot 2005).
Wie bereits erwähnt, stellt die Umwandlung der ECM von Granulationsgewebe zu
Narbengewebe den letzten Schritt der Wundheilung dar und wird durch die Synthese, Lyse
und Remodellierung bestimmt. Nach initialer vermehrter Synthese von biologisch
minderwertigem Kollagen III, folgt die schrittweise Lyse des Kollagen III welches durch
hochwertigeres Kollagen I ersetzt wird. Dabei ist die Orientierung des neugebildeten
Kollagens anfangs zufällig, was in keiner Steigerung der Widerstandskraft und Dehnbarkeit
gegenüber der Kollagen III-reichen Matrix resultiert. Während der späten
Remodellierungsphase steigt zwar nicht der absolute Gehalt an Kollagen I, doch durch
Quervernetzung und Anordnung von den Kollagenfasern entlang der Spannungslinien wird
die Dehnbarkeit des Narbengewebes gegenüber der vorherigen Matrix stark gesteigert
(Theoret und Schumacher 2017). Nichtsdestotrotz ist dabei auch zu berücksichtigen, dass das
Ersatzgewebe nie die biologischen Eigenschaften des originalen Gewebes zurückerlangt.
Zusammenfassend lässt ist somit festhalten, dass die räumliche und zeitliche Synchronisation
der Migration von verschiedenen Zelltypen während des gesamten Prozesses der
Wundheilung essentiell für die Wiederherstellung der Gewebsintegrität ist. Zudem ist
herauszuheben, dass die Freisetzung von Mediatoren verletzter oder zerstörter Zellen als
Signalwege für die Rekrutierung vor allem von Entzündungszellen eine hohe Bedeutung hat.
Die Apoptose stellt auch während der Wundheilung einen Prozess dar, wonach nicht mehr
benötigte Zelltypen zeitig dem programmierten Zelltod untergehen, um die folgenden Phasen
der Wundheilung einzuleiten bzw. zu ermöglichen. Das unzureichende Untergehen
bestimmter Zellgruppen kann demnach zu Wundheilungsstörung führen, wie beispielsweise
chronischen Entzündungen oder Fibrose.
14
3.3. Mechanismen der Zellmigration
Die grundlegenden Ereignisse, die sich bei der Migration von Zellen abspielen, wurden in der
Literatur zahlreich beschrieben und publiziert. Dabei wurden die Abläufe als
Migrationszyklus mit fünf aufeinanderfolgenden Ereignissen beschrieben, die sich zum Teil
zeitlich überlappen, aber dennoch als einzelne Ereignisse angesprochen werden und
kontinuierlich als Zyklus ablaufen (Horwitz und Webb 2003, Lauffenburger und Horwitz
1996, Ridley et al. 2003): Die Grundlage der Migration stellt die (1) Polarisation der Zelle als
Reaktion auf einen externen Stimulus dar. Zu den externen Stimuli, die die Migration
initiieren und unterstützen, zählen neben Molekülen, die direkt einen migratorischen
Phänotyp der Zelle initiieren (chemokinetisch), auch lösliche (chemotaktisch) und substrat-
assoziierte (haptotaktisch) Moleküle (Horwitz und Webb 2003). Die Polarisation der Zelle
ermöglicht es, durch Unterteilung der Zelle in einen frontal gerichteten und hinteren Teil eine
asymmetrische Form der Zelle zu schaffen (Lauffenburger und Horwitz 1996).
Der Vorgang der Zellpolarisation wird durch lokale Aktin-Polymerisation zu Filamenten
eingeleitet und führt zur Ausbildung einer Vorwölbung der Zellmembran in Richtung der
angestrebten Migrationsroute (Friedl 2004, Small et al. 1998, Webb et al. 2002). Der zweite
Schritt beschreibt die Ausbildung von (2) fokalen Adhäsionen oder Kontakten zwischen der
Vorwölbung an der frontalen Seite der Zelle und dem unterliegenden Substrat (Webb et al.
2002). Die fokalen Adhäsionen dienen einerseits zur Stabilisierung der Vorwölbung durch
Interaktion der Aktinfilamente mit der extrazellulären Matrix (ECM) und andererseits als
Zugpunkt, über den sich die Zelle durch Übertragung von propulsiven Bewegungen vorwärts
bewegt. Zudem werden durch die Interaktion zwischen Zellvorwölbung und ECM Proteasen
rekrutiert, um durch (3) lokale Proteolyse von ECM-Proteinen die Migrationsroute zu
erweitern und die Grundlage für weitere Adhäsionsstellen zu schaffen (Friedl 2004). Bereits
während der Ausbildung der umschriebenen fokalen Adhäsionen kommt es zur
Umstrukturierung des Aktin-Zytoskeletts in Richtung der Vorwölbung.
(4) Die Vernetzung der Aktinfilamente zu Aktinsträngen und die darauffolgende Interaktion
mit kontraktilen Proteinen (Myosin II) führen zur Kontraktion der gebildeten Aktinstränge an
15
der Front der Zelle (Keren et al. 2008, Kozlov und Mogilner 2007). Die an der Membran
verankerten Aktinstränge ziehen somit das gesamte Aktinzytoskelett in Richtung der
Vorwölbung, die durch fokale Adhäsion mit der unterliegenden Matrix verbunden ist, was
schließlich zu einem Vorwärtsgleiten der Zelle führt (Pollard und Borisy 2003). Während an
der vorwärts gerichteten Seite der Zelle durch die beschriebene lokale Zellkontraktion eine (5)
Zelltranslokation vorwärts stattfindet, werden die fokalen Adhäsionen an dem hinteren Ende
der Zelle wieder gelöst, worauf sich die Zelle in Richtung der Front zusammenzieht und
schlussendlich zur Translokation beiträgt (Friedl 2004, Horwitz und Webb 2003).
3.4. Formen der Zellmigration
Die Migration von Zellen kann in verschiedenen Formen vorkommen und wird durch eine
Vielzahl von Variablen determiniert respektive beeinflusst, was zu einer Änderung der
Migrationsform führen kann. Das ursprünglich von Friedl und Wolf publizierte ‚multiscale
tuning model‘ unterteilte die Variablen in Faktoren, die von der unterliegenden Matrix (ECM)
ausgehen und Faktoren, die von den Eigenschaften der migrierenden Zellen ausgehen (Friedl
und Wolf 2010). Durch die graphische Darstellung und der unterschiedlichen Gewichtung der
Faktoren kann die Form der Migration und die Effizienz illustriert werden. Auf der Basis des
‚multiscale tuning model‘ wurden die Einflussfaktoren präzisiert, integriert und das Modell
erweitert. Dabei wurden die Einflussfaktoren in vier Kategorien eingeteilt: (1) autonome
Zelleigenschaften, (2) lösliche Faktoren, (3) Eigenschaften der Matrix und (4) Interaktionen
zwischen Zellen (Ashby und Zijlstra 2012, Doyle et al. 2013, Palmer et al. 2011). Dabei
bestimmt die Kombination der Variablen die spezifische Form der Migration.
Dabei kann die Migration abhängig von Zellart und Rahmenbedingungen in unterschiedlichen
Formen erscheinen. Generell kann die Migration in zwei Kategorien unterteilt werden: (1)
Migration von einzelnen Zellen oder, (2) im Kollektiv, als multizelluläre Einheit.
Innerhalb dieser Kategorien werden wiederum verschiedene Formen der Migration
beschrieben. So kann bei der (1) Migration von einzelnen Zellen zwischen (1a) amöboider
Migration und (1b) mesenchymaler Migration von Zellen unterschieden werden.
16
Die (1a) amöboide Migration ist charakterisiert durch Migration von runden oder ellipsoiden
Zellen, die keine ausgebildete fokale Adhäsion zur unterliegenden Matrix aufweisen
(Lämmermann und Sixt 2009). Dabei werden wiederum zwei Unterkategorien der amöboiden
Migration unterschieden. Bei der (1a1) ‚blebby‘ amöboiden Migration migrieren Zellen mit
rundem Erscheinungsbild durch propulsive Bewegung, ohne Adhäsionen mit der
unterliegenden Matrix aufzubauen und sich davon abzustoßen (Charras und Paluch 2008,
Fackler und Grosse 2008, Yoshida und Soldati 2006). Die zweite Unterkategorie (1a2)
beschreibt die amöboide Migration von länglicheren Zellen, die im Gegensatz zur ‚blebby‘
amöboiden Migration, durch die Ausbildung von Aktin-reichen Filopodien an dem vorwärts
gerichteten Ende der Zelle charakterisiert ist (Smith et al. 2007, Yoshida und Soldati 2006).
An den Filopodien kommt es in weiterer Folge zur Ausbildung von schwachen fokalen
Adhäsionen und somit zur Interaktion mit dem unterliegenden Substrat, woran sich die
vorwärts migrierende Zelle abstoßen kann. Neben einigen Stammzellen (Blaser et al.
2006)bewegen sich Leukozyten und dendritische Zellen (Gadea et al. 2008) mit dieser Form
der Migration.
Zellen, die zwar ebenfalls individuell migrieren, sich aber durch starke Adhäsion zur
unterliegenden Matrix mit hoher zytoskeletaler Kontraktilität von der amöboiden
Migrationsformen unterscheiden, vollziehen eine (1b) mesenchymale Migration (Grinnell
2008). Diese ist neben den genannten Punkten durch starke Zell-Matrix Interaktion und
Bewegungseigenschaften wie bei Fibroblasten charakterisiert. Die Form der mesenchymalen
Migration wird beispielsweise von Fibroblasten, Myoblasten, Sarkomzellen oder
dedifferenzierten Tumorzellen unterschiedlicher Herkunft zur Fortbewegung genutzt
(Grinnell 2008, Tamariz und Grinnell 2002, Thiery 2002).
(2) Die Migration von multizellulären Einheiten wird in der Literatur als ‚collective cell
migration‘ tituliert und beschreibt die Migration von Zellverbänden, die durch enge Zell-Zell-
Adhäsionen als Einheit migrieren. Eine Zwischenrolle nimmt dabei die Migration von
individuellen Zellen mit temporären auf- und abbauenden Zell-Zell-Adhäsionen ein. Diese
Form der Migration ist als ‚cell streaming‘ oder ‚chain migration‘ definiert (Davis und
Trinkaus 1981, Kulesa und Fraser 2000). Darüber hinaus sind Zellen, die kollektiv als Einheit
migrieren, über starke Zell-Zell-Adhäsion permanent miteinander verbunden. Während auf
17
2D-Matrices ‚collective cell migration‘ in Form von ‚sheet migration‘ von Epithelzellen bei
der Wundheilung beobachtet werden kann, nehmen multizelluläre Einheiten während der
Migration durch 3D-Matrices verschiedene Formen an (Farooqui und Fenteany 2005, Gerharz
et al. 2007). Bei der Morphogenese von Milchdrüsen (Ewald et al. 2008) migriert das
Zellkollektiv in verästelnder Form, wohingegen bei der Angiogenese Endothelzellen in
Röhrenform migrieren (Gerhardt 2008). Bei der Tumorzellinvasion migrieren die
Zellverbände in unregelmäßig ausgebildeten Massen, wobei Zellen im Bereich der vorwärts
gerichteten Front invasiv wirken und die adhärenten Zellen auf der vorgegebenen Route
migrieren (Hegerfeldt et al. 2002, Kramer et al. 2013).
3.5. Unterscheidung von 2D-/ 3D-Zellmigrations- und Invasionsassays
Migration ist in der Zellbiologie als Prozess der gerichteten Bewegung von Zellen auf einer
Oberfläche definiert. Zu diesen Oberflächen gehört z.B. die Basalmembran, ECM-Fasern oder
auch Plastikoberflächen. Daraus resultierend kann die Migration von einzelnen Zellen oder
multizellulärer Verbände in-vitro in Form von 2D-Zellmigrationsassays simuliert, untersucht
und analysiert werden.
Demgegenüber können Zellen, wie z.B. Leukozyten während der Entzündungsphase der
Wundheilung, auch durch 3D-Matrices bzw. unterschiedliche Geweben migrieren. Neben der
Grundfähigkeit der Migration mit zellmorphologischen Veränderungen ist die enge
Interaktion mit der ECM charakteristisch für die Migration durch Gewebe und ist als 3D-
Zellmigration definiert (Friedl et al. 1998).
In Abgrenzung zur Zellinvasion, wo Zellen auch ebenfalls die Fähigkeit der Migration als
Grundlage der Fortbewegung durch 3D-Matrices aufweisen, verändern Zellen bei der 3D-
Zellmigration nicht die ECM. Zellen, die sich invasiv fortbewegen, benötigen daher, neben
den Fähigkeiten der Adhäsion und Migration, die Fähigkeit der Proteolyse von ECM-
Komponenten (Friedl und Gilmour 2009).
Zusammenfassend ist es somit essentiell zwischen 2D-, 3D-Zellmigration und Zellinvasion zu
unterscheiden, da bei der Zellmigration in den verschiedenen Dimensionen im Gegensatz zur
18
Invasion von Zellen, weder Komponenten der ECM zerstört bzw. proteolytisch abgebaut
werden, um sich innerhalb der 3D-Matrixen zu bewegen (Friedl und Gilmour 2009, Kramer et
al. 2013).
Zur Imitation der verschiedenen Möglichkeiten von Zellmigration und Zellinvasion wurden
zahlreiche in-vitro 2D-, 3D-Zellmigrations- und Invasionsassays entwickelt, die in der
Publikation von Kramer et al. ausführlich dargestellt und besprochen werden (Eccles et al.
2005, Kramer et al. 2013, Shaw 2005). Trotz der in vivo häufiger vorkommenden 3D-
Zellmigration, wird die Zellmigration in vitro überwiegend mit 2D-Zellmigrationsassays
untersucht, da 3D-Zellmigrationsassays noch nicht so weit entwickelt und publiziert wurden,
um in vitro realistische in vivo Rahmenbedingungen herzustellen (Ashby und Zijlstra 2012).
Aufgrund des Schwerpunktes dieser Arbeit werden folgend die verschiedenen Methoden der
2D-Zellmigrationsassays vorgestellt.
3.6. 2D-Zellmigrationsassays
Bei 2D-Zellmigrationsassays wird die Migration von Zellen beobachtet, die durch Entfernung
oder Ausgrenzung von Zellen, einem freien Areal ausgesetzt sind. Aus diesem Grund können
die verschiedenen Methoden der 2D-Zellmigrationsassays in zwei Kategorien unterteilt
werden: (1) Zellentfernungs- und (2) Zellexklusionsmethoden (Ascione et al. 2017, Ashby
und Zijlstra 2012, Riahi et al. 2012).
Bei den Zellentfernungsmethoden wird bei einem bestehenden, konfluenten Zellmonolayer
durch mechanische, elektrische, chemische, thermale oder optische Entfernung oder
Zerstörung von Zellen ein zellfreier Bereich geschaffen, in den die verbliebenden
angrenzenden Zellen migrieren können. Demgegenüber werden bei den
Zellexklusionsmethoden Barrieren aus festen Materialien, Gelen, Flüssigkeiten oder
elektromagnetischen Kräften hergestellt, um Zellen bei Ausbildung eines Zellmonolayers von
einem Areal auszuschließen, wohin die Zellen nach Entfernung der Barriere wiederum
migrieren können.
19
3.6.1. Zellentfernungsmethoden
Für Zellentfernungsmethoden wird in der Literatur häufig der Begriff ‚wound healing assay‘
als Synonym verwendet (Grada et al. 2017, Lampugnani 1999, Rodriguez et al. 2005). Dabei
wird Bezug auf den Umstand genommen, dass es durch die Entfernung oder Zerstörung von
Zellen innerhalb eines Zellmonolayers zu Zellschädigungen und auch Schädigungen der
unterliegenden Matrix kommt, was in vivo Umstände der Wundheilung am ehesten
widerspiegelt (Nikolić et al. 2006).
Die mechanische Entfernung von Zellen mittels Pipettenspitze oder eines scharfen
Gegenstandes stellt dabei die einfachste und preisgünstigste Methode der Zellentfernung dar
und wird in der Literatur als ‚scratch assays‘ betitelt (Cory 2011, Liang et al. 2007). Dabei
wird ein zuvor geschaffener Zellmonolayer mittels der oben genannten Hilfmitteln gestreift,
was zur Entfernung von Zellen und der Schaffung eines zellfreien Areals mit ca. 300 bis 900
µm Weite führt. Die Migration von Zellen ausgehend von den beiden freien Zellrasengrenzen
wird dabei im Zeitraffer oder zu bestimmten Zeitpunkten mikroskopisch aufgenommen und
das Migrationsverhalten/die Migrationsrate durch verschiedene Berechnungen bestimmt
(Bobadilla et al. 2019, Jonkman et al. 2014, Nyegaard et al. 2016). Diese Methode stellt
derzeit aufgrund ihrer einfachen Durchführbarkeit und dem geringen Anspruch an
labortechnischen Utensilien den ‚gold standard‘ dar. Trotz der weitläufigen Nutzung dieser
Methode unterliegt diese einer Reihe von möglichen Einflussfaktoren und Limitierungen, die
sich negativ auf die Migration von Zellen auswirken können und somit zu herabgesetzter
Reproduzierbarkeit der Methode führen können.
Die Geschwindigkeit mit der die Pipettenspitze bewegt wird und die Geometrie des daraus
resultierenden zellfreien Bereichs stellt dabei die erste Limitierung dar, da diese schwer zu
kontrollierende Parameter bei der Herstellung mit der klassischen Methode darstellen (Riahi
et al. 2012). Daneben werden durch die Entfernung Zellen verletzt und Zellinhaltsstoffe treten
aus, die auf die Migration der intakten, vitalen Zellen Einfluss nehmen können. Der Grad der
Zellschädigung kann dabei zwischen den verschiedenen Techniken und Operateuren stark
variieren und ist schwer zu kontrollieren, was den Vergleich zwischen verschiedenen
Experimenten selbst mit der gleichen Methode, erschwert (Ashby und Zijlstra 2012, Riahi et
20
al. 2012). Neben der direkten Zellschädigung kann durch die mechanische Entfernung ebenso
die unterliegende Matrix verletzt werden (Kam et al. 2008). Des Weiteren stellen sonst
untergeordnete Einflussfaktoren wie z.B. die initiale Konfluenz des Zellmonolayers
Limitierungen der ‚scratch assays‘ dar, die sich wiederum negativ auf die Reproduzierbarkeit
auswirken können (Jin et al. 2016). Neben den genannten Einflussfaktoren auf die
Reproduzierbarkeit des ‚scratch assays‘, stellt der geringe Durchsatz der klassischen Methode
eine weitere Limitierung dar.
Um diese Limitierungen zu reduzieren, wurden daraufhin verschiedene Variationen der
klassischen Methode entwickelt und publiziert. Dabei wurde aber das Prinzip der
mechanischen Entfernung von Zellen beibehalten. Um der Zellschädigung und Verletzung der
unterliegenden Matrix entgegenzuwirken wurden neben dem Einsatz von Pipettenspitzen aus
Silikon auch Gummischaber, sowie Teflon-Spatel zur Schaffung des zellfreien Bereichs
eingesetzt (Kam et al. 2009, Watanabe et al. 1995). Darüber hinaus wurden zahlreiche
Methoden für die simultane Herstellung mehrerer ‚scratch assays‘ vorgestellt, die unter
Verwendung von beispielsweise haarfeinen Plastikstreifen die Entfernung von Zellen
hervorrufen (Li et al. 2009, Yarrow et al. 2004, Yue et al. 2010). Um einerseits den Durchsatz
und andererseits die Reproduzierbarkeit durch Ausschluss von humanen Fehlerquellen zu
verringern, wurde darüber hinaus eine Methode unter Verwendung eines automatisierten
Robotersystems für die Entfernung von Zellen vorgestellt (Simpson et al. 2008).
Neben der klassischen ‚scratch assay‘ Methode und deren Variation basiert eine weitere
Methode auf der mechanischen Zerstörung von Zellen. Im Gegensatz zu den zuvor genannten
Methoden wird bei dem ‚stamp wound assay‘ der Zellmonolayer nicht durch das Wegstreifen
von Zellen verletzt, sondern durch einen Polydimethylsiloxan (PDMS) Stempel zerstört (Lee
et al. 2010). Bei dieser Methode wird der PDMS-Stempel auf den konfluenten Zellmonolayer
aufgebracht und durch Gewichte angepresst. Nach mehreren Minuten werden sowohl die
Gewichte, als auch der Stempel entfernt, was einen klar definierten zellfreien Bereich
hinterlässt, in den die angrenzenden Zellen migrieren können. Dabei werden die durch Druck
zerstörten Zellen in dem freien Areal belassen, wodurch die Migration von verbleibendem
Zelldebris im Wundbereich beobachtet werden kann (Lee et al. 2010). Wie bei den vorherigen
mechanischen Zellentfernungsmethoden spielen auch bei dem ‚stamp wound assay‘ die
21
Zellzerstörung und somit die Freisetzung von Zellinhaltsstoffen, die Einfluss auf die
Zellmigration haben können, eine wesentliche Rolle. Im Gegensatz dazu wird aber bei dieser
Methode der unterliegenden Matrix keinen Schaden zugefügt. Eine weitere Variation des
‚stamp wound assay‘ für die Untersuchung der Zellmigration unter dem Einfluss von
verbleibendem Zelldebris stellt der ‚stamp-sliding assay‘ dar (Lan et al. 2010). Dabei wird der
Zellmonolayer durch eine Polychloropren- bzw. Neopren-Gummifeder zerdrückt, die bei
Aufrechterhaltung des Druckes in rotierenden oder seitlichen Bewegungen die Zellen zerstört.
Durch die Bewegung der Feder können unterschiedliche Muster, wie Zellinseln oder -kreise
geschaffen werden, wo Zellen als zusammenhängende Bänder zurückbleiben, um die
kollektive Migration in das zellfreie Areal zu analysieren (Lan et al. 2010).
Die Methode der elektrischen Zellentfernung ist in der Literatur als ‚electric cell impedance
sensing‘ (ECIS) beschrieben und stellt eine Alternative zu den herkömmlichen ‚scratch
assays‘ dar (Keese et al. 2004). Bei dieser Methode wird ein konfluenter Zellmonolayer auf
einer Matrix geschaffen, die Elektroden beinhaltet. Um den zellfreien Bereich zu schaffen,
werden kurze Elektropulse einer bestimmten Feldstärke zwischen den beiden Elektroden
angelegt, was zunächst zur Elektroporation, sprich der vorübergehenden
Permeabilitätserhöhung der Zellmembran und anschließend innerhalb weniger Sekunden zum
Zelltod, führt (Keese et al. 2004). Die daraus resultierenden zellfreien Bereiche zeigen eine
zirkuläre Form und befinden sich direkt über den Elektroden. Das ECIS System kann darüber
hinaus Impedanzen, die durch die Interaktion zwischen Zellen und der unterliegenden Matrix,
welche die Elektroden beinhaltet, messen. Veränderungen der Impedanz sind bei
Zellproliferation, -migration, -ausbreitung und wechselnden Zell-Zell- oder Zell-Matrix-
Verbindungen messbar (Lo et al. 1993, Wegener et al. 2000). Aus diesem Grund können
somit auch nach Schaffung des zellfreien Bereichs die Impedanzveränderungen als Parameter
für die Migration von Zellen erfasst werden (Gorshkova et al. 2008).
Eine weitere Gruppe von Zellentfernungsmethoden basiert auf der chemischen Entfernung
von Zellen unter Verwendung unterschiedlicher Reagenzien und Techniken. Beispielsweise
wurde ein Modell unter Verwendung von Natriumhydroxid als chemische
Entfernungsmethode vorgestellt (Legrand et al. 1999). Dabei wurde ein Tropfen
Natriumhydroxid auf einen konfluenten Zellmonolayer aufgebracht und somit die Lyse von
22
Zellen, die im Kontakt mit dem Reagenz gekommen sind, hervorgerufen. Dabei konnte die
Größe des zellfreien Bereiches durch die applizierte Menge auf dem Zellmonolayer bestimmt
werden. Um die genaue Lokalisation der chemischen Entfernung von Zellen zu gewährleisten,
wurde die Methode durch Nutzung von Mikrofluidik-Systemen weiterentwickelt (Nie et al.
2007). Das Prinzip bei der Nutzung von Mikrofluidik-Systemen beruht auf der parallel
angeordneten laminären Strömung verschiedener Lösungen, die sich aufgrund
unterschiedlicher Viskosität und Reynolds-Zahl nicht mischen (van der Meer et al. 2010). Bei
der vorgestellten Methode unter Verwendung des Mikrofluidik-Systems wird eine Kammer
mit jeweils drei Zuflüssen, wo drei parallel angeordnete laminäre Strömungen erzeugt werden
können, mit einer Zellsuspension geflutet (Nie et al. 2007). Nach Adhäsion der Zellen und
Ausbildung eines konfluenten Zellmonolayers in der Hauptkammer wird über einen oder zwei
Zuflüssen eine laminäre Strömung aus einer Trypsin-Medium-Lösung erzeugt. Sobald die
Trypsin-Medium-Lösung Zellen durch Abbau der Adhäsionen zur unterliegenden Matrix
gelöst hat, werden diese durch den laminären Strom aus dem System entfernt und ein
zellfreier Bereich entsteht. In dieses zellfreie Areal kann daraufhin die angrenzende Zellfront
migrieren und die Migrationsrate unter mikroskopischer Kontrolle bestimmt werden. Zur
Steigerung des Durchsatzes wurde basierend auf dieser Methode ein Mikrofluidik-System
entwickelt, das sowohl die Herstellung des zellfreien Areals, als auch die mikroskopische
Aufnahme und anschließende Analyse vollautomatisch bei 24-well Zellkulturplatten
durchführen kann (Conant et al. 2010).
3.6.2. Zellexklusionsmethoden
Im Gegensatz zu den Zellentfernungsmethoden wird bei den Zellexklusionsmethoden ein
Bereich noch vor Ausbildung eines Zellmonolayers durch unterschiedliche Einsätze oder
Substanzen freigehalten, der bei Entfernung der Barriere ebenfalls zu einem zellfreien Bereich
führt, worin die umliegenden Zellen anschließend migrieren können. Neben festen Einsätzen
aus unterschiedlichen Materialien, werden Barrieren aus Gelen oder Flüssigkeiten genutzt, um
das zellfreie Areal zu schaffen (Park und Shuler 2003, van Horssen und Hagen 2011).
23
Darüber hinaus können Zellen von einem freien Bereich durch elektrische Felder oder
Verwendung von magnetischen Partikeln abgehalten werden.
Im Gegensatz zu den Zellentfernungsmethoden zeichnen sich die Zellexklusionsmethoden
durch ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit und Standardisierung aus. Des Weiteren wird
durch den Einsatz der physikalischen Barrieren die Verletzung der Zellen minimiert und die
Eigenschaften der ECM des zellfreien Bereichs bleiben unbeeinflusst. Aus diesem Grund
eignen sich Zellexklusionsmethoden im Besonderen für die Erforschung der Migration von
Zellen ohne die Einflussfaktoren der Zellschädigung, des Zelldebris oder der Veränderungen
der unterliegenden Matrix. Zellexklusionsmethoden können grundsätzlich in Methoden mit
Verwendung von festen oder flüssigen Barrieren unterschieden werden.
Feste Barrieren zur Schaffung des zellfreien Bereichs werden des Weiteren durch die
verwendeten Materialien und somit der Art des Ausschlusses von Zellen unterschieden.
Während ursprünglich feste Barrieren aus Nickel oder Edelstahl nur während der Adhäsion
Zellen exkludieren konnten (Park und Shuler 2003), werden heutige feste Barrieren aus
Zusammenstellung unterschiedlicher biokompatibler Materialien geschaffen, die neben der
Ausbildung der Zellvorwölbung auch die Migration von umliegenden Zellen bis zur
Entfernung der Barriere unterbinden (van Horssen und Hagen 2011). Während die festen
Barrieren aus unterschiedlichen Metallen durch ihr Gewicht auf der unterliegenden Matrix in
Position gehalten werden, werden moderne feste Barrieren durch Einkeilen, Autoadhäsion
oder durch magnetische Anziehungskraft in ihrer Position auf dem Zellmonolayer fixiert
(Ashby und Zijlstra 2012).
Eine der ersten Zellexklusionsmethoden basierte auf dem Einsatz eines ‚Teflon fence‘ (Pratt
et al. 1984). Bei dieser Methode wurde ein ‚Teflon fence‘ mittig auf eine mit Matrix
beschichteten Petrischale eingesetzt und Zellen mit hoher Dichte in die zentraler Aussparung
des ‚Teflon fence‘ ausgesät. Nach der Ausbildung eines konfluenten Zellmonolayers wurden
die Barriere und nicht adhärente Zellen durch Waschung entfernt. Die folgende Zellmigration
wurde beobachtet und analysiert.
Andere feste Barrieren stellen die ‚Flexiperm disc‘ (Ohtaka et al. 1996) und der Einsatz von
Mikroschablonen (Poujade et al. 2007), die hauptsächlich aus biokompatiblem Silikon oder
24
PDMS bestehen, dar. Durch Autoadhäsion an die unterliegende Matrix werden diese
Barrieren in Position gehalten und die Migrationsassays durch dasselbe Prinzip der
Zellaussaat und Entfernung der Barriere nach Ausbildung des konfluenten Zellmonolayers,
geschaffen.
Durch das weite Einsatzgebiet dieser Zellexklusionsmethoden sind verschiedene Einsätze
kommerziell von verschiedenen Firmen erhältlich. Dazu zählt das ‚Ortis™ cell migration
assay‘ der Fa. Platypus Technologies Inc. (https://www.platypustech.com/cell-based-
assays/oris-cell-migration, USA), welches für 96-well Zellkulturplatten entwickelt wurde.
Dabei werden konisch geformte Einsätze vor Aussaat der Zellen in die wells der
Zellkulturplatten eingesetzt. Nach Ausbildung des konfluenten Zellmonolayers werden diese
entfernt, wodurch ein zirkulärer, zellfreier Bereich mit 2 mm Durchmesser durch die Spitze
der Einsätze entsteht (Hulkower und Herber 2011).
Weitere Einsätze auf werden u.a. von der Fa. Ibidi (Ibidi GmbH, www.ibidi.com, Germany)
hergestellt und vertrieben. Bei den Einsätzen handelt es sich um PDMS-Einsätze, die zwei
Bereiche für die Zellaussaat durch eine 500 µm breite Wand voneinander trennt. Die Einsätze
werden auf die wells einer Zellkulturplatte eingebracht und Zellen in die beiden getrennten
Reservoirs ausgesät. Nach Ausbildung der Zellmonolayer werden diese entfernt, wodurch die
500 µm breite Wand den zellfreien Bereich zwischen den beiden Zellmonolayern definiert.
Dabei kann bei dieser Methode zusätzlich das Migrationsverhalten und die Interaktion von
zwei unterschiedlichen Zelltypen pro well beobachtet werden. Des Weiteren bietet die Fa.
Ibidi auch Einsätze mit drei getrennten Reservoirs an, womit zwei zellfreie Bereiche
geschaffen und drei unterschiedliche Zelltypen eingesetzt und beobachtet werden können.
Flüssige Barrieren stellen eine weitere Gruppe von Zellexklusionsmethoden dar. Das Prinzip
beruht dabei nicht auf dem Einsetzen und Entfernen einer Barriere, sondern auf dem
Aufbringen einer Substanz auf die unterliegende Matrix, die Zellen an der Migration und
Adhäsion in diesem Bereich hindert und somit exkludiert.
Bei den Gel-Barrieren handelt es sich ebenfalls um kommerziell erhältliche Migrationsassays,
wo bereits die Zellkulturplatten mit einem Gel in der Mitte der wells vorbehandelt wurden.
Für den späteren Gebrauch werden diese Gele entweder getrocknet oder polymerisiert. Für die
25
Erstellung der Migrationsassays werden Zellen in die wells der speziellen Zellkulturplatten
ausgesät, die daraufhin auf der freiliegenden Matrix einen konfluenten Monolayer ausbilden.
Das Gel zerfällt anschließend bei der Inkubation der Zellkulturplatten in einem definierten
Zeitraum, so dass der Bereich, wo das Gel aufgebracht war, mit der unterliegenden Matrix
freigelegt wird und die angrenzenden Zellen in diesen abschließend migrieren können. Neben
vorbehandelten 96- und 384-well Zellkulturplatten der Fa. Platypus Technologies Inc. (Oris™
Pro cell migration assays, https://www.platypustech.com/cell-based-assays/oris-pro-cell-
migration, US) werden solche Migrationsassays ebenfalls von der Fa. Cell Biolabs Inc.
(Radius™ Cell migration assays, https://www.cellbiolabs.com/cell-migration-assays-2d-gap-
closure, US) für 24-, 48-, 96- und 384-well Zellkulturplatten vertrieben. Neben der
selbstständigen Auflösung des Gels nach Inkubation, kann der Abbau des Gels alternativ
durch den Einsatz einer auflösenden Substanz eingeleitet werden. Aufgrund der Tatsache,
dass das Gel im Randbereich dünner als in der Mitte des Geltropfens ist, kann es aufgrund der
unterschiedlichen Abbauzeit zu unregelmäßigen Zellrasengrenzen kommen, was als Nachteil
gegenüber festen Barrieren angesehen werden kann. Im Gegensatz dazu ist bei den Gel-
Barrieren eine Entfernung der Barriere aufgrund des automatischen Abbaus nicht erforderlich,
was den Einflussfaktor des menschlichen Fehlers bei der Entnahme von festen Barrieren
minimiert.
Neben Gel-Barrieren können auch flüssige Barrieren zur Exklusion von Zellen und somit
auch zum Schutz der unterliegenden Matrix in dem zellfreien Bereich verwendet werden.
Eine der ersten flüssigen Substanzen, die zur Zellexklusion eingesetzt wurden, war
Agarosegel (Varani et al. 1978). Bei dieser Methode wurde das aus der Zentrifugation
gewonnene Zellpellet in Agarosegel suspendiert. Anschließend wurde ein Tropfen der Zell-
Agarosegel Suspension auf eine Zellkulturplatte aufgetragen und solange gekühlt, bis sich der
Tropfen aufgrund des Agrosegels gefestigt hat. Nach Einbringen des Kulturmediums wurde
die Zellkulturplatte inkubiert und die anschließende Migration erfasst.
26
3.7. Fragestellung/ Hypothese
Ziel dieser Arbeit ist es, auf Grundlage von Fotoufnahmen verschiedener Techniken der 2D-
Zellmigrationsassays zu unterschiedlichen Zeitpunkten eine Methode zur Analyse in Hinblick
auf Aufkommen und Verteilung von toten Zellen unter Verwendung eines open-source
Bildbearbeitungsprogamms zu entwickeln. Zusätzlich werden die Methoden der 2D-
Zellmigrationsassays anhand der erhobenen Daten auf das Aufkommen, die Verteilung und
die Veränderung toter Zellen über die Zeit nach Schaffung des zellfreien Bereichs
miteinander verglichen. Dabei wird die Hypothese überprüft, ob Methoden der Zellentfernung
nicht mehr tote Zellen zu Anfang und im Verlauf der 2D-Zellmigrationsassays aufweisen, als
Methoden der Zellexklusion.
27
4. Material und Methode
4.1. Literaturrecherche
Für die Recherche relevanter wissenschaftlicher Publikationen für die Literaturübersicht
wurden die Literaturdatenbanken Scopus (https://www.scopus.com/home.uri) und PubMed
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/) verwendet. Des Weiteren wurde die Suchmaschine
Google Scholar (https://scholar.google.at/) für weitere Literaturrecherchen genutzt. Neben der
Literatur in englischer Sprache wurden zudem deutsche Publikationen für die Erstellung der
Literaturübersicht berücksichtigt. Keywords für die Literaturrecherche bzgl. Informationen
für Migrationsassays waren ‚2D cell migration assay‘ OR ‚migration assay‘ OR ‚in vitro
assay‘. Die Keywords ‚wound healing assay‘ OR ‚scratch assay‘ OR ‚cell removing methods‘
OR ‚cell excluding methods‘ OR ‚physical exclusion assay‘ wurden sowohl einzeln als auch
in unterschiedlicher Kombination für spezifischere Publikationen zur Differenzierung der
verschiedenen Methoden der 2D-Zellmigrationsassays verwendet. Für Informationen
hinsichtlich Erstellung und Verarbeitung von mikroskopischen Aufnahmen dienten folgende
Keywords: ‚live-cell microscopy‘ OR ‚time-lapse microscopy‘ OR ‚digital image processing‘
OR ‚ImageJ‘ OR ‚Fiji‘. ‚Cell damage‘ OR ‚apoptosis‘ OR ‚dead cell imaging‘ AND
Kombinationen mit den oben genannten Keywords für die Migrationsassays dienten zur
Suche von Literatur für die Erarbeitung von Einflussfaktoren auf die Zellmigration innerhalb
der in-vitro 2D-Zellmigrationsassays. Die ermittelten Publikationen und Reviews wurden
daraufhin auf Relevanz für diese Arbeit geprüft und bei Zutreffen der Keywords ausgewertet
und inkludiert.
Keywords: migration assay, wound healing assay, scratch assay, live-cell microscopy, dead
cell imaging
4.2. Ursprung der Zellen für die Zellkultur
Zur Bearbeitung der vorliegenden Arbeit standen Bilder verschiedener 2D-
Zellmigrationsassays equiner Chondro- und Tenozytenzellkulturen zur Verfügung. Die Zellen
wurden von drei Pferden gewonnen, die unabhängig von dieser Arbeit aus unterschiedlichen
Gründen euthanasiert wurden. Die Entnahme der benötigten Knorpel- und Sehnengewebe zur
28
Zellgewinnung wurde auf Grundlage der ‚Good Scientific Practice and Ethics in Science and
Research‘ – Verordnung der Veterinärmedizinischen Universität Wien durchgeführt. Die
schriftliche Einverständniserklärung bezüglich Gewinnung und weiterer wissenschaftlicher
Verwendung der Gewebeproben wurde im Zuge einer vorangegangenen Studie, die zu den
Aufnahmen für diese Arbeit geführt hat, von den Patientenbesitzern eingeholt und von der
Ethik- und Tierschutzkommission der Veterinärmedizinischen Universität Wien genehmigt.
4.3. Zellgewinnung
Sowohl Chondrozyten, als auch Tenozyten für die Zellkulturen, die für die 2D-
Zellmigrationsassays als Grundlage der mikroskopischen Aufnahmen dienten, wurden aus
steril gewonnenen Knorpel- und Sehnengewebeproben der euthanasierten Pferde isoliert. Die
Knorpelgewebeprobe wurde bis zur weiteren Verarbeitung in einem sterilen
Transportbehälter, gefüllt mit einer Lösung aus PBS (Phosphate buffered saline, Sigma
Aldrich, US), Amphotericin B (Biochrom, Germany) und Gentamicin (Sigma Aldrich, US),
gelagert. Das Sehnengewebe wurde ebenfalls nach steriler Entnahme in einen
Transportbehälter gegeben, allerdings nur mit PBS befüllt.
4.3.1. Isolation von Chondrozyten aus Knorpelgewebe
Die Isolation der Chondrozyten aus dem Knorpelgewebsverband erfolgte durch enzymatische
Digestion des Knorpels mit Hilfe einer Collagenase-Lösung.
Zunächst wurde dafür eine Collagenase-Lösung mit der Endkonzentration von 1 mg/ml
hergestellt. Für die Herstellung dieser Lösung wurden 50 mg Collagenasepulver abgewogen
und in 5 ml PBS gelöst. Für die benötigten 50 ml gebrauchsfertige Collagenase-Lösung wurde
die entstandene Lösung nach Filtration mit 45 ml PBS auf 50 ml aufgefüllt. Des Weiteren
wurden 0,5 ml Amphotericin B (Biochrom, Germany) und 0,5 ml Gentamicin (Sigma
Aldrich, US) hinzugefügt.
Neben der Herstellung der Collagenase-Lösung war für die weitere Verarbeitung der
Gewebeproben die Herstellung von Kultivierungsmedium nötig. Dieses bestand aus
29
folgenden Komponenten und Mengenverhältnissen: DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's
medium, DMEM low Glucose®, Lonza, Germany) mit 1 % Amphotericin B (Biochrom,
Germany), 1 % Penicillin/Streptomycin (Sigma Aldrich, US), 1 % L-Alanyl/L-Glutamine
(Biochrom, Germany) und 10 % FCS (Sigma Aldrich, US).
Nach Desinfektion des Transportbehälters und dessen Einbringen in die Bench wurde die
Gewebeprobe entnommen und in einer vorbereiteten, sterilen Petrischale mit Hilfe von
Pinzette und Schere zerkleinert. Die daraus resultierenden zerkleinerten Knorpelgewebestücke
wurden daraufhin in ein steriles Becherglas eingegeben und abhängig von der Menge des
Knorpelgewebes mit der zuvor hergestellten Collagenase-Lösung versetzt. Nach steriler
Eingabe eines Rührfischs wurde das Becherglas mit einer Alufolie steril verschlossen und bei
150 Umdrehungen/min auf einem Magnetrührer im Brutschrank (HeracellTM 240i,
ThermoFisher Scientific, US) für drei Stunden bei 37 °C und 5 % CO2 verdaut. Nach
Digestion des Knorpelgewebes wurde die Digestionslösung durch ein Zellsieb mit 100 µm
Porengröße (Biosciences – Discovery Labware, US) in ein neues, steriles Becherglas
überführt, um allfälliges Restgewebe herauszufiltern. Anschließend wurde mit 40 ml PBS
(Phosphate buffered saline, Sigma Aldrich, US) nachgespült. Die filtrierte und mit PBS
versetzte Digestionslösung wurde daraufhin auf 15 ml Falcons aufgeteilt und in einer
Zentrifuge (Rotanta 460R, Hettich, Germany) bei 437 g (2000 rpm) und 21 °C für 5 Minuten
zentrifugiert. Nach Zentrifugation wurde der Überstand abgenommen, die Zellpellets in je 5
ml PBS resuspendiert und die 15 ml Falcons wiederum mit 14 ml PBS aufgefüllt. Nach
erneuter fünfminutiger Zentrifugation bei 437 g (2000 rpm) und 21 °C wurde der Überstand
abermals abgenommen. Die Chondrozyten – Zellpellets wurden im letzten Schritt mit 10 ml
Kultivierungsmedium (siehe oben) suspendiert, in einer T 75 Flask ausgesät und nach
Beschriftung bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.
Bis zur ersten Passage wurde die Probe täglich makroskopisch und mikroskopisch (CKX41,
Olympus, Japan) auf Kotamination kontrolliert. Zusätzlich zur makro- und mikroskopischen
Kontrolle und Beschreibung der Zellmorphologie, wurden die Zellen am zweiten Tag
zweimal mit PBS gewaschen und ein Mediumwechsel mit Kultivierungsmedium (siehe oben)
durchgeführt. Weitere Mediumwechsel wurden daraufhin zweimal wöchentlich durchgeführt
und die Zellen wurden bei Bedarf vor dem Mediumwechsel gewaschen.
30
4.3.2. Isolation von Tenozyten aus Sehnengewebe
Die Isolation der Tenozyten aus dem Sehnengewebe erfolgte durch Auswanderung und
Auswachsen von Zellen aus zerkleinertem Sehnengewebe. Für die Auswanderung wurde
ebenfalls vorbereitetes Kultivierungsmedium mit den oben angegebenen Bestandteilen und
Mengenverhältnissen benötigt.
Der Transportbehälter mit der Gewebeprobe wurde nach äußerlicher Desinfektion in die
Bench eingbracht, das Sehnenstück mit Hilfe einer sterilen Pinzette aus diesem entnommen
und in eine vorbereitete sterile Petrischale abgelegt. Darauf folgend wurden mit Hilfe eines
Skalpells und der Pinzette die Sehnenstücke in ca. drei bis vier mm2 große Stücke zerkleinert.
Drei zuvor vorbereitete 6-well Platten, mit jeweils vorgelegten 2 ml DMEM pro well, wurden
daraufhin mit jeweils sechs bis sieben von den zuvor zerkleinerten drei bis vier mm2 großen
Sehnenstückchen pro well bestückt. Die drei 6-well Platten wurden anschließend bei 37°C
und 5 % CO2 im Brutschrank inkubiert. Weitere Schritte bis zur Passage mit mikro- und
makroskopischer Kontrolle, Mediumwechsel und Waschung wurden wie bei der
Chondrozytenzellkultur durchgeführt. Bei der mikroskopischen Beurteilung wurde zudem die
Koloniekonfluenz abgeschätzt, um bei Erreichen einer 80 %-igen Konfluenz die Sehenstücke
mit Hilfe einer sterilen Pinzette oder Absaugen aus den wells zu entfernen. Durch die
Entnahme der Sehnenstücke wurde die Zellkultur durch mechanische Irritation teilweise
verletzt. Um wiederum die angestrebte 80 % Koloniekonfluenz zu erreichen, wurden die 6-
well Platten ohne Sehnenstücke bei den oben beschriebenen Parametern kultiviert.
4.3.3. Passage und Zellernte
Sowohl für die Zellkulturen der Chondrozyten als auch jene der Tenozyten wurde dasselbe
Protokoll zur Passage und Zellernte angewendet.
Die Passage der Zellen erfolgte nach Bestimmung der Koloniekonfluenz. Hierzu wurde mit
Hilfe der mikroskopischen Kontrolle die Konfluenz der Zellen bestimmt und bei mindestens
80 % Koloniekonfluenz mit dem nächsten Schritt fortgefahren.
31
Der nächste Schritt umfasste die Ernte der Zellen. Dazu wurde zunächst das Medium mittels
Pipette abgesaugt, die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, welches folgend wiederum
abgesaugt wurde. Daraufhin wurde in die Zellkulturflaschen mit der Chondrozytenzellkultur
und in die 6-well Platten mit der Tenozytenzellkultur Trypsin (Trypsin/EDTA 0.05 %,
Biochrom, Germany) eingebracht, um zelluläre sowie auch interzelluläre Mucoproteine zu
schädigen und folglich die Zellen vom Untergrund zu lösen. Die Menge des zugefügten
Trypsin richtete sich dabei einerseits nach der Größe der Flasks und andererseits wurden bei
den 6-well Platten 0,5 ml Trypsin pro well hinzugefügt. Nach sorgfältiger, gleichmäßiger
Verteilung des Trypsins durch Schwenken der Zellkulturen und anschließender 5 minütiger
Inkubation im Brutschrank bei 37 °C und 5 % CO2, wurden die Zellen vom Boden des
Kulturgefäßes gelöst. Das Lösen der Zellen wurde zudem durch Beklopfen der
Zellkulturflasche bzw. leichtes Aufklopfen der 6-well Platten gefördert. Neben der
makroskopischen Kontrolle wurden die Zellkulturen zudem mikroskopisch auf ausreichende
Zellablösung kontrolliert. Die zeitige Inaktivierung des Trypsins wurde einerseits durch
Zugabe der gleichen Menge Kultivierungsmedium bei der Zellkulturflasche und andererseits
durch 1,5 ml Kultivierungsmedium pro well bei den 6-well Platte erreicht. Die zeitige
Inaktivierung des Trypsins nach Inkubation ist dabei essentiell für den Schutz der Zellen und
die Erhaltung der Vitalität, da eine weitere Trypsin-Exposition zu starken
Zellmembranschädigungen führen kann. Anschließend wurde die Zellsuspension in 15 ml
Falcons überführt, die Kulturgefäße mit PBS nachgespült und ebenfalls in die Falcons
eingegeben, die darauf folgend mit PBS auf 14 ml Gesamtvolumen aufgefüllt wurden. Nach 5
minütiger Zentrifugation der Falcons bei 427 g (2000 rpm) und Abnahme des Überstands,
blieb am Boden der Falcons das Zellpellet zurück.
4.4. Bildung der Zellmonolayer
Für die drei Methoden der mechanischen Zellentfernung (50 g, 150 g und Magnet) wurden
100.000 Zellen pro well auf eine 12-well Platte ausgesät. Nach Ausbildung des
Zellmonolayers, ca. 24 Stunden nach Aussaat, wurden diese zweimal mit PBS gewaschen,
woraufhin die Methode zur Schaffung des zellfreien Bereichs angewendet wurde.
32
Das Einsetzen der Zellkulturinserts (80209, Ibidi, Germany) und die Aussaat der Zellen für
diese Zellexklusionsmethode wurde anhand der Gebrauchsanweisung der Fa. Ibidi
(Application Note 21
(https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN21_Wound_Healing_Assay.pdf) und Application
Note 36 (https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN36_WoundHealingAssay_24Well.pdf),
Ibidi, Germany) durchgeführt. Bei den Zellkulturinserts der Fa. Ibidi handelt es sich um
Silikoneinsätze zur physikalischen Exklusion von Zellen in einem definierten Bereich von
500 µm +/- 100 µm (Abb. 1.). Zum Einsetzen wurden die Silikoneinsätze mit einer sterilen
Pinzette aus dem Transportbehälter genommen und einzeln in die Mitte der wells einer 12-
well Platte eingegeben. Anschließend wurde in die zwei Kammern jeweils 70 µl
Zellsuspension eingegeben und somit pro Kammer 15.000 bis 20.000 Zellen ausgesät, um
nach 24 Stunden einen konfluenten Zellmonolayer je Kammer zu schaffen (Abb. 2.).
Abb. 1. 25 Zellkultureinsätze mit 2 Kammern
und einem definiertem zellfreien Bereich von
500 µm +/- 100 µm (80209, Ibidi.
https://ibidi.com/removable-chambers/25-25-
culture-inserts-2-well-for-self-insertion.html
[Zugriff: 28.05.2019])
Abb. 2. Aussaat von 70 µl Zellsuspension je
Kammer mit 15.000 bis 20.000 Zellen
(Application Note 36, Ibidi.
https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN36
_WoundHealingAssay_24Well.pdf [Zugriff:
28.05.2019])
33
4.5. Herstellung der 2D-Zellmigrationsassays
Für die Kreation des zellfreien Bereiches wurden Methoden beider Kategorien von
Zellentfernungs- und Zellexklusion verwendet.
Repräsentativ für die Zellentfernungsmethoden wurde neben dem derzeitigen ‚gold –
standard‘ der mechanischen Entfernung durch eine 1250 µl Pipettenspitze (‚scratch assay‘),
eine neue Methode durch Entfernung der Zellen mit Hilfe von Magneten angewendet. Zudem
wurde der ‚scratch‘ mittels Pipettenspitze mit zwei unterschiedlichen Drücken durchgeführt
(50 g und 150 g). Zur Kontrolle des angestrebten Drucks während der Durchführung des
scratches wurden die 12-well Platten auf eine Hochpräzisionswaage platziert.
Im Zuge einer dieser Arbeit vorhergegangenen Studie durch Forscher des VETERM wurde
eine neue Technik zur mechanischen Entfernung von Zellen entwickelt und validiert, die sich
von der herkömmlichen ‚scratch assay‘-Methode unter Verwendung einer Pipettenspitze
durch bessere Reproduzierbarkeit, höheren Durchsatz und regelmäßige zellfreie Bereiche
abhebt.
Das Werkzeug, das für die neue Technik benötigt wird, kann mit Hilfe von herkömmlichen
Multiwell-Zellkulturplatten und kommerziell erhältlichen Magneten in jedem Labor
selbstständig hergestellt werden. Dabei kann das Werkzeug an die vorhandenen individuellen
labortechnischen Utensilien und die Ausstattung des Labors, wie beispielsweise verschiedene
Größen und Formen von Zellkulturplatten, angepasst werden. Für die Herstellung werden
zunächst zwei Zellkulturplattendeckel im 90° Winkel zueinander zusammengeklebt, wobei
auf den unteren, waagerechten Deckel später die passende Zellkulturplatte aufgesetzt wird
und der senkrechte Deckel als Leitschiene dient. Anschließend wurden Neodym-Eisen-Bor
(NdFeB) Kugelmagnete (K-05-C, Supermagnete, Germany) mit einem Durchmesser von 5
mm (+/- 0,1 mm) auf den unteren Deckel so weit rechts und mittig wie möglich in die
angedeutete Form der wells des Zellkulturplattendeckel mit einem kommerziell erhältlichen
Klebstoff, aufgeklebt. Um die korrekte Ausrichtung der Magnete zu gewährleisten, wurden
Kontermagnete beim Ankleben genutzt. Für die Magneten, die den Zellmonolayer innerhalb
der wells der Zellkulturplatte zerstören sollen, wurden NdFeB Scheibenmagnete (S-1.5-0.5-N,
Supermagnete, Germany) mit einem Durchmesser von 1,5 mm und einer Höhe von 0,5 mm
34
(+/- 0,1 mm) verwendet. In einer Vorstudie wurde diesbezüglich festgestellt, dass vier
aufeinandergestapelte Scheibenmagnete das optimale Gewicht und die nötige magnetische
Anziehungskraft zur Schaffung von regelmäßigen zellfreien Bereichen über die gesamte
Länge der wells gewährleisten. Bevor die NdFeB Scheibenmagnete auf die Zellmonolayer
aufgebracht wurden, wurden diese in 70%igem Ethanol für 10 Minuten steril gemacht und
daraufhin zweimal mit PBS für jeweils 5 Minuten gewaschen. Die vier
aufeinandergestapelten NdFeB Scheibenmagnete wurden anschließend mit sterilen
Plastikpinzetten in die wells mit den konfluenten Zellmonolayern eingefügt. Für die korrekte
Positionierung wurde die Zellkulturplatte auf den unteren Deckel mit den aufgeklebten
Kugelmagneten aufgelegt. Dabei wurde die Zellkulturplatte vor Einbringen der Magnete
derart auf den Deckel aufgelegt, dass die unterliegenden Kugelmagnete am rechten Rand der
angedeuteten Formen der wells des Deckels unter dem linken Rand der darüber liegenden
Zellkulturplatten mit den Zellmonolayern zu liegen kamen. Nach vollständigem Einsatz der
NdFeB Scheibenmagnete wurden diese aufgrund der magnetischen Anziehungskraft an den
linken Rand des Zellmonolayers fixiert. Durch Verschiebung der Zellkulturplatte nach links
wurde daraufhin ein regelmäßiger, gerade verlaufender zellfreier Bereich geschaffen. Dabei
diente der senkrechte Deckel als seitliche Begrenzung, was die Regelmäßigkeit des zellfreien
Bereichs gewährleistete. Abschließend wurden die Scheibenmagnete aus den wells durch
Magnete, die an einem Metallstab angebracht waren, entnommen.
Das Prinzip dieser Methode wird in Abb. 3. Schematisch dargestellt.
35
Abb. 3. Schematische Darstellung der entwickelten Methode unter Verwendung von
Magneten. Der in den angedeuteten Vertiefungen des Zellkulturplattendeckels aufgeklebte
Kugelmagnet wird als hellblauer Kreis dargestellt. Die vier aufeinandergestapelten
Scheibenmagnete sind in der Abb. als dunkelblaue Stapel illustriert. (A) zeigt den
untenliegenden Zellkulturplattendeckel mit den aufgeklebten Kugelmagneten. Darüber
liegend wird die Zellkulturplatte mit den konfluenten Zellmonolayern so aufgebracht, dass
die Kugelmagnete am linken Rand der wells der darüberliegenden Zellkulturplatte zu liegen
kommen. Nach Einbringen der vier aufeinandergestapelten Scheibenmagnete, werden diese
durch die magnetische Anziehungskraft in Position gebracht. (B) Durch Verschiebung der
Zellkulturplatte nach links wird anschließend der zellfreie Bereich geschaffen.
(A)
(B)
36
Für die Schaffung des zellfreien Bereichs bei der Zellexklusionsmethode wurden die
Silikoneinsätze mit einer sterilen Pinzette entnommen. Dazu wurde eine Ecke des Einsatzes
vorsichtig gefasst und der Einsatz abgehoben (Abb. 4.).
Abb. 4. Entnahme der Silikoneinsätze mittels
steriler Pinzette (Application Note 36, Ibidi.
https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN36_
WoundHealingAssay_24Well.pdf [Zugriff:
28.05.2019])
Unabhängig von der Methode wurden die Zellen nach Schaffung des zellfreien Bereichs
zweimal mit PBS gewaschen, um nicht adhäsive Zellen und etwaigen Zelldebris zu entfernen.
Abschließend wurde pro well 1 ml frisches Kultivierungsmedium hinzugegeben.
4.6. Vital-Fluoreszenz-Doppelfärbung
Zur Unterscheidung von lebenden und toten Zellen in den Zellkulturen wurde eine Vital-
Fluoreszenz-Doppelfärbung unter Verwendung der Färbemittel Fluoreszindiacetat (FDA, C-
7521, Sigma-Aldrich) und Propidiumiodid (PI, P4170, Sigma-Aldrich) nach dem
Färbeprotokoll der Fa. Ibidi® angewendet (Application Note 33
37
(https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN33_Live_Dead_staining_with_FDA_and_PI.pdf),
Ibidi, Germany). Aufgrund der Esterase-abhängigen Umwandlung des nicht-fluoreszierende
FDA zum grün fluoreszierenden Metaboliten Fluoreszin, dienen die grün gefärbten Zellen als
Indikator für lebende Zellen. Demgegenüber stellen durch PI gefärbte rote Zellkerne tote
Zellen dar, da das PI intakte Zellmembranen von vitalen, lebenden Zellen nicht passieren
kann und somit auf Schädigungen der Zellmembran angewiesen ist, um den Zellkern zu
erreichen und durch Interaktion mit der DNA zu färben.
4.7. Erfassung der Bilder
Die 2D-Zellmigrationsassays wurden in Phasenkontrast unter Verwendung des
vollautomatischen EVOS™ FL Fluoreszenzsystems (AMAFD1000, ThermoFisher Scientic,
US) in Abb. 4. mit einem 4x/0.13 EVOS™ LWD Fluorit-Phasenkontrastobjektiv
(AMEP4680, ThermoFisher Scientific, US) in Abb. 5. dargestellt, aufgenommen. Zur
Erfassung der Veränderung toter Zellen in den Migrationsassays wurden die hochauflösenden
Bilder zu drei unterschiedlichen Zeitpunkten angefertigt: Direkt nach der Schaffung des
zellfreien Bereiches (null Stunden), nach acht Stunden und letztendlich nach 24 Stunden.
38
Abb. 5. Invitrogen™ EVOS™ FL
automatisches digitales inverses
Fluoreszenzsystem (ThermoFisher Scientific.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/
product/AMAFD1000?SID=srch-srp-
AMAFD1000 [Zugriff: 24.05.2019])
Abb. 6. Invitrogen™ 4X Objective, Fluorite,
LWD, Phase-contrast, 0.13NA/10.58WD
(ThermoFisher Scientific.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/
product/AMEP4680 [Zugriff: 24.05.2019])
4.8. Bildbearbeitung und –analyse
Für die Bildbearbeitung, -analyse und Entwicklung der hier beschriebenen Methode wurde
das open-source Bildbearbeitungsprogramm Fiji, das auf Grundlage der
Bildbearbeitungsbibliothek ImageJ (http://images.nih.gov/ij/, version 2.0.0-Ec-43/1.50e) mit
weiteren Plugins und Makros umfangreich erweitert wurde und sich im Speziellen für die
Analyse von mikroskopischen Aufnahmen eignet, verwendet (Collins 2007, Michael D.
Abràmoff et al., Schindelin et al. 2012). Fiji steht kostenlos auf der Hompage von ImageJ
zum Download zur Verfügung (https://imagej.net/Fiji/Downloads). Für diese Arbeit wurde
die 64-bit Version für Microsoft Windows verwendet.
39
4.9. Entwicklung der Methode
Hauptziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Validierung einer Methode zur Bestimmung
und Analyse von toten Zellen in verschiedenen 2D-Migrationsassays auf Basis des
Bildbearbeitungsprogrammes Fiji. Die Gesamtheit der einzelnen Schritte der Bildbearbeitung,
um die Anzahl der toten Zellen zu bestimmen, wird graphisch in der Abb. 8. dargestellt.
4.9.1. Kalibrierung
Für die Bearbeitung der Bilder war es zunächst nötig, bei Fiji eine Standardeinheit festzulegen
und anhand von gegebenen Größenverhältnissen in den Aufnahmen zu kalibrieren. Dazu wird
eine Linie bekannter Länge mit dem [Line selection tool] gezogen und via [Analyze Set
scale…] als bekannte Distanz eingefügt. Zudem ist anzugeben, in welcher Maßeinheit die
eingegebene Linie bemessen wurde [µm]. Um diese Festlegung auf weitere, zukünftig
geöffnete Aufnahmen automatisch zu übertragen, ist die Bestätigung der Kalibrierung mit
[global] nötig. Die 1000 µm Markierung innerhalb der mikroskopischen Aufnahmen wurde
als bekannte Länge angegeben. Der Umrechnungsfaktor betrug somit ~ 0,4525 Pixel/µm.
4.9.2. Festlegung der Region of interest (ROIs)
Als erster Schritt wurde der green channel der RBG-Bilder (1) zur Festlegung der Grenzen
des zellfreien Bereichs in Fiji geöffnet. Zur weiteren Bearbeitung war die Änderung des 16-
bit green channel in einen 8-bit greyscale channel nötig (2) [Image Type 8-bit]. Der
nächste Schritt umfasste das Thresholding, die Festlegung eines Schwellenwertes, wonach
Pixel entweder als weiß oder schwarz detektiert und angezeigt werden (3) [Image Adjust
Threshold]. Zur Festlegung der Zellrasengrenze wurde das Plugin Wand (tracing) tool
verwendet, das die Grenze zwischen weißen und schwarzen Pixel markiert (4). Anhand der
vorherg
ehenden Kalibrierung mit Umrechnung von µm in Pixel, wurde die detektierte Grenze in den
gewünschten Abständen dupliziert und verschoben. Dazu wurden die obere und untere
Zellrasengrenze bzw. die Kante zwischen weißen und schwarzen Pixeln in den ROI Manager
40
gespeichert [Analyze Tools ROI Manager…], [Add (t)]. Dieser Vorgang wurde
viermal wiederholt, um insgesamt acht duplizierte Grenzen zu erhalten. Die Verschiebung
von sechs Grenzen wurde durch die Funktion [More Translate] im ROI Manager mit den
Daten in Tab. 1. ausgeführt und resultierte in der Eingrenzung von drei Flächen an der oberen
und unteren Zellrasengrenze (6), die als ROI (A), (B) und (C) bezeichnet wurden und in Abb.
7 illustriert sind.
41
Tab. 1. Werte zur Verschiebung der duplizierten Grenzen. Angaben in Pixel.
ROI (A) ROI (B) ROI (C)
obere Zellrasengrenze x = 0, y = 55 x = 0, y = -55 x = 0, y = -110
untere Zellrasengrenze x = 0, y = -55 x = 0, y = 55 x = 0, y = 110
Abb. 7. Festlegung der ROIs. Die Verschiebung der Zellrasengrenze 25µm in Richtung des
zellfreien Bereichs, 25µm und 50µm in Richtung des verbleibenden Zellrasens resultiert in
drei eingeschlossene ROIs. Insgesamt folgen aus diesem Vorgang sechs ROIs an der oberen
und unteren Zellrasengrenze
42
4.9.3. Zählung der toten Zellen
Um die Anzahl der toten Zellen innerhalb der einzelnen ROIs zu bestimmen, wurden zunächst
die in dem ROI Manager gespeicherten Linien auf den 16-bit red channel übertragen. Zur
besseren Sichtbarkeit und Detektion der gefärbten Zellkerne wurde zunächst über die
Funktion [Image Adjust Brightness/Contrast] die Reichweite auf [Minimum
displayed value: 0; Maximum displayed value: 55] eingegrenzt (7). Für die automatische
Markierung der Zellkerne wurde die Funktion [Process Find Maxima…] mit den
Einstellungen [Noise tolerance: 15; Output type: Point Selection] angewendet (8). Die
Zählung der in den ROIs markierten Zellkerne folgte daraufhin manuell.
43
Abb. 8. Workflow – Analyse der 2D-Zellmigrationsassays, (1) 16-bit green channel der RGB
– Bilder, (2) Änderung auf 8-bit greyscale channel, (3) Tresholding, (4) Detektion der
Zellrasengrenze mit dem Wand (tracing) tool, (5) Übertragung der Grenze auf den 16-bit
green channel zur optischen Kontrolle der Genauigkeit, (6) Duplikation und Translation der
Zellrasengrenzen zur Eingrenzung der ROIs, (7) Übertragung auf den 16-bit red channel und
Änderung der Helligkeit/Kontrast zur besseren Sichtbarkeit der gefärbten Zellkerne, (8)
automatische Detektion der toten, rot gefärbten Zellkerne.
(3) (4)
(5) (6)
(7) (8)
(1))
(2)
44
4.10. Statistische Analyse
Die statistische Analyse wurde mit Hilfe von IBM SPSS Statistics (https://www-
01.ibm.com/support/docview.wss?uid=swg24043678, IBM, US) durchgeführt. Neben der
Erstellung der deskriptiven Statistik mit Median (m), Standardabweichung (s), Spannweite
(Min. – Max.) und Quartile (x0,25, x0,5 und x0,75) wurden für die nicht normalverteilten Werte,
sowohl Mann-Withney’s U-tests als auch zweiseitige t-tests angewendet. Diese statistischen
Tests wurden zur Analyse der Unterschiede zwischen Zellentfernungs- (50 g, 150 g und
Magnet) und der Zellexklusionsmethode (Ibidi) durchgeführt. P-Werte unter 0,05 wurden als
signifikant eingestuft. Darüber hinaus wurden sämtliche Box-Whiskers Diagramme mit Hilfe
des Programmes erstellt.
45
5. Ergebnisse
Insgesamt wurden auf Basis der beschriebenen Methode 279 Aufnahmen von 2D-
Zellmigrationsassays analysiert, wobei 140 Aufnahmen von Chondrozyten- und 139 von
Tenozytenzellkulturen stammten. Somit wurden von 288 möglichen Aufnahmen 97%
berücksichtigt und in die statistische Auswertung aufgenommen. Aus den 279
berücksichtigten Aufnahmen wurden 1674 Werte für die ROIs ermittelt.
Zum Teil war die Anzahl der toten Zellen in den drei ROIs nicht vollständig zu ermitteln. Der
Hauptgrund für die unvollständige Erhebung der toten Zellen war der in den mikroskopischen
Aufnahmen unzureichend tiefe, verbleibende Zellmonolayer, wodurch v.a. die ROI (C)
zwischen der 25 µm und 50 µm Grenze nicht vollständig eingeschlossen wurde. Weitere
Limitierungen der Methode durch z.B. fehlerhafte, automatische Detektion der
Zellrasengrenzen durch ausgerissene Zellverbände, oder der unzureichenden PI-Färbung der
Zellkerne, konnten durch manuelle Korrektur und Anpassung der Einstellungen behoben
werden. Insgesamt belief sich dieser Anteil auf 3,4%, zusammengesetzt aus 1,6% fehlender
ROIs aus den Chondrozytenzellkulturen und 5,2% aus den Tenozytenzellkulturen.
Die genaue Aufteilung der für die Analyse zur Verfügung stehenden Aufnahmen ist in Tab. 2.
ersichtlich. Dabei steht D für das jeweilige Spendertier, abs. gibt den absoluten und rel. den
relativen Wert an.
46
Tab. 2. Anzahl von Bildern und ROIs zur Analyse
Bilder ROIs unvoll. ROIs
Zellart Spendertier abs. abs. rel. abs. rel.
Chondrozyten
D1 48 288 1 7 0,024
D2 44 264 0,917 4 0,015
D3 48 288 1 2 0,007
gesamt 140 840 0,972 13 0,016
Tenozyten
D4 44 264 0,917 9 0,034
D5 48 288 1 19 0,066
D6 47 282 0,979 15 0,053
gesamt 139 834 0,965 43 0,052
gesamt 279 1674 0,969 56 0,034
Die Anzahl der toten Zellen pro ROI der einzelnen 2D-Migrationsassays sind in Tab. 3. –
Tab.8. dargestellt. Op bezeichnet dabei den Operateur, der die Assays angefertigt hat, T steht
für die Technik und Z stellt den Zeitpunkt der Aufnahme dar. Rot markierte Werte spiegeln
unvollständige bzw. nicht eindeutige Anzahlen von toten Zellen in der jeweiligen ROI wider.
Aufnahmen, die mit N/A gekennzeichnet sind, wurden nicht in die Analyse aufgenommen.
47
Tab. 3. Ergebnisse Chondrozyten D1 Obere Zellrasengrenze Untere Zellrasengrenze Op T Z ROI (A) ROI (B) ROI (C) ROI (A) ROI (B) ROI (C)
Op1
50g
0h 5 7 7 3 9 2 8h 4 52 43 4 60 59
24h 3 5 6 4 5 6 0h 3 4 1 2 4 6 8h 7 11 7 4 19 12
24h 2 1 4 4 9 4
150g
0h 4 4 5 2 9 5 8h 3 11 8 3 7 7
24h 1 4 1 2 1 3 0h 9 8 4 2 24 21 8h 2 7 10 2 7 3
24h 2 2 5 0 3 1
Ibidi
0h 4 4 0 4 6 5 8h 1 4 2 2 2 2
24h 0 2 6 4 0 2 0h 0 3 7 2 10 10 8h 7 9 7 2 5 7
24h 6 5 3 2 2 5
Magnet
0h 3 17 6 1 18 1 8h 3 30 6 5 35 11
24h 3 12 4 0 6 5 0h 1 8 2 6 12 0 8h 1 9 9 1 18 7
24h 2 10 7 4 5 8
Op2
50g
0h 4 11 3 8 11 6 8h 0 9 3 2 6 7
24h 4 6 10 1 8 3 0h 8 26 10 4 33 18 8h 4 10 8 2 8 6
24h 6 9 7 3 1 3
150g
0h 5 28 13 1 13 10 8h 1 11 5 1 7 3
24h 1 11 12 2 7 9 0h 5 19 6 3 4 1 8h 1 9 8 1 4 2
24h 3 8 6 1 6 8
Ibidi
0h 2 2 3 2 2 8 8h 4 2 4 2 6 4
24h 3 2 5 4 1 3 0h 2 2 7 2 5 5 8h 1 4 5 3 1 6
24h 2 4 6 1 4 4
Magnet
0h 6 16 5 12 29 11 8h 2 11 4 1 33 15
24h 5 8 5 4 23 5 0h 15 27 4 5 65 8 8h 2 25 10 3 28 10
24h 12 67 38 4 47 30
48
Tab. 4. Ergebnisse Chondrozyten D2 Obere Zellrasengrenze Untere Zellrasengrenze Op T Z ROI (A) ROI (B) ROI (C) ROI (A) ROI (B) ROI (C)
Op1
50g
0h 3 20 11 3 37 16 8h 1 13 7 3 14 26
24h 4 7 9 4 3 3 0h 3 16 13 2 19 11 8h 3 4 6 0 6 5
24h 4 13 5 6 12 14
150g
0h 6 15 7 6 27 16 8h 3 10 6 3 9 4
24h 2 5 5 1 5 3 0h 3 14 10 5 30 18 8h 3 21 28 4 7 5
24h 2 2 4 1 2 1
Ibidi
0h 5 34 39 4 42 54 8h 8 18 23 4 18 27
24h 8 25 43 5 19 21 0h 9 39 62 15 41 45 8h 4 23 22 4 13 36
24h 10 9 22 8 19 27
Magnet
0h 5 59 25 10 26 2 8h 2 17 15 2 39 13
24h 4 32 28 9 26 13 0h 2 59 5 6 69 15 8h 7 81 23 4 56 9
24h 11 67 54 5 11 42
Op2
50g
0h 7 30 8 5 37 5 8h 1 4 1 1 5 1
24h 6 13 11 5 9 6 0h 5 20 6 2 26 3 8h 2 7 0 2 3 2
24h N/A
150g
0h 5 27 8 1 22 0 8h 2 9 0 1 9 0
24h 3 8 11 5 2 4 0h N/A 8h 4 4 2 3 3 1
24h N/A
Ibidi
0h 19 26 28 28 47 86 8h 21 24 23 29 33 40
24h 18 10 24 26 20 49 0h 9 39 53 15 32 27 8h 13 26 31 5 17 45
24h 26 30 33 31 27 45
Magnet
0h 4 18 6 11 68 12 8h 0 8 3 1 4 3
24h 5 27 77 2 8 23 0h 7 38 5 1 63 2 8h 1 20 13 2 3 2
24h N/A
49
Tab. 5. Ergebnisse Chondrozyten D3 Obere Zellrasengrenze Untere Zellrasengrenze Op T Z ROI (A) ROI (B) ROI (C) ROI (A) ROI (B) ROI (C)
Op1
50g
0h 8 64 66 10 37 14 8h 12 51 72 3 12 28
24h 1 19 65 3 7 40 0h 5 47 32 1 27 19 8h 4 30 22 4 18 17
24h 5 76 168 4 27 114
150g
0h 13 171 106 9 120 89 8h 3 43 38 0 43 80
24h 3 15 22 2 2 10 0h 3 35 18 1 33 24 8h 4 61 68 6 35 40
24h 2 20 21 8 11 13
Ibidi
0h 13 29 44 12 35 46 8h 13 24 40 14 29 38
24h 1 9 20 2 9 16 0h 10 35 37 15 35 36 8h 3 32 33 14 30 34
24h 5 5 9 2 2 4
Magnet
0h 2 31 24 5 28 12 8h 9 29 24 10 27 25
24h 6 8 11 1 11 8 0h 7 39 21 8 32 9 8h 10 15 11 8 15 14
24h 3 6 9 3 5 4
Op2
50g
0h 4 64 55 3 65 47 8h 1 9 18 1 7 7
24h 3 7 12 4 11 21 0h 4 49 56 1 38 16 8h 1 11 11 5 18 24
24h 3 14 21 2 12 13
150g
0h 8 93 96 3 59 30 8h 2 13 20 3 16 8
24h 3 18 37 2 15 30 0h 7 34 16 1 26 10 8h 1 8 11 1 11 18
24h 1 16 28 3 14 45
Ibidi
0h 22 58 40 27 75 82 8h 36 49 40 29 56 71
24h 15 20 26 16 15 17 0h 18 43 32 19 32 46 8h 12 33 32 14 41 63
24h 23 16 26 14 22 15
Magnet
0h 3 30 11 5 74 37 8h 4 23 15 4 51 49
24h 5 38 45 11 40 149 0h 9 71 44 6 73 42 8h 7 35 32 7 42 29
24h 7 22 14 8 17 26
50
Tab. 6. Ergebnisse Tenozyten D4 Obere Zellrasengrenze Untere Zellrasengrenze Op T Z ROI (A) ROI (B) ROI (C) ROI (A) ROI (B) ROI (C)
Op1
50g
0h 2 16 20 6 24 28 8h N/A
24h 5 64 41 13 54 53 0h 5 44 28 2 52 56 8h 16 83 62 2 123 57
24h 1 23 27 4 35 54
150g
0h 6 44 31 5 35 11 8h 6 13 23 3 13 6
24h N/A 0h 4 40 39 3 62 32 8h 8 41 35 3 9 8
24h 4 48 114 6 13 29
Ibidi
0h 2 18 21 3 32 33 8h 10 35 48 12 34 49
24h 5 23 24 23 26 30 0h 9 27 34 43 46 40 8h 13 41 53 27 20 38
24h 10 28 42 12 18 34
Magnet
0h 4 50 14 6 39 15 8h 5 23 9 4 19 4
24h 11 27 12 6 84 104 0h 9 132 52 5 30 N/A 8h 3 20 10 5 12 18
24h 29 251 194 29 152 120
Op2
50g
0h 5 57 23 4 85 70 8h 1 11 4 1 8 6
24h 4 16 8 3 10 8 0h 5 17 11 5 45 41 8h 5 47 51 3 20 8
24h 2 4 10 4 7 6
150g
0h 3 7 6 2 3 1 8h 1 12 7 2 7 3
24h 3 10 7 2 9 4 0h 3 7 7 2 36 24 8h 2 13 2 2 9 3
24h 1 4 9 1 10 7
Ibidi
0h 15 35 75 13 43 33 8h 14 21 31 14 30 29
24h 27 32 41 27 24 22 0h 9 52 67 8 16 28 8h N/A
N/A 24h
Magnet
0h 6 33 6 5 30 6 8h 4 25 11 4 29 15
24h 7 28 9 10 30 23 0h 8 19 7 4 14 12 8h 3 21 10 5 102 32
24h 21 61 43 49 118 81
51
Tab. 7. Ergebnisse Tenozyten D5 Obere Zellrasengrenze Untere Zellrasengrenze Op T Z ROI (A) ROI (B) ROI (C) ROI (A) ROI (B) ROI (C)
Op1
50g
0h 10 38 15 5 19 4 8h 3 7 7 2 9 6
24h 5 36 31 4 44 15 0h 8 23 17 3 34 5 8h 2 19 7 2 9 4
24h 0 7 12 2 24 31
150g
0h 3 39 13 2 38 2 8h 7 8 7 2 2 5
24h 3 24 18 3 23 38 0h 1 17 3 1 20 5 8h 2 17 2 3 10 3
24h 4 21 10 3 18 8
Ibidi
0h 8 24 39 8 22 26 8h 4 7 6 3 5 9
24h 3 24 40 10 13 17 0h 5 14 21 7 48 62 8h 7 22 11 14 8 17
24h 9 20 30 6 11 23
Magnet
0h 1 38 6 4 47 3 8h 7 41 7 3 11 5
24h 4 31 14 4 82 71 0h 3 13 4 4 30 5 8h 1 11 5 1 39 11
24h 3 12 88 56 70 38
Op2
50g
0h 3 31 12 1 30 5 8h 3 11 9 2 13 12
24h 3 34 31 3 51 28 0h 5 33 13 2 23 2 8h 1 6 4 2 9 2
24h 7 38 43 2 17 32
150g
0h 5 53 25 3 42 10 8h 1 38 18 2 59 34
24h 2 30 29 3 46 58 0h 4 34 11 6 37 6 8h 3 57 17 3 18 4
24h 10 67 40 1 17 20
Ibidi
0h 6 12 13 5 27 37 8h 9 20 35 8 24 25
24h 5 7 7 4 17 33 0h 16 26 37 9 19 17 8h 8 8 3 12 32 50
24h 5 18 25 6 17 29
Magnet
0h 7 53 11 5 27 9 8h 3 25 12 5 117 28
24h 3 17 19 1 36 43 0h 3 13 7 4 21 13 8h 2 26 3 3 74 15
24h 3 11 10 4 21 19
52
Tab. 8. Ergebnisse Tenozyten D6
Obere Zellrasengrenze Untere Zellrasengrenze Op T Z ROI (A) ROI (B) ROI (C) ROI (A) ROI (B) ROI (C)
Op1
50g
0h 6 46 43 3 38 28 8h 3 28 36 1 23 20
24h 2 17 26 2 13 23 0h 3 24 17 3 53 37 8h 3 22 19 2 30 35
24h 2 20 21 3 10 28
150g
0h 3 59 41 3 112 49 8h 6 102 74 1 21 23
24h 4 19 18 4 13 15 0h 8 96 52 6 45 31 8h 6 82 92 6 43 48
24h 6 31 52 6 32 52
Ibidi
0h 6 30 33 3 46 99 8h 5 28 32 6 25 41
24h 5 20 24 6 12 25 0h 4 16 55 10 28 51 8h 6 26 38 4 18 22
24h 4 12 25 11 17 27
Magnet
0h 5 48 24 4 62 30 8h 3 21 3 3 59 38
24h 11 87 60 7 22 25 0h 4 21 17 5 67 16 8h 16 114 86 3 24 13
24h 3 10 18 3 20 64
Op2
50g
0h 3 18 20 4 7 9 8h 7 32 19 3 8 9
24h 4 19 17 3 15 7 0h 4 9 12 6 14 13 8h 1 18 7 3 8 5
24h 4 21 19 1 11 10
150g
0h 0 13 19 1 15 8 8h 1 11 19 4 10 3
24h 6 26 44 6 18 17 0h 3 22 7 1 12 5 8h 3 7 5 1 5 3
24h 4 18 15 3 15 13
Ibidi
0h 8 59 68 9 19 30 8h 3 14 31 5 8 27
24h 14 14 24 14 16 16 0h N/A 8h 8 18 38 4 23 32
24h 11 28 56 12 26 57
Magnet
0h 4 12 5 5 27 14 8h 1 17 10 2 3 0
24h 8 35 36 6 24 24 0h 5 23 13 8 21 9 8h 1 13 10 4 22 14
24h 0 17 33 8 20 19
53
Für die weitere statistische Bearbeitung der Daten wurden zunächst die ROIs der oberen und
unteren Zellmonolayergrenze je Aufnahme addiert (A1+A2), (B1+B2) und (C1+C2).
Anschließend wurde ein relativer Wert mit der Formel (𝑩𝟏+𝑩𝟐)−(𝑪𝟏+𝑪𝟐)(𝑨𝟏+𝑨𝟐)
ermittelt. Der durch
diese Berechnung ermittelte Wert spiegelt unter Berücksichtigung der ROI (A) das Verhältnis
von toten Zellen von ROI (B) gegenüber ROI (C) wider. Die ROI (B) stellt den Bereich
zwischen der Zellrasengrenze, also dem Übergang vom verbleibenden Zellmonolayer zum
zellfreien Bereich, und der 25 µm in Richtung des verbleibenden Zellmonolayers duplizierten
Zellrasengrenze, dar. Durch die Fragestellung dieser Arbeit, ist die ROI (B) für die
Interpretation des möglichen Einflusses der Methode auf das Aufkommen von toten Zellen
von zentraler Bedeutung, da dieser Bereich tote Zellen, die aus der direkten Herstellung des
zellfreien Areals durch die unterschiedlichen Techniken resultieren, berücksichtigt. ROI (C)
wird durch die duplizierten Zellrasengrenzen 25 µm und 50 µm in Richtung des
verbleibenden Zellmonolayers eingeschlossen und darin detektiere tote Zellen repräsentieren
das generelle Aufkommen toter Zellen innerhalb des Zellmonolayers, was nicht durch die
Herstellung des zellfreien Bereichs beeinflusst wird. Tote Zellen innerhalb der ROI (A), die
sich von der Zellrasengrenze und der 25 µm in Richtung des zellfreien Bereichs duplizierten
Zellrasengrenze erstreckt, stellen gelöste oder frei schwimmende Zellen dar, die ebenfalls bei
der ROI (B) und ROI (C) berücksichtigt werden müssen. Daraus resultiert, dass durch die
erhobenen relativen Werte, Aussagen bzgl. eines potentiellen Einflusses der durchgeführten
Methode zur Herstellung des zellfreien Bereichs auf das Aufkommen von toten Zellen
getroffen werden können.
Die Aussage, die beispielsweise aufgrund eines hohen Wertes getroffen werden kann ist, dass
die angewendete Methode zur Herstellung des zellfreien Bereichs in der ROI (B) gegenüber
der ROI (C), unter Berücksichtigung der gelösten oder frei schwimmenden Zellen (ROI (A)),
zu einem erhöhten Aufkommen von toten Zellen führt. Daraus folgend kommt es bei
Methoden mit hohen Werten zu einer stärkeren Zellschädigung durch mechanische
Zerstörung. Negative Werte wurden dabei gleich null gesetzt, da die Aussage, dass die
angewendete Methode zur Herstellung des zellfreien Areals keinen Einfluss auf das
Aufkommen von toten Zellen direkt am Wundbereich hat, gleichbleibend ist.
54
In den Tab. 9. und Tab. 10 sind die Anzahl der analysierten Bilder (N), der Median (m), die
Standardabweichung (s), die Spannweite (Min. – Max.) und die Quartile (x0,25, x0,5, x0,75)
angegeben. Tab. 9. bezieht sich dabei auf die 2D-Zellmigrationsassays der
Chondrozytenzellkulturen und Tab. 10. auf jene der Tenozytenzellkulturen, jeweils
unabhängig vom Operateur.
55
Tab. 9. Deskriptive Statistik Chondrozyten
N Median Standardabw. Spannweite Quartil
Technik Zeitpunkt gültig ungültig m s Min. Max. x0,25 x0,5 x0,75
50g
0h 12 0 219,9 134,4 20,0 385,7 92,7 236,3 354,1
8h 12 0 117,0 142,5 ,0 400,0 ,0 83,3 218,8
24h 12 0 12,5 21,2 ,0 66,7 ,0 ,0 27,1
150g
0h 12 0 245,5 190,4 ,0 650,0 78,5 218,2 397,6
8h 12 0 151,0 274,2 ,0 900,0 ,0 37,5 137,5
24h 12 0 5,2 12,1 ,0 33,3 ,0 ,0 ,0
Ibidi
0h 12 0 7,1 18,6 ,0 62,5 ,0 ,0 ,0
8h 12 0 5,6 19,2 ,0 66,7 ,0 ,0 ,0
24h 12 0 ,0 ,0 ,0 ,0 ,0 ,0 ,0
Magnet
0h 12 0 533,9 385,9 161,1 1542,9 261,2 393,3 700,0
8h 12 0 309,9 280,2 27,8 833,3 71,4 182,4 587,5
24h 11 1 79,5 126,7 ,0 300,0 ,0 ,0 233,3
56
Tab. 10. Deskriptive Statistik Tenozyten
N Median Standardabw. Spannweite Quartil
Technik Zeitpunkt gültig ungültig m s Min. Max. x0,25 x0,5 x0,75
50g
0h 12 0 300,1 322,1 ,0 1100,0 25,0 212,4 504,2
8h 11 1 213,5 189,6 ,0 483,3 60,0 120,0 425,0
24h 12 0 107,5 152,0 ,0 433,3 ,0 30,0 142,9
150g
0h 12 0 622,8 478,3 60,0 1450,0 264,1 491,4 1117,5
8h 12 0 341,7 454,8 ,0 1500,0 ,0 200,0 436,3
24h 11 1 68,1 108,3 ,0 300,0 ,0 ,0 160,0
Ibidi
0h 11 1 ,0 ,0 ,0 ,0 ,0 ,0 ,0
8h 12 0 ,8 2,7 ,0 9,5 ,0 ,0 ,0
24h 12 0 ,0 ,0 ,0 ,0 ,0 ,0 ,0
Magnet
0h 12 0 524,7 378,6 116,7 1520,0 205,6 492,9 619,4
8h 12 0 679,9 579,7 50,0 1700,0 245,6 375,0 1209,4
24h 12 0 75,9 107,0 ,0 350,0 ,0 21,4 148,0
57
Auf Grundlage der Daten aus Tab. 9. und Tab. 10. wird in Abb. 9. unabhängig vom Operateur
und der Zeitpunkte der Aufnahmen, das Aufkommen von toten Zellen für beide Zellarten
zusammen als Box-Whisker-Diagramm dargestellt.
Abb. 9. Vergleich der unterschiedlichen Methoden. Auf der Abzissenachse ist das relative
Verhältnis vom Aufkommen toter Zellen zwischen ROI (B) und ROI (C) unter
Berücksichtigung der ROI (A) abgebildet. Die Ordinatenachse beschreibt die
unterschiedlichen Methoden.
Dabei wird der Unterschied zwischen den Zellentfernungs- (50g, 150g und Magnet) und der
Zellexklusionsmethode (Ibidi) der 2D-Zellmigrationsassays deutlich. Sowohl Median, als
auch die Quartile liegen bei den drei Methoden für die Entfernung von Zellen deutlich höher
als die der Zellexklusionsmethode. Bei den für jede Methode berücksichtigten 71 Aufnahmen
ist zusätzlich ersichtlich, dass es zwischen den drei Methoden der Zellentfernungsmethoden
ebenfalls Unterschiede bei dem Verhältnis von Aufkommen von toten Zellen in der ROI (B)
gegenüber der ROI (C) gibt. Während die klassischen ‚scratch‘-Methoden (50g und 150g)
58
nahezu identische Werte für den Median und die Quartile liefern, zeigt die Methode mit
Magneten einen höheren Anteil von toten Zellen in der ROI (B) gegenüber der ROI (C),
sowohl im Median mit starker Standardabweichung, sowie Ausreißerwerten zu höheren
Werten. Die Zellexklusionsmethode zeigt deutlich, dass es im Verhältnis von ROI (B) zu ROI
(C) zu keinem erhöhten Aufkommen von toten Zellen kommt.
Auch bei Berücksichtigung des Zeitpunktes der Aufnahmen (Abb. 10.) zeigen sich die oben
genannten Phänomene.
Abb. 10. Vergleich der verschiedenen Methoden je Zeitpunkt der Aufnahme. Auf der
Abzissenachse ist das relative Verhältnis vom Aufkommen toter Zellen zwischen ROI (B)
und ROI (C) unter Berücksichtigung der ROI (A) abgebildet. Die Ordinatenachse
beschreibt die unterschiedlichen Methoden zu den drei Zeitpunkten.
Während alle drei Zellentfernungsmethoden einen erhöhten Anteil von toten Zellen, v.a. zu
den Zeitpunkten null Stunden und acht Stunden im Vergleich zu dem Zeitpunkt 24 Stunden
59
liefern, zeigt die Zellexklusionsmethode über alle drei Zeitpunkte der Aufnahmen, mit
Ausnahme von zwei Extremwerten, kein erhöhtes Aufkommen von toten Zellen.
In der Abb. 10. wird zudem die Dynamik für das Aufkommen toter Zellen in allen
Zellentfernungsmethoden zwischen den unterschiedlichen Zeitpunkten deutlich. Zum
Zeitpunkt null Stunden sind die höchsten Werte für Median und Quartil festzustellen.
Daraufhin fällt die Zahl an toten Zellen zum Zeitpunkt acht Stunden sowohl im Mittelwert,
als auch in den Perzentilen, wobei die Standardabweichung bei den Methoden 150g und
Magnet eine größere Spannweite zeigt. Zum Zeitpunkt 24 Stunden fallen die Werte weiterhin
und der Median geht bei allen drei Methoden gegen null, sprich kein erhöhtes Verhältnis toter
Zellen zwischen ROI (B) und ROI (C).
In Abb. 11. wird unabhängig vom Zeitpunkt der Aufnahmen, der gesamte Anteil von toten
Zellen, aufgeteilt auf den jeweiligen Zelltyp dargestellt.
60
Abb. 11. Vergleich der verschiedenen Methoden je Zelltyp. Auf der Abzissenachse ist das
relative Verhältnis vom Aufkommen toter Zellen zwischen ROI (B) und ROI (C) unter
Berücksichtigung der ROI (A) abgebildet. Die Ordinatenachse beschreibt die
unterschiedlichen Methoden je Zelltyp.
Auch hier wird der Unterschied zwischen Zellentfernungs- und Zellexklusionsmethoden
deutlich, mit höheren Werten für die Zellentfernungsmethoden. Zudem zeigt sich, dass diese
Ergebnisse auch unabhängig von den Zelltypen sind, die als Grundlage für die 2D-
Zellmigrationsassays gedient haben. Ein geringer Unterschied ist dennoch zwischen den
verschiedenen Zelltypen festzustellen, da 2D-Zellmigrationsassays mit Tenozyten bei allen
Zellentfernungsmethoden einen höheren Median, Quartile und eine größere Spannweite der
Werte aufweisen. Zudem kommen bei den Tenozytenzellkulturen vermehrt Ausreißerwerte
mit hohen Werten gegenüber Chondrozytenzellkulturen vor.
Abschließend ist in Abb. 12. jede Methode zu jedem Zeitpunkt, aufgeteilt auf beide Zelltypen
dargestellt. Die oben genannte Dynamik der abfallenden Werte ab dem Zeitpunkt null
61
Stunden bis 24 Stunden kann ebenfalls auf Grundlage der Abb. 12. für beide Zellarten
bestätigt werden.
Abb. 12. Vergleich der verschiedenen Techniken je Zeitpunkt und Zelltyp. Auf der
Abzissenachse ist das relative Verhältnis vom Aufkommen toter Zellen zwischen ROI (B)
und ROI (C) unter Berücksichtigung der ROI (A) abgebildet. Die Ordinatenachse beschreibt
die unterschiedlichen Methoden je Zelltyp und zu den drei Zeitpunkten.
Eine Ausnahme stellt bei den Tenozyten der Zeitpunkt acht Stunden mit der Methode
Entfernung von Zellen durch Magnete dar. Im Gegensatz zu den beiden anderen
Zellentfernungsmethoden unabhängig vom Zelltyp nimmt zwar der Median zu diesem
Zeitpunkt ebenfalls ab, doch der Interquartilbereich zwischen dem 75. und 25. Quartil zeigt
eine größere Bandbreite von Werten, als jener des Zeitpunktes null Stunden.
62
6. Diskussion
Um Bedingungen wie bei in vivo Wunden unter kontrollierten, labortechnischen
Rahmenbedingungen nachzustellen, wurden verschiedene 2D-Zellmigrationsassays
entwickelt (Ashby und Zijlstra 2012, Kramer et al. 2013). Die räumliche und zeitliche
Synchronisation der Migration von verschiedenen Zelltypen stellt einen essentiellen
Bestandteil der Wundheilung dar (Rodrigues et al. 2019). Neben der Beobachtung und
Analyse der Zellmigration können bei in vitro 2D-Zellmigrationsassays verschiedene
Parameter, die die Migration von Zellen beeinflussen können, kontrolliert beeinflusst bzw.
getestet werden, was zu einer potentiellen Änderung des Migrationsverhaltens führen kann
(Ashby und Zijlstra 2012, Decaestecker et al. 2007, Friedl und Wolf 2010).
Die möglichen Einflussfaktoren auf die Migration von Zellen innerhalb der 2D-
Zellmigrationsassays wurden in vier Kategorien eingeteilt (Ashby und Zijlstra 2012). Dabei
werden sowohl extrazelluläre Faktoren der umliegenden/ zugrundeliegenden Matrix und
löslicher Faktoren, als auch intra- und interzellulärer Faktoren voneinander getrennt
berücksichtigt (Friedl 2004). Die Apoptose, d.h. der programmierte Zelltod von Zellgruppen
während der Wundheilung stellt dabei einen wichtigen Faktor dar (Greenhalgh 1998). Zudem
ist die Verletzung und Zerstörung von Zellen und somit Freisetzung von deren gespeicherten
Mediatoren ein weiterer wichtiger Einflussfaktor (Nikolić et al. 2006, Vogt).
2D-Zellmigrationsassays werden in zwei Kategorien eingeteilt: Zellentfernungs- und
Zellexklusionsmethoden. Neben der unterschiedlichen Technik zur Herstellung des zellfreien
Bereichs, unterscheiden sich die beiden Methoden in der Verletzung oder Zerstörung von
Zellen und der unterliegenden Matrix. Dabei ist dieser Einflussfaktor in manchen
Applikationen, z.B. der Betrachtung der unbeeinflussten Zellmigration, nachteilig, stellt aber
einen in vitro Ansatz für die realen Bedingungen innerhalb einer in vivo Wunde dar.
In der vorliegenden Arbeit wurde eine Methode entwickelt und vorgestellt um, unter
Verwendung des open-source Bildbearbeitungsprogramms Fiji, Aufnahmen verschiedener
2D-Zellmigrationsassays auf das Aufkommen und die Verteilung von toten Zellen zu
analysieren. Zudem wurden für die Validierung dieser Methode mikroskopische Aufnahmen
von Techniken beider Kategorien der 2D-Zellmigrationsassays bearbeitet, analysiert und
63
ausgewertet. Auf Grundlage der erhobenen Daten / Ergebnisse konnte die Anwendbarkeit der
entwickelten Analysemethode zu unterschiedlichen Zeitpunkten und mittels zweier Zelltypen
bewertet werden.
Die Methode basiert auf zwei Schritten unter Verwendung des ‚green channels‘ zur
Bestimmung der Zellrasengrenzen und Begrenzung der ROIs, und des ‚red channels‘ zur
Detektion von toten Zellen. Zunächst wurde der ‚green channel‘ in eine Version, bestehend
aus Graustufen, konvertiert. Durch den Prozess des Thresholding wurden anschließend Pixel
abhängig von ihrer Graustufe entweder als weiße oder schwarze Pixel dargestellt, was zu
einer Grenze zwischen weißen und schwarzen Pixeln führte. Diese Grenze wurde
anschließend durch das ‚wand tracing tool‘ detektiert, in den ROI Manager gespeichert und
dupliziert. Die duplizierten Zellrasengrenzen wurden daraufhin in festgelegten Abständen,
einerseits in Richtung des zellfreien Bereichs und andererseits in Richtung des verbleibenden
Zellmonolayers, verschoben. Daraus resultierten pro Zellrasengrenze drei eingegrenzte
Bereiche, die als ROI (A), ROI (B) und ROI (C) bezeichnet wurden. Anschließend wurden
die ROIs auf den ‚red channel‘ übertragen. Durch Änderung der Werte für Kontrast und
Helligkeit wurden die mit PI angefärbten Zellkerne sichtbarer gemacht. Abschließend wurden
die rot gefärbten Zellkerne automatisch detektiert und innerhalb der drei ROIs ausgezählt.
Nahezu alle Aufnahmen, die zur Verfügung standen, konnten mit der vorgestellten Methode
analysiert und ausgewertet werden. Limitierungen dieser Methode sind die teilweise nicht
ausreichend großen, verbleibenden Zellmonolayer jenseits der Zellrasengrenze, sodass die
beschriebenen ROIs nicht eingefasst werden konnten. Im Besonderen konnte die ROI (C) bei
einigen mikroskopischen Aufnahmen nicht vollständig eingefasst und die darin markierten
toten Zellen detektiert werden. Da die ROI (C) zwischen den 25 µm und 50 µm in Richtung
des verbleibenden Zellmonolayers duplizierten Zellrasengrenzen eingeschlossen wird, waren
Bilder mit einem verbleibenden Zellmonolayer unter 50 µm z. T. nicht analysierbar. Daneben
musste bei manche Aufnahmen der Tresholding-Wert, durch den die Grenze zwischen Zellen
und zellfreien Bereichen bestimmt werden kann, manuell eingestellt werden, da
unterschiedliche Helligkeitswerte innerhalb der Aufnahmen kein einheitliches Tresholding
ermöglichten. Des Weiteren war die Färbung der toten Zellen durch PI in manchen
Aufnahmen mit den beschriebenen Werten nicht eindeutig zu detektieren, was in Einzelfällen
64
zur Änderung der Einstellungsparameter führte. Die unregelmäßige bzw. diskontinuierliche
Kontur der Zellrasengrenzen durch z.B. gelöste Zellverbände und einzelnen Zellen, die
minimal mit dem verbleibenden Zellmonolayer verbunden waren, führten in wenigen
Aufnahmen zu verfälschten Zellrasengrenzen. Die endgültige Auszählung der detektierten
toten Zellen erfolgte schließlich manuell, was einen hohen Zeitaufwand zur Folge hatte.
In der Abb. 13. werden die häufigsten Probleme bei Anwendung der vorgestellten Methode
graphisch dargestellt.
65
Abb. 13. Limitierungen der entwickelten Methode. (1) und (2) sind Bildausschnitte
desselben ‚scratch assays‘. Während der Prozess des Thresholding bei (1) für die Detektion
des rechten Bildausschnitts ausreicht, kann keine zusammenhängende Zellrasengrenze im
linken Bildauschnitt detektiert werden. (2) Nach Thresholding zur Detektion der
Zellrasengrenze des linken Bildausschnitts, entspricht die detektierte Zellrasengrenze des
rechten Bildausschnitts nicht der originalen Zellrasengrenze. (3) Darstellung einer gelösten
Zellgruppe von der Zellrasengrenze. (4) Duplikation der Zellrasengrenze zur Begrenzung
der ROIs nicht komplett möglich, da der aufgenommene, verbleibende Zellmonolayer eine
zu geringe Tiefe aufweist. (5) und (6) stellen die Detektion der mit PI gefärbten toten
Zellen dar. Dabei ist der Grenzwert für die Detektion variabel zwischen verschiedenen
Aufnahmen variabel, was zu Ungenauigkeiten führt.
(1) (2)
(3) (4)
(5) (6)
66
Unabhängig von den genannten Limitierungen konnte dennoch nahezu jede zur Verfügung
stehende Aufnahme bearbeitet, analysiert und ausgewertet werden. Auf Grundlage der
beschriebenen Methode könnten zukünftige Arbeiten auf die Erstellung eines Makros bzw.
PlugIn für das Bildbearbeitungsprogramms Fiji abzielen, wo der Arbeitsablauf der Methode
automatisch auf die Analyse von mikroskopischen Aufnahmen angewendet wird. Die
vorgestellte Methode stellt somit eine Möglichkeit dar, tote Zellen innerhalb verschiedener
2D Zellmigrationsassays und unabhängig vom verwendeten Zelltyp für die Zellmonolayer,
unter Verwendung eines kostenfreien Bildbearbeitungsprammes, präzise zu erheben.
In der aktuellen Literatur findet sich derzeit keine vergleichbare Methode zur Detektion von
toten Zellen in 2D Zellmigrationsassays. Dabei ist die beschriebene Methode auf andere
Bildbearbeitungsprogramme übertragbar. Für die Analyse von 2D Zellmigrationsassays
wurden zahlreiche Bildbearbeitungsprogramme eingesetzt, wobei sich in der aktuellen
Literatur das Einsatzgebiet dieser auf die Detektion der ‚Wundränder‘ zur anschließenden
Bestimmung der Migrationsrate beschränkt (Jonkman et al. 2014, Nyegaard et al. 2016). Eine
vergleichbare Methode mit Speicherung der Zellrasengrenze, der Verschiebung dieser in
definierten Abständen mit Übertragung auf einen anderen Farbkanal bei RGB-Bildern und
anschließender Detektion von toten Zellen konnte bei der Literaturrecherche nicht ermittelt
werden.
Zusätzlich konnten durch die erhobenen Daten/Ergebnisse Aussagen hinsichtlich potentiellen
Anwendungsgebiete der Methoden der 2D-Zellmigrationsassay getätigt werden. Anhand der
erhobenen Ergebnisse konnten deutliche Unterschiede bzgl. Aufkommen und Verteilung toter
Zellen zwischen den Techniken der zwei Kategorien der 2D-Zellmigrationsassays aufgezeigt
werden.
Die mechanischen Zellentfernungsmethoden verletzen vor allem direkt nach Herstellung des
zellfreien Areals sowohl absolut, als auch relativ mehr Zellen im Bereich der wundnahen ROI
B gegenüber des tieferliegenden, wundfernen, verbleibenden Zellmonolayers (ROI C). Aus
diesem Grund kann die Aussage getroffen werden, dass die mechanische Entfernung der
Zellen die Zellen im wundnahen Bereich direkt in Form von Zellschädigung affektiert. Zudem
konnte gezeigt werden, dass bei der intitiale Zellschädigung zum Zeitpunkt null Stunden der
67
größte Anteil toter Zellen im wundnahen Bereich auftritt. Zu späteren Zeitpunkten (acht und
24 Stunden) nimmt das relative Verhältnis von toten Zellen am Zellrasenrand gegenüber dem
tieferliegenden, verbleibenden Zellrasen ab und gleicht sich zum Zeitpunkt 24 Stunden
nahezu vollständig aus.
Auch zwischen den Techniken der Zellentfernungsmethoden sind ebenfalls geringgradige
Unterschiede festzustellen. Die neue Methode unter Verwendung eines ‚scratching device‘
mit Magneten zur Zellentfernung, welcher durch Forscher des VETERMs entwickelt und
validiert wurde, produzierte einen höheren absoluten Anteil an toten Zellen, v.a. unmittelbar
an der Zellrasengrenze. Zudem zeigte das relative Verhältnis toter Zellen am wundnahen
Bereich (ROI B) gegenüber dem restlichen Zellrasen (ROI C), dass durch die Methode
deutlich mehr Zellen direkt an der Zellrasengrenze verletzt/ zerstört wurden, als die anderen
beiden Zellentfernungsmethoden unter Verwendung einer Pipettenspitze mit
unterschiedlichen Drücken. Zwischen den beiden Techniken unter Verwendung einer
Pipettenspitze mit 50 g und 150 g Druck zeigen die Ergebnisse nahezu keine Unterschiede
beim Aufkommen und Verteilung toter Zellen, sodass ein Einfluss des Drucks auf die
Produktion von toten Zellen eine untergeordnete Rolle zu spielen scheint, bzw. nicht
nachgewiesen werden kann.
Die Ergebnisse der Zellexklusionsmethode unter Verwendung von Zellkultureinsätzen der Fa.
Ibidi zeigen zu jedem Zeitpunkt und unabhängig von der für die Zellmonolayer verwendeten
Zelltypen kein erhöhtes Aufkommen toter Zellen im wundnahen Bereich gegenüber den
restlichen, verbleibenden Zellmonolayern. Daraus lässt sich ableiten, dass die Zellschädigung
bzw. induzierte Apoptose am Rand des zellfreien Bereichs bei dieser Methode keinen
Einflussfaktor auf die Migration in das freie Areal darstellt.
Zusammenfassend simulieren somit die Zellentfernungsmethoden in vitro deutlicher den
Einflussfaktor der Zellschädigung auf die Zellmigration, wohingegen dieser Parameter bei
den reinen Migrationsassays der Zellexklusionsassays keine Rolle spielt (Ashby und Zijlstra
2012).
Welche besondere Bedeutung die Zellschädigung in Folge einer Verletzung in Bezug auf die
Migration von Zellen hat, wurde in der Studie von Nikolic et. al (2006) aufgezeigt.
68
In dieser Studie wurden bei Madin-Darby canine kidney epithelial monolayers (MDCK)
mittels dreier verschiedener Methoden der 2D-Zellmigrationsassays zellfreie Bereiche
geschaffen, um die Migration der angrenzenden Zellen zu studieren. Dabei wurden Methoden
beider Kategorien verwendet. (1) Der klassische ‚wound-healing assay‘ durch Verletzen des
Zellmonolayers mit Hilfe einer Pipettenspitze (‚scratch assay‘) und (2) ein ‚membrane peel-
of‘, wo die Membran aus Polydimethylsiloxane (PDMS) bestand und nach Adhäsion der
ausgesäten Zellen entnommen wurde und daraus eine Verletzung des Monolayers resultierte.
Bei der ‚membrane peel-of‘ Methode adhärieren die ausgesäten Zellen über die Ränder der
eingelegten Membran, sodass bei Entfernung dieser die Zellschädigung der an den Rändern
adhärierten Zellen hervorgerufen wird. Beide Methoden repräsentieren somit
Zellentfernungsmethoden mit Zellschädigung und Freisetzung des zellulären Inhaltes.
Zusätzlich wird bei (1) die unterliegende Matrix beschädigt, was einen weiteren
Einflussfaktor auf die Zellmigration darstellt. Im Gegensatz dazu, wurde bei der dritten
Methode eine Zellexklusionsmethode angewendet in Form von (3) „BSA-blocked PDMS
slabs“, wo nach Entfernung dieser ein zellfreier Bereich ohne Zellschädigung und Schädigung
der unterliegenden Matrix entstand. Im weiterem Verlauf dieser Studie wurde die Dynamik
der ERK1/2 MAPK (Isoformen 1 und 2 der extracellular-signal regulated kinases/ mitogen-
activated protein kinases) und der ROS (reactive oxygen species) analysiert. Ergebnis dieser
Arbeit war, dass nur bei Zellschädigung bei den Methoden (1) und (2) erhöhte
Konzentrationen von ROS im Bereich der freien Zellgrenzen festzustellen waren, was zu
einer ersten Welle von MAPK-Aktivität führte und somit großen Einfluss auf die weitere
Migration der Zellen in den zellfreien Bereich hatte. Demgegenüber wurde bei der
Zellexklusionsmethode nur die schwächere, zweite MAPK-Aktivität festgestellt, die später
einsetzt und geringeren Einfluss auf die Zellmigration aufweist (Nikolić et al. 2006).
Aus diesem Grund bestätigen die erhobenen Rückschlüsse auch die Nomenklatur in der
Literatur, wo die Begriffe des ‚scratch assays‘ und ‚wound healing assays‘ nur bei Techniken
der Zellentfernungsmethoden als Synonym verwendet werden (Ashby und Zijlstra 2012,
Riahi et al. 2012). Dementsprechend stellen diese Methoden die in vivo Wundbedingungen in
Hinblick auf Zellschädigung und Apoptose eher dar, als Zellexklusionsmethoden. Somit ist
69
die Aussage legitimiert, dass ‚wound healing‘ oder ‚scratch assays‘ die Untersuchung von
Zellmigration mit dem Hintergrund der Simulation von in vivo Wundbedingungen besser
abbilden (Ashby und Zijlstra 2012, Goetsch und Niesler 2011, Kramer et al. 2013). Für die
praktische Anwendung lässt sich ableiten, dass sich für die Migration von Zellen in Bezug auf
Rahmenbedingungen während der Wundheilung die Zellentfernungsmethoden eher anbieten,
als die Zellexklusionsmethoden (Goetsch und Niesler 2011).
70
7. Zusammenfassung
Die Migration von einzelnen Zellen, als auch von multizellulären Einheiten stellt innerhalb
vieler physiologischer, als auch pathologischer Prozesse einen elementaren Bestandteil dar.
Zur Untersuchung der Zellmigration in vitro unter kontrollierten, labortechnischen und
manipulierbaren Bedingungen wurden zahlreiche Zellmigrationsassays entwickelt und
publiziert. Zellmigrationsassays, die sich speziell für die Imitation von in vivo
Wundbedingungen eigen, werden als ‚wound healing assays‘ oder ‚scratch assays bezeichnet.
Dabei wird Bezug auf den Umstand genommen, dass bei dieser Art der Zellmigrationsassays
der zelluläre Efflux von Zellinhaltsstoffen und Apoptose, aufgrund von Zellverletzung und
-zerstörung, Einflussfaktoren auf die anschließende Zellmigration darstellt. Der Grad der
Zellschädigung ist dabei zwischen den verschiedenen Methoden der ‚wound healing assays‘
variabel.
Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Validierung einer Methode zur Bestimmung und
Analyse von toten Zellen in unterschiedlichen 2D-Migrationsassays unter Verwendung des
open-source Bildbearbeitungsprogramms Fiji / ImageJ. Dabei wurden hochauflösende,
mikroskopische Aufnahmen von 2D-Zellmigrationsassays auf Basis von Chondrozyten- und
Tenozytenzellkulturen verwendet. Neben dem derzeitigem ‚gold standard‘ des ‚scratch
assays‘ unter Verwendung einer Pipettenspitze mit zwei unterschiedlichen applizierten
Drücken und einer an dem VETERM entwickelten neuen Methode mit dem Einsatz von
Magneten, wurden Zellkultureinsätze der Fa. Ibidi für die Herstellung der 2D-
Zellmigrationsassays verwendet.
Die aus der entwickelten Methode gewonnenen Ergebnisse zeigen deutlich, dass die
angewendete Technik der 2D-Migrationsassays direkten Einfluss auf das Aufkommen und auf
die Verteilung von toten Zellen hat. Aufgrund der erhobenen Daten, konnte zudem die
Unterteilung der 2D-Zellmigrationsassays in Zellentfernungs-, die einen hohen Grad an toten
Zellen aufgrund der angewendeten Technik aufweisen, und Zellexklusionsmethoden, die
keinen Einfluss auf das Aufkommen von Zellen zeigen, unterstrichen werden. Auch innerhalb
der Zellentfernungsmethoden konnten geringgradige Unterschiede bzgl. des Aufkommens
von toten Zellen aufgezeigt werden.
71
Zunächst wurde in dieser Arbeit die Methode zur Detektion von toten Zellen unter
Verwendung des Bildbearbeitungsprogramms Fiji / ImageJ vorgestellt und validiert. Des
Weiteren konnte durch Anwendung dieser Methode der Einfluss der Technik zur Herstellung
der 2D-Zellmigrationsassays auf das Aufkommen von toten Zellen festgestellt werden.
72
8. Summary
The migration of single cells or multicellular units is crucial in various physiological as well
as pathological processes and constitutes a limiting factor for those processes.
During all phases of wound healing the temporal and spatial synchronization of cellular
migration including a variety of cell types with distinct roles is essential for the
accomplishment of wound repair.
Several cellular and environmental parameters can influence the behavior of migrating cells in
vivo as well as in vitro. One of those parameters is the influence of cell injury and the release
of their cellular content, including various mediators. For the investigation of cell migration in
vitro under controlled, laboratory conditions various different 2D cell migration assays were
developed and published.
In this study, a method was introduced and evaluated using microscopic images and the open
source image processing program Fiji/ImageJ to analyze the amount and potential
increase/decrease of dead cells over time in different 2D cell migration assays.
This new approach was applied to compare two different well established 2D cell migration
assays with a newly developed and evaluated cell removal method. Microscopic images of the
current gold standard scratch assay method, creating the cell free area with a pipette tip, were
compared with the new cell removal method, and a cell exclusion method using commercially
available cell culture inlets.
The data obtained suggest that cell removal methods produce more dead cells than the cell
exclusion method directly after creating the ‘wounds’ as well as after several hours.
Besides a few limitations, which were rather based on the size of the displayed image sections
than on the methods itself, the introduced method to analyze different 2D cell migration
assays in terms of dead cells, proved satisfactory. For future research a plugin or macro for
Fiji/ImageJ could be written, to let the shown steps of graphic data processing run
automatically and with a higher throughput.
73
9. Tabellen und Abbildungen
Tabellen
1. Werte zur Verschiebung der duplizierten Grenzen.
2. Anzahl von Bildern und ROIs zur Analyse
3. Ergebnisse Chondrozyten D1
4. Ergebnisse Chondrozyten D2
5. Ergebnisse Chondrozyten D3
6. Ergebnisse Tenozyten D4
7. Ergebnisse Tenozyten D5
8. Ergebnisse Tenozyten D6
9. Deskriptive Statistik Chondrozyten
10. Deskriptive Statistik Tenozyten
Abbildungen
1. 25 Zellkultureinsätze mit 2 Kammern und einem definiertem zellfreien Bereich von 500
µm +/- 100 µm, https://ibidi.com/removable-chambers/25-25-culture-inserts-2-well-for-
self-insertion.html [Zugriff: 24.06.2019]
2. Aussaat von 70 µl Zellsuspension je Kammer mit 15.000 bis 20.000 Zellen,
https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN36_WoundHealingAssay_24Well.pdf [Zugriff:
24.06.2019]
3. Schematische Darstellung der entwickelten Methode unter Verwendung von Magneten
4. Entnahme der Silikoneinsätze mittels steriler Pinzette,
https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN36_WoundHealingAssay_24Well.pdf [Zugriff:
24.06.2019]
5. Invitrogen™ EVOS™ FL automatisches digitales inverses Fluoreszenzsystem,
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AMAFD1000?SID=srch-srp-
AMAFD1000 [Zugriff: 24.06.2019]
6. Invitrogen™ 4X Objective, Fluorite, LWD, Phase-contrast, 0.13NA/10.58WD,
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AMEP4680 [Zugriff: 24.06.2019])
74
7. Festlegung der ROIs.
8. Workflow – Analyse der 2D-Zellmigrationsassays
9. Vergleich der unterschiedlichen Methoden
10. Vergleich der verschiedenen Methoden je Zeitpunkt der Aufnahme.
11. Vergleich der verschiedenen Methoden je Zelltyp.
12. Vergleich der verschiedenen Techniken je Zeitpunkt und Zelltyp.
13. Limitierungen der entwickelten Methode.
75
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