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Aus der Klinik und Poliklinik für Dermatologie und Allergologie der
Ludwig-Maximilians-Universität München
Direktor: Professor Dr. med. Dr. h.c. T. Ruzicka
Photoprotektion durch Antioxidantien
Dissertation
zum Erwerb des Doktorgrades der Medizin
an der Medizinischen Fakultät der
Ludwig-Maximilians-Universität zu München
vorgelegt von
Urs Kerkmann
aus
Stadthagen
2011
2
Mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät
der Universität München
Berichterstatter: Prof. Dr. med. B. Przybilla
Mitberichterstatter: Prof. Dr. med. Christian Sander
Priv. Doz. Dr. med. Matthias Kramer
Mitbetreuung durch den
Promovierten Mitarbeiter: Priv. Doz. Dr. med. M. Placzek
Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. M. Reiser, FACR, FRCR
Tag der mündlichen Prüfung: 24.02.2011
3
4
Inhaltsverzeichnis Seite
1. Einleitung 6
2. Material und Methode 11
2.1 Material 11
2.1.1 Reagentien 11 2.1.2 Medien, Seren und Antibiotika 11 2.1.3 Enzyme, Antikörper und Marker 12 2.1.4 Kommerzielle Komplettsysteme 12 2.1.5 Labormaterialien und Geräte 12 2.1.6 Zellen 13 2.2 Patienten und Probanden 13
2.3 Methoden 14
2.3.1 Studienablauf zur Antioxidantien-Bestimmung im Blut 14
2.3.1.1 Messung der Antioxidantien 15 2.3.2 Studienablauf zur minimalen Erythemdosis und zur
Proliferationsanalyse mittels Hautbiopsien 17 2.3.2.1 Bestimmung der minimalen Erythemdosis 17 2.3.2.2 Gewebeproben zur Proliferationsanalyse 19 2.3.2.3 Immunhistochemische Untersuchung 19 2.3.2.4 APAAP-Färbung und histologische Auswertung 20 2.3.2.5 Statistische Berechnungen 21
2.3.3 In-vitro-Untersuchungen 22 2.3.3.1 Zellkultur 22
2.3.3.2 Vorbereitung der Zellen zur Bestrahlung 23 2.3.3.3 Bestrahlungen 23
2.3.3.4 Zellproliferation nach Bestrahlung 24 2.3.3.5 Fixierung der Zellen nach Bestrahlung 25 2.3.3.6 DNA-Doppelmarkierung 26 2.3.3.7 Datenanalyse 27
3. Ergebnisse 29
3.1 Patienten und Probanden 29
3.1.1 Verteilung der Probanden 29 3.2 In vivo Untersuchungen 29
3.2.1 Antioxidantien-Bestimmung 29
3.2.1.1 L-Ascorbinsäure 29 3.2.1.2 D-alpha-Tocopherol-Spiegel 30 3.2.1.3 Antioxidantien-Spiegel der Probanden zur
Bestimmung der minimalen Erythemdosis 32
5
3.2.2 Minimale Erythemdosis für UV-B-Bestrahlung 33 3.2.3 Einfluss der Antioxidantien-Applikation und der UV-B-
Bestrahlung auf die Proliferationsaktivität in der Epidermis 35
3.3 In vitro Untersuchungen 38
3.3.1 Zellzyklus-Progressionsanalysen 38 3.3.2 UV-A-Effekte auf die Zellzyklusprogression 40 3.3.3 UV-B-Effekte auf die Zellzyklusprogression 42 3.3.4 Effekte ionisierender Strahlung auf die Zellzyklusprogression 44
4. Diskussion 46
4.1 Funktion und Eigenschaften der Vitamine C und E auf die Lichtsensibilität der Haut und auf UV-induzierte DNA-Schäden 46
4.1.1 Vitamin C 46 4.1.3 Vitamin E 46 4.1.4 Synergismus zwischen Vitamin C und E 47 4.1.4 Allgemeiner Einfluss der Vitamine C und E auf UV-Strahleneffekte 48 4.1.5 L-Ascorbinsäure und D-alpha-Tocopherol und ihr Einfluss
auf die UV-Strahleneffekte der Studienteilnehmer 50 4.1.6 L-Ascorbinsäure- und D-alpha-Tocopherol-Spiegel versus
Veränderung der minimalen Erythemdosis 51 4.1.7 DNA-Strahlenschäden und Messung der Zellzyklusproliferation 52 4.1.8 Epidermale Proliferation nach UV-B-Bestrahlung 53 4.1.9 Einfluss der L-Ascorbinsäure und des D-alpha-Tocopherol auf die
epidermale Proliferation nach UV-B-Bestrahlung 54
4.2 Einfluss der Bestrahlung mit UV-A-, UV-B- und mit ionisierender Strahlung auf die Proliferationskinetik der IPC-298-Zellen 55
4.2.1 Einfluss von UV-A-, UV-B- und ionisierender Strahlung auf den Zellzyklus 55 4.2.2 Einfluss von UV-A-, UV-B- und ionisierender Strahlung auf die IPC-298-Zellen 56
4.3 Schlussfolgerung 57 5 Zusammenfassung 59 6 Literaturverzeichnis 62 7 Anhang 75 8 Danksagung 81
6
1. Einleitung
Das elektromagnetische Strahlenspektrum umfasst u.a. UV-C (200 - 290 nm), UV-B
(290 – 320 nm), UV-A (320 – 400 nm), sichtbares Licht (400 - 800 nm) und Infrarot
(>800 nm). Die Sonnenstrahlung auf der Erdoberfläche enthält UV-B (oberhalb von
290 nm), UV-A, sichtbares Licht und Infrarot. Die Strahlenintensität und
Strahlenzusammensetzung auf der Erde wird u.a. durch die Ozonschicht,
Luftverschmutzung, Bewölkung und Tageszeit beeinflusst. Die Absorption
elektromagnetischer Strahlung durch die Ozonschicht ist im kürzerwelligen UV-
Spektrum stärker (unter 290 nm: Teile von UV-B und komplett UV-C) als im
langwelligen (38, 66). Daher führt die Abnahme der Ozonschicht zum Anstieg der
UV-Belastung auf der Erde, wie z.B. auf dem Jungfraujoch (3576m), wo der UV-B-
Strahlenanteil zugenommen hat (3).
Bei UV-Strahlenexposition reagiert die Haut beim Überschreiten der individuell
unterschiedlichen Schwellendosis obligat mit einer Dermatitis solaris (Sonnenbrand)
und einer Pigmentierung. Eine weitere akute Reaktion in der Haut ist die
Immunsuppression durch UV. Der Einfluss von Lichtsensibilisatoren, wie z.B.
Arzneiwirkstoffen (112), kann die UV-Empfindlichkeit (Phototoxizität) erhöhen und
nachfolgend auch die Prävalenz aktinischer Keratosen (AK) steigern (107).
Als chronische, langjährige Folge von UV-Strahlung kann die Hautalterung
beschleunigt sein. Betroffen bzw. geschädigt sind Kollagen- und Elastinfasern des
dermalen Bindegewebes (38). Gravierendere, chronische Folgen der Photokarzino-
genese sind die Ausbildung von Präkanzerosen oder malignen Hauttumoren.
Die Entstehung von Hauttumoren, wie z.B. von AK, spinozellulären Karzinomen (SK)
oder Basalzellkarzinomen (BK) korreliert mit einer hohen kumulativen
Lebenszeitdosis der UV-Exposition und hängt zudem von der
Strahlungsempfindlichkeit der Haut (2, 5, 38, 77, 134) ab. Als begünstigende
Risikofaktoren gelten ein heller Hauttyp (v.a. Ι und ΙΙ nach Fitzpatrick), rot-blondes
Haar, blaue Augen und Sommersprossen (41, 48, 49, 50, 62, 134). Die höhere
Lichtempfindlichkeit heller Hauttypen kann die kutane Tumorgenese begünstigen und
es scheinen bereits suberythematogene Dosen zur Tumorgenese auszureichen (38).
Auch die Exposition gegenüber ionisierender Strahlung (IR), z.B. in der Diagnostik
(42, 127, 128, 136) kann zur Hauttumorgenese unter anderem von BK beitragen.
7
Mit der Entwicklung des von Melanozyten ausgehenden malignen Melanoms (MM),
aber z.T. auch von nicht melanozytären Hauttumoren (NMM), scheinen vermehrte,
schmerzhafte akute Sonnenbrände im Kindes- und Jugendalter (13, 38, 51, 74)
assoziiert zu sein. Zudem scheinen ein heller Hauttyp, melanozytäre Naevi,
insbesondere atypische bzw. dysplastische Naevi (52), ebenso das Risiko für ein MM
zu erhöhen wie auch häufige Aufenthalte mit intensiver UV-Strahlung in Freizeit oder
im Beruf (8, 38, 139). Insbesondere Solarienbesucher scheinen häufiger an einem
MM oder NMM zu erkranken (32, 67, 140). Künstliches UV-A-Licht aus Solarien
scheint bei 6% der Todesfälle des MM ursächlich zu sein (33). Die Datenlage zeigt
einen ähnlichen ätiologischen Beitrag des UV-A in der Tumorgenese von nicht
melanozytären Hauttumoren und dem MM wie das UV-B (117, 130).
Die zunehmende UV-Belastung scheint zu einem Inzidenzanstieg maligner
Hauttumoren in vielen Regionen beizutragen (116). Betrachtet man die australische
alters-standardisierte Inzidenzrate aus Queensland, so gab es für das invasive MM
bei Männern einen Anstieg von 46,9 (1982) auf 82,1 (2002) und bei Frauen von 37,4
(1982) auf 55,3 (2002) pro 100000 Einwohner und Jahr (25). Beim nicht-invasivem
In-situ-Melanom stieg die Inzidenz in diesem Zeitraum von 5,3 auf 49,9 bei Männern
und von 5,4 auf 37,5 bei Frauen je 100000 Einwohner und Jahr (25). Im Vergleich
hierzu liegen die Inzidenzraten der Jahre 1998-2001 aus Deutschland (Schleswig-
Holstein) für das invasive MM bei 12,3 bei Männern und bei 14,8 bei Frauen je
100000 Einwohner. Das In-situ-Melanom wies zur gleichen Zeit eine Inzidenz von 2,9
bei Männern und von 4,5 bei Frauen je 100000 Einwohner (73) auf. Insgesamt liegt
das Lebenszeitrisiko der deutschen Bevölkerung für ein MM bei etwa 1:100 und in
Australien bei 1:25 (38, 119). Die Mortalität durch das MM in Deutschland lag im Jahr
2000 bei 2,9 bei Männern und bei 2,4 bei Frauen pro 100000 Einwohner und ist in
den letzten 30 Jahren nahezu konstant geblieben (119).
Die Inzidenz der epithelialen Hauttumoren zwischen 1998 und 2001 lag in Schleswig-
Holstein bei 100,2 bei Männern und bei 72,6 bei Frauen je 100000 Einwohner (73).
Dem gegenüber waren 1989 die Inzidenzen im Saarland für NMM mit 93,4 bei
Männern und mit 55,8 bei Frauen pro 100000 Einwohner und Jahr (116) geringer.
Starke Inzidenzzunahmen der epithelialen Tumoren von 174 (1988) auf 265 (1998)
pro 100000 Einwohner und Jahr sind auch in der englischen Bevölkerung zu
verzeichnen (65).
8
Die Problematik der Inzidenzzunahme von Hauttumoren verdeutlicht die
Notwendigkeit, Risikofaktoren ihrer Entstehung zu erkennen und zu minimieren.
Gleichzeitig ist die Entwicklung und konsequente Anwendung von effektiven
Hautschutzmaßnahmen gegenüber der UV-Strahlung erforderlich (38).
In der Haut werden die Strahlen reflektiert, gebeugt und gestreut. Langwellige
Strahlung dringt tiefer in die Haut ein als kurzwellige. Vereinfacht kann man
annehmen, dass UV-A bis in die Dermis, UV-B überwiegend bis in die Epidermis und
UV-C bis in die Hornschicht eindringt. Die Absorption von Strahlenenergie erfolgt z.B.
an der Zellmembran, der DNA oder dem Pigment Melanin und es entstehen instabile,
energetisch angeregte Moleküle, die die Energie zur Erlangung eines stabilen
Zustands auf Sauerstoff übertragen. Die hierbei entstehenden instabilen, reaktiven
freien Sauerstoffradikale wie Singulettsauerstoff, Superoxid-Anionen und
Hydroxylradikale (105) können indirekt schädigend mit DNA-Pyrimidinbasen, mit
Porphyrinen, Aminosäuren und Lipiden reagieren (27, 103). Daneben finden durch
Energieabsorption der UV-Strahlung v.a. an der Zielstruktur DNA auch direkte
Schädigungen statt, die typischerweise als DNA-Punktmutationen, 6-4-
Photoprodukte (38, 89) oder als UV-A- bzw. UV-B-induzierte Cyclobutan-Pyrimidin-
Dimere (z.B. Thymindimere) auftreten (20, 91). Vor allem UV-A und UV-B können
aber auch indirekte, oxidative Photoprodukte wie z.B. 8-oxy-7,8-dihydro-2`-
deoxyguanosin (16, 91) induzieren. Fibroblasten zeigten bei UV-A- und UV-B-
Strahlung mutagene, oxidative DNA-Veränderungen durch Photooxidation von
Guanin (79). UV-A ist häufig auch an direkt gebildeten Photoprodukten wie
Cyclobutan-Pyrimidin-Dimeren (91) oder Chromosomenstrangbrüchen beteiligt (101).
Insgesamt können sowohl hohe als auch niedrige Dosen von UV-A (18) und von UV-
B (20) zu einer direkten und indirekten DNA-Schädigung führen und zur
Karzinogenese beitragen. Die DNA-schädigende Wirkung einer wiederholten, 2-
wöchigen UV-Bestrahlung beim Menschen wurde durch den Anstieg von
Pyrimidindimeren und der p53-Expression in Keratinozytenzellkulturen nachgewiesen
(141).
Der Zellzyklus einer Zelle beschreibt die G1-, S- und G2-/M- Phase, die innerhalb von
24 Stunden von der Zelle zur Replikation der DNA durchlaufen werden. Die durch UV
oder IR induzierte Schädigung von Zellstrukturen kann eine Apoptose, einen
Zellzyklusblock und DNA-Reparaturmechanismen auslösen (30, 38, 100, 104, 142).
Die Apoptose bewahrt die Zellen vor der Weitergabe von irreparablen Mutationen
9
(78). Das p53-Tumor-Suppressor-Gen ist ein wichtiger Faktor zur
Zellzyklusregulation nach einem Schaden (58) und sorgt mit dem Proteinprodukt p53
für einen Zellzyklusblock in der G1-Phase zur Reparatur von DNA-Schäden (26).
Fehlerhafte DNA-Sequenzen, z.B. Dimere, werden bei der Exzisionsreparatur durch
Enzyme herausgeschnitten (DNA-Polymerase) und wieder ersetzt (DNA-Ligase). Bei
irreparablen DNA-Schäden kann p53 die Apoptose mit einleiten (78). Auch oxidativer
Stress kann zur Apoptose führen (111). Die erfolgte Replikation bzw. Reparatur der
DNA nach Bestrahlung mit UV oder IR wird vor der Zellteilung am Übergang von der
G2- zur M- (Mitose-) Phase (26, 64, 68) durch einen weiteren Zellzyklusblock
überprüft.
Nicht reparierte Mutationen in UV- oder IR-geschädigten Zellen können zum Verlust
von Funktionen und bei ungehinderter Proliferation zur malignen Entartung führen.
Die Haut schützt sich durch Melanin und bei wiederholter UV-Exposition durch die
entstehende Verdickung der Epidermis (Lichtschwiele) vor den Strahlen. Ein
antioxidatives Verteidigungssystem aus enzymatischen (z.B. Superoxid-Dismutase
und Peroxidase) und nicht-enzymatischen (z.B. Ascorbinsäure [Vitamin C],
Tocopherol [Vitamin E]) Antioxidantien (AO) schützt zudem die Epidermis und
Dermis vor freien Radikalen (44, 46, 125). AO überführen als Reduktionsmittel
Radikale wieder in einen stabilen Zustand und schützen vor oxidativen Schäden.
Vitamin C schützt hydrophile und Vitamin E lipophile Strukturen, z.B. Membranen
(19, 23, 125). Beide arbeiten synergistisch, indem oxidiertes Vitamin E in der
Zellmembran durch Vitamin C regeneriert wird (21, 59, 60).
Sowohl die Vitamin-E-Konzentration als antioxidativer Schutz für Membranen und
Proteine (132) als auch die Vitamin-C-Konzentration wird in der Haut durch Strahlung
reduziert (46, 124, 126). Die additive Anwendung von Ascorbinsäure und Tocopherol
allein oder kombiniert als Schutzmassnahme in menschlicher oder Tierhaut kann die
Entstehung von UV-induzierten Schäden reduzieren (14, 28, 83, 110, 113).
In der Lichttherapie nutzt man UV-Strahlung zur Behandlung unterschiedlicher
Dermatosen. Der Ermittlung der therapeutischen Strahlendosis des Patienten dient
die Lichttreppe, bei der man die minimale Erythemdosis (MED) als Maß der
individuellen Lichtempfindlichkeit bestimmt. Die Lichttreppe eignet sich auch für die
Untersuchung photoprotektiver Massnahmen (z.B. Wirksamkeit UV-absorbierender
Substanzen) an der Haut. Die MED ist die schwächste, noch scharf gegen die nicht
10
bestrahlte Umgebung begrenzte Hautrötung 24 Stunden nach UV-Bestrahlung (143)
und variiert mit dem Hauttyp und mit der Körperregion (94).
Ein protektiver Effekt von Vitamin C kombiniert mit Vitamin E auf die UV-
Empfindlichkeit wurde mittels MED-Bestimmung nachgewiesen (36, 45). Nach 8
Tagen oraler L-Ascorbinsäure- und D-alpha-Tocopherol-Applikation zeigte sich eine
Verminderung der UV-Empfindlichkeit durch einen MED-Anstieg von 80 auf 96,5
mJ/cm2 (36). Eine weitere Studie zeigte zudem die bessere Wirkung der AO-
Kombination gegenüber der Einzelapplikation (45).
Ziel der Arbeit
Insgesamt sollte die mögliche Photoprotektion durch den systemischen Einsatz der
AO (Kombination aus L-Ascorbinsäure und D-alpha-Tocopherol) als eine Strategie
zur Reduktion von UV-induzierten Hautschäden an der menschlichen Haut und als
Prophylaxe vor malignen Hauttumoren untersucht sowie mögliche unterschiedliche
Strahlenantworten in der Zellkultur analysiert werden.
Hierzu sollte in einer in vivo-Untersuchung über 3 Monate überprüft werden, ob eine
längerfristige, systemische AO-Applikation die UV-Empfindlichkeit (MED) der Haut
weiter verringert und somit eine protektive Wirkung vor der UV-Strahlung erzeugt.
Parallel untersuchte eine doppelblind, placebokontrollierte Studie mit HPLC-Analysen
die AO-Spiegel der täglich applizierten L-Ascorbinsäure und des D-alpha-
Tocopherols. Damit sollte der Frage nachgegangen werden, ob die zu
beobachtenden Einflüsse der AO mit einer Steigerung der Blutspiegel und somit
einer höheren Verfügbarkeit einhergehen.
Der Einfluss der UV-Strahlung auf die Proliferation der Epidermiszellen sollte mittels
des Proliferationsmarkers (Bromodeoxyuridin, BrdU) an bestrahlten Hautbiopsien im
Vergleich zu unbestrahlten Biopsien analysiert werden. Das Interesse galt vor allem
Proliferationsänderungen als Indikator für UV-induzierte Schäden. Begleitend sollte
der Einfluss der L-Ascorbinsäure und des D-alpha-Tocopherols auf die
Hautproliferation in bestrahlten und unbestrahlten Biopsien untersucht werden.
Ein in vitro-Teil sollte die unterschiedliche Wirkung verschiedener Strahlenarten wie
UV-A-, UV-B- und ionisierender Strahlung auf die Zellzykluskinetik und Proliferation
einer Melanomzelllinie mittels BrdU-Technik untersuchen (54, 55, 57).
11
2. Material und Methode
2.1 Material
2.1.1 Reagentien
DAKO® Antikörperverdünnungslösung Dako (Glostrup, Dänemark)
DMSO Sigma (St. Louis, USA)
Ethanol 80% Neolab (Heidelberg)
Formalin-ETOH (5%) Neolab (Heidelberg)
Hämatoxylin Sigma (St. Louis, USA)
Isopropanol Neolab (Heidelberg)
Kaisers Glycerin-Gelatine Merck (Darmstadt)
Meta-Phosphorsäure Merck (Darmstadt)
PBS (Phosphate Buffered Saline ) Sigma (St. Louis, USA)
Salzsäure 2 mol/l Neolab (Heidelberg)
Salzsäure, rauchend, 37% Merck (Darmstadt)
Tri-Natriumcitrat-Dihydrat Merck (Darmstadt)
Trizma® Base Sigma (St. Louis, USA)
Xylol Merck (Darmstadt)
Zitronensäure Sigma (St. Louis, USA)
2.1.2 Medien, Seren und Antibiotika
RPMI 1640 Medium (mit L-Glutamine) Gibco BRL® (Eggenstein)
Fetales Kälberserum (FCS) Boehringer Mannheim (Mannheim)
Antibiotics-Antimycotics (Pen-Strep-AmphoB) Gibco BRL® (Eggenstein)
Albumin, bovin (Fraction V) Sigma (St. Louis, USA)
12
2.1.3 Enzyme, Antikörper und Marker
Enzyme
Pepsin (70 FIP- U/g) Merck (Darmstadt)
Ribonuklease A (RNAse) Sigma (St. Louis, USA)
Trypsin/Ethylendiamintetraacetat (1x) Gibco BRL® (Eggenstein)
Antikörper
Alkalische Phosphatase Antialkalische Phophatase, Maus, monoklonal
Dako (Glostrup, Dänemark)
Kaninchen-Anti-Maus-Immunglobulin Dako (Glostrup, Dänemark)
Kaninchen-Anti-Maus-Immunglobulin (FITC-markiert)
Dako (Glostrup, Dänemark)
Maus-Anti-BrdU Becton Dickinson (San Jose, USA)
Marker
5-Bromo-2`deoxyuridin (BrdU) Serva (Heidelberg)
Propidium Jodid Sigma (St. Louis, USA)
Sigma FastTM Fast Red (TR/Naphthol AS-MX) Sigma (St. Louis, USA)
2.1.4 Kommerzielle Komplettsysteme
Komplett-Kit zur Vitamin-C-Bestimmung Immundiagnostik (Bensheim)
aus Plasma mittels HPLC-Analytik (KC 2900)
Reagenzienkit für die HPLC-Analytik der Chromsystems (München)
Vitamine A und E in Serum/Plasma
(34000 u. 34100)
2.1.5 Labormaterialien und Geräte
Arbeitsmaterialien
Cellstar®PP-Röhrchen 50 ml Greiner (Nürtingen)
13
Cellstar®PP-Röhrchen 15 ml Greiner (Nürtingen)
Gewebekulturflaschen 750 ml, 175 cm2 Becton Dickinson (San Jose, USA)
Gewebekulturflaschen 250 ml, 75 cm2 Becton Dickinson (San Jose, USA)
Gewebekulturflaschen 50 ml, 25 cm2 Becton Dickinson (San Jose, USA)
Multifly®Kanülen-Set 20G Sarstedt (Nümbrecht)
Nitrozellulose-Membran Schleicher & Schuell (Dassel)
Reaktionsgefäße Safe-Lock 2 ml Amber Eppendorf (Hamburg)
Rundbodenröhrchen 5 ml (FACS-Analyse) Becton Dickinson (San Jose, USA)
S-Monovette® 9 ml Kalium-EDTA Sarstedt (Nümbrecht)
Zellkulturschale 100 x 20 mm Becton Dickinson (San Jose, USA)
Zentrifugenröhrchen 15 ml TPP (Trasadingen, Schweiz)
Geräte
FACS-Scan Durchflußzytometer Becton Dickinson (San Jose, USA)
UVB-Waldmann 800 mit Waldmann (Schwenningen)
UV-Röhren Philips TL 20 W/12 UV Philips (Hamburg)
UVASUN 5000 Mutzhas (München)
Waldmann UV-Meter Typ 585 Waldmann (Schwenningen)
Röntgenröhre Seifert (Ahrensburg)
240 kV Röntgenstrahlen; 13 mA; Isovolt 320/10; 3 mm Be-Filter
2.1.6 Zellen
Die Melanomzellen IPC-298 (erhalten von V. Meineke, München) sind humane
Tumorzellen, die von einem bei einer 64-jährigen Patientin am Hals lokalisierten
kutanen Melanom abstammen. Sie wurden von Dr. C. Aubert (INSERM U.119,
Institut Paoli Calmette, Marseille, Frankreich) erstmals kultiviert (7).
2.2 Patienten und Probanden
Die insgesamt 80 Studienteilnehmer (43 Frauen, 37 Männer) wurden im Zeitraum
von März 2000 bis Februar 2002 in der Klinik und Poliklinik für Dermatologie und
14
Allergologie der Ludwig-Maximilians-Universität München, Frauenlobstr.9-11 in
80337 München rekrutiert. Es wurden Patienten mit malignem Melanom (MM),
Basalzellkarzinom (BK), spinozellulärem Karzinom (SK) und Kontrollpersonen (KP)
ausgewählt. Die Studie wurde gemäß der 1989 in Hongkong revidierten Fassung der
Deklaration von Helsinki durchgeführt. Ausschlusskriterium war die Einnahme von
Vitaminpräparaten zur Vermeidung eines dietätisch erhöhten AO-Spiegels. Auf eine
zusätzliche intensive Sonnenexposition wurde vor und während der 3 Monate
verzichtet. Es wurden nur Probanden mit Hauttyp 2 und 3 nach Fitzpatrick
ausgewählt. Einzelheiten zu den Patienten sind bei den jeweiligen Teilstudien
dargestellt.
Nach einem ausführlichen Aufklärungsgespräch über die Durchführung und
Zielsetzung sowie Risiken der Studie wurden das schriftliche Einverständnis, der
Hauttyp nach Fitzpatrick, die Haarfarbe, die Medikamentenanamnese und die
Rauchgewohnheiten sowie die Freizeit- und Sonnengewohnheiten der Teilnehmer in
einem Aufklärungsbogen dokumentiert. Keiner der Teilnehmer nahm Medikamente
ein, von denen bekannt war, dass sie die Lichtempfindlichkeit verändern würden,
oder hatte eine bekannte abnorme Empfindlichkeit gegenüber UV.
2.3 Methoden
2.3.1 Studienablauf zur Antioxidantien-Bestimmung im Blut
62 der insgesamt 80 Probanden wurden in einer doppelblind, placebokontrollierten
Studie für die Analyse der AO-Blutspiegel randomisiert nach 33 Patienten mit Verum-
(V, L-Ascorbinsäure und D-alpha-Tocopherol) und 29 mit Placebo-(P, Reisstärke)
Applikation. In der V-Gruppe waren 7 Patienten mit MM, 10 mit BK, 6 mit SK und 10
KP. In der P-Gruppe waren 6 Patienten mit MM, 9 mit BK, 4 mit SK und 10 KP
(Tabelle 1).
Die Teilnehmer nahmen täglich oral, morgens und abends jeweils 1000 mg L-
Ascorbinsäure in je 1 Kapsel und 500 IE (333 mg) D-alpha-Tocopherol in je 1 Kapsel
oder ein identisch aussehendes Plazebo-Präparat insgesamt über eine Dauer von 3
Monaten ein.
15
Den Probanden wurden am ersten Tag der Studie vor der 1. Einnahme und nach 1, 2
und 3 Monaten (jeweils +/- 5 Tage Toleranz) jeweils vor der Einnahme der AO etwa
30 ml EDTA-Blut entnommen. Die Entnahme fand zwischen 8:00 und 10:00 Uhr
morgens statt. Am Tag der Blutabnahme wurden die AO zur Vermeidung von
Spitzenspiegeln erst nach der Blutabnahme eingenommen.
Tabelle 1: Studienteilnehmer (n=62) zur Antioxidantien-Bestimmung im Blut
SA, Standardabweichung; MM, malignes Melanom; BK, Basalzellkarzinom; SK, spinozelluläres Karzinom; KP, Kontrollpersonen
2.3.1.1 Messung der Antioxidantien
Die Blutproben in den Kalium-EDTA Monovetten wurden sofort nach der Entnahme
zentrifugiert (4 °C; 2000 U/min; 15 min). Die Hälfte des gewonnenen Überstandes
wurde mit 10% Metaphosphorsäure (1:1) zur Fällung der Proteine und zur
Stabilisierung versetzt. Zur Gewinnung von Plasma wurde anschließend noch mal
wie oben zentrifugiert. Der gewonnene Überstand diente zur Analyse der L-
Ascorbinsäure im Plasma. Die andere Hälfte des Überstandes der primären
Zentrifugation wurde für die D-alpha-Tocopherol-Bestimmung im Serum abpipettiert.
Die so präparierten Proben wurden in lichtundurchlässigen Reaktionsgefäßen als
Plasmaprobe für die L-Ascorbinsäure-Bestimmung bei –70 °C und als Serumprobe
für die D-alpha-Tocopherol-Bestimmung bei –20 °C bis zur weiteren Analyse
eingefroren.
Die Analyse der AO-Spiegel im Serum und Plasma erfolgte mit Hilfe von Hochdruck-
flüssigkeitschromatographie (HPLC, englisch). Die HPLC gilt als Methode der Wahl
zur Vitaminanalyse (31, 118). Die Messungen wurden bei Prof. Dr. med. Dr. rer. nat.
Ekkehard Haen an der Klinik und Poliklinik für Psychiatrie im Bezirksklinikum
Regensburg durchgeführt. Die L-Ascorbinsäure-Bestimmung im Plasma erfolgte mit
Gesamt Männer Alter (Jahre) Hauttyp 2 Hauttyp 3
n n (%) Mittel +/- SA n (%) n (%)
MM 13 3 (23,1) 55,5 +/- 11,5 12 (92,3) 1 (7,7)
BK 19 8 (42,1) 60,7 +/- 12,5 19 (100) 0 (0) SK 10 7 (70) 75,1 +/- 8,9 10 (100) 0 (0)
KP 20 7 (35) 35,9 +/- 12,5 18 (90) 2 (10)
Gesamt 62 25 (40,3) 53,9 +/- 18,1 59 (95,2) 3 (4,8)
16
einem Kit der Firma Immundiagnostik (Bensheim) und für D-alpha-Tocopherol im
Serum mit einem Reagenzienkit der Firma Chromsystems (München). Zum
Ausschluss von Messschwankungen durch unterschiedliche Kalibrierungen wurden
alle Proben im selben Durchlauf gemessen.
Zur L-Ascorbinsäure-Bestimmung wurde nach dem Auftauen schnellst möglich mit
der Analyse begonnen, um Oxidationsprozesse zu vermeiden. Für die L-
Ascorbinsäure Bestimmung wurden 200 μl der Plasmaprobe zur Stabilisierung mit
200 μl Fällungsreagenz (Immundiagnostik, Bensheim) versetzt, gemischt, 10 min bei
2-8 °C inkubiert und zentrifugiert (10 min, 10000 G). 20 μl dieses Überstandes
wurden in das HPLC-System zur L-Ascorbinsäure Bestimmung injiziert.
Zur D-alpha-Tocopherol-Bestimmung wurden 100 μl des Serums mit 10 μl „Internal
Standard“ (Chromsystems, München) sowie mit 12,5 μl „Precipitation Reagent 1“
(Chromsystems, München) versetzt und lichtgeschützt aufbewahrt. Die Proben
wurden nach 30 s mit 100 μl „Precipitation Reagent 2“ (Chromsystems, München)
versetzt und zentrifugiert (10 min, 9000 G). 50 μl dieses Überstands wurden in das
HPLC-System zur D-alpha-Tocopherol-Bestimmung injiziert.
Die Trennung der Substanzen mittels HPLC erfolgt in einem isokratischen Verfahren
(HPLC-Pumpe, Injektor und UV-Detektor) bei 20-25 °C auf einer „reversed phase“
Säule (Flussrate für L-Ascorbinsäure 0,75 ml/min, für D-alpha-Tocopherol 1,5 ml/min;
Laufzeit 15 min bzw. 17 min). Mit einem UV Detektor (254 nm für L-Ascorbinsäure;
295 nm für D-alpha-Tocopherol) wurden die Chromatogramme aufgenommen und
über den mitgelieferten Kalibrator quantifiziert. Mit Hilfe der erhaltenen Daten und der
Integration der Peakflächen der Chromatogramme wurde die Konzentration der AO
berechnet (externe Standard-Methode).
Peakhöhe Patient x Konzentration Kalibrator (mg/l) Konzentration Probe (mg/l)= ----------------------------------------------------------------- Peakhöhe Kalibrator
17
2.3.2 Studienablauf zur minimalen Erythemdosis und zur Proliferationsanalyse
mittels Hautbiopsie
Bei 18 der 80 Probanden, die sich für die Bestimmung der MED vor und nach UV-B-
Bestrahlung bzw. zur Entnahme der Hautproben (n= 17) zur Verfügung stellten,
fanden ebenfalls Blutabnahmen zur Bestimmung der AO-Spiegel im Blut statt.
Teilnehmern an dieser Studie wurden ausschließlich L-Ascorbinsäure und D-alpha-
Tocopherol verabreicht. Unter den 18 Probanden waren 5 Patienten mit MM, 5 mit
BK, 4 mit SK und 4 KP (Tabelle 2). Die Blutabnahmen und auch die Verabreichung
der AO erfolgten nach demselben Schema wie in der Studie zur AO-Bestimmung im
Blut (s. oben). Insgesamt 17 Probanden (11 männlich; 6 weiblich; 21 bis 77 Jahre;
Hauttyp II n=16; Hauttyp III n=2) dieser Gruppe wurden mit UV-B zur MED-
Bestimmung bestrahlt und es wurden Ihnen jeweils vor und nach Bestrahlung
insgesamt 4 Hautbiopsien entnommen (4 Patienten mit MM, 5 mit BK, 4 mit SK und 4
KP).
Tabelle 2: Studienteilnehmer zur Bestimmung der minimalen Erythemdosis und zur
Proliferationsanalyse mittels Hautbiopsie (n=18)
SA, Standardabweichung; MM, malignes Melanom; BK, Basalzellkarzinom; SK, spinozelluläres Karzinom; KP, Kontrollpersonen
2.3.2.1 Bestimmung der minimalen Erythemdosis
Zur Untersuchung der Hautreaktionen auf UV-B-Strahlung wurden die Testpersonen
dem im folgendem beschriebenen Bestrahlungsschema unterzogen (36). Die
Bestimmung der MED erfolgte zu Studienbeginn Tag 0 und 24 Stunden später am
Tag 1 auf einer Seite des unteren Rückens. Hiernach wurde erstmals mit der
Gesamt Männer Alter (Jahren) Hauttyp 2 Hauttyp 3
n n (%) Mittel +/- SA n (%) n (%)
MM 5 3 (60) 43,4 +/- 10,2 5 (100) 0 (0)
BK 5 4 (80) 60,0 +/- 11,1 3 (91,7) 2 (8,3)
SK 4 3 (75) 70,0 +/- 5,3 4 (100) 0 (0) KP 4 2 (50) 23,5 +/- 1,0 4 (100) 0 (0)
Gesamt 18 12 (66,7) 49,5 +/- 19 16 (88,9) 2 (11,1)
18
Einnahme der AO begonnen. Am Ende der dreimonatigen AO-Einnahme wurde am
vorletzten und letzten Tag auf der gegenüberliegenden Seite erneut eine MED-
Bestimmung durchgeführt.
Als Testareal wurde ungebräunte Haut am Gesäß der Probanden ausgewählt. Eine
Gummischablone von 1,5 mm Dicke mit 10 kreisrunden Löchern wurde auf die Haut
aufgelegt. Die Löcher hatten eine Fläche von 1,8 cm2. Bei der Platzierung der
Schablone achtete man darauf, dass die Haut möglichst rechtwinklig von der
einfallenden UV-Strahlung getroffen wurde. Die umgebende Haut wurde sorgfältig
mit Tüchern abgedeckt. Die Dosierung der UV-B-Strahlung wurde ansteigend mit 20,
28, 40, 57, 80, 113, 125, 160, 175 bis 200 mJ/cm2 gewählt.
Die Platzierung des Waldmann-Bestrahlungsgeräts erfolgte mittels eines
Abstandhalters in einer Höhe von 40 cm über der Haut. Die Strahlungsintensität der
Lampe, ausgestattet mit TL 20 W/12-Strahlern (Philips, Hamburg), wurde vor jeder
Bestrahlungsreihe mit Hilfe des UV-Messgerätes (Waldmann, Schwenningen)
bestimmt und entsprechend die Bestrahlungszeit für die zu applizierenden Dosen
berechnet. Die Hauptemission der TL 20 W/12-Lampen liegt im Wellenlängenbereich
zwischen 272 und 365 nm mit einem Maximum um 315 nm.
Die Ablesung der Lichttreppe erfolgte 24 h (+/- 2 h) später visuell (Abb. 1). Die
niedrigste Dosis, die zu einem scharf begrenzten, homogenen Erythem geführt hatte,
wurde als MED definiert.
Abbildung 1. Bestimmung der MED MED ist die minimale Erythemdosis. Dies entspricht der niedrigsten UV-Strahlendosis der MED-Bestimmung, die gegenüber unbestrahlter Haut nach 24 Stunden ein scharf begrenztes Erythem erzeugt (143). In diesem Beispiel entspricht dies Punkt 8, der mit einer Dosis von 160 mJ/cm2 bestrahlt wurde.
19
2.3.2.2 Gewebeproben zur Proliferationsanalyse
Unmittelbar vor den MED-Bestimmungen wurden 17 Probanden gluteal eine
Hautbiopsie aus unbestrahlter Haut vor (p1) und am Ende der 3-monatigen AO-
Einnahme (p3) sowie aus UV-B-bestrahlter Haut aus dem Areal der zweifachen MED
vor (p2) und am Ende der 3-monatigen AO-Einnahme (p4) entnommen. Jede
Stanzbiopsie hatte einen Durchmesser von 6 mm und wurde sofort nach Entnahme
in zwei gleich große Stücke geteilt.
Die Biopsiehälften wurden unmittelbar nach Entnahme in jeweils 5 ml Medium (RPMI
1640 [mit L-Glutamin], 20% FCS, 1% Antibiotic Antimycotic) überführt und für 2 h bei
37 °C im Wasserbad mit 300 μl BrdU-Stammlösung (1 mg/ml; Endkonzentration:
60 μM) inkubiert. BrdU ist ein Proliferationsmarker, der als Analogon des Thymidins
in der S-Phase des Zellzyklus eingebaut wird und die Quantifizierung der S-Phase-
Zellen erlaubt. Hierdurch ist eine Analyse der Proliferationsaktivität von sich teilenden
Zellen in der Epidermis nach Bestrahlung möglich. Nach der BrdU-Inkubation folgte
die Fixierung einer Biopsiehälfte in 5%-Formalin-ETOH mit anschließender
Entwässerung und Einbettung in Paraffin. Die andere Biopsiehälfte wurde nach
stufenweisem Herunterkühlen mit 10 min Verwahrung bei +4 °C, über 30 min bei
–20 °C und nochmals 40 min bei –70 °C schließlich in flüssigem Stickstoff für weitere
Analysen verwahrt.
2.3.2.3 Immunhistochemische Untersuchung
Die Paraffinblöcke wurden in 5 μm dicke Scheiben geschnitten, auf Objektträger
aufgetragen und getrocknet. Anschließend wurde mit Xylol dreimal 6 min
entparaffiniert, in einer absteigenden Alkoholreihe entwässert (jeweils 5 min in 99%,
96%, 80%, 70%) und nachfolgend dreimal je 5 min mit Aqua dest. gespült.
Um das Antigen freizulegen, wurden die Schnitte in 10 mM Citratpuffer (s. u.; pH 6.0,
30 min) behandelt. Nach drei Spülungen für jeweils 3 min mit Leitungswasser folgte
eine weitere Spülung mit Aqua dest. (3 min). Zur Denaturierung der DNA inkubierten
die Schnitte 1 h mit 2 N HCL. Es folgten zwei Spülungen für jeweils 3 min mit
Leitungswasser, eine Spülung mit Aqua dest. (3 min) und zwei für 3 min mit Tris-
Puffer bevor die Schnitte mit Antikörpern inkubiert wurden.
20
Tris-Puffer 0,05 M (pH 7.4-7.6):
Stammlösungen: 1) 60,55 g Tris Base ad 1000 ml H2O
2) 87,66 g NaCl ad 1000 ml H2O
Gebrauchslösung: 100 ml Lösung 1 + 100 ml Lösung 2 + 800 ml H2O
Zitrat-Puffer 0,01 M (pH 6.0):
Stammlösungen:1) 0,1 M Zitronensäure (91,21 g Zitronensäure-Anhydrid ad
1000 ml H2O)
2) 0,1 M Natriumcitrat (29,41 g tri-Na-zitrat-Dihydrid ad
1000 ml H2O)
Gebrauchslösung: 9 ml Lösung 1 + 41 ml Lösung 2 ad 500 ml H2O
2.3.2.4 APAAP-Färbung und histologische Auswertung
Die Färbung der Paraffinschnitte erfolgte mittels APAAP-Verfahren (Abb. 2). Als
primärer Antikörper diente Maus-anti-BrdU (Becton Dickinson).
Nach der Spülung mit Tris-Puffer wurden alle Schnitte für 20 min mit DAKO-
Antikörperverdünnungslösung bei Raumtemperatur (RT) inkubiert und hierdurch zur
Vermeidung von unspezifischen Antikörperbindungen geblockt. 70 μl des Primär-
Antikörpers Maus-anti-BrdU (1:30 verdünnt) wurden für 2 h auf den Schnitten in einer
feuchten Kammer inkubiert. Bei den Negativ-Kontrollen wurde statt des Antikörpers
Tris-Puffer verwendet. Anschließend wurden 3 x 3 min mit Tris-Puffer gespült und die
Objektträger getrocknet. 70 μl des Sekundär-Antikörpers Kaninchen-anti-Maus (1:30
verdünnt) wurden 30 min inkubiert. Nach erneuter Spülung für 10 min mit Tris-Puffer
wurden 70 μl des dritten Antikörpers APAAP (1:30 verdünnt) für 30 min inkubiert.
Humanes Antigen
Maus-anti-BrdU-Antikörper
Kaninchen-anti-Maus- Antikörper
Monoklonaler Antikörper gegen alkalische Phosphatase (von der Maus)
Fast Red TR/Naphthol AS-MX Alkaline Substrat
Signal
Abbildung 2. Methode der
APAAP-Färbung
21
Dieser Antikörper besteht aus einem Komplex intestinaler alkalischer Phosphatase
und monoklonal-anti-alkalischer Phosphatase der Maus.
Der Einbau des Proliferationsmarkers BrdU in die DNA wurde sichtbar gemacht,
indem mit Fast Red (TR/Naphthol AS-MX Alkaline Substrat) Tabletten für 7 min
gefärbt wurde (Abb. 3). Die Zellkerne wurden nach Tris-Spülung kurz für 1 min mit
Hämatoxylin gefärbt und anschließend mit Leitungswasser gespült. Die getrockneten
Objektträger wurden mit Kaisers Glycerin-Gelatine eingedeckt.
Die Zellen, die zum Inkubationszeitpunkt in der S-Phase waren, wurden mit BrdU-
positiv markiert und erschienen im Lichtmikroskop rot. Sie wurden als proliferierende
Zellen eingestuft. Die Anzahl der positiv rot gefärbten Zellkerne in den Schnitten
wurde unter dem Lichtmikroskop ausgezählt. Desweiteren wurde die
Oberflächenlänge der Hautbiopsie gemessen. Die Anzahl der markierten Zellen
wurde anschließend im Verhältnis zur Hautoberfläche (pro mm) bestimmt.
2.3.2.5 Statistische Berechnungen
Zur statistischen Auswertung der Ergebnisse der Bestimmung der AO-
Konzentrationen im Blut wurden die Mittelwerte und die Standardabweichung
berechnet und der T-Test für verbundene Stichproben angewendet. Die Analyse der
Daten der MED-Bestimmung und der Messung der Zellproliferation erfolgten mittels
Wilcoxon-Test. Die Auswertungen wurden mit Hilfe des Instituts für Medizinische
Informationsverarbeitung, Biometrie und Epidemiologie und des Statistikprogramms
SPSS durchgeführt. Das Signifikanzniveau der AO-Werte wurde bei p≤ 0,05
festgelegt.
Abbildung 3. BrdU Inkorporation in der Epidermis
22
2.3.3 In-vitro-Untersuchungen
2.3.3.1 Zellkultur
Die IPC-298 Melanomzellen (Abb. 4) wurden bei 37 °C und 5% CO2-Sättigung der
Luft in Gewebekulturflaschen in einem Brutschrank bei zu 95% wasserdampf-
gesättigter Atmosphäre inkubiert. Die Zelllinie wurde in speziellem Medium (RPMI
1640 [mit L-Glutamin], 10% FCS, 1% Antibiotic Antimycotic) kultiviert. Zweimal
wöchentlich wurden das Medium gewechselt und die Zellen passagiert. Zur
Passagierung/ Trypsinierung wurden die Zellen einmal mit Trypsin/
Ethylendiamintetraacetat (EDTA, 1x) gewaschen und durch Inkubation mit 8 ml
Trypsin/ EDTA (1x) abgelöst. Die Trypsinaktivität wurde durch Hinzufügen von 16 ml
Medium inhibiert. Die Zellsuspension wurde bei 20 °C zentrifugiert (5 min, 1200 U)
und das Pellet mit 10 ml Medium versetzt. 2 ml dieser Suspension wurden in 25 ml
Medium in der Gewebekulturflasche (175 cm2 Bodenfläche der Gewebekulturflasche)
wieder ausgesät.
Zur Lagerung wurden die Zellen nach dem Ablösen und Sedimentieren in 1 ml
Einfriermedium (90% FCS, 10% DMSO) resuspendiert, bei –70 °C für einen Tag
eingefroren und danach in flüssigen Stickstoff überführt.
Zum Auftauen wurden die Zellen für kurze Zeit in ein warmes Wasserbad (37 °C)
gestellt und anschließend in ein 50 ml Reagenzgefäß mit 6 ml Medium überführt.
Nach einem Zentrifugationsschritt (s.o.) zum Auswaschen des DMSO wurde das
Pellet mit 2 ml Medium versetzt, in eine Gewebekulturflasche (25 cm2 Bodenfläche
der Gewebekulturflasche) mit 4 ml Medium überführt und hier bis zum Erreichen
Abbildung 4. IPC-298 Melanomzellen
23
einer geschlossenen, einschichtigen Zelldichte kultiviert bevor es in die größeren
Gewebekulturflaschen überführt wurde.
2.3.3.2 Vorbereitung der Zellen zur Bestrahlung
Die im Brutschrank mit 25 ml Zellkultur-Medium (RPMI 1640, 10% FCS, 1% Antibiotic
Antimycotic) in Gewebekulturflaschen (175 cm2) kultivierten IPC-298 Zellen wurden
mit 6 ml Trypsin/ EDTA (1x) zur Entfernung von Zellresten gespült und mit 8 ml
Trypsin/ EDTA (1x) abgelöst. Die Trypsinaktivität wurde durch Hinzufügen von 16 ml
Medium inhibiert und die Zellsuspension nachfolgend zentrifugiert (s.o.). Nach dem
Dekantieren des Überstandes wurde das Pellet mit 12 ml Medium versetzt und
resuspendiert. Mittels einer Neubauerzählkammer wurde die Zellzahl bestimmt und
24 h vor Beginn der Bestrahlung durch Hinzufügen einer entsprechenden Menge
Medium auf 1 x 105 Zellen/ml (je Petrischale 1,5 Mio. Zellen in 15 ml Medium)
eingestellt. Petrischalen eigneten sich durch den abnehmbaren Deckels, da somit die
UV-Strahlung ungehindert die Zellkultur erreichen konnte.
Für die Experimente mit ionisierender Strahlung (IR) wurden die Zellen in
Gewebekulturflaschen (75 cm2) ausgesät. Die Zellen wurden wie oben mit 4 ml
Trypsin/ EDTA (1x) gespült und mit 5 ml Trypsin/ EDTA (1x) abgelöst. Die
Trypsinaktivität wurde dann durch Hinzufügen von 5 ml Medium inhibiert. Nach der
Zentrifugation (s.o.) wurden die Zelldichte bestimmt und mit Medium auf
1 x 105 Zellen/ml eingestellt, so dass in den zu bestrahlenden Gewebekulturflaschen
(25 cm2) 0,6 Mio. Zellen in 6 ml Medium vorlagen.
2.3.3.3 Bestrahlungen
Die optimale Bestrahlungsdosis für die Progressionsanalysen wurde in Vorversuchen
für UV-A und UV-B ermittelt. Die Bestrahlung erfolgte mit Abstand von 40 cm zur
Strahlungsquelle. Die 1,5 Mio. Zellen in 15 ml Medium wurden in den Petrischalen
bei abgenommenen Deckel mit UV-A-Strahlung der unterschiedlichen Dosisstufen
von 0; 2,5; 5; 7,5 oder 10 J/cm2 im Wasserbad bei 37 °C bestrahlt. Bei UV-B-
Strahlung wurden 1,5 Mio. Zellen mit einer Bestrahlungsdosis zwischen 0, 10, 20, 30
24
oder 40 mJ/cm2 bestrahlt. Die unbestrahlten Kontrollzellen wurden während der
ganzen Versuchsdurchführung gleich behandelt.
Die deutlichsten Effekte auf die Zellzyklusprogression zeigten sich bei 10 J/cm2 UV-A
und bei 40 mJ/cm2 UV-B (unterschiedliche Strahleneffekte von 5 J/cm2 vs. 10 J/cm2
UV-A beispielhaft im Ergebnisteil, Abb.14).
UV-Bestrahlungen:
Als UV-A-Strahlenquelle diente das Bestrahlungsgerät UVASUN 5000 (Mutzhas,
München). Die Strahlenemission liegt zwischen 320-460 nm mit einem Maximum bei
374 nm. Die gemessene UV-A-Strahlungsintensität bei einem Abstand von 40 cm
betrug 58 mW/cm2. UV-B-Strahlung wurde durch Lampen vom Typ Philips
TL 20W/12 mit einer Emission zwischen 275-365 nm (Maximum bei 315 nm) erzeugt.
Die Strahlung der UV-Röhren wurde jedes Mal dosimetrisch mit Hilfe des Waldmann-
UV-Meter in 40 cm Abstand gemessen und hieraus die Bestrahlungszeit nach der
Formel berechnet:
Gewünschte Bestrahlungsdosis (J/cm2)
Bestrahlungszeit =
Intensität der Strahlung (mW/cm2)
Ionisierende Strahlung:
Die 0,6 Mio. Zellen in 6 ml Medium wurden mit Röntgenstrahlen (240kV; 13 mA;
Isovolt 320/10; Seifert, Ahrensburg) und einem Be-Filter (3 mm) in den
Gewebekulturschalen bestrahlt. Die Strahlendosis betrug 1 Gy min-1. Die Bestrahlung
wurde in Vorversuchen gestaffelt mit 0; 2,5; 5; 7,5 oder 10 Gy durchgeführt. Die
unbestrahlten Kontrollzellen wurden während der ganzen Versuchsdurchführung
gleich behandelt. Die Bestrahlung mit 7.5 Gy zeigte sich als geeignet zur Analyse der
Zellzykluseffekte.
2.3.3.4 Zellproliferation nach Bestrahlung
Eine etablierte Methode zur Bestimmung der Zellzyklusprogression nach Bestrahlung
ist die BrdU/DNA-Doppelmarkierungstechnik von DNA-sythetisierenden Zellen (34,
54, 55, 57, 120). BrdU ist ein Proliferationsmarker, der als Analogon des Thymidins in
der S-Phase des Zellzyklus eingebaut wird und die Quantifizierung der S-Phase-
25
Zellen zum BrdU-Inkubationszeitpunkt in asynchron wachsenden Zellkulturen erlaubt.
Die Messung der positiv markierten Zellen wird in vitro mittels fluoreszierenden anti-
BrdU-Antikörpers im Durchflußzytometer durchgeführt und erlaubt die Trennung von
BrdU-positiv und BrdU-negativ markierten Zellen. Desweiteren ermöglicht das
Durchflußzytometer, Zellen anhand ihres unterschiedlichen DNA-Gehalts den
einzelnen Zellzyklusphasen G1-, S- oder G2-Phase zu zuordnen.
Für die Analyse von akuten Zellzykluseffekten wurde in vorausgehenden Versuchen,
bei denen die Zellen über einen Zeitraum von 72 h nach UV-Bestrahlung beobachtet
wurden, ein optimales Zeitfenster von 0 h bis 24 h zur Beobachtung nach
Bestrahlung ermittelt. Zur BrdU-Markierung wurden unmittelbar nach der UV-
Bestrahlung die bestrahlten aber auch die unbestrahlten Kulturen in den Petrischalen
mit geschlossenem Deckel mit 150 μl BrdU-Stammlösung (1 mg/ml;
Endkonzentration 10 μM) für 10 min im Brutschrank bei 37 °C inkubiert. Nach
Auswaschen des BrdUs mit jeweils 10 ml Medium wurde den Zellen 15 ml Medium
zugefügt, um sie im Brutschrank für die Ermittlung der Progressionsanalyse bei 0 h,
6 h, 12 h und 24 h nach Bestrahlung zu verwahren. Für jeden Zeitpunkt wurde eine
einzelne Zellkultur vorbereitet.
Bei der BrdU-Markierung nach Bestrahlung mit IR wurden die unbestrahlten und
bestrahlten Kulturen sofort im Anschluss an die Bestrahlung, entsprechend des
geringeren Volumens der 25 cm2 Gewebekulturflaschen, mit 60 μl BrdU-
Stammlösung (1 mg/ml; Endkonzentration 10 μM) für 10 min im Brutschrank bei
37 °C inkubiert. Nach Auswaschen des BrdUs mit jeweils 3 ml Medium wurde den
Zellen 6 ml Medium zugefügt. Die Zellen wurden unmittelbar danach im Brutschrank
für die Ermittlung der Progressionsanalyse bei 0 h, 6 h, 12 h und 24 h nach
Bestrahlung verwahrt. Für jeden Zeitpunkt wurde eine einzelne Zellkultur vorbereitet.
2.3.3.5 Fixierung der Zellen nach Bestrahlung
Die jeweils für die einzelnen Progressionsanalysen bei 0 h, 6 h, 12 h und 24 h nach
Bestrahlung zurückgestellten Zellen wurden vor der Messung mit 2 ml Trypsin
gespült und mit 3 ml Trypsin abgelöst. Die Trypsinaktivität wurde durch Hinzufügen
von 6 ml Medium inhibiert. Die Suspension wurde 5 min zentrifugiert (1200 U; 20 °C).
26
Das Pellet wurde zur Fixierung der Zellen mit 2 ml 80% Ethanol versetzt und bis zur
weiteren Behandlung bei –20 °C eingefroren.
Bei den Experimenten mit IR wurde abweichend vom oben aufgeführten Protokoll
aufgrund des geringeren Zellvolumens mit 1 ml Trypsin gespült und mit 2 ml Trypsin
abgelöst. Die Trypsinaktivität wurde dann durch Hinzufügen von 2 ml Medium
inhibiert.
2.3.3.6 DNA-Doppelmarkierung
1 ml der in Ethanol fixierten Zellen wurden 5 min zentrifugiert (1200 U und 4 °C) und
das Pellet mit 2 ml RNAse (10% in PBS) für 10 min bei 37 °C im Wasserbad
inkubiert. Nach erneutem Zentrifugieren (1200 U und 4 °C) wurde die Suspension
10 min mit 2 ml Pepsin (70 FIP-U/g; 5% in 0,05 N Salzsäure) im Wasserbad inkubiert
(37°C). Die Proben wurden für 5 min ins Eisbad gestellt, anschließend mit 4 ml PBS-
Albumin (1 g Albumin auf 100 ml PBS) gewaschen und zentrifugiert (1200 U und
4 °C). Zum aufgeschüttelten Pellet wurde 2 N HCL gegeben und 10 min bei
Raumtemperatur (RT) inkubiert, um die DNA zu denaturieren. Nach 3
Waschschritten mit 4 ml PBS-Albumin (1%) wurden die Zellen mit 200 μl eines Maus-
Anti-BrdU-Antikörper (1:10 verdünnt in PBS-Albumin, 1%) versetzt und 30 min bei RT
inkubiert. Die Kontrollzellen wurden stattdessen mit 200 μl PBS-Albumin (1%)
versetzt. Nach Wasch- und Zentrifugationsschritten wurden die Zellen mit 200 μl
eines Fluorescein Isothiocyanat (FITC)-konjugierten Kaninchen-anti-Maus–
Antikörpers (1:50 verdünnt in PBS-Albumin, 1%) versetzt und 30 min bei RT im
Dunkeln inkubiert. Gleich im Anschluss wurden zur Gegenfärbung der DNA 350 μl
Propidiumiodid (PI)-Stammlösung (50 μg/ml) zugegeben und wie oben zentrifugiert.
Das Pellet wurde hiernach mit 200 μl einer PI-PBS-Albumin-RNAse Lösung (PI
verdünnt 1:1 mit PBS-Albumin sowie verstzt im Verhältnis 1:50 mit RNAse, s.o.)
mindestens 15 min bei 4 °C im Dunkeln inkubiert. Hiernach konnten der DNA-Gehalt
und die BrdU-Inkorporation pro Zelle in den gefärbten Proben am
Durchflusszytometer (FACScan, Becton Dickinson) gemessen und mittels Cell Quest
(Software, Becton Dickinson) analysiert werden.
27
2.3.3.7 Datenanalyse
Mit Hilfe der Messdaten des Durchflusszytometer und der FACScan Research
Software und einer überarbeiteten Methodik (55) lassen sich graphisch Histogramme
erstellen, die aus 2 Parametern ermittelt werden. Zum einen werden die Zellen nach
positiver bzw. negativer PI-Färbung auf der y-Achse unterschieden und auf der x-
Achse wird der unterschiedliche DNA-Gehalt dargestellt. Insgesamt wurden 6
Regionen in den Histogrammen definiert (Abb. 5).
Jeweils 3 Regionen auf der x-Achse wurden für die Zellen anhand des
unterschiedlichen DNA Gehalts definiert, um die Zellen in den einzelnen
Zellzyklusphasen (G1-, S- und G2- Phase) unterscheiden zu können. Jede dieser 3
Regionen wurde auf der y-Achse nochmals unterteilt in Zellen, die positiv oder
negativ mit PI gefärbt wurden und somit also BrdU aufgenommen oder nicht
aufgenommen hatten. Mit Hilfe dieser Methode konnte in den einzelnen Regionen
der Prozentsatz der Zellen in jeder Zellzyklusphase bestimmt und so getrennt für
BrdU-markierte (S-Phase-Zellen zum Zeitpunkt der Bestrahlung und Inkubation) und
nicht markierte Zellen (G1- und G2-Phase-Zellen zum Zeitpunkt der Bestrahlung und
Inkubation) betrachtet werden.
Die Analyse und Beobachtung jeder einzelnen Phase über mehrere Stunden erlaubt
Veränderungen in der Progression und Proliferationsaktivität der Zellen nach
Bestrahlung mit UV-A, UV-B oder IR zu bestimmen und mit den unbestrahlten Zellen
zu vergleichen. Für die Auswertung wurden die zwei einzelnen Versuchsdurchläufe
als Mittelwert zusammengefasst. Die Anzahl der Zellen, die sich zum
Bestrahlungszeitpunkt (0 h Wert) jeweils in der G1-, S- oder G2-Phase befanden,
wurden in der Auswertung einzeln über die Zeit analysiert und der Ausgangswert am
Bestrahlungszeitpunkt wurde in der graphischen Darstellung als 100% gesetzt und
normiert. Alle Werte der zeitlich nachgeordneten Messzeitpunkte wurden auf den
jeweiligen zugehörigen 0 h-Wert bezogen (s. Formel).
Mit Hilfe dieser Darstellung können die Veränderungen in der Progression und die
sich verändernden Mengen an Zellen in den verschiedenen Zellzyklus-Phasen als
eine Funktion der Zeit präsentiert werden.
Gemessener Wert zum jeweiligen Messzeitpunkt Normierter Wert (%)= ------------------------------------------------------------------ * 100 Gemessener 0-h-Wert
28
Abbildung 5. Histogramme der IPC-298 Zellen zu den Zeitpunkten 0 h, 6 h, 12 h und
24 h nach UV-B-Bestrahlung und Bestimmung von 6 Regionen (farbig abgegrenzt)
entsprechend des unterschiedlichen DNA-Gehalts (x-Achse) und der BrdU-
Markierung (y-Achse). G1-, S- und G2/M-Phase wurden nach ihrem zellulären DNA-
Gehalt (x-Achse) definiert und unterteilt in BrdU positive und negative Regionen (y-
Achse) sowie die Progression im zeitlichen Verlauf (0 h, 6 h, 12 h und 24 h)
dargestellt.
Brd
U
Brd
U
DNA-Gehalt pro Zelle
S = S-Phase-Zellen G1 = G1-Phase-Zellen G2 = G2-Phase-Zellen + = BrdU-positive Zellen - = BrdU-negative Zellen
29
3. Ergebnisse
3.1 Patienten und Probanden
3.1.1 Verteilung der Probanden
Von den 62 Patienten der Studie zur Bestimmung der Antioxidantien erhielten 33
Patienten Verum und 29 Patienten Placebo während des 3-monatigen
Studienzeitraums (s. Tab 4).
Tabelle 4. Verteilung der Probandengruppen nach P oder V
MM, malignes Melanom; BK, Basalzellkarzinom; SK, spinozelluläres Karzinom; KP,
Kontrollpersonen
3.2 In vivo Untersuchungen
3.2.1 Antioxidantien-Bestimmung
3.2.1.1 L-Ascorbinsäure-Spiegel
Der Mittelwert des L-Ascorbinsäure-Spiegels im Plasma lag vor Beginn der Studie für
die 33 Probanden der Verumgruppe mit 11,19 mg/l im Normbereich (4-20 mg/l).
Bereits nach 1 Monat zeigte sich in der Verumgruppe im Vergleich zum
Ausgangswert ein signifikanter Anstieg des L-Ascorbinsäure-Spiegels auf 16,84 mg/l
Doppelblind-placebokontrollierte Studie (n=62)
Gruppe Placebo (n) Verum (n)
MM
6
7
BK 9 10
SK 4 6
KP 10 10
Gesamt 29 33
30
(p<0,001). Dieser Anstieg blieb nach 2 Monaten mit 17,17 mg/l (p<0,001) nach 3
Monaten mit 14,64 mg/l (p=0,007) über den gesamten Studienzeitraum weitgehend
erhalten. Es war somit keine weitere Steigerung durch längerfristige Einnahme zu
beobachten (s. Abb. 6). In der Placebogruppe (n=29) betrugen die L-Ascorbinsäure-
Werte zu Studienbeginn 9,67 mg/l und blieben nach dem 1. Monat mit 11,02 mg/l,
nach dem 2. Monat mit 11,37 mg/l und nach dem 3. Monat mit 10,32 mg/l nahezu
konstant (s. Abb. 6). Die Veränderungen der L-Ascorbinsäure-Werte in der
Placebogruppe waren zu keinem Zeitpunkt statistisch signifikant. Keiner der
Probanden berichtete über Nebenwirkungen.
Abbildung 6. Mittelwerte der L-Ascorbinsäure-Blutspiegel der Verumgruppe (n=33)
im Plasma bei Studienbeginn (0), nach dem 1. Monat, 1 (p<0,001); 2. Monat, 2
(p<0,001) und 3. Monat, 3 (p=0,007) sowie die Veränderung der Mittelwerte der L-
Ascorbinsäure-Spiegel der Placebogruppe (n=29) im gesamten Studienverlauf (n.s.,
nicht signifikant).
3.2.1.2 D-alpha-Tocopherol-Spiegel
Bei den D-alpha-Tocopherol-Bestimmungen lag der Mittelwert der 33 Probanden der
Verumgruppe zu Studienbeginn bei 15,94 mg/l und somit innerhalb des
Normbereichs (5-20 mg/l). Bereits nach 1 Monat zeigte sich in der Verumgruppe im
0
5
10
15
20
25
30
0 1 2 3
Monate
mg
/l
Placebo
Verum
31
0
10
20
30
40
50
60
70
0 1 2 3
Monate
mg
/l
Placebo
Verum
Vergleich zum Ausgangswert ein signifikanter Anstieg des D-alpha-Tocopherol-
Spiegels auf 41,55 mg/l (p<0,001). Auch an den Kontrollzeitpunkten nach 2 Monaten
blieb der D-alpha-Tocopherol-Spiegel in der Verumgruppe mit 38,62 mg/l (p<0,001)
und nach 3 Monaten mit 38,18 mg/l (p<0,001) in etwa konstant (s. Abb. 7). Die
Messwerte für D-alpha-Tocopherol in der Placebogruppe (n=29) lagen zu
Studienbeginn bei 15,93 mg/l. Auch im weiteren Studienverlauf blieben die Werte
nahezu konstant in der Placebogruppe (1. Monat, 15,64 mg/l; 2. Monat, 16,23 mg/l
und 3. Monat, 16,42 mg/l) und innerhalb des Normbereichs (5-20 mg/l). Die
Veränderungen der D-alpha-Tocopherol-Werte in der Placebogruppe waren zu
keinem Zeitpunkt statistisch signifikant. In der Verumgruppe überschritten die Werte
den Normbereich nach 30-tägiger Verum-Applikation. Keiner der Probanden
berichtete über Nebenwirkungen.
Abbildung 7. Mittelwerte der D-alpha-Tocopherol-Blutpiegel der Verumgruppe
(n=33) im Serum bei Studienbeginn (0), nach dem 1. Monat, 1 (p<0,001); 2. Monat, 2
(p<0,001) und 3. Monat, 3 (p<0,001) sowie die Veränderung der Mittelwerte der D-
alpha-Tocopherol-Spiegel der Placebogruppe (n=29) im gesamten Studienverlauf
(n.s., nicht signifikant).
32
3.2.1.3 Antioxidantien-Spiegel der Probanden zur Bestimmung der
minimalen Erythemdosis
Der Ausgangsspiegel für L-Ascorbinsäure im Plasma bei der Probandengruppe zur
Bestimmung der MED lag bei 11,63 mg/l, stieg nach dem ersten Monat statistisch
signifikant zum Ausgangswert auf 19,25 mg/l (p<0,001, n=18) und blieb nach 2
Monaten mit 19,03 mg/l (p<0,001, n=18) sowie nach 3 Monaten mit 18,15 mg/l
(p<0,001, n=18) nahezu konstant auf diesem Niveau. Für D-alpha-Tocopherol im
Serum lag der Ausgangsspiegel in dieser Gruppe bei 20,96 mg/l und erreichte nach
dem ersten Monat statistisch signifikant zum Ausgangswert 36,03 mg/l (p<0,001,
n=18), nach 2 Monaten 39,54 mg/l (p<0,001, n=18) und nach 3 Monaten 38,84 mg/l
(p<0,001, n=18).
Abbildung 8. L-Ascorbinsäure und D-alpha-Tocopherol Mittelwerte in mg/l in der
Patienten- und Probandengruppe zur MED-Bestimmung (n=18). Alle Antioxidantien-
Werte für L-Ascorbinsäure und für D-alpha-Tocopherol im Studienverlauf waren zum
Ausgangswert jeweils statistisch signifikant erhöht (p<0,001).
0
10
20
30
40
50
60
70
0 1 2 3
Monate
mg
/l
Ascorbinsäured-alpha-Tocopherol
33
3.2.2 Minimale Erythemdosis für UV-B-Bestrahlung
Bei 18 Patienten wurde eine MED-Bestimmung für UV-B vor und während der AO-
Applikation durchgeführt (s. Tab. 3). Beim Vergleich der zu Studienbeginn und nach
3 Monaten durchgeführten MED-Bestimmung, zeigte sich bei 12 von 18 Probanden
eine Abnahme der Lichtempfindlichkeit der Haut gegenüber UV-B. In 6 Fällen war
keine Veränderung zu beobachten (Abb. 9). Es zeigte sich ein signifikanter Anstieg
des Medians der MED für UV-B (Abb. 9). Bei Studienbeginn war der Median der
MED 80 mJ/cm2 und nach 3 Monaten 113 mJ/cm2 (p=0,002).
Abbildung 9. Minimale Erythemdosis vor und während Antioxidantien-Applikation
(Gabe für 3 Monate von L-Ascorbinsäure- und D-alpha-Tocopherol). Jedes Symbol
bezeichnet einen Patienten oder Probanden.
Beim Vergleich der MED mit den L-Ascorbinsäure- und D-alpha-Tocopherol-Werten
zeigte sich bei Probanden ohne MED-Veränderung (n=6) nach 3 Monaten AO-
Einnahme ein höherer AO-Basisspiegel bei Studienbeginn als bei den 12 Probanden
mit MED-Veränderung. Der L-Ascorbinsäure-Wert bei Studienbeginn lag bei
34
14,23 mg/l für die 6 Probanden ohne MED-Änderung und bei 10,33 mg/l für die 12
Probanden mit MED-Änderung. Nach dem 1. Monat stiegen die L-Ascorbinsäure-
Spiegel bei Probanden ohne MED-Veränderung auf 22,94 mg/l (p=0,05), nach dem
2. Monat auf 21,79 mg/l (n.s.) und nach dem 3. Monat auf 20,32 mg/l (n.s.). In der
Gruppe mit MED-Anstieg stiegen die L-Ascorbinsäure-Spiegel nach dem 1. Monat
auf 17,41 mg/l (p=0,003), nach dem 2. Monat auf 17,65 mg/l (p=0,01) und nach dem
3. Monat auf 17,07 mg/l (p=0,01) (Abb. 10). Beim D-alpha-Tocopherol-Spiegel zu
Studienbeginn verhielt es sich ähnlich. Der Basiswert der 6 Probanden ohne MED-
Veränderung war mit 27,34 mg/l im Mittel deutlich höher als 17,78 mg/l für die 12
Probanden mit MED-Änderung (Abb. 11). Der D-alpha-Tocopherol-Spiegel stieg
nach dem 1. Monat in der Gruppe ohne MED-Änderung auf 31,69 mg/l (n.s.), nach
dem 2. Monat auf 34,24 (n.s.) und nach dem 3. Monat auf 38,95 mg/l (n.s.).
Hingegen stieg bei den 12 Probanden mit MED-Änderung der D-alpha-Tocopherol-
Spiegel nach dem 1. Monat auf 38,2 mg/l (p<0,001), nach dem 2. Monat auf 42,19
mg/l (p<0,001) und nach dem 3. Monat auf 38,78 mg/l (p<0,001) (Abb. 11). Die MED-
Auswertung für die Gruppe mit gleichbleibender MED zeigte zudem zu
Studienbeginn am Tag 0 (bzw. am Tag 90) einen Medianwert von 96,5 mJ/cm2, der
somit im Vergleich zu 80 mJ/cm2 am Tag 0 für die Probanden mit MED-Veränderung
höher ausfiel.
Abbildung 10. Vergleich der L-Ascorbinsäure-Spiegel in mg/l für die Probanden
ohne (n=6, Monat 1, p=0,05 und Monat 2 und 3 jeweils n.s.) und mit (n=12, Monat 1,
p=0,003, Monat 2 und 3 jeweils p=0,01) MED-Veränderung.
0
5
10
15
20
25
30
35
0 1 2 3 Monate
mg
/l
Mittelwert L-Ascorbinsäure-Spiegel ohne MEDVeränderungMittelwert L-Ascorbinsäure-Spiegel mit MEDVeränderung
35
Abbildung 11. Vergleich der D-alpha-Tocopherol-Spiegel in mg/l für die Probanden
ohne (n=6, Monat 1 bis 3, n.s.) und mit (n=12, Monat 1 bis 3, p<0,001) MED-
Veränderung.
3.2.3 Einfluss der Antioxidantien-Applikation und der UV-B-Bestrahlung auf
die Proliferationsaktivität in der Epidermis
Nach UV-B-Bestrahlung der Haut und vor AO-Applikation zeigte sich eine verringerte
Proliferationsaktivität der Epidermiszellen im Vergleich zur unbestrahlten Haut.
Lediglich 4 Probanden zeigten eine gleichbleibende bzw. leicht ansteigende
Proliferationsaktivität (Abb. 12). Der Median der proliferierenden BrdU-positiv
markierten Zellen vor AO-Applikation betrug in unbestrahlter Haut 7,8 Zellen/mm und
in bestrahlter Haut 5,0 Zellen/mm (p= 0,02; Abb. 13).
Die Proliferationsaktivitätsmessung nach 3 Monaten Gabe von AO ergab einen
Median der BrdU-positiv markierten Zellen in unbestrahlter Haut von 8,0 Zellen/mm
und in bestrahlter Haut von 4,0 Zellen/mm (p<0,001; Abb. 13). Somit wurde der
Median der proliferierenden Zellen durch die 3-monatige Gabe von L-Ascorbinsäure
und D-alpha-Tocopherol in unbestrahlter Haut nicht signifikant verändert (7,8
Zellen/mm vs. 8,0 Zellen/mm; n.s., Abb. 13). In der bestrahlten Haut zeigte sich
jedoch eine signifikante Verringerung der proliferierenden Epidermiszellen nach AO-
Applikation (5,0 Zellen/mm vs. 4,0 Zellen/mm; p=0,03, Abb. 13). Bei lediglich einem
der 17 Probanden kam es unter AO-Einfluss zu einer leicht erhöhten Proliferation
nach Bestrahlung (Abb. 12).
0
10
20
30
40
50
60
70
0 1 2 3 Monate
mg
/l
Mittelwert D-alpha-Tocopherol- Spiegel ohne MEDVeränderung Mittelwert D-alpha-Tocopherol- Spiegel mit MEDVeränderung
36
Abbildung 12. Proliferierende Zellen je mm Hautoberfläche in unbestrahlter vs.
bestrahlter Haut vor und nach 3 Monaten Antioxidantien (L-Ascorbinsäure und D-
alpha-Tocopherol)-Applikation; MM, malignes Melanom; BK, Basaliom; SK,
spinozelluläres Karzinom; KP, Kontrollpersonen
Anz
ahl B
rdU
-pos
itive
r Z
elle
n/m
m H
auto
ber
fläch
e
37
Abbildung 13. BrdU-positive Zellen/mm Hautoberfläche unbestrahlt (p1) und UV-B-
bestrahlt (p2) vor Einahme der Antioxidantien (L-Ascorbinsäure und D-alpha-
Tocopherol) sowie unbestrahlt (p3) und UV-B-bestrahlt (p4) während der 3-
monatigen Einnahme der Antioxidantien; n.s., nicht signifikant
38
3.3 In vitro Untersuchungen
3.3.1 Zellzyklus-Progressionsanalysen
Die Beobachtung der Zellzyklusprogression ermöglicht die Beurteilung der
Strahlungseffekte in den einzelnen Zellzyklusphasen nach UV-A-, UV-B- und
ionisierender Strahlung. Mit der Technik der BrdU-Markierung war es möglich, im
Durchflußzytometer die Unterscheidung einzelner Zellzyklusphasen in der nicht
synchron wachsenden Zellkultur IPC 298 durch zu führen. Die Zellen konnten in den
einzelnen Phasen G1, S oder G2 durch den jeweils unterschiedlichen DNA-Gehalt
separiert und getrennt voneinander analysiert werden. Hierdurch konnte der weitere
Verlauf jeder einzelnen Zellzyklusphase ab dem Zeitpunkt der Bestrahlung beurteilt
werden. Mittels der Messparameter wurde die Progression der Zellen in den
verschiedenen Zellzyklusphasen sowohl über die Zeit als auch getrennt für BrdU-
markierte S-Phase-Zellen (BrdU-positiv markierte Zellen) und nicht BrdU-markierte
Zellen analysiert.
Die Abbildung 14 demonstriert als ein Beispiel die Zellzykluskinetik von bestrahlten
Zellen verglichen mit unbestrahlten Kontrollen. Die Histogramme zeigen eine durch
UV-A-Bestrahlung induzierte Verzögerung der Zellen beim Eintritt in den nächsten
Zellzyklus und es wird die von der Bestrahlungsdosis abhängige Verstärkung dieser
Verzögerung dargestellt (Abb. 14, Pfeil bei 12 h). Ähnliche Histogramme konnten
sowohl für UV-B als auch für ionisierende Strahlung ermittelt werden.
Mit Hilfe der Progressionsanalyse konnten strahlungsabhängige Zellzyklus-
veränderungen und deren Intensität im Vergleich zu unbestrahlten Kontrollen sowie
eine Abhängigkeit dieser Effekte von der Bestrahlungsdosis ermittelt werden. In
Vorversuchen wurde für alle Strahlungsarten das optimale Zeitfenster für die
Untersuchung von Zellzykluseffekten und die geeignete Dosis der Strahlung
bestimmt. Die Vorversuche erstreckten sich über 72 h mit Untersuchungen vor und
6 h, 12 h, 24 h, 36 h, 48 h oder 72 h nach der Bestrahlung. Hierbei zeigte sich, dass
die Strahlungseffekte in einem Zeitfenster von 24 h (0 h, 6 h, 12 h und 24 h) optimal
zu beobachten sind. Zur Dosisfindung wurden Versuche mit UV-A-Dosen von 2,5, 5,
7,5 und 10 J/cm2, mit UV-B-Dosen von 10, 20, 30 und 40 mJ/cm2 sowie bei
ionisierender Strahlung mit 2,5, 5, 7,5 und 10 Gy durchgeführt. Als ideale Dosis für
39
UV-A-Bestrahlung wurden 10 J/cm2 und für UV-B 40 mJ/cm2 ermittelt. Für
ionisierende Strahlung zeigten sich die Einflüsse auf den Zellzyklus ideal bei 7,5 Gy.
Abbildung 14. BrdU/DNA-Histogramme UV-A-bestrahlter IPC-298 Zellen 6 h, 12 h
und 24 h nach Bestrahlung (5 J/cm2 oder 10 J/cm2) im Vergleich mit unbestrahlten
Kontrollen (0 J/cm2). Die Pfeile zeigen beispielhaft nach 12 h den verzögerten
Übertritt der BrdU-positiven Zellen in die G1-Phase in Abhängigkeit von der
Bestrahlungsdosis.
6 h 12 h 24 h
0 J/cm2
5 J/cm2
10 J/cm2
Brd
U In
korp
ora
tio
n
Brd
U In
korp
ora
tio
n
Brd
U In
korp
ora
tio
n
DNA Gehalt / Zelle
40
3.3.2 UV-A-Effekte auf die Zellzyklusprogression
Eine Zelle benötigt circa 24 Stunden, um den Zellzyklus zu durchlaufen. Daher ist die
Zellzyklusprogression der IPC-298 Zellen zu je 4 Zeitpunkten nach UV-A-Bestrahlung
in den Abbildungen 16 a-f über diesen Zeitraum dargestellt.
In der G1-Phase befindliche, mit 10 J/cm² UV-A-bestrahlte (BrdU negative Zellen)
IPC-298 Zellen wurden nicht in der G1-Phase blockiert (Abb. 16 d). Die zu
beobachtende leicht verlangsamte Progression in der G1-Phase zwischen 12 h und
24 h nach Bestrahlung ist die Folge einer Blockade der Zellen in der G2-Phase 6 h
nach Bestrahlung (Abb. 16 f).
Die S-Phase durchlaufen die BrdU negativ markierten Zellen ohne eine Verzögerung
(Abb. 16 e). Allerdings zeigt sich im weiteren Verlauf sowohl nach 6 h als auch nach
24 h eine Blockade der bestrahlten Zellen in der G2-Phase (Abb. 16 f). Der höhere
Anteil (195,1 %) von UV-A-bestrahlten Zellen nach 24 h in der G2-Phase im Vergleich
mit den unbestrahlten Kontrollen (113,9 %) zeigt, dass Zellen, die während der G1-
Phase bestrahlt worden sind, erst in der nachfolgenden G2-Phase 24 h nach
Bestrahlung blockiert werden (Abb. 16 f).
Die während der G2-Phase mit UV-A-bestrahlten Zellen (BrdU negative Zellen)
zeigten 6 h nach Bestrahlung eine Blockade in dieser Phase (Abb. 16 f). 74,6 % der
UV-A-bestrahlten Zellen waren nach 6 h blockiert gegenüber 45,2 % der
unbestrahlten Kontrollzellen. Die Folge hiervon war, wie oben bereits erwähnt, der
verzögerte Eintritt in die nachfolgende G1-Phase (Abb. 16 d).
Eine Bestrahlung während der S-Phase (BrdU positive Zellen) führte zwischen 0 h
und 12 h zu einer deutlichen Verzögerung der Progression durch die S-Phase (Abb.
16 b). Zum Zeitpunkt 12 h nach Bestrahlung in der S-Phase waren 11,8 % der
Kontrollen gegenüber 51,6 % der UV-A-bestrahlten Zellen in der S-Phase. Dadurch
kam es zu einer verzögerten Progression in die folgende G2-Phase und einer sich
anschließenden Blockade in der G2-Phase nach 12 h (Kontrollzellen 164,3 % vs.
293,2 % UV-A bestrahlte Zellen, Abb. 16 c).
Diese beiden Effekte sind der Grund für den verspäteten Übergang der in der S-
Phase mit UV-A-bestrahlten Zellen in die nächste G1-Phase (12 h bis 24 h nach
Bestrahlung, Abb. 16 a).
41
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0h 6h 12h 24h
Z eit (h)
Kontrollen (n=2)UVA (n=2)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0h 6h 12h 24h
Z eit (h)
Kontrollen (n=2)UVA (n=2)
0
20
40
60
80
100
120
0h 6h 12h 24h
Z eit (h)
Kontrollen (n=2)UVA (n=2)
0
20
40
60
80
100
120
140
0h 6h 12h 24h
Z eit (h)
Kontrollen (n=2)UVA (n=2)
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0h 6h 12h 24h
Z eit (h)
Kontrollen (n=2)UVA (n=2)
0
50
100
150
200
250
0h 6h 12h 24h
Z eit (h)
Kontrollen (n=2)UVA (n=2)
Abbildung 16 a-f: IPC-298-Zellzykluskinetik nach UV-A-Bestrahlung; BrdU-
positive (16 a-c) und BrdU-negative (16 d-f) Zellen; G1-Phase (a, d); S-Phase
(b, e); G2-Phase (c, f); BrdU: 5-Bromodesoxyuridin.
a
b
c
d
e
f
Brd
U p
os
itiv
e Z
ell
en
(%
)
Brd
U n
eg
ati
ve
Ze
lle
n (
%)
Brd
U p
os
itiv
e Z
ell
en
(%
)
Brd
U n
eg
ati
ve
Ze
lle
n (
%)
Brd
U p
os
itiv
e Z
ell
en
(%
)
Brd
U n
eg
ati
ve
Ze
lle
n (
%)
42
3.3.3 UV-B-Effekte auf die Zellzyklusprogression
Eine Zelle benötigt circa 24 Stunden, um den Zellzyklus zu durchlaufen. Daher ist die
Zellzyklusprogression der IPC-298 Zellen zu je 4 Zeitpunkten nach UV-B-Bestrahlung
in den Abbildungen 17 a-f über diesen Zeitraum dargestellt. Im Progressionsverlauf
nach Bestrahlung mit 40 mJ/cm² UV-B zeigte sich nach 12 h eine deutliche Blockade
im Zellzyklus in der G1-Phase (Abb. 17 d). 69,4% der unbestrahlten Kontrollen
zeigten sich 12 h nach Bestrahlung in der G1-Phase. Dem gegenüber konnten noch
99,1% der mit UV-B-bestrahlten Zellen zum Messzeitpunkt in der G1-Phase detektiert
werden. Die Progression in und durch die nachfolgende S-Phase (Abb. 17 e) war
entsprechend verzögert (s. 12 h-Wert, Abb. 17 e). Diese Verzögerung in der S-Phase
führte gleichzeitig zu einem späteren Eintritt (Zeitpunkt 24 h) in die anschließende
G2-Phase für UV-B-bestrahlte Zellen (Abb. 17 f). In der G2-Phase bestrahlte Zellen
(BrdU negative Zellen) zeigten eine leichte Verzögerung der Progression nach 6 h,
sie wurden jedoch nicht blockiert. Die verlangsamte Progression der bestrahlten
Zellen in der G2-Phase (Abb. 17 f) im Vergleich zu den Kontrollen und die verringerte
Zellzahl nach 24 h wurde durch den Block in der G1-Phase induziert (Abb. 17 d).
Eine Bestrahlung während der S-Phase (BrdU positive Zellen) sorgte für eine
Verzögerung der Progression in der S-Phase des Zellzyklus. Beginnend zwischen
6 h und 12 h nach UV-B-Bestrahlung zeigte sich eine deutliche Verzögerung in der
S-Phase (Abb. 17 b). 12 h nach Bestrahlung kumulierten 9,7% der unbestrahlten
Zellen gegenüber 55,6% der mit UV-B-bestrahlten Zellen in der S-Phase. Im weiteren
Zellzyklusverlauf sorgte die Verzögerung in der S-Phase auch für einen verzögerten
Eintritt der Zellen in die folgende G2-Phase nach Bestrahlung (Abb. 17c). Nach 6 h
zeigten sich bereits 226,3% der unbestrahlten Kontrollen in der G2-Phase gegenüber
deutlich weniger UV-B-bestrahlten Zellen (135,8%).
Nach 24 h wurden die in der S-Phase bestrahlten Zellen (BrdU positive Zellen) in der
G2-Phase blockiert. Es befanden sich 101,1% der unbestrahlten Zellen 24 h nach
Bestrahlung in der G2-Phase. Die UV-B-bestrahlten Zellen kumulierten hingegen mit
einem Wert von 224,2% in der G2-Phase 24 h nach Bestrahlung (Abb. 17 c). Als
Folge dieser Verzögerung und Blockade war auch die Progression durch die G1-
Phase für die in der S-Phase bestrahlten Zellen verlangsamt (s. 12 h bis 24 h, Abb.
17 a).
43
Abbildung 17 a-f: IPC-298-Zellzykluskinetik nach UV-B-Bestrahlung; BrdU-
positive (17 a-c) und BrdU-negative (17 d-f) Zellen; G1-Phase (a, d); S-Phase
(b, e); G2-Phase (c, f); BrdU: 5-Bromodesoxyuridin.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
0h 6h 12h 24h
Z eit (h)
Kontrollen (n=2)UVB (n=2)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0h 6h 12h 24h
Z eit (h)
Kontrollen (n=2)UVB (n=2)
0
20
40
60
80
100
120
140
0h 6h 12h 24h
Z eit (h)
Kontrollen (n=2)UVB (n=2)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0h 6h 12h 24h
Z eit (h)
Kontrollen (n=2)UVB (n=2)
0
20
40
60
80
100
120
0h 6h 12h 24h
Z eit (h)
Kontrollen (n=2)UVB (n=2)
0
50
100
150
200
250
300
0h 6h 12h 24h
Z eit (h)
Kontrollen (n=2)UVB (n=2)
a d
b e
c f
Brd
U p
os
itiv
e Z
ell
en
(%
)B
rdU
po
sit
ive
Ze
lle
n (
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Brd
U p
os
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e Z
ell
en
(%
)B
rdU
po
sit
ive
Ze
lle
n (
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Brd
U n
eg
ati
ve
Ze
lle
n (
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Brd
U n
eg
ati
ve
Ze
lle
n (
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Brd
U n
eg
ati
ve
Ze
lle
n (
%)
Brd
U n
eg
ati
ve
Ze
lle
n (
%)
44
3.3.4 Effekte ionisierender Strahlung auf die Zellzyklusprogression
Eine Zelle benötigt circa 24 Stunden, um den Zellzyklus zu durchlaufen. Daher ist die
Zellzyklusprogression der IPC-298 Zellen zu je 4 Zeitpunkten nach ionisierender
Bestrahlung in den Abbildungen 18 a-f über diesen Zeitraum dargestellt.
Die IR-Bestrahlung während der G1-Phase (BrdU negative Zellen) bewirkte keine
Blockade in dieser Phase (Abb. 18 d). Die Progression in und durch die S-Phase
(Abb. 18 e) war nicht verzögert und die Zellen zeigten den gleichen Zellzyklusverlauf
wie die unbestrahlten Kontrollen. Im weiteren Zellzyklusverlauf zeigte sich 24 h nach
IR-Bestrahlung ein Anstieg der Zellzahl in der G2-Phase im Vergleich mit den
Kontrollen (Abb. 18 f). Ursache des Anstiegs ist ein G2-Block nach 24 h für in der G1-
Phase bestrahlte Zellen. 48,5 % der unbestrahlten Kontrollen befanden sich nach
24 h in der G2-Phase (Abb. 18 f). Im Gegensatz dazu waren 118,1% der mit 7,5 Gy
bestrahlten Zellen nach 24 h in dieser Phase blockiert. Dieser G2-Block wiederum
führte zu einem verzögerten Eintritt der Zellen in die G1-Phase des nachfolgenden
Zellzyklus nach 24 h (Abb. 18 d).
Während der G2-Phase bestrahlte Zellen (BrdU negative Zellen) wurden beginnend
nach 6 h mit Persistenz über 12 h nach Bestrahlung hinaus in der G2-Phase blockiert
(Abb. 18 f). In der Progressionsanalyse wurden nach 6 h 14,7 % der unbestrahlten
und dem gegenüber 91,3 % der mit 7,5 Gy bestrahlten Zellen in der G2-Phase
gemessen.
In der S-Phase bestrahlte Zellen (BrdU positive Zellen) wiesen keine Veränderung
der Zellzyklusprogression in dieser Phase auf (Abb. 18 b), jedoch 12 h nach
Bestrahlung wurden sie stark in der G2-Phase blockiert (Abb. 18 c). Nach 7,5 Gy IR-
Bestrahlung in der S-Phase waren 354,8 % der Zellen gegenüber 85,8 % der
unbestrahlten Kontrollen in der G2-Phase blockiert. Dieser Block führte im Verlauf zu
einem verzögerten Eintritt nach 12 h bis 24 h nach Bestrahlung in die nachfolgende
G1-Phase verglichen mit den unbestrahlten Kontrollen (Abb. 18 a).
45
Abbildung 18 a-f: IPC-298-Zellzykluskinetik nach IR-Bestrahlung; BrdU-
positive (18 a-c) und BrdU-negative (18 d-f) Zellen; G1-Phase (a, d); S-Phase
(b, e); G2-Phase (c, f); BrdU: 5-Bromodesoxyuridin.
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Abbildung 18 a-f: IPC-298-Zellzykluskinetik nach IR-Bestrahlung; BrdU-
positive (18 a-c) und BrdU-negative (18 d-f) Zellen; G1-Phase (a, d); S-Phase
(b, e); G2-Phase (c, f); BrdU: 5-Bromodesoxyuridin.
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46
4. Diskussion
4.1 Funktion und Eigenschaften der Vitamine C und E auf die
Lichtsensibilität der Haut und auf UV-induzierte DNA-Schäden
4.1.1 Vitamin C
Vitamin C ist für die Primaten essentiell, da sie es aufgrund eines fehlenden Enzyms
nicht selbst synthetisieren können. Das Derivat L-Ascorbinsäure hat die beste
biologische Verfügbarkeit. Andere Derivate wie z.B. D-Ascorbinsäure oder L-
Isoascorbinsäure zeigen eine geringere Bioverfügbarkeit. Die Resorption erfolgt an
der Mund- und Darmschleimhaut mittels aktivem Transport und passiver Diffusion bei
höheren Konzentrationen. Die Resorptionsrate liegt bei Dosierungen von 1 g bei
etwa 50 % und sinkt auf 15 % bei 12 g (61). Bei Dosierungen stärker als die
Resorptionsrate wird der Rest unverändert renal ausgeschieden. Ascorbinsäure ist
hydrophil und somit nicht in lipophilen zellulären Strukturen zu finden. Im Ergebnisteil
dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass über eine erhöhte, tägliche orale Zufuhr
von 2000 mg/d L-Ascorbinsäure nach einem Monat ein signifikanter Anstieg im Blut
von 11,19 mg/l auf 16,84 mg/l erfolgt (p=0,007). Die Werte lagen damit stets im
Normbereich für L-Ascorbinsäure.
Zur Vermeidung einer Hypovitaminose (z.B. Scorbutprophylaxe) sind Gaben von 10
mg/d erforderlich. Für Vitamin C sind keine Hypervitaminosen bisher bekannt.
Nebenwirkungen von Vitamin C sogar bei Dosierungen von 10-20 g/d konnten nicht
gezeigt werden (12). Es kann lediglich bei sehr hohen Einzeldosen zu einem
osmotisch bedingten Durchfall kommen. Die Probanden in dieser Studie zeigten
keine Nebenwirkungen im Studienzeitraum von 3 Monaten.
4.1.2 Vitamin E
D-alpha-Tocopherol weist eine bessere Bioverfügbarkeit und Resorption (19, 70,
135) auf und führt somit zu höheren Konzentrationen in der Epidermis (47) als
andere Vitamin E-Derivate, wie z.B. β-Tocopherol oder γ-Tocopherol. Messungen
beim Menschen haben ergeben, dass nur 20-50% des mit der Nahrung
47
aufgenommenen Vitamin E resorbiert werden. In der Praxis geht man von einem
Wert bei 30% aus (37). Im Blut wird Vitamin E sowohl im Plasma als auch in den
zellulären Komponenten (22) transportiert und ist v.a. an die Lipoproteinfraktionen
gekoppelt (11, 87). Die Aufnahme in die Zellen des peripheren Gewebes ist eng mit
dem Lipoproteinkatabolismus verknüpft und erfolgt parallel zur Spaltung von
Triglyceriden durch Lipoproteinlipasen der Zelloberfläche (24).
Eine Erhöhung der D-alpha-Tocopherol-Zufuhr steigert die Blutspiegel wie im
Ergebnisteil dieser Arbeit gezeigt. Zu Beginn der Studie lag der D-alpha-Tocopherol-
Spiegel bei 15,94 mg/l und stieg signifikant nach einem Monat täglicher Gabe von
1000 IE/d auf 41,55 mg/l (p<0,001). In der Literatur haben ähnliche Analysen
ergeben, dass bei Personen, die über 21 Tage 400 IE, 800 IE bzw. 1600 IE all-rac-α-
Tocopherol einnahmen, die Plasmakonzentrationen von ca. 12,5 mg/l auf 21 mg/l, 26
mg/l bzw. 42 mg/l anstiegen (39). Tierexperimente an Ratten und Küken konnten
zeigen, dass auch die Gewebekonzentrationen an α-Tocopherol in unmittelbarer
Abhängigkeit zur Tocopherolaufnahme ansteigen (39).
Für Vitamin E werden orale Gaben bis 100 mg/d als physiologisch gewertet.
Dosierungen bis 200 mg/d zeigten bei langfristiger Applikation keine
Nebenwirkungen (72). In einer Analyse von Kappus et al. (71) wurde deutlich, dass
Vitamin E-Dosierungen bis 300 mg/d ohne Nebenwirkungen toleriert wurden und als
sicher zu betrachten sind. Die Probanden, die in der Studie zu dieser Arbeit
teilgenommen haben, berichteten ebenfalls über keine Nebenwirkungen im
Studienzeitraum von 3 Monaten.
Erst die langfristige Applikation von hohen Vitamin E-Dosierungen (>3000 IE/d) kann
Nebenwirkungen, insbesondere ein höheres Blutungsrisiko, hervorrufen. Vor allem
bei Personen, die Antikoagulantien einnehmen oder die an einer
Blutgerinnungsstörung durch Vitamin K-Mangel leiden, stellen solche Dosierungen
eine Kontraindikation dar (71, 88).
4.1.3 Synergismus zwischen Vitamin C und E
Für die Untersuchungen sowohl in vitro als auch in vivo wurde eine Kombination
beider Vitamine verwendet. Es gibt Hinweise für eine synergistische Wirkweise
beider Vitamine in der antioxidativen Protektion in biologischen Systemen. Diese
Interaktion von Vitamin C und E ist für die antioxidative Abwehr ein wesentlicher
48
Bestandteil. UV-aktivierte Moleküle können als Radikale zelluläre Strukturen
oxidieren und eine Kettenreaktion von Lipidperoxidation in Membranen induzieren.
Lipophiles membranständiges D-alpha-Tocopherol kann durch Reaktion mit freien
Radikalen, z.B. bei der Lipidperoxidation in Membranen durch UV-Strahlung, selbst
zum Tocopheroxyl-Radikal oxidiert werden (23, 43). Hierbei fungiert Vitamin E als
essentielles schützendes Antioxidans der Membran (19, 92). Der Synergismus mit
dem hydrophilen Vitamin C besteht darin, dass Vitamin C als Reduktionsmittel des
Vitamin E-Radikals fungieren kann, Vitamin E damit wieder regeneriert wird (97) und
erneut als Antioxidans zur Verfügung stehen kann (21, 59, 60, 93). Auch an
ungesättigten Fettsäuren in Mizellen (10) oder in Phosphatidylcholinliposomen (93)
konnte diese synergistische Reaktionsweise gezeigt werden.
Dieser antioxidative Wirksynergismus beider Vitamine und die damit verbundene
Reduktion von freien Radikalen vermindert schädigende Agentien auf zellulärer
Ebene. Dieses Funktionsprinzip stellt einen möglichen Ansatz dar, zusätzliche
protektive Methoden als Erweiterung der bisher bestehenden Schutzmöglichkeiten
(z.B. Sonnenschutzmilch) gegenüber UV-Strahlung zu entwickeln. Ein täglicher
Schutz vor UV-Strahlen und eine damit verbundene Reduktion von UV-Schäden gilt
als ein wesentlicher Faktor, der steigenden Inzidenz von UV-bedingten Hauttumoren
im Menschen vorzubeugen (85). Aus diesem Grund könnte die Kombinationstherapie
mit den antioxidativen Vitaminen C und E auch einen Schutz vor solchen Neoplasien
bedeuten. Eine zusätzliche orale Applikation zur Verstärkung des Eigenschutzes
gegenüber UV-Strahlung würde auch deshalb sinnvoll sein, da sowohl die UV-B- als
auch UV-A-Exposition eine Verringerung der beiden antioxidativen Vitamine C und E
in betroffenen Zellen und Geweben bewirken (126).
4.1.4 Allgemeiner Einfluss der Vitamine C und E auf UV-Strahleneffekte
In verschiedenen experimentellen Systemen konnte ein protektiver Effekt von
topischen Antioxidantien vor UV-bedingten Schäden demonstriert werden (105). In
Tierversuchen an Haut von Mäusen bzw. Kaninchen konnte die topische Applikation
von α-Tocopherol einen photoprotektiven Effekt (Schutz vor UV-induziertem
Erythem) erzeugen (113, 114, 133). Experimentell konnte α-Tocopherol außerdem
die Photoalterung der Haut vermindern (14, 69), Lipidperoxidationen (84) verhindern
und wie auch L-Ascorbinsäure die Immunsuppression senken, z.B. durch eine
49
Reduktion einer UV-induzierten Suppression der Kontakthypersensibilität der Haut
(53, 129, 144). Einige Autoren konnten im Tiermodell durch topische Behandlung mit
Vitamin E auch eine Reduzierung der Photokarzinogenese der Haut nach UV-
Strahlung feststellen (14, 17, 53, 144). Systemisch appliziertes Vitamin E konnte im
Hamstermodell die Entstehung eines Hauttumors inhibieren (121). Potapenko et al.
(109, 110) konnten nach topischer Vitamin E-Behandlung beim Menschen eine
Reduktion von UV-B- und PUVA-induzierten Erythemen nachweisen.
Die Anwendung von Ascorbinsäure auf Schweinehaut und menschlicher Haut konnte
vor phototoxischer Schädigung durch UV-A und UV-B schützen. Darr et al. 1992 (28)
konnten dies durch die Messung der Erytheme und durch die verringerte Bildung von
Sonnenbrandzellen nach topischer Applikation nachweisen.
Die Kombination von topischem Vitamin C und E zeigte in der Schweinehaut einen
Schutz vor Erythem, Entstehung von Sonnenbrandzellen (29) und
Thymindimerbildung (83), die einen Nachweis von Schäden am Genom der Zellen
anzeigen. Auch die Applikation von L-Ascorbinsäure oder D-α-Tocopherol allein
wirkte bereits protektiv, wobei die Kombination beider Vitamine effektiver wirksam
war und nur hierbei UV-Schäden auf DNA-Ebene (Thymindimere) reduziert werden
konnten (83).
Eine andere Studie hat gezeigt, dass D-α-Tocopherol und D-α-Tocopherol-Acetat
humane Keratinozyten vor UV-B-bedingten DNA-Schäden schützen kann (86). Die
systemische Applikation von Vitamin E konnte bei Mäusen die Erythembildung, die
Lipidperoxidation und die Bildung von Thymindimeren in der DNA (113) nach UV-A-
und UV-B-Strahlung senken. Vitamin C senkte, systemisch appliziert, die Inzidenz
und verzögerte die Ausbildung von malignen Hautveränderungen nach UV-A- und
UV-B-Strahlung (35). Eine andere Studie stellte allerdings die alleinige systemische
Gabe von Vitamin C in ihrer Effektivität in der Prävention bzw. Verminderung von
Sonnenbrandreaktionen in Frage (98). Auch die systemische Gabe von 400 IE D-
alpha-Tocopherol Acetat pro Tag ohne Vitamin C oder eines Selenium-Kupfer-
Vitamin-Komplexes (beinhaltet 40 mg D-alpha-Tocopherol/ Tag, aber kein Vitamin C)
konnte in menschlicher Haut die MED als Mass für die Lichtsensibilität im Sinne einer
Photoprotektion nicht signifikant beeinflussen (80, 138).
50
4.1.5 L-Ascorbinsäure und D-alpha-Tocopherol und ihr Einfluss auf die UV-
Strahleneffekte der Studienteilnehmer
Die 3-monatige tägliche orale Applikation von L-Ascorbinsäure (2000 mg/d) und D-
alpha-Tocopherol (1000 IE/d) in der doppelblind, Placebo-kontrollierten Studie führte
zu einer signifikanten Steigerung der Blutspiegel beider Antioxidantien im Vergleich
zur Placebogruppe. Eine weitere Steigerung war nicht nachweisbar. Die maximale
Blutspiegelsteigerung der beiden applizierten L-Ascorbinsäure- und D-alpha-
Tocopherol-Konzentrationen wurde somit wahrscheinlich innerhalb des ersten
Monats bzw. zum Ende des ersten Monats erreicht. Ab diesem Zeitpunkt könnte
somit von einem annähernd gleichwertigen Wirkspiegel ausgegangen werden.
Auch in der Gruppe zur Bestimmung der MED mit ausschließlicher Verumapplikation
zeigte sich ein signifikanter Anstieg der Antioxidantienspiegel. Der L-Ascorbinsäure-
Spiegel im Blut stieg signifikant von 11,63 mg/l nach 1 Monat auf 19,25 mg/l. Für D-
alpha-Tocopherol stieg der Blutspiegel signifikant im ersten Monat von 20,96 mg/l auf
36,03 mg/l. Im weiteren Verlauf blieben die AO-Spiegel auf diesem konstant höheren
Niveau des ersten Monats.
Einhergehend mit der erhöhten Blutvitaminkonzentration für L-Ascorbinsäure und D-
alpha-Tocopherol konnten wir die Sonnenbrandempfindlichkeit nach UV-B-Strahlung
der Probanden nach 3 Monaten senken. Untersuchungen von Eberlein-König et al.
(36) zeigten nach einer kurzzeitigen 8-tägigen Applikationsphase einen Anstieg des
Medians der MED für UV-B-Strahlung von 80 mJ/cm² auf 96,5 mJ/cm². Diese
Beobachtung wurde in ähnlicher Weise von Fuchs et al. und Mitarbeitern (45)
bestätigt, die aber eine höhere Vitamindosis von 3 g/d L-Ascorbinsäure und 2 g/d D-
α-Tocopherol eingesetzt haben und damit einen Anstieg der MED von 103 mJ/cm²
auf 183 mJ/cm² nach 50 Tagen messen konnten. Auch konnte in dieser Arbeit
gezeigt werden, dass die Einzelapplikation von L-Ascorbinsäure und D-alpha-
Tocopherol gegenüber der Kombination keinen MED-Anstieg bewirkt. Somit
unterstützt diese Beobachtung auch den synergistischen Effekt der beiden AO (45).
Durch die Verlängerung des Applikationszeitraums von L-Ascorbinsäure und D-
alpha-Tocopherol in dieser Studie auf 3 Monate konnte gegenüber der 8-tägigen
Studie (36) ein noch stärkerer Anstieg der MED von 80 mJ/cm² auf 113 mJ/cm²
erreicht werden. Dies zeigt eine noch bessere photoprotektive Wirkung der
längerfristigen Vitamineinnahme.
51
Betrachtet man die Untersuchungen dieser Arbeit und die von Eberlein-König et al.
(36), könnte man ableiten, dass die maximalen Blutspiegel und vermutlich auch die
Gewebespiegel (nicht bestimmt) dieser L-Ascorbinsäure- und D-alpha-Tocopherol-
Dosierung nicht nach 1 Woche sondern innerhalb des ersten Monats erreicht werden
und im weiteren Verlauf nach dem ersten Monat annähernd konstant bleiben. Eine
noch stärkere Steigerung der MED wäre somit nicht durch eine weitere Verlängerung
der Applikation sondern eventuell nur durch eine Erhöhung der täglichen
Applikationsdosis (mehr als 2 g L-Ascorbinsäure/d und 1000 IE D-alpha-
Tocopherol/d) zu errreichen. Diese würde eventuell noch höhere Blut- und
Gewebespiegel ermöglichen und Fuchs et al. (45) konnten diesen stärkeren Effekt
auf die MED nach höherer Vitamindosis nachweisen.
Die nachgewiesene Senkung der Sensibilität gegenüber Sonnenbrand zeugt von
einem protektiven Effekt der erhöhten Blutspiegel der L-Ascorbinsäure und des D-
alpha-Tocopherols. Die mögliche, erhöhte Vitaminkonzentration im Gewebe ist
hierbei für den Effekt sicherlich entscheidend wurde aber in dieser Arbeit nicht
einzeln gemessen. Insgesamt kommt es vermutlich durch die höhere L-
Ascorbinsäure- und D-alpha-Tocopherol-Einnahme zu einer physiologisch
wirkungsvollen Steigerung der antioxidativen Kapazität in der Haut, die eine
zusätzliche Photoprotektion vor UV-Strahlung erzeugen könnte.
4.1.6 L-Ascorbinsäure- und D-alpha-Tocopherol-Spiegel versus Veränderung
der minimalen Erythemdosis
Die Analyse der MED-Bestimmung zeigte bei 6 Probanden keine Veränderung in der
UV-Empfindlichkeit nach Vitaminapplikation. Bei vergleichender Betrachtung
zwischen Vitaminspiegel und MED-Veränderung hatten diese 6 Probanden jeweils
einen höheren Vitaminbasis-Spiegel bei Studienbeginn. Der L-Ascorbinsäure-Spiegel
am Tag 0 lag bei 14,23 mg/l für die 6 Probanden ohne MED-Änderung und bei 10,33
mg/l für die 12 Probanden mit MED-Veränderung nach 3 Monaten. Ebenso war der
D-alpha-Tocopherol-Ausgangswert bei den 6 Probanden mit 27,37 mg/l um 9,59 mg/l
höher als bei den 12 Probanden mit MED-Veränderung (17,78 mg/l). Parallel hierzu
lag auch der Median der MED zu Studienbeginn für die 6 Probanden mit 96,5 mJ/cm2
höher als bei den 12 Probanden mit 80 mJ/cm2. Diese Daten unterstützen den
beobachteten Einfluss der antioxidativen Vitamine in der Photoprotektion. Die Höhe
52
des AO-Spiegels scheint für das einzelne Individuum einen Einfluss auf seine
individuelle UV-Empfindlichkeit zu haben. Eine Aufsättigung durch orale Zufuhr kann
also die UV-Empfindlichkeit der Haut senken in Abhängigkeit vom individuellen
Ausgangswert der beiden Vitamine. Es ist aber nur ein begrenzter Schutz erreichbar,
der vermutlich nicht unbegrenzt weiter zu steigern ist.
4.1.7 DNA-Strahlenschäden und Messung der Zellzyklusproliferation
Die Reparatur UV-induzierter DNA-Schäden erfolgt überwiegend während der
Blockierung des Zellzyklus, welches der Zelle durch eine zeitliche Unterbrechung der
fortlaufenden Proliferation und Zellteilung die Überprüfung der DNA und Exzision von
defekten Elementen ermöglicht. Die erfolgreiche DNA-Reparatur, insbesondere
durch Exzision der entstandenen Photodimere, setzt eine Arretierung des Zellzyklus
und somit eine Unterbrechung der weiteren Proliferation voraus. Die Regulation des
Zellzyklus und somit der Proliferation erfolgt durch verschiedene Signalkaskaden und
Signalmoleküle. Zu nennen sind Proteinkinasen, Cycline, Tumorsuppressorgene, wie
p53, und Wachstumsfaktoren, wie TGFβ. Die Ataxia-Telangiectasia mutierten (ATM)
und Ataxia-Telangiectasia mutierten und Rad3-zugehörigen (ATR) Proteinkinasen,
die an der zellulären Antwort nach DNA-Schäden beteiligt sind, sind ein Teil der
Phosphatidyl Inositol 3-Kinase-artigen Familie der Serin/Threonin-Proteinkinasen
(PIKKs) (56). Die Aktivierung von ATM durch z.B. IR-Strahlung führt zur Aktivierung
der Zellzyklusblocks zwischen der G1- und S-Phase sowie zwischen der G2- und M-
Phase. ATR ist verantwortlich für die gleiche Zellzyklusblockaktivierung nach einem
UV-induzierten Schaden (56). Die Interaktion der Cyclin-abhängigen Kinasen (CDK),
Cycline, CDK-Inhibitoren, von ATM und ATR ist notwendig für die Regulation dieser
Zellzykluskontrollpunkte (sog. „Checkpoint“).
Zur Bestimmung der Proliferation nach Bestrahlung eignen sich Marker, wie z.B. das
Bromodeoxyuridin (BrdU). Die BrdU-Technik ist eine Methode zur Markierung von
DNA-replizierenden Zellen, um darüber Zellproliferation sowohl in vitro (55) und als
auch in vivo (122) zu bestimmen. Onuma et al. 2001 (95) ermittelten die BrdU-
Inkorporation in einer Hautorgankultur. BrdU ist ein Proliferationsmarker, der als
Analogon des Thymidins in der S-Phase des Zellzyklus eingebaut wird und die
53
Quantifizierung der S-Phase-Zellen erlaubt. Hierdurch ist eine Analyse der
Proliferationsaktivität von sich teilenden Zellen in der Epidermis nach Bestrahlung
möglich. BrdU ist allerdings auch ein potentielles Mutagen und wird daher in vitro
eingesetzt, damit die Gesundheit der Probanden nicht gefährdet wird. Experimente in
vitro an einer Zellkultur haben den Nachteil, Interaktionen und Signalwege, die durch
interzelluläre Verbände in zusammenhängenden Geweben bestehen (z.B. Zell-zu-
Zell Kontakte und parakrine Signalwege), auszublenden. In dieser Arbeit wurde eine
neuartige Methode verwendet, mit der eine Bestrahlung der Epidermis in vivo mit
einer BrdU-Markierung ex vivo kombiniert wurde. Die Methode ermöglicht die genaue
Bestimmung der Zellproliferationskapazität mittels Markierung von S-Phase-Zellen in
der Epidermis nach UV-B-Bestrahlung vor und nach Einnahme von AO, ohne die
Probanden der Gefahr einer Mutagenität bei systemischer Applikation von BrdU
auszusetzen.
4.1.8 Epidermale Proliferation nach UV-B-Bestrahlung
Die Probenentnahme erfolgte vor bzw. 24 h nach Bestrahlung aus unbestrahlter und
bestrahlter Haut. Es wurden die Proliferation und die Zellzyklusantwort auf UV-B-
Bestrahlung in den Biopsien analysiert, die makroskopisch einen ähnlichen Grad der
biologischen Strahlenantwort im MED-Ergebnis aufwiesen. Zusätzlich könnten
Variationen in der Epidermisdicke (vor allem des Stratum corneum) an
unterschiedlichen Körperregionen sowie Pigmentierungsunterschiede bei der
Entnahme von unterschiedlichen Regionen für nicht zu vernachlässigende
Unterschiede zwischen einzelnen Individuen sorgen. Deshalb wurden in dieser
Studie die Biopsien immer vom wenig pigmentierten unteren Rücken und aus dem
Bereich der zweifachen MED entnommen, um etwaige Variationen der
Epidermisbeschaffenheit auf die Strahlenantwort als Fehlerquelle zu reduzieren.
Diese wichtige Tatsache wurde in anderen Studien zum Teil vernachlässigt, in denen
eine unterschiedliche Strahlendosis für Hautproben unterschiedlicher Spender
definiert wurden (99).
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten eine reduzierte Zahl von BrdU-markierten Zellen
und somit eine verringerte epidermale Proliferation nach UV-B-Bestrahlung im
Vergleich mit den unbestrahlten Kontrollbiopsien. Bisherige Ergebnisse anderer
Arbeitsgruppen aus in-vitro- (64, 96) und ex-vivo- (99) Modellen zeigten ebenfalls
54
einen Rückgang der Zellproliferation nach UV-B-Bestrahlung. Pavey et al. (99)
berichtete von einer ähnlichen Verminderung der BrdU-Inkorporation 24 h nach UV-
B-Bestrahlung. Jedoch beobachtete diese Arbeitsgruppe einen Anstieg der BrdU-
Aufnahme während der ersten 24 h nach UV-B-Bestrahlung. Aufgrund der langen
Inkubationszeit von BrdU über 24 h ist es möglich, dass sowohl bei der einsetzenden
DNA-Reparatur nach dem UV-B-Strahlenschaden als auch bei der weiteren DNA-
Neusynthese BrdU eingebaut wurde und somit zu fälschlich hohen Werten führte.
4.1.9 Einfluss der L-Ascorbinsäure und des D-alpha-Tocopherols auf die
epidermale Proliferation nach UV-B-Bestrahlung
Ausgehend von dem protektiven Effekt der AO auf die UV-Lichtsensibilität der
Epidermis nach UV-B-Strahlung ergibt sich die Überlegung, dass eine Applikation
von L-Ascorbinsäure und D-alpha-Tocopherol auch vor UV-induzierten zellulären
Schäden der DNA schützen könnte, die z.B. die Zellproliferation beeinflussen.
In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die UV-induzierte Hemmung der epidermalen
Proliferation nach UV-B-Einwirkung in der menschlichen Haut durch die dreimonatige
Einnahme von L-Ascorbinsäure und D-alpha-Tocopherol signifikant verstärkt werden
konnte (5 Zellen/mm vs. 4 Zellen/mm, p=0,03). Die AO verstärkten scheinbar die
Inhibition der epidermalen Proliferation im Vergleich zu den unbehandelten Biopsien.
Die Tatsache der Verstärkung des Zellzyklusblocks unter AO-Einfluss war
unerwartet. Aufgrund des protektiven Einfluss der AO vor freien, UV-induzierten
Radikalen war ursprünglich eine weniger starke Inhibition der epidermalen
Zellproliferation bei UV- und AO-behandelten Individuen vermutet worden.
Die reduzierte Proliferationsrate könnte ein direkter Effekt des D-alpha-Tocopherols
sein, da auch andere Gruppen eine Verminderung der Zellproliferation unter Vitamin
E zeigen konnten. Dieser Mechanismus wird hauptsächlich über die Inhibition der
Proteinkinase C vermittelt (131).
Die durch AO verstärkte Zellzyklusblockade könnte mit der UV-bedingten
Beeinflussung von anderen Signalkaskaden, die nicht direkt eine Zellzyklusblockade
auslösen, erklärt werden. UV-Strahlung kann MAP-Kinasekaskaden aktivieren, was
vor allem durch die Induktion von ROS geschieht. MAP-Kinase-Aktivierung führt
schlussendlich zur Transkription und Induktion des Proto-Onkogens c-fos. C-fos
scheint für den Wiedereintritt in den Zellzyklus nach einer Blockade notwendig zu
55
sein (123). Eine Reduktion der ROS-Spiegel durch die AO könnte somit eine
verringerte Aktivierung der MAP-Kinase bedeuten. Die Konsequenz hiervon wäre
eine geringere Induktion von c-fos, wodurch der Wiedereintritt in den Zellzyklus bzw.
die weitere Proliferation verzögert wird. Dies könnte der Zelle mehr Zeit für eine
effektivere DNA-Reparatur geben. Das Risiko für die Replikation von Mutationen
könnte somit reduziert sein, da die Zelle genügend Zeit zur Reparatur hat. Die Gefahr
einer malignen Entartung der Zelle wäre vermindert.
Unsere Arbeitsgruppe (108) konnte zusätzlich zur Verlängerung der
Zellzyklusblockade zeigen, dass die Applikation von L-Ascorbinsäure und D-alpha-
Tocopherol über 3 Monate auch zu einer Reduktion des DNA-Schadens 24 h nach
UV-Bestrahlung führt. Der photoprotektive Effekt der AO auf direkte DNA-Schäden
nach UV-B wurde durch die Verringerung der Thymin-Dimere in der Epidermis nach
Bestrahlung und Einfluss der AO gezeigt.
Die Reduktion der Thymindimere, der Erythemreaktion sowie die Verringerung der
epidermalen Zellproliferation nach UV-Bestrahlung als Folge der kombinierten Gabe
von L-Ascorbinsäure und D-α-Tocopherol zeigen den protektiven Nutzen dieser AO
zur Verhinderung von UV-Schäden an der Haut. Die Anwesenheit der AO während
und nach der Bestrahlung ist von entscheidender Bedeutung für die protektive
Kapazität. Schäden entstehen auch unter AO-Einfluss, allerdings kann die Zelle bei
Anwesenheit von ausreichend AO während und nach dem Strahlenschaden
anscheinend besser die Schäden reduzieren.
4.2 Einfluss der Bestrahlung mit UV-A-, UV-B- und mit ionisierender
Strahlung auf die Proliferationskinetik der IPC-298-Zellen
4.2.1 Einfluss von UV-A-, UV-B- und ionisierender Strahlung auf den Zellzyklus
In der Literatur wird beschrieben, dass unterschiedliche Strahlenarten
Zellzykluseffekte in jeder Phase des Zellzyklus auslösen können. UV-A-Strahlung
kann z.B. einen G1-Block im Zellzyklus auslösen (75). UV-A-Strahlung induziert
desweiteren eine Reduktion der S-Phasen-Progression (9, 30) und ein G2-Block
wurde beschrieben (9). UV-B kann einen G1-Block (1, 15, 102, 137) sowie eine
Verlangsamung der S-Phasen-Progression (9, 30, 102, 137) induzieren. Ein
56
Zellzyklusblock in der G2-Phase wurde ebenso nach UV-B-Strahlung festgestellt (6,
137). IR aktiviert Zellzyklusblockaden in der G1-Phase (4). Die Progression durch die
S-Phase wird durch IR nur selten beeinflusst und nur sehr hohe Dosierungen
konnten eine Verlangsamung in der S-Phase auslösen (68, 90). Auch in der G2-
Phase kann es zu Zellzyklusblockaden nach ionisierender Strahlung kommen (76).
Ein Netzwerk an Signalkaskaden mit Sensoren und Mediatoren kontrolliert die
zelluläre Strahlenantwort (115). Die Proteinkinasen ATM und ATR sind zentrale
Komponenten des den DNA-Schaden erfassenden Netzwerks. ATM und ATR
fungieren als Schlüsselmoleküle, mit deren Hilfe das Signal eines DNA-Schadens in
zelluläre Handlungsmechanismen der Zelle übersetzt werden kann (56).
ATM und ATR stehen als auslösende Instanz am Beginn der Kette, durch die
nachgelagerte Effekte wie z.B. die Induktion von Zellzyklusblockaden initiiert werden
(56). Eine selektive Spezifität als Antwort auf verschiedene genotoxische Agentien,
wie z.B. Strahlung, scheinen ATM und ATR zu haben (63).
UV-A, UV-B oder IR können verschiedene Arten von DNA-Schäden auslösen. Zum
einen zählen zu den unterschiedlichen Schadensmechanismen mehrheitlich über
UV-A- oder IR- induzierte und über Radikale sowie reaktive Sauerstoffspezies
vermittelte indirekte Schäden der DNA. Zum anderen gibt es v.a. durch UV-B-
induzierte direkte Schäden der DNA, wie Thymin-Dimere mit nachfolgenden
Strangbrüchen, die eine Exzisionsreparatur erforderlich machen (81). Eine
Konsequenz hieraus könnte sein, dass durch unterschiedliche Schäden auch
unterschiedliche Signalkaskaden via ATM und bzw. oder ATR und somit
unterschiedliche Zellzykluseffekte induziert werden.
4.2.2 Einfluss von UV-A-, UV-B- und ionisierender Strahlung auf die IPC-298-
Zellen
Für die Experimente in dieser Arbeit wurde die Melanomzelllinie (IPC-298)
verwendet. Die IPC-298 Zellen sind p53 defizient (106). Das Tumorsuppressorgen
p53 ist notwendig für die Initialisierung von Zellzyklusblockaden. Der Mangel oder die
Mutation an p53 bedeutet, dass diese Zellen nur einen defekten bzw. keinen G1-
Block am Übergang zur S-Phase aktivieren können (40).
Die in vitro-Ergebnisse zeigten, dass die in der G1-Phase mit UV-A bestrahlten IPC-
298-Zellen keinen G1-Block am Übergang zur S-Phase ausbilden konnten, jedoch
57
effektiv beim Übertritt von der G2- zur M-Phase blockiert wurden. Auffällig war, dass
trotz p53-Mangel die IPC-298 Melanomzellen einen G1-Block nach UV-B-Bestrahlung
zeigten. IR induzierte ähnlich wie UV-A ebenfalls einen G2-Block, aber weder einen
Block in der G1-Phase noch eine Verlangsamung der Progression in der S-Phase.
Diese Daten der Zellzykluskinetik nach unterschiedlicher Bestrahlung wurden alle mit
der Zelllinie IPC-298 ermittelt. Dadurch können unterschiedliche Effekte in der
zellulären Strahlenantwort nicht durch eine unterschiedliche Zellcharakteristik
verschiedener Zelllinien, wie oft in der Literatur zu finden, bedingt sein.
DNA-Schäden ausgelöst durch UV-A- oder ionisierende Strahlung aktivieren die
ATM-Proteinkinase, die abhängig ist von einem funktionierendem p53-Protein (56).
Durch den p53-Mangel der IPC-298 Zellen kann dieser Zelltyp keinen G1/S-Phasen-
Kontrollpunkt des Zellzyklus nach Bestrahlung mit UV-A oder IR ausbilden.
Auf der anderen Seite scheint UV-B-Strahlung die ATR-Proteinkinase zu aktivieren.
Über diese Signalkaskade wird nach einem Schaden auch ohne das Vorhandensein
von p53 ein G1-Block eingeleitet. Hieraus kann man auch ableiten, dass UV-A-
induzierte Schäden nicht zu einer ATR Aktivierung wie bei UV-B führen können.
Weitere Studien sind notwendig, um die Strahlenantwort anderer Zelltypen,
insbesondere von humanen, nicht malignen Zellen zu untersuchen, damit ein
breiteres Verständnis für die Tumorgenese an der Haut nach UV- oder IR-Strahlung
entwickelt werden kann.
4.3 Schlussfolgerung
Die Studien konnten einen photoprotektiven Effekt einer langfristigen, oralen
Einnahme von L-Ascorbinsäure und D-alpha-Tocopherol durch die Reduktion der
Erythemreaktion für die Probanden zeigen. Zudem konnte mittels eines neuartigen
Ansatzes durch Kombination von Bestrahlung in vivo und BrdU-Markierung ex vivo
gezeigt werden, dass UV-B-Bestrahlung der menschlichen Haut in vivo die
epidermale Zellproliferation inhibiert. Erstaunlicherweise spiegelte sich der
photoprotektive Effekt der AO auf die Sonnenbrandreaktion nicht in einer geringeren
Inhibition des epidermalen Wachstums (Proliferation) wieder. Stattdessen war die
UV-B-induzierte Proliferationsverzögerung nach der AO-Einnahme deutlich verstärkt.
Durch Initiierung oder Verlängerung eines Zellzyklusblocks nach Bestrahlung und
durch eine Verringerung der Zellproliferation in menschlicher Haut besteht für die
58
einzelne Zelle die Möglichkeit, Strahlen-induzierte Schäden der Zelle und DNA
effektiver und über ein längeres Zeitintervall zu reparieren bzw., falls erforderlich, die
Apoptose der Zelle einzuleiten.
In vitro konnte gezeigt werden, dass unterschiedliche Wellenlängen unterschiedliche
Effekte im Zellzyklus der p53-defizienten IPC-298-Melanomzellen auslösen können.
UV-A und IR zeigen ähnliche Wirkungen auf die Zellzykluskinetik und führen zu
einem Block in der G2-Phase, jedoch können beide Strahlenarten bei p53-defizienten
IPC-298-Zellen keinen G1-Block induzieren. UV-B hingegen ist trotz p53-Defizienz in
der Lage einen G1-Block zu induzieren. Hieraus kann man ableiten, dass
unterschiedliche Strahlenarten unterschiedliche Zellzyklusreaktionen in der Zelle
auslösen können. In der Literatur wurde gezeigt, dass UV-B sich zur Aktivierung des
G1-Blocks vermutlich der ATR-Signalkaskade bedient, die unabhängig von p53 ist.
Dies steht im Gegensatz zu UV-A und IR, die die p53-abhängige ATM-Signalkaskade
zu aktivieren scheinen (56). Die Initiierung eines Blocks ohne die Anwesenheit von
p53 kann für die Zelle, trotz Mutation, die Möglichkeit zur Reparatur von weiteren
Schäden bedeuten.
Die konsequente Anwendung von Schutzmassnahmen gegenüber der ultravioletten
Strahlenbelastung wird empfohlen, um ein weiteres Ansteigen der Inzidenz von
Strahlen-induzierten malignen Tumoren der menschlichen Haut zu verhindern (85,
130). Folglich könnte der photoprotektive Effekt der Kombinationstherapie mit L-
Ascorbinsäure und D-alpha-Tocopherol einen Schutz vor der Entstehung von
Neoplasien darstellen.
Es sind weitere Studien erforderlich, um neben der möglichen photoprotektiven
Wirkung von AO gegenüber Radikalen und reaktiven Sauerstoffspezies auch den
möglichen protektiven Charakter durch effektivere DNA-Reparaturen nach UV-A-,
UV-B- und IR-Strahlung zu bestätigen. Ergebnisse von Lin et al. (82) belegen, dass
eine Erweiterung der Kombination von Vitamin C und E um Ferulic Acid
(Pflanzenantioxidans) zur Stabilisierung der AO-Lösung einen nahezu doppelt so
starken photoprotektiven Effekt vor Erythembildung und Thymindimerentstehung hat
und somit eine sinnvolle Strategie darstellen kann. Zusammenfassend ist die orale
Applikation von AO ein einfacher, viel versprechender und sicherer Ansatz, um
Strahlen-induzierte Effekte in der Haut mit ihren langfristigen Konsequenzen, wie z.B.
Tumorgenese, zu reduzieren bzw. zu vermeiden.
59
5. Zusammenfassung
Die Sonnenstrahlung setzt sich u.a. zusammen aus UV-A, UV-B und sichtbarem
Licht. UV-Strahlung wird in der Haut absorbiert und führt zu vielfältigen Effekten auf
molekularer Ebene. Eine gravierende Konsequenz einer übermäßigen UV-Exposition
für den Menschen ist die Ausbildung von Hauttumoren. Daher ist es notwendig,
einfache, additive und effektive Schutzmassnahmen zu untersuchen. Zu den
Eigenschutzsystemen der Haut gehören Antioxidantien (AO), wie z.B. die
synergistisch wirkenden Verbindungen L-Ascorbinsäure und D-alpha-Tocopherol.
Ihre Konzentration in der Haut wird durch UV-Strahlung verringert. In dieser Arbeit
sollten die Auswirkungen einer systemischen Applikation dieser beiden AO als
Strategie zum Schutz vor UV-Schäden in der Haut untersucht werden.
In einer doppelblinden, placebo-kontrollierten Studie mit 62 Probanden wurden
während der 3-monatigen Einnahme von täglich 2 g L-Ascorbinsäure und 1000 IE D-
alpha-Tocopherol (n=33) oder Placebo (n=29) die Blutspiegel dieser AO bestimmt.
Nach einem Monat war der Mittelwert des L-Ascorbinsäure-Blutspiegel von
11,19 mg/l auf 16,84 mg/l (p<0,001) angestiegen, derjenige von D-alpha-Tocopherol
von 15,94 mg/l auf 41,55 mg/l (p<0,001). L-Ascorbinsäure und D-alpha-Tocopherol-
Blutspiegel blieben über die gesamten 3 Monate gegenüber den Ausgangswerten
signifikant erhöht. Nach 3 Monaten wurde ein L-Ascorbinsäure-Blutspiegel von
14,64 mg/l (p=0,007) und ein D-alpha-Tocopherol-Blutspiegel von 38,18 mg/l
(p<0,001) gemessen. In der Placebogruppe blieben die L-Ascorbinsäure- und D-
alpha-Tocopherol-Blutspiegel nahezu unverändert.
Bei weiteren 18 Probanden wurde die UV-B-Empfindlichkeit vor und nach der 3-
monatigen, täglichen Einnahme von 2 g L-Ascorbinsäure und 1000 IE D-alpha-
Tocopherol anhand der minimalen Erythemdosis (MED) untersucht. Auch in dieser
Gruppe (n=18) zeigten die Mittelwerte der AO-Blutspiegel im Vergleich zu den
Ausgangswerten nach 1 Monat und nach 3 Monaten einen Anstieg (L-Ascorbinsäure-
Basiswert: 11,63 mg/l, 1. Monat: 19,25 mg/l, 3. Monat: 18,15 mg/l, gegenüber
Basiswert jeweils p<0,001; D-alpha-Tocopherol-Basiswert: 20,96 mg/l, 1. Monat:
36,03 mg/l, 3. Monat: 38,84 mg/l, gegenüber Basiswert jeweils p<0,001).
60
Nach 3 Monaten AO-Applikation war der Median der MED von 80 mJ/cm2
auf 113 mJ/cm2 (p= 0,002) angestiegen. Bei 17 dieser Probanden wurden vor und
am Ende der AO-Applikation jeweils aus unbestrahlter und mit der 2-fachen MED
bestrahlter Haut (nach 24 ± 2 h) Biopsien zur Proliferationsanalyse epidermaler
Zellen gewonnen. Die Biopsien wurden nach der Entnahme mit dem
Proliferationsmarker BrdU inkubiert, der in der S-Phase des Zellzyklus als Thymidin-
Analogon in die DNA eingebaut wird. Der immunhistochemische Nachweis erfolgte
mittels BrdU-Antikörperfärbung. Die UV-B-Bestrahlung führte zu einer Hemmung der
epidermalen Proliferation vor AO-Einnahme (unbestrahlt: 7,8 markierte Zellen/mm
Hautoberfläche; bestrahlt: 5,0 markierte Zellen/mm Hautoberfläche; Medianwerte,
p=0,02). Die 3-monatige AO-Applikation verstärkte diesen UV-Effekt (unbestrahlt: 8,0
markierte Zellen/mm Hautoberfläche; bestrahlt: 4,0 markierte Zellen/mm
Hautoberfläche; Medianwerte, p<0,001).
Sowohl UV- als auch IR-Strahlen können Zellzyklusblockaden in der G1-, S- und der
G2-Phase induzieren. Für die Initialisierung von Zellzyklusblockaden u.a. am Ende
der G1- Phase ist die Anwesenheit des Tumorsuppressorgens p53 notwendig. Die
Effekte unterschiedlicher Strahlenarten auf die Zellzyklusphasen wurden an p53-
defizienten IPC-298-Melanomzellen mittels BrdU-Markierung nach UV-A- (10 J/cm2),
UV-B- (40 mJ/cm2) oder ionisierender Strahlung (IR 7,5 Gy) analysiert.
- UV-A-Bestrahlung erzeugte keinen G1-Phasen-Block. Jedoch wurde die
Progression UV-A-bestrahlter Zellen nach 12 h in der S-Phase verzögert und
UV-A-Bestrahlung von Zellen in der G2-Phase erzeugte nach 6 h einen G2-
Phasen-Block.
- 12 h nach UV-B-Bestrahlung war ein G1-Phasen-Block der IPC-298-
Melanomzellen zu messen. UV-B-bestrahlte Zellen zeigten in der S-Phase
eine Progressions-verzögerung und einen G2-Phasen-Block nach 6 h.
- IR-Bestrahlung induzierte keinen G1-Phasen-Block und keine Verzögerung in
der S-Phase. Hingegen erzeugte IR-Bestrahlung während der G2-Phase nach
6 h einen G2-Phasen-Block.
Trotz p53-Mangels führte UV-B im Gegensatz zu UV-A und IR zu einem G1-Block.
Der UV-B-induzierte G1-Block wurde offensichtlich durch einen p53-unabhängigen
Signalweg ausgelöst. Dieser Signalweg scheint durch UV-A bzw. IR nicht aktiviert zu
werden. Ebenso können UV-A und UV-B im Gegensatz zu IR eine Verzögerung der
61
S-Phase induzieren. Ein G2-Phasen-Block wurde nach Bestrahlung mit allen 3
Strahlenarten gemessen. Damit induzierten unterschiedliche Strahlenarten
unterschiedliche Zellzyklusreaktionen der IPC-298-Zellen.
Die Ergebnisse zeigen, dass durch systemische Gabe von AO die MED ansteigt und
eine Verringerung der epidermalen Proliferation nach UV-Bestrahlung eintritt. In vitro
konnten Proliferationshemmungen im Zellzyklus der IPC-298-Zellen durch UV-A-,
UV-B- oder IR-Strahlung ausgelöst werden, die offensichtlich abhängig von der
Strahlenart durch unterschiedliche Signalkaskaden aktiviert werden. Diese vielfältige
Aktivierung von Zellzyklusblockaden gibt der Zelle vermutlich Zeit zur Reparatur von
Strahlenschäden.
62
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7. Anhang
L-Ascorbinsäure D-alpha-Tocopherol
Verum Monat 0 Monat 1 Monat 2 Monat 3 Monat 0 Monat 1 Monat 2 Monat 3
MM2 10,15 29,43 29,13 14,39 4,59 23,07 29,22 29,02
MM3 15,96 31,25 17,83 16,08 11,7 26,36 30,69 28,61
MM5 13,84 20,91 16,9 19,63 10,48 44,64 23,86 29,26
MM7 10 13,9 14,98 12,58 17,92 37,76 40,04 38,42
MM8 12,79 31,94 30,25 24,8 11,16 48,83 45,26 34,58
MM11 9,54 10,87 13,05 14,01 25,49 97,44 64,28 46,34
MM13 11,9 19,55 32,8 21,1 17,03 54,25 63,83 60,44
BK1 14,11 9,36 10,97 11,77 11,38 28,42 27,35 34
BK2 14,54 14,74 15,98 11,9 11,94 25,28 21,71 20,39
BK3 9,85 9,69 21,87 18,99 16,73 27,45 34,88 27,99
BK5 6,57 15,45 28,17 13,27 9,39 30,96 27,26 40,7
BK7 5,93 14,61 21,53 27,91 13,4 26,91 29,43 35,24
BK9 9,19 27,87 21,39 16,4 9,63 28,08 31,16 28,58
BK10 10,18 14,29 14,51 14,59 14,13 21,89 24,05 19,65
BK15 6,59 24,29 19,43 17,08 10,9 43,41 53 44,57
BK17 8,2 16,41 13,57 6,77 48,53 91,15 92,49 96
BK18 9,12 13,35 10,67 13,1 26,91 91,28 45,64 55,28
SK4 13,16 16,11 14,77 12,02 23,3 85,8 88,79 52,79
SK6 4,57 7,92 11,18 11,27 11,85 21,02 23,17 31,76
SK7 10,62 13,32 8,17 11,64 20,52 88,59 41,48 81,48
SK9 7,07 10,87 11,72 11,23 13,42 39,32 76,07 62,8
SK10 9,59 24,35 14,45 17,06 30,36 80,93 50,79 48,29
SK11 11,27 20,46 32,49 6,52 22,51 51,99 55,09 48,93
KP1 4,77 17,71 12,97 12,47 10,78 19,34 40,28 16,94
KP4 14,27 13,37 12,14 6,96 10,15 22,54 18,55 26,16
KP5 15,8 10,05 19,46 13,89 7,79 14,43 15,72 15,46
KP6 15,96 8,84 11,95 12,11 12,13 19,31 11,25 13,62
KP8 14,93 12,46 10,25 14,4 10,53 10,57 13,95 12,69
KP12 11,4 27,36 14,25 13,84 20,97 45,48 34,14 36,85
KP13 9,07 12,58 16,73 30,16 19,24 54,79 31,77 62,97
KP15 12,32 10,48 11,73 9,69 7,63 12,57 19,04 15,49
KP16 23,88 21,41 21,63 17,84 20,28 31 34,31 45,56
KP19 12,08 10,47 9,54 7,74 13,39 26,45 36,44 18,95
M 11,18848 16,83848 17,16545 14,64273 15,94424 41,55485 38,63606 38,17606
SA 3,920823 6,953482 6,851199 5,499568 8,447915 25,66166 20,25061 19,58037
a. Individuelle L-Ascorbinsäure- und D-alpha-Tocopherol-Blutspiegelwerte jeweils in mg/l der Probanden der Verumgruppe am jeweiligen Messzeitpunkt (Monat 0 bis Monat 3) und Berechnung des Mittelwertes und der Standardabweichung. BK, Basalzellkarzinom; KP, Kontrollpersonen; M, Mittelwert; MM, malignes Melanom; SA, Standardabweichung; SK, spinozelluläres Karzinom.
76
L-Ascorbinsäure D-alpha-Tocopherol
Placebo Monat 0 Monat 1 Monat 2 Monat 3 Monat 0 Monat 1 Monat 2 Monat 3
MM1 5,48 3,04 5,95 4,59 14,05 19,43 16,1 15,84
MM4 17,53 14,29 25,21 17,45 10,27 14,11 14,49 14,03
MM6 15,2 11,68 16,45 7,91 11,96 10,81 13,42 13,78
MM9 9,8 13,71 14,73 13,21 22,22 20,45 23,21 17,32
MM10 10,89 11,98 9,36 13,51 19,45 24,63 18,12 23,25
MM12 9,49 13,32 13,29 11,46 19,8 18,43 17,57 17,5
BK4 6 6,16 4,77 6,13 9,18 10,39 8,64 11,91
BKC6 11,94 11,77 14,82 9,55 15,87 11,3 9,59 12,52
BK8 10,83 9,28 10,6 8,32 12,98 13,09 10,44 9,74
BK11 13,77 12,94 11,99 11,54 11,34 9,61 16,58 12,43
BK12 8,25 8,43 8,81 10,83 10,02 10,07 13,9 7,91
BK13 11,13 7,35 12,22 12,82 15,54 15,91 18,49 25,99
BK14 5,93 12,83 7,99 7,55 12,62 17,5 24,51 19,09
BK16 12,04 20 16,9 18,22 20,3 15,58 14,7 8,38
BK20 14,78 12,77 16,09 7,78 23,27 23,45 29,95 22
SK1 7,61 11,08 16,75 11,13 31,26 22,86 26,29 23,44
SK2 8,89 11,14 12,39 9,25 48,66 35,48 33,28 41,65
SK5 9,1 9,98 6,73 3,99 27,89 37,19 34,49 41,23
SK8 9,04 9,3 5,76 9,79 16,14 19,16 18,33 26,62
KP2 5,06 11,09 8,16 6,58 7,78 7,29 9,15 8,16
KP3 5,33 11,33 9,35 10,76 10,77 8,31 11,96 8,3
KP7 5,79 10,74 8,21 11,88 8,28 8,62 8,63 10,52
KP9 9,37 5,42 8,09 7,65 14,96 12,39 13,68 13,75
KP10 10,42 18,03 12,72 17,33 10,43 12,97 10,69 12,53
KP11 10,25 11,77 7,93 7,27 11,62 10,88 10,61 11,13
KP14 9,53 12,25 12,01 14,14 11,2 13,79 10,88 14,53
KP17 11,76 15,72 13,4 11,06 8,44 6,4 9,14 10,64
KP18 7,17 4,43 9,68 5,73 11,98 10,83 11,73 10,1
KP20 8,1 8,01 9,25 11,85 13,6 12,6 12,12 11,88
M 9,671724 11,02897 11,36586 10,32 15,9269 15,63897 16,23069 16,41966
SA 3,121948 3,721067 4,380948 3,678479 8,5832 7,543678 7,345361 8,75624
b. Individuelle L-Ascorbinsäure- und D-alpha-Tocopherol-Blutspiegelwerte jeweils in mg/l der Probanden der Placebogruppe am jeweiligen Messzeitpunkt (Monat 0 bis Monat 3) und Berechnung des Mittelwertes und der Standardabweichung. BK, Basalzellkarzinom; KP, Kontrollpersonen; M, Mittelwert; MM, malignes Melanom; SA, Standardabweichung; SK, spinozelluläres Karzinom.
77
L-Ascorbinsäure D-alpha-Tocopherol
Verum Monat 0 Monat 1 Monat 2 Monat 3 Monat 0 Monat 1 Monat 2 Monat 3
MM21 14,55 14,92 7,17 9,64 13,3 28,52 22,28 17,5
MM22 15,14 26,13 26,8 24,59 55,7 45,27 42,81 69,99
MM23 10,09 21,08 21,09 19,28 10,18 21,21 26,6 20,6
MM24 11,28 15,33 16,4 15,16 42,8 18,19 13,21 20,13
MM25 13,45 32,58 35,64 33,89 12,64 18,78 27,37 18,49
BK21 10,64 11,38 19,37 14,1 13,26 31,08 35,49 30,28
BK23 14,29 17,69 17,57 13,97 20,1 40,74 35,34 27,61
BK24 12,86 20,22 21,45 18,9 30,94 58,12 39,57 75,37
BK25 5,25 18,97 14,02 23,65 12,59 25,27 36,88 47,11
BK26 13,82 32,76 36,53 23,09 18,28 42,98 40,38 35,54
SK21 7,53 8,29 9,84 6,85 24,41 49,13 76,28 36,49
SK22 3,57 9,12 20,47 13,33 13,17 39,53 54,67 69,78
SK23 7,7 22,73 25,82 21,45 18,94 38,89 42,5 40,17
SK24 7,88 10,01 11,67 16,48 23,38 71,61 87,38 42,72
KP21 11,74 25,56 13 22,21 13,83 35,88 32,94 27,63
KP22 13,45 14,43 12,49 7,45 29 36,53 32,22 48,34
KP23 25,59 26,78 19,39 21,48 14,55 17,69 36,8 33,34
KP24 10,46 18,58 13,8 21,22 10,26 29,13 29 37,95
M 11,62722 19,25333 19,02889 18,15222 20,96278 36,03056 39,54 38,83556
SA 4,805499 7,478683 8,120262 6,760778 12,17135 14,38583 17,90688 17,76033
c. Individuelle L-Ascorbinsäure- und D-alpha-Tocopherol-Blutspiegelwerte jeweils in mg/l der Probanden der MED Messungen am jeweiligen Messzeitpunkt (Monat 0 bis Monat 3) und Berechnung des Mittelwertes und der Standardabweichung. BK, Basalzellkarzinom; KP, Kontrollpersonen; M, Mittelwert; MM, malignes Melanom; SA, Standardabweichung; SK, spinozelluläres Karzinom.
78
MED-Veränderung
Probanden Monat 0 Monat 3
MM21 57 80
MM22 113 113
MM23 57 113
MM24 113 113
MM25 80 113
BK21 80 160
BK23 80 80
BK24 80 113
BK25 80 80
BK26 113 113
SK21 80 113
SK22 80 113
SK23 80 113
SK24 113 160
KP21 80 113
KP22 113 125
KP23 80 80
KP24 80 113
Median 80 113
d. Bestimmung der MED in mJ/cm² am jeweiligen Messzeitpunkt (Monat 0 und Monat 3) und Berechnung des Medians. BK, Basalzellkarzinom; KP, Kontrollpersonen; MM, malignes Melanom; SK, spinozelluläres Karzinom.
79
Anzahl der gefärbten Zellen pro mm
Probanden unbestrahlt bestrahlt unbestrahlt nach 3 Monaten AS/AT
bestrahlt nach 3 Monaten AS/AT
MM22 1,4 1,7 9,7 2,7
MM23 5,9 4,8 7,2 2,9
MM24 13,3 6,9 8,4 4,0
MM25 10,0 8,0 8,0 4,6
BK21 11,4 9,8 10,4 4,2
BK23 0,8 1,0 10,0 4,8
BK24 4,6 1,3 4,9 1,3
BK25 12,0 2,5 7,0 5,1
BK26 9,8 15,4 14,6 6,2
SK21 7,8 10,0 10,4 5,5
SK22 14,2 7,0 7,6 8,4
SK23 6,7 5,0 8,5 2,2
SK24 5,5 4,8 6,9 2,3
KP21 11,8 10,5 10,9 4,3
KP22 7,2 2,4 5,1 0,8
KP23 2,0 1,5 7,3 3,6
KP24 15,2 7,0 3,0 1,2
Median 7,8 5,0 8,0 4,0
e. Bestimmung der epidermalen Zellproliferation in den unbestrahlten und bestrahlten Gewebsschnitten vor und nach 3 Monaten L-Ascorbinsäure (AS)- und D-alpha-Tocopherol (AT)-Applikation. Messwerte als Anzahl der gefärbeten Zellen pro mm Hautoberfläche und Berechnung des Medians. BK, Basalzellkarzinom; KP, Kontrollpersonen; MM, malignes Melanom; SK, spinozelluläres Karzinom.
80
UV
-A
G
1-P
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siti
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-Ph
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tiv
G2
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tiv
G1
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iv
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neg
ativ
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2-P
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ativ
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10
0%
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M
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100%
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A
M
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10
0%
SA
00
0 0
0 0
41,6
0,
9 10
0 2,
16
11,5
1,
9 10
0 16
,5
31,7
4,
4 10
0 13
,9
4,1
0,2
100
4,88
11
,5
1,2
100
10,4
6
14,3
6,
72
14,3
6,
72
19,5
1,
8 46
,9
4,33
26
,4
4,8
230
41,7
36
,8
4,2
116
13,2
5,
3 1,
1 12
9 26
,8
5,2
2 45
,2
17,4
12
36
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36
7,
27
4,9
1 11
,8
2,4
18,9
1,
7 16
4 14
,8
23,7
0,
2 74
,8
0,63
15
,8
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385
12,2
7,
6 2
66,1
17
,4
24
21,8
2 3,
1 21
,82
3,1
18,6
0,
2 44
,7
0,48
12
,4
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108
6,96
27
,9
0,3
88
0,95
9,
4 3
229
73,2
13
,1
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114
6,96
100
0 0
0 0
38,6
2,
5 10
0 6,
48
8,8
0,7
100
7,95
36
,4
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100
11,8
4,
6 0,
1 10
0 2,
17
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0,
9 10
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38
6
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1,
05
4,74
1,
05
29,5
0,
8 76
,4
2,07
15
,4
1,7
175
19,3
35
,6
0,9
97,8
2,
47
5,8
0,2
126
4,35
9,
1 0,
9 74
,6
7,38
12
9,37
9,
32
9,37
9,
32
19,9
4,
4 51
,6
11,4
25
,8
3,8
293
43,2
25
,1
0,6
69
1,65
17
,7
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385
6,52
7,
9 0,
8 64
,8
6,56
24
12,5
4 4,
46
12,5
4 4,
46
11
0,1
28,5
0,
26
19,1
3
217
34,1
21
3
57,7
8,
24
13,3
0,
9 28
9 19
,6
23,8
4,
8 19
5 39
,3
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0 13
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5 0,
1 10
0 1,
05
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0 12
,9
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100
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9,
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9 10
0 9,
28
6
14,3
6,
72
14,3
6,
72
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2,
4 43
,9
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21
,5
4,5
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34
,8
2,9
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6,
7 0,
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3 12
,2
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0,4
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4,
12
12
36
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36
7,
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189
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23
,2
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12
,3
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0,
9 42
0 22
8
1,5
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15
,5
24
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2 3,
1 21
,82
3,1
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1,
1 36
2,
55
9,6
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101
8,42
24
,4
4,3
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12
,9
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9 73
,2
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0,
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0 0
0 0
40,1
2,
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34
,8
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,2
6
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,9
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,6
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,2
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,4
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4,
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,6
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20
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,4
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,1
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6 22
7,
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14,3
9 2,
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12,4
2,
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,9
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21
,3
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224
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,2
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,8
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0 19
,1
6
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1,4
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,5
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,1
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32
,1
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0,5
174
21,7
2
0,5
14,7
3,
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12
35,6
4
35,6
4
13,1
5,
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,8
13,2
13
,3
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,8
25,8
10
,3
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19,8
18
,6
1,9
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7,
2 2,
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,9
21,3
24
19,3
4,
1 19
,3
4,1
18,4
3,
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,8
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,2
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130
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25
,1
6,4
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25
,4
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17
,6
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0 46
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,7
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,7
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4 1,
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13
,3
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5,
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11
,6
15,1
3,
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,2
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24
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4,
5 17
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16
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8. Danksagung
Herrn Prof. Dr. med. Dr. hc. mult. G. Plewig sowie Herrn Prof. Dr. med. Dr. hc. T.
Ruzicka danke ich für die Arbeitsmöglichkeiten in der Klinik und Poliklinik für
Dermatologie und Allergologie der Ludwig-Maximilians-Universität München und
Herrn Dr. V. Meineke für die Übereignung der IPC-298-Kulturen.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. med. B. Przybilla für die Überlassung des
Dissertationsthemas und Hilfestellung bei ihrer Konzeption und Dokumentation.
Während der ganzen Zeit hat er durch seine spontane Bereitschaft, neue Ideen mit
Ratschlägen und Anregungen zu unterstützen, ganz wesentlich zum Fortschritt der
Experimente beigetragen.
Des weiteren möchte ich mich ganz besonders bei Frau Priv. Doz. Dr. med. M.
Placzek bedanken, die meine Arbeit in der gesamten Zeit gewissenhaft betreut, mich
jederzeit unterstützt und mir mit wissenschaftlichem Rat und zahlreichen wertvollen
Anregungen zur Seite gestanden hat.
Auch Herrn Dr. K.-P. Gilbertz vom Institut für Radiobiologie der Sanitätsakademie der
Bundeswehr in München möchte ich meinen Dank für die tatkräftige
wissenschaftliche Unterstützung und Anregung aussprechen.
Herrn Prof. Dr. med. Dr. rer. nat. Ekkehard Haen an der Klinik und Poliklinik für
Psychiatrie im Bezirksklinikum Regensburg gilt mein Dank für die Kooperation bei der
HPLC-Analytik der Antioxidantien.
Auch gilt mein Dank Frau Dr. med. S. Gaube für die weiterführende und ergänzende
Mitarbeit an den Projekten und Frau Stefanie Müller für die unentbehrliche, vielfältige
Unterstützung und Hilfe sowie für die wichtigen Hinweise im photobiologischen
Labor.
Gefördert wurde die Arbeit durch den Bayerischen Forschungsverbund BayFORUV -
Erhöhte UV-Strahlung in Bayern Folgen und Maßnahmen. Ich bedanke mich bei den
zuständigen Stellen und Behörden, die es ermöglichen, solche kliniknahe
Grundlagenforschung zu unterstützen.
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