Aus der Abteilung Plastische und Handchirurgie

Chirurgische Universitaumltsklinik der Albert-Ludwigs-

Universitaumlt Freiburg i Br

Wundheilung von Vollhautdefekten durch Kombination einer autologen

Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS) mit einer dermalen

Matrix mit und ohne Fibroblasten - ein Kurz- und Langzeitversuch am

Schweinemodell

I N A U G U R A L ndash D I S S E R T A T I O N

Erlangung des Medizinischen Doktorgrades

der Medizinischen Fakultaumlt

der Albert-Ludwigs-Universitaumlt

Freiburg im Breisgau

Vorgelegt 2003

Von Friedrich Knam

Geboren in Baden-Baden

Dekan Prof Dr med J Zentner

1 Gutachter Prof Dr med GB Stark

2 Gutachter PD Dr med M Augustin

Jahr der Promotion 2005

1 EINLEITUNG 3

11 Allgemeines 3

12 Hautersatzstrategien 4 121 Anforderungen an einen Hautersatz 4 122 Temporaumlrer Hautersatz 5 123 Definitiver Hautersatz 6 124 Bedeutung der dermalen Matrix 7 125 Komposit-Hautersatz 8

13 Versuchstier Schwein 8

14 Fragestellung 9

2 METHODIK 11

21 Uumlberblick 11

22 Zellkultivierung 15 221 Kultivierung der Schweinekeratinozyten 15

2211 Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFKS) 17 222 Etablierung der Schweinefibroblastenkultur 18

2221 Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS) 19 2222 Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten mit Fluospheresreg 19

223 Verwendung des humanen und des porcinen Dermisersatzes (AlloDermreg) 20

23 Tierversuchsdurchfuumlhrung 23 231 Operation 23 232 Hautentnahme zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblasten 26 233 Taumltowierung und Transplantation 27 234 Verlauf des Kurz- und Langzeitexperiments postoperativ 29 235 Planimetrie zur Bestimmung der Wundkontraktion 29 236 Bestimmung der Einheilungsrate und des Wundverschlusses 31 237 Untersuchung der Hautqualitaumlt mit einer Saugsonde 31

24 Histologische Untersuchungen 33 241 Klassische Lichtmikroskopie 33 242 Immunhistochemie 33

2421 Nachweis der rekonstituierten Basalmembran 33 2422 Nachweis von Myofibroblasten 34

243 Bewertung der Reteleisten 35

25 Statistik und Computerprogramme 35

3 ERGEBNISSE 36

31 Praumloperative Zellkultivierung 36

32 Verlauf des Tierversuchs 36 321 Operation 36 322 Versuchsverlauf 38

33 Makroskopische Wundheilung Wundkontraktion und Elastizitaumltsbestimmung 39 331 Einheilung der Transplantate 39 332 Wundverschluss 40 333 Die makroskopische Wundheilung 41

3331 KFGS-Gruppe 42

3332 F-KFGS-Gruppe 43 3333 hAD-Gruppe 44 3334 hAD+F-Gruppe 44 3335 pAD-Gruppe 45 3336 pAD+F-Gruppe 46

334 Planimetrische Auswertung der Kontraktion 46 335 Bestimmung der Elastizitaumlt der Wunden mit der Vakuumsonde 50

34 Histologische Resultate 52 341 Klassische Lichtmikroskopie 52

3411 Ergebnisse der Gruppen 52 3412 Nachweis der markierten Fibroblasten auf dem Dermisersatz in vitro 57

342 Immunhistochemie 58 3421 Nachweis der rekonstituierten Basalmembran 58 3422 Nachweis von Myofibroblasten 60

4 DISKUSSION 62

41 Allgemeine Gegebenheiten 62

42 Geschichte 62 421 Keratinozytenkultivierung und die Entwicklung von bdquosheet graftsldquo 62 422 Verschiedene Traumlgermaterialien 64 423 Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension 65 424 bdquocomposite-graftsldquo 65 425 Bedeutung der Fibroblasten in der Wundheilung 67

43 Eigenes Projekt Vollhautersatz durch kultivierte autologe Keratinozyten als Suspension in Fibrinkleber in Kombination mit einer dermalen Matrix mit und ohne Fibroblasten 68

431 Wundkontraktion 69 432 Vaskularisieung des Transplantats 70 433 Reepithelisierung 71 434 Basalmembrankomplex 71 435 Elastizitaumltsbestimmung 72

44 Schlussfolgerungen 74

5 WEITERE ANSAumlTZE UND AUSBLICKE 75

6 ZUSAMMENFASSUNG 76

7 LITERATURVERZEICHNIS 77

8 VEROumlFFENTLICHUNGEN 83

9 LEBENSLAUF 84

10 DANKSAGUNG 85

1 Einleitung

11 Allgemeines

Jaumlhrlich beduumlrfen Tausende von Brandverletzten sowie Hunderttausende von

Patienten mit chronischen Wunden unterschiedlicher Genese eines

Wundverschlusses um Fluumlssigkeits- und Elektrolytverluste Infektionen

Stoffwechselentgleisungen Schmerzen und Amputationen zu verhindern

Allein die Kosten fuumlr die stationaumlre Behandlung von Schwerbrandverletzten an den

deutschen Zentren fuumlr Brandverletzte betragen jaumlhrlich mehrere hundert Millionen

Euro bei Tagessaumltzen zwischen 2000 und 4000 Euro Die Kosten fuumlr die Behandlung

chronisch nicht heilender Wunden bei Diabetes Mellitus und arterieller

Verschlusskrankheit sowie venoumls bedingter Ulzera und Dekubitalulzera die mit

steigendem Alter vermehrt auftreten gehen in die Milliarden [Kremer und Berger

2000] Mit demographisch zunehmendem Lebensalter der Bevoumllkerung ist zu

erwarten dass diese Zahlen noch steigen werden Somit ist den Entwicklungen auf

dem Gebiet kuumlnstlicher Hautersatzverfahren eine wesentliche medizinische und

wirtschaftliche Bedeutung beizumessen Waumlhrend die initiale Schockphase bei

ausgedehnten drittgradigen Verbrennungen dank der modernen

intensivmedizinischen Maszlignahmen in der Regel uumlberlebt werden kann ist die

weitere Prognose hauptsaumlchlich von dem fruumlhzeitigen Ersatz des verlorenen

Gewebes abhaumlngig

Seit uumlber hundert Jahren bedienen sich Chirurgen der autologen Vollhaut- oder

Spalthauttransplantation [Reverdin 1872] Daruumlber hinaus kam waumlhrend des zweiten

Weltkrieges vermehrt die Idee auf einen kuumlnstlich hergestellten Hautersatz

einzusetzen [Ciaschini und Bernard 2001] Der Nachteil bei den autologen

Hauttransplantationen besteht darin dass an den Spenderstellen eine

Hebedefektmorbiditaumlt entsteht und dies ein zusaumltzliches Trauma bedeutet

Auszligerdem wird die Deckung ausgedehnter exzidierter Brandwunden

natuumlrlicherweise durch die Menge der verfuumlgbaren Hautspenderareale des Patienten

begrenzt So kann eine plastische Deckung des Hautverlustes ab etwa 70 Prozent

der Koumlrperoberflaumlche nicht mehr durch patienteneigene Haut alleine erzielt werden

[Muhlbauer et al 1995]

Eine weitere Moumlglichkeit zur Behandlung von Verbrennungswunden ist die

Verwendung von Leichenhaut Auf diesem Gebiert leistete Medawar in den 30er und

40er Jahren Pionierarbeit Er erhielt fuumlr seine Arbeit auf dem Gebiet der erworbenen

Immuntoleranz nach Hauttransplantation 1960 den Nobelpreis fuumlr Medizin [Medawar

1961] Hauptprobleme bei der Verwendung von Leichenhaut sind die

Abstoszligungsreaktionen und die Gefahr der Uumlbertragung von Krankheitserregern wie

Hepatitsviren oder HIV

Durch die Errungenschaften in den letzten Jahrzehnten auf dem Gebiet der in vitro

Kulturtechniken entstanden neue Moumlglichkeiten zur Schaffung eines Hautersatzes

Rheinwald und Green gelang durch die Kultivierung von Keratinozyten bereits 1975

die Herstellung von mehrlagigen Epithelschichten im Labor [Rheinwald und Green

1975] Die erste Transplantation eines derartigen Hautersatzes auf einen Menschen

wurde bereits ein paar Jahre spaumlter durch OrsquoConnor 1981 durchgefuumlhrt [Gallico et al

1984] Die Haut war somit das erste mittels bdquoTissue Engineeringldquo hergestellte Organ

Ziel des bdquoTissue Engineeringldquo ist die Regeneration von Gewebe mit normaler

Anatomie und Funktion

Anfaumlngliche Euphorie wurde jedoch gedaumlmpft da es trotz intensiver Bemuumlhungen

weltweit bis dato nicht gelungen war einen Hautersatz zu schaffen der in saumlmtlichen

Eigenschaften wie beispielsweise Stabilitaumlt und Aumlsthetik der natuumlrlichen Haut

entsprach

12 Hautersatzstrategien

121 Anforderungen an einen Hautersatz Die Anforderungen an einen biotechnologisch hergestellten Hautersatz muumlssen sich

an den Eigenschaften menschlicher Haut orientieren Dieser muss zudem die

Faumlhigkeit besitzen mit dem Wundbett in physiologischer Weise zu interagieren Der

ideale kuumlnstliche Hautersatz sollte eine gute Adhaumlrenz an das Wundbett und eine

Keimbarriere gewaumlhrleisten Er sollte einen Schutz vor Fluumlssigkeitsverlust bieten und

zur Temperaturregulation beitragen Auszligerdem stimuliert der optimale Hautersatz die

Wundheilungsvorgaumlnge und verhindert eine ausgepraumlgte Narbenbildung Zudem soll

die bdquoneueldquo Haut langfristig zufriedenstellende Ergebnisse liefern was die

mechanische und aumlsthetische Qualitaumlt angeht [Ruszczak und Schwartz 2000 Schulz

et al 2000 Boyce 2001]

Zahlreiche Hautersatzverfahren sind bis heute entwickelt worden und auch

kommerziell erhaumlltlich Grundsaumltzlich lassen sich diese in einen temporaumlren und

einen definitiven Hautersatz unterteilen

122 Temporaumlrer Hautersatz Hierbei soll ein sicherer und stabiler temporaumlrer Wundverschluss erreicht werden

bis entweder Spenderareale fuumlr eine erneute Nutzung zur Spalthautentnahme zur

Verfuumlgung stehen oder aber bis zur Kultivierung ausreichend groszliger epithelialer

Transplantate aus den Hautbiopsien eines Brandverletzten Zu dieser Gruppe gehoumlrt

die homologe Fremdhaut die den besten verfuumlgbaren temporaumlren Wundverschluss

darstellt Das groumlszligte Risiko der Fremdhauttransplantation ist die Uumlbertragung von

Infektionskrankheiten Fremdhaut wird in aller Regel von Leichen gewonnen Frische

Fremdhaut besitzt eine sehr gute Barrierefunktion und hat eine guumlnstige Wirkung auf

die Heilung Die kosmetischen Ergebnisse sind bei Anwendung von zweitgradigen

Verbrennungen sehr gut Probleme bestehen in den antigenen Eigenschaften die

innerhalb von 3 bis 4 Wochen zu einer Abstoszligung fuumlhren Die Aufbewahrung uumlber

eine Woche hinaus macht die Kryokonservierung erforderlich wobei die antigenen

Eigenschaften erhalten bleiben Derzeit wird an den meisten deutschen

Verbrennungszentren glycerolkonservierte Haut verwendet die von der Euro Skin

Bank in Beverwijk Niederlande bezogen wird [Horch et al 1994] Sie kann bei 4 degC

gelagert werden und ist im Gegensatz zu frischer und kryokonservierter Haut avital

Waumlhrend des Konservierungsprozesses gehen sowohl die dermalen als auch die

epidermalen Zellen zugrunde Dies fuumlhrt zu einer Reduzierung der antigenen

Eigenschaften [Germann und Raff 1995]

Das Intervall bis ein definitiver Wundverschluss moumlglich ist kann anstelle von

Fremdhaut auch mit allogenen Keratinozytentransplantaten uumlberbruumlckt werden

[Hefton et al 1983] Eine akute Abstoszligung der Fremdkeratinozyten kommt nach

Eldad et al (1987) nur gelegentlich vor und das Risiko der Uumlbertragung von

Infektionen ist geringer [Eldad et al 1987] Entscheidend fuumlr das Uumlberleben der

Fremdkeratinozyten wie grundsaumltzlich aller Transplantate ist der Wundgrund Tief

dermale und tiefere Wunden fuumlhren zu einem fruumlheren Verlust als

Spalthautentnahmestellen mit vorhandener Dermis [Germann und Raff 1995]

Als weitere Moumlglickeiten des temporaumlren Hautersatzes sind Integrareg (Integra

Lifesciences Corporation USA) und TransCytereg (fruumlher Dermagraft-TC Advanced

Tissue Sciences Inc USA) zu nennen Integrareg ist ein synthetischer Hautersatz der

groumlszligtenteils aus dreidimensionalem feinporigem bovinem Kollagen sowie aus

Chondroitin-6-Sulfat besteht Zusaumltzlich beinhaltet Integrareg eine Silikonschicht als

temporaumlrer Epidermisersatz die vor Austrocknung und Infektion schuumltzen soll

Integrareg wird schon seit laumlngerer Zeit eingesetzt und hat sich in zahlreichen

klinischen Studien bewaumlhrt [Burke et al 1981 Heimbach et al 1988 Berger et al

TransCytereg besteht aus einer nicht resorbierbaren Nylonmatrix und einer durch

vitale humane Fibroblasten synthetisierten Kollagenmatrix Bei Applikation enthaumllt

das Produkt keine lebenden Fibroblasten mehr lediglich die extrazellulaumlren

Strukturen bleiben erhalten Im Vergleich mit kryokonservierter Leichenhaut zeigte

Transcytereg gleiche Einheilungsergebnisse [Hansbrough et al 1997] Von den

Wunden laumlsst es sich leichter wieder abloumlsen als allogener Hautersatz und fuumlhrt

dabei zu geringeren Blutungen [Purdue et al 1997]

123 Definitiver Hautersatz Zur Gruppe der Hautersatzverfahren die einen definitiven Wundverschluss erzielen

sollen gehoumlren die sogenannten Cultured Epithelial Autografts (CEAlsquos) bestehend

aus mehreren Lagen autologen Keratinozyten Vorteile dieser Methode sind die

Vermeidung einer Abstoszligung sowie der Ausschluss einer Infektionsuumlbertragung

[Gallico et al 1984] Als Nachteile sind die schwierige Handhabung der CEAlsquos

wegen der hohen Fragilitaumlt und die Ausbildung einer mechanisch nur wenig

belastbaren Haut aufgrund des Fehlens der dermalen Komponente mit einer schlecht

ausgebildeten Basalmembran zu nennen Auszligerdem wird eine relativ lange

Zeitdauer zur Herstellung der CEAlsquos benoumltigt [Woodley et al 1988 Munster et al

1990 Kaiser et al 1994 Poumay et al 1994 Stark und Kaiser 1994 Stark et al

1995 Bannasch et al 2000]

Eine moumlgliche Alternative hierzu stellen kultivierte autologe Keratinozyten als

Suspension in Fibrinkleber dar (Keratinocyte-Fibrin-Glue-Suspension bdquoKFGSldquo)

Dieses Verfahren fand bereits mehrfach seine erfolgreiche klinische Anwendung

[Kaiser et al 1994 Stark und Kaiser 1994 Stark et al 1995] Die Applikation von

KFGS ist technisch einfach durchzufuumlhren Weitere Vorteile im Vergleich mit den

CEAlsquos bestehen in der rascheren Verfuumlgbarkeit der subkonfluenten autologen

Keratinozyten durch eine verkuumlrzte Kultivierungszeit und eine erhoumlhte

Proliferationsbereitschaft der nicht kontaktinhibierten Einzelzellen Eine weitere

Applikationsmoumlglichkeit ist das Aufspruumlhen einer Keratinozytensuspension Es wurde

gezeigt dass die Behandlung von Vollhautwunden mit Spalthauttransplantaten und

einer aufgespruumlhten Keratinozytensuspension zu einer schnelleren Reepithelisierung

fuumlhrte als die Verwendung von Spalthauttransplantaten die nur mit Kulturmedium

ohne Zellen bespruumlht wurden [Wood und Stoner 1996 Navarro et al 2000] Vorteile

gegenuumlber der Verwendung herkoumlmmlicher CEArsquos die in Plastikkulturflaschen

kultiviert werden bestehen in der Verwendung einer Fibrinmatrix auf der die

Keratinozyten ebenfalls kultiviert werden koumlnnen Hierbei entfaumlllt das komplizierte

Abloumlsen der fragilen Haumlutchen vom Flaschenboden und die Handhabung wird

erheblich erleichtert [Ronfard et al 1991 De Luca et al 1992]

124 Bedeutung der dermalen Matrix Neben dem epidermalen Anteil eines Hautersatzes spielt auch der dermale Anteil

eine wichtige Rolle Die Bedeutung einer dermalen Matrix bei der Behandlung von

drittgradigen Verbrennungswunden bei denen die Lederhaut zerstoumlrt ist wurde

durch zahlreiche wissenschaftliche Arbeiten und klinische Studien bestaumltigt [Livesey

et al 1995 Wainwright 1995 Gustafson und Kratz 1999] Durch den Einsatz einer

dermalen Matrix wird die Bildung von Granulationsgewebe gehemmt und die

Wundkontraktion reduziert Auszligerdem fuumlhrt sie durch die Bildung von

Verankerungsstrukturen zwischen Oberhaut und Lederhaut zu einer mechanisch

belastbaren Neodermis [Brown et al 1990 Medalie et al 1997 Coulomb et al

Das in der vorliegenden Studie verwendete AlloDermreg (LifeCell Corporation USA)

wird aus dezellulierter Leichenhaut durch ein patentiertes Verfahren gewonnen und

ist durch die Moumlglichkeit der Gefriertrocknung langfristig haltbar gemacht worden

[Wainwright 1995] Eine Abstoszligungsreaktion findet aufgrund des Fehlens von MHC-I

und MHC-II-Antigenen nicht statt Auf das Wundbett aufgebracht soll die Matrix von

ortsstaumlndigen Bindegewebszellen besiedelt und vaskularisiert werden [Nanchahal

und Ward 1992] und die Bildung von Granulationsgewebe wird verhindert

[Ruszczak und Schwartz 2000] Ein Nachteil besteht darin dass das AlloDermreg

wegen der geringen Spenderanzahl nicht unbegrenzt zur Verfuumlgung steht Moumlgliche

Indikationen fuumlr AlloDermreg sind drittgradige Verbrennungswunden ausgedehnte

vollschichtige Hautdefekte und die Unterfuumltterung von Weichteilkonturdefekten in der

aumlsthetisch plastischen Chirurgie

125 Komposit-Hautersatz Da die Anspruumlche an einen kuumlnstlichen Hautersatz immer houmlher werden gewinnen

die vielversprechenden Komposit-Verfahren zunehmend an Bedeutung Sie

bestehen aus einem epidermalen und einem dermalen Anteil und haben von allen

Ersatzverfahren mit der Architektur der gesunden Haut die groumlszligte Aumlhnlichkeit

Untersuchungen belegten die wechselseitige stimulierende Wirkung von Epidermis

und Dermis und fuumlhren zur Ausbildung einer stabilen neuen Haut [Woodley et al

1988] Zwar sind diese Verfahren bislang technisch sehr aufwaumlndig und mit hohen

Kosten verbunden doch sprechen die Vorteile einer rascheren Reepithelisierung und

einer verminderten Wundkontraktion fuumlr sich [Cuono et al 1986 Wainwright 1995

Medalie et al 1996 Rennekampff et al 1997 Walden et al 2000] Ein noch

ungeloumlstes Problem dieser Verfahren stellt die Vaskularisierung des Transplantates

dar die im Wesentlichen von deren Dicke abhaumlngt [Kremer und Berger 2000]

Duumlnnere Transplantate werden schneller revaskularisiert und sichern somit die

Durchblutung des Praumlparates und das Uumlberleben der oberflaumlchlichen epidermalen

Zellen [Xu et al 1996] Dickere Transplantate fuumlhren jedoch zu besseren

Wundheilungsergebnissen mit beispielsweise einer geringeren Wundkontraktion und

besseren aumlsthetischen Ergebnissen

13 Versuchstier Schwein

Anatomisch und physiologisch gesehen ist die Haut und die Wundheilung des

Schweines der des Menschen sehr aumlhnlich Andere Saumlugetiere wie beispielsweise

Maumluse haben nach wie vor ihren unbestrittenen Platz in der wissenschaftlichen

Erforschung der Grundlagen des Hautersatzes Allerdings spielt bei ihnen die

Wundkontraktion die groumlszligte Rolle in der Wundheilung beim Schwein wie auch beim

Menschen steht jedoch die Reepithelisierung im Vordergrund Weitere

Gemeinsamkeiten zwischen porciner und humaner Haut sind eine aumlhnlich dicke

Epidermis und Dermis mit einem vergleichbaren Verhaumlltnis zueinander (zwischen

110 und 113) gut ausgebildete Reteleisten im Bereich des dermo-epidermalen

Uumlberganges und biochemisch vergleichbares porcines und humanes dermales

Kollagen [Vardaxis et al 1997 Sullivan et al 2001] Zudem kann pro Tier eine

groumlszligere Anzahl Biopsate und damit erheblich mehr wissenschaftlicher Aufschluss

gewonnen werden So koumlnnen mit einem solchen Modell nicht nur interindividuelle

sondern auch intraindividuelle Probenvergleiche erfolgen

14 Fragestellung

Ziel der vorliegenden Studie war die Untersuchung eines Vollhautersatzes durch

bdquoTissue Engineeringldquo am Wundheilungsmodell des Schweines

Die Arbeitsgruppe untersuchte bereits in der Vergangenheit die Moumlglichkeit des

Hautersatzes durch die einzeitige Applikation von kultivierten Keratinozyten als

Suspension in Fibrin in Kombination mit einer dermalen Matrix Die hierbei etablierte

Methode sollte in der vorliegenden Arbeit weiterentwickelt und -wenn moumlglich-

optimiert werden Fuumlr die Vertiefung dieser Methode spricht die Moumlglichkeit der

vergleichsweise einfachen Herstellung eines Komposit-Hautersatzes in vivo

bestehend aus einem epidermalen und dermalen Anteil Dies ist vor allem bei einem

klinischen Einsatz von Vorteil Als dermaler Ersatz dient prozessierte Leichendermis

die auf dem freien Markt unter dem Namen AlloDermreg erhaumlltlich ist Der epidermale

Anteil besteht aus einer in vitro einfach herzustellenden Keratinozyten-Fibrin-

Suspension Beide Anteile werden erst intraoperativ zusammengebracht Auf die

Konstruktion aufwendiger Konstrukte in vitro kann somit verzichtet werden

Zur Optimierung des bestehenden Verfahrens wurden die Transplantate mit

autologen dermalen Fibroblasten inokuliert Somit entstand ein Hautersatz aus

dermaler Matrix inklusive Fibroblasten kombiniert mit einer Keratinozyten-Fibrin-

Suspension Untersucht werden sollte ob und wie die zusaumltzliche Applikation der

Fibroblasten den Prozess der Wundheilung beeinflusst Mehrere Studien weisen auf

einen positiven Einfluss von Fibroblasten auf die Wundheilung wie beispielsweise

die Reepithelisierung und Wundkontraktion hin [Lamme et al 1998 Svensjo et al

Auszligerdem kam neben der bereits untersuchten dermalen Matrix humanen Ursprungs

ein porciner Dermisersatz zum Einsatz Hierbei sollte durch den Vergleich eines

humanen Produkts mit einem porcinen Produkt am Schweinemodell untersucht

werden ob die Verwendung der homologen Matrix im Vergleich zu der heterologen

Matrix zu besseren Heilungsergebnissen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]

Des Weiteren sollten neue Erkenntnisse aus einem Langzeitversuch gewonnen

werden Vergleichbare tierexperimentelle Studien wurden bisher uumlberwiegend uumlber

Versuchszeitraumlume von 4 Wochen durchgefuumlhrt In dieser Studie wurde der

Wundheilungsverlauf erstmalig uumlber einen Zeitraum von 6 Monaten untersucht um

festzustellen wie die bdquoneueldquo Haut uumlber einen laumlngeren Zeitraum hinweg den

alltaumlglichen Belastungen standhaumllt Vor Beendigung des Versuchs wurde die

Hautqualitaumlt mit Hilfe eines biomechanischen Tests untersucht

2 Methodik

21 Uumlberblick

In der vorliegenden Studie wurden kultivierte Keratinozyten in Form einer

Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS) zusammen mit einer dermalen Matrix

auf Vollhautwunden von Hausschweinen transplantiert Als dermale Matrix diente

AlloDermreg humanen Ursprungs (hAD) und AlloDermreg porcinen Ursprungs (pAD)

Zusaumltzlich wurde ein Teil der dermalen Matrices sowohl humanen als auch porcinen

Ursprungs vor der Transplantation mit kultivierten autologen dermalen Fibroblasten

inokuliert (hAD+F und pAD+F)

Als Kontrollen dienten Wunden die nur mit KFGS bzw nur mit einer Fibroblasten-

Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS) behandelt wurden

Es ergaben sich folgende Transplantatgruppen

- Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS)

- Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS)

- humanes AlloDermreg mit KFGS (hAD KFGS)

- humanes AlloDermreg plus Fibroblasten mit KFGS (hAD+F KFGS)

- porcines AlloDermreg mit KFGS (pAD KFGS)

- porcines AlloDermreg plus Fibroblasten mit KFGS (pAD+F KFGS)

Insgesamt wurden 9 Tiere operiert mit je 6 Wunden pro Tier

Auf allen Tieren wurden 2 der 6 Wunden mit den Kontrollgruppen versehen (KFGS

und F-KFGS ohne dermale Matrix) Die restlichen 4 Wunden wurden mit den

dermalen Matrices mit und ohne Fibroblasten und KFGS behandelt (s Abb 2-1) Die

Anordnung der Transplantate erfolgte randomisiert

Schwanz Kopf pAD KFGS

hAD KFGS

F-KFGS

pAD+F KFGS

hAD+F KFGS

Abb2-1 Schematische Darstellung zur Anordnung der Transplantate auf dem Ruumlcken eines Schweines KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten pAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg plus Fibroblasten

Bei allen Tieren erfolgte fuumlr mindestens 4 Wochen nach der Transplantation eine

Wunddokumentation 5 Tiere schieden nach diesem Zeitraum aus dem Versuch aus

4 Tiere wurden fuumlr weitere 5 Monate beobachtet (Langzeittierversuch uumlber insgesamt

6 Monate)

Zur Gewinnung der Zellen wurde jedem Tier eine spindelfoumlrmige etwa 10 cmsup2 groszlige

Hautprobe an der Flanke entnommen Die Epidermis wurde enzymatisch von der

Dermis separiert Aus der Epidermis wurde unter serumfreien Kulturbedingungen

eine Keratinozyten-Primaumlrkultur angelegt Die Dermis diente der Gewinnung der

Fibroblasten die in serumhaltigen Medium kultiviert wurden Nach einer

Kultivierungszeit von 14 ndash 21 Tagen wurden die Transplantation vorbereitet Die

Fibroblasten wurden 4 Tage vor der Transplantation auf die Unterseite einer dermale

Matrix (AlloDermreg) ausgesaumlt Die Fibrin-Zell-Suspension wurde am Tag der

Transplantation hergestellt In die Thrombinkomponente eines handelsuumlblichen

Fibrinklebers wurden die Keratinozyten und die Fibroblasten aufgezogen und somit

die Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS) und die

Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hergestellt

In Inhalationsnarkose wurden die Wundraumlnder mittels einer Taumltowiermaschine

markiert um somit eine Verlaufskontrolle der Wundkontraktion zu haben

Anschlieszligend wurden pro Tier jeweils sechs 5 x 5 cm groszlige Exzisionswunden bis

auf die Muskelfaszie auf dem Ruumlcken gesetzt die eine Nekrektomie von tiefen

Verbrennungswunden simulierten Die Behandlung der Exzisionswunden erfolgte mit

den bereits beschriebenen Transplantatgruppen (s oben Abb 2-1)

Der makroskopische Wundheilungsverlauf wurde bei allen Tieren fotografisch und

planimetrisch uumlber den gesamten Versuchszeitraum dokumentiert Mit diesen Daten

wurden die Einheilung der Transplantate der Wundverschluss und die

Wundkontraktion ausgewertet

Die mikroskopische Beurteilung erfolgte mittels Biopsien die an den post-OP Tagen

7 14 und 28 bzw bei den Tieren des Langzeitversuchs zusaumltzlich nach 6 Monaten

entnommen wurden Zur klassischen Lichtmikroskopie wurden fuumlr Haumlmatoxilin-Eosin

Elastica-van-Gieson- und Trichrom-Faumlrbungen Biopsieproben formalinfixiert

Auszligerdem wurde von den in fluumlssigem Stickstoff schockgefrorenen Biopsieteilen

Kryoschnitte fuumlr immunhistochemische Untersuchungen angefertigt Mit der

indirekten Immunperoxidasetechnik wurde zum Nachweis der rekonstituierten

Basalmembran Kollagen-VII zum Nachweis von Myofibroblasten αminussm-Aktin

angefaumlrbt

Zudem wurde die Elastizitaumlt der verschiedenen Transplantat-Gruppen bei den Tieren

des Langzeitversuchs nach 6 Monaten mittels eines biomechanischen Tests

(Cutometerreg MPA580 Fa CourageampKhazaka Koumlln) untersucht

Abbildung 2-2 Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus

Histologische und morphometrische Auswertung aller Tiere

Langzeittiere auf dem Bauernhof

Applikation der Fibrin-Zell-Suspension auf die bereits eingenaumlhte dermale Matrix

Zellkultivierung fuumlr 21 Tage

bdquoZellernteldquo nach Trypsinierung

Wundverschluszlig der einzelnen Gruppen d28

K K+F hAD hAD+F pAD pAD+F

Gruppen

lt5050-100100

Biopsieentnahme an post-OP Tag 7 14 28 (dagger Kurzzeittiere) und nach 6 Monaten

Trennung der Epidermis von der Dermis

Entnahme der Hautprobe

Bestimmung der Hautqualitaumlt nach 6 Monaten

22 Zellkultivierung

221 Kultivierung der Schweinekeratinozyten

Hautentnahme und Hautverarbeitung

Unter Vollnarkose (Beschreibung siehe Seite 23) wurde dem Versuchstier

(Hausschwein deutsche Landrasse Alter 5 Wochen Geschlecht weiblich

Ausgangsgewicht 35 kg) nach Rasur und sterilem Abwaschen der Entnahmestelle

mit Jodobacreg (Bode Chemie Hamburg) an der Flanke ein ca 10 cmsup2 groszliges

spindelfoumlrmiges Hautresektat entnommen Der Entnahmedefekt wurde primaumlr durch

Ruumlckstichnaumlhte mit nichtresorbierbarem Nahtmaterial verschlossen

Die Probe wurde anschlieszligend an einer sterilen Werkbank (bdquolaminar air flowldquoNalge

NUNC International Wiesbaden-Biebrich Deutschland) in mit Phosphatpuffer (1x

PBS Biochrom KG) gefuumlllten Petrischalen praumlpariert Nach dem Entfernen des

Subkutangewebes mit sterilen Instrumenten folgte zur Reinigung und der weiteren

Desinfektion das jeweils zweimalige Schwenken in 70 Alkohol und PBS Das

soweit vorbereitete Hautstuumlck wurde nun in eine Petrischale mit 1 Dispase (Fa

Boehringer Mannheim) gelegt der 10 microg Gentamycin zugesetzt waren und uumlber

Nacht bei 4 degC inkubiert Die Proteinase Dispase zerstoumlrt im Bereich der

Basalmembran Kollagen IV und somit den Dermo-Epithelialen-Zusammenhalt Die

Desmosomen der Epidermis bleiben allerdings erhalten [Poumay et al 1994] Vor

der weiteren Praumlparation erfolgte anschlieszligend an die Aufbewahrung im Kuumlhlschrank

eine weitere zweistuumlndige Inkubation im Brutschrank bei 37 degC um den Verdau zu

unterstuumltzen Der Verdau galt als abgeschlossen wenn sich die Epidermis als

Ganzes von der Dermis abloumlsen lieszlig

Keratinozytenisolierung

Das abgeloumlste Epithel wurde mit einer sterilen Schere zerkleinert und anschlieszligend

in sterilen Roumlhrchen mit 5 ml TrypsinEDTA (025 Fa Sigma BRD) 20 min im 37

degC warmen Wasserbad inkubiert wobei sie alle 5 min geschuumlttelt wurden Dadurch

wurde sowohl eine mechanische als auch enzymatische Zelldissoziation unter

Zerstoumlrung der Desmosomen ermoumlglicht Durch Resuspension mit 7 ml 10 -igem

NCS (neonatales Kaumllberserum Fa Gibco Eggenstein BRD) wurde der

enzymatische Vorgang gestoppt und somit eine Schaumldigung der Zellen vermieden

Diese Loumlsung wurde durch ein feines Zellsieb mit 70 microm Porengroumlszlige (Fa Falcon-

Becton-Dickinson UK) filtriert und bei 4 degC und 1200 Umin fuumlr 10 min zentrifugiert

Der erhaltene Uumlberstand wurde verworfen und das gewonnene Zellpellet in

Komplettmedium resuspendiert Dieses setzte sich zusammen aus serumfreien

Keratinozytenmedium EGF (Epithelial Growth Factor) Rinderhypophysenextrakt

(alles Fa Gibco Eggenstein BRD) und 1 microgml Gentamycin Nach der

Untersuchung der Vitalitaumlt der Zellen mittels Trypanblau 04 (Fa Sigma Irvine

Groszligbritannien) und der Ermittlung der gewonnen Zellzahl mit Hilfe der Neubauer-

Zaumlhlkammer erfolgte die Aussaat in einer Dichte von 3 Mio Zellen pro 13 ml Medium

in einer 75 cmsup2 kollagenbeschichteten Zellkulturflasche (Fa Falcon BRD) mit

Ventilationsdeckel (Fa Costar Corporation Cambridge MA USA) Die

anschlieszligende Inkubation erfolgte in einem Brutschrank (HeraCell Fa

HeraeusKendro Laboratory Products Hanau Deutschland) bei 37 degC und 5 -iger

CO2 Begasung Der Mediumwechsel fand alle 2-3 Tage statt Von den urspruumlnglich

inokulierten Zellen waren etwa noch 1-5 mitosefaumlhig [Rheinwald und Green 1975]

Zellen aus den oberen Schichten der Epidermis wie zB Stratum corneum und

Stratum granulosum erlangten keine Adhaumlrenz und wurden bei den Mediumwechsel

abgesaugt Die restlichen mitosefaumlhigen Zellen lagerten sich in Form von Klonen ab

und breiteten sich einlagig auf dem Flaschenboden als sogenannter bdquoMonolayerldquo

aus Da die Zellen bei zu hoher Dichte ihre mitotische Potenz durch Kontaktinhibition

verlieren [Freshney 1992] war es noumltig die Zellen bei 70-80 iger Konfluenz nach

ca 10 Tagen zu passagieren Hierfuumlr wurden die Zellen mit 4 ml TrypsinEDTA (005

FaSigma) fuumlr ca 7 min bei 37 degC inkubiert Zusaumltzliches Abklopfen erleichterte

das Abloumlsen der Zellen vom Flaschenboden Nach Abstoppen der Trypsinierung mit

neonatalem Kaumllberserum und Zentrifugation war es ausreichend die Zellen mit einer

Dichte von 1 Mio pro Kulturflasche erneut auszusaumlen Aus einer 75 cmsup2 Kulturflasche

waren bei 80 Konfluenz ca 3 Mio Zellen zu gewinnen Diese Vermehrung ist nicht

unbegrenzt durchfuumlhrbar da die Keratinozyten in der Kultur einen houmlheren

Stoffwechsel als in vivo aufweisen Nach 80-100 Mitosen was etwa 6 Passagen

entspricht geht die Wachstumskurve gegen null und Fibroblasten uumlberwuchern die

Kultur [Leigh 1994] Vermutlich fehlen den Keratinozyten in vitro langfristig parakrine

Stimuli die fuumlr die Persistenz von Basalzellen essentiell sind [Pittelkow und Scott

1986] Der guumlnstigste Zeitpunkt fuumlr eine Transplantation ist nach 2-3 Wochen

erreicht wenn schon eine betraumlchtliche Vermehrung stattgefunden hat die meisten

Zellen sich aber noch in der exponentiellen Wachstumsphase befinden

2211 Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFKS)

Fuumlr die Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension wurden

proliferierende Zellen einer subkonfluenten und somit nicht kontaktinhibierten Kultur

benoumltigt um einen moumlglichst hohen Anteil an Stammzellen zu erhalten [Kaiser et al

1994] Die Zellkulturen wurden wie bei Durchfuumlhrung einer Passage abzentrifugiert

resuspendiert und ausgezaumlhlt Durch erneute Abzentrifugation einer definierten

Menge Medium samt Zellen erhielt man so ein Zentrifugat mit bekannter

Keratinozytenanzahl Dieses Pellet konnte nun in der gewuumlnschten Konzentration in

einem handelsuumlblichen Fibrinkleber (Tissucol Duo Sreg Packungsgroumlsse 05 ml Fa

Immuno Heidelberg) resuspendiert werden

Der biologische Zweikomponentenkleber besteht aus einer Fertigspritze

Kleberproteinloumlsung (hier 05 ml enthaumllt Humanplasmaproteinfraktion mit

Fibrinogen Blutgerinnungsfaktor XIII Plasmafibronectin Plasminogen und bovines

Aprotinin) und einer Fertigspritze Thrombinloumlsung (hier 05 ml enthaumllt 250 IE

humanes Thrombin und Calciumchlorid-Dihydrat) Mit dem System Duploject koumlnnen

die beiden Spritzen parallel entleert werden so dass die Vermischung der beiden

Komponenten unmittelbar vor dem Aufbringen auf die Wunde erfolgt

Zur Resuspension des Pellets wurde die Thrombinloumlsung aufgrund ihrer geringeren

Viskositat gewaumlhlt Unter sterilen Kautelen wurde das definierte Keratinozytenpellet

(hier zwischen 18 ndash 72 Mio gesamt fuumlr alle 6 Wunden dh 03 ndash 12 Mio pro

Defekt) in die Spritze mit der Thrombinloumlsung aufgezogen So ergab sich eine

Zellkonzentration von 03 ndash 12 Mio Keratinozyten pro ml Endvolumen Fibrinkleber

wobei auf jede Wunde 1 ml Fibrinkleber appliziert wurde Das fertig installierte

Applikationsset wurde bis zur Operation in steriler Verpackung bei 4 ordmC gelagert Die

Durchfuumlhrung der Passage bis zum Aufbringen des KFGS auf die Wunden erfolgte

binnen 3 Stunden was den Anforderungen des Herstellers entsprach

Abb 2-3 Subkonfluente Keratinozytenkultur wie sie zur Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS) verwendet wurde

222 Etablierung der Schweinefibroblastenkultur

Die nach dem Abloumlsen der Oberhaut verbliebene Lederhaut wurde an der sterilen

Werkbank mit einer sterilen Schere zerkleinert und fuumlr 2 h in Kollagenase II (35 mg

Fa Biochrom 268 Umg aufgeloumlst in 45 ml PBS und steril filtriert) bei 37 ordmC im

Schuumlttelbad inkubiert Die Kollagenase eine Proteinase spaltet die Dreifach-Helix

der Kollagenmolekuumlle und loumlst somit die Zellen aus ihrer extrazellulaumlren Matrix Um

die Enzymaktivitaumlt zu stoppen wurde neonatales Kaumllberserum im Uumlberschuss

zugegeben Der fluumlssige Uumlberstand wurde durch ein Zellsieb der Porengroumlszlige 70 microm

in sterile Roumlhrchen filtriert und bei 4 degC und 1200 Umin fuumlr 10 min zentrifugiert

Das so gewonnene Pellet wurde in DMEndashMedium (Dulbeccoacutes Modified Eagles

Medium mit 45 gl Glucose Biowitthaker Belgien) mit 10 -igem NCS (neonatales

Kaumllberserum Fa Gibco Eggenstein BRD) und 1 -igem PenicillinStreptomycin

resuspendiert und die Zellzahl mit Hilfe der Neubauer-Zaumlhlkammer bestimmt Die

Aussaat der Zellen erfolgte in einer Konzentration von 3-4 Mio Zellen pro 75 cmsup2

Kulturflasche Mediumwechsel erfolgte alle 2-3 Tage Die Zellen erreichten nach

etwa 5 Tagen eine 70-80 -ige Konfluenz und wurden passagiert (Abb 2-3) Nach

ca 3 Passagen wurden die Zellen fuumlr die Transplantation vorbereitet

Abb 2-4 Subkonfluente Fibroblastenkultur wie sie zur Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber- Suspension (F-KFGS) verwendet wurden

2221 Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension

(F-KFGS)

Zur Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension wurde am

Tag der Transplantation der Teil der Fibroblasten verwendet der bereits zuvor zum

Zeitpunkt der Inokulierung der Kollagenmatrix mit Fibroblasten separiert und

weiterkultiviert wurde Die Inokulierung auf der Unterseite der dermalen Matrix fand

stets 4 Tage vor der Transplantation mit ca 200000 ndash 700000 Fibroblasten pro

Defekt statt Die gleiche Anzahl an Zellen wurde weiterkultiviert und fuumlr die F-KFGS-

Gruppe verwendet Die Fibroblasten wurden trypsiniert zentrifugiert Das Pellet

wurde mit 05 ml der bereits praumlparierten Keratinozyten-Thrombin-Mischung

resuspendiert und in einer separaten Spritze steril bis zur Transplantation

aufbewahrt

2222 Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten

Die Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten erfolgte mit Fluospheresreg (Molecular

Probes Oregon USA) Dies sind fluoreszierende Micropartikel die in die Zelle

inkorporiert werden und auf diese nicht toxisch wirken Diese Markierung diente

dazu um in einem in vitro Ansatz herauszufinden wie die Fibroblasten nach der

Inokulierung auf der dermalen Matrix in diese integriert werden und ob hierbei

Unterschiede zwischen der duumlnneren humanen Dermis (01-05 mm) und der

dickeren porcinen Dermis (0675 mm) bestanden

Fuumlr die Markierung der Fibroblasten wurden Fluospheresreg in Medium (15000 05

microM) gegeben und die Zellen damit in der Kulturflasche uumlber Nacht im Brutschrank

inkubiert Mit dem Fluoreszenzmikroskop (Fa Zeiss Jena) wurde am naumlchsten Tag

uumlberpruumlft ob die Fluospheresreg von den Fibroblasten aufgenommen wurden

Die so markierten Zellen wurden etwa 5 Tage weiterkultiviert und anschlieszligend auf

die Unterseite der dermalen Seite von 1 cmsup2 groszligen Stuumlckchen humanem und

porcinem AlloDermreg in einer 12 well Platte aufgetragen (40000 Zellen geloumlst in 300

microl Medium pro 1 cmsup2) Nachdem die Zellen nach 45 min auf der Matrix adhaumlrent

wurden wurden die wells mit DME-Medium aufgefuumlllt Die Probeentnahme und

histologische Aufarbeitung erfolgte an den Tagen 1 4 7 und 10

Abb 2-5 b Abb 2-5 a

Abb 2-5 a und b Ein mit Fluospheresreg fluoreszenzmarkierter Fibroblast AlloDermreg wurde in vito mit markierten Fibroblasten besiedeln um deren Verbleib innerhalb der Matrix besser verfolgen zu koumlnnen

223 Verwendung des humanen und des porcinen Dermisersatzes (AlloDermreg)

Die Verwendung eines dermalen Ersatzes findet insbesondere bei der Behandlung

von schwerstverbrannten Patienten bereits eine weitreichende klinische Anwendung

[Livesey et al 1995 Wainwright 1995 Gustafson und Kratz 1999] Im Rahmen

dieser Arbeit wurde das Produkt AlloDermreg (Fa Lifecell Texas USA) verwendet

das schon seit vielen Jahren weltweit frei auf dem Markt erhaumlltlich ist und neben der

Verwendung als Dermisersatz in der plastischen Chirurgie zur Gewebeaugmentation

beispielsweise Lippenaugmentation eingesetzt wird Hierbei handelt es sich um

humane Leichenhaut die mittels eines mehrere Pozessierungsschritte umfassenden

Verfahrens bearbeitet wird um epidermale und dermale Zellen herauszuloumlsen ohne

dabei die biologische dermale Matrix zu zerstoumlren Als Erstes wird die Epidermis von

der Dermis getrennt Dann werden die zellulaumlren Bestandteile der verbleibenden

Dermis (zB Endothelzellen) die eine immunologische Abstoszligungsreaktion bewirken

koumlnnten herausgeloumlst Als letzter Schritt erfolgt eine moumlglichst gewebeschonende

Gefriertrocknung Von Bedeutung fuumlr die spaumltere Transplantation der Keratinozyten

und die Reepithelisierung ist die Tatsache dass bei der Herstellung die aus Lamina

lucida und Lamina densa bestehende Basalmembran intakt bleibt Vor dem

Versterben des Spenders werden Blutproben auf Hepatitis B und C HIV-I HIV-2

HTLV-I HTLV-II Antikoumlrper und Syphilis hin untersucht um das Risiko der

Uumlbertragung von Erregern so gering wie moumlglich zu halten Der Hersteller garantiert

ein von zellulaumlren Bestandteilen freies und somit ein als immunologisch inert

geltendes Produkt

Neben dem humanen Dermisersatz kam auch ein analoger porciner Dermisersatz

zum Einsatz Diese homologe porcine Matrix wurde nach demselben Verfahren wie

auch das AlloDermreg humanen Ursprungs hergestellt Die Dicke der humanen

Dermis betrug laut Hersteller 0007-002 Zoll (01-05 mm) die des porcinen ca

0027 Zoll (0675 mm) Trotz der Herausloumlsung der zellulaumlrer Bestandteile wird der

Einfluszlig der Xenogenitaumlt auf mehrere Parameter der Wundheilung kontrovers

diskutiert So gibt es Anzeichen dass die Verwendung einer xenogenen azellulaumlren

dermalen Matrix zu einer verstaumlrkten Kontraktion einer verminderten Einheilungsrate

und erhoumlhten Entzuumlndungsreaktionen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]

Sowohl das humane als auch das porcine Allodermreg wurde vor der Transplantation

geschlitzt Durch die Schlitze gelangt das naumlhrstoffhaltige Wundsekret zu den

transplantierten Keratinozyten

Beimpfen der azellulaumlren Matrix (AlloDermreg) mit den praumlkultivierten Fibroblasten

Zunaumlchst wurden die gefriergetrockneten Dermisstuumlcke (5 x 5 cm) in isotoner

Kochsalzloumlsung 3 mal rehydriert Das porcine AlloDermreg musste im Gegensatz zu

dem praumlparierten humanen AlloDermreg nach dem Rehydrieren mit einem Skalpell

geschlitzt

Die praumlkultivierten Fibroblasten wurden trypsiniert zentrifugiert und ausgezaumlhlt Ein

Drittel der Zellen (200000-700000 Fibroblasten geloumlst in 05 ml DMEM) wurden auf

die Unterseite eines Dermisstuumlcks aufgetragen Nach einer Stunde Inkubationszeit

wurde Medium zugegeben und die Komposit-Konstrukte fuumlr 4 Tage bis zum

Operationstag kultiviert Somit hatten die Zellen Zeit in dem dermalen Konstrukt

adhaumlrent zu werden und einzuwachsen Ein Drittel der Fibroblasten und somit die

gleiche Anzahl an Zellen die auch auf die Transplantate gebracht wurde wurde in

einer Kulturflasche bis zum Operationstag weiterkultiviert Diese Zellen waren fuumlr die

Fibroblasten-KFGS-Gruppe bestimmt Somit konnte von einer aumlhnlichen Zellzahl auf

allen mit Fibroblasten behandelten Wunden ausgegangen werden da sowohl die

Zellen auf dem vorbeimpften Transplantat als auch in der Kulturflasche bis zum

Zeitpunkt der Operation weiter proliferieren konnten

Abb 2-6 a Kollagen VII-Faumlrbung Abb 2-6 b Elastica-van-Gieson-Faumlrbung

Abb 2-6 a und b Der verwendete azellulaumlre dermale Ersatz (AlloDermreg) enthaumllt eine intakte kontinuierliche Basalmembran (Pfeil Abb 2-5 a Kollagen VII-Faumlrbung) Die Elastica-van-Gieson-Faumlrbung (Abb 2-5 b) zeigt die vorhandenen kollagenen (rot) und elastischen (schwarz) Fasern (Vergroumlszligerung beide x 100)

23 Tierversuchsdurchfuumlhrung

Nach Genehmigung durch die Tierversuchskommission des Regierungspraumlsidiums

Freiburg (Aktenzeichen 35-9185811591) wurden insgesamt 10 Schweine

(deutsche Landrasse Geschlecht weiblich Zuchtbetrieb Rein Breisach-Guumlndlingen)

im Alter von 8-12 Wochen und einem Ausgangsgewicht von 30-35 kg als

Versuchstiere verwendet

231 Operation

Insgesamt wurden 10 Tiere operiert wobei ein Tier kurz nach Entnahme der

Hautprobe verstarb Die Transplantation erfolgte somit bei 9 Tieren mit je 6 Wunden

dermalen Matrices mit und ohne Fibroblasten und KFGS behandelt Die Anordnung

der Transplantate erfolgte randomisiert

5 Tiere blieben fuumlr 4 Wochen post-OP im Versuch

4 Tiere blieben fuumlr 6 Monate post-OP im Versuch

Transplantatverteilung bei den Tieren uumlber den Versuchszeitraum von 4 Wochen

Bei 4 Tieren kam nur die dermale Matrix humanen Ursprungs (hAD) zum Einsatz (s

Abb 2-7 2-9)

Bei 1 Tier kam sowohl die Matrix humanen Ursprungs (hAD) als auch die Matrix

porcinen Ursprungs (pAD) zum Einsatz (s Abb2-8 2-9)

Schwanz Kopf

hAD KFGS

F-KFGS

hAD+F KFGS

KFGS Abb 2-7 Schematische Darstellung der Transplantatanordnung der Tiere die mit der humanen Dermis behandelt wurden KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten

Transplantatverteilung bei den Tieren uumlber einen Versuchszeitraum von 6 Monaten

Bei allen 4 Tieren kam sowohl die Matrix humanen Ursprungs (hAD) als auch die

Matrix porcinen Ursprungs (pAD) zum Einsatz (s Abb2-8 2-9)

Schwanz Kopf

pAD KFGS

hAD KFGS

F-KFGS

pAD+F KFGS

hAD+F KFGS

KFGS Abb 2-8 Schematische Darstellung der Transplantatanordnung der Tiere die mit der humanen und der porcinen Dermis behandelt wurden KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten pAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg plus Fibroblasten

Insgesamt ergab sich folgende Verteilung bei der Anzahl der Transplantatgruppen

Wunden gesamt

alle Tiere 54

davon Langzeitversuch uumlber 6 Monate 24

KFGS 9 4

KFGS+F 9 4

hAD+F KFGS 13 4

hAD KFGS 13 4

pAD+F KFGS 5 4

pAD KFGS 5 4

Muskel

Dermis

Epidermis

Fibrinkleber mit Keratinozten Praumlinkubiertes

AlloDermreg Vollhauzexzisionswunde

hAD+F KFGShAD KFGSF+KFGS

Keratinozyten

Abb 2-9 Schematische Darste KFGS = Keratinozyten-FibrinkleF-KFGS = Fibroblasten-KeratinohAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg ppAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg p

Die im Rahmen der Versuch

Anleitung und Aufsicht eines T

den Rahmen einer Wundins

Verbaumlnde mit fotografisc

beziehungsweise Sedierung

Hautentnahme zur Kultivierun

Transplantation und die spaumlt

Arealen zur histologischen Un

pAD KFGS

llung der Wundbehandlu

ber-Suspension zyten-Fibrinkleber-Susp

lus Fibroblasten

sdurchfuumlhrung erfor

ierarztes Saumlmtliche

pektion uumlberschritte

her Dokumentatio

durchgefuumlhrt Hie

g der autologen Ke

ere Entnahme der

tersuchung

pAD+F KFGS

roblasten

ension

derlichen Eingriffe erfolgten unter

Manipulationen an den Tieren die

n (Uumlberpruumlfung auf Integritaumlt der

n) wurden unter Narkose

rzu zaumlhlten insbesondere die

ratinozyten und Fibroblasten die

Biopsien aus den transplantierten

Vor den geplanten Eingriffen erfolgte die sedative Praumlmedikation mit Flunitrazepam

im und Ketamin im Anschlieszligend wurde unter laryngoskopischer Kontrolle

intubiert und mittels Vecuronium iv muskelrelaxiert Die Narkose wurde mit

SauerstoffLachgas und Flunitrazepam iv Propofol iv Fentanyl iv und

Vecuronium iv aufrechterhalten Zur Volumensubstitution erfolgte eine basale Gabe

von Ringer-Loumlsung iv Die Toumltung der Tiere nach Abschluss der Experimente

erfolgte durch eine letal wirkende Bolusgabe von KCl iv

232 Hautentnahme zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblasten

Unter Vollnarkose wurde dem Versuchstier (Hausschwein deutsche Landrasse Alter

5 Wochen Geschlecht weiblich Ausgangsgewicht 35 kg) nach Rasur und sterilem

Abwaschen der Entnahmestelle mit Jodobac (Bode Chemie Hamburg BRD) an der

Flanke ein ca 10 cmsup2 groszliges spindelfoumlrmiges Hautstuumlck entnommen (Abb 2-10)

Der Entnahmedefekt wurde primaumlr durch Ruumlckstichnaumlhte mit nichtresorbierbarem

Nahtmaterial (Ethilonreg II 2-0 Fa Ethicon Norderstedt BRD) spannungsfrei

verschlossen

Abb 2-10 Wunde nach Entnahme eines spindelfoumlrmigen Hautresektats zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblasten

233 Taumltowierung und Transplantation

Die Taumltowierung der Wundraumlnder wurde eingefuumlhrt um waumlhrend des

Versuchverlaufs die Kontraktionsmessungen einheitlich durchfuumlhren zu koumlnnen

Dabei verwendeten wir eine bei plastisch-rekonstruktiven Operationen

herangezogene Taumltowiermaschine (Fa Voltkraft BRD) und graues Taumltowierpigment

(bdquoAccentsldquo Micropigmentation grey pigment San Luis Obispo CA USA Abb 2-11

Abb 2-11 Die zur Markierung der Wundraumlnder eingestzte Taumltowiermachine mit Pigment

Abb 2-12 Nach Auftragen des Taumltowierpigments erfolgte die Taumltowierung

Nach der Taumltowierung wurden unter sterilen OP-Bedingungen auf dem Ruumlcken jedes

Versuchstieres 6 Vollhautdefekte mit einer Groumlszlige von 5 x 5 cm bis auf die

Muskelfaszie ausgeschnitten Nach sorgfaumlltiger Blutstillung und ausgiebiger

Rehydrierung der Dermis-Stuumlcke die nicht mit Zellen beimpft worden waren wurde

die Dermis mit nicht resorbierbarem Faden (Ethilonreg II 4-0 Fa Ethicon Norderstedt

BRD) an den Wundraumlndern in die Exzisionswunden eingenaumlht und die Keratinozyten-

Fibrinkleber-Suspension aufgetragen (Abb 2-13) Auf eine Wunde wurde als

Kontrolle die reine Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension auf eine andere die

Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrin-Suspension jeweils ohne dermale Matrix

aufgetragen

Nach Aushaumlrten des Fibrins was etwa 20-30 sec dauerte wurde eine stabile

Fettgaze (Grassolindreg Fa Hartmann BRD) auf die Defekte aufgebracht und die

Wundraumlnder mit einer NeomycinBacitracin- haltigen Salbe bestrichen (Polyspectran-

Salbereg Fa Alcon BRD) Durch die Gaze konnte ein feuchtes die Wundheilung

foumlrderndes Milieu geschaffen werden und das Verkleben des Verbandes mit den

Transplantaten verhindert werden Zusaumltzlich wurde die Gaze mit einer

semipermeablen Siliconfolie (Biobranereg Bertel Pharmaceuticals Inc Texas USA)

bedeckt und an den Wundraumlndern mit nicht resorbierbarem Faden (Ethilonreg II 5-0

Fa Ethicon Norderstedt BRD) fixiert Biobranereg aus einem Silikonfilm und einem

Nylonnetzwerk bestehend foumlrdert die Wundheilung und stellt eine Barriere fuumlr

Bakterien dar Auszligerdem folgte eine mehrlagige Abdeckung mit Kompressen und

einer Schaumstoffplatte die mit Verbandsklebestreifen (FixomullHaftreg Fa

Beiersdorf AG Hamburg BRD) fixiert wurden Dies gewaumlhrleistete eine

Wundkompression und einen mechanisch-hygienischen Schutz Postoperativ wurden

die Tiere taumlglich bis zum kompletten Wundverschluss auf Integritaumlt der Verbaumlnde

sowie auf etwaige Wundinfektionen hin untersucht

Abb 2-13 Auftragen der Fibrinkleber-Zellsuspension mit einer Zweikomponentenspritze

234 Verlauf des Kurz- und Langzeitexperiments postoperativ

Die Versuchsdauer fuumlr die Kurzzeittiere betrug 28 Tage die der Langzeittiere 6

Monate Die Tiere waren in einer fuumlr sie eigens eingerichteten Stallbox

untergebracht die taumlglich gereinigt wurde Auszligerdem wurden die Langzeittiere nach

komplettem Wundverschluszlig paarweise in mit frischem Stroh ausgelegten Staumlllen auf

einem landwirtschaftlichen Universitaumltslehrbetrieb untergebracht Um Infektionen

vorzubeugen wurden die angelegten Verbaumlnde engmaschig auf ihre Integritaumlt hin

untersucht

Der makroskopische Wundheilungsverlauf wurde zu den Probeentnahmen an Tag 7

14 und 28 sowie bei den Langzeittieren nach 42 Tagen 3 und 6 Monaten

protokollarisch und photographisch festgehalten

Um den Wundheilungsverlauf auch mikroskopisch beurteilen zu koumlnnen wurde zu

definierten Zeitpunkten (post-OP Tage 7 14 28) je eine Stanzbiopsie (6mm

Durchmesser) aus der Mitte der Wunde entnommen Durch die Entnahme der

Biopsie aus der Wundmitte konnte sichergestellt werden dass es sich um die

transplantierten Zellen handelte und nicht um von den Wundraumlndern her

einwachsendes Epithel Zum jeweiligen Zeitpunkt des Versuchendes am post-OP

Tag 28 (Kurzzeittiere) und nach 6 Monaten (Langzeittiere) wurde die komplette

Wunde exzidiert Saumlmtliche Probeentnahmen fanden unter Vollnarkose statt

Um den Wundheilungsverlauf nicht zu sehr zu beeinflussen wurde allerdings nicht

jede Wunde nach 7 und 14 Tagen bzw nach 28 Tagen biopsiert Durch die

Probeentnahme kommt es zur zusaumltzlichen Bildung von Granulationsbewebe um das

entnommene Areal herum und somit zur Beeintraumlchtigung der Wundkontraktion

Die gewonnenen Proben wurden mit einem Mikrotommesser halbiert Ein Teil wurde

daraufhin fuumlr die klassische Lichtmikroskopie in 4 -igem Formalin (Fa Merck

Darmstadt BRD) fixiert und die zweite Haumllfte fuumlr die immunhistochemischen

Untersuchungen in fluumlssigem Stickstoff schockgefroren wodurch die Zerstoumlrung von

antigenen Epitopen verhindert wird [Luppa 1987]

235 Planimetrie zur Bestimmung der Wundkontraktion

Von Hunt und Dunphy (1969) wird die Wundkontraktion als bemerkenswerter

physiologischer Vorgang bezeichnet durch den sich bdquooffene Wunden spontan

schlieszligen Im Gegensatz zur Bildung des Granulationsgewebes ist der Prozeszlig der

Kontraktion weniger vom Gesamtorganismus abhaumlngig und stellt damit eine

Ausnahme im Heilvorgang dar

Die Wundkontraktion fuumlhrt durch die zur Kontraktion befaumlhigten Myofibroblasten zu

einer Annaumlherung der nicht zerstoumlrten Gewebssubstanzen Myofibroblasten

entwickeln sich im Wundgebiet aus eingewanderten Fibroblasten und aumlhneln mit

ihren aktinhaltigen Mikrofilamenten den glatten Muskelzellen Folglich wird das

Gebiet der unvollstaumlndigen Reparation so klein wie moumlglich gehalten Durch diesen

Prozess wird bei Tieren die erforderliche Neubildung von Bindegewebe und Epithel

um 50-90 reduziert Sie wirkt sich um so mehr aus je beweglicher die Haut

gegenuumlber der Unterlage ist Die Langerschen Linien bestimmen dabei den Verlauf

der Zugkraumlfte [Sedlarik und Weidenbach 1993 Singer und Clark 1999]

Auswertung der Planimetrie

Zur Bestimmung der Kontraktion wurde eine Planimetrie durchgefuumlhrt Dazu wurden

die mittels der Tatowierung definierten Wundraumlnder auf eine Wundschablone

uumlbertragen Diese Kopie der Wunden wurde mit einem Flachbettscanner eingescannt

und das digitalisierte Bild mit einem Rechner zur Flaumlchenberechnung mit dem

Programm bdquoScion Imageldquo bearbeitet werden Dieses Programm ist eine kostenlose

Version des von den National Institutes of Health entwickelten Programms NIH

Image und kann im Internet unter httprsbinfonihgovnih-image heruntergeladen

werden Die von dem Programm ermittlete Anzahl an Pixel jeder Flaumlche wurde

automatisch in cmsup2 umgerechnet Somit konnte die prozentuale Verkleinerung der

Wundflaumlchen im Vergleich zur urspruumlnglichen Transplantationsflaumlche am OP-Tag zu

jedem Zeitpunkt der Datenerhebung ermittelt werden

Fragestellung war ob sich die verschiedenen Transplantatgruppen untereinander

hinsichtlich der Inhibition der Wundkontraktion unterscheiden Wie schon von

anderen Arbeitsgruppen gezeigt werden konnte fuumlhrt die Verwendung eines

dermalen Ersatzes zu einer Reduktion der Kontraktion Fuumlr uns stellte sich weiterhin

die Frage ob es einerseits durch die zusaumltzliche Applikation von autologen

Fibroblasten zu einer verminderten Wundkontraktion kommt [Lamme et al 2000]

Auszligerdem fuumlhrten wir Transplantatgruppen ein bei denen die xenogene humane

dermale Matrix mit einer homologen porcinen Matrix ersetzt wurde Der Einfluszlig der

Xenogenitaumlt auf mehrere Parameter der Wundheilung wird kontrovers diskutiert So

gibt es Anzeichen dass die Verwendung einer xenogenen azellulaumlren dermalen

Matrix zu einer verstaumlrkten Kontraktion einer verminderten Einheilungsrate und

erhoumlhten Entzuumlndungsreaktionen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]

236 Bestimmung der Einheilungsrate und des Wundverschlusses

Neben der Wundkontraktion wurden auch die Einheilungsraten und der

Wundverschluss der einzelnen Gruppen miteinander verglichen

Die Einheilungsrate wurde definiert als der Nachweis eines sowohl makroskopisch

wie auch mikroskopisch sichtbaren Neoepithels Hierzu wurden die Ergebnisse des

post-OP Tages 14 herangezogen da dies der fruumlheste Zeitpunkt darstellte an dem

eine makroskopische Neoepithelbildung nachweisbar war War zu diesem Zeitpunkt

eine Epithelbildung mit Stratum corneum ersichtlich so wurde die Einheilung als

positiv gewertet

Der Wundverschluszlig wurde makroskopisch am post-OP Tag 28 beurteilt Hier wurde

besonders auf drei moumlgliche den Wundverschluszlig beeinflussende Faktoren geachtet

Zum einen der Einsatz einer demalen Matrix an sich zweitens der Austausch der

xenogenen humanen mit einer homologen porcinen Dermis und drittens die

Applikation von autologen Fibroblasten [Lamme et al 1998 Srivastava et al 1999

Svensjo et al 2002]

237 Untersuchung der Hautqualitaumlt mit einer Saugsonde

Mit dem CutometerregMPA 580 (Fa Courage amp Khazaka Koumlln) lassen sich

verschiedene biomechanische Parameter der Haut wie zB die Elastizitaumlt reliabel

und valide bestimmen [van Zuijlen et al 2000] Da die Haut visko-elastisch ist

beinhaltet sie sowohl elastische als auch plastische Komponenten die sich im

Verlauf der Hautalterung und bei bestimmten pathologischen Veraumlnderungen der

Haut (Narbenbildung Hautkrankheiten wie zB Sklerodermie) erheblich veraumlndern

Starke Verluste der elastischen Hauteigenschaften sind in der Regel die Folge von

Anomalien der Kollagen-Biosynthese zB bei einer hypertrophen Narbenbildung

oder Sklerodermie Um die Steifheit der Haut zu evaluieren und eine Korrelation mit

dem Krankheitsverlauf zu finden sind Elastizitaumltsmessungen in vivo von groszligem

Interesse Ebenso liefert die Elastizitaumltsmessung wichtige Erkenntnisse uumlber den

Heilungsprozess

Das Messprinzip dieses Geraumltes basiert auf der Saugmethode Im Geraumlt wird ein

konstanter Unterdruck erzeugt der zwischen 20 und 500 mbar variabel einstellbar

ist Die zu messende Hautstelle wird waumlhrend der Messung durch den Unterdruck in

die Oumlffnung der Messsonde gezogen Die Eindringtiefe der Haut in die Oumlffnung

(Elongation) wird durch ein optisches Messsystem beruumlhrungslos erfasst (Abb 2-14)

Das optische Messsystem besteht aus einem Lichtsender und einem Lichtempfaumlnger

sowie zwei gegenuumlberliegenden Glasprismen die das Licht vom Sender zum

Empfaumlnger leiten Das Lichtverhaumlltnis wird durch die Eindringtiefe der Haut

proportional veraumlndert

Fuumlr die Messungen wurde ein konstanter Unterdruck von 500 mbar bei einer

Ansaugzeit von einer Sekunde und einer Relaxationszeit von ebenfalls einer

Sekunde gewaumlhlt Die Messungen wurden 8 mal hintereinander wiederholt an

insgesamt 3 unterschiedlichen Messtagen Die Messungen wurden einmal mit einer

2 mm Sonde und ein weiteres mal mit einer 8 mm Sonde durchgefuumlhrt Durch die

Verwendung der verschiedenen Sondendurchmesser war es moumlglich verschiedene

Anteile der Haut gezielt zu untersuchen So misst die 2 mm Sonde besonders den

epidermalen Anteil und die 8 mm Sonde hauptsaumlchlich den dermalen Anteil der Haut

Als Messergebnisse erhielten wir die maximale Auslenkung beim Erreichen eines

Unterdruckes von 500 mbar und die Elastizitaumlt als Quotient aus Retraktion

(Ruumlckbildung nach max Auslenkung) und maximaler Auslenkung

Abb 2-14 Das zur Bestimmung der H(Cutometerreg MPA 580) mit MessprinzipVakuumsonde hineingezogenen Haut wirerfasst

autqualitaumlt verwendete Geraumlt Die Auslenkung der in die d uumlber ein optisches System

24 Histologische Untersuchungen

241 Klassische Lichtmikroskopie

Die Aufarbeitung der Biopsien erfolgte nach der Paraffinmethodik mit den folgenden

Faumlrbungen Haumlmatoxilin-Eosin (HE) als Standardfaumlrbung Elastica-van-Gieson (EvG)

und Trichrom-Goldner Protokolle der hier durchgefuumlhrten Standardtechniken siehe

Romeis Mikroskopische Technik [Romeis]

242 Immunhistochemie

Saumlmtliche immunhistochemischen Untersuchungen wurden an Kryoschnitten

durchgefuumlhrt Dazu wurden die schockgefrorenen Nativproben im Kryostaten (Fa

Jung Heidelberg) bei ndash 20 degC in Gefriermedium (Fa Leica Nussloch) eingebettet

und geschnitten Die 5 microm dicken Schnitte wurden auf Objekttraumlger aufgezogen

Nach einstuumlndiger Lufttrocknung bei Raumtemperatur konnten die Schnitte gefaumlrbt

werden Dies geschah immer in einer Feuchtkammer bei Raumtemperatur um ein

Austrocknen der Schnitte zu verhindern Bei jeder Faumlrbung wurden Positiv- und

Negativkontrollen durchgefuumlhrt um Qualitaumlt und Spezifitaumlt der Antikoumlrper zu

uumlberpruumlfen [Luppa 1987]

2421 Nachweis der rekonstituierten Basalmembran

Die Etablierung und Wiederherstellung der Basalmembran ist wesentlich fuumlr eine

erfolgreiche Einheilung von kultivierten Hauttransplantaten Schon die unzureichende

Entwicklung von einzelnen Komponenten der Basalmembran wie zB der

Ankerfibrillen fuumlhrt zu einer verstaumlrkten Fragilitaumlt und Blasenbildung der Haut

[Woodley et al 1988 Aumailley und Smyth 1998] Kollagen VII gilt als

Hauptbestandteil der Ankerfibrillen wird von Keratinozyten gebildet Die Ankerfibrillen

sind mitverantwortlich fuumlr die Vernetzung zwischen basalen Epithelschichten und

dem laminaumlren Anteil der Basalmembran Der Nachweis dieses Proteins zeigt die

epithelial-mesenchymale Interaktion in Form einer sich rekonstituierenden

Basalmembran

Die Faumlrbung gegen Kollagen Typ VII wurde in der indirekten

Immunperoxydasetechnik durchgefuumlhrt Als Primaumlrantikoumlrper wurde ein monoklonaler

Mausantikoumlrper (Fa Sigma Steinheim BRD) verwendet der mit den

Basalmembranen von Mensch Schwein Meerschweinchen Rind Schaf und Ziege

kreuzreagiert

Zunaumlchst wurden die Schnitte in PBS rehydriert und fuumlr 10 min mit dem Peroxidase

Blocking Reagent (Fa DakoCytomation Carpinteria CA USA) inkubiert um

endogene Gewebsperoxidasen zu blockieren die zu einer unspezifischen

Substratumsetzung fuumlhren koumlnnten Anschlieszligend wurden die unspezifischen

Bindungsstellen des zweiten Antikoumlrpers mit 5 -igem Ziegenserum fuumlr 15 min

geblockt Dann erfolgte die Inkubation der Schnitte mit dem Maus-Anti-Kollagen VII

Primaumlrantikoumlrper in einer Verduumlnnung von 1200 fuumlr 1 Stunde Nach einem weiteren

Waschvorgang wurden die Schnitte mit einem Ziege-Anti-Maus-IgG

Sekundaumlrantikoumlrper (Fa DakoCytomation CA USA) fuumlr eine Stunde uumlberschichtet

Nach nochmaligen Waschen in PBS konnten die Schnitte dann mit dem AEC-

Chromogen (Fa DakoCytomation CA USA) uumlberschichtet werden das von der

Peroxydase zu einem purpurroten Farbstoff umgesetzt wird Diese Reaktion musste

unter dem Lichtmikroskop verfolgt werden um sie rechtzeitig stoppen zu koumlnnen

Abschlieszligend wurde mit Haumlmalaun gegengefaumlrbt um die Zellkerne sichtbar zu

machen Die Schnitte wurden mit Aquatexreg (Fa Merck Darmstadt BRD)

eingedeckelt

2422 Nachweis von Myofibroblasten

Entgegen der fruumlheren Vorstellung dass die Wundkontraktion durch die

Schrumpfung der Kollagenfasern zustande kommt weiszlig man heute dass dies nur

eine untergeordnete Rolle spielt Verantwortlich fuumlr die Kontraktion sind vielmehr die

Fibroblasten im Granulationsgewebe die sich unter besonderen Bedingungen

strukturell und funktionell in einen Zelltyp umwandeln der den Zellen der glatten

Muskulatur aumlhnelt und wie diese den kontraktionsfaumlhigen Muskeleiweiszligkoumlrper

Actomyosin enthaumllt [Gabbiani et al 1971 Hirschel et al 1971 Singer und Clark

1999] So steht das Auftreten von Myofibroblasten mit der Wundkontraktion in

Zusammenhang

Die Faumlrbung gegen α-sm-Aktin wurde wie die Anti-Kollagen VII-Faumlrbung mit der

indirekten Immunperoxydasetechnik durchgefuumlhrt Der monoklonale Primaumlrantikoumlrper

stammte von der Maus und wurde in einer Verduumlnnung von 1100 verwendet

Blocking Reagent (Fa DakoCytomation CA USA) inkubiert um endogene

Gewebsperoxidasen zu blockieren die zu einer unspezifischen Substratumsetzung

fuumlhren koumlnnten Anschlieszligend wurden die unspezifischen Bindungsstellen des

zweiten Antikoumlrpers mit 5 -igem Ziegenserum fuumlr 15 min geblockt Dann erfolgte

die Inkubation der Schnitte mit dem Maus-Anti-α-sm-Aktin Primaumlrantikoumlrper in einer

Verduumlnnung von 1100 fuumlr 1 Stunde Nach einem weiteren Waschvorgang wurden

die Schnitte mit einem Ziege-Anti-Maus-IgG Sekundaumlrantikoumlrper (Fa

DakoCytomation CA USA) fuumlr eine Stunde uumlberschichtet Nach nochmaligen

Waschen in PBS konnten die Schnitte dann mit dem AEC-Chromogen (Fa

DakoCytomation CA USA) uumlberschichtet werden das von der Peroxydase zu einem

purpurroten Farbstoff umgesetzt wird Diese Reaktion musste unter dem

Lichtmikroskop verfolgt werden um sie rechtzeitig stoppen zu koumlnnen Abschlieszligend

wurde mit Haumlmalaun gegengefaumlrbt um die Zellkerne sichtbar zu machen Die

Schnitte wurden mit Aquatexreg (Fa Merck Darmstadt BRD) eingedeckelt

243 Bewertung der Reteleisten

Reteleisten mit ihren papillaumlren Verzahnungen zwischen Epidermis und Dermis sind

von Bedeutung fuumlr die mechanische Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs

aber auch fuumlr die Ernaumlhrung der auf Diffusion angewiesenen Epidermis [Putland et

al 1995] Anhand der Histologien nach 6 Monaten wurde die Ausbildung der

Reteleisten bestimmt Hierzu wurden 31 Schnitte von 3 unabhaumlngigen Beobachtern

begutachtet Von jeder Wundgruppe lagen etwa 5 Schnitte (keine Serienschnitte)

vor Es galt die Ausbildung der Reteleisten jedes Schnittes auf einer Skala von 1 (=

keine Reteleisten vorhanden) bis 4 (=Reteleisten gut ausgebildet) zu beurteilen Die

statistische Signifikanz wurde mit dem Student-Newman-Keuls-Test ermittelt

25 Statistik und Computerprogramme

Alle Ergebnisse sind als Mittelwerte +- Standardfehler des Mittelwertes dargestellt

(SEM) Die Auswertung aller Rohdaten erfolgte mittels des Programms MS-Excel

(MS-Office 97 Fa Microsoft USA) Die statistischen Auswertungen erfolgten mittels

des Programms StatView for Windows 50 (Abacus Concepts Berkley USA)

3 Ergebnisse

31 Praumloperative Zellkultivierung

Die Keratinozyten konnten problemlos aus der Epidermis nach dem Abloumlsen von der

Dermis und der Behandlung mit Trypsin gewonnen werden Die Verwendung des

houmlher konzentrierten Trypsins (025 anstelle 005 ) fuumlhrte zu einer besseren

Zellausbeute und hatte keinen negativen Einfluss auf die Vitalitaumlt der Zellen Bei der

Kontrolle mittels der Trypanblau Faumlrbung zeigte sich keine verstaumlrkte Anfaumlrbbarkeit

der Zellen da nur lysierte bzw abgestorbene Zellen den blauen Farbstoff

aufnehmen Die ausgesaumlten Keratinozyten zeigten auf mit Kollagen Typ I

beschichteten Kulturflaschen eine schnellere Adhaumlrenz und verbesserte

Wachstumseigenschaften als auf unbeschichteten Kulturflaschen Durch die

beguumlnstigte Adhaumlrenz konnte der Zellverlust beim ersten Mediumwechsel nach 2

Tagen reduziert werden

Die Kultivierung der Fibroblasten erwies sich ebenfalls als problemlos Aufgrund des

guten Wachstums der Fibroblasten war die Verwendung der teureren mit Kollagen

beschichteten Kulturflaschen nicht notwendig

32 Verlauf des Tierversuchs

321 Operation

Bei der Verwendung des handelsuumlblichen Fibrinklebers musste darauf geachtet

werden die Fibrinogen-Komponente vor der Herstellung der Suspension im

Waumlrmebad auf 37 degC zu erwaumlrmen da das Fibrinogen ansonsten zur Erstellung der

Suspension zu viskoumls war

Beim Auftragen der zwei Komponenten mit Hilfe der Doppelspritze auf die Wunden

war es wichtig die zuvor wegen der Zellen auf Eis gelagerten Spritzen auf

Raumtemperatur zu bringen da ansonsten die zwei Komponenten nur unzureichend

zu Fibrin aushaumlrteten

Nach der Exzision der Vollhautwunden war auf eine suffiziente Blutstillung zu achten

um die Bildung von Haumlmatomen unter den Transplantaten zu vermeiden Bei einigen

Wunden konnte am 7 post-OP Tag eine Serombildung beobachtet werden Die

Entlastung durch das vorsichtige Eroumlffnung mit einem spitzen Skalpell fuumlhrte zu

einem komplikationslosen weiteren Wundheilungsverlauf

Bei der Wahl der Wundgroumlszligen und der Verbandstechnik konnte auf die Erfahrungen

von Versuchen aus der eigenen Arbeitsgruppe zuruumlckgegriffen werden Die

Defektgroumlszlige musste groszlig genug gewaumlhlt werden um das Transplantat in der Mitte

mit etwas Abstand zu den Wundraumlndern aufzutragen Eine Groumlszlige von 5 x 5 cm

erwies sich hierzu als geeignet (Abb3-1 3-2) Somit wurde erreicht dass sich zentral

ein neues Epithel bilden konnte bevor die vom Rand einwachsende Haut das

Transplantat erreichte [Compton et al 1989]

Bei der Verbandstechnik war es wichtig ein fuumlr die Wundheilung optimales Milieu zu

schaffen und gleichzeitig die fragilen Transplantate vor mechanischen Belastungen

die zB beim ldquoSich-Scheuernldquo der Tiere entstanden zu schuumltzen Die Verwendung

von direkt auf die Transplantate aufgetragener Fettgaze (Grassolindreg Fa Hoffmann

BRD) und einer darauf angebrachten durchlaumlssigen Siliconfolie (Biobranereg)

verhinderte ein Austrocknen der Wunden und ein Sekretstau Die Silikonfolie wurde

an den Wundraumlndern mit einem nicht resorbierbarem Faden fixiert und nach einer

Woche beim ersten Verbandswechsel entfernt

Abb 3-1 Nach sorgfaumlltiger Blutstillung wurden die Transplantate an den Raumlndern der Exzisionswunden eingenaumlht

Abb 3-2 Nach erfolgter Transplantation sieht man den bereits ausgehaumlrteten Fibrinkleber als glaumlnzende geleeartige Schicht Auf Wunde V ist das geschlitzte AlloDermreg sichtbar (Pfeil)

322 Versuchsverlauf

Bis zum kompletten Verschluss der Wunden war entscheidend dass die Verbaumlnde

stabil genug waren um den taumlglichen Belastungen standzuhalten Die gewaumlhlte

Methode die Wundflaumlchen zusaumltzlich mit einer Schaumstoffplatte die mit

Verbandsklebestreifen (FixomullHaftreg Fa Beiersdorf) fixiert wurde zu schuumltzen

erwies sich hierzu als hilfreich Bei einem Versuchstier konnte jedoch nicht verhindert

werden dass sich der Verband einige Tage nach der Transplantation auf einer Seite

abscherte und es bei 3 Wunden daraufhin zu Wundinfektionen kam Diese Wunden

konnten daher nicht in die Auswertung mit einbezogen werden Ein weiteres Tier

wurde 2 Tage nach erfolgter Hautentnahme tot im Stall aufgefunden Die

Entnahmestelle zeigte keine Anzeichen einer Infektion Bei der Obduktion durch eine

Tieraumlrztin wurde ein Strangulationsileus diagnostiziert

Insgesamt gingen 9 Tiere in die Bewertung ein 5 Tiere fuumlr den Kurzzeitversuch 4 fuumlr

den Langzeitversuch

33 Makroskopische Wundheilung Wundkontraktion und Elastizitaumltsbestimmung

331 Einheilung der Transplantate

Von insgesamt 51 in die Auswertung einbezogene Wunden zeigten 42 (823 ) am

post-OP-Tag 14 eine positive Einheilungsrate Bei der KFGS-Gruppe zeigten am 14

post-OP Tag 7 von 9 Wunden eine Neoepithelbildung und somit eine positive

Einheilung (778) Bei der F-KFGS-Gruppe waren es 6 von 8 Wunden (75 ) Bei

der Verwendung der humanen dermalen Matrix heilten alle 12 Wunden ein (100)

In der hAD+F Gruppe waren es 12 von 13 Wunden (923 ) die eine positive

Einheilungsrate aufwiesen Am schlechtesten schnitten die Gruppen ab bei denen

porcine Dermis zum Einsatz kam Diese stand bei 5 Tieren zur Verfuumlgung Porcines

AlloDermreg mit Fibroblasten heilte bei 3 von 5 Wunden (60 ) nach 14 Tagen ein

porcines AlloDermreg ohne Fibroblasten bei 2 von 4 Wunden (50 )

Die besten Einheilungsraten erzielten die Gruppen die mit humanem AlloDermreg

behandelt wurden Sowohl die hAD als auch die hAD+F Gruppe hatte eine Rate von

uumlber 90 (Abb 3-3)

Einheilungsraten

823 778 75

100923

0102030405060708090

gesamt KFGS KFGS+F hAD hAD+F pAD pAD+F

Abb 3-3 Einheilungsraten am post-OP Tag 14 Gesamt sind 42 von 51 Wunden eingeheilt KFGS 7 von 9 KFGS+F 6 von 8 hAD 12 von 12 hAD+F 12 von 13 pAD 2 von 4 und pAD+F 3 von 5

332 Wundverschluss Zur Beurteilung des Wundverschlusses am Tag 28 post-OP wurde folgende

Einteilung durchgefuumlhrt

a) Von der Wundflaumlche ist weniger als die Haumllfte verschlossen (lt50 )

b) Mindestens die Haumllfte der Flaumlche weist einen Verschluss auf (50-100 )

c) Es liegt ein kompletter Wundverschluss vor (100 )

Grundlegend lieszlig sich feststellen dass die Wunden der Transplantatgruppen die

kultivierte Fibroblasten enthielten am 28 post-OP Tag einen fortgeschritteneren

Wundverschluss aufwiesen als die Gruppen ohne Fibroblasten

Bei der KFGS-Gruppe waren zum definierten Zeitpunkt 2 Wunden komplett

verschlossen und 5 Wunden zeigten einen uumlber 50 -igen Wundverschluss Im

Vergleich dazu waren bei der F-KFGS-Gruppe 4 Wunden vollstaumlndig und 2 uumlber 50

verschlossen

Auch bei der Verwendung des humanen Dermisersatzes ergaben sich durch die

zusaumltzliche Verwendung von Fibroblasten deutliche Unterschiede In der Gruppe mit

Fibroblasten waren 8 Wunden komplett und 4 zwischen 50-100 verschlossen

Ohne Fibroblasten wiesen 5 Wunden einen 100 Wundverschluss auf 6 waren

uumlber 50 und eine unter 50 verschlossen

Bei der Verwendung von porcinem AlloDermreg mit Fibroblasten waren nach 28

Tagen 2 Wunden ganz und eine mehr als zur Haumllfte verschlossen Ohne Fibroblasten

erreichte zu diesem Zeitpunkt keine Wunde einen kompletten Verschluss 2 Wunden

waren zwischen 50-100 geschlossen

Der Wundverschluss wurde vor allem durch die autologen Fibroblasten positiv

beeinflusst Die Verwendung einer dermlen Matrix hatte keinen zusaumltzlichen

positiven Effekt Die besten Ergebnisse zeigten die Gruppen hAD+F und F+KFGS

(Abb 3-4)

Wundverschluss nach 28 Tagen

KFGS KFGS+F hAD hAD+F pAD pAD+F

50-100

Abb 3-4 Wundverschluss aller Gruppen 28 Tage nach der Transplantation 100 = kompletter Wundverschluss 50 ndash 100 = mehr als die Haumllfte der Flaumlche einer Wunde ist verschlossen 50 = weniger als die Haumllfte der Flaumlche einer Wunde ist verschlossen Beispiel hAD+F Von insgesamt 12 eingeheilten Wunden weisen nach 28 Tagen 8 einen kompletten Wundverschluss auf 4 Wunden sind zu 50-100 verschlossen

333 Die makroskopische Wundheilung Die makroskopische Wundheilung im Uumlberblick

7 Tage nach der Transplantation sieht man auf allen Wunden ein frisches gut

vaskularisiertes Granulationsgewebe Bei den mit einer dermalen Matrix behandelten

Wunden ist diese teilweise unter dem Granulationsgewebe noch zu erkennen An

post-OP Tag 14 hat sich teilweise bereits ein Neoepithel gebildet Das

Oberflaumlchenrelief ist unregelmaumlszligig An Tag 28 herrscht ein nahezu kompletter

Wundverschluss mit einer duumlnnen Epithelschicht vor Die bereits stattfindende

Wundkontraktion ist erkennbar Stellenweise sind die Wunden mit Fibrinschorf

bedeckt Nach 6 Monaten sind alle Wunden verheilt Im Gegensatz zur gesunden

Haut weisen sie eine staumlrkere Pigmentierung auf und sind durch das Fehlen der

Hautanhangsgebilde gekennzeichnet Das Ausmaszlig der Kontraktion der

verschiedenen Gruppen wird besonders deutlich (Abb 3-5 a bis d)

Abb 3-5 b Abb 3-5 a

Abb 3-5 d

Abb 3-5 c

Abb 3-5 a-d Uumlberblick der makroskopischen Wundheilung An post-OP Tag 7 sieht man ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe auf allen Wunden Bei Wunden die mit AlloDermreg behandelt wurden schimmert die Matrix stellenweise durch (Pfeil Abb 3-5 a) An post-OP Tag 14 hat sich teilweise ein Neoepithel mit mattem Aspekt gebildet (Abb 3-5 b) An post-OP Tag 28 sind alle Wunden durch eine duumlnne Epithelschicht verschlossen Die eingesetzte Wundkontraktion ist deutlich zu erkennen (Abb 3-5 c) Nach 6 Monaten ist die Wundheilung abgeschlossen und das Ausmaszlig der Wundkontraktion wird besonders deutlich Vergleiche die starke Wundkontraktion der mit KFGS behandelten Wunde VI mit der geringeren Kontraktion der hAD+F Wunde IV (Pfeile Abb 3-5 d)

3331 KFGS-Gruppe Wie bei allen Wunden hat sich an post-OP Tag 7 uumlber die gesamte Wunde hinweg

ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe ausgebildet Neoepithel ist zu diesem

Zeitpunkt makroskopisch noch nicht erkennbar (Abb 3-6) Am 28 Tag hat sich

neben der Epitheleinwanderung vom Wundrand her auch eine zentral gelegene

Epithelinsel gebildet Ein kompletter Wundverschluss wird nicht erreicht (Abb 3-7)

Abb 3-6 Tag 7 KFGS Man erkennt das gut durchblutete Granulationsgewebe

Abb 3-7 Tag 28 KFGS Man erkennt die beginnende Reepithlisierung vom Wundrand her (Pfeil) und eine zentral gelegene Epithelinsel (Blockpfeil)

3332 F-KFGS-Gruppe An Tag 7 besteht ein stark vaskularisiertes Granulationsgewebe ohne Epithel wie bei

der Mehrheit der anderen Gruppen auch Im Vergleich zur KFGS-Gruppe zeigt sich

ein etwas matter Aspekt was auf eine beginnende Neoepithelisierung hindeutet

(Abb 3-8) An Tag 14 sieht man ein duumlnnes Neoepithel mit mattem Aspekt das sich

uumlber die gesamte Wunde erstreckt (Abb 3-9) Einige Wunden aus dieser Gruppen

sind zu diesem Zeitpunkt noch nicht vollstaumlndig mit Neoepithel bedeckt An Tag 28 ist

die Wunde teilweise mit Fibrinschorf bedeckt teilweise bildet sich eine stabile

Epidermis aus Der Wundverschluss ist insgesamt weiter fortgeschritten als bei der

KFGS-Gruppe

Abb 3-8 Tag 7 F-KFGS Zu erkennen ist ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe

Abb 3-9 Tag 14 F-KFGS Zu erkennen ist der matte Aspekt des sich neu bildenden Epithels

3333 hAD-Gruppe Im Vergleich zu den Gruppen ohne Dermis kann man hier bereits an Tag 7 eine von

den Wundraumlndern her stattfindende Reepithelisierung und Fibrinreste als milchig-

weiszlige Oberflaumlche erkennen (Abb 3-10) An Tag 14 hat sich auf den meisten mit hAD

behandelten Wunden ein zartes Neoepithel gebildet (vgl Abb 3-9) An Tag 28 ist der

Groszligteil der Wunden zwar komplett verschlossen die unregelmaumlszligige Oberflaumlche

weist jedoch auf noch stattfindende Umbauprozesse mit einer unausgereiften

Epidermis hin (Abb 3-11)

Abb 3-10 Tag 7 hAD Neben dem frischen Granulationsgewebe ist eine von den Wundraumlndern einsetzende Reepithelisierung zu erkennen

Abb 3-11 Tag 28 hAD Der Wundverschluss ist nahezu komplett Die unregelmaumlszligige Oberflaumlche weist auf noch stattfindende Unbauprozesse hin

3334 hAD+F-Gruppe Diese Gruppe weist an Tag 14 eine uumlber die gesamte Wundflaumlche ausgedehnte

Neoepithelbildung auf zT mit einem unregelmaumlszligigen Relief Nach 28 Tagen sind

die Wunden der hAD+F-Gruppe vollstaumlndig verschlossen Die Wunde ist bereits

belastbar (Kneiftest) und weist von allen Gruppen die geringste Kontraktion auf (Abb

3-12) Nach 6 Monaten hat sich eine geschmeidige bdquoneue Hautldquo mit einer glatten

Oberflaumlche gebildet die sich von der gesunden Haut nur noch bezuumlglich der leichten

Hyperpigmentation und fehlenden Hautanhangsgebilde unterscheidet (Abb 3-13)

Abb 3-13 6 Monate hAD+F Es hat sich eine belastbare geschmeidige bdquoneueldquo Haut gebildet die sich durch fehlende Hautanhangsgebilde und einer staumlrkeren Pigmentierung von der gesunden Haut unterscheidet

Abb 3-12 Tag 28 hAD+F Die Wunde ist vollstaumlndig verschlossen bei geringer Wundkontraktion Auffallend ist die starke Pigmentierung der Wunde

3335 pAD-Gruppe An Tag 7 ist das dicke porcine AlloDermreg unter dem Granulationsgewebe noch

deutlich zu erkennen An Tag 14 ist die Wunde groumlszligtenteils mit Epithel bedeckt es

liegen jedoch einzelne Stellen des porcinen AlloDermreg frei (Abb 3-14) An Tag 28

zeigt sich eine weitgehend geschlossene zum Teil mit Fibrinschorf bedeckte Wunde

(Abb 3-15)

Abb 3-15 Tag 28 pAD Die Wunde zT mit Fibrinschorf bedeckt ist noch nicht komplett verschlossen

Abb 3-14 Tag 14 pAD Einzelne Stellen der porcinen Matirx liegen noch frei (Pfeil) Die Wunde ist groumlszligtenteils epithelisiert

3336 pAD+F-Gruppe Auch hier schimmert an Tag 7 die porcine dermale Matrix durch das

Granulationsgewege durch An Tag 14 faumlllt eine vollstaumlndigere Neoepithelbildung auf

als bei der pAD-Gruppe ohne Fibroblasten Die Oberflaumlche weist ein unregelmaumlszligiges

Relief auf (Abb 3-16) Nach 28 Tagen ist die Wund nahezu vollstaumlndig verschlossen

Nach 6 Monaten ist die Wunde komplett verheilt Der stattgefundene

Kontraktionsvorgang wird anhand der eintaumltowierten Wundraumlndern deutlich Die

Wundoberflaumlche ist glatt und hyperpigmentiert (Abb 3-17)

Abb 3-17 6 Monate pAD+F Die Wunde ist verheilt Deutlich wird die stattgefundene Kontraktion und Hyperpigmentierung der Wunde

Abb 3-16 Tag 14 pAD+F Zu erkennen ist eine von zentral ausgehende Epithelisierung (Pfeil)

334 Planimetrische Auswertung der Kontraktion Die Bestimmung der Wundflaumlchen und somit der Kontraktion erfolgte sowohl bei den

Kurz- wie auch bei den Langzeittieren am 14 und am 28 post-OP Tag sowie bei

den Langzeittieren 3 und 6 Monate nach der Transplantation

Bei allen Wunden kann von einer Ausgangsflaumlche von 25 cmsup2 ausgegangen werden

Wegen dem Groumlszligenzuwachs der Tiere wurden nur die Flaumlchen der Wundgruppen

eines Messtages miteinander verglichen und nicht die Ergebnisse einzelner Gruppen

uumlber den gesamten Verlauf hinweg

Bereits nach der ersten Messung am 14 post-OP Tag weisen alle mit Fibroblasten

behandelte Gruppen eine geringere Kontraktion auf als die Gruppen ohne

Fibroblasten Diese Tendenz ist auch am 28 post-OP Tag zu beobachten Zu

diesem Zeitpunkt weist die hAD+F Gruppe die geringste Kontraktion auf Nach 3

Monaten hat sich der Unterschied zwischen den Dermis-Gruppen mit bzw ohne

Fibroblasten zugunsten der Gruppen mit Fibroblasten noch verstaumlrkt Bei den

Messungen nach 3 und 6 Monaten sind keine wesentlichen Unterschiede

festzustellen Die Gruppen mit der geringsten Wundkontraktion nach 3 und 6

Monaten sind hAD+F und pAD+F (Abb 3-18 bis 3-22)

post-OP Tag 14 post-OP Tag 28 post-OP 6 Monate

hAD (n=12) 2005 cmsup2 (plusmn234) 1691 cmsup2 (plusmn145) 1928 cmsup2 (plusmn284)

hAD+F (n=12) 2195 cmsup2 (plusmn215) 2005 cmsup2 (plusmn139) 2377 cmsup2 (plusmn629)

pAD (n=2) 1814 cmsup2 (plusmn346) 1617 cmsup2 (plusmn106) 1548 cmsup2 (plusmn122)

pAD+F (n=3) 1963 cmsup2 (plusmn274) 1765 cmsup2 (plusmn172) 2303 cmsup2 (plusmn622)

KFGS (n=7) 1868 cmsup2 (plusmn358) 1651 cmsup2 (plusmn202) 2052 cmsup2 (plusmn34)

KFGS+F (n=6) 2207 cmsup2 (plusmn399) 1727 cmsup2 (plusmn265) 1640 cmsup2 (plusmn472)

Abb 3-18 Tabellarische Uumlbersicht der Transplantatflaumlchen der einzelnen Gruppen an den verschiedenen Messtagen In Klammern hinter den Flaumlchenangaben die jeweiligen Standardabweichungen

Kontraktion d14

hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F

dflauml

Abb 3-19 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen am post-OP Tag 14 Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und KFGS+F (Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspenion) weisen die geringste Wundkontraktion auf Alle mit Fibroblasten behandelten Gruppen zeigen eine geringere Kontraktion im Vergleich mit den entsprechenden Gruppen ohne Fibroblasten

Kontraktion d28

dflauml

Abb 3-20 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen am post-OP 28 Die Gruppe hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) weist die geringste Wundkontraktion auf Alle mit Fibroblasten behandelten Gruppen zeigen eine geringere Kontraktion im Vergleich mit den entsprechenden Gruppen ohne Fibroblasten

Kontraktion nach 3 Monaten post-OP

Flaumlc

Abb 3-21 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen nach 3 Monaten Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen die geringste Wundkontraktion auf

Flaumlc

335 Bestimmung der Elastizitaumlt der Transplantatflaumlchen mit der Vakuumsonde

Die Elastizitaumltsmessungen erfolgten bei den Langzeittieren nach 6 Monaten bevor

die Tiere aus dem Versuch ausschieden Bei der Bestimmung der maximalen

Auslenkung mit der 8 mm Sonde zeigen die Gruppen hAD+F und pAD+F mit der

Kontrollhaut vergleichbare Ergebnisse (Abb 3-23) Bei der Elastizitaumltsbestimmung

zeigt sich dass alle Gruppen sowohl mit der 2 mm Sonde als auch mit der 8 mm

Sonde ein aumlhnliches Verhalten bezuumlglich der Elastizitaumlt wie die Kontrollhaut

(gesunde Haut auf dem Ruumlcken der Tiere) aufweisen (Abb 3-24 3-25)

max Auslenkung (8mm Sonde)

002040608

112141618

hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr

Abb 3-23 Maximale Auslenkung gemessen mit einer 8 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen vergleichbare Ergebnisse wie die Kontrolle (gesunde Haut) auf

Elastizitaumlt (8mm Sonde)

0010203040506070809

Abb 3-24 Elastizitaumlt bei Verwendung der 8 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Elastizitaumlt wird bestimmt aus dem Quotient von Ruumlckbildung nach staffgefundener Auslenkung (Retraktion) und der maximalen Auslenkung (Elongation)

Elastizitaumlt 2mm Sonde 1sec

Abb 3-25 Elastizitaumlt bei Verwendung der 2 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Elastizitaumlt wird bestimmt aus dem Quotient von der Ruumlckbildung nach staffgefundener Auslenkung (Retraktion) und der maximalen Auslenkung (Elongation) Alle Gruppen weisen mit der Kontrolle (gesunde Haut) vergleichbare Ergebnisse auf

34 Histologische Resultate

3411 Ergebnisse der Gruppen

KFGS- F-KFGS-Gruppen

Am 7 post-OP Tag laumlsst sich in einigen Praumlparaten die Fibrinmatrix als homogenes

eosinrotes Netzwerk erkennen Das gebildete Neoepithel ist noch weitgehend

inhomogen mit diffus angeordneten Zellkonglomeraten die stellenweise tief in die

Dermis hineinreichen Das Stratum corneum ist duumlnn ausgebildet Alle Histologien

zeigen eine deutliche Parakeratose und eine leichte Hyperkeratose (Abb 3-26)

Am 14 post-OP Tag bildet sich die anfaumlngliche Parakeratose zuruumlck und die

Hyperkeratose verstaumlrkt sich Die Fibrinmatrix ist nicht mehr nachweisbar

Nach 28 Tagen vollzieht sich eine Ausdifferenzierung des Epithels mit Entwicklung

einer intakten Basalmembran und Praumlservierung der Reteleisten Als Ausdruck einer

abgeschlossenen Differenzierung laumlsst sich die charakteristische Schichtung vom

Stratum basale zum Stratum corneum mit einer mehrlagigen Hornschicht

nachweisen Eine Gefaumlszligbildung ist in der Dermis zu erkennen (Pfeil Abb 3-27) In

der aus dem Randbereich entnommenen Biopsie ist das eingelagerte

Taumltowierpigment nachweisbar (Pfeil Abb 3-28)

Abb 3-26 Tag 7 KFGS HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein inhomogenes parakeratotisches Epithel

Abb 3-27 Tag 28 KFGS HE Faumlrbung Neben dem ausdifferenzierten Epithel ist ein Gefaumlszlig in der Dermis zu sehen (Pfeil)

Abb 3-28 Tag 28 KFGS+F HE Faumlrbung Man erkennt das in der Dermis eingelagerte Taumltowierpigment (Pfeil)

hAD- hAD+F- Gruppen

Histologisch laumlsst sich bereits am 7 post-OP Tag ein duumlnnes unverhorntes

Neoepithel erkennen das stellenweise stark hyperproliferiert und eine deutliche

Parakeratose aufweist Aufgrund der geschlitzten Struktur des AlloDermreg kann man

die Einwanderung von Keratinozyten entlang der Schlitze sehen (Pfeil Abb 3-29) In

der Elastica-van-Gieson-Faumlrbung wird der Verbleib der Dermis anhand der

elastischen Fasern ersichtlich (Pfeil Abb 3-30) Oberhalb der Dermis sieht man eine

epithelartige Keratinozytenanordnung

Am 14 Tag zeigt sich die Einheilung der azellulaumlren Dermis und die Bildung eines

Neoepithels Das Epithel stellt sich teilweise noch inhomogen dar und weist eine

mehrschichtige Verhornung auf Die Hyperkeratose bildet sich zuruumlck Reste des

Fibrinklebers sind nicht mehr nachweisbar (Abb 3-31) Die Vitalitaumlt und die

Ausdifferenzierung der Keratinozyten wird durch die Dermis als Diffusionsbarriere

nicht erkennbar gestoumlrt Die dermale Matrix ist in der Haumlmatoxilin-Eosin-Faumlrbung

nicht deutlich abgrenzbar In der Elastica-van-Gieson-Faumlrbung (EvG) ist das

AlloDermreg anhand seiner elastischen Fasern am 14 Tag noch erkennbar Im

Verlauf ist eine strukturelle Auflockerung sowie ein Verlust an elastischen Fasern zu

verzeichnen In der Trichrom-Faumlrbung lassen sich durch die Anordnung einzelner

Kollagenfasern die sich verstaumlrkt anfaumlrben Ruumlckschluumlsse auf den Verbleib der

Matrix ziehen Die anfaumlngliche Parakeratose bildet sich am 14 post-OP Tag zuruumlck

Am 28 Tag hat sich ein durchgaumlngiges Epithel gebildet mit der als Ausdruck einer

abgeschlossenen Differenzierung charakteristischen Schichtung vom Stratum basale

zum Stratum corneum Fasern des AlloDermreg sind nicht mehr nachweisbar (Abb 3-

In saumlmtlichen Biopsien zeigt sich kein Anhalt fuumlr eine stattfindende oder abgelaufene

Abstoszligungsreaktion des AlloDermreg es sind keine perivaskulaumlren Infiltrate oder

groumlszligere Lymphozytenanteicherungen zu erkennen Die erkennbare jedoch zum

physiologischen Wundheilungsprozess gehoumlrende Einwanderung von Granulozyten

in das Wundbett nimmt im Verlauf stetig ab

Abb 3-29 Tag 7 hAD+F HE Faumlrbung Durch das geschlitzte AlloDermreg eingewanderte Keratinozyten

Abb 3-30 Tag 7 hAD+F EvG Faumlrbung Man erkennt die schwarz angefaumlrbten elastischen Fasern (Pfeil) des transplantierten humanen AlloDermreg Daruumlber Epithelbildung (Blockpfeil)

Abb 3-32 Tag 28 hAD+F HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein gut ausdifferenziertes leicht hyperproliferiertes Epitel und regelmaumlszligig ausgebildete Reteleisten (Pfeil)

Abb 3-31 Tag 14 hAD HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein mehrschichtig verhornendes Epithel

pAD- pAD+F-Gruppen

Die eingeheilten Transplantate zeigen am post-OP Tag 28 ein orthokeratotisches

zT noch hyperproliferiertes Epithel In der Gruppe mit Fibroblasten bilden sich

deutlichere Reteleisten aus (Abb 3-33) als in der Gruppe ohne praumlinkubierte

Fibroblasten (Abb 3-34) In der Trichrom-Faumlrbung sieht man vereinzelte stark

angefaumlrbte Kollagenfasern die einen unregelmaumlszligigen Verlauf zeigen (Pfeil Abb 3-

35) Hierbei koumlnnte es sich um Uumlberreste des transplantierten porcinen

Dermisersatzes handeln

Abb 3-34 Tag 28 pAD HE Faumlrbung Die Parakeratose bildet sich zuruumlck Reteleisten sind nicht nachweisbar

Abb 3-33 Tag 28 pAD+F HE Faumlrbung Es stellen sich ein hyperproliferiertes Epithel und gut ausgebildete Reteleisten dar

Abb 3-35 Tag 28 pAD+F Trichrom Faumlrbung Es heben sich vereinzelt staumlrker angefaumlrbte Kollagenfasern hervor Hierbei handelt es sich wahrscheinlich um Reste des transplantierten porcinen AlloDermreg

Langzeitergebnisse nach 6 Monaten

6 Monate nach der Transplantation laumlsst sich in allen Gruppen ein ausdifferenziertes

mehrschichtiges Epithel mit intakter Basalmembran und Praumlservierung der

Reteleisten nachweisen In den Gruppen mit Fibroblasten faumlllt die Ausbildung der

Reteleisten ausgepraumlgter aus als in den Gruppen ohne Fibroblasten (Abb 3-36 3-

37 3-38) Die statistische Signifikanz wurde mit dem Student-Newman-Keuls-Test

bestimmt Signifikant besser schnitt die Gruppe pAD+F im Vergleich zur pAD Gruppe

ab genauso wie die Gruppe KFGS+F im Vergleich zur KFGS Gruppe Kein

signifikanter Unterschied besteht zwischen hAD+F und hAD Im Vergleich mit pAD

und KFGS schneidet hAD signifikant besser ab dh hAD ohne Fibroblasten fuumlhrt

ebenfalls zu einer besseren Ausbildung der Reteleisten Unterschiede zwischen den

mit Fibroblasten behandelten Gruppen (hAD+F pAD+F KFGS+F) bestehen nicht

Die Zelldichte der Dermis nahm im Vergleich zu den Biopsien am Tag 28 deutlich ab

Reste des transplantierten AlloDermreg sind nicht mehr zu sehen Die Regeneration

der funktionsfaumlhigen Dermis befindet sich in der Reifungs- bzw Endphase die bis zu

einem Jahr oder laumlnger anhalten kann Es kommt zu einer Umbildung der

Kollagenfasern mit Reorganisation des Kollagens

Ausbildung der Reteleisten

000050100150200250300350400450

Abb 3-36 Ausbildung der Reteleisten nach 6 Monaten bewertet anhand einer Skala von 1(=keine Reteleisten ausgebildet) bis 4 (=Reteleisten gut ausgebildet) Die Gruppen die zusaumltzlich mit autologen Fibroblasten behandelt wurden bilden bessere Reteleisten aus als die Gruppen ohne Fibroblasten Bei den Gruppen ohne Fibroblasten weist die hAD (humanes AlloDermreg) Gruppe das beste Ergebnis auf

Abb 3-37 6 Monate KFGS HE Faumlrbung Abb 3-38 6 Monate pAD+F HE Faumlrbung

Abb 3-37 und 3-38 Nach 6 Monaten wird die unterschiedlich starke Ausbildung der Reteleisten bei den Gruppen mit und ohne Fibroblasten deutlich Links ein Beispiel einer Gruppe ohne Fibroblasten Hier haben sich keine Reteleisten gebildet Rechts eine mit Fibroblasten behandelte Wunde mit gut ausgebildeten Reteleisten (Pfeile)

3412 Nachweis der markierten Fibroblasten auf dem Dermisersatz in vitro

Auf den Fluoreszenzaufnahmen 7 Tage nach Besiedlung ist zu erkennen dass die

Fibroblasten in die Matrix bestehend aus humanem AlloDermreg einwanderten und in

diese integriert wurden (Abb 3-39) Im Vergleich dazu sind bei dem porcinen

dermalen Konstrukt die Fibroblasten nur auf der Oberflaumlche der beimpften Seite zu

sehen Eine Einwanderung der Zellen in die Matrix fand nicht statt (Abb 3-40)

Auszligerdem wird auf diesen Aufnahmen die unterschiedliche Strukturdichte der beiden

Konstrukte deutlich Die humane Matrix erweist sich als lockerer im Vergleich zur

dichten porcinen Matrix

Abb 3-39 Humaner dermaler Ersatz besiedelt mit fluoreszenzmarkierten FibroblastenDie Fibroblasten wandern in das Konstrukt ein (Pfeile)

Abb 3-40 Porciner dermaler Ersatz besiedelt mit fluoreszenzmarkierten Fibroblasten Die Fibroblasten wandern kaum in das Konstrukt ein und lagern sich va an der Oberflaumlche ab (Pfeile)

Kollagen VII - Faumlrbung

Bereits am 7 post-OP-Tag laumlsst sich in einigen Biopsien Kollagen VII als Bestandteil

der Ankerfibrillen der Basalmembran eines noch duumlnnen und unverhornten Epithels

anfaumlrben (Abb 3-41) In Biopsien die zu diesem Zeitpunkt noch keine Epithelbildung

aufweisen laumlsst sich ebenfalls eine durchgaumlngige basalmembranaumlhnliche Struktur

anfaumlrben die in der Mitte des Praumlparates vorliegt (Pfeil Abb 3-42) Anhand der

Lokalisation kann am ehesten von dem transplantierten humanen Kollagen

ausgegangen werden Ab Tag 14 laumlsst sich eine durchgehende positive Anfaumlrbung

unterhalb des Epithels nachweisen wobei hier auch neugebildetes

Schweinekollagen vorliegen kann (Abb 3-43) Da eine hohe Kreuzreaktivitaumlt

zwischen humanem und porcinem Kollagen besteht kann man uumlber den

Beobachtungszeitraum von 4 Wochen keine genaue Aussage uumlber den Ursprung

machen Bei Proben ohne dermale Transplantate laumlsst sich in der Fruumlhphase keine

Kollagen VII-Struktur nachweisen

Nach 6 Monaten ist in allen ausgewerteten Gruppen eine intakte kontinuierliche

Basalmembran nachweisbar Unterschiede zwischen den Gruppen bestehen nicht

(Abb 3-44 3-45)

Abb 3-42 Tag 7 hAD Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung der Basalmembran des transplantierten AlloDermreg (Pfeil)

Abb 3-41 Tag 7 hAD Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung der Basalmembran eines duumlnnen unverhornten Epithels (Pfeil)

Abb 3-44 6 Monate hAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembran (Pfeil)

Abb 3-43 Tag 14 hAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembran (Pfeil)

Abb 3-46 Negativkontrolle Kollagen VII Faumlrbung

es laumlsst sich keine Basalmembranstruktur anfaumlrben

Abb 3-45 6 Monate pAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembean (Pfeil)

Die indirekte Immunperoxidase-Faumlrbung gegen α-sm-Aktin wurde durchgefuumlhrt um

den moumlglichen Einfluss der zu Myofibroblasten umgewandelten Fibroblasten auf die

Kontraktion zu zeigen Unterschiede wurden zwischen den Gruppen mit und ohne

Fibroblasten deutlich So kommt es zu einer diffusen groszligflaumlchigen Anfaumlrbung ab

dem 14 Tag von α-sm-Aktin als Bestandteil von Myofibroblasten in den Gruppen

ohne praumlinkubierte Fibroblasten Im Vergleich dazu zeigen die Gruppen deren

dermale Matrices vor der Transplantation mit autologen Fibroblasten inokuliert

wurden weit weniger Bereiche die sich durch die indirekte Immunperoxidasereaktion

rotbraun anfaumlrben lieszligen (Abb 3-47 3-48) Aumlhnliches ist bei den Gruppen mit KFGS

und F-KFGS zu beobachten Auch hier lassen sich in den Gruppen die mit F-KFGS

behandelt wurden weniger Myofibroblasten durch α-sm-Aktin nachweisen als in den

Gruppen mit KFGS

Auch am post-OP-Tag 28 laumlsst sich bei den mit Fibroblasten vorbehandelten

Gruppen eine schwaumlchere α-sm-Aktin Anfaumlrbung nachweisen als bei den Gruppen

ohne Fibroblasten Exemplarisch werden hierfuumlr die Gruppen hAD und hAD+F

dargestellt (Abb 3-49 3-50)

Nach 6 Monaten kommt es lediglich im Bereich von Gefaumlszligen zur Anfaumlrbung von α-

sm-Aktin (Abb 3-51) Gefaumlszligwaumlnde bestehen zum Teil aus glatten Muskelzellen die

in ihrem Zytoplasma α-sm-Aktin enthalten Unterschiede zwischen den

verschiedenen Gruppen lassen sich nicht mehr beobachten Der

Kontraktionsvorgang ist abgeschlossen

Abb 3-48 Tag 14 hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung schwacher Nachweis von Myofibroblasten

Abb 3-47 Tag 14 hAD α-sm-Aktin Faumlrbung starker Nachweis von Myofibroblasten

Abb 3-50 Tag 28 hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung Die Anfaumlrbung faumlllt schwaumlcher aus als in der Gruppe ohne Fibroblasten ( vgl Abb 3-52)

Abb 3-49 Tag 28 hAD α-sm-Aktin Faumlrbung Es zeigen sich groszligflaumlchig angefaumlrbte Areale (Pfeile)

Abb 3-52 Negativkontrolle α-sm-Aktin Faumlrbung Abb 3-51 6 Monate hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung Anfaumlrbungr der Glatten Muskelzellen im Bereich der Gefaumlszlige (Pfeile)

4 Diskussion

41 Allgemeine Gegebenheiten

Waumlhrend die Mortalitaumlt nach ausgedehnten Verbrennungsverletzungen durch

intensivmedizinische Fortschritte kontinuierlich faumlllt waumlchst der Wunsch die

Morbiditaumlt der entstandenen Wundflaumlchen ebenfalls auf ein Minimum zu reduzieren

Biotechnologisch hergestellter Hautersatz kann mittlerweile zwar zur Behandlung von

Verbrennungswunden in groszligen Mengen produziert werden vermag jedoch nur

ansatzweise die anatomischen Strukturen und physiologischen Funktionen der Haut

wiederherzustellen Bis heute sind ausschliesslich autologe Vollhauttransplantate

freie oder gestielte Lappenplastiken und Gewebeexpansionen zur Wiederherstellung

von anatomisch und funktionell gesunder Haut in der Lage Die unzaumlhligen

Eigenschaften der normalen unverletzten Haut wie protektive perzeptive und

regulatorische Funktionen die den menschlichen Koumlrper mit seiner Umwelt im

Gleichgewicht halten machen es so schwierig den optimalen Hautersatz zu

entwickeln

42 Geschichte

Die ersten Bemuumlhungen auf diesem Gebiet reichen weit in die Vergangenheit zuruumlck

So gelang es Ljunggren bereits im Jahre 1898 Hautstuumlcke bis zu 6 Monate

auszligerhalb des Organismus in Ascitesfluumlssigkeit am Leben zu halten und wieder zu

retransplantieren [Ljunggren 1898] Allerdings gelang es nicht die Oberflaumlche der

Transplantate mit dieser Methode zu vergroumlszligern Weitere Probleme waren die

Kontamination der Kulturen mit Bakterien und die Uumlberwucherung durch Fibroblasten

[Leigh 1994]

421 Keratinozytenkultivierung und die Entwicklung von bdquosheet graftsldquo 1975 waren es Rheinwald und Green die humane Keratinozyten isoliert uumlber

mehrere Passagen hinweg kultivierten Als Ammenzellen dienten bestrahlte

Maumlusefibroblasten die ihre Teilungsfaumlhigkeit verloren hatten Dieses sogenannte

bdquofeeder layerldquo ermoumlglichte die Proliferation der Keratinozyten die zu mehrlagigen

nach oben ausdifferenzierten Klonen heranwuchsen und nach ungefaumlhr 20-50

Generationen (entspricht 6-7 Passagen) abstarben Bis zu dieser Zeit war eine

Zunahme der Ausgangsbiopsie-Oberflaumlche um das 6000fache moumlglich [Rheinwald

und Green 1975]

Neben der Verwendung des Trypsins einer Protease die die Zellen enzymatisch aus

ihrem Verband loumlst waren es ua die Verbesserung der Kulturmedien mit

Antibiotikazusaumltzen und die Moumlglichkeit des keimfreien Arbeiten an sterilen

Werkbaumlnken die zu dem Erfolg auf dem Gebiet der dissoziierten Zellkultivierung

fuumlhrte [Rheinwald und Green 1975 Freshney 1992]

Hennings et al fand 1980 heraus dass durch niedrige Calcium-Konzentrationen im

Medium die Keratinozyten keine Desmosomen ausbilden und somit besser

proliferieren Statt dessen formen sie ein Monolayer und differenzieren nicht aus

Wird die Calcium-Konzentration erhoumlht bilden die Keratinozyten innerhalb weniger

Tage ein mehrlagiges Epithel [Hennings et al 1980] Ein weiterer Effekt der

niedrigen Calcium-Konzentration besteht darin dass das Wachstum der Fibroblasten

gehemmt wird Somit kann verhindert werden dass die Keratinozyten von den

Fibroblasten uumlberwuchert werden [De Luca und Cancedda 1992]

Eine weitere Innovation auf diesem Gebiet war die Identifizierung von

Wachstumsfaktoren wie zum Beispiel EGF (bdquoepidermal growth factorldquo) und KGF

(bdquokeratinocyte growth factorldquo) Die Verwendung dieser Faktoren hatte zur Folge dass

auf einen Serumzusatz im Medium und ein bdquofeeder layerldquo verzichtet werden konnte

[Boyce und Ham 1983] Mittlerweile sind zahlreiche bdquoserumfreieldquo

Keratinozytenmedien kommerziell erhaumlltlich denen meist noch

Rinderhypophysenextrakt und Antibiotika hinzugefuumlgt werden [De Luca und

Cancedda 1992]

Die Etablierung und die Standardisierung der Keratinozytenkultivierung und die

daraus entstandene Moumlglichkeit autologe Keratinozyten als konfluente mehrlagige

bdquosheet graftsldquo zu zuumlchten fuumlhrte 1981 durch OrsquoConnor erstmals zur klinischen

Anwendung Die Deckung ausgedehnter Brandwunden mit diesen sogenannten CEA

(bdquocultured epithelial autograftldquo) stellt seit uumlber 20 Jahren das bei weitem am

haumlufigsten geuumlbte Verfahren bei der klinischen Anwendung von Hautersatz durch

bdquoTissue Engineeringldquo dar Diese Methode ist vor allem dann von Bedeutung wenn

Brandopfer mehr als 70 ihrer Koumlrperoberflaumlche verloren haben und eine

Spalthautentnahme fuumlr den Organismus ein zu groszliges weiteres Trauma darstellt

[Hull et al 1990 Gustafson und Kratz 1999] Das Verfahren das mittlerweile

hundertfach bei Patienten weltweit durchgefuumlhrt wurde hat jedoch auch etliche

Nachteile [Donati et al 1992] Keratinozyten in differenzierten mehrlagigen

epithelialen Transplantaten repraumlsentieren eher einen ruhenden postmitotischen

Zelltyp als einen aktivierten Zelltyp Es gibt Anzeichen dass die proliferative Potenz

der mehrlagigen bdquosheet graftsldquo eingeschraumlnkt ist [De Luca und Cancedda 1992

Juhasz et al 1993] Auszligerdem entspricht die Integrin-Expressioin von basalen

Keratiozyten in einem CEA eher der von normaler unverletzter Haut Bei der

enzymatischen Abloumlsung aus der Kulturflasche mit Dispase kommt es zur

Kontraktion der Haumlutchen und zu einem voruumlbergehenden Verlust von α6β4-

Integrinen welche fuumlr die Adhaumlsion der Zellen von essentieller Bedeutung sind und

zur Internalisierung der Hemidesmosomen der basalen Zellschicht fuumlhrt [Poumay et

al 1994] Die daraus resultierende Immaturitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs

und die verzoumlgerte Rekonstitution der Basalmembran mit ausbleibender Bildung von

Reteleisten [Woodley et al 1988 Raghunath und Meuli 1997] machen das

Transplantat extrem empfindlich gegen Scherkraumlfte und fuumlhren selbst noch Monate

bis Jahre nach der Transplantation zu spontanen Blasenbildungen [Rennekampff et

al 1996] Durch das doch recht komplizierte Herstellungsverfahren sind die Kosten

fuumlr die bdquosheet graftsldquo sehr hoch Auszligerdem werden 3-5 Wochen benoumltigt um eine 18

msup2 groszlige Zellschicht aus einer 2 cmsup2 groszligen Biopsie zu erhalten Deshalb ist eine

voruumlbergehende Deckung der Wunden mit synthetischen Hautersatzmaterialien oder

Leichenhaut erforderlich Die duumlnne Neoepidermis ist sowohl bei dem Abloumlsen aus

der Kulturflasche als auch bei der Transplantation aumluszligerst schwierig handzuhaben

422 Verschiedene Traumlgermaterialien Zur Umgehung der enzymatischen Abloumlsung und zur Vereinfachung der

chirurgischen Handhabbarkeit wurden Keratinozyten auf verschiedenen

Traumlgermaterialien kultiviert darunter diverse natuumlrliche oder synthetischen

Substanzen wie Polyurethan-Mambranen [Juhasz et al 1993] Silikon-Kollagen-

Membranen Hyaluronsaumlurefolien Kollagenschwaumlmme [Jones et al 2002] und

Fibrinkleber [Hunyadi et al 1988 Kaiser et al 1994 Stark und Kaiser 1994]

Durch die Verwendung von autologen kultivierten Keratinozyten als

Einzelzellsuspension in Fibrinkleber wird die Kultivierungszeit verkuumlrzt und die Zellen

werden zu einem Zeitpunkt mit optimaler Wachstumspotenz transplantiert Nach nur

zweiwoumlchiger Kultivierungsphase konnte die Anwendung sowohl experimentell als

auch klinisch gezeigt werden [Stark et al 1995 Horch et al 1998]

Fibrin als Matrixbaustein und gleichzeitiges Transplantationsvehikel fuumlr Zellen hat in

den letzten Jahren zunehmende Aufmerksamkeit erfahren Hunyadi stellte 1988

erstmals Fibrinkleber als Applikationsmatrix fuumlr einzelne nicht kultivierte

Keratinozyten in Form einer Suspension zur Behandlung von Vollhautwunden vor

[Hunyadi et al 1988] Dabei spielen die guumlnstigen Eigenschaften des Fibrins eine

wichtige Rolle Als Endprodukt der Gerinnungskaskade unterstuumltzt Fibrin die

Haumlmostase und das Einsprossen von neuen Blutgefaumlszligen im Rahmen der

Wundheilung [Giardino et al 1994] Auszligerdem wurde ein guumlnstiger Effekt auf die

Proliferations- und Migrationsfaumlhigkeit von Keratinozyten und Fibroblasten

verbesserte Einheilungsraten und reduzierte Infektionen beobachtet [Ronfard et al

1991 Jabs et al 1992 Kaiser et al 1994]

423 Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension Zur Herstellung der Fibrinkleber-Keratinozyten-Suspenion werden kultivierte

Keratinozyten in einem subkonfluenten Stadium in die Traumlgermatrix eingebracht

Somit entgehen sie der Kontaktinhibition und weisen eine houmlhere proliferative Potenz

und damit eine houmlhere Wundheilungspotenz auf als ein konfluenter Zellrasen der

bereits zur Differenzierung angeregt wurde und somit mehr postmitotische Zellen

enthaumllt [Kaiser et al 1994 Stark und Kaiser 1994 Stark et al 1995] Allerdings ist

bei dieser Methode eine houmlhere Zellzahl notwendig Nur die Zellen der

dreidimensionalen Fibrinmatrix die auf dem Wundbett zu liegen kommen bilden ein

Neoepithel Die anderen wachsen zu Zellnestern zusammen und gehen allmaumlhlich

durch Abschilferung verloren Auch im Bereich der Basalmembran brachte die KFGS

Vorteile mit sich Im Vergleich zu sheet-graft-Transplantaten entwickelte sich bereits

in der Fruumlhphase der Wundheilung eine reifere Basalmembran Die Applikation der

Suspension stellt sich einfacher dar als die Transplantation von den fragilen bdquosheet

graftsldquo [Bannasch et al 2000] So koumlnnen auch Stellen abgedeckt werden die mit

herkoumlmmlichen bdquosheet graftsldquo nicht zu behandeln sind

424 bdquocomposite-graftsldquo Ein weiterer Ansatz bei der Herstellung von Hautersatz ist die Entwicklung

sogenannter bdquocomposite graftsldquo welche aus einer bdquoepithelialenldquo und einer bdquodermalenldquo

Komponente bestehen

Verschiedenste Materialien wurden bislang als Dermissubstitute eingesetzt ua

prozessierte Leichendermis Kollagenpraumlparate und in vitro hergestellte kultivierte

Substrate [Boyce 2001 Jones et al 2002] In vitro Experimente zeigten die

Wichtigkeit einer intakten Basalmembran von dermalen Strukturen und

proliferierenden Keratinozyten fuumlr optimales Zellwachstum

Erst durch die Kombination von Keratinozyten mit einer dermalen Matrix lassen sich

auch tiefere Wunden mit Verlust der Lederhaut effektiv behandeln Der definitive

Wundverschluss ist einfacher und schneller zu bewerkstelligen und auch die

Einheilungsraten von epidermalen bdquosheetsldquo auf einer Dermis transplantiert sind sehr

zufriedenstellend Es wird bei Anwendung der oben genannten Methode in klinischen

Studien von einer Einheilungsrate von fast 94 berichtet [Hickerson et al 1994] Die

epithelialen und dermalen Komponenten scheinen sich durch gegenseitige

Stimulation positiv auf die Bildung von Basalmembranproteinen auszuwirken

Zwischen Keratinozyten und dermalen Fibroblasten findet eine Kommunikation statt

die zur fruumlhzeitigen Bildung von Reteleisten und Ankerfibrillen fuumlhrt [Konig und

Bruckner-Tuderman 1991 Compton et al 1993]

Diese Ergebnisse fuumlhrten zur Entwicklung von bdquoVollhaut-Substitutenldquo bestehend aus

kultivierten Keratinozyten extrazellulaumlrer Matrix und aus kultivierten dermalen

Fibroblasten Schon in den achtziger Jahren wurden Hautersatzverfahren bestehend

aus autologen epidermalen Anteilen und einer allogenen Dermis zur Behandlung

schwerer Verbrennungswunden erfolgreich eingesetzt [Cuono et al 1986 Langdon

et al 1988] Allerdings kam in diesen Faumlllen Leichenhaut zum Einsatz deren

allogener epidermaler Anteil einige Zeit nach der Transplantation abradiert und mit

autologen Keratinozyten ersetzt wurde Somit wurde ein definitiver Wundverschluss

mit einer allogenen dermalen Matrix und autologen kultivierten Keratinozyten nach

zweizeitiger operativer Behandlung erreicht

Mittlerweile ist vorbehandelte allogene Dermis kommerziell erhaumlltlich Hierbei

handelt es sich um das auch in der vorliegenden Arbeit verwendete Produkt

AlloDermreg dass mittels eines patentierten Verfahrens von der antigenreichen

Epidermis bei Erhalt der Basalmembran getrennt wird und weiterhin saumlmtliche

zellulaumlren Strukturen wie beispielsweise Endothelzellen aus der Dermis herausgeloumlst

werden Die Bedeutung einer erhaltenen Basalmembran verdeutlichte Ralston 1999

[Ralston et al 1999] Beim Vergleich praumlparierter dermaler Konstrukte mit und ohne

Basalmembran kam es bei der Gruppe mit Basalmembran zur Bildung von

Hemidesmosomen Dies fuumlhrte zur besseren Anheftung der epithelialen Zellen an der

Dermis zur weiteren Differenzierung des Epithels und zur bleibenden Bildung von

Basalmembranproteinen wie Laminin und Kollagen IV [Guo und Grinnell 1989

Ralston et al 1999] Neben der Basalmembran bleibt auch die Exrazellulaumlrmatrix mit

kollagenen und elastischen Fasern des AlloDermreg intakt So bleiben beispielsweise

die extrazellulaumlren Strukturen ehemaliger Gefaumlszligsysteme erhalten und dienen bei der

Revaskularisierung der Transplantate als ldquoLeitschienenldquo Durch die Moumlglichkeit der

Gefriertrocknung steht ein gut haltbares und verfuumlgbares Produkt bereit [Ben-Bassat

et al 2001] dass als Vorlage der dermalen Regeneration dient indem es besiedelt

vaskularisiert und von dem umgebenden Gewebe inkorporiert wird [Livesey et al

Obwohl die dezellulierte Dermis als immunologisch inert gilt und zahlreiche

Arbeitsgruppen eine Abstoszligungsreaktion ausschlieszligen [Heck et al 1985

Matouskova et al 1993] postuliert Srivastava et al dass die Verwendung

xenogener Dermis im Vergleich zu allogener Dermis eine verzoumlgerte Wundheilung

und eine verstaumlrkte Kontraktion aufweist [Srivastava et al 1999]

Kombiniert man AlloDermreg mit duumlnnen Spalthauttransplantaten so erhaumllt man einen

Komposit-Hautersatz der von den Heilungsergebnissen mit denen von dicken

Spalthauttransplantaten vergleichbar ist [Wainwright et al 1996 Lattari et al 1997]

Vorteil dieser Methode ist dass die Morbiditaumlt des Spenderhautareals wesentlich

geringer ausfaumlllt

425 Bedeutung der Fibroblasten in der Wundheilung Neben den Keratinozyten spielen auch die Fibroblasten eine bedeutende Rolle im

Prozess der Wundheilung Waumlhrend der proliferativen Phase der Wundheilung

stellen sie sogar die wichtigsten Zellen dar Sie produzieren Matrixproteine wie zum

Beispiel Kollagen was einen entscheidenden Beitrag zur mechanischen Stabilitaumlt

leistet und dienen als Quelle zahlreicher Wachstumsfaktoren

Dass kultivierte Fibroblasten einen Einfluss auf die epidermale Regeneration haben

und in die Dermis integriert werden wurde ua von Svensjouml gezeigt Die

Transplantation von Fibroblasten auf Vollhautwunden beschleunigt die

Reepithelisierung Als Kotransplantation mit kultivierten Keratinozyten bildete sich

eine groumlszligere Anzahl von Keratinozytenkolonien im Vergleich zur Gruppe ohne

Fibroblasten die sich im weiteren Verlauf zur Wundoberflaumlche hin orientierten und

dort in Neoepidermis uumlbergingen [Svensjo et al 2002] Vergleichbar ist dieser Effekt

mit den sogenannten bdquofeeder layerldquo aus Fibroblasten die Rheinwald und Green zur

seriellen in vitro Kultivierung von Keratinozyten nutzte [Rheinwald und Green 1975]

Neben der epidermalen Regeneration besteht auch ein Einfluss auf die dermale

Regeneration durch die Fibroblasten Eine mit Fibroblasten besiedelte Dermis wird

verzoumlgert degradiert und es kommt zur Reduktion der Myofibroblastenbildung mit

reduzierter Wundkontraktion [Lamme et al 1998] Der Zelltyp der Myofibroblasten

wurde erstmals durch Gabbiani et al beschrieben [Gabbiani et al 1971]

Myofibroblasten sind sowohl Fibroblasten als auch Glatten Muskelzellen in ihren

morphologischen und biochemischen Eigenschaften sehr aumlhnlich Waumlhrend der

Wundheilung entwickeln sie sich aus Granulationsgewebe-Fibroblasten und

exprimieren voruumlbergehend den Marker der Glatten Muskelzelldifferenzierung α-

smooth-muscle-Aktin Dieser Marker kommt in Glatten Muskelzellen

Myoepithelzellen und in den Glatten Muskelzellen der Gefaumlszlige vor [Desmouliere et

al 1993] Waumlhrend der Wundheilung sind Myofibroblasten Bestandteil des

Granulationsgewebes und korrelieren in Anzahl und Verteilung mit der

Wundkontraktion [Gabbiani et al 1971 McGrath und Hundahl 1982 Gabbiani

43 Eigenes Projekt Vollhautersatz durch kultivierte autologe Keratinozyten als Suspension in Fibrinkleber in Kombination mit einer dermalen Matrix mit und ohne Fibroblasten

Einen Ansatz im Sinne der Idee bdquoRegeneration statt Reparaturldquo verfolgt die eigene

Gruppe Die Moumlglichkeit der simultanen Applikation von kultivierten Keratinozyten

und einer mit autologen Fibroblasten besiedelten dermalen Matrix in vivo ohne

vorherige Kokultivierung in vitro wurde am Groszligtiermodell des Schweines untersucht

Dahinter steht die Ansicht Zellen und Matrix mit Regenerationspotential direkt in vivo

zu applizieren anstatt aufwendige Konstrukte in vitro zu generieren Auf einen

zweiten operativen Eingriff kann somit verzichtet werden

Wie die Ergebnisse der eigenen Arbeit belegen fuumlhrt die einzeitige Applikation von

kultivierten autologen Keratinozyten in Fibrinklebersuspension in Kombination mit

einer dermalen Matrix bei der Behandlung von Vollhautwunden zum erfolgreichen

Wundverschluss Daruumlber hinaus tragen die kultivierten autologen Fibroblasten

zahlreiche positive Einfluumlsse zur Wundheilung bei wie beispielsweise die Reduktion

der Wundkontraktion

431 Wundkontraktion Es konnte gezeigt werden dass bereits bei den ersten Kontraktionsmessungen am

14 post-OP Tag alle Gruppen die mit Fibroblasten vorinkubiert wurden eine

geringere Kontraktion aufwiesen als die Gruppen die nicht mit kultivierten

Fibroblasten vorbehandelt wurden Bei den Gruppen mit dermaler Matrix sowohl

human als auch porcin setzte sich diese Tendenz bis zur letzten Messung nach 6

Monaten fort Stets wiesen die mit Fibroblasten behandelten Wunden eine geringere

Kontraktion auf als die Vergleichsgruppen ohne Fibroblasten

Eine reduzierte Wundkontraktion ist ein wichtiger Schritt bei der Optimierung des

Hautersatzes Eine stark ausgepraumlgte Wundkontraktion fuumlhrt besonders im Bereich

von Gelenken zu Kontrakturen mit erheblichen Funktionseinbuszligen weil der volle

Bewegungsumfang nicht mehr erreicht wird

Lamme zeigte dass die Fibroblastenmigration aus der Subkutis in die Wunde

verzoumlgert stattfindet wenn sich bereits kultivierte Fibroblasten in den transplantierten

Konstrukten befinden [Lamme et al 1998] Es scheint dass die eingewanderten

Fibroblasten mehr zur Differenzierung wirksame Signale erhalten die dann zur

Bildung der zur Kontraktion befaumlhigten Myofibroblasten fuumlhren

Lamme et al fuumlhrte Untersuchungen durch in denen er die Anzahl der

transplantierten Fibroblasten variierte In der mit einer houmlheren Zahl an Fibroblasten

inokulierten Gruppe zeigte sich eine α-sm-Aktin Anfaumlrbung der Myofibroblasten fast

ausschlieszliglich um Gefaumlszligstrukturen herum In Wunden ohne Fibroblasten waren sich

Bereiche mit einer deutlichen Myofibroblastenanfaumlrbung vorhanden [Lamme et al

2000] Ein komplettes Ausbleiben der α-sm-Aktin Anfaumlrbung mit Ausnahme der

Gefaumlszligstrukturen konnte in der vorliegenden Arbeit nicht beochachtet werden Ein

deutlicher Unterschied an Intensitaumlt und Flaumlche der Anfaumlrbung wurde jedoch deutlich

Dass es auch bei den Gruppen mit Fibroblasten zu einer Myofibroblastenanfaumlrbung

kam wenn auch deutlich schwaumlcher mag daran liegen dass die von Lamme et al

eingesetzte maximale Zellzahl nicht erreicht wurde (auch Lamme hatte in Gruppen

mit weniger Fibroblasten α-sm-Anfaumlrbungen jedoch geringer als die azellulaumlren

Gruppen) Nach 6 Monaten lieszligen sich Myofibroblasten in allen Gruppen nur noch

um Gefaumlszlige herum anfaumlrben Dies ist damit zu erklaumlren dass zu diesem Zeitpunkt der

Kontraktionsvorgang als abgeschlossen gilt

432 Vaskularisieung des Transplantats Inokulierte kultivierte Fibroblasten verzoumlgern auszligerdem den Abbau der

transplantierten dermalen Konstrukte [Lamme et al 1998] Die verlaumlngerte Praumlsenz

des dermalen Konstrukts koumlnnte fuumlr die Geweberegeneration von Vorteil sein weil

die Matrix als Vorlage fuumlr Zellinfiltration Vaskularisierung und Proliferation dient So

ergeben sich hieraus moumlglicherweise positive Einfluumlsse auf die Ernaumlhrung des neuen

Konstruktes was eines der Hauptprobleme bei der Zuumlchtung von Ersatzgewebe ist

Aufgrund der anfaumlnglich stattfindenden Ernaumlhrung der epidermalen Zellen durch

Diffusion ist die Dicke des Hautersatzes limitiert Je dicker das Transplantat desto

schwieriger ist seine Neovaskularisation durch das Empfaumlngerlager desto groumlszliger ist

jedoch seine mechanische Belastbarkeit desto besser ist seine Sensibilitaumlt und

desto geringer ist seine sekundaumlre Schrumpfungsneigung Je nach

Transplantatdicke bedarf es 2-5 Tage bis zur Neovaskularisation des

Hauttransplantats Bis dahin wird es durch Diffusion aus dem Transplantatlager

ernaumlhrt Eine Diffusionbarriere innerhalb der ersten Stunden fuumlhrt zum

unweigerlichen Absterben der transplantierten Zellen Die schlechten

Einheilungsraten des porcinen AlloDermreg in der vorliegenden Studie koumlnnen damit

erklaumlrt werden Das porcine Kollagenkonstrukt war mit 0675 mm um ein Vielfaches

dicker als das humane AlloDermreg (01-05 mm)

Ein rein mechanischer Ansatz um dieses Problem zu loumlsen besteht in der

Schlitzung der Transplantate wodurch Wundfluumlssigkeit mit Wachstumsfaktoren etc

die Zellen an der Oberflaumlche erreichen kann

In Wunden mit porcinem AlloDermreg fand eine staumlrkere Infiltration von

Entzuumlndungszellen statt Ob es sich hierbei um eine Abstoszligungsreaktion oder ein

lokales Geschehen handelt kann nicht sicher beantwortet werden Aber auch bei

einigen Wunden mit humanem AlloDermreg kam es zur Infiltration von

Entzuumlndungszellen Dies koumlnnte eine Erklaumlrung dafuumlr bieten weshalb die Gruppen

mit Dermis im Vergleich zur Kontrollgruppe ohne Dermis keine wesentlichen

Unterschiede in der Wundkontraktion aufwiesen Bei Wunden mit

Entzuumlndungsreaktion kommt es zu einer verstaumlrkten Wundkontraktion [McGrath und

Hundahl 1982]

433 Reepithelisierung Die Beobachtung von Svensjouml dass die Transplantation von kultivierten Fibroblasten

auf Vollhautwunden die Reepithelisierung beschleunigt [Svensjo et al 2002]

bestaumltigt sich ebenfalls in der vorliegenden Arbeit Analysiert man den

Wundverschluss der einzelnen Gruppen nach 28 Tagen so zeigt sich dass die

Gruppen mit Fibroblasten zu diesem Zeitpunkt einen fortgeschritteneren

Wundverschluss aufweisen als die Gruppen ohne Fibroblasten Erst wenn eine

Wunde komplett reepithelisiert ist kommt es zu einem Ruumlckgang der Bildung von

Granulationsgewebe Dies wiederum stellt eine Voraussetzung fuumlr die narbenlose

Wundheilung dar Eine verzoumlgerte Reepithelisierung hat dagegen durch die

verstaumlrkte Bildung von Granulationsgewebe eine Sekundaumlrheilung mit Narbenbildung

zur Folge

Der positive Effekt der kultivierten Fibroblasten auf die Wundheilung laumlsst sich damit

erklaumlren dass die inokulierten Zellen einen oder mehrere Wachstumsfaktoren in die

Wundfluumlssigkeit sezernieren die den Heilungsprozess foumlrdern Sie nehmen

moumlglicherweise aktiv am Wundheilungsprozess teil indem sie auf zahlreiche Stimuli

waumlhrend des Heilungsvorgangs reagieren Studien haben belegt dass inokulierte

Fibroblasten die Faumlhigkeit zur Proliferation besitzen [Lamme et al 1998] und bis zu 5

Wochen nach Transplantation uumlberleben [Bell et al 1981]

434 Basalmembrankomplex Coulomb beschreibt die Entwicklung von Reteleisten nach 3 bis 4 Monaten und die

Neosynthese von elastischen Fasern nach 6 bis 9 Monaten bei Wunden die mit

Fibroblasten besiedeltem Kollagen und kultivierten Keratinozyten behandelt wurden

Im Vergleich kam es bei Wunden die nur mit epidermalen bdquosheetsldquo behandelt

wurden zu einer spaumlteren Ausbildung der Reteleisten Auszligerdem kam es zu

geringeren Schmerzen einer guten Haumlmostase und zu besseren mechanischen und

kosmetischen Eigenschaften [Coulomb et al 1998] Bei den lichtmikroskopischen

Untersuchungen der vorliegenden Studie zeigte sich ebenfalls eine deutlichere

Ausbildung der Reteleisten der Gruppen mit Fibroblasten Reteleisten mit ihren

papillaumlren Verzahnungen zwischen Epidermis und Dermis sind von Bedeutung fuumlr die

mechanische Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs aber auch fuumlr die

Oberflaumlchenvergroumlszligerung der Kontaktzone des gut vaskularisierten Stratum papillare

der Dermis und der auf Ernaumlhrung durch Diffusion angewiesenen Epidermis [Putland

et al 1995] Daruumlber hinaus zeigte Pins 2000 in einem in vitro Versuch dass die

Topographie der Basalmembran mit seinen Vertiefungen fuumlr die Differenzierung der

Keratinozyten von Bedeutung ist [Pins et al 2000] Weitere Hinweise auf die

Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs bietet der Nachweis verschiedener

Bestandteile der Basalmembran Kollagen VII als Hauptbestandteil der Ankerfibrillen

wird von Keratinozyten gebildet Die Ankerfibrillen befestigen die Basalmembran in

den Dermispapillen [Regauer et al 1990] Woodley fuumlhrte 1988 die Fragilitaumlt der

Epidermis nach Transplantation von bdquosheet graftsldquo auf die nicht vollstaumlndige

Ausbildung der Ankerfibrillen zuruumlck Bei der angeborenen Hautkrankheit

Epidermolysis bullosa bei der die Ankerfibrillen nur unzureichend ausgebildet

werden beziehungsweise gaumlnzlich fehlen kommt es bereits durch kleinste

mechanische Belastungen der Haut oder sogar spontan zur Blasenbildung

Bei den durchgefuumlhrten immunhistologischen Kollagen-VII Faumlrbungen ist ab Tag 14

eine in allen Gruppen einheitlich angefaumlrbte Basalmembran zu erkennen An Tag 7

laumlsst sich noch keine eindeutige Beurteilung treffen Aufgrund der Kreuzreaktivitaumlt

von porcinem und humanem Kollagen laumlsst sich der Ursprung der angefaumlrbten

Ankerfibrillen nur vermuten Da eine Anfaumlrbbarkeit nur in den Gruppen mit

transplantierter Dermis besteht muss wegen der Lage der angefaumlrbten Struktur

davon ausgegangen werden dass es sich um die Basalmembran des

transplantierten AlloDermreg handelt und nicht um eine neu gebildete porcine

Basalmembran Inwieweit die Basalmembran bis zum 14 Tag abgebaut und durch

eine sich neu gebildete ersetzt wird laumlsst sich nicht nachweisen

435 Elastizitaumltsbestimmung Die Elastizitaumltsmessungen nach 6 Monaten fanden statt um festzustellen ob es

zwischen den einzelnen Gruppen einen Unterschied hinsichtlich der

biomechanischen Eigenschaften gibt Die Hautqualitaumlt wurde mit dem Cutometerreg

MPA 580 bestimmt Laut einer Studie uumlber Systemische Sklerose ist das Geraumlt sehr

reliabel Enomoto erzielte mit der 8 mm Sonde hinsichtlich der Reproduzierbarkeit die

besten Ergebnisse [Enomoto et al 1996] Die duumlnne 2 mm Sonde misst die Qualitaumlt

der Epidermis und der oberflaumlchlichen Dermis die 8 mm Sonde die Dermis

zusammen mit der Beweglichkeit der Grenzschicht zwischen Dermis und

subkutanem Fettgewebe Anzumerken ist der Einfluss von Luftfeuchtigkeit und

Temperatur auf die Elastizitaumlt der Haut Deshalb sollten die Messungen stetes unter

gleichen Bedingungen durchgefuumlhrt werden Mittlerweile wird der Cutometerreg

zahlreich zur Evaluation von Verbrennungsnarben [Matsuzaki et al 1995 Fong et

al 1997] und von Hauttransplantaten nach rekonstruktiven Eingriffen verwendet [van

Zuijlen et al 2000]

Die Tatsache dass nach 6 Monaten kein Unterschied zwischen den einzelnen

Gruppen festzustellen war kann an der fortgeschrittenen Narbenreifung liegen Es

zeigten sich auch in den histologischen Untersuchungen nach 6 Monaten keine

wesentlichen Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen Die Epidermis war

mehrschichtig ausdifferenziert und von gleicher Dicke Auch die Dermis war

unauffaumlllig In allen Gruppen waren beispielsweise in der Elastica-van-Gieson

Faumlrbung elastische Fasern gleichermaszligen anfaumlrbbar Die Kollagenstruktur der

einzelnen Gruppen war vergleichbar Uumlberreste der transplantierten Dermis waren

meist nur bis zum 14 post-OP Tag nachweisbar In einer Arbeit von van Zuijlen lieszlig

sich beim Vergleich von Spalthauttransplantaten mit Kollagensubstitut und

Spalthauttransplantaten allein bei rekonstruktiven Eingriffen nach 3 Monaten ein

Elastizitaumltsunterschied feststellen Nach einem Jahr verhielten sich die Gruppen

gleich Bei der Behandlung von Verbrennungswunden bestand bereits nach 3

Monaten kein Unterschied in der Elastizitaumlt zwischen den Gruppen Die gleichen

Messergebnisse zwischen den einzelnen Gruppen sind auf die fortgeschrittene

Narbenreifung zuruumlckzufuumlhren

44 Schlussfolgerungen

bull Die einzeitige Applikation von KFGS und Dermis mit Fibroblasten fuumlhrt zum

Wundverschluss

bull Auf die Konstruktion aufwendiger und kostspieliger in vitro Konstrukte kann

verzichtet werden

bull Ein zweiter operativer Eingriff ist nicht notwendig

bull Die Epithelisierung und die Bildung der Reteleisten bei intakter Basalmembran

wird duch kultivierte autologe Fibroblasten gefoumlrdert

bull Kultivierte autologe Fibroblasten fuumlhren in Kombination mit einer dermalen Matrix

zu einer reduzierten Wundkontraktion

bull Kultivierte autologe Fibroblasten fuumlhren zu einer Reduktion der

Myofibroblastenbildung

bull Die Elastizitaumlt der bdquoneuenldquo Haut ist vergleichbar mit der gesunder Haut

bull Die durch bdquoTissue Engineeringldquo hergestellte Haut haumllt den alltaumlglichen

Belastungen uumlber einen Untersuchungszeitraum von 6 Monaten stand

5 Weitere Ansaumltze und Ausblicke

Weitere Ansaumltze im Bereich bdquoTissue Engineeringldquo sind die Veraumlnderungen der Zellen

durch gerichtete Gentherapie mittels diverser Transfektionsarten (liposomal viral

Genkanone Elektroporation) wodurch beispielsweise Keratinozyten bestimmte

Wachstumsfaktoren sezernieren sollen um die Wachstumsbedingungen oder die

Durchblutung der Konstrukte zu optimieren Ein aumlhnlicher Ansatz mit gleicher

Zielsetzung ist die topische Applikation spezifischer Wachstumsfaktoren zB durch

die externe Zufuumlhrung einer mit Wachstumsfaktoren angereicherten Loumlsung

Eines der groumlszligten Probleme beim Einsatz solcher Faktoren ist die Tatsache dass es

aufgrund fehlender Langzeitergebnisse keine gesicherten Hinweise auf eine

moumlgliche Entartungstendenz der genetisch veraumlnderten Zellen gibt Ebenso ist die

topische Applikation von Wachstumsfaktoren nicht hinreichend auf eine moumlgliche

Cancerogenitaumlt untersucht

Mit zunehmender Verbesserung der Anatomie und der Physiologie von

biotechnologisch hergestelltem Hautersatz wird es zu einer immer staumlrkeren

Annaumlherung an die natuumlrlichen Hauttransplantate kommen Verbesserungen auf

diesem Gebiet koumlnnten durch die Hinzunahme weiterer Zelltypen (zB Melanozyten)

und aus Matrixmodifikationen zur verbesserten Einheilung resultieren Weitere

Fortschritte koumlnnten in der Generierung von modifizierten nicht immunogenen

allogenen Keratinozyten bestehen die zu einem jederzeit verfuumlgbaren Epithelersatz

fuumlhren wuumlrden [Jones et al 2002]

Gezuumlchteter Hautersatz wird vielleicht eines Tages dem gegenwaumlrtigen

bdquoGoldstandard Spalthautldquo ebenbuumlrtig sein [Boyce 2001]

6 Zusammenfassung

Kultivierte autologe Keratinozyten als Suspension in Fibrinkleber (KFGS) stellen eine

etablierte Therapie bei schwersten Verbrennungen dar In Kombination mit

Fibroblasten findet eine gegenseitige Stimulation statt mit zahlreichen positiven

Einfluumlssen auf die Wundheilung Bei der Behandlung von tiefen drittgradigen

Wunden ist ausserdem der Ersatz des zerstoumlrten dermalen Anteils der Haut ein

wichtiger prognostischer Faktor Die Vollhautregeneration durch die einzeitige

Applikation dieser Bestandteile war Ziel dieses tierexperimentellen Versuchs

Subkonfluente porcine Keratinozyten- und Fibroblastenkulturen wurden nach 2-3

Wochen trypsinert und in Fibrinkleber suspendiert Fibroblasten wurden 4 Tage vor

der Transplantation auf einer azellulaumlren dermale Matrix (AlloDermreg human und

porcin) ausgesaumlt Auf dem Ruumlcken von 9 Hausschweinen wurden jeweils 6

Vollhautdefekte (5 x 5 cm) mit KFGS in Kombination mit azellulaumlrer Dermis

behandelt Die Dermis wurde sowohl mit als auch ohne praumlkultivierte Fibroblasten

transplantiert Als Kontrollen dienten Wunden die nur mit KFGS oder einer

Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension transplantiert wurden Der

Versuchszeitraum betrug 4 Wochen (n=5) bzw 6 Monate (n=4) Der makroskopische

Wundheilungsverlauf und die Wundkontraktion wurden fotografisch und planimetrisch

uumlber den gesamten Versuchszeitraum dokumentiert Die Wunden wurden am post-

OP Tag 7 und 14 biopsiert und nach 28 Tagen bzw nach 6 Monaten exzidiert

Haumlmatoxilin-Eosin- Elastica-van-Gieson- und Trichrom-Faumlrbungen wurden zum

Nachweis der Histomorphologie und der Einheilung der Transplantate durchgefuumlhrt

Immunhistologisch wurden Kollagen-VII und αminussm-Aktin Faumlrbungen zum Nachweis

der rekonstituierten kontinuierllichen Basalmembran und der Myofibroblasten

durchgefuumlhrt Die Qualitaumlt der Haut wurde nach 6 Monaten mittels eines

biomechanischen Tests untersucht

- Die einzeitige Applikation von Dermis und Keratinozyten fuumlhrt zum Wundverschluss

- Die Kombination von azellulaumlrer Dermis und Fibroblasten fuumlhrt zu einer deutlich

reduzierten Wundkontraktion

- Die Epithelisierung und Bildung von Reteleisten bei intakter Basalmembran wird

durch Fibroblasten gefoumlrdert

- Kultivierte Fibroblasten fuumlhren zu einer Reduktion der Myofibroblastenbildung

- Die Elastizitaumlt der bdquoneuenldquo Haut ist vergleichbar mit der normaler Haut

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74 Rennekampff H O V Kiessig S Griffey G Greenleaf and J F Hansbrough (1997) Acellular human dermis promotes cultured keratinocyte engraftment J Burn Care Rehabil 18(6) 535-44

75 Reverdin J (1872) De la greffe epidermique Arch Gen Med(19) 276 555703

76 Rheinwald J G and H Green (1975) Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes the formation of keratinizing colonies from single cells Cell 6(3) 331-43

77 Romeis Mikroskopische Technik Urban u Schwarzenberg 78 Ronfard V H Broly V Mitchell J P Galizia D Hochart E Chambon P

Pellerin and J J Huart (1991) Use of human keratinocytes cultured on fibrin glue in the treatment of burn wounds Burns 17(3) 181-4

79 Ruszczak Z and R A Schwartz (2000) Modern aspects of wound healing An update Dermatol Surg 26(3) 219-29

80 Schulz J T 3rd R G Tompkins and J F Burke (2000) Artificial skin Annu Rev Med 51 231-44

81 Sedlarik K and H Weidenbach (1993) Wundheilung Gustav Fischer Verlag Jena Stuttgart 2 Auflage 101-109

82 Singer A J and R A Clark (1999) Cutaneous wound healing N Engl J Med 341(10) 738-46

83 Srivastava A L J Jennings M Hanumadass S Sethi E DeSagun N Pavlis H M Reyes and R J Walter (1999) Xenogeneic acellular dermal matrix as a dermal substitute in rats J Burn Care Rehabil 20(5) 382-90

84 Stark G B and H W Kaiser (1994) Cologne Burn Centre experience with glycerol-preserved allogeneic skin Part II Combination with autologous cultured keratinocytes Burns 20 Suppl 1 S34-8

85 Stark G B H W Kaiser R E Horch J Kopp and G Spilker (1995) Cultured autologous keratinocytes suspended in fibrin glue (KFGS) with allogenic overgraft for definitive burn wound coverage Eur J Plast Surg 18 267-271

86 Sullivan T P W H Eaglstein S C Davis and P Mertz (2001) The pig as a model for human wound healing Wound Repair Regen 9(2) 66-76

87 Svensjo T F Yao B Pomahac T Winkler and E Eriksson (2002) Cultured autologous fibroblasts augment epidermal repair Transplantation 73(7) 1033-41

88 van Zuijlen P P A J van Trier J F Vloemans F Groenevelt R W Kreis and E Middelkoop (2000) Graft survival and effectiveness of dermal substitution in burns and reconstructive surgery in a one-stage grafting model Plast Reconstr Surg 106(3) 615-23

89 Vardaxis N J T A Brans M E Boon R W Kreis and L M Marres (1997) Confocal laser scanning microscopy of porcine skin implications for human wound healing studies J Anat 190 ( Pt 4) 601-11

90 Wainwright D J (1995) Use of an acellular allograft dermal matrix (AlloDerm) in the management of full-thickness burns Burns 21(4) 243-8

91 Wainwright D M Madden A Luterman J Hunt W Monafo D Heimbach R Kagan K Sittig A Dimick and D Herndon (1996) Clinical evaluation of an acellular allograft dermal matrix in full-thickness burns J Burn Care Rehabil 17(2) 124-36

92 Walden J L H Garcia H Hawkins J R Crouchet L Traber and D C Gore (2000) Both dermal matrix and epidermis contribute to an inhibition of wound contraction Ann Plast Surg 45(2) 162-6

93 Wood F M and M L Stoner (1996) Implication of basement membrane development on the underlying scar in partial thickness burn injury Burns 22(6) 459-62

94 Woodley D T H D Peterson S R Herzog G P Stricklin R E Burgeson R A Briggaman D J Cronce and E J OKeefe (1988) Burn wounds resurfaced by cultured epidermal autografts show abnormal reconstitution of anchoring fibrils Jama 259(17) 2566-71

95 Xu W L Germain F Goulet and F A Auger (1996) Permanent grafting of living skin substitutes surgical parameters to control for successful results J Burn Care Rehabil 17(1) 7-13

8 Veroumlffentlichungen

Im Rahmen der Arbeit entstanden folgende Veroumlffentlichungen Originalpublikationen H BANNASCH M FOEHN T UNTERBERG F KNAM B WEYAND G B STARK (2003) Gewebeersatz (tissue engineering) von Dermis und Epidermis Der Chirurg Band 74 Heft 9 September 2003 Seite 802-807 Vortraumlge M FOEHN F KNAM H BANNASCH RE HORCH GB STARK (2003) Preleminary Results Vollhautersatz durch Kombination einer autologen Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension und Fibroblasten in Kombination mit einer azellulaumlren Dermis - experimentelle Langzeituntersuchung am Schweinemodell 120 Kongress der Deutschen Gesellschaft fuumlr Chirurgie 29 April bis 02 Mai 2003 in Muumlnchen F KNAM M FOEHN H BANNASCH RE HORCH GB STARK (2003) Vollhautersatz durch Kombination einer autologen Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension und Fibroblasten in Kombination mit einer azellulaumlren Dermis ndash experimentelle Langzeituntersuchung am Schweinemodell 7 Kongress der Deutschen Gesellschaft fuumlr Wundheilung und Wundbehandlung 26-27 Juni 2003 in Augsburg Abstract in Zeitschrift fuumlr Wundheilung Sonderband 2003Seite 19 F KNAM M FOEHN H BANNASCH GB STARK (2003) Full thickness skin regeneration by combination of an autologous keratinocytes-fibrin-glue-suspension and fibroblasts combined with acellular dermis - an experimental long-term study in a pig model 2nd Annual Meeting of the European Tissue Engineering Society 03-06 September 2003 in Genua Abstract in Tissue Engineering Volume 9 Number 4 August 2003 Seite 831 F KNAM M FOEHN H BANNASCH GB STARK (2003) Vollhautersatz durch Kombination einer autologen Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension und Fibroblasten in Kombination mit einer azellulaumlren Dermis ndash experimentelle Langzeituntersuchung am Schweinemodell 34 Jahrestagung der Vereinigung der Deutschen Plastischen Chirurgen (VDPC) 8Jahrestagung der Deutschen Aumlsthetisch-Plastischen Chirurgen (VDAumlPC) 30 September ndash 05 Oktober 2003 in Freiburg Abstract in Plastische Chirurgie Supplement 1 3 Jahrgang September 2003 Seite 17

9 Lebenslauf

Friedrich Knam geboren am 02 Oktober 1976 in Baden-Baden Besuch der Grundschule Sasbach von 1983 bis 1987 Besuch der Heinschule Lender Gymnasium von 1987 bis 1996 Erlangung der allgemeinen Hochschulreife 1996 Ableistung eines bdquoAnderen Dienstes im Auslandldquo bei einer juumldischen Sozialarbeiterorganisation in New York City von Februar 1997 bis August 1998 Aufnahme des Studiums der Humanmedizin an der Albert-Ludwigs-Universitaumlt Freiburg im Oktober 1998 Aumlrztliche Vorpruumlfung im August 2000 Erster Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im August 2001 USMLE step 1 im Oktober 2001 Famulaturen in den Faumlchern Chirurgie Plastische Chirurgie Radiologie und Paumldiatrie in Wien New York City Freiburg und Prag in den Jahren 2001 bis 2003 Arbeit an der Dissertation im Tissue Engineering Labor der Abteilung fuumlr Plastische und Handchirurgie der Universitaumltsklinik Freiburg von Dezember 2001 bis September 2003 Promotionskolloquium im Januar 2004 Zweiter Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im April 2004 Praktisches Jahr von April 2004 bis Februar 2005 Innere Medizin am Tampa General Hospital der University of South Florida USA als Stipendiat der Medizinischen Fakultaumlt Freiburg Chirurgie am Diakonissenkrankenhaus in Karlsruhe und Plastische und Handchirurgie als Wahlfach an der Universitaumltsklinik Freiburg Dritter Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im April 2005 Approbation als Arzt und Promotion im Mai 2005

10 Danksagung

Fuumlr die Uumlberlassung des Themas bedanke ich mich recht herzlich bei meinem

Doktorvater Herrn Prof Stark Ganz herzlich moumlchte ich mich auch fuumlr die hilfreichen

Anregungen im Rahmen der woumlchentlich stattfindenden Doktorandenseminare und

der Moumlglichkeit die Arbeit auch bei groumlszligeren Veranstaltungen vorstellen zu duumlrfen

bedanken

Auszligerdem bedanke ich mich fuumlr die zuverlaumlssige und unkomplizierte Unterstuumltzung

durch meinen Betreuer Herrn Dr Bannasch der mir stets Vertrauen entgegenbrachte

und mir viel Freiraum lieszlig

Ein besonderer Dank gilt Herrn Dr Foumlhn der mir waumlhrend der gesamten Zeit stets

herzlich und geduldig beiseite stand mit mir Erfolge und auch Ruumlckschlaumlge teilte und

ohne dessen Mithilfe ich mir einen erfolgreichen Abschluss dieses Projekts nicht

vorstellen kann

Auch der tiermedizinischen Abteilung gilt mein herzlicher Dank besonders Herrn

Prof Haberstroh Frau Andrea Geist sowie dem gesamten tierpflegerischen Team fuumlr

die gewissenhafte und sorgfaumlltige Betreuung unserer Schweine

Ein herzliches Dankeschoumln auch an alle im Labor taumltigen insbesondere an Herrn Dr

Torio Padron die mir stets mit Rat und Tat zur Seite standen

Sehr Dankbar bin ich auch Herrn Alexander Klein der sich fuumlr die Vorkorrektur

meiner Arbeit sehr viel Zeit nahm und mir etliche hilfreiche Tipps gab

Ohne die groszligzuumlgige finanzielle Unterstuumltzung durch die Firma Baxter waumlre das

Projekt nicht realisierbar gewesen Hierfuumlr bedanke ich mich besonders bei Frau Dr

Katharina Bittner

Weiterhin moumlchte ich mich bei meinen Eltern meinen Groszligeltern und meinen

Geschwistern bedanken die mich alle auf ihre ganz besondere Weise waumlhrend der

letzten 2 Jahre unterstuumltzten und begleiteten

Einleitung

Allgemeines

Hautersatzstrategien

Anforderungen an einen Hautersatz

Temporaumlrer Hautersatz

Definitiver Hautersatz

Bedeutung der dermalen Matrix

Komposit-Hautersatz

Versuchstier Schwein

Fragestellung

Methodik

Uumlberblick

Zellkultivierung

Kultivierung der Schweinekeratinozyten

Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFKS)

Etablierung der Schweinefibroblastenkultur

Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Susp

Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten

Verwendung des humanen und des porcinen Dermisersatzes (All

Tierversuchsdurchfuumlhrung

Operation

Hautentnahme zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblaste

Taumltowierung und Transplantation

Verlauf des Kurz- und Langzeitexperiments postoperativ

Planimetrie zur Bestimmung der Wundkontraktion

Bestimmung der Einheilungsrate und des Wundverschlusses

Untersuchung der Hautqualitaumlt mit einer Saugsonde

Histologische Untersuchungen

Klassische Lichtmikroskopie

Immunhistochemie

Nachweis der rekonstituierten Basalmembran

Nachweis von Myofibroblasten

Bewertung der Reteleisten

Statistik und Computerprogramme

Ergebnisse

Praumloperative Zellkultivierung

Verlauf des Tierversuchs

Operation

Versuchsverlauf

Makroskopische Wundheilung Wundkontraktion und Elastizitaumlts

Einheilung der Transplantate

Wundverschluss

Die makroskopische Wundheilung

KFGS-Gruppe

F-KFGS-Gruppe

hAD-Gruppe

hAD+F-Gruppe

pAD-Gruppe

pAD+F-Gruppe

Planimetrische Auswertung der Kontraktion

Bestimmung der Elastizitaumlt der Transplantatflaumlchen mit der V

Histologische Resultate


Ergebnisse der Gruppen

Nachweis der markierten Fibroblasten auf dem Dermisersatz in

Immunhistochemie



Diskussion

Allgemeine Gegebenheiten

Geschichte

Keratinozytenkultivierung und die Entwicklung von bdquosheet gra

Verschiedene Traumlgermaterialien

Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension

bdquocomposite-graftsldquo

Bedeutung der Fibroblasten in der Wundheilung

Eigenes Projekt Vollhautersatz durch kultivierte autologe

Wundkontraktion

Vaskularisieung des Transplantats

Reepithelisierung

Basalmembrankomplex

Elastizitaumltsbestimmung

Schlussfolgerungen

Weitere Ansaumltze und Ausblicke

Zusammenfassung

Literaturverzeichnis

Veroumlffentlichungen

Lebenslauf

Danksagung

Dekan Prof Dr med J Zentner

1 Gutachter Prof Dr med GB Stark

2 Gutachter PD Dr med M Augustin

Jahr der Promotion 2005

1 EINLEITUNG 3

11 Allgemeines 3

14 Fragestellung 9

2 METHODIK 11

21 Uumlberblick 11

3 ERGEBNISSE 36

3331 KFGS-Gruppe 42

4 DISKUSSION 62

9 LEBENSLAUF 84

10 DANKSAGUNG 85

1 Einleitung

11 Allgemeines

Gewebes abhaumlngig

entsprach

14 Fragestellung

2 Methodik

21 Uumlberblick

hAD KFGS

F-KFGS

pAD+F KFGS

hAD+F KFGS

6 Monate)

angefaumlrbt

Gruppen

lt5050-100100

22 Zellkultivierung

(F-KFGS)

aufbewahrt

Abb 2-5 b Abb 2-5 a

geltendes Produkt

geschlitzt

231 Operation

Abb 2-7 2-9)

Schwanz Kopf

hAD KFGS

F-KFGS

hAD+F KFGS

Schwanz Kopf

pAD KFGS

hAD KFGS

F-KFGS

pAD+F KFGS

hAD+F KFGS

Wunden gesamt

alle Tiere 54

KFGS 9 4

KFGS+F 9 4

hAD+F KFGS 13 4

hAD KFGS 13 4

pAD+F KFGS 5 4

pAD KFGS 5 4

Muskel

Dermis

Epidermis

Keratinozyten

pAD KFGS

lus Fibroblasten

her Dokumentatio

durchgefuumlhrt Hie

g der autologen Ke

ere Entnahme der

tersuchung

pAD+F KFGS

roblasten

ension

verschlossen

aufgetragen

untersucht

positiv gewertet

Svensjo et al 2002]

Heilungsprozess

Basalmembran

kreuzreagiert

eingedeckelt

Zusammenhang

3 Ergebnisse

321 Operation

322 Versuchsverlauf

den Langzeitversuch

Einheilungsraten

823 778 75

100923

0102030405060708090

verschlossen

(Abb 3-4)

50-100

Abb 3-5 b Abb 3-5 a

Abb 3-5 d

Abb 3-5 c

KFGS-Gruppe

(Abb 3-15)

Kontraktion d14

dflauml

Kontraktion d28

dflauml

Flaumlc

002040608

112141618

0010203040506070809

hAD- hAD+F- Gruppen

pAD- pAD+F-Gruppen

000050100150200250300350400450

(Abb 3-44 3-45)

Gruppen mit KFGS

4 Diskussion

entwickeln

42 Geschichte

[Leigh 1994]

und Green 1975]

Cancedda 1992]

Komponente bestehen

der Wundkontraktion

Hundahl 1982]

zur Folge

Zuijlen et al 2000]

Wundverschluss

verzichtet werden

6 Zusammenfassung

9 Lebenslauf

10 Danksagung

bedanken

vorstellen kann

Katharina Bittner

Einleitung

Allgemeines






Komposit-Hautersatz


Fragestellung

Methodik

Uumlberblick

Zellkultivierung








Operation









Immunhistochemie





Ergebnisse



Operation

Versuchsverlauf



Wundverschluss


KFGS-Gruppe

F-KFGS-Gruppe

hAD-Gruppe

hAD+F-Gruppe

pAD-Gruppe

pAD+F-Gruppe







Immunhistochemie



Diskussion


Geschichte







Wundkontraktion


Reepithelisierung

Basalmembrankomplex


Schlussfolgerungen


Zusammenfassung



Lebenslauf

Danksagung

1 EINLEITUNG 3

11 Allgemeines 3

14 Fragestellung 9

2 METHODIK 11

21 Uumlberblick 11

3 ERGEBNISSE 36

3331 KFGS-Gruppe 42

4 DISKUSSION 62

9 LEBENSLAUF 84

10 DANKSAGUNG 85

1 Einleitung

11 Allgemeines

Gewebes abhaumlngig

entsprach

14 Fragestellung

2 Methodik

21 Uumlberblick

hAD KFGS

F-KFGS

pAD+F KFGS

hAD+F KFGS

6 Monate)

angefaumlrbt

Gruppen

lt5050-100100

22 Zellkultivierung

(F-KFGS)

aufbewahrt

Abb 2-5 b Abb 2-5 a

geltendes Produkt

geschlitzt

231 Operation

Abb 2-7 2-9)

Schwanz Kopf

hAD KFGS

F-KFGS

hAD+F KFGS

Schwanz Kopf

pAD KFGS

hAD KFGS

F-KFGS

pAD+F KFGS

hAD+F KFGS

Wunden gesamt

alle Tiere 54

KFGS 9 4

KFGS+F 9 4

hAD+F KFGS 13 4

hAD KFGS 13 4

pAD+F KFGS 5 4

pAD KFGS 5 4

Muskel

Dermis

Epidermis

Keratinozyten

pAD KFGS

lus Fibroblasten

her Dokumentatio

durchgefuumlhrt Hie

g der autologen Ke

ere Entnahme der

tersuchung

pAD+F KFGS

roblasten

ension

verschlossen

aufgetragen

untersucht

positiv gewertet

Svensjo et al 2002]

Heilungsprozess

Basalmembran

kreuzreagiert

eingedeckelt

Zusammenhang

3 Ergebnisse

321 Operation

322 Versuchsverlauf

den Langzeitversuch

Einheilungsraten

823 778 75

100923

0102030405060708090

verschlossen

(Abb 3-4)

50-100

Abb 3-5 b Abb 3-5 a

Abb 3-5 d

Abb 3-5 c

KFGS-Gruppe

(Abb 3-15)

Kontraktion d14

dflauml

Kontraktion d28

dflauml

Flaumlc

002040608

112141618

0010203040506070809

hAD- hAD+F- Gruppen

pAD- pAD+F-Gruppen

000050100150200250300350400450

(Abb 3-44 3-45)

Gruppen mit KFGS

4 Diskussion

entwickeln

42 Geschichte

[Leigh 1994]

und Green 1975]

Cancedda 1992]

Komponente bestehen

der Wundkontraktion

Hundahl 1982]

zur Folge

Zuijlen et al 2000]

Wundverschluss

verzichtet werden

6 Zusammenfassung

9 Lebenslauf

10 Danksagung

bedanken

vorstellen kann

Katharina Bittner

Einleitung

Allgemeines






Komposit-Hautersatz


Fragestellung

Methodik

Uumlberblick

Zellkultivierung








Operation









Immunhistochemie





Ergebnisse



Operation

Versuchsverlauf



Wundverschluss


KFGS-Gruppe

F-KFGS-Gruppe

hAD-Gruppe

hAD+F-Gruppe

pAD-Gruppe

pAD+F-Gruppe







Immunhistochemie



Diskussion


Geschichte







Wundkontraktion


Reepithelisierung

Basalmembrankomplex


Schlussfolgerungen


Zusammenfassung



Lebenslauf

Danksagung

4 DISKUSSION 62

9 LEBENSLAUF 84

10 DANKSAGUNG 85

1 Einleitung

11 Allgemeines

Gewebes abhaumlngig

entsprach

14 Fragestellung

2 Methodik

21 Uumlberblick

hAD KFGS

F-KFGS

pAD+F KFGS

hAD+F KFGS

6 Monate)

angefaumlrbt

Gruppen

lt5050-100100

22 Zellkultivierung

(F-KFGS)

aufbewahrt

Abb 2-5 b Abb 2-5 a

geltendes Produkt

geschlitzt

231 Operation

Abb 2-7 2-9)

Schwanz Kopf

hAD KFGS

F-KFGS

hAD+F KFGS

Schwanz Kopf

pAD KFGS

hAD KFGS

F-KFGS

pAD+F KFGS

hAD+F KFGS

Wunden gesamt

alle Tiere 54

KFGS 9 4

KFGS+F 9 4

hAD+F KFGS 13 4

hAD KFGS 13 4

pAD+F KFGS 5 4

pAD KFGS 5 4

Muskel

Dermis

Epidermis

Keratinozyten

pAD KFGS

lus Fibroblasten

her Dokumentatio

durchgefuumlhrt Hie

g der autologen Ke

ere Entnahme der

tersuchung

pAD+F KFGS

roblasten

ension

verschlossen

aufgetragen

untersucht

positiv gewertet

Svensjo et al 2002]

Heilungsprozess

Basalmembran

kreuzreagiert

eingedeckelt

Zusammenhang

3 Ergebnisse

321 Operation

322 Versuchsverlauf

den Langzeitversuch

Einheilungsraten

823 778 75

100923

0102030405060708090

verschlossen

(Abb 3-4)

50-100

Abb 3-5 b Abb 3-5 a

Abb 3-5 d

Abb 3-5 c

KFGS-Gruppe

(Abb 3-15)

Kontraktion d14

dflauml

Kontraktion d28

dflauml

Flaumlc

002040608

112141618

0010203040506070809

hAD- hAD+F- Gruppen

pAD- pAD+F-Gruppen

000050100150200250300350400450

(Abb 3-44 3-45)

Gruppen mit KFGS

4 Diskussion

entwickeln

42 Geschichte

[Leigh 1994]

und Green 1975]

Cancedda 1992]

Komponente bestehen

der Wundkontraktion

Hundahl 1982]

zur Folge

Zuijlen et al 2000]

Wundverschluss

verzichtet werden

6 Zusammenfassung

9 Lebenslauf

10 Danksagung

bedanken

vorstellen kann

Katharina Bittner

Einleitung

Allgemeines






Komposit-Hautersatz


Fragestellung

Methodik

Uumlberblick

Zellkultivierung








Operation









Immunhistochemie





Ergebnisse



Operation

Versuchsverlauf



Wundverschluss


KFGS-Gruppe

F-KFGS-Gruppe

hAD-Gruppe

hAD+F-Gruppe

pAD-Gruppe

pAD+F-Gruppe







Immunhistochemie



Diskussion


Geschichte







Wundkontraktion


Reepithelisierung

Basalmembrankomplex


Schlussfolgerungen


Zusammenfassung



Lebenslauf

Danksagung

1 Einleitung

11 Allgemeines

Gewebes abhaumlngig

entsprach

14 Fragestellung

2 Methodik

21 Uumlberblick

hAD KFGS

F-KFGS

pAD+F KFGS

hAD+F KFGS

6 Monate)

angefaumlrbt

Gruppen

lt5050-100100

22 Zellkultivierung

(F-KFGS)

aufbewahrt

Abb 2-5 b Abb 2-5 a

geltendes Produkt

geschlitzt

231 Operation

Abb 2-7 2-9)

Schwanz Kopf

hAD KFGS

F-KFGS

hAD+F KFGS

Schwanz Kopf

pAD KFGS

hAD KFGS

F-KFGS

pAD+F KFGS

hAD+F KFGS

Wunden gesamt

alle Tiere 54

KFGS 9 4

KFGS+F 9 4

hAD+F KFGS 13 4

hAD KFGS 13 4

pAD+F KFGS 5 4

pAD KFGS 5 4

Muskel

Dermis

Epidermis

Keratinozyten

pAD KFGS

lus Fibroblasten

her Dokumentatio

durchgefuumlhrt Hie

g der autologen Ke

ere Entnahme der

tersuchung

pAD+F KFGS

roblasten

ension

verschlossen

aufgetragen

untersucht

positiv gewertet

Svensjo et al 2002]

Heilungsprozess

Basalmembran

kreuzreagiert

eingedeckelt

Zusammenhang

3 Ergebnisse

321 Operation

322 Versuchsverlauf

den Langzeitversuch

Einheilungsraten

823 778 75

100923

0102030405060708090

verschlossen

(Abb 3-4)

50-100

Abb 3-5 b Abb 3-5 a

Abb 3-5 d

Abb 3-5 c

KFGS-Gruppe

(Abb 3-15)

Kontraktion d14

dflauml

Kontraktion d28

dflauml

Flaumlc

002040608

112141618

0010203040506070809

hAD- hAD+F- Gruppen

pAD- pAD+F-Gruppen

000050100150200250300350400450

(Abb 3-44 3-45)

Gruppen mit KFGS

4 Diskussion

entwickeln

42 Geschichte

[Leigh 1994]

und Green 1975]

Cancedda 1992]

Komponente bestehen

der Wundkontraktion

Hundahl 1982]

zur Folge

Zuijlen et al 2000]

Wundverschluss

verzichtet werden

6 Zusammenfassung

9 Lebenslauf

10 Danksagung

bedanken

vorstellen kann

Katharina Bittner

Einleitung

Allgemeines






Komposit-Hautersatz


Fragestellung

Methodik

Uumlberblick

Zellkultivierung








Operation









Immunhistochemie





Ergebnisse



Operation

Versuchsverlauf



Wundverschluss


KFGS-Gruppe

F-KFGS-Gruppe

hAD-Gruppe

hAD+F-Gruppe

pAD-Gruppe

pAD+F-Gruppe







Immunhistochemie



Diskussion


Geschichte







Wundkontraktion


Reepithelisierung

Basalmembrankomplex


Schlussfolgerungen


Zusammenfassung



Lebenslauf

Danksagung

entsprach

14 Fragestellung

2 Methodik

21 Uumlberblick

hAD KFGS

F-KFGS

pAD+F KFGS

hAD+F KFGS

6 Monate)

angefaumlrbt

Gruppen

lt5050-100100

22 Zellkultivierung

(F-KFGS)

aufbewahrt

Abb 2-5 b Abb 2-5 a

geltendes Produkt

geschlitzt

231 Operation

Abb 2-7 2-9)

Schwanz Kopf

hAD KFGS

F-KFGS

hAD+F KFGS

Schwanz Kopf

pAD KFGS

hAD KFGS

F-KFGS

pAD+F KFGS

hAD+F KFGS

Wunden gesamt

alle Tiere 54

KFGS 9 4

KFGS+F 9 4

hAD+F KFGS 13 4

hAD KFGS 13 4

pAD+F KFGS 5 4

pAD KFGS 5 4

Muskel

Dermis

Epidermis

Keratinozyten

pAD KFGS

lus Fibroblasten

her Dokumentatio

durchgefuumlhrt Hie

g der autologen Ke

ere Entnahme der

tersuchung

pAD+F KFGS

roblasten

ension

verschlossen

aufgetragen

untersucht

positiv gewertet

Svensjo et al 2002]

Heilungsprozess

Basalmembran

kreuzreagiert

eingedeckelt

Zusammenhang

3 Ergebnisse

321 Operation

322 Versuchsverlauf

den Langzeitversuch

Einheilungsraten

823 778 75

100923

0102030405060708090

verschlossen

(Abb 3-4)

50-100

Abb 3-5 b Abb 3-5 a

Abb 3-5 d

Abb 3-5 c

KFGS-Gruppe

(Abb 3-15)

Kontraktion d14

dflauml

Kontraktion d28

dflauml

Flaumlc

002040608

112141618

0010203040506070809

hAD- hAD+F- Gruppen

pAD- pAD+F-Gruppen

000050100150200250300350400450

(Abb 3-44 3-45)

Gruppen mit KFGS

4 Diskussion

entwickeln

42 Geschichte

[Leigh 1994]

und Green 1975]

Cancedda 1992]

Komponente bestehen

der Wundkontraktion

Hundahl 1982]

zur Folge

Zuijlen et al 2000]

Wundverschluss

verzichtet werden

6 Zusammenfassung

9 Lebenslauf

10 Danksagung

bedanken

vorstellen kann

Katharina Bittner

Einleitung

Allgemeines






Komposit-Hautersatz


Fragestellung

Methodik

Uumlberblick

Zellkultivierung








Operation









Immunhistochemie





Ergebnisse



Operation

Versuchsverlauf



Wundverschluss


KFGS-Gruppe

F-KFGS-Gruppe

hAD-Gruppe

hAD+F-Gruppe

pAD-Gruppe

pAD+F-Gruppe







Immunhistochemie



Diskussion


Geschichte







Wundkontraktion


Reepithelisierung

Basalmembrankomplex


Schlussfolgerungen


Zusammenfassung



Lebenslauf

Danksagung

14 Fragestellung

2 Methodik

21 Uumlberblick

hAD KFGS

F-KFGS

pAD+F KFGS

hAD+F KFGS

6 Monate)

angefaumlrbt

Gruppen

lt5050-100100

22 Zellkultivierung

(F-KFGS)

aufbewahrt

Abb 2-5 b Abb 2-5 a

geltendes Produkt

geschlitzt

231 Operation

Abb 2-7 2-9)

Schwanz Kopf

hAD KFGS

F-KFGS

hAD+F KFGS

Schwanz Kopf

pAD KFGS

hAD KFGS

F-KFGS

pAD+F KFGS

hAD+F KFGS

Wunden gesamt

alle Tiere 54

KFGS 9 4

KFGS+F 9 4

hAD+F KFGS 13 4

hAD KFGS 13 4

pAD+F KFGS 5 4

pAD KFGS 5 4

Muskel

Dermis

Epidermis

Keratinozyten

pAD KFGS

lus Fibroblasten

her Dokumentatio

durchgefuumlhrt Hie

g der autologen Ke

ere Entnahme der

tersuchung

pAD+F KFGS

roblasten

ension

verschlossen

aufgetragen

untersucht

positiv gewertet

Svensjo et al 2002]

Heilungsprozess

Basalmembran

kreuzreagiert

eingedeckelt

Zusammenhang

3 Ergebnisse

321 Operation

322 Versuchsverlauf

den Langzeitversuch

Einheilungsraten

823 778 75

100923

0102030405060708090

verschlossen

(Abb 3-4)

50-100

Abb 3-5 b Abb 3-5 a

Abb 3-5 d

Abb 3-5 c

KFGS-Gruppe

(Abb 3-15)

Kontraktion d14

dflauml

Kontraktion d28

dflauml

Flaumlc

002040608

112141618

0010203040506070809

hAD- hAD+F- Gruppen

pAD- pAD+F-Gruppen

000050100150200250300350400450

(Abb 3-44 3-45)

Gruppen mit KFGS

4 Diskussion

entwickeln

42 Geschichte

[Leigh 1994]

und Green 1975]

Cancedda 1992]

Komponente bestehen

der Wundkontraktion

Hundahl 1982]

zur Folge

Zuijlen et al 2000]

Wundverschluss

verzichtet werden

6 Zusammenfassung

9 Lebenslauf

10 Danksagung

bedanken

vorstellen kann

Katharina Bittner

Einleitung

Allgemeines






Komposit-Hautersatz


Fragestellung

Methodik

Uumlberblick

Zellkultivierung








Operation









Immunhistochemie





Ergebnisse



Operation

Versuchsverlauf



Wundverschluss


KFGS-Gruppe

F-KFGS-Gruppe

hAD-Gruppe

hAD+F-Gruppe

pAD-Gruppe

pAD+F-Gruppe







Immunhistochemie



Diskussion


Geschichte







Wundkontraktion


Reepithelisierung

Basalmembrankomplex


Schlussfolgerungen


Zusammenfassung



Lebenslauf

Danksagung

14 Fragestellung

2 Methodik

21 Uumlberblick

hAD KFGS

F-KFGS

pAD+F KFGS

hAD+F KFGS

6 Monate)

angefaumlrbt

Gruppen

lt5050-100100

22 Zellkultivierung

(F-KFGS)

aufbewahrt

Abb 2-5 b Abb 2-5 a

geltendes Produkt

geschlitzt

231 Operation

Abb 2-7 2-9)

Schwanz Kopf

hAD KFGS

F-KFGS

hAD+F KFGS

Schwanz Kopf

pAD KFGS

hAD KFGS

F-KFGS

pAD+F KFGS

hAD+F KFGS

Wunden gesamt

alle Tiere 54

KFGS 9 4

KFGS+F 9 4

hAD+F KFGS 13 4

hAD KFGS 13 4

pAD+F KFGS 5 4

pAD KFGS 5 4

Muskel

Dermis

Epidermis

Keratinozyten

pAD KFGS

lus Fibroblasten

her Dokumentatio

durchgefuumlhrt Hie

g der autologen Ke

ere Entnahme der

tersuchung

pAD+F KFGS

roblasten

ension

verschlossen

aufgetragen

untersucht

positiv gewertet

Svensjo et al 2002]

Heilungsprozess

Basalmembran

kreuzreagiert

eingedeckelt

Zusammenhang

3 Ergebnisse

321 Operation

322 Versuchsverlauf

den Langzeitversuch

Einheilungsraten

823 778 75

100923

0102030405060708090

verschlossen

(Abb 3-4)

50-100

Abb 3-5 b Abb 3-5 a

Abb 3-5 d

Abb 3-5 c

KFGS-Gruppe

(Abb 3-15)

Kontraktion d14

dflauml

Kontraktion d28

dflauml

Flaumlc

002040608

112141618

0010203040506070809

hAD- hAD+F- Gruppen

pAD- pAD+F-Gruppen

000050100150200250300350400450

(Abb 3-44 3-45)

Gruppen mit KFGS

4 Diskussion

entwickeln

42 Geschichte

[Leigh 1994]

und Green 1975]

Cancedda 1992]

Komponente bestehen

der Wundkontraktion

Hundahl 1982]

zur Folge

Zuijlen et al 2000]

Wundverschluss

verzichtet werden

6 Zusammenfassung

9 Lebenslauf

10 Danksagung

bedanken

vorstellen kann

Katharina Bittner

Einleitung

Allgemeines






Komposit-Hautersatz


Fragestellung

Methodik

Uumlberblick

Zellkultivierung








Operation









Immunhistochemie





Ergebnisse



Operation

Versuchsverlauf



Wundverschluss


KFGS-Gruppe

F-KFGS-Gruppe

hAD-Gruppe

hAD+F-Gruppe

pAD-Gruppe

pAD+F-Gruppe







Immunhistochemie



Diskussion


Geschichte







Wundkontraktion


Reepithelisierung

Basalmembrankomplex


Schlussfolgerungen


Zusammenfassung



Lebenslauf

Danksagung

14 Fragestellung

2 Methodik

21 Uumlberblick

hAD KFGS

F-KFGS

pAD+F KFGS

hAD+F KFGS

6 Monate)

angefaumlrbt

Gruppen

lt5050-100100

22 Zellkultivierung

(F-KFGS)

aufbewahrt

Abb 2-5 b Abb 2-5 a

geltendes Produkt

geschlitzt

231 Operation

Abb 2-7 2-9)

Schwanz Kopf

hAD KFGS

F-KFGS

hAD+F KFGS

Schwanz Kopf

pAD KFGS

hAD KFGS

F-KFGS

pAD+F KFGS

hAD+F KFGS

Wunden gesamt

alle Tiere 54

KFGS 9 4

KFGS+F 9 4

hAD+F KFGS 13 4

hAD KFGS 13 4

pAD+F KFGS 5 4

pAD KFGS 5 4

Muskel

Dermis

Epidermis

Keratinozyten

pAD KFGS

lus Fibroblasten

her Dokumentatio

durchgefuumlhrt Hie

g der autologen Ke

ere Entnahme der

tersuchung

pAD+F KFGS

roblasten

ension

verschlossen

aufgetragen

untersucht

positiv gewertet

Svensjo et al 2002]

Heilungsprozess

Basalmembran

kreuzreagiert

eingedeckelt

Zusammenhang

3 Ergebnisse

321 Operation

322 Versuchsverlauf

den Langzeitversuch

Einheilungsraten

823 778 75

100923

0102030405060708090

verschlossen

(Abb 3-4)

50-100

Abb 3-5 b Abb 3-5 a

Abb 3-5 d

Abb 3-5 c

KFGS-Gruppe

(Abb 3-15)

Kontraktion d14

dflauml

Kontraktion d28

dflauml

Flaumlc

002040608

112141618

0010203040506070809

hAD- hAD+F- Gruppen

pAD- pAD+F-Gruppen

000050100150200250300350400450

(Abb 3-44 3-45)

Gruppen mit KFGS

4 Diskussion

entwickeln

42 Geschichte

[Leigh 1994]

und Green 1975]

Cancedda 1992]

Komponente bestehen

der Wundkontraktion

Hundahl 1982]

zur Folge

Zuijlen et al 2000]

Wundverschluss

verzichtet werden

6 Zusammenfassung

9 Lebenslauf

10 Danksagung

bedanken

vorstellen kann

Katharina Bittner

Einleitung

Allgemeines






Komposit-Hautersatz


Fragestellung

Methodik

Uumlberblick

Zellkultivierung








Operation









Immunhistochemie





Ergebnisse



Operation

Versuchsverlauf



Wundverschluss


KFGS-Gruppe

F-KFGS-Gruppe

hAD-Gruppe

hAD+F-Gruppe

pAD-Gruppe

pAD+F-Gruppe







Immunhistochemie



Diskussion


Geschichte







Wundkontraktion


Reepithelisierung

Basalmembrankomplex


Schlussfolgerungen


Zusammenfassung



Lebenslauf

Danksagung

14 Fragestellung

2 Methodik

21 Uumlberblick

hAD KFGS

F-KFGS

pAD+F KFGS

hAD+F KFGS

6 Monate)

angefaumlrbt

Gruppen

lt5050-100100

22 Zellkultivierung

(F-KFGS)

aufbewahrt

Abb 2-5 b Abb 2-5 a

geltendes Produkt

geschlitzt

231 Operation

Abb 2-7 2-9)

Schwanz Kopf

hAD KFGS

F-KFGS

hAD+F KFGS

Schwanz Kopf

pAD KFGS

hAD KFGS

F-KFGS

pAD+F KFGS

hAD+F KFGS

Wunden gesamt

alle Tiere 54

KFGS 9 4

KFGS+F 9 4

hAD+F KFGS 13 4

hAD KFGS 13 4

pAD+F KFGS 5 4

pAD KFGS 5 4

Muskel

Dermis

Epidermis

Keratinozyten

pAD KFGS

lus Fibroblasten

her Dokumentatio

durchgefuumlhrt Hie

g der autologen Ke

ere Entnahme der

tersuchung

pAD+F KFGS

roblasten

ension

verschlossen

aufgetragen

untersucht

positiv gewertet

Svensjo et al 2002]

Heilungsprozess

Basalmembran

kreuzreagiert

eingedeckelt

Zusammenhang

3 Ergebnisse

321 Operation

322 Versuchsverlauf

den Langzeitversuch

Einheilungsraten

823 778 75

100923

0102030405060708090

verschlossen

(Abb 3-4)

50-100

Abb 3-5 b Abb 3-5 a

Abb 3-5 d

Abb 3-5 c

KFGS-Gruppe

(Abb 3-15)

Kontraktion d14

dflauml

Kontraktion d28

dflauml

Flaumlc

002040608

112141618

0010203040506070809

hAD- hAD+F- Gruppen

pAD- pAD+F-Gruppen

000050100150200250300350400450

(Abb 3-44 3-45)

Gruppen mit KFGS

4 Diskussion

entwickeln

42 Geschichte

[Leigh 1994]

und Green 1975]

Cancedda 1992]

Komponente bestehen

der Wundkontraktion

Hundahl 1982]

zur Folge

Zuijlen et al 2000]

Wundverschluss

verzichtet werden

6 Zusammenfassung

9 Lebenslauf

10 Danksagung

bedanken

vorstellen kann

Katharina Bittner

Einleitung

Allgemeines






Komposit-Hautersatz


Fragestellung

Methodik

Uumlberblick

Zellkultivierung








Operation









Immunhistochemie





Ergebnisse



Operation

Versuchsverlauf



Wundverschluss


KFGS-Gruppe

F-KFGS-Gruppe

hAD-Gruppe

hAD+F-Gruppe

pAD-Gruppe

pAD+F-Gruppe







Immunhistochemie



Diskussion


Geschichte







Wundkontraktion


Reepithelisierung

Basalmembrankomplex


Schlussfolgerungen


Zusammenfassung



Lebenslauf

Danksagung

14 Fragestellung

2 Methodik

21 Uumlberblick

hAD KFGS

F-KFGS

pAD+F KFGS

hAD+F KFGS

6 Monate)

angefaumlrbt

Gruppen

lt5050-100100

22 Zellkultivierung

(F-KFGS)

aufbewahrt

Abb 2-5 b Abb 2-5 a

geltendes Produkt

geschlitzt

231 Operation

Abb 2-7 2-9)

Schwanz Kopf

hAD KFGS

F-KFGS

hAD+F KFGS

Schwanz Kopf

pAD KFGS

hAD KFGS

F-KFGS

pAD+F KFGS

hAD+F KFGS

Wunden gesamt

alle Tiere 54

KFGS 9 4

KFGS+F 9 4

hAD+F KFGS 13 4

hAD KFGS 13 4

pAD+F KFGS 5 4

pAD KFGS 5 4

Muskel

Dermis

Epidermis

Keratinozyten

pAD KFGS

lus Fibroblasten

her Dokumentatio

durchgefuumlhrt Hie

g der autologen Ke

ere Entnahme der

tersuchung

pAD+F KFGS

roblasten

ension

verschlossen

aufgetragen

untersucht

positiv gewertet

Svensjo et al 2002]

Heilungsprozess

Basalmembran

kreuzreagiert

eingedeckelt

Zusammenhang

3 Ergebnisse

321 Operation

322 Versuchsverlauf

den Langzeitversuch

Einheilungsraten

823 778 75

100923

0102030405060708090

verschlossen

(Abb 3-4)

50-100

Abb 3-5 b Abb 3-5 a

Abb 3-5 d

Abb 3-5 c

KFGS-Gruppe

(Abb 3-15)

Kontraktion d14

dflauml

Kontraktion d28

dflauml

Flaumlc

002040608

112141618

0010203040506070809

hAD- hAD+F- Gruppen

pAD- pAD+F-Gruppen

000050100150200250300350400450

(Abb 3-44 3-45)

Gruppen mit KFGS

4 Diskussion

entwickeln

42 Geschichte

[Leigh 1994]

und Green 1975]

Cancedda 1992]

Komponente bestehen

der Wundkontraktion

Hundahl 1982]

zur Folge

Zuijlen et al 2000]

Wundverschluss

verzichtet werden

6 Zusammenfassung

9 Lebenslauf

10 Danksagung

bedanken

vorstellen kann

Katharina Bittner

Einleitung

Allgemeines






Komposit-Hautersatz


Fragestellung

Methodik

Uumlberblick

Zellkultivierung








Operation









Immunhistochemie





Ergebnisse



Operation

Versuchsverlauf



Wundverschluss


KFGS-Gruppe

F-KFGS-Gruppe

hAD-Gruppe

hAD+F-Gruppe

pAD-Gruppe

pAD+F-Gruppe







Immunhistochemie



Diskussion


Geschichte







Wundkontraktion


Reepithelisierung

Basalmembrankomplex


Schlussfolgerungen


Zusammenfassung



Lebenslauf

Danksagung

2 Methodik

21 Uumlberblick

hAD KFGS

F-KFGS

pAD+F KFGS

hAD+F KFGS

6 Monate)

angefaumlrbt

Gruppen

lt5050-100100

22 Zellkultivierung

(F-KFGS)

aufbewahrt

Abb 2-5 b Abb 2-5 a

geltendes Produkt

geschlitzt

231 Operation

Abb 2-7 2-9)

Schwanz Kopf

hAD KFGS

F-KFGS

hAD+F KFGS

Schwanz Kopf

pAD KFGS

hAD KFGS

F-KFGS

pAD+F KFGS

hAD+F KFGS

Wunden gesamt

alle Tiere 54

KFGS 9 4

KFGS+F 9 4

hAD+F KFGS 13 4

hAD KFGS 13 4

pAD+F KFGS 5 4

pAD KFGS 5 4

Muskel

Dermis

Epidermis

Keratinozyten

pAD KFGS

lus Fibroblasten

her Dokumentatio

durchgefuumlhrt Hie

g der autologen Ke

ere Entnahme der

tersuchung

pAD+F KFGS

roblasten

ension

verschlossen

aufgetragen

untersucht

positiv gewertet

Svensjo et al 2002]

Heilungsprozess

Basalmembran

kreuzreagiert

eingedeckelt

Zusammenhang

3 Ergebnisse

321 Operation

322 Versuchsverlauf

den Langzeitversuch

Einheilungsraten

823 778 75

100923

0102030405060708090

verschlossen

(Abb 3-4)

50-100

Abb 3-5 b Abb 3-5 a

Abb 3-5 d

Abb 3-5 c

KFGS-Gruppe

(Abb 3-15)

Kontraktion d14

dflauml

Kontraktion d28

dflauml

Flaumlc

002040608

112141618

0010203040506070809

hAD- hAD+F- Gruppen

pAD- pAD+F-Gruppen

000050100150200250300350400450

(Abb 3-44 3-45)

Gruppen mit KFGS

4 Diskussion

entwickeln

42 Geschichte

[Leigh 1994]

und Green 1975]

Cancedda 1992]

Komponente bestehen

der Wundkontraktion

Hundahl 1982]

zur Folge

Zuijlen et al 2000]

Wundverschluss

verzichtet werden

6 Zusammenfassung

9 Lebenslauf

10 Danksagung

bedanken

vorstellen kann

Katharina Bittner

Einleitung

Allgemeines






Komposit-Hautersatz


Fragestellung

Methodik

Uumlberblick

Zellkultivierung








Operation









Immunhistochemie





Ergebnisse



Operation

Versuchsverlauf



Wundverschluss


KFGS-Gruppe

F-KFGS-Gruppe

hAD-Gruppe

hAD+F-Gruppe

pAD-Gruppe

pAD+F-Gruppe







Immunhistochemie



Diskussion


Geschichte







Wundkontraktion


Reepithelisierung

Basalmembrankomplex


Schlussfolgerungen


Zusammenfassung



Lebenslauf

Danksagung

2 Methodik

21 Uumlberblick

hAD KFGS

F-KFGS

pAD+F KFGS

hAD+F KFGS

6 Monate)

angefaumlrbt

Gruppen

lt5050-100100

22 Zellkultivierung

(F-KFGS)

aufbewahrt

Abb 2-5 b Abb 2-5 a

geltendes Produkt

geschlitzt

231 Operation

Abb 2-7 2-9)

Schwanz Kopf

hAD KFGS

F-KFGS

hAD+F KFGS

Schwanz Kopf

pAD KFGS

hAD KFGS

F-KFGS

pAD+F KFGS

hAD+F KFGS

Wunden gesamt

alle Tiere 54

KFGS 9 4

KFGS+F 9 4

hAD+F KFGS 13 4

hAD KFGS 13 4

pAD+F KFGS 5 4

pAD KFGS 5 4

Muskel

Dermis

Epidermis

Keratinozyten

pAD KFGS

lus Fibroblasten

her Dokumentatio

durchgefuumlhrt Hie

g der autologen Ke

ere Entnahme der

tersuchung

pAD+F KFGS

roblasten

ension

verschlossen

aufgetragen

untersucht

positiv gewertet

Svensjo et al 2002]

Heilungsprozess

Basalmembran

kreuzreagiert

eingedeckelt

Zusammenhang

3 Ergebnisse

321 Operation

322 Versuchsverlauf

den Langzeitversuch

Einheilungsraten

823 778 75

100923

0102030405060708090

verschlossen

(Abb 3-4)

50-100

Abb 3-5 b Abb 3-5 a

Abb 3-5 d

Abb 3-5 c

KFGS-Gruppe

(Abb 3-15)

Kontraktion d14

dflauml

Kontraktion d28

dflauml

Flaumlc

002040608

112141618

0010203040506070809

hAD- hAD+F- Gruppen

pAD- pAD+F-Gruppen

000050100150200250300350400450

(Abb 3-44 3-45)

Gruppen mit KFGS

4 Diskussion

entwickeln

42 Geschichte

[Leigh 1994]

und Green 1975]

Cancedda 1992]

Komponente bestehen

der Wundkontraktion

Hundahl 1982]

zur Folge

Zuijlen et al 2000]

Wundverschluss

verzichtet werden

6 Zusammenfassung

9 Lebenslauf

10 Danksagung

bedanken

vorstellen kann

Katharina Bittner

Einleitung

Allgemeines






Komposit-Hautersatz


Fragestellung

Methodik

Uumlberblick

Zellkultivierung








Operation









Immunhistochemie





Ergebnisse



Operation

Versuchsverlauf



Wundverschluss


KFGS-Gruppe

F-KFGS-Gruppe

hAD-Gruppe

hAD+F-Gruppe

pAD-Gruppe

pAD+F-Gruppe







Immunhistochemie



Diskussion


Geschichte







Wundkontraktion


Reepithelisierung

Basalmembrankomplex


Schlussfolgerungen


Zusammenfassung



Lebenslauf

Danksagung

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Aus der Abteilung Plastische und Handchirurgie