Aus der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin · Erkältungsbeschwerden wie Rhinitis oder leichter Pharyngitis kommt, können junge Säuglinge schwere klinische Verläufe mit Atemwegsobstruktion,

Aus der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin

des St. Josef-Hospitals Bochum - Universitätsklinik -

der Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. Eckard Hamelmann

Ausdifferenzierung von Memory-Zellen unter Einfluss Respiratory Syncytial Virus-infizierter

Dendritischer Zellen in vitro

Inaugural-Dissertation zur

Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer

Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von Sandra Zawatzki

aus Gelsenkirchen

2012

Dekan: Prof. Dr. med. Klaus Überla Referent: Prof. Dr. med. Uwe Schauer Korreferent: Prof. Dr. med. Albrecht Bufe Tag der Mündlichen Prüfung: 14. Mai 2013

Meinen Eltern

und

Großeltern

„Phantasie

ist wichtiger als Wissen,

denn Wissen ist begrenzt.“

Albert Einstein

1

INHALTSVERZEICHNIS

1. EINLEITUNG .........................................................................10

1.1 DAS RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS .......................................10

1.1.1 Geschichte und Virologie ...........................................................10

1.1.2 Klinisches Erscheinungsbild und Pathophysiologie ...................11

1.1.3 Diagnostik ..................................................................................13

1.1.4 Therapie und Impfung ...............................................................14

1.2 DIE IMMUNANTWORT .......................................................................15

1.2.1 Die primäre Immunantwort: T-Zellen und Dendritische Zellen ...15

1.2.2 Das immunologische Gedächtnis: Zentrale Memory- und

Effektor-Memory-T-Zellen ..........................................................17

1.3 OBERFLÄCHENMOLEKÜLE ANTIGENPRÄSENTIERENDER ZELLEN ...............................................................................................19

1.3.1 Antigenpräsentation durch Humane Leukozytenantigene .........19

1.3.2 CD80 und CD86 als Co-Stimulatoren Antigenpräsentierender

Zellen .........................................................................................21

1.3.3 CD83 als Marker reifer Dendritischer Zellen ..............................23

1.4 POLY-IC: EIN SIMULATOR VIRALER INFEKTIONEN IN VITRO

UND SEINE BINDUNG AN DEN TOLL-LIKE-REZEPTOR 3 .........25

1.5 SUPERANTIGENE ...............................................................................27

1.5.1 Der Aufbau des T-Zell-Rezeptors ..............................................27

1.5.2 Superantigene und ihre besondere Bindung an den TCR .........27

1.5.3 Aufbau und Bindungsspezifität des Toxic Shock Syndrome

Toxins-1 .....................................................................................29

2

2. FRAGESTELLUNG ..............................................................30

3. MATERIAL UND METHODEN ...........................................31

3.1 GEWINNUNG DENDRITISCHER ZELLEN AUS NABEL- SCHNURBLUT .....................................................................................31

3.1.1 Gewinnung von Nabelschnurblut ...............................................31

3.1.2 Gewinnung mononukleärer Zellen mittels Dichtegradienten-

zentrifugation .............................................................................32

3.1.3 Gewinnung CD34+ Stammzellen mittels magnetischer

Zellseparation ...........................................................................32

3.1.4 Einfrieren der CD34--Fraktion ....................................................33

3.1.5 Anzucht Dendritischer Zellen .....................................................33

3.1.6 Auftauen Dendritischer Zellen ...................................................34

3.1.7 Restimulation Dendritischer Zellen an Tag 7 .............................35

3.2 ISOLIERUNG NAIVER T-ZELLEN UND CO-KULTUR MIT DENDRITISCHEN ZELLEN ................................................................35

3.2.1 Gewinnung naiver CD4+ T-Zellen ..............................................35

3.2.2 Co-Kulturen naiver T-Zellen mit Dendritischen Zellen als

in vitro-Modell der primären Immunantwort ...............................36

3.3 PRÄPARATION VON UND INFEKTION MIT RSV .........................37

3.4 ZELLBESTIMMUNG MITTELS DURCHFLUSSZYTOMETRIE .........38

3.4.1 Das Prinzip der Durchflusszytometrie ........................................38

3.4.2 Fluoreszenzfärbungen und durchflusszytometrische

Messungen ................................................................................38

3.5 DIE SYNGENE LANGZEIT-CO-KULTUR IM ZEITLICHEN ABLAUF ...............................................................................................39

3

3.6 DATENAUFNAHME UND -ANALYSE ...............................................42

3.7 STATISTISCHE ANALYSE .................................................................42 3.8 EINGESETZTE MATERIALIEN UND HERSTELLERNACHWEIS ....43

4. ERGEBNISSE .......................................................................46 4.1 DIE RSV-INFEKTION FÜHRT LEDIGLICH ZU EINER SCHWACHEN REIFUNG DENDRITISCHER ZELLEN IN VITRO ..47

4.2 DIE RSV-INFEKTION HAT KEINEN NEGATIVEN EINFLUSS AUF DIE AUSBILDUNG VON MEMORY-T-ZELLEN BEI DER IMMUNOLOGISCHEN SEKUNDÄRANTWORT .................................51

5. DISKUSSION ........................................................................57

5.1 DIE RSV-INFEKTION FÜHRT ZU EINER IMMUNOLOGISCHEN

SEKUNDÄRANTWORT MIT AUSBILDUNG VON MEMORY- T-ZELLEN ............................................................................................57

5.2 DIE RSV-INFEKTION INDUZIERT DIE REIFUNG DENDRI- TISCHER ZELLEN WENIGER STARK ALS POLY-IC ...................61

5.3 DIE REAKTION DER T-ZELLEN AUF TSST-1 IST EHER

SUPERANTIGEN- ALS ANTIGEN-SPEZIFISCH ..............................64

4

6. ZUSAMMENFASSUNG ........................................................65

7. LITERATURVERZEICHNIS ..................................................67

DANKSAGUNG LEBENSLAUF

5

VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN

+ positiv

- negativ

α alpha

β beta

γ gamma

Δ Delta

ĸ kappa

µ mikro

Abb. Abbildung

al. andere (alii/aliae)

APC Antigenpräsentierende Zelle (antigen presenting cell)

BAL Bronchoalveoläre Lavage

BPD Bronchopulmonale Dysplasie

CCR Chemokinrezeptor (chemokine receptor)

CD Cluster of Differentiation

CMV Cytomegalie-Virus

CPAP Continuous Positive Airway Pressure

Da Dalton

DC Dendritische Zelle (dendritic cell)

DNA Desoxyribonukleinsäure (desoxyribonucleic acid)

ds doppelsträngig (double-stranded)

ELISA Enzyme-linked immunosorbent Assay

ER Endoplasmatisches Retikulum

ExT Exfoliating toxin

FSC Vorwärtsstreulicht (forward scatter channel)

g Gramm

g Gravitationskonstante

h human

HEp Humane Epithelzelle

HIV Human Immunodeficiency Virus

6

HLA Humanes Leukozyten-Antigen

HSV Herpes Simplex Virus

IE Internationale Einheit

IFN Interferon

Ig Immunglobulin

IL Interleukin

IU International Unit

k Kilo

L Levo (links)

l Liter

LPS Lipopolysaccharid

LRR domain leucinreiche Wiederholungsdomäne (leucine-rich repeat

domain)

m Bote (messenger)

m mega

m Meter

m milli

m murin

M Molare Masse

MAP Mitogen-aktiviertes Protein (mitogen-activated protein)

MFI mittlere Fluoreszenzintensität (mean fluorescence

intensity)

MHC Majorhistokompatibilitätskomplex (Major

Histocompatibility Complex)

MOI Infektionsmultiplizität (Multiplicity of Infection)

MyD88 Adapterprotein (Myeloid differentiation primary response

gene 88)

n nano

NFĸB Transkriptionsfaktor (nuclear factor of kappa-light chain

inducer in mature B cells)

NK Natürliche Killerzellen

n. s. nicht signifikant

PAMP Pathogen-assoziiertes Molekülmuster (pathogen-

associated molecular pattern)

7

PCR Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase chain reaction)

PGE Prostaglandin E

PKR Proteinkinase R

Poly-IC Polyinosinic-polycytidylic acid

PRR Mustererkennungsrezeptor (pattern recognition receptor)

RNA Ribonukleinsäure (ribonucleic acid)

RSV Respiratory Syncytial Virus

s. siehe

SEB Staphylococcus aureus Enterotoxin B

SEC2 Staphylococcus aureus Enterotoxin C2

SEE Staphylococcus aureus Enterotoxin E

ss einzelsträngig (single-stranded)

SSC Seitwärtsstreulicht (side scatter channel)

SSW Schwangerschaftswoche

TCR T-Zell-Rezeptor (T-Cell Receptor)

TIR domain Toll-IL-1-Rezeptordomäne

TLR Toll-like Rezeptor

TSST Toxic Shock Syndrome Toxin

vs. versus

W Watt

8

VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN

Abbildung 1: Aufbau des Respiratory Syncytial Virus ........................11

Abbildung 2: Anteil RSV-F-Protein-positiver Dendritischer Zellen

nach Infektion mit RSV, Stimulation mit Poly-IC und

ohne Behandlung (Kontrolle) ........................................46

Abbildung 3: MFI (mean fluorescence intensity) HLA-DR-positiver

Dendritischer Zellen nach Infektion mit RSV,

Stimulation mit Poly-IC und ohne Behandlung

(Kontrolle) .....................................................................48

Abbildung 4: Anteil CD86-positiver Dendritischer Zellen nach

Infektion mit RSV, Stimulation mit Poly-IC und

ohne Behandlung (Kontrolle) ........................................49

Abbildung 5: MFI (mean fluorescence intensity) CD83-positiver

Dendritischer Zellen nach Infektion mit RSV,

Stimulation mit Poly-IC und ohne Behandlung

(Kontrolle) .....................................................................50

Abbildung 6: Präsentation des naiven T-Zell-Oberflächenmarkers

CD45RA an den Tagen 1, 3, 7 und 22 nach Infektion

mit RSV, Stimulation mit Poly-IC und ohne

Behandlung (Kontrolle) .................................................53

Abbildung 7: Präsentation des Memory-T-Zell-Oberflächenmarkers

CD45R0 an den Tagen 1, 3, 7 und 22 nach Infektion



9

Abbildung 8: Präsentation des Memory-T-Zell-Oberflächenmarkers

CD49a an den Tagen 1, 3, 7 und 22 nach Infektion



Abbildung 9: Präsentation des T-Zell-Rezeptor-Oberflächenmarkers

Vβ2 an den Tagen 1, 3, 7 und 22 nach Infektion



10

1. EINLEITUNG

1.1 DAS RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS 1.1.1 Geschichte und Virologie

Das RNA-Virus Respiratory Syncytial Virus (RSV) gehört zu einer Subfamilie

der Paramyxoviren, den Pneumoviren. Es wurde erstmals im Jahr 1956 von

Morris als Erreger eines Schimpansen-Schnupfens beschrieben (Morris et al.,

1956). Ein Jahr später konnte Chanock denselben Erreger bei Kindern mit

Atemwegsinfektionen nachweisen (Chanock et al., 1957).

Der Name Respiratory Syncytial Virus beschreibt die Fähigkeit des Erregers,

Atemwegsinfektionen hervorzurufen und in der Zellkultur große Synzytien zu

bilden. Es ist ein einzelsträngiges RNA-Virus negativer Polarität [(-)ssRNA] und

umfasst 15.222 Basenpaare, welche die zehn Virusproteine kodieren

(Sullender, 2000). Umschlossen wird das Genom von einem Nukleokapsid von

etwa 13,5 nm Durchmesser, das nochmals von einer Lipiddoppelschicht, dem

so genannten envelope, umgeben ist. Die envelope-Proteine der Pneumoviren

besitzen keine Neuraminidase- und Hämagglutinin-Aktivität (Eigenschaften, die

das Anheften an die Wirtszelle und das Eindringen ermöglichen), was sie von

den übrigen Paramyxoviren unterscheidet. Die Fähigkeit, sich an die Wirtszelle

zu heften und in sie einzudringen, erhält das RS-Virus durch zwei seiner drei

Oberflächenproteine: Das Glycoprotein G stellt den Kontakt zur Wirtszelle her

und ermöglicht über spikes die Anheftung. Das Fusionsprotein F ermöglicht die

Penetration in die Wirtszelle und die Virenverbreitung. Die Funktion des dritten,

hydrophoben Glycoproteins, des SH-Proteins (small hydrophobic), ist bisher

noch unklar, es scheint jedoch - gemeinsam mit dem G-Protein - eine Rolle bei

der angeborenen Immunantwort auf die RSV-Infektion zu spielen (Tripp et al.,

1999).

11

Abb. 1: Aufbau des Respiratory Syncytial Virus (modifiziert nach Moscona, 2005)

1.1.2 Klinisches Erscheinungsbild und Pathophysiologie

Beim Menschen verursacht RSV Infektionen des unteren Respirationstraktes. In

der Regel beträgt die Zeit bis zur Rekonvaleszenz etwa 7 Tage bei leichter

Infektion (Punnoose, 2012), jedoch reichen die Ausprägungsgrade vom

symptomlosen Infekt bis zur schweren Bronchiolitis mit Beatmungspflichtigkeit.

Betroffen sein können Menschen jeder Altersgruppe, jedoch sind besonders

12

junge Säuglinge im Alter von unter sechs Monaten gefährdet, an einer

schweren RSV-Infektion zu erkranken.

Während es bei größeren Kindern und Erwachsenen meist lediglich zu milden

Erkältungsbeschwerden wie Rhinitis oder leichter Pharyngitis kommt, können

junge Säuglinge schwere klinische Verläufe mit Atemwegsobstruktion, pneumo-

nieähnlichen Symptomen der Bronchiolitis bis hin zu Sauerstoffbedarf oder

Intubationspflichtigkeit aufgrund von Hypoxämie und Hyperkapnie zeigen.

Besondere Risikogruppen stellen Frühgeborene mit vorgeschädigter Lunge

(Bronchopulmonale Dysplasie), Kinder mit Shuntvitien (insbesondere mit

Belastung des Lungenkreislaufs) und immunsupprimierte oder immundefiziente

Patienten dar. Innerhalb der immunsupprimierten Patienten sind Patienten nach

allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation besonders gefährdet,

komplizierte Krankheitsverläufe zu erleiden, da diese häufig schwere

Pneumonien mit einer hohen Letalität entwickeln (Ullmann und Maschmeyer,

2012).

Die Ansteckung erfolgt über Tröpfcheninfektion. Als Eintrittspforte dient das

respiratorische Epithel insbesondere der Nasenschleimhaut. Das RS-Virus

vermehrt sich auf den zilientragenden Schleimhäuten der Atemwege, von dort

breitet es sich direkt oder hämatogen auf den unteren Respirationstrakt aus.

Die Inkubationszeit beträgt zwei bis acht Tage. Besonders in den

Wintermonaten (November bis April) treten RSV-Infektionen gehäuft auf, man

spricht daher auch von der RSV-Saison.

Durch starkes Anschwellen der Atemwegsschleimhaut kommt es zur Zunahme

des Atemwegswiderstandes in den kleinen Bronchien und Bronchiolen, was

wiederum zu einem Missverhältnis zwischen Ventilation und Perfusion im

Lungenkreislauf führt. Die daraus resultierende Hypoxämie kann bei

respiratorischer Erschöpfung zu einer lebensbedrohlichen Hyperkapnie führen.

Bei Säuglingen können neben typischen Symptomen der Bronchiolitis wie

Tachydyspnoe, Einziehungen und Giemen auch Apnoen (mitunter auch als

Erstsymptom) auftreten. Sie stellen somit eine besondere Risikogruppe dar.

Etwa 5% der erkrankten Kinder werden ateminsuffizient und bedürfen einer

maschinellen Beatmung, die Letalität beträgt unter heutigen intensiv-

medizinischen Bedingungen 1% (Therapiehinweis zu Palivizumab, Bundes-

ausschuss für Arzneimittel, 2008).

13

Doch nicht nur während der akuten Erkrankung, auch in Bezug auf die Allergie-

entwicklung hat die RSV-Infektion einen Einfluss: Insbesondere innerhalb des

ersten Jahres nach schwerer RSV-Infektion ist die Wahrscheinlichkeit einer

Sensibilisierung für Nahrungsmittel deutlich erhöht im Vergleich zu milder oder

nicht durchlebter RSV-Erkrankung (Schauer et al., 2002). Zudem wurde die

RSV-Bronchiolitis als wichtigster und unabhängiger Risikofaktor für wieder-

kehrendes Giemen identifiziert. Möglicherweise besteht auch ein Zusammen-

hang mit der Sensibilisierung für inhalative Allergene und der Entwicklung einer

Atopischen Dermatitis.

Innerhalb der ersten Lebenswochen besteht ein Nestschutz durch diaplazentar

übertragene mütterliche Antikörper. Eine einmalig durchgemachte RSV-

Infektion schützt jedoch nicht vor der Reinfektion; beschrieben wurden sogar

Reinfektionen kurz nach der primären Infektion mit dem genetisch identischen

Virus (Scott et al., 2006).

1.1.3 Diagnostik

Die Viruskultur ist nach wie vor Goldstandard in der Labordiagnostik zum

Nachweis von RSV (Respiratory Syncytial Viren, Robert-Koch-Institut, 2011).

Da diese sehr zeitaufwändig ist (zytopathische Effekte treten erst nach vier bis

sieben Tagen auf), haben sich in der klinischen Praxis sensitive und spezifische

immunologische Nachweistechniken wie der Enzyme-linked-immunosorbent

Assay (ELISA) oder Immunfluoreszenzverfahren durchgesetzt, die innerhalb

weniger Stunden virale Antigene mithilfe monoklonaler Antikörper in Nasen-

rachenspülwasser nachweisen. Breiten Einsatz finden auch Antigen-

schnelltests, die in etwa 20 Minuten das Ergebnis liefern und so für die

patientennahe Diagnostik geeignet sind. Auch ein Nachweis von RSV-

Genomfragmenten mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist möglich. Die

PCR-Methode ist sehr spezifisch, schnell und hochsensitiv.

14

1.1.4 Therapie und Impfung

Bisher gibt es keine Kausaltherapie, so dass sich die Behandlung schwer RSV-

erkrankter Kinder auf die symptomatische Therapie beschränkt. Der Einsatz

inhalativer Betasympathomimetika wird kontrovers diskutiert, ein Therapie-

versuch sollte daher unter stationären Bedingungen durchgeführt werden,

ebenso wie die Inhalation mit Epinephrin. Neben einer Flüssigkeitssubstitution

sollte bei transcutan gemessener Sauerstoffsättigung unter 94% eine Sauer-

stoffgabe erfolgen, bei drohender respiratorischer Insuffizienz muss eine CPAP-

oder invasive Beatmung erwogen werden.

Eine routinemäßig durchgeführte antibiotische Therapie erbrachte keinen

Vorteil, ebenso wenig die Gabe inhalativer oder systemischer Glucocorticoide.

Die antivirale Therapie mit Ribavirin kann in Einzelfällen sinnvoll sein

(Respiratory Syncytial Viren, Robert-Koch-Institut, 2011), da sie sich als

wirksam bezüglich eines geringeren Sauerstoffbedarfs betroffener Säuglinge

und einer geringeren Dauer der invasiven Beatmung zeigte. Auf das Outcome

hatte die Behandlung jedoch keinen nachweisbaren Nutzen (Ventre and

Randolph, 2004).

Ein aktiver Impfstoff wird derzeit entwickelt. Als am besten geeignet erscheint

der rekombinante attenuierte Lebendimpfstoff rA2cp248/404/1030ΔSH, welcher

bereits in Phase IIa-Studien getestet wurde (Karron et al., 2005).

Zur allgemeinen Verfügung steht bislang jedoch lediglich der monoklonale

Antikörper Palivizumab gegen das F-Protein zur passiven Immunisierung. Der

guten Wirksamkeit [nach prophylaktischer Gabe von Palivizumab auf einer

neonatologischen Intensivstation während eines RSV-Ausbruchs wurden keine

weiteren Neuinfektionen mit dem RS-Virus beobachtet (O´Connell et al., 2011)]

stehen eine hohe Belastung des Kindes und ein enormer, jedoch auch

gerechtfertigter Kostenfaktor gegenüber (Resch et al., 2012), da während der

RSV-Saison monatlich eine gewichtsadaptierte Menge Palivizumab intra-

muskulär verabreicht wird.

Die derzeitigen Impfempfehlungen des Robert-Koch-Institutes erstrecken sich

auf ehemals Frühgeborene mit chronischer Lungenerkrankung infolge

15

Bronchopulmonaler Dysplasie (BPD) bis zum Alter von 24 Monaten, wenn sie in

den letzten sechs Monaten behandlungsbedürftig waren. Frühgeborene der 32.

bis 35. SSW ohne BPD sollten eine Prophylaxe erhalten, wenn zusätzliche

Risikofaktoren vorliegen (Respiratory Syncytial Viren, Robert-Koch-Institut,

2011).

Um die Pathogenese der Erkrankung noch besser verstehen zu können,

beschäftigt sich diese Arbeit mit der Frage, welche Mechanismen zu den

häufigen und klinisch symptomatischen Reinfektionen führen können und mit

welchen Mechanismen das RS-Virus die Immunabwehr des Wirtes unterläuft.

1.2 DIE IMMUNANTWORT

1.2.1 Die primäre Immunantwort: T-Zellen und Dendritische Zellen

Es zeigt sich, dass das RS-Virus Strategien entwickelt hat, die antiviralen

Mechanismen seines Wirtes zu durchbrechen. Um diese verstehen zu können,

muss man sich zunächst mit den Zellen der spezifischen Immunantwort

befassen: Die T-Lymphozyten nehmen eine Schlüsselstellung bei der

erworbenen, zellvermittelten Immunantwort ein.

Sie entstehen aus der pluripotenten Stammzelle des Knochenmarks, wandern

in den Thymus ein und durchwandern diesen von der Rinde her ins Mark. Dabei

differenzieren sie sich zu reifen T-Lymphozyten, von denen der größte Teil

(etwa 90%) abstirbt und nur ein Teil von etwa 10% den Thymus als reife und

immunologisch kompetente T-Zelle verlässt.

Solange diese reifen T-Zellen noch keinen Antigenkontakt hatten, gelten sie als

immunologisch naive T-Zellen. Erst der Kontakt mit einem Antigen führt zur

endgültigen Reifung und ermöglicht es der T-Zelle, an der Immunantwort

teilzunehmen.

Als professionellen, also hochspezialisierten, Antigenpräsentierenden Zellen

(APC) kommt den Dendritischen Zellen die Aufgabe zu, mit naiven T-Zellen in

Kontakt zu treten und deren Differenzierung auszulösen. Dendritische Zellen

16

sind die stärksten Stimulatoren naiver T-Zellen, und die Aktivierung naiver T-

Zellen durch Dendritische Zellen ist der erste entscheidende Schritt zur

Einleitung der spezifischen Immunantwort: Durch Antigenaufnahme und

-präsentation über den Major Histocompatibility Complex (MHC) interagieren

sie mit den T-Zellen über deren T-Zell-Rezeptor (TCR).

Bevor die Dendritische Zelle jedoch in der Lage ist, eine T-Zelle zu aktivieren,

muss sie einen Reifungsprozess durchlaufen. Die unreife Dendritische Zelle

besitzt nur eine geringe Anzahl antigenpräsentierender MHC-Moleküle und

keine co-stimulierenden Oberflächenmoleküle der B7-Immunglobulinfamilie.

Über Phagozytose und Pinozytose nehmen unreife Dendritische Zellen im

Verlauf ihrer Entwicklung Antigene in peripheren Geweben auf und wandern zu

benachbarten Lymphknoten. Dabei verlieren sie die Fähigkeit zur Antigen-

aufnahme und synthetisieren stattdessen MHC-Moleküle, mit denen sie Peptide

des Antigens an ihrer Oberfläche präsentieren. Außerdem exprimieren sie jetzt

co-stimulierende B7- und Adhäsionsmoleküle, was sie zu optimalen

Stimulatoren naiver T-Zellen macht.

Die RSV-Infektion führt zu einer vermehrten Anzahl von reifen Dendritischen

Zellen im Lungengewebe, welche die Primär-T-Zell-Antwort induzieren. Die

Beeinträchtigung der Funktion dieser Zellen ist ein starker viraler Mechanismus,

die Immunantwort zu umgehen oder abzuschwächen. Insbesondere scheint

hier die Fähigkeit von Bedeutung zu sein, die Interferon-γ-Produktion

herabzusetzen. IFN-γ hat zum einen einen direkt antiviralen Effekt, zum

anderen fördert es indirekt die Viruselimination durch Aktivierung natürlicher

Killerzellen, Makrophagen und zytotoxischer T-Zellen. So zeigen Lymphozyten

während der RSV-Bronchiolitis eine deutlich herabgesetzte IFN-γ-Produktion im

Vergleich zu Zellen der nichtinfizierten Kontrollgruppe. Dendritische Zellen

modulieren demnach T-Zell-Antworten wie IFN-γ-Ausschüttung. Weiterhin

konnten Schauer et al. zeigen, dass die erniedrigte IFN-γ-Produktion noch drei

Jahre später nachgewiesen werden konnte. Eine milde RSV-Infektion scheint

im Vergleich zur RSV-Bronchiolitis diese Effekte nicht in einem solchen Maße

zu erzielen (Schauer et al., 2004).

IFN-γ ist als ein die Virusreplikation limitierender Mediator essenziell bei der

Beeinflussung einer RSV-Infektion, und es konnte anhand eines in vitro-Modells

17

der Primärimmunantwort gezeigt werden, dass eine RSV-Infektion die Anzahl

IFN-γ-produzierender T-Zellen vermindert, wohingegen eine hohe Produktion

von IFN-γ vor RSV-vermittelter Erkrankung schützt.

Die verminderte IFN-γ-Produktion steht in Zusammenhang mit der Induktion

einer Apoptose in unreifen DCs, einem Anstieg der CD86-Expression und einer

verminderten Ausschüttung proinflammatorischer Zytokine (Bartz et al., 2003).

Ein lediglich leichter Anstieg der Expression von CD83 und HLA-DR, die als

Marker für reife DCs gelten, konnte nachgewiesen werden. Die Induktion der

Apoptose unreifer DCs könnte die effiziente T-Zell-Antwort verhindern und

somit ein Grund für die herabgesetzte zellvermittelte Immunität sein.

Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Frage, ob RSV-infizierte, unreife

Dendritische Zellen in vitro vollständig ausreifen oder ob es Mechanismen gibt,

die die Ausreifung beeinträchtigen.

1.2.2 Das immunologische Gedächtnis: Zentrale Memory- und Effektor-

Memory-T-Zellen

Treten bisher unbekannte Pathogene in den Körper ein, reagiert das

Immunsystem zunächst verzögert wegen des Fehlens antigenspezifischer

Zellen. Unbekannte Antigene müssen zunächst ins lymphatische Gewebe

transportiert werden, wo sie eine primäre Immunantwort durch Interaktion

naiver CD4+ T-Lymphozyten und APCs auslösen. Dieser Primärantwort ent-

stammen Memory-Zellen, die sich wiederum in zwei unterschiedliche Zell-

formen unterteilen: zentrale Memory-T-Zellen, die vor nachfolgenden

Infektionen durch diesen Erreger schützen, und Effektor-Memory-T-Zellen,

welche die Ausbreitung des Pathogens verhindern. Etwa 5% aller naiven T-

Zellen differenzieren zu Memory-T-Zellen aus.

Mithilfe der unterschiedlichen Expression von CD45-Isoformen lassen sich

naive T-Zellen von Memory-T-Zellen unterscheiden: Naive T-Zellen exprimieren

die Isoform CD45RA, Memory-T-Zellen die Isoform CD45R0, die einer

Spleißvariante des CD45RA entspricht.

18

Das Glykoprotein CD45, auch Leukocyte Common Antigen genannt, findet man

auf allen kernhaltigen, blutbildenden Zellen; es interagiert mit dem T-Zell-

Rezeptor (Trowbridge, 1991). Seine drei Domänen sind die extrazelluläre, die

transmembranöse und die intrazelluläre bzw. zytoplasmatische Domäne

(Fischer et al., 1991, Trowbridge et al., 1991). Die extrazelluläre Domäne kann

durch alternatives Spleißen, Glycosylierung oder Sulfatierung vielfältig

prozessiert werden, so dass eine große Bandbreite an möglichen

Ligandenrezeptoren entsteht (Cyster et al, 1994, Trowbridge et al, 1992).

CD45RA gilt als Marker für ruhende, naive T-Zellen, wohingegen CD45R0 die

Memory-T-Zellen charakterisiert. Die Assoziation zum T-Zell-Rezeptor ist beim

RA-Typ eher gering und beim R0-Typ stark. Es wurden bisher einige CD45R-

Isoformen identifiziert. Diese Isoformen entstehen durch alternatives Spleißen

von Exons der Messenger-RNA (mRNA).

Unter Einbeziehen des Chemokinrezeptors CCR7 und der Oberflächenmarker

CD45RA bzw. CD45R0 lassen sich nicht nur naive von Memory-T-Zellen

unterscheiden, es lassen sich ebenfalls noch die Effektor-Memory-T-Zellen von

den zentralen Memory-T-Zellen abgrenzen (Sallusto et al., 1999).

Somit ergeben sich drei Typen von T-Zellen: Naive T-Zellen (CD45RA+,

CCR7+), zentrale Memory-T-Zellen (CD45R0+, CCR7+) und Effektor-Memory-T-

Zellen (CD45R0+, CCR7-). Alle drei Untergruppen übernehmen unterschiedliche

Aufgaben bei der zellulären Immunabwehr.

Insbesondere auf epithelialen Oberflächen findet man Effektor-Memory-T-

Zellen, welche die Ausbreitung des Pathogens verhindern, da hier die Haupt-

eintrittspforte pathogener Erreger ist. Sie produzieren sehr rasch Effektor-

zytokine wie Interferon γ (IFN-γ), Interleukin 4 (IL-4) und Interleukin 5 (IL-5).

Zentrale Memory-T-Zellen exprimieren kein IFN-γ und kein IL-4, dafür aber

hohe Mengen an Interleukin 2 (IL-2) (Mackay, 1999).

CCR7+ zentrale Memory-T-Zellen können sich in die CCR7- Effektor-Memory-T-

Zellen differenzieren, wenn sie durch ein Antigen stimuliert werden. Beide

Zellgruppen unterscheiden sich in ihrer Fähigkeit, L-Selektin zu exprimieren,

was - neben den ebenfalls CCR7+ naiven T-Zellen - nur den zentralen Memory-

Zellen möglich ist. L-Selektin befähigt die Zellen, in Lymphknoten einzutreten.

19

Nur das Zusammenspiel zentraler mit Effektor-Memory-T-Zellen ermöglicht eine

kompetente und schnelle Immunantwort auf bereits bekannte Antigene

(Mackay, 1993). Während Effektor-Memory-T-Zellen eine Abwehr bereits an

oberflächlichen epithelialen Geweben, also der Haupteintrittspforte für Erreger,

darstellen, können zentrale Memory-T-Zellen nach Kontakt mit dem Antigen in

den Lymphknoten zu Effektor-Memory-T-Zellen differenzieren. Nur so kann eine

optimale Immunantwort generiert werden.

Da bekannt ist, dass bereits kurze Zeit nach durchlebter RSV-Infektion eine Re-

infektion mit dem genetisch identischen Virus auftreten kann, stellte sich uns die

Frage, ob sich dies auf die fehlende Ausbildung eines immunologischen

Gedächtnisses zurückführen lässt und somit eine unzureichende immuno-

logische Sekundärantwort der frühzeitigen Reinfektion zugrunde liegt. In

unserer Arbeit unterscheiden wir zwischen den Isoformen CD45RA und

CD45R0, also zwischen naivem und Memory-T-Zell-Typ, wobei nicht weiter

zwischen zentralen Memory- und Effektor-Memory-T-Zellen differenziert wurde.

1.3 OBERFLÄCHENMOLEKÜLE ANTIGENPRÄSENTIERENDER ZELLEN

1.3.1 Antigenpräsentation durch Humane Leukozytenantigene

Humane Leukozytenantigene (HLA) sind Oberflächenmoleküle, die auf dem

kurzen Arm von Chromosom 6 codiert werden. Diesen Genort bezeichnet man

als Major Histocompatibility Complex (MHC). Man unterscheidet die MHC-

Klassen Ia (HLA-A, -B, -C), Ib (HLA-G, -E, -H, -CD1 u. a.) und II (HLA-DR, -DP,

-DQ), die sich in Struktur, Funktion und Zellverteilungsmuster unterscheiden

(Pichler und Peter, 2001).

HLA-Klasse I-Moleküle findet man auf allen kernhaltigen Zellen in unterschied-

licher Dichte. Fehlt die HLA-Klasse I-Expression oder ist sie deutlich reduziert,

kommt es zur Aktivierung Natürlicher Killerzellen (NK).

HLA-Klasse II-Moleküle werden insbesondere auf professionellen Antigen-

präsentierenden Zellen exprimiert. Diese nehmen Antigene aus der Umgebung

20

auf und präsentieren sie nach Prozessierung auf ihrer Oberfläche. Daher

werden mittels MHC-Klasse II-Molekülen hauptsächlich Peptide aus Proteinen

präsentiert, die mittels Phagozytose, rezeptorvermittelter Endozytose oder

Pinozytose aufgenommen wurden.

HLA-DR (Genlocus 6p21.31) findet man auf der Oberfläche von Makrophagen,

B-Zellen und Dendritischen Zellen. T-Zellen binden mit ihrem T-Zell-Rezeptor

an von HLA-Oberflächenmolekülen präsentierten Antigenen.

Strukturell handelt es sich bei HLA-DR um ein Heterodimer, bestehend aus

einer α- und einer β-Kette, die in der Plasmamembran verankert sind. Jede

Untereinheit besteht wiederum aus zwei extrazellulären Domänen, einer

membranverankerten Domäne und einem zytoplasmatischen Teil.

Bei der Immunantwort spielt das HLA-DR eine wichtige Rolle in der Antigen-

präsentation. Des Weiteren kann HLA-DR als Marker einer Immunstimulation

dienen, da häufig die gesteigerte Anwesenheit von HLA-DR auf der

Zelloberfläche die Antwort auf eine Stimulation darstellt.

MHC-Klasse II-Moleküle werden von Antigenpräsentierenden Zellen an deren

Oberfläche präsentiert und von CD4+ T-Helferzellen erkannt. MHC II-Moleküle

nehmen Peptide mittels Endozytose auf und bilden aus diesen T-Zell-Rezeptor-

Liganden. In den Lysosomen unreifer DCs werden Antigene prozessiert und in

Peptid-MHC II-Komplexe umgewandelt, wobei die Reifung Dendritischer Zellen

induziert wird. Diese Komplexe migrieren dann an die Zelloberfläche. Hier

spielen sie eine wichtige Rolle als Liganden für den T-Zell-Rezeptor.

Ein entscheidender Schritt für die T-Zell-Immunität ist die Antigenpräsentation

durch MHC-Produkte auf DCs.

In unreifen DCs werden jedoch weder Peptide noch Proteine in Peptid-MHC II-

Komplexe umgebaut, solange kein Reifungsstimulus wie beispielsweise

Lipopolysaccharid (LPS) anwesend ist (Turley et al., 2000). Sobald dieser

Stimulus hinzugegeben wird, wandern die Komplexe zunächst ins lysosomale

Kompartiment und von dort aus über das Endoplasmatische Retikulum (ER) an

die Plasmamembran. Hierbei durchlaufen die DCs ihren Reifungsprozess über

eine intermediäre Form hin zu reifen DCs. Die DC-Reifung ist demnach

charakterisiert durch eine deutliche Hochregulation der Oberflächenexpression

von MHC II und co-stimulierenden Molekülen.

21

Dendritische Zellen gehören zu den potentesten APCs. Ihre immunologische

Fähigkeit, naive T-Zellen zu stimulieren, ist unübertroffen. Hierzu bedienen sie

sich der Fähigkeit, Fremdprotein in Peptid-MHC II-Komplexe umzubauen und

an ihrer Zelloberfläche zu präsentieren. Als Reifemarker kann HLA-DR neben

CD83 für reife Dendritische Zellen genutzt werden.

Wir nutzten das Oberflächenmolekül HLA-DR zum einen als Marker der

Immunstimulation und zum anderen als Marker reifer Dendritischer Zellen.

1.3.2 CD80 und CD86 als Co-Stimulatoren Antigenpräsentierender Zellen

Um Lymphozyten zu aktivieren, muss das Antigen über MHC-Klasse II-

Moleküle präsentiert werden. Für die Aktivierung ist jedoch noch ein weiteres

co-stimulierendes Signal notwendig. Wird T-Zellen ein MHC-Antigen-Komplex

ohne co-stimulierende Moleküle präsentiert, können sie eine Toleranz-

entwicklung für das Antigen zeigen. CD80 und CD86 gehören zu den

wichtigsten co-stimulierenden Molekülen.

Die Abkürzung CD steht für cluster of differentiation. Es handelt sich um

Oberflächenmoleküle verschiedener Zellen, die zum Teil zellspezifisch sind.

CD80 und CD86 gehören einer Immunglobulin-Familie an, der so genannten

B7-Familie (June et al., 1994). Beide spielen eine Rolle bei der Ausbildung von

Immuntoleranz oder der Abstoßung eigener (Autoimmunreaktion) und fremder

Gewebe als co-stimulierende Faktoren bestimmter Antigenpräsentierender

Zellen.

Als „professionelle“ Antigenpräsentierende Zellen werden diejenigen Zellen

bezeichnet, die hohe Mengen CD80 und CD86 auf ihrer Zelloberfläche

präsentieren. Sie sind starke Stimulatoren der T-Zell-Aktivierung. Zu den

professionellen APCs gehören aktivierte B-Zellen, Makrophagen und reife

Dendritische Zellen.

„Nicht-professionelle“ Antigenpräsentierende Zellen tragen deutlich weniger

CD80- und CD86-Moleküle, sie exprimieren hingegen bevorzugt MHC-

Moleküle. Zu ihnen gehören die ruhenden B-Zellen und unreife Dendritische

22

Zellen. Professionelle und nicht-professionelle APCs unterscheiden sich

demnach in der Stärke ihrer Antigen-Präsentation (Lu et al., 1997).

CD86 findet man auf reifen Dendritischen Zellen, Monozyten und Makrophagen.

Bei Aktivierung wird es schnell (innerhalb von Stunden) exprimiert und

hochreguliert. Daher spielt es in der Initialphase der Immunantwort die

entscheidende Rolle.

CD80 findet man ebenfalls auf reifen Dendritischen Zellen, Makrophagen und

Monozyten. Es wird jedoch während der Immunantwort deutlich langsamer

(innerhalb von Tagen) exprimiert und auch langsamer hochreguliert. Demnach

kommt diesem Molekül die herausragende Rolle bei der Aufrechterhaltung einer

Immunantwort, der chronischen Phase, zu (Inaba et al., 1995, Hathcock et al.,

1994).

Beide Moleküle sind als Co-Stimulatoren gemeinsam bei der Toleranz-

entwicklung Eigen- und Fremdgeweben gegenüber beteiligt. Anhand von

Autoimmun-Krankheitsmodellen oder der Transplantatforschung konnte man

ihre Rolle besser verstehen (Khoury et al., 1995, Charlton et al., 1994). Die Co-

Stimulation von T-Zellen durch CD80/CD86 stellt einen entscheidenden Schritt

bei der Immunantwort dar. Blockiert man die CD80/CD86-Co-Stimulation, so

führt dies zu einer Blockade der T-Zell-Aktivierung und damit zur

Immuntoleranz, da Antigene, die ohne co-stimulierende Signale präsentiert

werden, vom Immunsystem als harmlos registriert werden. Lu et al. zeigten,

dass die CD80/CD86-Blockade bei Autoimmunerkrankungen zu einer Langzeit-

T-Zell-Anergie führte, die das Nichtreagieren auf ein Antigen bei herabgesetzter

Immunlage beschreibt und als eine Form der T-Zell-Toleranz angesehen wird

(Lu et al., 1997).

Das von Matzinger entworfene „danger-Modell“ erklärt den Zusammenhang von

T-Zell-Aktivierung und Toleranzentwicklung folgendermaßen: Nur wenn ein

Antigen durch professionelle, co-stimulierte APCs präsentiert wird, wird dieses

Antigen als Gefahrsignal vom Immunsystem klar erkannt, und die T-Zell-

Aktivierung wird initiiert. Im Gegensatz hierzu können Antigene, die ohne co-

stimulierende Faktoren präsentiert werden, keine ausreichende Immunantwort

auslösen und führen so zur Toleranzentwicklung (Matzinger, 1994).

23

Wir nutzten den Nachweis des Moleküls CD86 als Marker der primären

Immunantwort, da dieser Co-Stimulator nach Aktivierung auf der Zelloberfläche

Dendritischer Zellen hochreguliert wird und zur T-Zell-Aktivierung führt.

1.3.3 CD83 als Marker reifer Dendritischer Zellen

CD83 ist ein 45 kDa-Glykoprotein und gehört zur Ig-Superfamilie. Es wird unter

anderem von reifen Dendritischen Zellen, Langerhans-Zellen, B- und T-Zellen

exprimiert. Als Marker wird es für reife Dendritische Zellen genutzt.

Zudem scheint es auch eine wichtige Rolle bei der Immunantwort zu spielen.

So konnte gezeigt werden, dass die lösliche Form des humanen CD83

(hCD83ext) die von Dendritischen Zellen vermittelte T-Zell-Proliferation

dosisabhängig inhibiert. Diese lösliche Form konnte auch in menschlichen

Seren nachgewiesen werden; sie wird von aktivierten Dendritischen Zellen und

B-Zellen freigesetzt (Hock et al., 2001).

Ebenfalls inhibiert hCD83ext die Reifung Dendritischer Zellen. Lechmann et al.

zeigten, dass mit hCD83ext inkubierte unreife Dendritische Zellen nicht

vollständig ausreiften; es kam zu einer Herabregulation von CD80, einem co-

stimulierenden Molekül, und von CD83 selbst (Lechmann et al., 2001). Diese

Reifungsblockade könnte einen Mechanismus darstellen, Immunantworten zu

beeinflussen, indem unter Stimulationsbedingungen das membrangebundene

CD83 an seinen Liganden auf Dendritischen Zellen bindet und somit ein Signal

auslöst, welches zur Aktivierung der Reifung Dendritischer Zellen führt. Bindet

jedoch lösliches CD83 an diesen Rezeptor, wird er blockiert, so dass das

Signal, das zur Ausreifung Dendritischer Zellen führt, nicht weiter transmittiert

werden kann.

Obwohl nur reife Dendritische Zellen CD83 exprimieren und CD83 somit als

Marker für diese ausgereiften Dendritischen Zellen gilt, binden auch unreife

Dendritische Zellen CD83 (Lechmann et al., 2001).

Details, die die Existenz, Expression und Struktur des CD83-Liganden näher

definieren, blieben bisher noch ungeklärt. Erstmals beschrieben wurde ein

möglicher CD83-Ligand von Cramer et al. im Jahr 2000. Die Arbeitsgruppe

nutzte das rekombinante Fusionsprotein mCD83-IgG1, erzeugt aus der

24

extrazellulären Domäne von murinem CD83 (mCD83) und der Fc-Domäne von

humanem Immunglobulin G1 (IgG1). Dieses dimere Molekül war in der Lage,

eine Subpopulation muriner B-Zellen zu binden, nicht jedoch CD4-positive

Zellen (Cramer et al., 2000).

Lechmann et al. identifizierten 2001 einen möglichen CD83-Liganden auf reifen

und unreifen menschlichen DCs. Ähnlich wie Cramer et al. nutzten sie ein

Fusionsmolekül aus humanem CD83 und IgG1 (hCD83-IgG1) und konnten

zeigen, dass dieses Molekül dosisabhängig eine DC-Bindung vermittelt.

Scholler et al. nutzten das gleiche Fusionsprotein und konnten eine schwache

Bindung von hCD83-IgG1 an CD8+ T-Zellen sowie an menschliche Monozyten

nachweisen, wohingegen B-Zellen, CD56+ Natürliche Killerzellen oder Granu-

lozyten keine Bindung eingingen (Scholler et al., 2001).

Obwohl es deutliche Hinweise auf die Existenz und Funktion eines CD83-

Liganden gibt, bleibt eine genauere Beschreibung dieses Liganden weiterhin

abzuwarten.

Einen weiteren Hinweis auf eine funktionelle Rolle von CD83 lieferte die

Beobachtung, dass in viral infizierten Zellen die CD83-Expression deutlich

herunterreguliert wurde; dies wiederum führte zu einer Inhibition der Reifung

Dendritischer Zellen. Kruse et al. infizierten DCs mit Herpes simplex Virus Typ 1

und analysierten sie phänotypisch und strukturell: Zehn Stunden nach Infektion

kam es zu einer starken Herabregulation von CD83 an der Zelloberfläche reifer

DCs. Da die fehlende CD83-Oberflächenexpression nicht durch die Inhibition

der CD83-mRNA-Synthese hervorgerufen wurde (es konnte kein Rückgang der

CD83-mRNA-Level beobachtet werden), vermutete man, dass ein post-

transkriptionelles Ereignis für die Herabmodulation von CD83 und damit auch

für die Reifung Dendritischer Zellen verantwortlich sein müsse: Es konnte

gezeigt werden, dass CD83 in Lysosomen abgebaut wird (Kruse et al., 2000).

Zusammengefasst lässt sich sagen, dass CD83 als Oberflächenmolekül reifer

Dendritischer Zellen eine wichtige Rolle in der DC-vermittelten Immunantwort

spielt. Lösliches CD83 wirkt immunsuppressiv (Scholler et al., 2002). Zudem

wird CD83 für die CD4+ T-Zell-Generierung benötigt (Fujimoto et al., 2002).

25

Uns stellte sich die Frage, wie sich die RSV-Infektion Dendritischer Zellen auf

die CD83-Generierung auswirkt.

1.4 POLY-IC: EIN SIMULATOR VIRALER INFEKTIONEN IN VITRO

UND SEINE BINDUNG AN DEN TOLL-LIKE-REZEPTOR 3

Poly-IC (Polyinosinic-polycytidylic acid) ist ein Molekül, das mit dem Toll-like-

Rezeptor 3 (TLR3) interagiert. Dieser Rezeptor wird in B-Zellen und Dendri-

tischen Zellen exprimiert und geht eine Bindung mit doppelsträngiger RNA ein,

welche unter anderem von den meisten Viren während ihres Infektionszyklus

gebildet wird. Strukturell ähnelt Poly-IC doppelsträngiger RNA; diese synthe-

tische dsRNA wird als Immunmodulator angewandt, um virale Infektionen in

vitro zu simulieren.

Toll-like-Rezeptoren spielen als Teil des angeborenen Immunsystems eine

Rolle bei der Erkennung mikrobieller Erreger, der Induktion antimikrobieller

Gene und der Kontrolle der adaptiven Immunantwort. Sie unterstützen ebenfalls

die Kontrolle der DC-Reifung und der Differenzierung von T-Helferzellen

(Medzhitov, 2001).

Strukturell handelt es sich um transmembrane Rezeptoren, die charakterisiert

sind durch eine extrazelluläre, leucinreiche Wiederholungsdomäne [leucine-rich

repeat (LRR) domain] und eine intrazelluläre Toll-IL-1-Rezeptordomäne (TIR

domain). Sie sind eine Art „Mustererkennungsrezeptor” (pattern recognition

receptor, PRR) und erkennen Moleküle, die verschiedenen Pathogenen gemein

sind (pathogen-associated molecular patterns, PAMPs), jedoch unterscheidbar

von Eigenmolekülen. Mit dem IL-1-Rezeptor bilden TLRs eine Superfamilie, die

„IL-1-Receptor/Toll-like Receptor Superfamily“, deren Mitglieder alle eine so

genannte Toll-IL-1-Rezeptor(TIR)-Domäne besitzen. Die TIR-Domäne gilt als

Protein-Protein-Interaktions-Modul und umfasst drei Untergruppen:

Proteine der ersten Subgruppe sind Interleukinrezeptoren, die von Makro-

phagen, Monozyten und Dendritischen Zellen gebildet werden. Alle tragen

extrazelluläre Immunglobulindomänen.

26

Proteine der zweiten Untergruppe sind klassische TLRs, die direkt oder indirekt

mikrobielle Moleküle binden.

Proteine der dritten Untergruppe besitzen zytosolische Adapterproteine und

vermitteln Signalwege von Proteinen der ersten und zweiten Subgruppe.

TLR-Liganden sind durchaus verschieden in Struktur und Ursprung, jedoch gibt

es auch Gemeinsamkeiten: Die meisten TLR-Liganden sind mikrobielle

Produkte, PAMPs, welche die Anwesenheit einer Infektion signalisieren. Zudem

können TLRs verschiedene, strukturell nicht verwandte Liganden erkennen.

Einige TLRs nutzen akzessorische Proteine, um Liganden zu identifizieren. Es

gibt Hinweise, dass Säugetier-TLRs ihre Liganden direkt binden und als PRRs

funktionieren.

TLR3 erkennt virale Doppelstrang-RNA und das synthetische Analogon Poly-IC.

Nach Bindung wird die Interferon-Ausschüttung induziert und mit ihr die

inflammatorische Zytokin- und Chemokin-Produktion sowie die DC-Reifung

(Matsumoto et al., 2008).

Im Gegensatz zu anderen Säugetier-TLRs besitzt der TLR3 eine strukturelle

Besonderheit: Er hat keinen Prolin-Rest an der sonst typischen Position. Dies

bedeutet, dass der TLR3-Signalweg sich möglicherweise ebenfalls von dem

anderer TLRs unterscheidet. Der TLR3 wird bevorzugt, jedoch nicht

ausschließlich, in Dendritischen Zellen exprimiert (Medzhitov, 2001).

Bindet dsRNA an den TLR3, wird eine dsRNA-abhängige Proteinkinase

aktiviert, die PKR. Der gleiche Effekt wird ausgelöst, wenn Poly-IC an den TLR3

bindet. Es können dann zwei verschiedene Signaltransduktionswege ein-

geschlagen werden: ein vom Adapterprotein MyD88-abhängiger Signalweg,

den alle TLRs nutzen (shared pathway), und ein MyD88-unabhängiger Signal-

weg, der von TLR4 und TLR3 getriggert wird (specific pathway). Dieser MyD88-

unabhängige Signalweg kann die DC-Reifung induzieren.

Poly-IC ermöglicht die TLR3-vermittelte Aktivierung von NFκB und einer MAP

(mitogen activated protein)-Kinase und induziert zudem die Ausschüttung

zytotoxischer Zytokine und die Interferon-Produktion MyD88-abhängig (Fortier

et al., 2004).

27

Außerdem kann Poly-IC die Aktivierung von NFκB und der MAP-Kinase

MyD88-unabhängig auslösen, womit die Reifung Dendritischer Zellen induziert

wird (Alexopoulou et al., 2001).

Verdijk at al. zeigten, dass die Behandlung unreifer Dendritischer Zellen mit

Poly-IC deren Reifung induziert und dieser reife Phänotyp hohe Level von HLA-

DR, CD86 und CD83 exprimiert (Verdijk et al., 1999).

Daher wählten wir in unseren Experimenten Poly-IC, einen Simulator viraler

Infektionen in vitro, als Positiv-Kontrolle im Vergleich zur Infektion unreifer

Dendritischer Zellen mit RSV aus.

1.5 SUPERANTIGENE

1.5.1 Der Aufbau des T-Zell-Rezeptors

Der T-Zell-Rezeptor (TCR) ist bei 95% aller T-Zellen ein Heterodimer aus einer

α- und einer β-Kette. Zur Rezeptorseite gehören neben nicht keimbahn-

codierten Aminosäuren auch fünf genetisch codierte, variable Elemente (Vα, Jα,

Vβ, Dβ, Jβ). Bei allen T-Zellen bildet der Oberflächenmarker CD3 einen

Komplex mit dem TCR, so dass am Rezeptor empfangene Signale durch

Aktivierung einer intrazellulären Proteinkinase verstärkt weitergeleitet werden

können.

Liganden der α- oder β-Untereinheit des TCRs sind an MHC gebundene

Peptide. Normalerweise wird die Spezifität der TCRs für an MHC gebundene

Antigene bestimmt durch alle variablen Elemente der α- und β-Kette. Die

Region Vβ, die als Bindungsstelle für Superantigene identifiziert werden konnte,

liegt an einem Teil der β-Kette.

1.5.2 Superantigene und ihre besondere Bindung an den TCR

„Superantigene“ haben sich experimentell als Simulatoren der Virusantigen-

Reaktion bewährt. Es sind Rezeptorliganden, die - unabhängig von den

28

anderen variablen Elementen beider Ketten - mit ihrer MHC-Kombination die-

jenigen T-Zellen stimulieren, die ein bestimmtes Vβ tragen. Es gibt sowohl

exogene als auch endogene Superantigene. Hierbei handelt es sich um hitze-

stabile, hydrophile Moleküle mit einem Molekulargewicht von 22 bis 30 kDa,

welche zudem auch relativ stabil gegenüber proteolytischer Spaltung sind.

Im Unterschied zu gewöhnlichen Antigenen werden Superantigene direkt von

T-Zellen erkannt, ohne zuvor über MHC-Moleküle präsentiert worden zu sein.

Gascoigne und Ames zeigten, dass Superantigene den T-Zell-Rezeptor und

MHC II-Moleküle praktisch miteinander „verschmelzen“ können und somit ein

Dauersignal in der T-Zelle auslösen (Gascoigne und Ames, 1991). Es kommt zu

einer starken, polyklonalen und antigenunspezifischen T-Zell-Aktivierung, die

jedoch Vβ-selektiv ist (Dellabona et al., 1990). Hierbei findet die Bindung des

TCRs mit dem Superantigen nicht an der typischen antigenspezifischen

Bindungsstelle im Innern des Moleküls statt, sondern außen am MHC II-

Komplex.

Die Bindungsstelle am TCR für Superantigene ist die Region Vβ.

Normalerweise ist eine Aktivierung des TCRs nur möglich durch Bindung an

den MHC I- oder II-Komplex der Antigenpräsentierenden Zelle, womit die

Superantigen-Bindung hier eine Sonderstellung einnimmt: Superantigene

müssen nicht erst durch APCs prozessiert und dann den T-Zellen mit dem

MHC-Komplex als Peptidfragmente präsentiert werden, sondern sie binden

direkt an den TCR der T-Zelle einerseits und den MHC II-Komplex der APC

andererseits (Fleischer und Schrezenmeier, 1988, White et al., 1989). Dies

erklärt die außergewöhnliche stimulative Potenz der Superantigene.

Es sind bisher etliche Vβ-Elemente beschrieben worden. Weil die Vβ-Region

des TCRs nicht die Variabilität des gesamten Rezeptors erreicht, werden durch

ein Vβ-spezifisches Superantigen jeweils mehrere Prozent (5% bis 20%) des

gesamten T-Zell-Pools aktiviert, wohingegen bei der antigenabhängigen T-Zell-

Aktivierung nur 0,0001% bis 0,01% der T-Zellen aktiviert werden (Choi et al.,

1989, Choi et al., 1990). Es resultieren somit eine starke T-Zell-Aktivierung mit

einer deutlichen Zytokinproduktion und eine Expansion von T-Zell-Klonen mit

spezifischen Vβ-Strukturen.

Nach zunächst extremer T-Zell-Proliferation kommt es zur Apoptose und T-Zell-

Anergie, was in vivo eine systemische Inflammation mit Symptomen wie Fieber,

29

Hypotension und Kreislaufdysregulation bis hin zum Schock auslösen kann

(Krakauer, 1999).

In unseren Versuchen setzten wir das Superantigen Toxic Shock Syndrome

Toxin-1 als Simulator der Virusantigen-Reaktion in vitro ein.

1.5.3 Aufbau und Bindungsspezifität des Toxic Shock Syndrome Toxins-1

TSST-1, das als Auslöser des Toxic Shock Syndromes bekannt ist, gehört zur

Gruppe der Superantigene und umfasst 194 Aminosäuren bei einem

Molekulargewicht von 22.049 Da. In seiner Sekundärstruktur weist es - wie

andere Superantigene auch - hauptsächlich β-Faltblattstrukturen sowie nur

wenige α-Helices und aperiodische Bereiche auf, was der Tertiärstruktur mit

einer zylindrischen oder Fassform eine große Kontaktfläche nach außen

ermöglicht (Singh et al., 1988). TSST-1 bindet einerseits an MHC-Klasse II-

Moleküle der Dendritischen Zellen, andererseits an die Vβ2-Kette des T-Zell-

Rezeptors.

Choi et al. zeigten, dass das Toxic Shock Syndrome Toxin in besonderem

Maße (45%) die Vβ2+ Untergruppe der T-Zellen stimuliert und zudem - in jedoch

nur geringem Maße (anteilig zwischen 8,2% und <1%) - Vβ1+ und Vβ3+ bis

Vβ20+ T-Zellen (Choi et al., 1989).

Auch die anderen untersuchten Toxine scheinen bevorzugte Vβ T-Zellen zu

stimulieren [Staphylococcus aureus Enterotoxin E (SEE) Vβ8; Staphylococcus

aureus Enterotoxin B (SEB) Vβ3 und Vβ17; Staphylococcus aureus

Enterotoxin C2 (SEC2) Vβ13.1 und Vβ17; Exfoliating toxin (ExT) Vβ2 (<15%)].

Jedoch fand sich neben TSST kein anderes Staphylokokkentoxin, das in

diesem hohen Maße von 45% ein Vβ so spezifisch stimulierte wie TSST das

Vβ2.

In unseren Versuchen verwendeten wir TSST-1 als TCR-Ligand, da die

Stimulation hochspezifisch ist und der TSST-1-bindende T-Zell-Rezeptor Vβ2

schnell mittels Durchflusszytometrie erkannt werden kann.

30

2. FRAGESTELLUNG

Nach wie vor stellt die RSV-Infektion eine häufige und zum Teil schwer

verlaufende Erkrankung insbesondere junger Säuglinge dar. Eine besondere

Risikogruppe bilden ehemalige Frühgeborene und Kinder mit Shuntvitien. Auf

diese beziehen sich die derzeitigen Impfempfehlungen des Robert-Koch-

Instituts. Die üblichen Immunmechanismen nach durchlaufener Infektion

scheinen für das RS-Virus nicht zu gelten: Es konnten nach überstandener

Erkrankung Reinfektionen mit dem genetisch identischen Virus nachgewiesen

werden.

Da sich in den letzten Jahrzehnten große Fortschritte in der Behandlung

Frühgeborener erzielen ließen, stellt sich immer mehr die Frage nach einer

suffizienten, kostengünstigen und patientenschonenden Immunisierung. Zur

Verfügung steht derzeit lediglich ein Passivimpfstoff, der in der RSV-Saison

monatlich injiziert werden muss. Dies stellt eine erhebliche Belastung für die

kleinen Patienten dar und ist zudem mit hohen Kosten verbunden.

Diese Arbeit beschäftigt sich daher mit der Frage, welche Mechanismen die

Immunantwort nach durchlaufener RSV-Infektion beeinflussen und das

immunologische Gedächtnis beeinträchtigen. Als immunologisches Modell

dienten RSV-infizierte Dendritische Zellen.

Zusammengefasst ergaben sich folgende Fragestellungen:

1. Führt die RSV-Infektion unreifer Dendritischer Zellen im in vitro-Modell zu

einer Reifung mit Ausbildung der Oberflächenmarker CD83 und HLA-DR

in der immunologischen Primärantwort und somit zu einer potenten und

zielgerichteten Immunantwort?

2. Kommt es zu einer immunologischen Sekundärantwort mit Ausbildung

von Memory-T-Zellen und somit zur Generierung eines immunologischen

Gedächtnisses, oder ist eine ausbleibende Bildung von Memory-T-Zellen

begünstigend für die frühzeitige Reinfektion?

31

3. MATERIAL UND METHODEN Diese Arbeit entstand im Rahmen des DFG Projekts „Modulation von

Dendritischen Zellen und T-Zellen durch das Respiratory Syncytial Virus in

vitro", an dem eine Gruppe von Doktoranden beteiligt war. Ausgangsmaterial

für die Untersuchungen waren aus Nabelschurblut angezüchtete Dendritische

Zellen und isolierte naive T-Zellen. Am Aufbau eines Pools an Zellen waren alle

Doktoranden gleichermaßen beteiligt.

Die Untersuchung der Expression von Markern auf Dendritischen Zellen und

die Ausreifung von Memory-T-Zellen ist alleiniger Gegenstand dieser Arbeit.

In dem Artikel „Differential response of human naive and memory/effector T

cells to dendritic cells infected by respiratory syncytial virus“ wurden die

Ergebnisse des Gesamtprojektes veröffentlicht (Rothoeft et al., 2007). Im

Folgenden stelle ich den Teil der Untersuchungen dar, den ich experimentell

betreut habe.

3.1 GEWINNUNG DENDRITISCHER ZELLEN AUS NABELSCHNUR-

BLUT 3.1.1 Gewinnung von Nabelschnurblut

Nabelschnurblut klinisch gesunder Neugeborener der geburtshilflichen

Abteilung der Augusta Krankenanstalt Bochum wurde mittels Punktion der

Umbilicalvene steril entnommen. Um eine mögliche präpartale Aktivierung oder

Unreife des Immunsystems zu vermeiden, waren Frühgeburtlichkeit, eine

bekannte mütterliche Hepatitis- oder HIV-Infektion sowie Schwangerschafts-

komplikationen Ausschlusskriterien. Zuvor waren die Eltern über Entnahme und

Verwendung des Blutes aufgeklärt worden und gaben ihr schriftliches

Einverständnis. Da es sich um Untersuchungen an von Menschen gewonnenen

Proben handelte, durchlief die Studie zudem die Ethikkommission der Ruhr-

Universität Bochum.

32

Verwendet wurden Proben, die bei Beginn der Weiterverarbeitung nicht älter als

zwölf Stunden waren und deren Blutmenge mindestens 30 ml betrug, um eine

ausreichende Menge an Zellen zu gewinnen.

3.1.2 Gewinnung mononukleärer Zellen mittels Dichtegradientenzentri-fugation

Das Nabelschnurblut wurde steril in einen 50 ml Falcon Tube gegeben. Diesem

waren bereits 7 ml einer gerinnungs- und keimhemmenden Pufferlösung aus

Citrat-Phosphat-Dextrose-Lösung, Hepes 0,02 M, Kanamycin 0,1 mg/ml und

Partricin 0,5 µg/ml zugesetzt worden.

Mittels Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation wurden die Zellen des Gesamt-

blutes aufgetrennt und die mononukleären Zellen - neben Lymphozyten und

Monozyten gehören auch die hämatopoetischen Stammzellen zu dieser

Zellgruppe - aus dem Nabelschnurblut isoliert. Aufgrund ihrer größeren Dichte

trennen sich bei der Dichtegradientenzentrifugation die Erythrozyten sowie die

polymorphkernigen Leukozyten von den mononukleären Zellen ab. An der

Phasengrenze zwischen Plasma und Ficoll reichern sich die mononukleären

Zellen an und können dort abpipettiert werden. Das Nabelschnurblut wurde

hierzu mit PBS im Verhältnis 1:4 verdünnt und mit 15 ml Ficoll-Lösung

unterschichtet. Nach Zentrifugation bei 400 x g für 20 Minuten wurde der

Interphasenring abpipettiert und zweimal mit PBS bei 300 x g für 10 Minuten

gewaschen. Die Zellzahl wurde nach Anfärben mit Türkscher Lösung in der

Neubauer-Zählkammer ermittelt.

3.1.3 Gewinnung CD34+ Stammzellen mittels magnetischer Zellseparation

Von diesen mononukleären Zellen separierten wir die CD34+ Stammzellen

mittels einer Positivselektion durch anti-CD34-beladene MicroBeads und

MiniMACS-Separationssäulen nach Protokoll des Herstellers Miltenyi:

Die Zellen wurden hierzu in 300 µl Puffer je 108 Zellen aufgenommen und

- ebenfalls je 108 Zellen - mit 100 µl humanem IgG und 100 µl Hapten-

33

konjugierten CD34-Antikörpern für 15 Minuten bei 4°C bis 6°C inkubiert.

Danach wurden die Zellen bei 300 x g für 10 Minuten gewaschen, in 400 µl

Puffer je 108 Zellen aufgenommen und mit 100 µl je 108 Zellen mit gegen das

Hapten des CD34-Antikörpers gerichteten MicroBeads markiert, für 15 Minuten

bei 4°C bis 6°C inkubiert und erneut für 10 Minuten mit 300 x g gewaschen.

Nach Resuspension in 500 µl Puffer je 108 Zellen wurden die Zellen über eine

MiniMACS-Separationssäule nach Herstellervorschrift sortiert. Um eine

möglichst hohe Reinheit der Sortierung zu erzielen, wurde die CD34+-Fraktion

der ersten Sortierung ein zweites Mal über eine MiniMACS-Separationssäule

sortiert.

3.1.4 Einfrieren der CD34--Fraktion

Das Eluat der MiniMacs-Säulen enthielt alle anderen mononukleären Zellen

inklusive naiver T-Zellen. Bis zur weiteren Verwendung wurden diese

eingefroren.

Hierzu wurden die Zellkulturplatte für 10 Minuten auf Eis gestellt, die Zellen mit

einer Pipette gut gemischt und in ein 50 ml Falcon Tube geerntet. Danach

wurden die Zellen bei 300 x g für 10 Minuten zentrifugiert, der Überstand wurde

verworfen, das Pellet zur Stabilisierung in eine Gefrierpufferlösung (bestehend

aus 45% FCS, 44% RPMI-1640, 10% Dimethylsulfoxid und 1% Penicillin/

Streptomycin) resuspendiert und bei -80°C in einem KryoTube eingefroren.

Nach 24 Stunden wurden die Zellen bei -196°C in Flüssigstickstoff

kryokonserviert.

3.1.5 Anzucht Dendritischer Zellen

Die Anzucht Dendritischer Zellen erfolgte modifiziert nach der von Caux

beschriebenen Methode (Caux et al., 1992).

Aus den durch Positivselektion gewonnenen, CD34+ hämatopoetischen

Progenitorzellen wurde eine Probe entnommen, die Zellzahl nach Anfärben mit

Türkscher Lösung in der Fuchs-Rosenthal-Zählkammer ermittelt und in

34

endotoxinfreiem Kulturmedium eingestellt. Das Kulturmedium setzte sich

zusammen aus RPMI-1640, 10% hitzeinaktiviertem fetalem Kälberserum (FCS)

und 4% nährstoffreicher und keimhemmender Lösung. Die Kultivierung erfolgte

in 24-Loch-Platten in einer Dichte von 1,5 x 105 Zellen/ml.

Den Kulturen wurden 100 ng/ml GM-CSF, 2,5 ng/ml TNF-α und 100 ng/ml SCF

als Stimuli zugesetzt. Bei 37°C und 8% Kohlendioxid wurden die Zellen für 7

Tage kultiviert, wenn nötig die Kulturen geteilt und mit frischem Kulturmedium

versehen. Die Proliferation wurde mikroskopisch kontrolliert.

An Tag 7 wurden die Dendritischen Zellen geerntet und bis zur weiteren

Verwendung eingefroren.

Hierzu wurden die Zellkulturplatte für 10 Minuten auf Eis gestellt, die Zellen mit

einer Pipette gut gemischt und in ein 50 ml Falcon Tube geerntet. Danach

wurden die Zellen bei 300 x g für 10 Minuten zentrifugiert, der Überstand wurde

verworfen, das Pellet zur Stabilisierung in eine Gefrierpufferlösung (bestehend

aus 45% FCS, 44% RPMI-1640, 10% Dimethylsulfoxid und 1% Penicillin/

Streptomycin) resuspendiert und bei -80°C in einem KryoTube eingefroren.

Nach 24 Stunden wurden die Zellen bei -196°C in Flüssigstickstoff

kryokonserviert.

3.1.6 Auftauen Dendritischer Zellen

Zum Auftauen der Dendritischen Zellen am benötigten Zeitpunkt wurden die

KryoTubes in einem 37°C warmen Wasserbad geschwenkt, bis sich im

Randbereich eine Flüssigkeitsschicht bildete. Danach wurden die Zellen in

einen 50 ml Falcon Tube, der zuvor mit 40 ml PBS befüllt worden war, überführt

und bei 300 x g für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen,

danach wurden die Zellen noch zweimal mit PBS gewaschen und erneut für

jeweils 10 Minuten bei 300 x g zentrifugiert. Die Zellen wurden danach in 10 ml

Kulturmedium, bestehend aus RPMI, 10% FCS und 4% nährstoffreicher und

keimhemmender Lösung, resuspendiert. Die Bestimmung der Zellzahl erfolgte

in der Neubauer-Zählkammer nach Anfärbung mit Türkscher Lösung.

35

3.1.7 Restimulation Dendritischer Zellen an Tag 7

Nach dem Auftauen und Waschen wurden die Zellen auf eine Konzentration

von 4 x 105 je ml Kulturmedium aus RPMI, 10% FCS und 4% nährstoffreicher

und keimhemmender Lösung eingestellt und in eine 24-Loch-Platte gesetzt. Zur

Stimulation wurden 125 IU/ml IL-4, 2,5 ng/ml TNF-α und 100 ng/ml GM-CSF

hinzugegeben. Bei 37°C und 8% Kohlendioxid reiften die Zellen weiter aus,

wurden an Tag 8 mit GM-CSF und TNF-α nachstimuliert und bis zu Tag 12

nicht weiter geteilt.

An Tag 12 wurden die Dendritischen Zellen dann entweder mit RSV infiziert

oder mit Poly-IC stimuliert und 24 Stunden später in der Co-Kultur eingesetzt.

An Tag 14 wurden die Dendritischen Zellen - wie bereits in 3.1.4 und 3.1.5

beschrieben - geerntet und nach Anfärbung mit Türkscher Lösung und

Bestimmung der Zellzahl in der Neubauer-Zählkammer zunächst für 24 Stun-

den bei -80°C in KryoTubes eingefroren, danach erfolgte eine Langzeitlagerung

in Flüssigstickstoff bei -196°C.

3.2 ISOLIERUNG NAIVER T-ZELLEN UND CO-KULTUR MIT DENDRI-TISCHEN ZELLEN

3.2.1 Gewinnung naiver CD4+ T-Zellen

Zur Gewinnung naiver T-Zellen wurde erneut die magnetische Zellseparation

eingesetzt.

Diesmal wurden die Zellen mittels Negativselektion sortiert, das heißt, es

wurden alle Zellen mit Ausnahme der naiven CD4+ T-Zellen depletiert.

Die Zellen, die entfernt werden sollten, wurden mit paramagnetischen beads

der Firma Miltenyi wie im Herstellerprotokoll beschrieben markiert und über eine

AutoMACS Separationssäule über das Programm depleteS entfernt. Die

Negativfraktion beinhaltete dann die unmarkierten CD4+ T-Zellen.

Folgende Zellen mussten aus dem Eluat der Stammzellseparation depletiert

werden: CD14+ Monozyten, B-Lymphozyten, CD56+ NK-Zellen, CD8+ zyto-

36

toxische T-Zellen, CD45R0+ Memory-T-Zellen und eventuell noch vorhandene

Granulozytenverunreinigungen. Zudem wurden Glycophorin A (CD235a)-

positive Zellen (Erythrozyten und Erythrozytenvorläufer) depletiert, um eine

Störung der durchflusszytometrischen Messung durch Normoblasten zu

verhindern.

Das am Tag der CD34+-Stammzellsortierung gewonnene und kryokonservierte

CD34- Eluat (s. 3.1.4) enthielt alle Leukozyten des Nabelschnurbluts (inklusive

naiver T-Zellen) und Normoblasten.

Zur Gewinnung naiver CD4+ T-Zellen wurde das Eluat in einem 37°C warmen

Wasserbad vorsichtig aufgetaut und wie oben bereits beschrieben dreimal

gewaschen. Nach dem dritten Waschen wurde die Zellzahl nach Anfärben mit

Türkscher Lösung in der Neubauer-Zählkammer bestimmt.

Danach wurden die Zellen in einem Kleinstvolumen von 100 µl resuspendiert.

Je 107 Zellen wurden 20 µl der folgenden beads hinzugegeben: CD8, CD14,

CD56, HLA-DR, CD45R0, Glycophorin A und 10 µl je 107 Zellen CD16. Dieser

Ansatz wurde für 15 Minuten bei 4°C bis 6°C im Kühlschrank inkubiert, danach

mit 15 ml PBS für 10 Minuten bei 300 x g gewaschen. Nach dem Waschen

wurde der Überstand abgegossen, das Pellet in 1 ml PBS resuspendiert und im

AutoMACS (depleteS) nach Herstellerprotokoll sortiert.

Die CD4+ naiven T-Zellen (also die Negativfraktion) wurden nach der Sortierung

abzentrifugiert und in 1 ml Kulturmedium aufgenommen. Nach Anfärben mit

Türkscher Lösung wurde die Zellzahl in der Neubauer-Zählkammer bestimmt.

3.2.2 Co-Kulturen naiver T-Zellen mit Dendritischen Zellen als in vitro-

Modell der primären Immunantwort

Die Co-Kulturen naiver T-Zellen und Dendritischer Zellen wurden in 24-Loch-

Platten angesetzt. Hierzu wurden je ml Medium 106 CD4+ T-Zellen mit 105

Dendritischen Zellen co-kultiviert. Je well wurde 0,1 ng/ml TSST-1

hinzugegeben.

37

TSST-1 wurde verwendet, da der TSST-1-bindende T-Zell-Rezeptor Vβ2

schnell mittels Durchflusszytometrie erkannt werden kann. In T-Zell-

Monokulturen induziert TSST-1 keine T-Zell-Proliferation.

3.3 PRÄPARATION VON UND INFEKTION MIT RSV

Die Dendritischen Zellen wurden entweder unbehandelt belassen, mit RSV

infiziert oder mit 10 µg/ml Poly-IC für 24 Stunden stimuliert.

Die Präparation von und Infektion mit RSV erfolgte wie von Thurau beschrieben

(Thurau et al., 1998):

HEp-2-Wirtszellen wurden mit einem RS-Virenstamm (long strain) mit geringer

Infektionsmultiplizität (MOI 3) infiziert. Sobald die Infektion gelungen war,

wurden die Zellüberstände abgeerntet und mittels Ultraschall die zum Teil noch

intakten Zellen zerstört, um das Virus freizusetzen. Zellen und Debris wurden

abzentrifugiert, und der virushaltige Überstand wurde weiter gereinigt über

ultrazentrifugierte Sucrose-Gradienten. Die dadurch gewonnenen Virus-

präparationen wurden bei -80°C eingefroren.

Infektionstiter des Virenstammes wurden durch die Beimpfung von HEp-2-

Zellen in einer Verdünnungsreihe bestimmt. Das Virenwachstum wurde anhand

typischer zytopathischer Effekte und darauf folgender immunzytochemischer

Färbung der infizierten Zellen beurteilt.

Eine Testung auf Mycoplasmen mittels Polymerasekettenreaktion erfolgte

mithilfe eines Mycoplasmenkits (Venor GeM®) wie im Herstellerhandbuch

beschrieben.

38

3.4 ZELLBESTIMMUNG MITTELS DURCHFLUSSZYTOMETRIE

3.4.1 Das Prinzip der Durchflusszytometrie

Die Durchflusszytometrie erlaubt, verschiedene chemische und physikalische

Eigenschaften einzelner Zellen oder Zellpartikel simultan in einem Flüssigkeits-

strom zu messen. Die Analyse erfolgt dabei über unterschiedliche Fluoreszenz-

intensitäten und Streulichtsignale. Es können bis zu fünf Parameter gleichzeitig

gemessen werden: Vorwärtsstreulicht (FSC) als Maß für die Zellgröße,

Rechtwinkel- oder Seitwärtsstreulicht (SSC) als Maß für die Granularität und

Zelldichte und drei verschiedene Fluoreszenzfärbungen. Hierbei müssen die

Fluoreszenzfarbstoffe so gewählt werden, dass deren Emissionsspektrum dem

Photodetektionsbereich des Durchflusszytometers entspricht. Das verwendete

Gerät (FACScan, Firma BD) enthält einen 15 mW Argon-Ionen-Laser der

Wellenlänge 488 nm und drei Photodetektoren, die Licht der Wellenlänge

530 nm, 585 nm und >650 nm aufnehmen können. Dementsprechend sind

folgende Fluoreszenzfarbstoffe geeignet: Fluoresceinisothiocyanat FITC

[530 nm (Fl-1)], Phycoerythrin PE [585 nm (Fl-2)] und Tricolor [>650 nm (Fl-3)].

Die Daten wurden im „List-Mode“ anhand der fünf beschriebenen Parameter

aufgenommen und mittels CellQuest® Software analysiert.

3.4.2 Fluoreszenzfärbungen und durchflusszytometrische Messungen

Um die Expression der co-stimulierenden Moleküle HLA-DR, CD83 und CD86

der Dendritischen Zellen zu messen, wurden die kultivierten Zellen zweimal

gewaschen und die Konzentration auf 2 x 105 Zellen je ml in PBS eingestellt.

Bei 4°C bis 6°C wurden sie mit Phycoerythrin-gekennzeichneten Antikörpern

gegen die Oberflächenproteine (HLA-DR, CD83 und CD86) für 20 Minuten

inkubiert; im Anschluss wurde die Expression der co-stimulierenden Moleküle

durchflusszytometrisch gemessen.

39

Die Expression der T-Zell-Oberflächenmarker wurde nach Anfärben mit

anti-CD45RA-Fluoresceinisothiocyanat, anti-CD45R0-Phycoerythrin oder anti-

CD49a-Phycoerythrin und parallel mit anti-CD3-Tricolor oder TCR-Vβ2-

Phycoerythrin durchflusszytometrisch gemessen.

Um die Rate RSV-infizierter Dendritischer Zellen zu ermitteln, mussten die

Zellen zunächst mit 4% Paraformaldehyd fixiert und anschließend

permeabilisiert werden. Hierfür resuspendierten wir die Zellen in Saponinpuffer,

bestehend aus HBSS, 0,1% Saponin und 0,01 M HEPES-Puffer. Diese Zellen

mit der nun permeablen Zellmembran wurden mit biotinyliertem goat-anti-RSV-

Antikörper für 20 Minuten bei 4°C bis 6°C inkubiert, mit Saponinpuffer

gewaschen und dann mit FITC-markiertem Streptavidin für 20 Minuten bei 4°C

bis 6°C im Kühlschrank inkubiert. Nach erneutem Waschen mit Saponinpuffer

wurden die Zellen in 200 µl PBS für die durchflusszytometrische Analyse

resuspendiert.

3.5 DIE SYNGENE LANGZEIT-CO-KULTUR IM ZEITLICHEN ABLAUF

Co-kultiviert wurden naive CD4+ T-Zellen (aus 3.2.1) mit Dendritischen Zellen

(aus 3.1.7) desselben Spenders.

Die Co-Kultur lief von Tag -1 über Tag 0 bis Tag 22.

An Tag -1 wurden die Dendritischen Zellen aus 3.1.7 nach zwölftägiger Kultur

geerntet und bei 300 x g für 10 Minuten gewaschen. Der Überstand wurde

abgegossen und die Zellen in 3 ml DMEM ohne Zusätze resuspendiert.

Nach Anfärben mit Türkscher Lösung wurde die Zellzahl in der Neubauer-

Zählkammer bestimmt und eine Zellkonzentration von 5 x 104 Zellen je

300 µl DMEM eingestellt.

Um die Dendritischen Zellen mit RSV zu infizieren, inkubierten wir 300 µl der

Zellsuspension für drei Stunden mit gereinigtem Virus der Infektionsmultiplizität

von 20 (MOI 20). Bei 5 x 104 Dendritischen Zellen wurden also 1 x 106 Viren

zugegeben. Im Anschluss wurde das Virus entfernt und durch Kulturmedium

40

RPMI 1640 mit 10% FCS und 4% nährstoffreicher und keimhemmender Lösung

ersetzt. Co-Kulturen wurden 24 Stunden nach Infektion angesetzt. Vorab-

untersuchungen haben gezeigt, dass 85% der Dendritischen Zellen noch

lebensfähig waren.

Folgende drei Ansätze wurden bei 37°C und 8% Kohlendioxid für drei Stunden

im Brutschrank in einer 24-Loch-Platte kultiviert:

• 8 wells nicht-infizierte Kontrollansätze,

• 8 wells RSV long strain-infizierte Ansätze (MOI 20) und

• 8 wells Poly-IC-stimulierte Ansätze (10 µg/ml).

Nach drei Stunden wurden 200 µl Medium bzw. virushaltiger Überstand

vorsichtig abpipettiert und 500 µl Kulturmedium aus RPMI-1640, 10% FCS und

4% nährstoffreicher und keimhemmender Lösung hinzugegeben. Über Nacht

wurden die Ansätze im Brutschrank inkubiert. Alle Zellen, die an Tag -1 nicht

eingesetzt wurden, wurden in drei gleichgroße Portionen aufgeteilt und

eingefroren.

An Tag 0 erfolgte die oben beschriebene Sortierung der CD4+ T-Zellen aus

dem Eluat (s. 3.2.1). Die Zellkonzentration wurde auf 5 x 105 je 500 µl

eingestellt, und die T-Zellen wurden zu den an Tag -1 vorbereiteten

Dendritischen Zellen gegeben. Danach wurde in jedes well 0,1 ng/ml TSST-1

gegeben.

An Tag 1 wurde je ein well der drei Ansätze geerntet, und die Oberflächen-

marker CD45RA, CD45R0, CD49a und Vβ2 wurden mittels Durchfluss-

zytometrie - wie in 3.4.2 beschrieben - analysiert.

An Tag 3 wurde erneut je ein well der drei Ansätze geerntet, und die

Oberflächenmarker CD45RA, CD45R0, CD49a und Vβ2 wurden mittels

Durchflusszytometrie - wie in 3.4.2 beschrieben - analysiert.

An Tag 6 wurde in alle wells 50 IU/ml IL-2 (auch: TCGF, T-Cell Growth Factor)

hinzugegeben.

41

Zudem wurde eine Portion der an Tag -1 eingefrorenen Dendritischen Zellen

dreimal gewaschen. Nach Anfärben mit Türkscher Lösung wurde die Zellzahl in

der Neubauer-Zählkammer bestimmt und die Zellkonzentration auf 1 x 105 in

300 µl DMEM eingestellt.

Folgende drei Ansätze wurden bei 37°C und 8% Kohlendioxid für drei Stunden

im Brutschrank in einer 24-Loch-Platte kultiviert:

• 4 wells nicht-infizierte Kontrollansätze,

• 4 wells RSV long strain-infizierte Ansätze (MOI 20) und

• 4 wells Poly-IC-stimulierte Ansätze (10 µg/ml).

Nach drei Stunden wurden Medium beziehungsweise virushaltiger Überstand

vorsichtig abpipettiert und 1 ml Kulturmedium aus RPMI-1640, 10% FCS und

4% nährstoffreicher und keimhemmender Lösung hinzugegeben. Über Nacht

wurden die Ansätze im Brutschrank inkubiert.




Zudem wurden die restlichen wells der Co-Kultur durch Zugabe Dendritischer

Zellen restimuliert. Hierzu wurden die an Tag 6 vorbereiteten Dendritischen

Zellen für 10 Minuten auf Eis gestellt. Währenddessen wurde das Zellwachstum

in der Co-Kultur mikroskopisch beurteilt. In der Regel hatten sich die Zellen

stark vermehrt, so dass die Co-Kultur zunächst gründlich mit einer Eppendorf-

Pipette gemischt wurde und 500 µl des Ansatzes verworfen wurden.

Nun konnten - nach gründlichem Durchmischen der auf Eis stehenden

Dendritischen Zellkultur - 500 µl Dendritische Zellen je well zur Co-Kultur

hinzugegeben werden. Zusätzlich wurde 0,1 ng/ml TSST-1 je well

hinzugegeben.

An Tag 10 wurde in alle wells 50 IU/ml IL-2 hinzugegeben.

An Tag 13 wurde erneut eine Portion der an Tag -1 eingefrorenen Dendri-

tischen Zellen aufgetaut und - wie an Tag 6 beschrieben - in je 4 wells

unbehandelt, RSV-infiziert oder Poly-IC-stimuliert kultiviert.

42

An Tag 14 wurde die Co-Kultur - wie an Tag 7 beschrieben - restimuliert.

An Tag 17 wurde in alle wells 50 IU/ml IL-2 hinzugegeben.

An Tag 20 wurde erneut eine Portion der an Tag -1 eingefrorenen Dendri-

tischen Zellen aufgetaut und - wie an Tag 6 beschrieben - in je 4 wells

unbehandelt, RSV-infiziert oder Poly-IC-stimuliert kultiviert.

An Tag 21 wurde die Co-Kultur - wie an Tag 7 beschrieben - restimuliert.




3.6 DATENAUFNAHME UND -ANALYSE

Es wurde ein FACScan® Durchflusszytometer benutzt mit Filtereinrichtungen

für FITC-, PE- und Tricolor-Emissionen. 10.000 bis 50.000 Ereignisse wurden

im „List-Mode“ aufgenommen und mittels CellQuest® Software analysiert.

3.7 STATISTISCHE ANALYSE

Die Daten wurden mittels Varianzanalyse (ANOVA) und dem Bonferroni Test

für Nachtestung selektiver Daten-Sets analysiert.

43

3.8 EINGESETZTE MATERIALIEN UND HERSTELLERNACHWEIS

24-Loch-Platte Nunc, Wiesbaden, Deutschland

96-Loch-Platte Nunc, Wiesbaden, Deutschland

4% nährstoffreiche und keimhemmende

Lösung, bestehend aus

1 % Natriumpyruvat 100 mM, Biochrom AG, Berlin, Deutschland

1 % L-Glutamin 200 mM, Biochrom AG, Berlin, Deutschland

1 % nicht-essentiellen Aminosäuren Biochrom AG, Berlin, Deutschland

(L-Alanin, L-Asparagin, Glycin,

L-Glutamat, L-Prolin, L-Serin),

1% Penicillin 10.000 IE/ml und Biochrom AG, Berlin, Deutschland

1% Streptomycin 10.000 IE/ml Biochrom AG, Berlin, Deutschland

im Mischverhältnis 1 : 1 : 1 : ½ : ½

50 ml Falcon Tube Falcon, Heidelberg, Deutschland

anti-CD3-Tricolor Caltag, Hamburg, Deutschland

anti-CD45RA-Fluoresceinisothiocyanat BD Biosciences, Californien, USA

anti-CD45R0-Phycoerythrin BD Biosciences, Californien, USA

anti-CD49a-Phycoerythrin BD Biosciences, Californien, USA

AutoMACS Separationssäule Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch

Gladbach, Deutschland

CD14 MicroBeads Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch






CD45R0 MicroBeads Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch






44

CD83-Phycoerythrin-Antikörper Beckman Coulter, Krefeld,

Deutschland

CD86-Phycoerythrin-Antikörper BD Biosciences, Heidelberg,

Deutschland

CellQuest® Software BD Biosciences, Californien, USA

Citrat-Phosphat-Dextrose-Lösung Sigma Aldrich, Taufkirchen,

Deutschland

Dimethylsulfoxid Sigma Aldrich, Taufkirchen,

Deutschland

DMEM (Dulbecco's Modified Eagle

Medium) Biochrom AG, Berlin, Deutschland

FACScan (Fluorescence Activated

Cell Sorting) BD Biosciences, Californien, USA

FCS (fetal calf serum) Biochrom AG, Berlin, Deutschland

Ficoll Seperating Solution Biochrom AG, Berlin, Deutschland

FITC-markiertes Streptavidin Caltag Laboratories, Burlingame,

Californien, USA

Glutamin 2 mM Biochrom AG, Berlin, Deutschland

Glycophorin A MicroBeads Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch


GM-CSF (Granulocyte macrophage

colony-stimulating factor) Peprotech, Rocky Hill, New Jersey,

USA

goat-anti-RSV Antikörper Biodesign International, Saco, Maine,

USA

HBSS (Hank´s balanced salt solution) Biochrom AG, Berlin, Deutschland

HEp-2-Zellen ATCC-LGC Standards, Wesel,

Deutschland

HEPES-Puffer (Hydroxyethylpiperazinyl-

Ethansulfonsäure-Puffer) Biochrom AG, Berlin, Deutschland

HLA-DR MicroBeads Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch


HLA-DR-Phycoerythrin-Antikörper BD Biosciences, Heidelberg,

Deutschland

45

IL-2 (Interleukin 2) Peprotech, Rocky Hill, New Jersey,

USA

IL-4 (Interleukin 4) Peprotech, Rocky Hill, New Jersey,

USA

Kanamycin 0,1 mg/ml Biochrom AG, Berlin, Deutschland

KryoTube Nunc, Wiesbaden, Deutschland

MiniMACS Separationssäulen Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch


Natriumpyruvat 1 mM Biochrom AG, Berlin, Deutschland

Paraformaldehyd, Pulver Riedel-de Haën AG, Seelze,

Deutschland

Partricin 0,5 µg/ml Biochrom AG, Berlin, Deutschland

PBS (Phosphate Buffered Saline) Biochrom AG, Berlin, Deutschland

Penicillin 100 µU/ml Biochrom AG, Berlin, Deutschland

Poly-IC 10 µg/ml (polyinosinic:

polycytidylic acid) Sigma Aldrich, Taufkirchen,

Deutschland

RPMI-1640 Kulturmedium Biochrom AG, Berlin, Deutschland

RS-Virenstamm „long strain“ American Type Culture Collection,

Maryland, USA

Saponin Riedel-de Haën AG, Seelze,

Deutschland

SCF (stem cell factor) Peprotech, Rocky Hill, New Jersey,

USA

Streptomycin 100 µg/ml Biochrom AG, Berlin, Deutschland

TCR-Vβ2-Phycoerythrin Beckman Coulter, Krefeld,

Deutschland

TNF-α (Tumor-Nekrose-Faktor-Alpha) Peprotech, Rocky Hill, New Jersey,

USA

TSST-1 (toxic shock syndrome toxin-1) Toxin Technology, Sarasota, Florida,

USA

Türksche Lösung Fluka Chemika, Buchs, Schweiz

Venor GeM® Mycoplasmenkit Minerva Biolabs, Berlin, Deutschland

46

4. ERGEBNISSE

Für die Experimente wurden naive T-Zellen, Memory-/Effektor-T-Zellen und

Dendritische Zellen aus dem Nabelschnurblut desselben Blutspenders

gewonnen.

Unreife Dendritische Zellen wurden aus hämatopoetischen Stammzellen durch

Kultur für zwölf Tage unter dem Einfluss von Stammzellfaktor (SCF),

Granulozyten-/Makrophagen-Kolonien-stimulierendem Faktor (GM-CSF), Inter-

leukin 4 (IL-4) und Tumornekrosefaktor α (TNF-α) gewonnen.

Die uninfizierten, RSV-infizierten oder Poly-IC-behandelten Dendritischen

Zellen dienten in unseren Experimenten als Stimulatoren.

Die mit RSV-infizierten Dendritischen Zellen trugen zu 24,8% ± 4,4% das RSV-

F-Protein, was mittels durchflusszytometrischer Analyse gezeigt werden konnte

und was dem Anteil RSV-infizierter Zellen entspricht (s. Abb. 2).

Abb. 2: Anteil RSV-F-Protein-positiver Dendritischer Zellen nach Infektion mit RSV, Stimulation mit Poly-IC und ohne Behandlung (Kontrolle)

47

4.1 DIE RSV-INFEKTION FÜHRT LEDIGLICH ZU EINER SCHWACHEN

REIFUNG DENDRITISCHER ZELLEN IN VITRO

Zunächst untersuchten wir den Oberflächenphänotyp der Dendritischen Zellen.

Hierfür wurden unreife Dendritische Zellen entweder unbehandelt gelassen, mit

RSV (MOI 20) infiziert oder mit Poly-IC (10 µg/ml) stimuliert.

Danach wurde die Expression co-stimulierender Moleküle untersucht, indem die

Dendritischen Zellen mit spezifischen Antikörpern für HLA-DR, CD86 und CD83

inkubiert wurden.

Die durchflusszytometrische Analyse nach Fluoreszenzfärbung zeigte, dass die

Poly-IC-Behandlung zu einer starken Ausbildung aller drei untersuchten co-

stimulierenden Moleküle führte. Die mean fluorescence intensity (MFI) für HLA-

DR lag bei 1061 ± 223. 69,2% ± 10,2% der Zellen trugen den Oberflächen-

marker CD86, die MFI der CD83+ Zellen lag bei 423 ± 36. Dies bedeutet, dass

Poly-IC als „in vitro-Simulator“ einer Virusinfektion zu einer Expression des co-

stimulierenden Moleküls CD86 führt und eine Reifung Dendritischer Zellen

induziert, was der Anstieg von CD83 und HLA-DR zeigt.

In der Negativ-Kontrollgruppe der unbehandelten Dendritischen Zellen zeigte

HLA-DR eine MFI von 727 ± 211. 33,8% ± 9,6% der Zellen trugen den

Oberflächenmarker CD86, CD83 wies eine MFI von 221 ± 117 auf; verglichen

mit der Poly-IC-Gruppe kam es erwartungsgemäß zu einem deutlich geringeren

Effekt.

Die RSV-Infektion zeigte lediglich einen leichten Anstieg des co-stimulierenden

Moleküls CD86 (47,7% ± 2,8% CD86-positive Zellen). Auch wurde die Reifung

Dendritischer Zellen nur mäßig induziert: CD83 zeigte eine MFI von 283 ± 144

im Vergleich zu 423 ± 36 bei der Stimulation mit Poly-IC, es zeigte sich kein

Effekt beim HLA-DR (MFI 705 ± 106) im Vergleich zur Kontrollgruppe mit einer

MFI von 727 ± 211 (s. Abb. 3 bis 5).

48

Abb. 3: MFI (mean fluorescence intensity) HLA-DR-positiver Dendritischer Zellen nach Infektion mit RSV, Stimulation mit Poly-IC und ohne Behandlung (Kontrolle)

49

Abb. 4: Anteil CD86-positiver Dendritischer Zellen nach Infektion mit RSV, Stimulation mit Poly-IC und ohne Behandlung (Kontrolle)

50

Abb. 5: MFI (mean fluorescence intensity) CD83-positiver Dendritischer Zellen nach Infektion mit RSV, Stimulation mit Poly-IC und ohne Behandlung (Kontrolle)

51

Somit zeigt sich zwar eine Reifung Dendritischer Zellen durch Kontakt zu RSV,

im Vergleich zur Poly-IC-Positiv-Kontrollgruppe sind der Effekt der Ausbildung

co-stimulierender Moleküle und die Ausreifung Dendritischer Zellen jedoch

deutlich abgeschwächt.

4.2 DIE RSV-INFEKTION HAT KEINEN NEGATIVEN EINFLUSS AUF DIE AUSBILDUNG VON MEMORY-T-ZELLEN BEI DER IMMUNO-LOGISCHEN SEKUNDÄRANTWORT

Um die Primärimmunantwort zu untersuchen, wurden naive T-Zellen,

Dendritische Zellen und 0,1 ng/ml TSST-1 co-inkubiert. TSST-1 aktiviert

bevorzugt T-Zellen, deren T-Zell-Rezeptoren eine Vβ2-Kette tragen. Wir nutzten

dies zur Simulation einer Antigen-Stimulation. Analysen wurden jeweils an den

Tagen 0, 1, 3 und 7 durchgeführt.

An den Tagen 0 und 1 waren fast 100% der Zellen CD45RA+, CD45R0- und

CD49a-. Demzufolge handelte es sich um naive, nicht-aktivierte T-Zellen. Etwa

5% der Zellen waren Vβ2+.

Zwischen Tag 1 und 3 sank der Anteil der CD45RA+ Zellen auf etwa 20% ab,

etwa 75% waren CD45R0+ und um 20% CD49a+. Der Anteil Vβ2-tragender

Zellen stieg auf etwa 13%.

Am 7. Tag waren annähernd 100% der Zellen CD45R0+ und CD45RA-. Sie

hatten somit einen Memory-/Effektor-Memory-T-Zell-Phänotyp angenommen.

Etwa 20% trugen zudem den Oberflächenmarker CD49a. 50% trugen eine Vβ2-

Kette. Es gab zu keinem Zeitpunkt signifikante Unterschiede im Vergleich der

RSV-Gruppe zur Kontroll- und zur Poly-IC-Gruppe.

An Tag 7, 14 und 21 wurden naive T-Zellen erneut mit nichtinfizierten, RSV-

infizierten oder Poly-IC-behandelten Dendritischen Zellen restimuliert, um auch

die Memory-/Effektor-Memory-Phase untersuchen zu können, deren Analyse an

Tag 22 erfolgte.

Hier zeigte sich, dass weiterhin 0% der Zellen CD45RA+ waren. Etwa 85%

trugen den Oberflächenmarker CD45R0 und etwa ein Viertel waren CD49a+.

52

Alle Zellen trugen eine Vβ2-Kette. Auch hier gab es keine signifikanten Unter-

schiede zwischen den einzelnen untersuchten Gruppen (s. Abb. 6 bis 9).

Dies zeigt, dass die T-Zellen ihren naiven CD45RA+ Charakter ablegten und

einen CD45R0+/CD49a+ Memory-/Effektor-Memory-T-Zell-Phänotyp akquirier-

ten, unabhängig davon, ob sie mit RSV-infizierten, Poly-IC-behandelten oder

nichtinfizierten Dendritischen Zellen kultiviert worden waren.

Demzufolge beeinflusst die RSV-Infektion die Bildung eines immunologischen

Gedächtnisses nicht, da trotz der Infektion durch das RS-Virus T-Zellen ihren

naiven Phänotyp ablegten und einen Memory-/Effektor-Memory-T-Zell-Phäno-

typ annahmen, was sich anhand der geänderten Oberflächenantigene nach-

vollziehen ließ.

53

Tag 1 Tag 3 Tag 7 Tag 22

RSV vs. Kontrolle n. s. n. s. n. s. n. s. RSV vs. Poly-IC n. s. n. s. n. s. n. s.

Abb. 6: Präsentation des naiven T-Zell-Oberflächenmarkers CD45RA an den Tagen 1, 3, 7 und 22 nach Infektion mit RSV, Stimulation mit Poly-IC und ohne Behandlung (Kontrolle).

54



Abb. 7: Präsentation des Memory-T-Zell-Oberflächenmarkers CD45R0 an

den Tagen 1, 3, 7 und 22 nach Infektion mit RSV, Stimulation mit Poly-IC und ohne Behandlung (Kontrolle).

55



Abb. 8: Präsentation des Memory-T-Zell-Oberflächenmarkers CD49a an den

Tagen 1, 3, 7 und 22 nach Infektion mit RSV, Stimulation mit Poly-IC und ohne Behandlung (Kontrolle).

56



Abb. 9: Präsentation des T-Zell-Rezeptor-Oberflächenmarkers Vβ2 an den

Tagen 1, 3, 7 und 22 nach Infektion mit RSV, Stimulation mit Poly-IC und ohne Behandlung (Kontrolle).

57

5. DISKUSSION

5.1 DIE RSV-INFEKTION FÜHRT ZU EINER IMMUNOLOGISCHEN SEKUNDÄRANTWORT MIT AUSBILDUNG VON MEMORY-T- ZELLEN

Es ist bekannt, dass die RSV-Infektion keinen lang anhaltenden Schutz vor

einer Reinfektion hinterlässt. Im Gegenteil, schon kurz nach überstandener

Erstinfektion wurden Reinfektionen mit dem genetisch identischen Virus

beschrieben, und auch Erwachsene erkranken immer wieder im Laufe ihres

Lebens symptomatisch an RSV-Infektionen, wenngleich auch mit abge-

schwächtem Krankheitsbild (Scott et al., 2006, Hall et al., 1991, Henderson et

al., 1979). Bisher gibt es keinen aktiven, lang anhaltenden Impfschutz; lediglich

für Hochrisikogruppen wie ehemals sehr junge Frühgeborene oder Säuglinge

mit Lungen- oder Herzerkrankungen steht ein Passivimpfstoff zur Verfügung.

Uns stellte sich daher die Frage, ob die Ursache der häufigen symptomatischen

Reinfektionen in der fehlenden Ausbildung von Memory-T-Zellen liegt, es also

zu keiner ausreichenden immunologischen Sekundärantwort kommt.

Hierfür untersuchten wir den Effekt RSV-infizierter Dendritischer Zellen

zunächst auf die T-Zell-Primär- und dann auch auf die -Sekundärantwort in

vitro. Die Zellen separierten wir aus Nabelschnurblut, welches eine hohe Anzahl

naiver T-Zellen und adulter hämatopoetischer Stammzellen enthält, aus denen

große Mengen Dendritischer Zellen gewonnen werden können. Um die Antigen-

Stimulation in vitro zu simulieren, nutzen wir das Superantigen TSST-1,

welches sich in vielen Versuchsreihen als Simulator der Virusantigen-Reaktion

bewährt hat. Als Kontrollgruppen dienten uninfizierte und mit Poly-IC, einem

Simulator viraler Infektionen in vitro, behandelte Dendritische Zellen.

Naive T-Zellen (CD45RA+) reifen durch wiederholten Antigenkontakt zu

CD45R0+ aktivierten oder Memory-/Effektor-Memory-T-Zellen heran und

erwerben so ein immunologisches Gedächtnis (Koning et al., 1996).

58

In unseren Untersuchungen konnten wir zeigen, dass es nach wiederholter

Stimulation zu einer Sekundärantwort mit der Ausbildung von Memory-/Effektor-

Memory-T-Zellen kommt: Nach Re-Stimulation der Co-Kulturen naiver T-Zellen,

Dendritischer Zellen und TSST-1 an den Tagen 7, 14 und 21 zeigte die Analyse

an Tag 22, dass die T-Zellen ihren naiven CD45RA+-Charakter verloren und

einen CD45R0+/CD49a+-Phänotyp akquirierten. Dieser Phänotyp entspricht

Memory-/Effektor-Memory-T-Zellen.

Ähnliche Ergebnisse konnten bei neugeborenen Kälbern, die mit bovinem RSV

infiziert wurden, erzielt werden. In ihrer Studie zeigten McInnes et al., dass es

nach RSV-Infektion zu einem Anstieg der Memory-Zellen im Untersuchungs-

material der Kälber kam. Während an Tag 1 die Mehrheit der Zellen im Blut, in

der Lunge und in der Bronchoalveolären Lavage (BAL) uninfizierter Kälber

naive T-Zellen waren, entsprach am fünften Tag nach Infektion die Anzahl

naiver T-Zellen bereits der Menge CD45R0-positiver T-Zellen. An Tag 10 nach

Infektion war der Anteil von Memory-/Effektor-Memory-T-Zellen signifikant

größer als der von naiven T-Zellen (McInnes et al., 1999).

Zudem wurde das Sputum infizierter Kälber und an RSV-Bronchiolitis erkrankter

Kinder untersucht: Im Vergleich der humanen mit den bovinen RSV-Infektionen

zeigte sich, dass bei infizierten Kälbern in der Bronchoalveolären Lavage eher

CD8+ T-Zellen dominierten, wohingegen es bei Kindern mit RSV-Bronchiolitis

zu einem Überwiegen der CD4+ T-Zellen kommt.

Die Vergleichbarkeit dieser Studie mit unseren Ergebnissen unterstreicht die

Theorie, dass es zur Ausbildung eines immunologischen Gedächtnisses kommt

und der eingeschränkten Immunität nach RSV-Infektion nicht eine fehlende

Ausbildung von Memory-/Effektor-Memory-T-Zellen zugrunde liegt.

Offen bleibt in unseren Untersuchungen jedoch die Differenzierung der

Untergruppen der zentralen Memory- und Effektor-Memory-T-Zellen.

Mithilfe des Chemokinrezeptors CCR7 und der Oberflächenmarker CD45RA

und CD45R0 lassen sich drei Typen von T-Zellen unterscheiden: Naive T-

Zellen (CCR7+, CD45RA+), zentrale Memory-T-Zellen (CCR7+, CD45R0+) und

Effektor-Memory-T-Zellen (CCR7-, CD45R0+).

59

De Bree et al. zeigten, dass RSV-spezifische CD8+ T-Zellen von Erwachsenen

zumeist (92%) einen CCR7- Phänotyp aufweisen, also die Effektor-Memory-T-

Zellen deutlich überwiegen (de Bree et al., 2005).

In unseren Untersuchungen unterschieden wir nicht, ob es sich um zentrale

Memory-T-Zellen handelt, die hauptsächlich das „Langzeitgedächtnis“ reprä-

sentieren, oder um Effektor-Memory-T-Zellen, die eher kürzer wirksam sind und

die Ausbreitung des Erregers verhindern. Möglicherweise besteht auch hier

eine Imbalance in der Ausbildung dieser beiden Subgruppen, die dazu führen

könnte, dass die Immunität nicht optimal generiert werden kann. Dies ist eine

Frage, die durch weiterführende Untersuchungen noch zu klären sein wird.

Eine andere mögliche Erklärung für die unzureichende Immunität liefern die

Ergebnisse weiterer, in dieser Arbeit nicht beschriebener Untersuchungen der

Zytokingeneration und der Proliferation.

Wir untersuchten die Zytokingeneration während der immunologischen Primär-

und der Sekundärantwort (Rothoeft et al., 2007). Bekannt ist nicht nur, dass

RSV unter anderem die Interferon-γ-Generation deutlich negativ beeinträchtigt,

sondern auch, dass die Schwere der klinischen Symptome von der Interferon-γ-

Generation abhängig ist (Bartz et al., 2003, Legg et al., 2003, Schauer et al.,

2004). Wir konnten zeigen, dass, während es bei der Primärantwort zu einer

deutlichen Beeinflussung der Zytokinmuster kam, die Memory-Antwort hin-

gegen nicht in diesem Maße beeinträchtigt wurde (Rothoeft et al., 2007).

Während der Primärantwort kam es zu einer zeitlichen Abfolge der maximalen

Ausschüttung der verschiedenen Zytokine (IL-2, TNF-α, IL-10, IL-4, IL-13 und

IFN-γ); zudem beeinträchtigte die RSV-Infektion die Anzahl zytokin-

produzierender Zellen einerseits und die Konzentration der ausgeschütteten

Zytokine andererseits. Insbesondere ergaben sich signifikante Unterschiede in

der IFN-γ-Reihe sowie beim TNF-α.

Im Vergleich hierzu kam es während der Sekundärantwort an Tag 22 zu einem

zeitlich simultanen Peak aller Zytokine, deren Konzentration jedoch zum Teil

signifikante Unterschiede zeigte: An Tag 3 erreichte IFN-γ seine maximale

Ausschüttung, wobei die Interferon-γ-Produktion in der RSV-Gruppe deutlich

niedriger war. Auch die Sekundärantwort an Tag 22 war gekennzeichnet durch

eine signifikant herabgesetzte IFN-γ-Ausschüttung im Vergleich zu Poly-IC.

60

Sowohl die Anzahl IFN-γ-produzierender Zellen als auch die Konzentration des

ausgeschütteten Zytokins zeigten signifikante Unterschiede, die klinischen

Beispielen entsprechen, in denen reduzierte Interferon-γ-Spiegel bei an RSV-

Bronchiolitis Erkrankten gemessen wurden. Dass es während der

Sekundärantwort zu einer zwar schwachen, jedoch ausreichenden IFN-γ-

Generation kommt, könnte ein Grund für die abnehmende Schwere der

klinischen Symptomatik bei einer Reinfektion im Erwachsenenalter sein, da

IFN-γ möglicherweise eine protektive Wirkung hat (Henderson et al., 1979,

Kumar et al., 1999).

Ebenfalls ist bekannt, dass RSV neben der Zytokingeneration auch die

Proliferation von T-Zellen beeinflusst. Schlender et al. beschreiben eine

herabgesetzte T-Zell-Proliferation durch Kontakt zum RSV-F-Protein, das auf

der Zelloberfläche des RS-Virus exprimiert wird (Schlender et al., 2002).

Wir untersuchten in weiteren, in dieser Arbeit nicht beschriebenen

Experimenten die Induktion der T-Zell-Proliferation durch Dendritische Zellen

mittels Durchflusszytometrie (Rothoeft et al., 2007).

In Co-Kulturen unbehandelter, Poly-IC-behandelter oder RSV-infizierter

Dendritischer Zellen mit TSST-1 und entweder naiven oder Memory-/Effektor-

Memory-T-Zellen zeigte sich eine signifikant eingeschränkte Proliferation bei

RSV-infizierten im Vergleich zu unbehandelten und Poly-IC-behandelten

Kulturen. Naive T-Zellen, die den höchsten Proliferationsgrad zeigten, sprachen

dabei deutlich stärker auf die Kontaktinhibition an als Memory-/Effektor-

Memory-T-Zellen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Memory-/Effektor-Memory-T-Zellen

zwar ausreifen und Zytokine gebildet werden, die Anzahl der gebildeten

Memory-/Effektor-Memory-T-Zellen jedoch eventuell zu gering ist, so dass bei

einer Reinfektion möglicherweise zu wenige kompetente Zellen zur Immun-

abwehr vorliegen und es daher zu einer Infektion mit abgeschwächter klinischer

Symptomatik kommt.

61

5.2 DIE RSV-INFEKTION INDUZIERT DIE REIFUNG DENDRITISCHER

ZELLEN WENIGER STARK ALS POLY-IC

Dendritische Zellen sind als professionelle Antigenpräsentierende Zellen die

wichtigsten Induktoren der T-Zell-vermittelten Immunantwort. Während der

RSV-Infektion kommt es zur Ausreifung Dendritischer Zellen, jedoch ist ein

viraler Mechanismus, die Immunantwort des Wirtes zu umgehen, die

Beeinflussung der Funktion Dendritischer Zellen.

Wir untersuchten daher die Ausbildung der Oberflächenmoleküle CD83 und

HLA-DR als Reifemarker Dendritischer Zellen und die Ausbildung des co-

stimulierenden Moleküls CD86 in Kulturen Dendritischer Zellen, die wir ent-

weder unbehandelt ließen, mit Poly-IC behandelten oder mit RSV infizierten.

Unsere Untersuchungen zeigten eine mangelnde Reifung Dendritischer Zellen

trotz erfolgreicher Infektion mit dem RS-Virus (etwa 25% der Zellen trugen das

RSV-F-Protein). In der Positiv-Kontrollgruppe der mit Poly-IC behandelten

Dendritischen Zellen zeigte sich eine deutliche Expression der Ober-

flächenmoleküle CD83 (MFI 423 ± 36) und HLA-DR (MFI 1061 ± 223),

wohingegen es bei der Infektion mit RSV zu einer abgeschwächten Expression

von CD83 (MFI 283 ± 144) kam und zu keinem Effekt beim HLA-DR (MFI 705 ±

106). Hier lag die Negativ-Kontrollgruppe der nicht-infizierten Dendritischen

Zellen mit einer MFI von 727 ± 211 sogar noch höher in der HLA-DR-

Expression als die RSV-Gruppe.

Einen ähnlichen Effekt sahen wir bei der Expression des co-stimulierenden

Faktors CD86: 69,2% ± 10,2% der mit Poly-IC behandelten Dendritischen

Zellen trugen nach 24-stündiger Stimulation diesen Oberflächenmarker, bei den

mit dem RS-Virus infizierten Zellen lag die Rate lediglich bei 47,7% ± 2,8%, bei

den unbehandelten Zellen bei 33,8% ± 9,6%.

Vergleichbares beschrieben bereits de Graaff et al.: Sie beobachteten eine

Reifung Dendritischer Zellen nach Infektion mit RSV, die im Vergleich zur

Behandlung mit Poly-IC jedoch deutlich herabgesetzt war (de Graaff et al.,

2005).

62

Poly-IC ist ein starker Stimulus für Dendritische Zellen, deren Reifung zu

induzieren und einen Phänotyp zu generieren, der hohe Level von HLA-DR,

CD83 und CD86 exprimiert. Dies zeigten bereits Verdijk et al., als sie 1999 die

Reifung von Dendritischen Zellen mit Poly-IC auslösten (Verdijk et al., 1999).

Als synthetische dsRNA ist Poly-IC ein Molekül, welches mit dem Toll-like-

Rezeptor 3 (TLR3) interagiert und eine virale Infektion simuliert. Es gilt als

starker Ligand des TLR3. In unseren Experimenten setzten wir Poly-IC daher

als Positivkontrolle ein.

Über rezeptorvermittelte Signalwege nach Bindung von Poly-IC an den TLR3

werden sowohl Zytokine ausgeschüttet als auch die Reifung Dendritischer

Zellen induziert. Somit stellt es einen annähernd optimalen Reifungsstimulus für

Dendritische Zellen in vitro dar.

Neben Poly-IC bindet virale Doppelstrang-RNA (dsRNA) an TLR3 (Matsumo et

al., 2008). RSV hingegen ist ein Einzelstrang-RNA-Virus (ssRNA), das nur

während eines kurzen Momentes der Virusreplikation - wenn die messenger-

RNA (mRNA) an den ssRNA-Strang bindet - doppelsträngig vorliegt. Die

Bindung an einen Rezeptor wird somit durch seine Verfügbarkeit zu diesem

Zeitpunkt des Replikationszyklus limitiert, womit die abgeschwächte Ausbildung

der Oberflächenmarker bei der RSV-Infektion im Vergleich zur Poly-IC-

Behandlung möglicherweise erklärt werden könnte.

Bekannt ist auch, dass ssRNA mit dem TLR7 interagiert, wie die Arbeitsgruppe

von Diebold et al. zeigte (Diebold et al., 2004). Zudem interagiert das RS-Virus

mit TLR4. Der TLR4 erkennt virale Oberflächenproteine wie das RSV-F-Protein

(Kurt-Jones et al., 2000). Poly-IC hingegen interagiert ausschließlich mit TLR3,

womit sich die Bindungswahrscheinlichkeit an TLR3 im Vergleich zu RSV

deutlich erhöht.

Daher ist es möglich, dass es bei Behandlung mit Poly-IC zu einer stärkeren

Ausbildung der Oberflächenmarker kommt als nach Infektion mit dem RS-Virus.

Einen weiteren Effekt auf die DC-Reifung konnten Kruse et al. in Studien mit

Herpes simplex Virus-1 (HSV-1) beschreiben: 10 Stunden nach Infektion kam

es zu einer starken Herabregulation von CD83 an der Zelloberfläche reifer DCs.

Da die fehlende CD83-Oberflächenexpression nicht durch die Inhibition der

CD83-mRNA-Synthese hervorgerufen wurde, vermutete man, dass ein

63

posttranskriptionelles Ereignis für die Herabmodulation von CD83 und damit

auch für die Reifung Dendritischer Zellen verantwortlich sein müsse, da die

CD80/86 Expression nicht beeinflusst wurde: Es konnte gezeigt werden, dass

CD83 in Lysosomen abgebaut wird (Kruse et al., 2000).

Arrode et al. zeigten an mit humanem Cytomegalievirus (hCMV) spätinfizierten

Fibroblasten, dass diese vermindert CD83 exprimierten, was wiederum zur

Inhibition der DC-Reifung führte (Arrode et al., 2002).

Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die CD83-Herabmodulation und die

Inhibition der DC-Reifung virale Mechanismen sind, eine Induktion antiviraler

Immunantworten zu verhindern. Möglicherweise kann ein ähnlicher Effekt durch

Infektion mit RSV ausgelöst werden, so dass auch hier die Immunantwort

zugunsten des Virus abgeschwächt wird.

Eine weitere mögliche Ursache der weniger stark ausgeprägten Reifung

Dendritischer Zellen könnte sein, dass es bei der Virusinfektion noch zu

anderen Begleitreaktionen von Virusproteinen in der Zelle kommt, die den

Effekt auf die Oberflächenmarkerexpression herabsetzen. Beispielsweise

beschreiben Jeffree et al. eine Interaktion von Aktin und RSV, wodurch es zu

einer „Lähmung“ der RSV-infizierten Zelle kommt (Jeffree et al., 2007). Das

Aktin-Zytoskelett spielt eine wichtige Rolle bei der Zellmotilität, -bewegung und

-morphologie. Aktin selbst ist ein wichtiger viraler Transkriptionsfaktor (Bitko et

al., 2003).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die RSV-Infektion im Vergleich zur

Behandlung mit Poly-IC zu einer verminderten Ausreifung Dendritischer Zellen

in vitro führt. Aufgrund der rezeptorspezifischen Bindung von Poly-IC erhöht

sich die Bindungswahrscheinlichkeit und damit die Ausreifung Dendritischer

Zellen deutlich. Das RS-Virus ist hingegen weiteren Rezeptorinteraktionen

ausgesetzt, die zu einer herabgesetzten Bindungswahrscheinlichkeit führen.

Ebenfalls unterliegt RSV anderen zellulären Mechanismen, die die Oberflächen-

markerexpression herabregulieren können.

64

5.3 DIE REAKTION DER T-ZELLEN AUF TSST-1 IST EHER SUPER-

ANTIGEN- ALS ANTIGEN-SPEZIFISCH

TSST-1, ein Superantigen, welches bevorzugt an die Vβ2-Kette des T-Zell-

Rezeptors bindet, wurde genutzt, um die Antigen-Stimulation in vitro nach-

zuahmen. Dass an Tag 22 annähernd 100% der T-Zellen Vβ2+ waren, ist ein

Effekt der klonalen Expansion nach Stimulation mit TSST-1, somit ist die

Reaktion eher superantigen- als antigenspezifisch.

Zudem ist bekannt, dass TSST-1 eher MHC-Klasse II-Reaktionen fördert,

wohingegen RSV MHC-Klasse I-spezifisch reagiert. Aus diesem Grunde ist das

genutzte in vitro-Modell nicht vollständig auf die in vivo-Situation übertragbar,

liefert jedoch einige Hinweise und Erklärungen, um die Pathogenese der RSV-

Infektion verstehen zu können.

65

6. ZUSAMMENFASSUNG

In dieser Arbeit sollte an einem humanen in vitro-Modell untersucht werden, ob

es nach einer Infektion mit dem RS-Virus zu einer potenten Primärantwort des

Immunsystems mit Ausreifung professioneller Antigenpräsentierender Zellen

kommt und ob während der Sekundärantwort die Ausbildung von Memory-T-

Zellen als Zellen des immunologischen Gedächtnisses induziert wird.

Folgende Oberflächenmoleküle als Marker der Reifung Dendritischer Zellen

wurden durchflusszytometrisch bestimmt: CD86, CD83, CD49a und HLA-DR.

Als Negativkontrolle diente die Co-Kultur naiver T-Zellen mit uninfizierten DCs,

als Positivkontrolle die Co-Kultur naiver T-Zellen mit Poly-IC-stimulierten DCs.

Poly-IC gilt als Simulator viraler Infektionen in vitro.

In der syngenen Langzeit-Co-Kultur untersuchten wir die immunologische

Sekundärantwort. Hier diente das Superantigen TSST-1 als exogener Stimulus,

der hauptsächlich an die Vβ2-Untereinheit des T-Zell-Rezeptors bindet, welcher

schnell durchflusszytometrisch erkannt werden kann. Die Langzeit-Co-Kultur

wurde an den Tagen 7, 14 und 21 restimuliert. Eine Messung der

Oberflächenmarker CD45RA, CD45R0, CD49a und Vβ2 erfolgte jeweils an den

Tagen 1, 3, 7 und 22. Den Oberflächenmarker CD45RA tragen naive T-Zellen,

die Marker CD45R0 und CD49a Memory-T-Zellen.

In den Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass das RS-Virus eine

Reifung Dendritischer Zellen induziert, wenngleich auch schwächer als Poly-IC.

Dies kann erklärt werden mit der hochspezifischen Bindung des Poly-IC an den

Toll-like-Rezeptor 3, womit Poly-IC bei der Bindungsspezifität dem RS-Virus,

das unter anderem noch mit dem Toll-like-Rezeptor 4 interagiert, deutlich

überlegen ist. Auch kann das einzelsträngige RS-Virus nur während eines

kurzen Moments der Virusreplikation, wenn es doppelsträngig vorliegt, an den

TLR3 binden, da dieser lediglich Doppelstrang-Nukleide bindet.

66

In der Langzeit-Co-Kultur konnten wir zeigen, dass sich ein immunologisches

Gedächtnis in Form von Memory-T-Zellen bildet:

An Tag 22 trugen etwa 85% der T-Zellen den Oberflächenmarker CD45R0 und

entsprachen somit dem Memory-T-Zell-Typ. Das initial vorliegende Ober-

flächenmolekül CD45RA als Charakteristikum der naiven T-Zelle hatten sie

abgelegt.

Somit ist die Tatsache, dass es bereits kurze Zeit nach durchlaufener, schwerer

RSV-Infektion zu Reinfektionen mit dem genetisch identischen Virus kommt,

nicht ursächlich auf die fehlende Ausbildung eines immunologischen Gedächt-

nisses zurückzuführen. Hier müssen andere Faktoren eine Rolle spielen.

67

7. LITERATURVERZEICHNIS

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of mature T cells and clonal deletion in neonatal mice. Cell 56, 27-35

DANKSAGUNG

Mein besonderer Dank gilt meinem Doktorvater, Herrn Professor Doktor Uwe

Schauer, für die Überlassung des interessanten Themas und die engagierte

und geduldige Betreuung meiner Arbeit, für die begleitende Unterstützung und

fachliche Beratung sowie für die kritische Korrektur.

Frau Veronika Baumeister und Frau Angelika Michel führten mich in freund-

licher Arbeitsatmosphäre in labortechnische Arbeitsweisen ein und standen

jederzeit und uneigennützig bei Fragen und Problemen zur Verfügung.

Für seine Hilfe bei allen computertechnischen Schwierigkeiten und die persön-

liche Unterstützung meiner Arbeit danke ich Herrn Martin Schulte.

Unter der Leitung von Herrn Doktor Bernhard Ibach durfte ich meine

pädiatrische Ausbildung absolvieren und lernen, dass ärztliches Handeln und

Denken stets dem Wohl des Kindes zu unterstellen sind: Primum nil nocere!

Ich danke Linda Sender für den seit Kindertagen gemeinsam und in aufrichtiger

Freundschaft beschrittenen Lebensweg, der mich zu einem erfüllenden Beruf

führte.

Mein ganz persönlicher Dank gilt meinen Eltern, die meinen Werdegang ermög-

licht, mich zu jeder Zeit gefördert und gefordert haben und mir Rückhalt und

Ansporn gaben, meine Ziele zu erreichen.

LEBENSLAUF

PERSÖNLICHE DATEN

Name Sandra Zawatzki

Geburtsdatum 12. November 1978

Geburtsort Gelsenkirchen

SCHULISCHE AUSBILDUNG

08 / 1985 - 06 / 1989 Städtische Grundschule an der Devensstraße in

Gelsenkirchen-Horst

08 / 1989 - 06 / 1998 Annette-von-Droste-Hülshoff-Gymnasium in

Gelsenkirchen-Buer

12. Juni 1998 Erlangen der Allgemeinen Hochschulreife

BERUFLICHE AUSBILDUNG

10 / 1998 - 09 / 2001 Katholische Krankenpflegeschule am St. Josef-

Hospital in Gelsenkirchen-Horst

01. Oktober 2001 Erlangen der Berufsbezeichnung Krankenschwester

10 / 2001 - 09 / 2005 Teilzeitbeschäftigung als Krankenschwester im

St. Josef-Hospital in Gelsenkirchen-Horst, Klinik für

Medizinische & Radiologische Onkologie,

Hämatologie & Palliativmedizin

10 / 2005 - 10 / 2007 Teilzeitbeschäftigung als Krankenschwester in den

Evangelischen Kliniken Gelsenkirchen, Klinik für

Radioonkologie & Strahlentherapie

STUDIUM & MEDIZINISCHE AUSBILDUNG

10 / 2001 - 12 / 2007 Studium der Humanmedizin an der Ruhr-Universität

Bochum

10. September 2003 Bestehen der Ärztlichen Vorprüfung

08 / 2006 - 07 / 2007 Praktisches Jahr in der Klinik für Innere Medizin, der

Klinik für Chirurgie sowie der Klinik für Kinder &

Jugendliche am Sana-Klinikum in Remscheid

27. November 2007 Bestehen des Zweiten Staatsexamens

18. Dezember 2007 Approbation als Ärztin

01 / 2008 - 03 / 2013 Assistenzärztin in der Klinik für Kinder & Jugendliche

am Sana-Klinikum in Remscheid

20. März 2013 Anerkennung als Fachärztin für Kinder- &

Jugendmedizin

seit 01. April 2013 Fachärztin in der Uniklinik Köln, Klinik & Poliklinik für

Kinder- & Jugendmedizin, Abteilung für Neonatologie

& pädiatrische Intensivmedizin

Documents

Aus der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin · Erkältungsbeschwerden wie Rhinitis oder leichter Pharyngitis kommt, können junge Säuglinge schwere klinische Verläufe mit Atemwegsobstruktion,