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Aus dem Institut für Neuroendokrinologie der Universität zu Lübeck Direktor: Prof. Dr. J. Born
Die regulatorische Rolle von Cortisol und Wachstumshormon auf die Zytokinproduktion humaner T-Lymphozyten und die Th1/Th2-Balance
Inauguraldissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Medizin
(Dr. med.)
der Medizinischen Fakultät
der Universität zu Lübeck
Vorgelegt von: Melanie Wolf
aus Neubrandenburg
Lübeck, 2012
2
1. Berichterstatter: Professor Dr. med. J. Born
2. Berichterstatter: Priv. - Doz. Dr. med. Kai Mortensen
Tag der mündlichen Prüfung: 01.11.2012
Zum Druck genehmigt. Lübeck, den 01.11.2012 -Promotionskommission der Sektion Medizin-
3
Diese Arbeit widme ich meiner Familie
Inhaltsverzeichnis
4
Inhaltsverzeichnis Seite
Abkürzungsverzeichnis 6
1 Einleitung 8
1.1 Das Immunsystem 8
1.1.1 Zellen des Immunsystems 8
1.1.2 Th1/Th2-Immunbalance 12
1.2 Endokrinum und das Immunsystem 14
1.2.1 Das Glukokortikoid Cortisol 16
1.2.2 Einfluss von Cortisol auf das Immunsystem und die Th1/Th2-Balance 17
1.2.3 Das humane Wachstumshormon GH 18
1.2.4 Einfluss von GH auf das Immunsystem und die Th1/Th2-Balance 19
1.3 Schlaf, Endokrinum und das Immunsystem 19
1.4 Fragestellung und Ziel der Arbeit 24
2 Material und Methoden 25
2.1 Probanden 25
2.2 Reagenzien 25
2.3 Versuchsablauf 26
2.3.1 Zellstimulation und Aktivierung 26
2.3.2 Durchflusszytometrische Analyse 27
2.3.3 Hormonbestimmung 28
2.3.4 Statistische Auswertung der Ergebnisse 29
3 Ergebnisse 30
3.1 Plasma - Hormon - Konzentration innerhalb der Kontrollgruppe 30
Inhaltsverzeichnis
5
3.2 Auswirkungen auf IFN-γ-produzierende CD4-positive T-Helferzellen 31
3.3 Auswirkungen auf IL-4-produzierende CD4-positive T-Helferzellen 33
3.4 Auswirkungen auf das IFN-γ-/ IL-4-Gleichgewicht (Th1/Th2-Balance) 35
4 Diskussion 37
5 Zusammenfassung 54
6 Literaturverzeichnis 56
7 Anhang 82
8 Danksagung 84
9 Lebenslauf 85
10 Veröffentlichung der Arbeitsergebnisse 86
Abkürzungsverzeichnis
6
Abkürzungsverzeichnis
ACTH: Adrenocorticotropes Hormon (Adrenocorticotropin)
APC: Allophycocyanin
APZ: Antigenpräsentierende Zellen
BFA: Brefeldin A
CD: Cluster of Differentiation
CRH: Corticoliberin (corticotropin-releasing hormone)
CTL: Cytotoxische T-Lymphozyten (cytotoxic T-cells)
DC: Dendritische Zellen (dendritic cells)
DEX: Dexamethason
DFG: Deutsche Forschungsgemeinschaft
DMSO: Dimethylsulfoxid
FACS: Durchflusszytometer (Fluorescence Activated Cell Sorter)
FITC: Fluorescein-Iso-Thio-Cyanat (Fluorochrom)
FSC: Vorwärtsstreuung (Frontscatter)
GK: Glukokortikoid
hGh: Wachstumshormon, somatotrophes Hormon (human growth hormone)
HHN – Achse: Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-Achse
HVL: Hypophysenvorderlappen
IFN: Interferon
Ig: Immunglobulin
IGF: Insulinähnlicher Wachstumsfaktor (Insuline-like growth factor)
IL: Interleukin
MHC: Haupthistokompatibilitätskomplex (Major Histocompatibility Complex)
MK: Mineralokortikoid
NK-Zellen: Natürliche Killerzellen
NNR: Nebennierenrinde
nTreg: natürliche regulatorische T-Zellen (natural regulatory T cells)
Abkürzungsverzeichnis
7
SEM: Standard Error of the Mean
SSC: Seitwärtsstreuung (Sidescatter)
SWS: langsamwellige Schlafphase (Slow Wave Sleep)
PE: Phycoerythrin
PerCP: Peridin Chlorophyll Protein
PBMC: mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (peripher blood mononuclear
cells)
PBS: Phosphatgepufferte Salzlösung (phosphate buffered saline)
PMA: Phorbol 12-myristate 13-acetate
R-A-A-S: Renin-Aldosteron-Angiotensin-System
REM: Rapid eye movement
Rpm: Umdrehungen pro Minute (revolutions per minute)
Th-Zellen: T-Helferzellen
TCR: T-Zell Rezeptor (t-cell receptor)
TSH: Thyreotropin, thyreotropes Hormon (thyroid stimulating hormone)
Einleitung
8
1. Einleitung
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem Einfluss des Wachstumshormons
(GH) und des Cortisols auf das Immunsystem. Insbesondere wird dabei das
Verhältnis der Th1- und Th2-Zytokine unter in vitro Bedingungen untersucht. Es
galt die Hypothese zu überprüfen, ob niedrige Cortisol- und / oder hohe GH-
Konzentrationen zu einer Dominanz des Th1-Zytokinprofils führen. Um einen
Überblick über die klinische Relevanz des Versuchsvorhabens zu geben, wird im
Folgenden auf das Immunsystem und dessen Bestandteile eingegangen.
1.1 Das Immunsystem
Der Mensch benötigt ein gut funktionierendes Immunsystem, um in einer Umwelt
verschiedenster gesundheitlicher Herausforderungen überleben zu können. In den
Organismus eingedrungene körperfremde Strukturen müssen aufgesucht und
bekämpft werden. Ebenfalls müssen fehlerhaft veränderte, mutierte (z. B. maligne
entartete) körpereigene Zellen gefunden und, bevor Schäden im Organismus
auftreten, eliminiert werden. Man unterscheidet eine unspezifische, bereits bei
wirbellosen Lebewesen vorhandene, angeborene Immunabwehr von einer
adaptiven Immunabwehr. Letztere bietet einen spezifischen Schutz gegen Erreger
und ist in der Lage, ein immunologisches Gedächtnis gegen wiederkehrende
Pathogene auszubilden. Auf dieses immunologische Gedächtnis stützt sich das
Prinzip der Impfung (Janeway et al., 2009; Müller et al., 2008).
1.1.1 Zellen des Immunsystems
Die „erste“ Linie der Verteidigung gegen Pathogene wird durch das angeborene
Immunsystem realisiert. Hierfür stehen Makrophagen, natürliche Killerzellen (NK-
Zellen), dendritische Zellen (DC), neutrophile, basophile und eosinophile
Granulozyten zur Verfügung (Figdor et al., 2002; Houssaint und Sai 1988; Svedmyr und Jondal 1975). Durch Makrophagen werden Pathogene anhand der
auf ihrer Oberfläche befindlichen Proteine erkannt, durch Phagozytose zersetzt
Einleitung
9
und die so entstandenen Antigene auf der Oberfläche der Makrophagen
präsentiert (Aderem und Underhill 1999). Diese Antigenpräsentation führt zur
Aktivierung von Zellen der erworbenen Immunabwehr. Die aktivierten
Makrophagen leiten durch Freisetzung verschiedener chemischer Botenstoffe, den
Zytokinen, lokale Entzündungsreaktionen ein (Kayser et al., 2005).
Die 1973 von Ralf Steinmann entdeckten dendritischen Zellen (DC) gehören
analog den Makrophagen zu den antigenpräsentierenden Zellen (APZ). Sie
vermitteln über aktivierte B- und T-Lymphozyten zwischen angeborener und
erworbener Immunabwehr (Banchereau et al., 2000; Steinman und Hemmi 2006; Villadangos und Schnorrer 2007). Natürliche Killerzellen (NK) sind Bestandteil der
angeborenen Immunabwehr. Sie sind in der Lage virus-infizierte und entartete
Zellen zu erkennen. NK werden über ein komplexes Rezeptorsystem aktiviert und
lösen durch Ausschüttung verschiedener Zytotoxine die Apoptose der Zielzelle
aus (Bukowski et al., 1985; Janeway et al., 2009; Kayser et al., 2005).
Ein weiterer Bestandteil der angeborenen Immunabwehr ist das
Komplementsystem, welches aus Plasmaproteinen und proteolyischen Enzymen
besteht. Durch Lyse, Opsonierung und Einleitung von lokalen
Entzündungsreaktionen können Bakterien und Viren inaktiviert und zerstört
werden (Frank und Fries 1991; Rambach et al., 2008; Ricklin et al., 2010; Tosi 2005). Diese Art der Immunantwort erfolgt zeitnah und liegt somit vor den
spezifischen Immunreaktionen (Fearon und Locksley 1996).
Sollten die Erreger diese Front des angeborenen Immunsystems überwinden oder
umgehen, ist eine spezifische, erworbene (adaptive) Immunantwort notwendig,
wobei im Verlauf antigenspezifische Effektorzellen und Gedächtniszellen
entstehen. Durch diese Eigenschaft des Immunsystems können Erreger, mit
denen sich der Körper bereits zu einem früheren Zeitpunkt auseinandergesetzt
hat, schnell erkannt und anschließend eliminiert werden. Dies steigert die
Effektivität der immunologischen Prozesse und verhindert unnötige
Begleitschäden. Das adaptive Immunsystem wird durch B- und T-Lymphozyten
repräsentiert.
Einleitung
10
Die B-Lymphozyten entwickeln sich aus den hämatopoetischen Stammzellen des
Knochenmarks (B = bone marrow). Sie differenzieren sich zu Gedächtniszellen
oder zu antikörpersezernierenden Plasmazellen. Sie sind in der Lage, mit oder
ohne Kontakt zu T-Zellen (T-Helferzellen, Th-Zellen), antigenspezifische
Antikörper (Ig, Immunglobuline) zu bilden, wodurch sie zur humoralen
Immunantwort gezählt werden (Janeway et al., 2009; Neumann 2008). Neuere
Studien zeigen jedoch auch einen negativen Effekt der B-Zellen auf das
Immunsystem. Regulatorische B-Zellen sollen im Tiermodell das Immunsystem
sogar unterdrücken und an der Entstehung einiger Krankheiten wie chronischer
Colitis, Arthritis und autoimmuner Encephalitis beteiligt sein (Bouaziz et al., 2008; Matsushita et al., 2008; Mauri und Bosma 2012; Mauri und Ehrenstein 2008; Mizoguchi und Bhan 2006; Noh und Lee 2011; Yanaba 2009; Yang et al., 2009).
T-Lymphozyten werden in der fetalen Leber und dem Knochenmark gebildet und
gelangen über das Blutsystem in den Thymus (T-Lymphozyten), wo sie
heranwachsen und ausreifen (Graf 2008). Durch Rekombination von
Gensegmenten werden spezifische Rezeptoren für bestimmte Antigene gebildet.
Je nach Differenzierungsgrad und Aktivierungszustand exprimieren die
Lymphozyten auf ihrer Oberfläche zelluläre Glykoproteine, die „clusters of
differentiation“ (CD) genannt werden (Geenen et al., 2001). So differenzieren T-
Lymphozyten zu verschiedenen Populationen wie T-Helferzellen (Th-Zellen), die
den Oberflächenmarker CD4 tragen, oder zu den CD8-positiven (CD8+)
cytotoxischen T-Lymphozyten (CTL). Nach Heranreifung werden diese Zellen in
das sekundäre lymphatische Gewebe ausgeschwemmt, wo sie auf ihre jeweiligen
Antigene treffen sollen. Diese Antigene müssen den T-Zellen durch B-
Lymphozyten, dendritische Zellen oder Makrophagen, die als
antigenpräsentierende Zellen (APZ) bezeichnet werden, präsentiert werden. In
den APZ lysierte Peptidfragmente der Antigene werden an bestimmte
Oberflächenproteine, wie z. B. dem Haupthistokompatibilitätskomplex II (MHC =
Major Histocompatibility Complex) gekoppelt, von den T-Zell Rezeptoren (TCR = t-
cell receptor) erkannt und gebunden (Fraser et al., 1998). Es werden zwei Klassen
von Proteinen des MHC unterschieden.
MHC I kommt auf der Oberfläche der meisten Zellen des Organismus vor und wird
von den CD8- Rezeptoren der CTL’s gebunden. Die an MHC I gebundenen
Antigene werden durch die CTL’s erkannt und vernichtet (Berke 1994; Kirchner et
Einleitung
11
al., 1998). Darüber hinaus werden durch Aktivierung der CTL’s verschiedene
Zytokine wie z. B. Interferone (IFN) freigesetzt, die unter anderem die
antigenpräsentierenden Eigenschaften der APZ verstärken und eine Inflammation
einleiten (Kirchner et al., 1998). Der von B-Lymphozyten und Makrophagen
exprimierte MHC II wird von CD4-positiven (CD4+) T-Lymphozyten gebunden
(Long 1992), wodurch eine Aktivierung mit anschließender Ausschüttung von
Zytokinen resultiert. Anhand der Zytokinmuster werden die T-Helferzellen in Th1
und Th2 unterteilt (Delves und Roitt 2000a; Delves und Roitt 2000b; Janeway et al., 2009).
Der Umstand, dass CD4+ T-Lymphozyten nur von MHC II präsentierte Antigene
und CD8+ T-Lymphozyten ausschließlich an MHC I gebundene Antigene
erkennen, wird als MHC-Restriktion der T-Lymphozyten bezeichnet (Stevanovic 2002; Zinkernagel und Doherty 1974a; Zinkernagel und Doherty 1974b).
Eine weitere Lymphozytensubpopulation, die erstmalig 1995 von Sakaguchi
beschrieben wurde, stellen die natürlichen regulatorischen T-Zellen (nTreg) dar
(Sakaguchi 2005). Sie machen bis zu 10% der peripheren CD4-positiven T-
Lymphozyten aus und sind in der Lage CD25 zu exprimieren (Sakaguchi 2005; Sakaguchi 2011; Stephens et al., 2001). Bei ihnen wurden ausgeprägte
immunmodulierende Eigenschaften in vitro und in vivo nachgewiesen. Sie spielen
eine wichtige Rolle für die Aufrechterhaltung der Selbsttolleranz (Murakami et al., 2002; Sakaguchi 2004; Shevach 2000) und werden mit unterschiedlichen Th1-
und Th2-bedingten Autoimmunerkrankungen in Verbindung gebracht (Bollinger et al., 2010; Corthay 2009; Tang und Bluestone 2008). Ferner sollen nTreg-Zellen in
der Entstehung von Immunantworten gegen Tumore (Onizuka et al., 1999), Infektionen (Belkaid et al., 2002) und bei Reaktionen nach allogenen
Organtransplantationen beteiligt sein (Cohen et al., 2002). Zusätzlich verhindern
sie die Reifung der DCs und unterdrücken die Funktion der natürlichen Killerzellen
(Cederbom et al., 2000; Miyara und Sakaguchi 2007). Sie inhibieren die
Proliferation, Aktivierung und Zytokinproduktion von CD4+- sowie CD8+-Zellen
(Sakaguchi 2004; Thornton und Shevach 1998) und von B-Lymphozyten (Miyara und Sakaguchi 2007).
Einleitung
12
1.1.2 Th1/Th2-Immunbalance
An der Steuerung des Immunsystems sind unter anderem Zytokine beteiligt.
Hierbei handelt es sich um Mediatoren, kurzlebige Botenstoffe, die für die
Kommunikation der Zellen untereinander unerlässlich sind. Zu ihnen gehören
Tumornekrosefaktoren (TNF), Interleukine (IL), Interferone (INF),
Wachstumsfaktoren und koloniestimulierende Faktoren (CSF). Diese werden in
unterschiedlichen Konzentrationen vorwiegend von Leukozyten exprimiert und
bewirken unterschiedliche Reaktionen des Organismus (Ibelgaufts 2012; Janeway et al., 2009). Je nach ihrer Funktion kann man sie in proinflammatorische
Zytokine, wie z. B. IL-1, IL-6, TNF-α (Cavaillon 1994; Kirchner et al., 1998) und
antiinflammatorische Zytokine, wie z. B. IL-4, IL-5, IL-10 einteilen (Fiorentino et al., 1991a; Fiorentino et al., 1991b).
Mosmann und Mitarbeiter entdeckten, dass naive T-Lymphozyten nach ihrer
Aktivierung zwei funktionell verschiedene Zytokinmuster exprimieren. Anhand der
freigesetzten Zytokine klassifiziert man die T-Helferzellen als Th1- und Th2-
Zellen. Th1 Leitzytokine sind IL-2, IL-12, IFN-γ und TNF-α. Th2-Zellen sind vor
allem durch Ausschüttung von IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 und IL-13 charakterisiert (Han et al., 2012; Kasakura 1998; Mosmann 1991; Mosmann und Coffman 1989; Ramos et al., 2011; Romagnani 1991; Szczypka et al., 2012; Takato-Kaji et al., 2005). Th1-Zytokine wirken proinflammatorisch. Sie führen zur Freisetzung von
Makrophagen, aktivieren zytotoxische T-Zellen und sind besonders wichtig bei der
Abwehr intrazellulärer Erreger (Viren, Chlamydien, Mykobakterien, Pilze). Th2-
Zytokine wirken antiinflammatorisch. Sie hemmen die Makrophagenaktivität,
aktivieren Mastzellen und eosinophile Granulozyten. Außerdem stimulieren sie
antikörperproduzierende B-Lymphozyten, was die humorale Immunantwort
unterstützt. Dieser Abwehrmechanismus reguliert unter anderem allergische
Reaktionen des Organismus sowie die Bekämpfung extrazellulärer Parasiten
(Kidd 2003; Mosmann 1991; Mosmann und Coffman 1989; Romagnani 1991).
Für einen optimalen Ablauf der Immunantwort ist die Balance der Th1- und Th2-
Zytokine von entscheidender Bedeutung (Kidd 2003). Beim gesunden Menschen
sollte sie ausgeglichen sein und sich nach Ablauf einer Immunreaktion erneut
einstellen. Überschießende Th1-Antworten können zu einer übermäßigen
Einleitung
13
Entzündungsreaktion bis hin zum septischen Schock führen. Ein Überwiegen der
Th2-Zytokine begünstigt hingegen eine Immunschwäche. Eine physiologische
Th2-Dominanz sorgt jedoch für eine erfolgreiche Schwangerschaft und lässt sich
auch in den ersten Lebensjahren eines Kindes nachweisen (Herberth et al., 2010; Kasakura 1998). Zudem wird in der Literatur eine rhythmische Schwankung der
Th1/Th2-Balance mit einem Maximum in der ersten Nachthälfte beschrieben
(Besedovsky et al., 2012; Dimitrov et al., 2004b; Lange et al., 2006a). Der
Zusammenhang zwischen einer Immundysbalance und diversen chronischen
Leiden wird durch eine Vielzahl von Studien belegt. So sind sowohl Erkrankungen
wie rheumatoide Arthritis, Diabetes mellitus Typ I, als auch Multiple Sklerose oder
Morbus Crohn mit einer Dominanz der Th1-Zytokine assoziiert. Bei Überlegenheit
der Th2-Zytokine werden vor allem allergische Reaktionen, Infektionen mit dem
humanen Immundefizienz-Virus (HIV) und das erworbene Immundefektsyndrom
(AIDS) beobachtet (Herberth et al., 2010; Janeway et al., 2009; Kayser et al., 2005; Neumann 2008; Romagnani 1991).
Zur Regelung und Aufrechterhaltung dieser Immunbalance sind die Zytokine
ausgefeilten Regelmechanismen durch das Endokrinum und durch das
Nervensystem unterworfen, wobei der Psyche und dem Schlaf ebenfalls eine
große Rolle zugeschrieben wird (Ader et al., 1995; Besedovsky et al., 2012;
Dhabhar 2009; Forsythe 2012; Ricklin et al., 2010; Whitesman und Booth 2004). Dabei hemmen sich die Zytokine der Th1- und Th2-Reihe gegenseitig (McEwen et al., 1997; Romagnani 1991). IFN-γ inhibiert beispielsweise selektiv die Proliferation
und Funktion von Th2-Zytokinen, hat aber keinen direkten Einfluss auf die Th1-
Zellen. Die Th2-Zytokine IL-4 und IL-10 wirken ihrerseits supprimierend auf die
Produktion der Th1-Zytokine (Gajewski und Fitch 1988; Gajewski et al., 1989).
Neuere Studien zeigen auf, dass natürliche regulatorische T-Zellen (nTreg)
ebenfalls an der Regulierung der Zytokinbalance beteiligt sind. NTreg
unterdrücken die Sekretion von IFN-γ, IL-2 und TNF-α, aber nicht die von IL-4, IL-6
und IL-10 (Bollinger et al., 2010; Stroopinsky et al., 2009). Um ihre suppressive
Wirkung entfalten zu können, sind sie wiederum wesentlich auf die Präsenz und
Unterstützung von IL-6 und IL-2 angewiesen (Doganci et al., 2005; Pandiyan et al., 2007; Pasare und Medzhitov 2003). Bollinger und Mitarbeiter demonstrierten,
Einleitung
14
dass Hormone, insbesondere Cortisol und Prolaktin in Zusammenarbeit mit nTreg
die zirkadiane Steuerung der T-Zell-Aktivität modulieren (Bollinger et al., 2010).
1.2 Endokrinum und das Immunsystem
Die Wechselwirkung zwischen dem Endokrinum und dem Immunsystem ist ein
wichtiges Forschungsgebiet der Medizin. Die genauen Zusammenhänge und
Wirkmechanismen sind bis dato nicht vollständig geklärt. Bereits in den späten
vierziger Jahren des letzten Jahrhunderts stand fest, dass einige Hormone starke
Auswirkungen auf das Immunsystem haben. So wurden z. B. dem Steroidhormon
Cortisol immunsuppressive Eigenschaften zugewiesen. Es wurde zur Behandlung
der rheumatoiden Arthritis verwandt, wofür Hench und Kollegen im Jahr 1950 den
Nobelpreis verliehen bekamen (Kendall 1950; Lloyd 2002; Schubert und Schussler 2009).
Das Endokrinum zählt neben dem Nervensystem zum wichtigsten Steuerelement
des Organismus. Als „Kommunikationsmittel“ dienen Botenstoffe, unter anderem
Hormone, die von Zellen des Endokrinums sezerniert werden und am Zielort ihre
Wirkung über bestimmte Rezeptoren entfalten. Die „oberste Kontrollinstanz“ ist der
Hypothalamus, der über komplexe Regulationsmechanismen als
Verbindungselement zwischen Endokrinum und Nervensystem fungiert. Seine
Verbindung mit dem Hypophysenvorderlappen (HVL) und der Nebennierenrinde
(NNR) nennt man Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-Achse (HHN-
Achse) (Abb. 1). Über die Ausschüttung des Corticoliberins (Corticotropin-
releasing Hormone = CRH) im Hypothalamus wird die Freisetzung vom
Adrenocorticotropin (adrenocorticotropes Hormons = ACTH) im
Hypophysenvorderlappen (HVL) gefördert. ACTH regt die Nebennierenrinde unter
anderem zur Produktion von Mineralokortikoiden (MK), Glukokortikoiden (GK) und
Sexualhormonen an. Sie regulieren über negative Feedback-Mechanismen die
Freisetzung von ACTH und CRH (Hermus et al., 1984; Suda et al., 1985; Suda et al., 1987; Suda et al., 1986) und wirken auch auf Vorgänge innerhalb des
Immunsystems (Arlt und Hewison 2004; Bornstein et al., 2004; Forsythe 2012; Janeway et al., 2009; Kelley et al., 2007; Kidd 2003).
Einleitung
15
Abbildung 1: Schematische Darstellung der HHN-Achse. Regelmechanismen zur Freisetzung von Cortisol. HT = Hypothalamus, CRH = Corticotropin Releasing Hormone, HVL = Hypophysenvorderlappen, NNR = Nebennierenrinde, IS = Immunsystem, Rote Pfeile = Inhibition, Grüne Pfeile = Induktion
Zwei weitere Hormone, die einen wichtigen Einfluss auf das Immunsystem haben
und deren Freisetzung aus dem HVL über sogenannte Releasing - Hormone des
Hypothalamus stimuliert wird, sind das Prolaktin und das humane
Wachstumshormon (GH = human growth hormone). Deren Produktion und
Freisetzung wird ebenfalls durch negative Rückkopplungsmechanismen reguliert
(Dimitrov et al., 2004a; Jara et al., 2006; Kelley 1988; Kelley et al., 2007).
Nachfolgende Abbildung schematisiert die Regulationsmechanismen der GH-
Sekretion.
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Regelmechanismen zur Freisetzung von GH. HT = Hypothalamus, GHIH = Growth Hormone Inhibiting Hormone, GHRH = Growth Hormone Releasing Hormone, GIT = Gastrointestinaltrakt, HVL = Hypophysenvorderlappen, GH = Growth Hormone, IGF = Insulin-Like Growth Factor, IS = Immunsystem, Rote Pfeile = Inhibition, Grüne Pfeile = Induktion
Im Folgenden wird auf die zwei, in dieser Studie untersuchten Hormone Cortisol
und GH eingegangen.
Einleitung
16
1.2.1 Das Glukokortikoid Cortisol
Kortikoide sind eine Gruppe von Hormonen, die in den Zellen der
Nebennierenrinde gebildet werden. Anhand ihrer Hauptwirkung werden sie in
Glukokortikoide (GK) und Mineralokortikoide (MK) eingeteilt. GK fördern die
Glukoneogenese der Leber durch Induktion verschiedener Enzyme und stellen
dadurch die Energieversorgung des Organismus in Bedarfssituationen sicher,
wohingegen MK an der Aufrechterhaltung des Salz- und Wasserhaushaltes
beteiligt sind. Über das Renin-Aldosteron-Angiotensin-System (R-A-A-S)
regulieren sie das Blutvolumen. Ihre Wirkung entfalten beide Steroide über zwei
Rezeptortypen: die Glukokortikoid- (GR) und Mineralokortikoidrezeptoren (MR) (de Kloet et al., 1993; Funder 1986; Funder 2000; Joels und de Kloet 1994). Die
wichtigsten Liganden für GR und MR sind Cortisol und Aldosteron, wobei Cortisol
seine Wirkung über beide Rezeptoren vermitteln kann. Als Antagonisten dienen
unter anderem der GR-Antagonist RU-486 und der MR-Antagonist Spironolacton
(Castinetti et al., 2012; de Kloet et al., 1999), womit in dieser Studie die
Rezeptorbindung komplett unterbunden wurde.
Das Glukokortikoid Cortisol wird in der Zona fasciculata der Nebennierenrinde
über verschiedene Zwischenschritte aus Cholesterin gebildet. Wie bereits
beschrieben, unterliegt die Cortisolsekretion der hypothalamischen und
hypophysären Regulation durch CRH und ACTH. Aber auch andere Hormone
(Fehm et al., 1984), wie z. B. GH (Castro-Magana et al., 1983) und Katecholamine
(Rivier und Vale 1983) können seine Freisetzung beeinflussen. Zudem ist Cortisol
selbst in der Lage, seine Synthese auf jeder Ebene der Bildungskaskade zu
regulieren (Abb. 1).
Die Plasmahalbwertszeit des Cortisols beträgt ca. 90 - 120 Minuten. Nach Abbau
durch die Leber werden die entstandenen Metabolite über die Niere
ausgeschieden (Köhrle und Petrides 2007a). Die Cortisolfreisetzung unterliegt
einem strengen zirkadianen Rhythmus mit einem Höchstwert in den frühen
Morgenstunden und sinkenden Werten in den späten Abendstunden,
beziehungsweise während des Schlafes (Ball et al., 2006; Dimitrov et al., 2009;
Einleitung
17
Esteban et al., 1991; Gallagher et al., 1973; Migeon et al., 1956; Nichols und Tyler 1967; Perkoff et al., 1959; Rimmele et al., 2010). Der Nadir der Cortisolfreisetzung
wird zwischen Mitternacht und zwei Uhr morgens erreicht.
Die wichtigste Funktion des Cortisols besteht in der Einleitung der
Glukoneogenese zur kurzfristigen Bereitstellung von Energie bei der Bewältigung
von Stresssituationen (Köhrle und Petrides 2007a; Munck et al., 1984). Diese
Situationen können unter anderem körperliche Anstrengung (Brandenberger und Follenius 1975; Brandenberger et al., 1982), psychischer Stress (Holl et al., 1984) oder geistige Anspannung sein (Kamezaki et al., 2012). Ein Cortisolanstieg kann
sogar nach einer Mahlzeit erfolgen (Follenius et al., 1982). Um die Wirksamkeit zu
verbessern und die Nebenwirkungen zu verringern, wurden im letzten Jahrhundert
synthetische Cortisolderivate entwickelt. Einige wichtige Vertreter sind das
kurzwirksame Prednisolon und die langwirksamen Kortikoide Bethametason und
Dexamethason (DEX) (Kaiser und Kley 2002; Mutschler et al., 2008).
1.2.2 Einfluss von Cortisol auf das Immunsystem und die Th1/Th2-Balance
Neben seiner katabolen Hauptwirkung hat Cortisol auch immunmodulierende
Eigenschaften, die bereits in den vierziger Jahren des letzten Jahrhunderts zur
Behandlung immunologischer Erkrankungen, wie z. B. der rheumatoiden Arthritis
ausgenutzt wurden (Hench et al., 1949; Kendall 1950). Die immunsuppressive
Wirkung des Cortisols wurde in den letzten Jahren gründlich untersucht
(Besedovsky et al., 2012; Pinto et al., 2006; Skjolaas et al., 2002; Yeager et al., 2008).
Cortisol hemmt unter anderem die Entwicklung von Monozyten sowie die
Proliferation und Expression von Rezeptoren auf Makrophagen. Durch GK wird die
Anzahl der zirkulierenden Lymphozyten verändert, die Lymphozytenakkumulation,
besonders im entzündeten Gewebe gehemmt und eine Lymphozyten-Apoptose
induziert (Dimitrov et al., 2009; Dobbs et al., 1996; McEwen et al., 1997). Studien
zeigen, dass durch erhöhte GK-Konzentrationen die Produktion der Th1-Zytokine
IL-2, INF-γ und TNF-α gehemmt wird. Zudem kommt es zu einem leichten
Sekretionsanstieg der Th2-Zytokine IL-10 und IL-4 (Agarwal und Marshall Jr.
Einleitung
18
2001; Gleeson und Bishop 2005; Visser et al., 1998; Yeager et al., 2008). Der
endgültige Umschwung des Zytokinmusters zugunsten von Th2 soll eher durch die
Inhibition der Th1-Zytokine, als durch Aktivierung der Th2-Zytokine zustande
kommen. Analog dazu führt eine erniedrigte GK-Konzentration, die z. B. durch
Blockade der GK-Wirkung hervorgerufen wurde, zur stärkeren Entwicklung Th1-
spezifischer Zytokine (Agarwal und Marshall Jr. 2001; Bollinger et al., 2010; Brinkmann und Kristofic 1995; Daynes und Araneo 1989; Dhabhar 2009; Franchimont et al., 2000; Franchimont et al., 1998; Pinto et al., 2006; Schreiber 2011).
1.2.3 Das humane Wachstumshormon (GH)
GH ist ein Peptidhormon und wird im Hypophysenvorderlappen gebildet. Seine
Sekretion wird unter anderem vom Hypothalamus über Growth Hormone
Releasing Hormone (GHRH) und Somatostatin gesteuert. Ein weiterer Stimulus
für seine Freisetzung ist das Hormon Ghrelin, welches größtenteils von der
Magenmukosa produziert und ins Blut sezerniert wird (Köhrle und Petrides
2007b). GH wird pulsativ abgegeben und unterliegt einem ausgeprägten
zirkadianen Rhythmus, wobei seine höchste Konzentration im Tiefschlaf
gemessen werden kann. Daneben ist die Sekretion geschlechts- und
altersabhängig (Antonijevic et al., 1999; Baeza et al., 2008; Veldhuis et al., 1997). Sie nimmt mit zunehmendem Lebensalter ab. GH löst in der Leber, aber auch in
der Muskulatur und im Fettgewebe die Freisetzung von Insulin-ähnlichen
Wachstumsfaktoren (IGF = Insuline like growth factors) aus, die zusammen mit
Somatostatin die wichtigsten Inhibitoren der GHRH- und GH-Sekretion darstellen
(Krueger und Obal 1993; Nyberg 2000) (Abb. 2). Die Hauptwirkung des GH wird
durch IGF vermittelt und besteht in der Regulierung des Wachstums. Aus einem
Hyposomatotropismus im Kindesalter kann ein Zwergwuchs resultieren. Eine
Überproduktion dagegen führt entweder zu Gigantismus oder im
Erwachsenenalter zu Akromegalie (de Boer et al., 1996; Köhrle und Petrides 2007b; Schiebler 2005).
Einleitung
19
1.2.4 Einfluss von GH auf das Immunsystem und die Th1/Th2-Balance
Wie auch Cortisol besitzt GH immunmodulatorische Eigenschaften. Ihm werden
Interaktionen mit T- und B-Zellen zugeschrieben. So soll GH immunstimulierende
Fähigkeiten wie Förderung des Thymuswachstums oder Antikörperbildung
besitzen. Ebenso sollen Makrophagen aktiviert, die Sekretion von Antikörpern
durch B-Zellen stimuliert und über direkte Wirkung auf Monozyten die Freisetzung
von proinflammatorischen Zytokinen (IL-12, IFN-γ und TNF-α) gefördert werden
(Chappel 1999; Kelley et al., 2007; Postel-Vinay et al., 1997; Tripathi und Sodhi 2009). Ferner soll GH die Aktivität der CTL und NK sowie die Expression von
Rezeptoren auf immunkompetente Zellen begünstigen (Auernhammer und Strasburger 1995; Berczi 1994; Chappel 1999; Davila et al., 1987).
Mehrere Studien belegen, dass durch GH die Anzahl der Th1-Zytokine gesteigert
und die Th2-Aktivität sogar erniedrigt wird (Barbano et al., 2001; Liu et al., 2008; Mustafa et al., 1997; Takagi et al., 1998), wodurch die Th1/Th2-Balance
zugunsten der proinflammatorischen Th1-Antwort verschoben wird. Eine neue
Studie von Borrione und Mitarbeitern beschreibt jedoch einen unerwarteten Shift
zur Th2-Dominanz nach Gabe hoher Dosen des Wachstumshormons bei
gesunden Sportlern (Borrione et al., 2012).
1.3 Schlaf, Endokrinum und das Immunsystem
Ein weiterer Schwerpunkt der heutigen immunologischen Forschung ist die
Wechselwirkung zwischen Immunsystem, Endokrinum und Schlaf. In
vorangegangenen Studien wurde der regulatorische Einfluss des Schlafes auf
immunologische Prozesse belegt. Schlaf gilt nunmehr als essenziell zur
Aufrechterhaltung aller homöostatischer Prozesse, indem er auf den Stoffwechsel,
das Endokrinum und das Immunsystem wirkt (Besedovsky et al., 2012; Horne 1988).
In der Polysomnographie werden 5 Schlafstadien unterschieden. Das erste
Stadium (S1) schließt sich direkt an die Einschlafphase an. Darauf folgt eine
weitere Phase des leichten Schlafes (S2), indem der Körper noch ohne Weiteres
Einleitung
20
erweckbar ist. Als Tiefschlaf oder slow wave sleep (SWS) werden die Stadien 3
und 4 bezeichnet, die sich durch langsamere Wellen mit hoher Amplitude
auszeichnen. Diese Tiefschlafphasen findet man vor allem in der ersten
Nachthälfte. Im zweiten Abschnitt der Nacht werden sie durch vermehrt
auftretende und länger andauernde rapid-eye-movement Phasen (REM) abgelöst.
Die Übergänge dieser Schlafphasen sind fließend und werden mehrmals pro
Nacht durchlaufen (Rechtschaffen und Kahles 1968).
Die im Rahmen dieser Studie untersuchten Hormone Cortisol und GH unterliegen
einem schlafassoziierten Sekretionsmuster. Somit beeinflusst Schlaf deren
Plasmakonzentration und deren Wirkung auf die Zytokinproduktion der T-Zellen.
SWS-reiche Schlafphasen der ersten Nachthälfte inhibieren die
Cortisolfreisetzung, was in einem Nadir zwischen 24:00 und 2:00 Uhr resultiert. Mit
Abnahme der Tiefschlafphasen in der zweiten Nachthälfte steigen die Cortisol-
Plasmaspiegel kontinuierlich an und erreichen ihr Maximum in den frühen
Morgenstunden (Born und Fehm 1998; Gallagher et al., 1973; Weitzman 1976a; Weitzman 1976b). Auch bei GH wurde eine schlafassoziierte Abhängigkeit des
Sekretionsmusters beobachtet. Im Gegensatz zu Cortisol wurde jedoch der
Sekretionsgipfel in den ersten SWS-Phasen nach dem Einschlafen beschrieben.
Im Verlauf der folgenden 24 Stunden lassen sich nur noch länger andauernde
Phasen einer verminderten Freisetzung verzeichnen (Davidson et al., 1991; Lange et al., 2006a; Van Cauter und Copinschi 2000; Weitzman et al., 1981). Die
Zusammenhänge zwischen Schlafstadien, Hormonfreisetzung und Zytokinbalance
sind in der folgenden Abbildung dargestellt (Abb. 3).
Einleitung
21
Abbildung 3: Schematische Darstellung eines Hypnogramms mit Cortisol- und GH- Plasmakonzentrationen sowie dazugehörigem Zytokinprofil: W = Wachphase, REM = Rapid Eye Movement, S1 bis S4 = Non REM Schlafphasen, S3 und S4 = SWS = Tiefschlafphasen, GH = Wachstumshormon, Blaue Linie = Konzentrationverlauf GH, Rote Linie = Konzentrationsverlauf Cortisol, Grüne Fläche = Th1-Zytokinprofil, Gelbe Fläche = Th2-Zytokinprofil, GG = Th1/Th2-Gleichgewicht (Balance)
Wie in der obigen Skizze verdeutlicht, unterliegt die Zytokinsekretion diurnalen
Schwankungen. Unter erniedrigtem Cortisolspiegel und hohen Konzentrationen
von GH, wie sie in der ersten Nachthälfte (SWS-Phasen) bestehen, werden
proinflammatorische Zytokine freigesetzt. Es kommt zur Sekretion von IL-1, IL-12,
TNF-α und IFN-γ. Das Verhältnis der IFN-γ zu IL-4 produzierenden T-Zellen
verschiebt sich zugunsten des Th1-Zytokins IFN-γ (Besedovsky et al., 2012;
Dimitrov et al., 2004b; Esquifino et al., 2004; Hattori 2009; Haus 2007; Kelley et al., 2007). In der zweiten Nachthälfte und den frühen Morgenstunden, die durch
erniedrigte GH- und erhöhte Cortisolspiegel bei vermehrt auftretenden REM-
Phasen gekennzeichnet sind, ist ein Umschwung der Th1/Th2-Balance zugunsten
von Th2 zu verzeichnen (Besedovsky et al., 2012; Dimitrov et al., 2004b). Diese
Zusammenhänge verdeutlichen die Interaktionen zwischen Endokrinum,
Immunsystem und Schlaf, wobei der Hypothalamus als zentrales
Regulationsorgan anzusehen ist. Er moduliert über den Ncl. suprachiasmaticus
die zirkadiane Rhythmik, über Releasing- und Inhibiting-Hormone das
Endokrinum, über den Locus coeruleus und Raphe Kerne den Schlaf sowie über
Ausschüttung bestimmter Neurotransmitter das vegetative Nervensystem (Abb. 4).
Einleitung
22
Abbildung 4: Schematische Darstellung der Immunmodulation: Wechselwirkungen und Rückkopplungsmechanismen zwischen Hypothalamus als Vermittler und zentraler Instanz zwischen Nervensystem, Endokrinum, zirkadianem Schrittmacher und Immunsystem (Guillemin 2005). HT = Hypothalamus, HVL = Hypophysenvorderlappen, EP = Epiphyse, CRH = Corticotropin Releasing Hormone (Corticoliberin), ACTH = Adrenocorticotropes Hormon, GHRH = Growth Hormon Releasing Hormon, GHIH = Growth Hormon Inhibiting Hormon SWS = Slow Wave Sleep = Tiefschlaf, REM = Rapid Eye Movement, NNR = Nebennierenrinde, GH = Growth Hormon, Th1/Th2 = Zytokine der Th1- und Th2-Helferzellen, Rote Pfeile = Inhibition, Grüne Pfeile = Induktion, Schwarze Pfeile = gegenseitige Beeinflussung
Dem Wachstumshormon schreibt man proinflammatorische Effekte zu, während
Cortisol konzentrationsabhängig eher antiinflammatorische Reaktionen hervorruft
(Elenkov 2004; Kelley et al., 2007). Weitere schlafassoziierte Hormone sind
Melatonin und Prolaktin. Auch sie sollen synergistische Effekte auf die
Regulierung einer Immunantwort haben. Mit Anstieg ihrer Sekretion während des
Einleitung
23
Schlafes sollen sie eine proinflammatorische Reaktion begünstigen (Besedovsky et al., 2012; Dimitrov et al., 2004b).
Zusammenfassend besitzen der Schlaf, ebenso wie die zirkadiane Rhythmik,
einen starken Einfluss auf das Immunsystem. Ein geregelter Schlaf-Wach-
Rhythmus ist essenziell für eine suffiziente Immunabwehr. Insomnie führt zu einer
herabgesetzten Immunantwort und früher oder später zur Beeinträchtigung der
Gesundheit (Besedovsky et al., 2012; Cohen et al., 2009; Dhabhar 2009; Everson 1993; Everson 2005; McEwen 2006; Meerlo et al., 2008).
Einleitung
24
1.4 Fragestellung und Ziel der Arbeit
Diese in vitro Studie beschäftigt sich mit den Auswirkungen physiologischer
Konzentrationen des humanen Wachstumshormons (GH) und des Cortisols auf
das Immunsystem, insbesondere auf die Balance der Th1/Th2-Zytokine.
Als Parameter für die Funktion des Immunsystems dienten IFN-γ- und IL-4-
produzierende CD4+ T-Helferzellen, wobei IFN-γ als Leitzytokin für Th1 und IL-4
für Immunreaktionen der Th2-Zellreihe dienten.
Unter standardisierten Bedingungen wurden T-Lymphozyten aus Vollblutproben
von 15 gesunden jungen Männern auf ihre intrazelluläre Konzentration an den o.g.
Zytokinen am Durchflusszytometer untersucht.
Im Einzelnen sollten folgende Fragen beantwortet werden.
1. Welchen Einfluss besitzen die Hormone GH und Cortisol auf IFN-γ-
produzierende CD4-positive T-Helferzellen?
2. Welchen Einfluss besitzen die Hormone GH und Cortisol auf IL-4-produzierende
CD4-positive T-Helferzellen?
3. Welche Auswirkungen haben veränderte GH- und Cortisolkonzentrationen auf
die Th1/Th2-Balance?
Material und Methoden
25
2. Material und Methoden
2.1 Probanden
An dieser Studie nahmen 15 physisch und psychisch gesunde männliche
Probanden im Alter zwischen 20 und 35 Jahren teil. Voraussetzung für die
Teilnahme war ein gesunder und regelmäßiger Schlaf-Wach-Rhythmus, der einen
Nachtschlaf von sieben bis neun Stunden ermöglichte und Schichtarbeit in den der
Untersuchung vorausgegangenen sechs Wochen ausschloss. Innerhalb der
letzten drei Monate durften die Probanden unter keinerlei Medikamenteneinfluss
gestanden haben. Weitere Ausschlusskriterien waren Nikotinabusus und
allergische Erkrankungen. Akute und / oder chronische Krankheiten wurden
mittels eines Anamnesebogens (s. Anhang), klinischer Untersuchung sowie einer
Routine-Laborkontrolle ausgeschlossen. Die Laborparameter schlossen ein
großes Blutbild (Leukozyten < 9/µl, C-reaktives Protein (CRP) < 6mg/l), Elektrolyt-
und Plasmametabolitbestimmungen und Bestimmung des TSH- (Thyroid
Stimulating Hormon) Wertes ein.
Bei der vorliegenden Studie handelt es sich um ein DFG-gefördertes Projekt
(FOR457). Das Studienprotokoll wurde im Vorfeld von der Ethikkommission der
Universität zu Lübeck vorgelegt und genehmigt. Jeder Proband wurde ausführlich
aufgeklärt. Von jedem Teilnehmer lag eine schriftliche Einverständniserklärung vor
Beginn der Studie vor.
2.2 Reagenzien
Das humane Wachstumshormon (GH), der GR-Antagonist RU-486 sowie der MR-
Antagonist Spironolacton wurden über Sigma-Aldrich (St. Louis, Minnesota, USA)
erworben.
Die monoklonalen GH-Antikörper (5801) wurden von Oy Medix Biochemica
Antibody (Kaunianinen, Finnland) hergestellt.
Material und Methoden
26
2.3 Versuchsablauf
Um eine Aussage über die immunologischen Effekte physiologischer
Konzentrationen von GH und Cortisol treffen zu können, wurden Vollblutproben
gesunder Männer analysiert. Nach in vitro-Stimulation mit Ionomycin und PMA, in
An- und Abwesenheit von GH und dem Cortisol-Rezeptor-Antagonisten RU-486
und Spironolacton wurde mittels Durchflusszytometers die Zytokinproduktion CD4-
positiver T-Helferzellen untersucht. Als Kontrollgruppe diente eine nicht stimulierte
Vollblutprobe eines jeden Probanden.
2.3.1 Zellstimulation und Zellaktivierung
Jedem Probanden wurde durch eine Venenpunktion 0,5 ml venöses Vollblut in
heparinisierte Monovetten (Firma Becton Dickinson, San Jose, Kalifornien, USA)
entnommen. Die Blutentnahme erfolgte, gemäß Studienprotokoll, immer morgens
gegen 8:00 Uhr durch die gleiche Person. Die Probanden waren zum
Abnahmezeitpunkt nüchtern und befanden sich in sitzender Position. Das Blut
wurde unverzüglich im Verhältnis 1:1 mit dem Kulturmedium RPMI-1640 unter
Zusatz von Penicillin, Streptomycin, Glutamin, nicht essentiellen Aminosäuren und
Natriumpyruvat in Falcon-Röhrchen (Becton Dickinson, San Jose, Kalifornien,
USA) versetzt. Danach folgte eine sechsstündige Inkubation der Proben in einem
Brutschrank bei 37°C und 5 %-igem CO2-Zusatz in An- bzw. Abwesenheit von 20
ng/ml GH, 8,3 µM RU-486, einer Kombination aus GH und RU-486, und 8,3 µM
Spironolacton. Durch den Zusatz von RU-486 und Spironolacton wurde eine
komplette Blockade der Cortisolwirkung erreicht, da Cortisol seine Wirkung
bekanntermaßen über beide Rezeptortypen (GR und MR) entfalten kann. So
wurde der physiologische Nadir der Cortisol-Plasmakonzentration, wie er in der
ersten Nachthälfte vorliegt, simuliert. Eine weitere Kultur, ohne jeglichen Zusatz,
diente als unbehandelte Kontrolle. Diese Vollblutprobe enthielt die physiologisch
hohe Cortisolkonzentration, die üblicherweise in den frühen Morgenstunden
vorherrscht. Für die letzten vier Stunden der insgesamt sechsstündigen Inkubation
wurden die Proben mit jeweils 1µg/ml Ionomycin und 8 ng/ml PMA (Phorbol-12-
myristat-13-acetat) stimuliert. Eine Proteinausschüttung wurde durch Zugabe des
Material und Methoden
27
Golgi-Inhibitors Brefeldin A in einer Konzentration von 10 µg/ml verhindert. Alle
hier verwandten Reagenzien wurden von Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Minnesota,
USA hergestellt.
2.3.2 Durchflusszytometrische Analyse
Nach abgeschlossener Stimulation der Zellen, wie unter 2.3.1 erklärt, erfolgte
deren Markierung für die durchflusszytometrische Analyse. Dazu wurden direkt
konjugierte Antikörper gegen die Oberflächenmarker CD3 mit dem Fluorochrom
Allophycocyanin (APC) (CD3-APC) und die Oberflächenmarker CD8 mit dem
Farbstoff Peridin-Chlorophyll (PerCP) (CD8-PerCP) verwandt (Becton Dickinson,
San Jose, Kalifornien, USA). Die Markierung wurde unter Lichtschutz bei
Raumtemperatur für 20 Minuten durchgeführt. Anschließend erfolgte die
zehnminütige Lyse der Erythrozyten mit 2 ml einer FACS-Lyse-Lösung (BD
FACS™ lysing solution, Becton Dickinson, San Jose, Kalifornien, USA). Nach
Zentrifugation für 5 Minuten bei 500g wurde der Überstand entfernt. Um ein
Eindringen der zytokin-spezifischen Antikörper in die Zellen zu ermöglichen,
erfolgte eine zehnminütige Permeabilisierung mittels FACS-
Permeabilisierungslösung (BD FACS™ permeabilizing solution, Becton
Dickinson). Nach der Zellwaschung mit CellWash + 0,5% FCS (fetales
Kälberserum, fetal calf serum) erfolgte die Inkubation mit den intrazellulären
Antikörpern gegen die Zytokine IFN-γ mit dem Fluorochrom
Fluoresceinisothiocyanat (FITC) (IFN-γ-FITC) und gegen die Zytokine IL-4 mit dem
Farbstoff Phycoerythrin (PE) (IL4-PE). Um eine Differenzierung zwischen positiven
und negativen Zellen zu ermöglichen, wurden Isotyp-Kontroll-Antikörper benutzt
(Machura et al., 2007; Pala et al., 2000; Prussin 1997).
Nach einer erneuten Wäsche wurden die Zellen mit einer phosphatgepufferten
Salzlösung (Phosphate buffered saline, PBS) versetzt und umgehend im
Durchflusszytometer (BD FACSCalibur flow cytometer, Becton Dickinson) anhand
der Software BD CellQuest Pro (ebenfalls Becton Dickinson) analysiert.
Bei der Durchführung der Durchflusszytometrie wurde strikt nach der Anleitung
des Geräteherstellers vorgegangen. Bei jeder Analyse wurden mindestens 10.000
Material und Methoden
28
Zellen innerhalb der CD3+-Region, die den T-Lymphozyten entspricht, gezählt.
Die Schwelle für Zytokin-positive Zellen wurde anhand von Isotyp-Kontroll-
Antikörpern ermittelt. Um eine Kontamination durch andere Zellpopulationen
auszuschließen, wurde die Vorwärts- und Seitwärts-Streuung für Lymphozyten
zusammen mit den CD3-positiven Zellen (CD3+) entsprechend eingestellt.
Die für diese Untersuchung relevanten IFN-γ- und IL-4-positiven Zellen wurden als
prozentualer Anteil der CD3+CD8- T-Helferzellen ausgedrückt. Da der sonst
übliche Marker CD4 durch Stimulation durch PMA herunterreguliert werden kann
(Petersen et al., 1992; Suzuki et al., 1991), wurde im Rahmen dieser Studie der
Marker CD8 zur Bestimmung der T-Helferzellen ausgewählt.
2.3.3 Hormonbestimmung
Für die Hormonbestimmung wurde das durch eine morgendliche Venenpunktion
gewonnene Blut in Serum-Monovetten (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) gefüllt.
Nach sofortiger Zentrifugation wurde der Überstand gewonnen und bis zur
Hormonbestimmung bei -20 °C aufbewahrt.
Die Messung des humanen Wachstumhormons (GH) erfolgte durch einen
Radioimmunoassay (RIA, Diagnostic Products Corporation, Los Angeles,
Kalifornien). Die Sensitivität der Untersuchung betrug 0,9 ng/ml. Der Intra- und
Interassay-Variationskoeffizient (CV) lag unter 5,9 bzw. 8,3%.
Für die Cortisol-Bestimmung wurde ein enzymgekoppelter Immunadsorptionstest
(EIA) der Firma Diagnostic Systems Laboratories, Sinsheim, Deutschland mit der
Sensitivität 0,1 µg/dl herangezogen. Der Intra- und Interassay-Variationskoeffizient
(CV) lag unter 5,0 bzw. 12%.
Material und Methoden
29
2.3.4 Statistische Auswertung der Ergebnisse
Folgende Parameter wurden statistisch ausgewertet:
- Anzahl der IFN-γ-produzierenden CD4+ T-Helferzellen und IL-4-
produzierenden CD4+ T-Helferzellen als Leitzytokine der Th1- bzw. Th2-
Immunantwort
- absolute Änderung IFN-γ-produzierenden CD4+ T-Helferzellen und IL-4-
produzierenden CD4+ T-Helferzellen nach Zusatz von GH, RU-486, GH und
RU-486 sowie Spironolacton.
Um starke interindividuelle Schwankungen der Absolutwerte auszugleichen und
eine genauere Aussage über die Konzentrationsänderung der Zytokine treffen zu
können, wurden diese Absolutwerte zusätzlich ins Verhältnis zur unbehandelten
Kontrollgruppe gesetzt und anschließend statistisch ausgewertet. Hierdurch
wurden nicht die Absolutwerte, sondern die tatsächliche Änderung der
Zytokinproduktion erfasst.
Darüber hinaus wurde das Verhältnis der Th1- zu Th2-Helferzellen (Th1/Th2-
Balance) nach Zusatz der o.g. Substanzen verglichen zur Kontrollgruppe
ausgewertet.
Nach Prüfung der Normalverteilung mit Hilfe des parameterfreien Kolmogoroff-
Smirnov-Testes erfolgte die Evaluation der Änderung der Th1- und Th2-Zellen
nach Zugabe der o.g. Substrate im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe.
Hierfür wurde der zweiseitige t-Test nach Student für abhängige Proben verwandt.
Alle Daten wurden als Mittelwerte ± SEM (Standard Error of Mean) angegeben.
Die Auswertung erfolgte mit der Software IBM SPSS Statistics 18 für Mac OS/X
(SPSS Incorporated, an IBM Company, Chicago, Illinois USA). Die Unterschiede
wurden als signifikant betrachtet, wenn die Irrtumswahrscheinlichkeit p < 0,05 war.
Ergebnisse
30
3. Ergebnisse
Im Rahmen dieser Studie wurden Vollblutproben von 15 gesunden Männern im
Alter von 20 bis 35 Jahren auf die Veränderungen von IL-4- bzw. IFN-γ-
Konzentrationen nach in vitro-Stimulation untersucht. Als Kontrolle diente
stimuliertes Blut ohne Zusatz von GH oder Rezeptorantagonisten. In diesen
Proben lagen physiologische morgendliche Hormonkonzentrationen vor. IFN-γ
repräsentierte die Zytokinproduktion des Th1-Profils, IL-4 wurde als Marker für die
Th2-Zytokingruppe herangezogen. Die für diese Untersuchung relevanten IFN-γ-
und IL-4-positiven Zellen wurden, wie unter Material und Methoden beschrieben,
als prozentueller Anteil der CD3+CD8- T-Helferzellen ausgedrückt.
3.1 Plasma-Hormon-Konzentration innerhalb der Kontrollgruppe
Der Schwellenwert für eine mögliche Bestimmung der GH-Konzentration im Blut
liegt bei 0,9 ng/ml. Bei keinem der Probanden (n=15) konnte dieser Wert erreicht
werden.
Der Schwellenwert für die Cortisol-bestimmung (durch EIA) ist 0,1 µg/dl. Die
Cortisol-Konzentration im Blut der Probanden schwankte zwischen 10,3 und 29,6
µg/dl (20,19 ± 1,53) (Mittelwert ± SEM) (Abb. 5)
Ergebnisse
31
Abbildung 5: Schematische Darstellung der Cortisol - Plasmaspiegel der Probanden in µg/dl
3.2 Auswirkungen auf IFN-γ-produzierende CD4+ T-Helferzellen
Die gemessenen Werte (Absolutwerte) der Kontrollgruppe, der IFN-γ-
produzierenden CD4+ T-Helferzellen bewegten sich zwischen 11,4 und 35,4
(22,1 ± 1,8%). Nach Zugabe von humanem Wachstumshormon (growth hormone,
GH) konnte ein Anstieg der Zellen auf 23,1 ± 1,7% gemessen werden. Den
größten Einfluss auf die Produktion der IFN-γ-produzierenden CD4+ Zellen hatte
die Zugabe des Spironolactons, wodurch sich die Zellzahl auf 25,6 ± 2,1% erhöhte
(p=0,007) (Tab. 1; Abb. 6).
Kontrolle RU-486 GH + RU-486 GH Spironolacton
22,1 ± 1,8 24,5 ± 2,1 24,4 ± 2,0 23,1 ± 1,7 25,6 ± 2,1
p-Wert 0,002 * 0,0007 * 0,04 * 0,007 *
Tabelle 1: Absolutwerte (gemessene Werte) der IFN-γ-produzierenden CD4+ T-Helferzellen (in %) nach Zugabe von RU-486, GH+RU-486, GH und Spironolacton nach Inkubation mit Ionomycin und PMA (MW ± SEM), * = signifikant (p < 0,05)
Ergebnisse
32
Abbildung 6: Schematische Darstellung der Absolutwerte (Mittelwerte ± SEM) der IFN-γ- produzierenden CD4+ T-Helferzellen nach Zugabe von RU-486, GH+RU-486, GH und Spironolacton (Spiro) im Vergleich zur Kontrolle, * = signifikant (p < 0,05)
Nach Zugabe von GH (p=0,04), von RU-486 (p=0,002), Spironolacton (p=0,007)
und der Kombination aus GH und RU-486 (p=0,0007) war ein signifikanter Anstieg
der IFN-γ-produzierenden CD4+ T-Helferzellen zu verzeichnen (Abb. 6; Tab. 1).
Betrachtet man die relative Änderung der Zellzahlen im Verhältnis zur Kontrolle,
so war hier ebenfalls eine signifikante Zunahme der IFN-γ-produzierenden CD4+
T-Helferzellen nach Zusatz von GH, RU-486, Spironolacton und der Kombination
von GH und RU-486 erkennbar. Der größte Anstieg der IFN-γ-produzierenden
CD4+ T-Lymphozyten wurde auch hier nach Zugabe von Spironolacton gemessen
(Tab. 2; Abb. 7).
Ergebnisse
33
RU-486 GH + RU-486 GH Spironolacton
11,3 ± 2,9 11,0 ± 2,6 5,5 ± 2,9 12,9 ± 3,8
p = 0,002 * p = 0,0004 * p = 0,048 * p = 0,005 *
Tabelle 2: Relativ zur Kontrolle stattgefundene Änderung der IFN-γ-produzierenden CD4+ T-Helferzellen (in %) nach Zugabe von RU-486, GH+RU-486, GH und Spironolacton nach Inkubation mit Ionomycin und PMA (MW ± SEM) und die dazugehörigen p-Werte, * = signifikant (p < 0,05)
Abbildung 7: Schematische Darstellung der Auswirkungen (Mittelwerte ± SEM) von RU-486, GH+ RU-486, GH sowie Spironolacton (Spiro) auf IFN-γ-produziernde CD4+ T-Helferzellen verglichen mit der Kontrolle, * = signifikant
3.3 Auswirkungen auf IL-4-produzierende CD4+ T-Helferzellen
Die Ergebnisse der Kontrollgruppe bewegten sich zwischen 0,21 und 2,56 % (1,08
± 0,15 %). In Tab. 3 und Abb. 8 sind die gemessenen Absolutwerte und die
dazugehörigen p- Werte nach Zugabe der einzelnen Substanzen ersichtlich. Nach
Zugabe der jeweiligen Substanzen kam es in dieser Gruppe zu keiner
signifikanten Veränderung der Anzahl der IL-4-produzierenden CD4+ T-
Helferzellen.
Ergebnisse
34
Kontrolle RU-486 GH + RU-486 GH Spironolacton
1,08 ± 0,15 1,10 ± 0,16 0,99 ± 0,14 1,06 ± 0,17 1,05 ± 0,16
p - Wert 0,6 0,1 0,8 0,2
Tabelle 3: Absolutwerte der IL-4-produzierenden CD4+ T-Helferzellen (in %) nach Zugabe von RU-486, GH+RU-486, GH, und Spironolacton nach Inkubation mit Ionomycin und PMA (MW ± SEM) und die dazugehörigen p- Werte
Abbildung 8: Schematische Darstellung der Absolutwerte (Mittelwerte ± SEM) der IL-4-produzierenden CD4+ T-Helferzellen nach Zugabe von RU-486, GH+RU-486, GH und Spironolacton im Vergleich zur Kontrolle
Betrachtet man die relativ zur Kontrollgruppe stattgefundene Änderung der Anzahl
IL-4-produzierender CD4+ T-Helferzellen, sieht man ebenfalls keine signifikanten
Unterschiede (Tab. 4; Abb. 9).
RU-486 GH + RU-486 GH Spironolacton
4,8 ± 6,4 -6,9 ± 3,5 9,0 ± 13,0 -5,7 ± 4,9
p = 0,4 p = 0,06 p = 0,6 p = 0,2
Tabelle 4: Relativ zur Kontrollgruppe stattgefundene Änderung der IL-4 produzierenden CD4+ T-Helferzellen (in %) nach Zugabe von RU-486, GH+RU-486, GH und Spironolacton nach Inkubation mit Ionomycin und PMA (MW ± SEM) und die dazugehörigen p-Werte
Ergebnisse
35
Abbildung 9: Schematische Darstellung der Auswirkungen (Mittelwerte ± SEM) von RU-486, GH+ RU-486, GH sowie Spironolacton (Spiro) auf IL-4-produzierende CD4+ T-Helferzellen verglichen mit der Kontrolle
3.4 Auswirkungen auf das IFN-γ-/ IL-4-Gleichgewicht (Th1/Th2-Balance)
Da in vivo die Th1/Th2-Balance eine bessere Aussage über die Immunkompetenz
des Organismus zulässt, als die isolierten Absolutwerte der Zytokine, wurde im
Rahmen dieser Studie das Verhältnis der IFN-γ- zu IL-4-produzierenden CD4+ T-
zellen bestimmt. Betrachtet man die Relation der IFN-γ- zu IL-4-produzierenden
CD4+ Zellen (Th1/Th2-Balance), so hatten alle Substanzen einen Anstieg der IFN-
γ Produktion zur Folge, wobei durch Zugabe von GH+RU-486 und Spironolacton
signifikante Werte erreicht wurden (p=0,0008 bzw. p= 0,002) (Abb. 10; Tab. 5).
RU-486 GH + RU-486 GH Spironolacton
10,3 ± 5,9 21,6 ± 5,0 8,24 ± 8,7 23,1 ± 6,3
p = 0,1 p = 0,0008 * p = 0,3 p = 0,002 *
Tabelle 5: Relativ zur Kontrollgruppe erfolgte Änderung des Verhältnisses der IFN-γ- zu IL-4-produzierenden CD4+ T-Helferzellen (in %) nach Zugabe von RU-486, GH+RU-486, GH und Spironolacton nach Inkubation mit Ionomycin und PMA (MW ± SEM) und die dazugehörigen p-Werte, * = signifikant (p < 0,05)
Ergebnisse
36
Abbildung 10: Schematische Darstellung der relativen Änderung (Mittelwerte ± SEM) des Verhältnisses IFN-γ- zu IL-4-produzierenden CD4+ T-Helferzellen zur Kontrolle in % nach Zugabe von RU-486, GH+RU-486, GH und Spironolacton, * = signifikant (p < 0.05)
Diskussion
37
4. Diskussion
Die Modulation einer Immunantwort stellt einen wichtigen klinischen Aspekt bei
der Behandlung und Prävention unterschiedlichster Erkrankungen dar. Sie
unterliegt komplexen Steuermechanismen, welche weiterer Erforschung bedürfen.
Zytokine fungieren als wichtige Akteure immunologischer Reaktionen und sind
daher Gegenstand klinischer Untersuchungen. Besondere Aufmerksamkeit wird in
diesem Zusammenhang dem Th1/Th2-Verteilungsmuster, der so genannten
Th1/Th2-Balance geschenkt. Inzwischen ist bekannt, dass Schlaf über
weitreichende Einflüsse auf die Modulation des Zytokinprofils und somit auf die Art
der Immunantwort verfügt. Hier werden bestimmte Hormonkonstellationen
ausgenutzt, die sich begünstigend auf proinflammatorische Reaktionen auswirken
(Besedovsky et al., 2012; Born et al., 1997; Dimitrov et al., 2004b; Lange et al., 2010). In diesem Zusammenhang gehören Cortisol und GH zu den immunologisch
aktiven, schlafassoziierten Hormonen.
In der vorliegenden Arbeit sollte die Auswirkung physiologischer Konzentrationen
von Cortisol und GH auf das menschliche Immunsystem, insbesondere auf das
Gleichgewicht der Th1/Th2-Zytokine analysiert werden. Dabei sollten
Hormonzustände simuliert werden, die üblicherweise während der ersten
Nachthälfte (SWS - Phasen) in vivo existieren. Mittels Durchflusszytometers
wurden die Vollblutproben von gesunden männlichen Probanden auf Alterrationen
bezüglich der Zytokinproduktion CD4+ T-Zellen untersucht. Als repräsentative
Parameter der Th1- und Th2-Zellreihen dienten die Zytokine IFN-γ und IL-4. Die
Wirkung des GH wurde direkt durch dessen Zugabe und die des Cortisols indirekt
durch Blockade der Glukokortikoid- und Mineralokortikoidrezeptoren gemessen.
IFN-γ wurde als repräsentatives Zytokin für das Th1-Profil gewählt. Es unterstützt
als Hauptzytokin der proinflammatorischen, Th1-vermittelten Immunantwort die
Proliferation von T-Helferzellen der unspezifischen zellulären Immunabwehr
(Fearon und Locksley 1996; Gajewski und Fitch 1988; Gajewski et al., 1989; Maggi et al., 1992; Mosmann und Coffman 1989; Sad und Mosmann 1994). IFN-γ
wurde in früheren Untersuchungen mehrfach als reproduzierbarer Parameter zur
Evaluation der Th1-Funktionen herangezogen (Kidd 2003; Petrovsky und Harrison
Diskussion
38
1998; Skjolaas und Minton 2002; Szczypka et al., 2012). Analog dazu liegen
Studien vor, die IL-4 als Leitzytokin für die Beurteilung einer Th2-Immunantwort
postulieren (Agarwal und Marshall Jr. 2001; Holland et al., 2008; Romagnani 1991; Szczypka et al., 2012) und zudem bestätigen, dass dieses Zytokin für eine
Th2-vermittelte Immunantwort unerlässlich ist (Chen et al., 2004; Liew 2002; Paul und Seder 1994; Swain et al., 1990). Diese Erkenntnisse führten zur
entsprechenden Zytokinauswahl im Rahmen dieser Studie. Aber auch andere
Zytokine können als repräsentative Parameter für eine Th1- oder Th2-gerichtete
Immunantwort herangezogen werden. Dazu gehören unter anderem IL-2, IL-4, IL-
7, IL-10, TNF-α und IL-12 (Benedict et al., 2007; Besedovsky et al., 2012; Bollinger et al., 2009; Dimitrov et al., 2006; Dimitrov et al., 2007; Lange et al., 2010; Lange et al., 2006a; Lange et al., 2006b).
In der vorliegenden Arbeit wurden ausschließlich gesunde, allergiefreie, männliche
Nichtraucher einbezogen. Entsprechend den Protokollvorgaben wurden mittels
eines Fragebogens (s. Anhang, Kapitel 7) und nach Bestimmung entsprechender
Laborwerte, akute, chronische, psychische und medikamentös therapierte
Erkrankungen ausgeschlossen. Probanden mit labordiagnostisch nachgewiesenen
Infektionen (CRP über 6 mg/l und / oder erhöhter Leukozytenzahl > 9000/µl)
wurden aus der Studie ausgeschlossen. Jede Infektion stellt eine relevante
Stressbelastung für den Organismus dar (Dhabhar 2009; Dobbs et al., 1996; Kidd 2003) und führt unter anderem zu erhöhten Cortisolspiegeln und somit zu
Veränderungen der Zytokinaktivität (Black 1994; Dhabhar 2009; Lucey et al., 1996; Pinto et al., 2006; Tosi 2005). Schlafstörungen oder regelmäßiger Konsum
von Drogen und Alkohol haben gleichermaßen Auswirkungen auf die
immunologische Situation des Probanden. Um verfälschten Ergebnissen entgegen
zu wirken, wurden betroffene Probanden von der Teilnahme ausgeschlossen
(Besedovsky et al., 2012; Born et al., 1997; Dimitrov et al., 2004b; Jerrells 1991; Lange et al., 2010; Redwine et al., 2003). Bei psychischen Leiden sind ebenso
Alterationen in der Th1/Th2-Balance beschrieben. So wurden bei Untersuchungen
schizophrener Patienten diskrepante Veränderungen der IFN-γ-Spiegel
beobachtet (Schwarz et al., 2001). Auch bei depressiven Patienten fielen
supprimierte IFN-γ-Spiegel bei parallel gesteigerter IL-4-Synthese auf (Myint et al.,
Diskussion
39
2005; Song et al., 2009), so dass auch diese Patientengruppe aus der Studie
ausgeschlossen wurde. Durch eine Begrenzung des Alters der Teilnehmer auf
maximal 35 Jahre wurden altersbedingte Schwankungen der Immunsituation
berücksichtigt. So wurde zum einen eine Vergleichbarkeit der Probanden
untereinander sowie zu Ergebnissen anderer Studien ermöglicht. Diverse Autoren
beschrieben eine Dysbalance des Immunprofils zugunsten von Th2 mit
zunehmendem Alter (Castle et al., 1997; Rink et al., 1998; Schwab et al., 1992;
Van Cauter et al., 2000). Aufgrund erhöhter hormoneller Schwankungen wurden
Frauen aus der Studie ausgeschlossen (Kalu et al., 2008; Kruse et al., 2000; Piccinni und Romagnani 1996; Piccinni et al., 2000). Zudem stellten
Autoimmunerkrankungen, z. B. der Schilddrüse, ein Ausschlusskriterium dar.
Pathologisch veränderte Hormonwerte, z. B. TSH beeinflussen nachweislich die
Immunkompetenz (Kelley et al., 2007; Kidd 2003; Klecha et al., 2008) und könnten
dadurch zu nicht repräsentativen Ergebnissen führen. Die oben aufgeführten
Kriterien bekräftigen die Wahl der Probandengruppe, um möglichst unverfälschte
Voraussetzungen für diese Studie zu schaffen.
Die im Blut der Probanden gemessenen Cortisolspiegel lagen innerhalb der
üblichen Referenzbereiche. Die interindividuellen Schwankungen könnten durch
geringe stressbedingte Konzentrationsänderungen bedingt sein. Beispielsweise
könnte eine Trypanophobie zu einer vermehrten Sekretion des Stresshormons
Cortisol führen (Kamezaki et al., 2012; Petrovsky und Harrison 1998; Schubert und Schussler 2009). Die GH-Konzentration in den morgendlichen Blutproben lag,
wie erwartet, unterhalb der Detektionsgrenze (Dimitrov et al., 2004b; Lange et al., 2010; Lange et al., 2006a)(Kapitel 3.1).
Ein Teil der immunologischen Forschung beschäftigte sich mit Zytokinen und ihren
Auswirkungen auf das Immunsystem. Es gibt mehrere in Studien erprobte
Methoden zur Untersuchung und Bestimmung von Zytokinen. Hierzu zählen unter
anderem der Enzyme linked immuno-sorbant-assay (ELISA), Enzyme linked
immuno-spot-assay (Elispot), Radio immuno-assay (RIA), Reverse-transcription-
polymerase chain reaction (RT-PCR), die Westernblot-Technik und Verfahren zur
Detektion einer messenger (m)RNA Expression (Arora 2002; Ford 2010; Pala et
Diskussion
40
al., 2000; Skapenko und Schulze-Koops 2007).
Im vorliegenden Studiendesign wurde die Untersuchung von stimulierten und
aktivierten Vollblutproben am Durchflusszytometer gewählt. Der Nachweis reaktiv
gebildeter Zytokine nach Antigenstimulation ist jedoch auch durch die Verwendung
mononukleärer Zellen des peripheren Blutes (Peripheral Blood Mononuclear Cell,
PBMC) möglich. In beiden Varianten werden die Zellen stimuliert, fixiert,
permeabilisiert und die dann exprimierten Zytokine mittels monoklonaler
fluoreszierender Antikörper markiert und anschließend am Durchflusszytometer
dargestellt. Studien belegen, dass beide Verfahren vergleichbare
Analysemethoden zur Zytokinmessung per Durchflusszytometer darstellen (De Groote et al., 1992; Jason und Larned 1997; McNerlan et al., 2002; Yaqoob et al., 1999), auch wenn in Untersuchungen von Waldrop und Mitarbeitern die Frequenz
der Zytokinexpression bei Vollblutstimulationen im Vergleich zu PBMC höher war
(Waldrop et al. 1997).
In der vorliegenden Arbeit wurde die Vollblutanalyse verwandt, um ungewollte
Zellaktivierungen, die eventuell durch konventionelle Separationsvorgänge
verursacht werden könnten, zu umgehen. Eine Zell-Separation könnte eine
Abtrennung der T-Zellen von ihrem umgebenden hormonellen Milieu bedeuten,
welches jedoch gerade im Rahmen dieser Untersuchung von Interesse war
(Schultz et al., 2002). Zudem wird durch Nutzung von Vollblutproben eine
Reproduzierbarkeit sowie die Vergleichbarkeit mit bereits vorausgegangenen
Studien unserer und anderer Arbeitsgruppen zu dieser Thematik ermöglicht
(Dimitrov et al., 2009; Duramad et al., 2004; Lange et al., 2006a; Matalka und Ali 2005; Visser et al., 1998).
Die im Rahmen dieser Arbeit verwandte Zytokinbestimmung mittels
Durchflusszytometer ist eine anerkannte Methode zur Erfassung der Th1/Th2-
Immunaktivität und ermöglicht detaillierte Aussagen über das Zytokinmuster
(Arora 2002; Brown und Wittwer 2000; Longobardi-Givani 1992; Pala et al., 2000).
Die FACS setzt jedoch eine Stimulation der Zellen vor der Messung voraus,
wodurch eine spontane Zytokinmessung nicht möglich ist. Ein weiterer Nachteil
dieser Methode ist, dass zur intrazellulären Akkumulation der Zytokine Brefeldin A
eingesetzt wird, welches zugleich verhindert, dass die stimulierten Zellen
Rezeptoren exprimieren oder autokrine bzw. parakrine Mediatoren freisetzen.
Diskussion
41
Andererseits erlaubt sie eine individuelle Analyse großer Zellpopulationen auf
Einzelzellbasis (Jung et al., 1993; Pala et al., 2000) und mittels FACS-Analyse
stellt sie die einzige Methode zur Identifizierung der gewünschten Zellreihen in
heterogenen Suspensionen wie Vollblut dar (Kwak et al., 2000; Martin et al., 1992). Zudem ist die Durchflusszytometrie objektivierbar, d. h. vom Untersucher
unabhängig und läßt die Vergleichbarkeit der Daten verschiedener Arbeitsgruppen
zu (Brown und Wittwer 2000; Sack et al., 2000). Außerdem siedelt sich die
Erfassungsgrenze für Zytokine unterhalb der für Serum-Testverfahren an (Lange et al., 2006a). Aus den oben aufgeführten Gründen wurde sich in dieser Studie für
die FACS-Analyse als Mittel der Wahl zur Zytokinbestimmung und deren
Quantifizierung entschieden.
Die Interpretation durchflusszytometrisch ermittelter Daten ist von diversen
Einflussfaktoren, wie Lagerung und Transport der Proben sowie Tageszeit und
Körperlage zum Zeitpunkt der Blutabnahme, abhängig. Lange Transport- und /
oder Lagerungszeiten können zu verfälschten Ergebnissen, gerade in der
Bestimmung von Lymphozytenpopulationen, führen (Schultz et al., 2002; Tayebi et al., 1999). Für die korpuskulären Bestandteile im Vollblut ergeben sich niedrigere
Werte in liegender Position der Probanden zum Zeitpunkt der Abnahme (Sack et al., 2000). Zudem sind für die in der vorliegenden Studie untersuchten Substanzen
zirkadiane Rhythmen charakteristisch (Besedovsky et al., 2012; Born et al., 1997; Dimitrov et al., 2009; Lange et al., 2010; Levi et al., 1985; Levi et al., 1988). Um
diesen Schwankungen entgegen zu wirken und vergleichbare Ergebnisse zu
erzielen, wurde das Blut unter standardisierten Bedingungen entnommen und
unverzüglich verarbeitet.
Für die Stimulation der Zellen zur Zytokinproduktion wurden Ionomycin und PMA
verwendet. Ionomycin und PMA sind unspezifische, unphysiologische Stimulantien
des T-Zellrezeptor-Komplexes. Sie beeinflussen die intrazelluläre Bildung von
Zytokinen wie IFN, IL-2 und IL-4 (Andersson et al., 1990; Rostaing et al., 1999; Yssel et al., 1992). In vivo hingegen benötigen T-Zellen ein spezifisches Antigen,
welches nach Präsentation durch die APZ an den entsprechenden T-Zell-Rezeptor
bindet und so zur Zytokinfreisetzung führt. Studien belegen aber, dass die
Ergebnisse einer Zytokinstimulation in vivo durchaus mit denen einer Stimulation
Diskussion
42
in vitro vergleichbar sind, auch wenn die letztgenannte APZ unabhängig durch
unphysiologische Stimuli wie PMA / Ionomycin erfolgt (Jung et al., 1993;
Schuerwegh et al., 2003). Somit stellt die in vitro-Stimulation von T-Zellen eine
anerkannte, reproduzierbare und gut erforschte Methode dar (Lange et al., 2006a; Picker et al., 1995; Prussin 1997; Tayebi et al., 1999).
Die PMA-Konzentration wurde mit 8 ng/ml relativ gering gehalten. Diese
Dosierung entspricht jedoch der üblichen Standarddosierung zur Induktion einer
Zytokinaktivität (McNerlan et al., 2002; Picker et al., 1995). Eine weitere
Steigerung der PMA-Konzentration (25 ng/ml) führte in einer Pilotstudie und in
einer parallelen Versuchsreihe unter analogen Bedingungen zu keiner
signifikanten Änderung der Th1/Th2-Balance, was die Wahl der PMA-Dosierung
bekräftigte (Dimitrov et al., 2004a; Lange et al., 2006a).
Für die Blockade des Sekretionsapparates der Zellen und Freisetzung von
Mediatoren wurde Brefeldin A (BFA) verwandt. Es führt zur intrazellulären
Akkumulation der Zytokine und macht ihre intrazelluläre Messung mittels
Durchflusszytometer erst möglich. Im Gegensatz zu Monensin, welches in einigen
Studien zum gleichen Zweck herangezogen wurde, blockiert BFA den
Proteintransport zwischen endoplasmatischem Retikulum und dem Golgi-Apparat.
Nachweislich ist BFA der potentere Inhibitor der Exozytose bei geringerer Toxizität
(Nylander und Kalies 1999; Schuerwegh et al., 2001). In der Literatur werden
BFA-Konzentrationen von 0,1 bis 10 µg/ml beschrieben, wobei bereits bei einer
Dosierung von 0,1 µg/ml eine suffiziente Inhibition des Golgiapparates
nachgewiesen werden konnte (Lippincott-Schwartz et al., 1991). Um eine
maximale Inhibition und eine Vergleichbarkeit mit der Literatur sowie
vorangegangener und nachfolgender Studien unserer Arbeitsgruppe zu erreichen,
wurde in diesem Versuch mit einer Endkonzentration von 10 µg/ml gearbeitet
(Dimitrov et al., 2004a; Dimitrov et al., 2004b; Waldrop et al., 1997).
In der vorliegenden Arbeit wurde die Auswirkung von Cortisol und GH auf die
Produktion von CD4+ T-Zellen mit besonderem Augenmerk auf die Th1/Th2-
Zytokinbalance untersucht. Cortisol und andere Glukokortikoide sind für ihre
immunsuppressiven und antiinflammatorischen Wirkungen bekannt und werden
als Standardtherapeutika zur Behandlung immun- und entzündungsbedingter
Diskussion
43
Erkrankungen eingesetzt (Belvisi und Hele 2003; Hench et al., 1950; Kendall 1950; Miner et al., 2005; Schreiber 2011). Heute mehren sich die Belege dafür,
dass systemisch wirkende GK, darunter Cortisol, eher immunmodulierend agieren.
Sie sollen selektiv die Th1-Antwort hemmen und eine humorale Immunreaktion
fördern, wobei unter anderem vermutlich deren Dosierung eine erhebliche Rolle
spielt. Während pharmakologisch eingesetzte, unphysiologische Konzentrationen
die Immunreaktionen unterdrücken, sollen physiologische Dosen
immunmodulierend wirken (Ashwell et al., 2000; Daynes und Araneo 1989; Elenkov 2004; Elenkov und Chrousos 1999; Franchimont et al., 2000; Sternberg 2001).
Im Rahmen dieser Studie wurde die Wirkung des Cortisols auf die
Zytokinproduktion und die Th1/Th2-Balance untersucht. Durch Blockade der GR
durch RU-486 und MR durch Spironolacton wurden die Effekte des Cortisols
unterbunden, wodurch ein Cortisol-Nadir, wie er während des Tiefschlafes
besteht, simuliert wurde. Es ist bekannt, dass Cortisol seine Wirkung über
Stimulation beider Rezeptoren entfaltet (De Kloet et al., 1998; Lange et al., 2006a; White et al., 1997). Die gewählte Dosis von 8,3 ηM RU-486 und 8,3 ηM
Spironolacton zeigten in einer Pilotstudie eine komplette Blockade beider
Rezeptoren.
Wie man es aus den Ergebnissen entnehmen kann, fand durch die Blockade der
MR durch Spironolacton eine signifikante Verschiebung der Th1/Th2-Balance in
Richtung Th1 statt (Tab. 5; Abb. 10), was auf einen signifikanten Anstieg des Th1-
Zytokins IFN-γ durch IFN-γ-produzierende CD4+ T-Zellen zurückzuführen ist (Abb.
6, 7; Tab. 1, 2). Es erfolgte keine signifikante Änderung der IL-4-produzierenden
CD4+ Th-Zellen durch die Blockade des MR (Tab. 3, 4; Abb. 8, 9). Im Gegensatz
dazu wurde durch die Blockade des GR durch RU-486 weder die Th1/Th2-
Balance (Tab. 5; Abb. 10), noch die Anzahl IL-4-produzierender CD4+ Zellen
signifikant verändert (Tab. 3, 4; Abb. 8, 9). Es kam jedoch zu einer signifikanten
Zunahme der IFN-γ-produzierenden CD4+ Zellen (Abb. 6, 7; Tab.1, 2).
Die Kombination von Wachstumshormon und dem Cortisolrezeptor-Antagonisten
RU-486 führte zu einem signifikanten Shift in Richtung des Th1-Zytokinmusters
(Tab. 5; Abb. 10), der auch in diesem Fall nicht auf einer Veränderung der IL-4-
produzierenden Th-Zellen (Tab. 3, 4; Abb. 8, 9), sondern durch den signifikanten
Diskussion
44
Anstieg der IFN-γ-produzierenden CD4+ Zellen bedingt ist (Abb. 6, 7; Tab.1, 2).
Zusammenfassend ist festzustellen, dass die Dysbalance zugunsten der Th1-
Zytokine unter vollständiger Inhibition der Cortisolwirkung auf einer signifikanten
Zunahme der IFN-γ-produzierenden CD4+ Zellen beruht. Diese Ergebnisse
werden von vielen in vitro-Studien indirekt bestätigt, in denen Cortisol einen
Umschwung vom Th1- zum Th2-Profil vornehmlich durch Inhibition der Th1-
Zytokine bewirkt (Agarwal und Marshall Jr. 2001; Franchimont et al., 2000; Petrovsky und Harrison 1997; Petrovsky und Harrison 1998; Visser et al., 1998).
Eine Zunahme des Th1-Profils unter abfallenden Cortisolwerten stellt eine
Voraussetzung für inflammatorische Reaktionen dar, die im Rahmen einer
suffizienten Abwehrreaktion notwendig sind. Diese Konstellation ist
charakteristisch für die SWS-Phasen der ersten Nachthälfte und unterstreicht die
Relevanz des Schlafes im Rahmen der Immunabwehr (Besedovsky et al., 2012; Born et al., 1997; Lange et al., 2010).
Bei der Durchsicht der Literatur findet man kontroverse Aussagen über den
Einfluss von Glukokortikoiden auf die Th2-Zytokine. Die Produktion dieser
Zytokinreihe soll nach GK-Zusatz gesenkt, gesteigert oder unverändert bleiben.
Nach Cortisoladministration fanden Lange und Mitarbeiter eine Reduktion der IL-4-
produzierenden CD4+ Zellen um 30% (Lange et al., 2006a), wobei andere
Arbeitsgruppen eine dosisabhängige Reduktion von bis zu 90% beschrieben
(Byron et al., 1992; Wu et al., 1991). Nach erneuter Stimulation einiger, bereits mit
Glukokortikoiden anbehandelter Zellen fand eine signifikante Zunahme der IL-4-
Synthese statt (Agarwal und Marshall Jr. 1998; Agarwal und Marshall Jr. 2001; Brinkmann und Kristofic 1995; Daynes und Araneo 1989; Elenkov 2004; Ramirez 1998; Ramirez et al., 1996). Dies könnte entweder durch einen indirekten Effekt
der GK, eine lange andauernde Stimulation oder die Anwesenheit von
akzessorischen Zellen bedingt sein. Beispielsweise hemmen GK die Produktion
von IL-12 durch Herabregulierung seiner Rezeptoren. IL-12, welches unter
anderem von DC gebildet wird, induziert als potenter Inhibitor der IL-4-Zytokine
und durch Steigerung der Synthese IFN-γ-produzierender CD4+ T-Zellen eine
Th1-Dominanz. Eine Senkung des IL-12-Spiegels durch Cortisol führt demnach zu
Diskussion
45
einem Anstieg der IL-4- und Reduktion der IFN-γ-produzierenden CD4+ Zellen,
was in einer Verschiebung der Th1/Th2-Balance in Richtung Th2 resultiert
(Besedovsky et al., 2012; Blotta et al., 1997; Dimitrov et al., 2007; Franchimont et al., 2000; Langenkamp et al., 2000; Moser und Murphy 2000).
In der vorliegenden Studie konnte kein signifikanter Einfluss von GK auf IL-4
gezeigt werden, was durch die hier verwandten körpereigenen, physiologischen
Konzentrationen für Cortisol bedingt sein könnte. Ein Großteil der Studien, in
denen eine Änderung der IL-4-Produktion beschrieben wurde, benutzte zur
Evaluierung der GK-Wirkung das potente, synthetische Glukokortikoid
Dexamethason (DEX) in eher unphysiologischen Konzentrationen (Agarwal und Marshall Jr. 2001; Daynes und Araneo 1989; Franchimont et al., 2000; Franchimont et al., 1998; Ramirez 1998; Ramirez et al., 1996; Skjolaas et al., 2002; Visser et al., 1998). Unter Verwendung synthetischer GK in
unphysiologischen Konzentrationen wurde überwiegend eine generelle
Immunsuppression und Inhibition der Zytokinproduktion, sowohl der Th1- als auch
der Th2-Zytokinreihe beobachtet (Braun et al., 1997; Kunicka et al., 1993; Snijdewint et al., 1995).
Ein direkter Vergleich dieser Ergebnisse mit denen der vorliegenden Arbeit ist
aufgrund der unterschiedlichen Potenz und Pharmakokinetik der verwandten GK
nicht möglich. Beispielsweise liegt ein Großteil der körpereigenen GK in
gebundener Form vor und nur ein Bruchteil des frei im Blut zirkulierenden Anteils
ist biologisch aktiv (Tyrrell et al., 1986). Synthetische Steroide dagegen liegen
vermehrt in ungebundener Form vor, was sich in ihrer höheren Wirkpotenz
widerspiegelt (Fleshner et al., 2001; Pugeat et al., 1981; Skjolaas und Minton 2002; Spencer et al., 1990). Dies ist besonders bei in vivo-Studien zu bedenken.
Ferner müssen hier bei der Interpretation und Vergleich der Ergebnisse
synergistische oder antagonistische Effekte akzessorischer Zellen auf die
Zytokinproduktion beachtet werden, die unter in vitro-Bedingungen
ausgeschlossen werden können.
Bei der Auswertung der Ergebnisse muss man sich mit der Wirkungsweise der
Kortikosteroide und deren Rezeptoren auseinandersetzen. Kortikosteroide
Diskussion
46
entfalten ihre Wirkungen über 2 Rezeptortypen, den Glukokortikoid- und
Mineralokortikoid-Rezeptoren (Funder 1996; Funder 1997). Man ging davon aus,
dass MR von Aldosteron, einem Mineralokortikoid aktiviert wird, worüber es seine
Funktionen auf den Salz- und Wasserhaushalt des Körpers vermittelt. Analog
dazu sollte das Glukokortikoid Cortisol seine Wirkung über GR entfalten (Frey et al., 2004). Heute ist bekannt, dass Cortisol seine Effekte über beide Rezeptoren
vermittelt und sogar mit höherer Affinität an MR binden kann, als an GR (Funder 1997; Funder 2005; Mihailidou et al., 2009; Rupprecht et al., 1993). Abhängig von
der An- und Abwesenheit des Enzyms 11β-Hydroxysteroiddehydrogenase (11β-
HSD) im betroffenen Gewebe bindet Cortisol vermehrt an MR als an GR (De Kloet et al., 1998; Edwards et al., 1996; White et al., 1997). Beide Rezeptoren sollen
sogar als funktionelle Antagonisten fungieren (Funder 1993; Tanaka et al., 1997).
Bei der Untersuchung der Th1/Th2-Balance und deren Beeinflussung durch GK
wurde überwiegend auf DEX zurückgegriffen, welches selektiv an GR bindet. Bei
der Interpretation einiger Studien, bei denen die Wirkung des Cortisols auf das
Immunsystem eruiert wurde, ging man ebenfalls von seiner höheren Affinität zu
GR aus (Dobbs et al., 1996). Die in dieser Studie durch Spironolacton blockierten
MR bewirken einen signifikanten Umschwung des Gleichgewichts zugunsten der
Th1-Zytokine. Der spezifische GR-Antagonist RU-486 induzierte einen ähnlichen
Effekt, erreichte jedoch nur in Kombination mit GH-Signifikanz. Diese
Beobachtungen könnten wie folgt interpretiert werden:
1. GR und MR arbeiten bezüglich der cortisolinduzierten Suppression
proinflammatorischer Zytokine synergistisch, indem die Blockade beider
Rezeptoren zu einer Steigerung des proinflammatorischen Zytokins IFN-γ und
dadurch zu einer Verschiebung der Th1/Th2-Balance zugunsten von Th1 führte.
Dieses Resultat widerspricht der Annahme, dass MR und GR als funktionelle
Antagonisten fungieren (Funder 1993; Tanaka et al., 1997). Im Rahmen einer
Parallelstudie wurde die Synergie beider Steroidrezeptoren durch
Synthesesteigerung von TNF-α und IL-2 in CD4+ und CD8+ T-Zellen bei Blockade
von GR und MR erneut bestätigt (Dimitrov et al., 2004a).
2. Cortisol entfaltet den größeren Teil seiner immunologischen Wirkung nicht, wie
Diskussion
47
erwartet, über die GR, sondern über die MR. Auch Sauer und Mitarbeiter konnten
durch MR-Blockade mittels Spironolacton in humanen Monozyten eine Umkehr
der cortisolinduzierten Inhibition der IL-1-Sekretion, einem proinflammatorischen
Zytokin, belegen (Sauer et al., 1996). Analog dazu konnten Vedder und Mitarbeiter
einen Anstieg der TNF-α-Sekretion in menschlichen PBMC nach in vitro-Zusatz
von Spironolacton feststellen (Vedder et al., 2003), was für die
Wirkungsvermittlung der GK über MR spricht. In der oben genannten
Parallelstudie konnte dieser TNF-α Anstieg über MR ebenfalls bestätigt werden
(Dimitrov et al., 2004a).
Zu diskutieren wäre an dieser Stelle außerdem auch der Einfluss des
Mineralokortikoids Aldosteron auf das Immunsystem, denn dieses Hormon ist der
eigentliche Ligand der MR. Aldosteron hat ebenfalls immunologisch modulierende
Eigenschaften. Sie sollen unter anderem die Anzahl der zirkulierenden
Lymphozyten, der NK und der Monozyten senken (Miller et al., 1994). Der
periphere Plasmaspiegel von Cortisol liegt annähernd 1.000-fach über dem des
Aldosterons (Charloux et al., 2001). Ferner liegt die Plasmaverweildauer des
Aldosterons deutlich unter dem des Cortisols, da es kaum gebunden und bereits
nach einer Leberpassage vollständig eliminiert wird. Die Plasmahalbwertszeit
beträgt ca. 30 Minuten (Hubl et al., 1975).
Des Weiteren findet man im Rahmen eines Hyperaldosteronismus einen Anstieg
proinflammatorischer Zytokine wie z. B. TNF-α (Ahokas et al., 2003; Anker und Rauchhaus 1999; Carvajal et al., 2009). Trotz Blockade der MR durch
Spironolacton im Rahmen der vorliegenden Arbeit kam es dennoch zu einem
signifikanten Anstieg der proinflammatorischen Zytokine.
Diese Feststellung und die oben aufgeführten Eigenschaften des Aldosterons
sprechen gegen dieses Hormon als Auslöser der über MR-vermittelten Änderung
der Zytokinbalance. Diese Argumente lassen die Schlussfolgerung zu, dass
Cortisol seine Wirkung auf die Th1/Th2-Zytokinsynthese über MR ausübt.
Ein weiteres Hormon, welches an der Immunmodulation beteiligt ist, ist GH. Ihm
wird eine supportive Wirkung auf das Immunsystem zugeschrieben. Dieser Effekt
wird entweder direkt von GH oder durch Insulin-like growth factor-1 (IGF1), dessen
Diskussion
48
Bildung von GH stimuliert wird, ausgelöst (Auernhammer und Strasburger 1995; Clark 1997; Koo et al., 2001).
Im Rahmen dieser Studie wurde der Einfluss von GH auf die Zytokinproduktion
und die Th1/Th2-Balance untersucht. GH unterliegt einer starken,
schlafgebundenen zirkadianen Rhythmik, mit einer maximalen Ausschüttung direkt
nach dem Einschlafen und einem Nadir in der zweiten Nachthälfte und
Morgenstunden (Born et al., 1997; Lange et al., 2010; Mallmann et al., 1989; Van Cauter und Copinschi 2000). Dies wurde durch die Messung der
Hormonkonzentration im Rahmen dieser Studie bestätigt. Der GH-Spiegel im
untersuchten Blut lag, wie erwartet, unterhalb der Bestimmungsgrenze (0,9 ng/ml).
Um den Effekt einer GH Auswirkung auf das Immunsystem zu untersuchen, wurde
den morgendlichen Blutproben GH in einer Konzentration von 20 ng/ml zugesetzt.
Durch die Zufuhr des GH kam es zu einem signifikanten Anstieg des Th1-Zytokins
IFN-γ. Eine signifikante Auswirkung auf die Zytokine der Th2-Reihe konnte jedoch
nicht beobachtet werden. Ebenfalls konnte keine signifikante Änderung der
Th1/Th2-Balance durch GH gemessen werden. Lediglich die Kombination von GH
und RU-486 führte zu deren Verschiebung zugunsten von Th1 (Kapitel 3.1, 3.2,
3.3).
Eine durch GH bedingte Steigerung der Th1-Zytokinproduktion wird durch die
Ergebnisse mehrerer Arbeitsgruppen bestätigt (Lange et al., 2006a; Malarkey et al., 2002; Mellado et al., 1998; Mustafa et al., 1997; Sommese et al., 1996; Takagi et al., 1998).
Eine signifikante Änderung der IL-4-produzierenden CD4+ Zellen konnte in dieser
Studie nach GH-Applikation nicht festgestellt werden. Diese Resultate wurden
ebenfalls durch mehrere Studien belegt (Galdiero et al., 1995; Galdiero et al., 1997).
Im Widerspruch dazu lassen sich jedoch auch Berichte zu GH-bedingten
signifikanten Änderungen der Th2-Zytokine, unter anderem von IL-4 finden (Liu et al., 2008). Die Arbeitsgruppe um Mellado beschrieb einen Anstieg der IFN-γ- aber
einen Rückgang der IL-4-Produktion nach Zugabe von GH (Mellado et al., 1998). Takagi et al. haben einen signifikanten Rückgang von IL-4 durch GH an Mäusen,
Diskussion
49
die einem Verbrennungstrauma ausgesetzt waren, festgestellt. Dieses führte zu
einem Anstieg der Th2- und einem Abfall der Th1-Zytokinsynthese, repräsentiert
durch IL-4 bzw. IFN-γ. Nach Zugabe von rekombinantem GH gelang eine Umkehr
dieses Zytokinmusters erneut zugunsten von Th1, indem IFN-γ wieder anstieg und
IL-4 sank (Takagi et al., 1998). Im Gegensatz zur vorliegenden Arbeit waren diese
jedoch in vivo-Studien.
Schlussfolgernd ist zu sagen, dass GH eine Th1-vermittelte Immunantwort
induziert, welche in vivo, jedoch nicht in vitro, zu einer indirekten Suppression der
Th2-Zytokine führen kann. Eine generelle Suppression der Th2-Immunantwort
durch eine verstärkte IFN-γ-Aktivität wurde bereits mehrfach beschrieben
(Gajewski und Fitch 1988; Gajewski et al., 1989).
Ein weiterer Erklärungsversuch dieser Resultate könnte in der Verteilung der GH-
Rezeptoren liegen. Die Expression der Rezeptoren für das Wachstumshormon auf
T-Zellen ist gering, wobei fast alle (80-90%) B-Zellen und Makrophagen GH-
Rezeptor-positiv sind (Bresson et al., 1999; Dardenne et al., 1998; Postel-Vinay et al., 1997). Dies lässt vermuten, dass der direkte Effekt von GH auf die T-Zellen
geringer ausfallen muss, als seine indirekte Wirkung auf die T-Zellen, welche über
die APZ vermittelt wird. Derartige indirekte Effekte des GH können in der
vorliegenden Arbeit durch die APZ unabhängige Stimulation der Zellen mit PMA
maskiert werden (Lange et al., 2006a).
Im Gegensatz zu einem Abfall der Th2-Zytokine konnte Borrione einen
signifikanten Anstieg selbiger durch GH feststellen. Da Borrione jedoch die
Auswirkung unphysiologischer GH-Konzentrationen ab 200 ng/ml bis 600 ng/ml
untersucht hatte, können diese Ergebnisse mit denen der vorliegenden Arbeit, in
der physiologische Konzentrationen verwandt wurden, nicht verglichen werden
(Borrione et al., 2012). Ein Anstieg der Th2-Zytokine durch GH wurde auch durch
die Arbeitsgruppe um Ramos beobachtet. Hier wurde gezeigt, dass
- GH die IL-10-Sekretion der CD4+ T-Zellen in gesunden Probanden stimuliert
und
- IL-10 die Sekretion der Th1-Zytokine verhindert, wodurch die Th1/Th2-Balance
zugunsten von Th2 verschoben wurde (Ramos et al., 2011).
Diskussion
50
Ein Vergleich ist ebenfalls nicht möglich, da im Rahmen der vorliegenden Arbeit
die IL-10-Aktivität nicht untersucht wurde. Obwohl auch IL-10 zur Beantwortung
der Fragestellung dieser Arbeit hätte dienen können, wurde sich aufgrund der
Vergleichbarkeit mit vorangegangenen Studien unserer Arbeitsgruppe für IL-4
entschieden (Dimitrov et al., 2004a; Dimitrov et al., 2004b; Lange et al., 2006a).
Zudem wurde eine mögliche immunmodulierende Wirkung von IGF-1, welches
durch Stimulation von GH unter anderem von der Leber sezerniert wird, in dieser
Studie nicht untersucht. In vivo hat dieser Wachstumsfaktor ebenfalls
weitreichende Einflüsse auf die Immunkompetenz (Bernabei et al., 2003; Hattori 2009; Tu et al., 1999).
Bei der Betrachtung der Auswirkungen der hier untersuchten Hormone auf das
Immunsystem sollte auch die Rolle ihrer Releasing-Hormone diskutiert werden.
Wie bereits erwähnt, wird die Freisetzung des GH durch GHRH reguliert (Abb. 1).
GHRH selbst hat ebenfalls immunmodulierende Eigenschaften (Siejka et al., 2005a; Siejka et al., 2005b; Stepien et al., 2010; Valtorta et al., 1991), die zu
Verschiebung der Th1/Th2-Balance führen können. Siejka und Mitarbeiter zeigten
auf, dass GHRH unter in vitro-Bedingungen zu einem signifikanten Anstieg der
IFN-γ-Sekretion in PBMC führt (Siejka et al., 2004).
Die Freisetzung von Cortisol wird unter anderem über CRH reguliert. Auch dieses
Hormon beeinflusst inflammatorische Reaktionen. Im Rahmen seiner supportiven
Eigenschaften unterstützt es die Lymphozytenproliferation (Gay et al., 2008; Karalis et al., 1997; McGillis et al., 1989; Singh 1989). Über Aktivierung der HHN-
Achse durch die Zytokine TNF-α, IL-1 und IL-6 wirkt CRH über vermehrte
Ausschüttung des Cortisols letztlich immunsuppressiv (Besedovsky et al., 1986; Sapolsky et al., 1987).
Der weit verbreitete Spruch „Schlaf Dich gesund“ fand durch zunehmende
Forschung auf den Gebieten der Neuroendokrinologie und Immunologie der
letzten Jahrzehnte immer wieder Bestätigung. Schlaf dient also nicht nur der
Erholung, sondern in gewissem Maße auch der zellulären Regeneration und
Diskussion
51
unterstützt das Abwehrsystem. Dabei werden die vegetativen und hormonellen
Gegebenheiten während des Schlafes ausgenutzt, um Pathogene suffizient zu
bekämpfen. Klinische Beobachtungen verdeutlichen den engen Zusammenhang
zwischen Schlaf und Immunsystem. Beispielsweise leiden Patienten mit Insomnie
oder chronischen Schlafstörungen, genauso wie ältere Menschen, unter einer
verstärkten Anfälligkeit für Infektionen mit protrahiertem Heilungsverlauf
(Besedovsky et al., 2012; Zikorsky et al., 2001). Demgegenüber zeigten Lange
und Mitarbeiter, dass gesunder Schlaf im Gegensatz zu Schlafentzug nach einer
Hepatitis A-Impfung zu einer deutlich höheren Aktivität der antigenspezifischen T-
Helferzellen führt. Diese Veränderung der Immunlage konnte ein Jahr nach
erfolgter Impfung noch nachvollzogen werden (Lange et al., 2011).
Um in diesem in vitro-Modell schlafassoziierte hormonelle Verhältnisse und ihre
Einflüsse auf die Zytokinproduktion zu simulieren, erfolgte die Stimulierung und
Aktivierung der morgendlichen Vollblutproben nach Studienprotokoll. Die für die
SWS-Phasen charakteristischen Konzentrationen an GH und Cortisol wurden
erreicht. Dennoch limitieren einige Faktoren die Interpretation der Ergebnisse.
In vivo wird das Zytokinmilieu und die Aktivität dieser Mediatoren durch
verschiedene Faktoren beeinflusst, welche jedoch unter experimentellen
Bedingungen nicht reproduzierbar sind (Born et al., 1997; Dhabhar 2002; Dhabhar et al., 1994; von Andrian und Mackay 2000).
Dennoch gehen die vorliegenden Ergebnisse mit denen anderer Arbeitsgruppen
konform. Für die SWS-Phasen und für die erste Nachthälfte sind
Sekretionssteigerungen der proinflammatorischen Zytokine charakteristisch. So
beschrieben Petrovsky et al. ein Maximum der IFN-γ-Sekretion gegen 23 Uhr
(Petrovsky und Harrison 1997). Dieses Ergebnis stimmt mit denen anderer
Arbeitsgruppen überein, die für dieses Zytokin einen Höchstwert in der ersten
Nachthälfte postulieren (Dimitrov et al., 2004b; Petrovsky und Harrison 1998;
Petrovsky et al., 1998). Bisherige Forschungsergebnisse über die
proinflammatorischen Zytokine IL-1, IL-6, TNF-α, IL-2 und IL-12 bestätigen das
Vorliegen einer Th1-dominierten Immunantwort während des nächtlichen Schlafes
(Born et al., 1997; Gudewill et al., 1992; Irwin et al., 2000; Palm et al., 1996; Petrovsky et al., 1998; Zabel et al., 1993). Dimitrov und Mitarbeiter beschrieben
Diskussion
52
sogar einen Shift der Balance zugunsten von Th1, gemessen anhand der Zytokine
IFN-γ und IL-4 (Dimitrov et al., 2004b). Dies bekräftigt sich erneut im Rahmen der
vorliegenden Studie, indem unter einer schlafähnlichen Hormonkonstellation eine
Th1-Dominanz, allein durch die isolierte Zunahme von IFN-γ-produzierenden
CD4+ T-Helferzellen zu verzeichnen war. Die IL-4-Synthese wurde in diesem
hormonellen Milieu nicht signifikant beeinflusst. Zum anderen zeigt es, dass
Cortisol eine deutlich höhere immunmodulierende Potenz besitzt, als sein
Gegenspieler GH. Dies wird deutlich, indem GH nur durch parallele Drosselung
der Cortisolwirkung signifikante Effekte auf die Th1/Th2-Balance aufwies.
Die Kernfragen der Studie konnten anhand der erzielten Ergebnisse wie folgt
beantwortet werden:
1. Die Zugabe von GH in einer physiologischen Konzentration von 20 ng/ml zu
den morgendlichen Blutproben der Probanden führte zu einem signifikanten
Anstieg der IFN-γ-produzierenden CD4+ T-Helferzellen. Die Wirkung des Cortisols
auf die IFN-γ-produzierenden CD4+ T-Helferzellen wurde durch Blockade der MR
und GR untersucht. Dies führte zu einem signifikanten Anstieg der IFN-γ-
produzierenden CD4+ T-Helferzellen. Im Umkehrschluss führt Cortisol zu einem
signifikanten Abfall der IFN-γ-produzierenden CD4+ T-Helferzellen.
2. Durch die Zugabe von GH in einer physiologischen Konzentration von 20 ng/ml
zu den morgendlichen Blutproben der Probanden konnte kein signifikanter Effekt
auf IL-4-produzierende CD4+ T-Helferzellen gezeigt werden. Ebenfalls konnte
dem Cortisol durch Blockade von MR und GR kein signifikanter Einfluss auf die IL-
4-produzierenden CD4+ T-Helferzellen nachgewiesen werden.
3. Durch die Zugabe von GH in einer physiologischen Konzentration von 20 ng/ml
zu den morgendlichen Blutproben der Probanden konnte kein signifikanter Effekt
auf die Th1/Th2-Balance beobachtet werden. Lediglich durch die Blockade von
MR durch Spironolacton wurde die Th1/Th2-Balance signifikant zugunsten von
Th1 verschoben. Die Blockade von GR führte nur in Kombination mit GH zu einer
Diskussion
53
signifikanten Änderung dieses Gleichgewichtes in Richtung Th1-Dominanz. Im
Umkehrschluss führt Cortisol zu einem Umschwung der Th1/Th2-Balance zur Th2-
Dominanz, vermittelt durch MR.
Unabhängig von den anfangs gestellten Fragen führte die Auswertung der
vorliegenden Arbeit zu weiteren Kenntnissen, die sich wie folgt zusammenfassen
lassen:
1. Die Verschiebung der Th1/Th2-Balance erfolgt durch die Auswirkung des
Cortisols durch Änderungen der Th1-und nicht der Th2-Zytokinaktivität.
2. Cortisol entfaltet seine immunmodulierende Wirkung über MR und nicht über
GR.
3. Erhöhte GH- sowie erniedrigte Cortisol-Konzentrationen bewirken eine
vermehrte Synthese des Th1-Zytokins IFN-γ, die in einer Th1 dominierten
Immunantwort resultiert.
Im Rahmen dieser in vitro Studie ist es gelungen, schlafähnliche
Hormonverhältnisse zu simulieren. Diese führten, wie erwartet, zu einer
Verschiebung der Th1/Th2-Balance zugunsten der Th1-Zytokine. Dieses
Zytokinprofil ist essenziell für die proinflammatorische Immunantwort im Rahmen
einer Abwehrreaktion und spiegelt die Bedeutung des Schlafes bezüglich seiner
immunmodulierenden Eigenschaften wider.
Um die Aussagen der vorliegenden Arbeit zu verifizieren, sollten weiterführende
Studien durchgeführt werden. Unter anderem wäre es sinnvoll, die Blutentnahme
während der SWS Phasen durchzuführen, um zu eruieren, ob eine
Reproduzierbarkeit der Ergebnisse möglich ist. Weiterhin könnten physiologische
Stimuli der Zytokinsynthese, wie z. B. Staphylokokkus Enterotoxin B verwendet
werden.
Zusammenfassung
54
5. Zusammenfassung
Eine suffiziente Immunabwehr ist essenziell für das Überleben eines Organismus
in einer Umwelt verschiedenster gesundheitlicher Herausforderungen. Ein
ausgewogenes Verhältnis zwischen Th1-und Th2-Zytokinen, welches auf den
immunologischen Reiz optimal abgestimmt sein sollte, ist hierbei von
herausragender Bedeutung. Die Steuerung einer Immunantwort unterliegt
komplexen Regulationsmechanismen, wobei das endokrine System eine wichtige
Instanz darstellt. Hierbei übernehmen Cortisol und GH als Immunmodulatoren
eine wichtige Rolle.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Auswirkung physiologischer
Konzentrationen des humanen Wachstumshormons (GH) und des Cortisols auf
das Immunsystem, insbesondere auf die Balance der Th1/Th2-Zytokine unter in
vitro-Bedingungen zu untersuchen. Als repräsentative Parameter dienten IFN-γ-
bzw. IL-4-produzierende CD4+ T-Helferzellen. Die Wirkung des GH wurde direkt
durch dessen Zugabe bestimmt, während die Messung der Cortisoleffekte indirekt
über Blockade der Glukokortikoid- und Mineralokortikoidrezeptoren erfolgte.
Vollblutproben von 15 gesunden jungen Männern wurden durch Ionomycin und
PMA in An- und Abwesenheit folgender Substanzen stimuliert: GH, RU-486 (GR-
Antagonist), Kombination aus GH und RU-486 sowie Spironolacton (MR-
Antagonist). Die intrazelluläre Zytokinproduktion wurde mittels eines
Durchflusszytometers gemessen.
Unter Administration von GH wurde lediglich eine signifikante Steigerung der IFN-
γ-produzierenden CD4+ T-Helferzellen beobachtet. Die IL-4-produzierenden CD4+
T-Helferzellen sowie die Th1/Th2-Balance blieben unbeeinflusst.
Die Kombination von GH und RU-486 führte zu einer signifikanten Zunahme der
IFN-γ-produzierenden CD4+ T-Helferzellen, durch Ausbleiben einer signifikanten
Änderung IL-4-produzierender CD4+ T-Helferzellen in einer signifikanten Th1-
Dominanz resultierte.
Nach Blockade von MR und GR durch die Zugabe von Spironolacton bzw. RU-486
Zusammenfassung
55
wurde eine signifikante Synthesesteigerung IFN-γ-produzierender CD4+ T-
Helferzellen protokolliert. Jedoch führte keine der zugesetzten Substanzen zu
einer signifikanten Änderung IL-4-produzierender CD4+ T-Zellen. In Bezug auf die
Th1/Th2-Balance zog ausschließlich Spironolacton eine signifikante Verschiebung
zugunsten der Th1-Dominanz nach sich.
Zudem konnte gezeigt werden, dass Cortisol seine immunmodulatorische Wirkung
hauptsächlich über MR und nicht über GR entfaltet.
Die Dysbalance zugunsten des Th1-Zytokinprofils resultiert primär durch Zunahme
des Th1-Zytokins IFN-γ- und nicht durch Veränderungen der IL-4-Synthese.
Die oben genannten Erkenntnisse wurden durch Simulation schlafähnlicher
Hormonkonstellationen gewonnen. Durch niedrige Cortisolspiegel und hohe GH-
Konzentrationen, die für die ersten Stunden des Schlafes charakteristisch sind,
entstand ein proinflammatorisches Zytokinprofil durch eine gesteigerte IFN-γ-
Synthese. Dies verdeutlicht die Notwendigkeit eines geregelten Schlaf-Wach-
Rhythmus für einen suffizienten und ungestörten Ablauf immunologischer
Prozesse.
Die Möglichkeit durch fundiertes Wissen auf dem Gebiet der Immunologie
Abwehrreaktionen von extern beeinflussen oder gar steuern zu können, ist
wichtiger Bestandteil der heutigen Forschung. Auch im Rahmen der Therapie von
Immunerkrankungen zeigt sie neue Möglichkeiten auf.
Bis dato sind jedoch nicht alle Zusammenhänge und Wirkmechanismen bekannt
und bedürfen weiterer klinischer Erforschung. Besonderes Augenmerk sollte dabei
den möglichen Therapieansätzen immunbedingter Erkrankungen gelten.
Literturverzeichnis
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Anhang
82
7. Anhang
Anhang
83
Danksagung
84
8. Danksagung
An erster Stelle möchte ich meinem Doktorvater, Herrn Professor Dr. med. J. Born
für die Überlassung des Promotionsthemas herzlich danken. Insbesondere
bedanke ich mich für das nochmals entgegenbrachte Vertrauen, mit dieser Arbeit
promovieren zu dürfen.
Zu tiefem Dank bin ich Frau Dr. med. T. Lange und Herrn Dr. Dipl.- Biol. S.
Dimitrov für die fürsorgliche Betreuung im Rahmen des experimentellen
Abschnittes verpflichtet. Ihre Geduld und das Engagement in der langen
Erstellungsphase dieser Promotionsarbeit möchte ich an dieser Stelle
hervorheben.
Mein besonderer Dank gilt Professor Dr. med. Dr. med. dent. P. Sieg, Direktor der
Klinik für Kiefer- und Gesichtschirurgie sowie meinen Kollegen, die mich in der Zeit
meines Zweitstudiums und während der Fertigstellung dieser Arbeit entlasteten.
Ferner bedanke ich mich bei Frau C. Zinke und A. Otterbein für die technische
Beratung während der Durchführung des labormedizinischen Teils der Arbeit.
Herrn Privatdozent Dr. Dipl.-Ing. P. D. Sindilariu bin ich für die kompetente
Beratung und Hilfe bei der statistischen Auswertung sehr verbunden.
Ich danke auch meiner Kondoktorandin und Freundin Frau W. Becker für die
wunderbare Zusammenarbeit im einsamen Labor.
Nicht zuletzt möchte ich Dir Attila für die konstruktive Kritik bei der Überarbeitung
des Manuskriptes, Deine liebevolle Unterstützung und dein Verständnis in den
vergangenen Jahren danken. Ohne Deine nahezu endlose Geduld hätte ich diese
Arbeit wohl nicht mehr fertig gestellt.
Lebenslauf
85
9. Lebenslauf
Persönliche Daten
Name: Wolf
Vorname: Melanie
Geburtsdatum: 26.09.1977
Geburtsort: Neubrandenburg
Staatsangehörigkeit: deutsch
Familienstand: ledig
Schulausbildung und beruflicher Werdegang
1984 -1989 Gesamtschule Polytechnische Oberschule Dessau
1989 -1997 Fürst Franz Gymnasium Dessau
1997 Abitur
10/1997-10/2005 Studium der Humanmedizin am Universitätsklinikum
Schleswig-Holstein, Campus Lübeck
10/2005 Approbation als Ärztin
seit 11/2005 Tätigkeit als wissenschaftliche Assistentin in der Klinik für
Kiefer- und Gesichtschirurgie am Universitätsklinikum
Schleswig-Holstein, Campus Lübeck
10/2006 -11/2011 Studium der Zahnmedizin an der Universität Hamburg und
an der CAU Kiel
11/2011 Approbation als Zahnärztin
Lübeck, den 28.06.2012
Veröffentlichung der Arbeitsergebnisse
86
10. Veröffentlichung der Arbeitsergebnisse
Dimitrov S, Lange T, Fehm HL, Born J: A regulatory role of prolactin, growth
hormone, and corticosteroids for human T-cell production of cytokines. Brain
Behav Immun 18(4), 368-74 (2004)