Aus der Zentrumsabteilung für Lebensmitteltoxikologie der ... · RP Umkehrphase (reversed-phase) RSA relative Standardabweichung SDB Styroldivinylbenzolphase t Tonne Tab. Tabelle

Aus der

Zentrumsabteilung für Lebensmitteltoxikologie

der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Entwicklung und Einsatz neuer rückstandsanalytischer Nachweisverfahren

für Antibiotika und Antiparasitika in Umwelt- und Lebensmittelproben

Habilitationsschrift zur Erlangung der

Venia legendi

für das Fachgebiet Lebensmitteltoxikologie

an der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Dr. rer. nat. Gerd Hamscher

aus Idar-Oberstein

Hannover 2003

Nicht öffentliche wissenschaftliche Aussprache: 25.05.2004

Inhaltsverzeichnis 3

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis 5

Liste der Publikationen, die Bestandteil der Habilitationsschrift sind 7

1 Einleitung und Problemstellung 9

1.1 Einsatz von Human- und Tierarzneimitteln 10

1.2 Eintrag von Tierarzneimitteln in die Umwelt 11

1.3 Neue Eintragswege für Tierarzneimittel und antiparasitär wirksameSubstanzen in die Umwelt 13

2 Forschungsbedarf 14

3 Zusammenfassung der Ergebnisse 16

3.1 Entwicklung und Einsatz neuer rückstandsanalytischer Nachweisverfahrenfür Antibiotika in Umwelt- und Lebensmittelproben 16

3.1.1 HPLC-ESI-MS-MS-Verfahren für Tetracycline und Tylosin in Gülle, Boden,Sicker- und Grundwasser und Untersuchungen von Feldproben 16

3.1.2 Weiterentwicklung der Probenahme für Wasserproben und räumliche undzeitliche Ausdehnung der Felduntersuchungen 20

3.1.3 Kopplung HPLC/mikrobiologischer Assay und ESI-MS-MS zum Nachweisvon Tetracyclinen in Umweltmatrices und Hühnereiern 23

3.1.4 HPLC-ESI-MS-MS-Verfahren für Sulfonamide in Gülle, Boden, Sicker-und Grundwasser und Untersuchungen von Feldproben 25

3.1.5 HPLC-ESI-MS-MS-Verfahren zum Nachweis von Tetracyclinen, Tylosin,Sulfonamiden und Chloramphenicol in Stallstaub und Untersuchungen vonFeldproben 27

3.2 Entwicklung und Einsatz neuer rückstandsanalytischer Nachweisverfahrenfür Antiparasitika in Lebensmittel- und Umweltproben 28

3.2.1 HPLC-DAD-Verfahren zum Nachweis des Carbamates Propoxur inHühnereiern, Luft- und Staubproben 28

3.2.2 HPLC-DAD-Verfahren zum Nachweis des ThiophosphorsäureestersPhoxim in Hühnereiern 30

3.2.3 HPLC-DAD-Verfahren zum Nachweis des Pyrethroides Deltamethrinin Hühnereiern 33

Inhaltsverzeichnis 4

4 Zusammenfassende Diskussion der Ergebnisse 34

4.1 Eintrag von Tierarzneimitteln in die Umwelt 34

4.1.1 Eintrag von Tierarzneimitteln in die Gülle 34

4.1.2 Eintrag von Tierarzneimitteln in den Boden 36

4.1.3 Eintrag von Tierarzneimitteln in das Sicker- und Grundwasser 39

4.1.4 Eintrag von Tierarzneimitteln in den Stallstaub 41

4.1.5 Mögliche Risiken durch den Eintrag von Tierarzneimitteln in die Umwelt 41

4.2 Problematik der Bekämpfung der Roten Vogelmilbe (Dermanyssus gallinae)in der Legehennenhaltung 43

5 Zusammenfassung 45

6 Summary 46

7 Literaturverzeichnis 47

8 Darstellung des eigenen Anteils an den wissenschaftlichen Arbeiten 52

9 Ausführliche Darstellung der Ergebnisse (Publikationen 1–8) 55


Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung

ACN Acetonitril

BDF(s) Boden-Dauerbeobachtungsfläche(n)

BLAC Bund-/Länderausschuß Chemikaliensicherheit

°C Grad Celcius

ca. circa

C18 Octadecyl-Rest

cm Zentimeter

CTC Chlortetracyclin

DAD Diodenarray-Detektion

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EMEA European Agency for the Evaluation of Medicinal Products

ESI Elektrospray-Ionisation

EU Europäische Union

EWG Europäische Wirtschaftsgemeinschaft

FEDESA European Federation of Animal Health

g Gramm

GÜN Gewässerüberwachungsnetz Niedersachsen

HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (high performance liquid

chromatography)

HPLC-DAD Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gekoppelt mit

Diodenarray-Detektion

HPLC-MS-MS Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gekoppelt mit

Tandemmassenspektrometrie

HPLC-MS Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gekoppelt mit

Massenspektrometrie

kg Kilogramm

L Liter

λ Wellenlänge

m Meter

M Molar

m/z Masse/Ladungs-Verhältnis


m3 Kubikmeter

mg Milligramm

µg Mikrogramm

min Minute

mL Milliliter

µL Mikroliter

mM Millimolar

MRL maximum residue limit

MS Massenspektrometrie

MS-MS Tandemmassenspektrometrie

[M+H]+ protoniertes Molekülion

n Anzahl

N Stickstoff

ng Nanogramm

nm Nanometer

OTC Oxytetracyclin

PEC erwartete Umweltkonzentration (predicted environmental

concentration)

pH negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionen-Aktivität

RP Umkehrphase (reversed-phase)

RSA relative Standardabweichung

SDB Styroldivinylbenzolphase

t Tonne

Tab. Tabelle

TC Tetracyclin

UBA Umweltbundesamt

UMK Umweltministerkonferenz

UV Ultraviolett

vol Volumen


Liste der Publikationen, die Bestandteil der Habilitationsschrift sind

Publikation 1:

Hamscher G, Sczesny S, Abu-Qare A, Höper H, Nau H (2000):

Stoffe mit pharmakologischer Wirkung einschließlich hormonell aktiver Substanzen in der

Umwelt: Erster Nachweis von Tetracyclinen in güllegedüngten Böden.

Deutsche Tierärztliche Wochenschrift 107, 332–334.

Publikation 2:

Hamscher G, Sczesny S, Höper H, Nau H (2002):

Determination of persistent tetracycline residues in soil fertilized with liquid manure by high-

performance liquid chromatography with electrospray ionization tandem mass spectrometry.

Analytical Chemistry 74, 1509–1518.

Publikation 3:

Hamscher G, Pawelzick HT, Höper H (2003):

Abschlussbericht des UBA-Forschungsprojektes „Tierarzneimittelanalysen gemäß BLAC-

Untersuchungsprogramm“ (FKZ 201 91 217).

Eingereicht: Umweltbundesamt (Juni 2003)

Publikation 4:

Höper H, Kues J, Nau H, Hamscher G (2002):

Eintrag und Verbleib von Tierarzneimittelwirkstoffen in Böden.

Bodenschutz 7, 141–148.

Publikation 5:

Hamscher G, Pawelzick HT, Höper H, Nau H (2003):

Different behavior of tetracyclines and sulfonamides in sandy soils after repeated fertilization

with liquid manure.

Eingereicht: Environmental Toxicology and Chemistry (September 2003)


Publikation 6:

Sczesny S, Nau H, Hamscher G (2003):

Residue Analysis of tetracyclines and their metabolites in eggs and in the environment by

HPLC coupled with a microbiological assay and tandem mass spectrometry.

Journal of Agricultural and Food Chemistry 51, 697–703.

Publikation 7:

Hamscher G, Pawelzick HT, Sczesny S, Nau H, Hartung J (2003):

Antibiotics in dust originating from a pig fattening farm: a new source of health hazard for

farmers?

Environmental Health Perspectives 111, 1590–1594.

Publikation 8:

Hamscher G, Prieß B, Hartung J, Nogossek MI, Glünder G, Nau H (2003):

Determination of propoxur residues in eggs with HPLC-DAD after treatment of stocked

housing facilities for the poultry red mite (Dermanyssus gallinae).

Analytica Chimica Acta 483, 19–26.


1 Einleitung und Problemstellung

Die Gesunderhaltung von Tieren sowie die Produktion hochwertiger tierischer Lebensmittel

in der heutigen Quantität wäre ohne den gezielten Einsatz von Tierarzneimitteln nicht zu

gewährleisten. Die rechtlichen Anforderungen an Tierarzneimittel sind hoch. Seit 1978

müssen Tierarzneimittel, die neu auf den Markt kommen sollen, einem aufwändigen Zulas-

sungsverfahren unterworfen werden. Einerseits müssen die Qualität des pharmazeutischen

Erzeugnisses, die Wirksamkeit sowie die Unbedenklichkeit vom Hersteller nachgewiesen

werden. Andererseits muss bei Tierarzneimitteln, die bei lebensmittelliefernden Tieren einge-

setzt werden sollen, der Schutz des Verbrauchers vor gesundheitlich bedenklichen Rückstän-

den dieser Stoffe im Lebensmittel gewährleistet sein. Werden diese Anforderungen nicht

erfüllt, so wird einer Zulassung nicht statt gegeben (Kietzmann 2003).

Darüber hinaus müssen Arzneimittel auch hohe Anforderungen an die Stabilität im Organis-

mus, an die Resorbierbarkeit und vor allem hinsichtlich ihrer Wirksamkeit erfüllen. Aufgrund

dieser Eigenschaften ist es jedoch auch möglich, dass Arzneimittel nach einer mehr oder

wenigen starken Metabolisierung im Organismus ausgeschieden werden und in die Umwelt

gelangen können. Mögliche Folgen sind:

� Die chemische Stabilität eines Arzneimittels im Organismus kann dann zur Persistenz in

der Umwelt führen.

� Die mehr oder weniger gute Wasserlöslichkeit von Arzneimitteln oder deren Metaboliten

bedingt eine gewisse Mobilität in der aquatischen Umwelt.

� Die erwünschte Wirkung eines Arzneimittels (z. B. an einem Rezeptor) kann zu toxischen

Wirkungen an dafür nicht vorgesehenen Zielorten von Organismen in der Umwelt führen.

Obwohl Arzneimittel schon seit Jahrzehnten in großen Mengen in der Human- und Veteri-

närmedizin eingesetzt werden, war bis Anfang der 90er Jahre nur sehr wenig bekannt über

Vorkommen, Verteilung und Verhalten dieser Stoffe in der Umwelt. In der Zwischenzeit sind

insbesondere für den Bereich der Humanarzneimittel viele Arbeiten erschienen, die dazu bei-

getragen haben, diese Wissenslücken zu schließen. Es konnte gezeigt werden, dass diese

Substanzen insbesondere über den Weg Abwasser-Kläranlage-Oberflächengewässer in das

Grundwasser und auch in das Trinkwasser gelangen können. Relevante Substanzgruppen sind

Antibiotika (z. B. Erythromycin, Sulfamethoxazol), Antiphlogistika (z. B. Diclofenac, Ibupro-


fen, Naproxen), Arzneistoffe mit hormonellen Wirkungen, Lipidsenker (z. B. Clofibrinsäure,

Bezafibrat), Psychopharmaka und Zytostatika. Die ermittelten Konzentrationen (unterer µg/L

bis ng/L-Bereich) liegen in der Regel deutlich unterhalb der pharmakologisch wirksamen

Dosis dieser Substanzen. Allerdings können ökotoxikologische Wirkungen, insbesondere bei

synthetischen Hormonen, nicht ausgeschlossen werden (umfassende Übersichten geben

Daughton und Ternes 1998, Heberer 2002, Kümmerer 2001, Sattelberger 1999).

Im Bereich der Tierarzneimittel sind bis heute nur wenige Arbeiten durchgeführt worden,

allerdings ist auch hier die Umweltrelevanz dieser Substanzen erkannt worden. Diskutiert

werden in diesem Zusammenhang neben rein toxischen Wirkungen auch die Induktion bzw.

Verbreitung von Antibiotikaresistenzen und ein möglicher Einfluß auf die Zusammensetzung

von mikrobiologischen Lebensgemeinschaften im Boden (Halling-Sørensen et al. 1998).

Erkenntnisse – insbesondere über den Eintrag und das Verhalten der mengenmäßig bedeu-

tendsten Tierarzneimittel in der Umwelt – können nur gewonnen werden, wenn die Entwick-

lung neuer selektiver und sensitiver spurenanalytischer Nachweisverfahren für diese Substan-

zen vorangetrieben wird.

1.1 Einsatz von Human- und Tierarzneimitteln

Arzneimittel zählen zu den Stoffen, die in beträchtlichen Mengen hergestellt und demzufolge

auch in bedeutendem Maße in der Human- und Veterinärmedizin eingesetzt werden. Von der

Europäischen Förderation für Tiergesundheit (FEDESA) liegen Zahlen für den Antibiotika-

Einsatz in der Tierhaltung und der Humanmedizin für die Jahre 1997 und 1999 für die EU-

Mitgliedsstaaten und die Schweiz vor (siehe Tabelle 1). Im Jahr 1999 kamen in der Tier-

haltung 4.700 t Antibiotika-Wirkstoffe zum Einsatz, davon wurden ca. 3.900 t als Tierarznei-

mittel und ca. 800 t als Futterzusatzstoffe (Leistungsförderer) verwendet. Der Verbrauch an

Antibiotika in der Humanmedizin war 1999 mit 8.500 t knapp doppelt so hoch (Anony-

mus 2001).

Nach Angaben der FEDESA für 1997 machte die Wirkstoffgruppe der Tetracycline bei den

Tierarzneimitteln mit 2.294 t fast zwei Drittel der eingesetzten antimikrobiell wirksamen

Substanzen aus, es folgen Makrolid-Antibiotika (424 t), �-Laktame (322 t) und Aminoglyko-

side (154 t). Erhebungen in Deutschland (basierend auf Herstellungsaufträgen für Fütterungs-

arzneimittel) über den Einsatz von Tierarzneimitteln in der Region Weser-Ems, Brandenburg

und Schleswig-Holstein zeigen ähnliche Verbrauchsmuster, allerdings werden hier als zweit-


häufigste Gruppe Sulfonamide genannt (Broll et al. 2002, Kratz et al. 2001, Winckler und

Grafe 2000). Diese Zahlen werden auch durch eine vergleichbare Erhebung aus Kenia bestä-

tigt: hier wurden im Mittel der Jahre 1995–1999 insbesondere Tetracycline (54,7%) und

Sulfonamide (21,3%) eingesetzt (Mitema et al. 2001). Der weltweite Einsatz vor allem dieser

beiden Substanzklassen läßt sich nahezu ausschließlich mit den sehr günstigen Preisen dieser

Mittel erklären. Der therapeutische Nutzen ist aufgrund der ausgeprägten Resistenzen gegen-

über Tetracyclinen und Sulfonamiden umstritten, oftmals wird nur noch bei höherer Dosie-

rung eine Wirkung erzielt (Löscher et al. 1999).

Tab. 1: Antibiotika-Einsatz in der EU in den Jahren 1997 und 1999 (FEDESA).

Einsatzgebiet 1997 1999 Veränderung1997–1999

t % t % %

Tierarzneimittel 3.494 27,4 3.902 29,5 + 11,7

Antibiotische Futter-mittelzusatzstoffe(Leistungsförderer)

1.599 12,5 786 5,9 - 50,8

Humanarzneimittel 7.659 60,1 8.528 64,6 + 11,3

Gesamt 12.752 100,0 13.216 100,0 + 3,6

1.2 Eintrag von Tierarzneimitteln in die Umwelt

Es ist aus verschiedenen Untersuchungen bekannt, dass Tetracycline und Sulfonamide nach

Applikation teilweise metabolisiert und innerhalb von 7–10 Tagen nahezu vollständig ausge-

schieden werden und so in die Exkremente gelangen können (Berger et al. 1986, Kroker et

al. 1983, Langhammer et al. 1989, Winckler und Grafe 2000). Sulfonamide liegen zu ca. 50%

als ihre N4-Acetyl-Derivate vor, die aber in der Gülle während des Lagerungsprozesses durch

Mikroorganismen gespalten werden können und so den originären Wirkstoff wieder freisetzen

(Langhammer 1989). Tetracycline hingegen werden zum größten Teil unmetabolisiert ausge-

schieden (Winckler und Grafe 2001).

Im Gegensatz zu Humanarzneimitteln, bei denen der Eintrag in die Umwelt wie bereits

erwähnt hauptsächlich über Kläranlagenabflüsse in die Oberflächengewässer erfolgt, ist für


Tierarzneimittel der Eintragsweg über die Gülle in den Boden und dann möglicherweise mit

dem Sickerwasser in das Grundwasser von höchster Relevanz (siehe Abbildung 1).

Exposition Deposition Effekte

ArzneimittelAquakultur

Arzneimittel zur Behandlung von Tierbeständen

Arzneimittel als Leistungsförderer

oder Kokzidio-statika

Lokale Kläranlagen von

Fischfarmen

Exkremente auf landwirtschaft-

lichen Nutzflächen

Gülletank

Grundwasser

Ausbringen von Gülle

oder Klärschlamm

Oberflächen-gewässer

Grundwasser

Effekte auf Bodenlebe-

wesen

Effekte aufWasserlebe-

wesen

Auswaschung

Mensch, Tier ??

Abb. 1: Mögliche Eintragspfade für Tierarzneimittel in die Umwelt (modifiziert nach Jørgen-sen und Halling-Sørensen 2000).

Legt man die von Winckler und Grafe (2000) erhobenen Verbrauchsmengen zugrunde, so

wäre bei einem gleichmäßigen Eintrag von Tetracyclinen in die landwirtschaftliche Nutz-

fläche der Region Weser-Ems mit Konzentrationen von ca. 5 µg/kg Tetracyclin und 9 µg/kg

Chlortetracyclin im Bereich der Ackerkrume (0–30 cm) zu rechnen. Berechnungen dieser

Autoren basierend u. a. auf einer praxisüblichen Behandlung eines Mastschweinebestandes

mit einem tetracyclinhaltigen Fütterungsarzneimittel und anschließender Lagerung der Gülle

über einen Zeitraum von 180 Tagen ergaben, dass nach Gülleausbringung eine lokale

Tetracyclinkonzentration in den ersten 5 cm des Bodens von bis zu 166 µg/kg zu erwarten ist.


1.3 Neue Eintragswege für Tierarzneimittel und antiparasitär wirksame Substanzen

in die Umwelt

Die in Abbildung 1 dargestellten möglichen Eintragswege für Tierarzneimittel stellen in

quantitativer Hinsicht gesehen die bedeutendsten dar und stehen daher auch im Mittelpunkt

des gegenwärtigen Forschungsinteresses.

Im Rahmen der landwirtschaftlichen Produktion entstehen insbesondere in der Schweine- und

Geflügelmast nicht nur enorme Mengen an Gülle bzw. Geflügelmist. In der Regel fallen auch

hohe Mengen an Stäuben an (Hartung et al. 1997 und 1998, Pederson et al. 2000), die über

die Ablufteinrichtungen der Ställe in die Umwelt gelangen können (Hartung et al. 1995,

Seedorf und Hartung 2002).

Stäube aus der landwirtschaftlichen Produktion sind seit vielen Jahren bekannt als eine Quelle

zahlreicher unerwünschter Stoffe wie z. B. Mykotoxine, Endotoxine, Viren, und Milben-

bestandteile (Hartung 1997) und werden daher als gesundheitliches Risiko eingestuft (Iversen

et al. 2000, Nowak 1998, Platz et al. 1995, Radon et al. 2002). Inwieweit dieser Eintragsweg

auch für Tierarzneimittel und antiparasitär wirksame Stoffe von Relevanz ist, wurde bislang

nicht untersucht.

Die Rote Vogelmilbe (Dermanyssus gallinae) ist derzeit der wirtschaftlich wichtigste Ekto-

parasit in der Legehennenhaltung in vielen europäischen Ländern (Chauve 1998) einschließ-

lich Deutschland (Iburg et al. 1998). Es wird intensiv nach Wirkstoffen gesucht, die einerseits

die direkte Bekämpfung des Parasiten im belegten Stall ermöglichen und andererseits keine

bzw. toxikologisch unbedenkliche Rückstände im Hühnerei verursachen. Ein wesentliches

Problem in der Bekämpfung besteht darin, dass die Parasiten nach einer Blutmahlzeit in ihre

Verstecke zurückkehren (Nordenfors et al. 2001). Daher besteht eine wesentliche Strategie

der Bekämpfung darin, die Verstecke der Milben gezielt zu besprühen. Diese Art der

Behandlung beinhaltet zwei mögliche Risiken: einerseits eine Exposition der Tiere und somit

eine Kontamination der hieraus gewonnenen Lebensmittel, andererseits einen Eintrag in die

Umwelt. Dies könnte – nach Entwicklung geeigneter Analyseverfahren – durch die Unter-

suchung von Eiern, Luft- und Staubproben vor und nach der Behandlung im belegten Stall

untersucht werden.


2 Forschungsbedarf

Aus dem in den Kapiteln 1.1–1.3 dargelegten Schrifttum ließen sich daher folgende Ansätze

für eigene Forschungsarbeiten ableiten:

� Es fehlte an geeigneten analytischen Verfahren zur Bestimmung von Tierarzneimitteln in

den unterschiedlichsten Umweltmatrices. Unter Berücksichtigung der Erhebungen zum

Einsatz von Tierarzneimitteln in der Region Weser-Ems (Winckler und Grafe 2000) war

die Entwicklung spurenanalytischer Nachweisverfahren – insbesondere für die mengen-

mäßig bedeutendsten Substanzklassen der Tetracycline und Sulfonamide – in Gülle,

Boden, Sicker- und Grundwasser als Grundlage für eine Expositionserfassung prioritär

durchzuführen.

� Die Frage, ob neben den Muttersubstanzen auch antimikrobiell aktive Metabolite existie-

ren war für eine umfassendere Expositionsabschätzung von hoher Relevanz. Hierzu

musste neben den physikalisch-chemischen Analysenverfahren auch ein funktioneller

Assay entwickelt werden, der einen wirkungsbezogenen Nachweis dieser Substanzen z. B.

nach Extraktion und chromatographischer Auftrennung ermöglichte.

� Mittels dieser neuen Nachweisverfahren mussten die Eintragspfade Gülle, Boden, Sicker-

und Grundwasser systematisch untersucht und die wichtigsten Tierarzneimittel quantifi-

ziert werden. Die Durchführung von kontrollierten Felduntersuchungen in Regionen mit

intensiver Tierhaltung zur Beurteilung der räumlichen Verteilung und dem Verhalten von

Tierarzneimitteln waren hierfür besonders geeignet. Eine weitere wesentliche Grundlage

der durchzuführenden Arbeiten stellte das Erfassen verfügbarer und repräsentativer

Standorte dar. Im Rahmen des Niedersächsischen Programmes zur Boden-Dauerbe-

obachtung (Kleefisch und Kues 1997) konnten solche Flächen beispielsweise in der

Region Weser-Ems beprobt werden. Boden-Dauerbeobachtungsflächen stellen eine ideale

Forschungsplattform dar, um den Eintrag, das Verhalten und gegebenenfalls auch die

Effekte von Tierarzneimitteln auf Böden zu untersuchen.


� Auch für die Bestätigung positiver Rückstandsbefunde von Tetracyclinen in Lebensmit-

teln stehen in der Regel nur sehr aufwändige Probenvorbereitungsverfahren zur Verfü-

gung. Hier war es sinnvoll zu prüfen, ob sich die für die Umweltanalytik etablierten

Verfahren auch für die Lebensmittelanalytik einsetzen lassen.

� Erste Untersuchungen von Langhammer et al. (1989) zeigten, dass auch hohe Sulfonamid-

einträge über die Gülle im Boden schon nach kurzer Zeit nur Rückstände im Bereich

weniger µg/kg Boden hinterließen. Ein möglicher Eintrag von Sulfonamiden in das

Grundwasser wurde von dieser Gruppe daher nicht untersucht, da auch keine hinreichend

empfindlichen Methoden für die Grundwasseranalytik zur Verfügung standen. Diesem

Umweltkompartiment sollte in neuen Untersuchungen mit sensitiven Analysenverfahren

besonderes Interesse gelten.

� Darüber hinaus schien auch die Untersuchung bislang nicht berücksichtigter Eintragspfade

wie z. B. Stäube aus der Tierhaltung sinnvoll. Allerdings war auch hier eine wesentliche

Grundvoraussetzung die Bereitstellung entsprechender Untersuchungsverfahren für die

Matrix Staub. Eine weitere wichtige Voraussetzung war die Bereitstellung adäquaten

Probenmaterials. Hier bestand die Möglichkeit, in den Jahren 1981–2000 gesammelte

Staubproben retrospektiv auf verschiedene Antibiotika hin zu untersuchen.

� Der Einsatz des Biozids Propoxur in der Bekämpfung der Roten Vogelmilbe kann einer-

seits Rückstände in Lebensmitteln und andererseits in der Umwelt hinterlassen. Bislang

lagen keine systematischen Untersuchungen zu dieser Problematik vor. Daher war es

sinnvoll, spurenanalytische Nachweisverfahren für Propoxur in Hühnereiern und in

verschiedenen Umweltmatrices aufzubauen. Mittels kontrollierter Studien konnten

darüber hinaus auch der Einfluss unterschiedlicher Haltungsformen für Legehennen auf

das Rückstandsverhalten von Propoxur untersucht werden.

� Organische Phosphorsäureester und Pyrethroide stellen ebenfalls Substanzklassen dar, die

zur Bekämpfung der Roten Vogelmilbe prinzipiell eingesetzt werden könnten. Für zwei

geeignete Vertreter dieser Substanzklassen, Phoxim und Deltamethrin, war es sinnvoll zu

prüfen, ob sich das für Propoxur etablierte Verfahren gegebenenfalls auch für den spuren-

analytischen Nachweis dieser beiden Substanzen einsetzen ließ.


3 Zusammenfassung der Ergebnisse

3.1 Entwicklung und Einsatz neuer rückstandsanalytischer Nachweisverfahren für

Antibiotika in Umwelt- und Lebensmittelproben

3.1.1 HPLC-ESI-MS-MS-Verfahren für Tetracycline und Tylosin in Gülle, Boden,

Sicker- und Grundwasser und Untersuchungen von Feldproben

(siehe Publikation 1: Stoffe mit pharmakologischer Wirkung einschließlich hormonell aktiver

Substanzen in der Umwelt: Erster Nachweis von Tetracyclinen in güllegedüngten Böden und

Publikation 2: Determination of persistent tetracycline residues in soil fertilized with liquid

manure by high-performance liquid chromatography with electrospray ionization tandem

mass spectrometry)

Ein wesentliches Ergebnis der vorliegenden Arbeit stellt die Entwicklung eines HPLC-ESI-

MS-MS-Verfahrens zum Nachweis von Tetracyclinen in verschiedenen Umweltmatrices wie

Gülle, Boden, Sicker- und Grundwasser dar (Publikationen 1 und 2). Gülle, Boden und

Sickerwasser stellen sehr anspruchsvolle Probenmatrices dar, für die es bislang zum Nach-

weis von Antibiotika keine spurenanalytischen Verfahren mit den hier erreichten Nachweis-

grenzen gab.

Als Methode der Wahl empfahl sich nach adäquater Probenvorbereitung der Einsatz der

Hochleistungsflüssigkeitschronmatographie gekoppelt mit der Tandem-Massenspektrometrie

(HPLC-MS-MS). Da hierdurch ein sensitives und durch den Einsatz der Tandem-Massen-

spektrometrie auch ein hochselektives Detektionssystem zur Verfügung stand, konnten relativ

einfache aber effektive Extraktionsverfahren für Gülle, Boden, Sicker- und Grundwasser ent-

wickelt und eingesetzt werden.

Tetracycline stellen analytisch schwer erfassbare Substanzen dar. Dies ist einerseits bedingt

durch ihre Fähigkeit mit mehrfach geladenen Kationen wie Calcium, Magnesium, Aluminium

und Eisen Chelate zu bilden. Andererseits wurde auch die Wechselwirkung mit Silanolgrup-

pen, beispielsweise an Glasoberflächen oder an chromatographischen Trennsäulen, beschrie-

ben (Oka et al. 2000). Dies kann zu großen Analytverlusten im Rahmen der Probenvorberei-

tung führen. Daher war eine Strategie in der Probenvorbereitung, die Zahl der Probenvorbe-

reitungsschritte auf ein Mindestmaß zu reduzieren. Darüber hinaus mussten auch die adsorp-

tiven Eigenschaften der Tetracycline im ganzen Analysenverfahren Berücksichtigung finden.


Diese Ziele wurden u. a. dadurch erreicht, dass alle Glaswaren, die im Zuge der Probenvorbe-

reitung mit Tetracyclinen in Berührung kamen, mit einer gesättigten EDTA-Methanol-Lösung

vorbehandelt wurden. Darüber hinaus wurden alle Glaswaren vor jeder Verwendung bei 450

ºC ausgeheizt, um organische Verunreinigungen zu zerstören aber auch um etwaige freie

Silanolgruppen an den Glasoberflächen wieder zu vernetzen (Oehme 1998). Weitere

Maßnahmen, die ergriffen werden mussten, um eine Adsorption der Tetracycline an Oberflä-

chen zu verhindern, ist der Einsatz eines sehr sauren Fließmittels (0,5% Ameisensäure,

pH 2,5), die Verwendung von endcap-Säulenmaterialien und darüber hinaus der Einsatz einer

speziellen Spüllösung für den eingesetzten Autosampler. Als optimal erwies sich eine Lösung

von 1 mM Oxalsäure in Methanol/Wasser (90/10, vol/vol). Der Zusatz von Oxalsäure dient

dazu, eine Adsorption von Tetracyclinen an die Leitungen des Autosamplers sowie ein mögli-

ches Verschleppen (carryover) von Tetracyclinen nach Mehrfachinjektionen zu verhindern.

Da eine reproduzierbare Extraktion der Tetracycline mittels (angesäuerter) organischer

Lösungsmittel wie Methanol oder Essigsäureethlyester aus dem Boden nicht etabliert werden

konnte, wurden die Bodenproben in Anlehnung an ein Verfahren nach Cooper et al. (1998)

zur Bestimmung von Tetracyclinen im Hühnerei extrahiert. Die Bodenprobe wurde zunächst

sorgfältig durchmischt, mit Citratpuffer bei pH 4,7 aufgeschlämmt und anschließend zweimal

mit Essigsäureethylester extrahiert. Die vereinigten organischen Überstände wurden zur

Trockene eingedampft und in einer Lösung von 10 mM Ammoniumacetat in Aceto-

nitril/Wasser (90/10, vol/vol) aufgenommen. Mit dem neuentwickelten Verfahren ist eine

deutliche Absenkung der Nachweisgrenzen und damit ein direkter Nachweis der Tetracycline

in Boden und Sickerwasser möglich (Publikationen 1 und 2). Durch die so modifizierte

Extraktionsmethode konnte eine hohe Wiederfindungsrate von 69,2% für Chlortetracyclin

und 74,2% für Oxytetracyclin erreicht werden. Die Wiederfindungsrate für Tetracyclin liegt

für die untersuchten Sandböden mit 37,7% allerdings deutlich niedriger (Publikation 2). Die

relative Standardabweichung lag bei diesen Versuchen im Bereich von 5–100 µg/kg im Mittel

unter 20% und ist unter Berücksichtigung der komplexen Matrix und der erreichten Bestim-

mungsgrenze von 5 µg/kg als sehr gut anzusehen.

Gülleproben konnten mit der gleichen Aufarbeitungsprozedur wie Bodenproben untersucht

werden. Da in dieser Matrix mit deutlich höheren Antibiotikagehalten als im Boden zu rech-

nen war, konnte auf eine Anreicherung der Analyten verzichtet werden. Die mittleren Wieder-

findungsraten sind im Bereich von 0,2–1 mg/kg für alle Tetracycline nahezu 100%; die relati-

ven Standardabweichungen liegen im Mittel sogar deutlich unter 10% (siehe Publikation 2).


Die Sicker- und Grundwasserproben wurden über Festphasenextraktion an einer Styroldi-

vinylbenzolphase (SDB 1) angereichert. Diese Polymerphase bietet einerseits den Vorteil,

dass keine Silanolgruppen vorhanden sind und sich andererseits störende Huminstoffe –

zumindest teilweise – abtrennen lassen (Pichon et al. 1996). Auch konnte bei dieser Phase

durch einen Waschschritt mit einem geringen Volumen Methanol eine effiziente Verbes-

serung der Probenvorreinigung erreicht werden, da eine vollständige Elution der Tetracycline

nur mit essigsaurem Methanol möglich ist. Die Wiederfindungen sind im Bereich von 0,2–

1,0 µg/L deutlich besser als im Boden, auch liegen die relativen Standardabweichungen im

Mittel unter 20% (siehe Publikation 2).

Die qualitative und quantitative Bestimmung der Antibiotikarückstände erfolgte bei allen

Matrices nach HPLC-Trennung an einer RP-C18-Phase und Gradientenelution mittels Elek-

trospray-Tandemmassenspektrometrie (HPLC-ESI-MS-MS, System: LCQ, Thermo-Finni-

gan). Nach chromatographischer Trennung der Substanzen wurden diese in einem Elektro-

spray-Interface ionisiert und nach Separation des Molekülions in einer Ionenfalle fragmen-

tiert. Tetracycline zeigen unter diesen Bedingungen charakteristische Fragmentierungen. Sie

resultieren aus dem Verlust eines Wasser- (-18 Masseneinheiten) bzw. eines Ammoniakmole-

küls (-17 Masseneinheiten) und beider Moleküle (-35 Masseneinheiten). In Abbildung 3 der

Publikation 2 sind in der linken Spalte die aus diesen Fragmenten rekonstruierten Ionenchro-

matogramme dargestellt und in der rechten Spalte die erhaltenen Massenspektren. Zu erken-

nen sind darüber hinaus noch ca. 5% des eigentlich fragmentierten protonierten Molekülions

(im Spektrum ganz rechts, als [M+H]+ dargestellt), auch dieses Ion kann zur Identifizierung

herangezogen werden. Die dabei erhaltenen relativen Intensitäten der Fragmentionen sind für

die Verbindungen charakteristisch und werden neben der Retentionszeit für eine eindeutige

Identifizierung der Substanzen herangezogen.

Darüber hinaus konnte in Publikation 2 am Beispiel des Nachweises von Tetracyclin und

seinem Epimer in Gülle mittels MS3(= MS-MS-MS)-Techniken erstmalig gezeigt werden,

dass durch diese multiple Massenspektrometrie hochselektive Spektren generiert werden

können, die bislang nicht bekannte Identifizierungsmöglichkeiten dieser Substanzen gewähr-

leisten. Dieses Nachweisverfahren lässt sich nur in Massenspektrometern basierend auf der

Ionenfallen-Technologie durchführen: hierbei wird ein Ion, das aus einem tandenmassen-

spektrometrischen (= MS-MS) Experiment stammt, isoliert und erneut fragmentiert. Diese

Technik könnte auch für die Bestätigungsanalytik von Tetracyclinrückständen in Lebens-

mitteln wertvolle Dienste leisten.


Da die Gülle den ersten Eintragspfad für Tierarzneimittel in die Umwelt darstellt, wurden für

verschiedene BDFs die korrespondierenden Feldproben untersucht. In sieben von acht Proben

(fünf Schweinegülleproben, zwei Kälbergülleproben, eine Hühnermistprobe) wurden mittels

HPLC-ESI-MS-MS Tetracyclin und Chlortetracyclin in einer maximalen Konzentration von

45,3 mg/kg nachgewiesen (siehe Tabelle 1 in Publikation 4). Darüber hinaus lassen sich mit

diesem hochselektiven Verfahren auch Epimerisierungs- und biologisch nicht aktive Abbau-

produkte der Tetracycline (iso-Verbindungen) nachweisen. Tylosin konnte in den Proben

nicht nachgewiesen werden.

Mit den entwickelten MS-MS-Verfahren konnten erstmalig Rückstände von Tetracyclin und

Chlortetracyclin in güllegedüngten Ackerböden nachgewiesen werden (Publikation 1). In

dieser Pilotstudie konnte gezeigt werden, dass Tetracycline in signifikanten Konzentrationen

(über 10 µg/kg) in zehn von zwölf untersuchten Flächen vorlagen. Es wurde auch festgestellt,

dass in den mit Schweinegülle beaufschlagten Flächen tendenziell höhere Konzentrationen zu

finden waren als in den mit Rindergülle gedüngten. Ein weiterer Befund dieser Studie war,

dass Tetracycline Persistenz in der Umwelt zeigen, da die Begüllung der untersuchten Fläche

bereits 4–5 Monate zurücklag. Eine Verlagerung dieser Stoffe in tiefere Bodenschichten (40–

90 cm) bzw. in das Sicker- und Grundwasser konnte oberhalb der Nachweisgrenzen des

Verfahrens (1 µg/kg Boden, 0,05 µg/L Wasser) nicht festgestellt werden.

Basierend auf dieser Pilotstudie erfolgten weitere Felduntersuchungen. Eine regelmäßig mit

Schweinegülle beaufschlagte Fläche wurde in vier verschiedenen Kernzonen jeweils im Mai

der Jahre 2000 und 2001 sowie im November 2000 untersucht (siehe Publikation 2). Die indi-

viduelle Untersuchung der vier Kernflächen zeigte, dass Tetracyclin und Chlortetracyclin

durch die praxisübliche Gülleausbringung relativ gleichmäßig über das ganze Feld verteilt

wurden. Mittels dieser Untersuchungen konnte darüber hinaus nicht nur gezeigt werden, dass

Tetracycline im Boden nur langsam abgebaut werden: der relative Rückgang der Tetracyclin-

konzentration von Mai 2000 nach November 2000 betrug 23%. Nach erneuter Zufuhr tetra-

cyclinhaltiger Gülle im Mai 2001 wurde auch eine Akkumulation dieser Substanzen im

Boden nachgewiesen (Publikation 2).


3.1.2 Weiterentwicklung der Probenahme für Wasserproben und räumliche und zeit-

liche Ausdehnung der Felduntersuchungen

(siehe Publikation 3: Abschlussbericht des UBA-Forschungsprojektes „Tierarzneimittel-

analysen gemäß BLAC-Untersuchungsprogramm“ (FKZ 201 91 217))

Die in den Publikationen 1 und 2 durchgeführten Studien lieferten bereits wichtige Erkennt-

nisse über das Vorkommen und das Verhalten von Tetracyclinen in der Umwelt.

Das Projekt „Ermittlung von Tierarzneimittelkonzentrationen in Gülle, Böden und Grundwas-

ser im Rahmen des Bund-/Länder Untersuchungsprogramms – Arzneimittel in der Umwelt –

Konzept für ein Untersuchungsprogramm – UMK-Beschluss vom 27./28. Oktober 1999“

sollte daher das bislang erhobene Datenmaterial bezüglich des Vorkommens von Tetracycli-

nen in Gülle, Böden und Grundwasser sowohl in zeitlicher als auch in räumlicher Hinsicht auf

eine breitere Basis stellen. Ein weiteres Ziel dieses Projektes war die Optimierung der Probe-

nahme speziell für Tetracycline in Sicker- und Grundwasser.

Zur Erfassung der Stoffströme wurden zwei landwirtschaftliche Nutzflächen aus dem nieder-

sächsischen Programm zur Boden-Dauerbeobachtung, die mit unterschiedlichen Wirtschafts-

düngern beaufschlagt wurden, ausgewählt. Über einen Zeitraum von 18 Monaten wurden

Ober- und Unterboden (0–90 cm) in 10-cm-Segmenten sowie Grundwasser und Gülle beprobt

und auf Oxytetracyclin, Tetracyclin und Chlortetracyclin untersucht. Die Bodenuntersu-

chungen wurden darüber hinaus um vierzehn weitere Flächen der gleichen Region erweitert.

Für den Standort BDF 01, der überwiegend mit Schweinegülle beaufschlagt wurde, ließen

sich sehr hohe Tetracyclinkonzentrationen nachweisen, wohingegen die Chlortetracyclin-

konzentrationen meist nahe der Bestimmungsgrenzen lagen. Dieses Rückstandsprofil blieb

über den gesamten Untersuchungszeitraum erhalten und spiegelt in qualitativer Hinsicht auch

die Zusammensetzung der aufgebrachten Gülle wieder. Die Untersuchungen zeigten darüber

hinaus, dass diese landwirtschaftliche Nutzfläche langfristig mit beträchtlichen Tetracyclin-

konzentrationen exponiert war. Die persistenten Tetracyclinkonzentrationen im Oberboden

(0–30 cm) lagen während der 18 Monate im Mittel bei ca. 160 µg/kg und damit über den

gesamten Untersuchungszeitraum oberhalb des EMEA-Triggerwertes für Ökotoxikologie von

100 µg/kg. Bei Überschreitung dieses Triggerwertes im Boden sind seit dem 1. Juni 2001 bei

der Zulassung von neuen Tierarzneimitteln weitergehende ökotoxikologische Untersuchungen

zum Verhalten dieser Stoffe in der Umwelt erforderlich. Betrachtet man die Werte der

Einzelproben, so lassen sich lokale Maxima ermitteln, die 500 µg/kg überschreiten. Aufgrund


des Unterpflügens frisch ausgebrachter Gülle ist jedoch in der Regel von einer relativ homo-

genen Verteilung der Tetracyclinrückstände in der gesamten Fläche und über die Tiefe in der

Ackerkrume auszugehen. Ein Vergleich der Probengehalte von Juni und November 2002

zeigt einen Rückgang der mittleren Tetracyclinkonzentrationen um 37% bzw. 60%. Ob bioti-

sche oder abiotische Abbaufaktoren hier eine Rolle spielen, kann zurzeit nicht beantwortet

werden. Im Mittel lagen die Bodentemperaturen in den betrachteten Zeiträumen 2001 und

2002 bei etwa 15 °C, einer Temperatur die offensichtlich einen gewissen Abbau zulässt. Die

Temperaturabhängigkeit des Abbaus von Chlortetracyclin wurde 1994 von Gavalchin und

Katz erstmalig beschrieben.

Der Standort BDF 02, der mit einer Mischung aus Rinder- und Schweinegülle beaufschlagt

wurde, weist eine deutlich niedrigere Belastung an Tetracyclin und Chlortetracyclin auf. Über

den gesamten Untersuchungszeitraum liegt die mittlere Tetracyclinkonzentration bei 11 µg/kg

und die mittlere Chlortetracyclinkonzentration bei 12 µg/kg. Obwohl die Belastung mit

Tetracyclinen sehr viel geringer ist als bei Standort BDF 01, ist auch hier ein kontinuierlicher

Eintrag und eine gewisse Persistenz von Tierarzneimittelrückständen im Boden feststellbar.

Die Untersuchung von weiteren 14 Standorten aus der gleichen Region von BDF 01 und

BDF 02 ergab ein Rückstandsprofil mit im Allgemeinen deutlich höheren Tetracyclinkonzen-

trationen als Chlortetracyclinkonzentrationen. Bezogen auf die Gesamtbelastung des Ober-

bodens an Tetracyclinen überschreitet eine Fläche wiederum deutlich den EMEA-Triggerwert

von 100 µg/kg, 10 von 14 Flächen liegen zwischen 10–100 µg/kg und nur eine Fläche liegt

unter 10 µg/kg. Die Konzentrationen bei zwei von 14 Flächen liegen unter den Nachweis-

grenzen von 1 µg/kg für Tetracyclin bzw. 2 µg/kg für Chlortetracyclin.

Um die Probenahme im Bereich Sicker- und Grundwasser weiter zu optimieren, wurden drei

Saugsonden (Keramik, Nylon, Borosilikat) und eine Grundwassersonde aus Teflon unter

Laborbedingungen getestet. Obwohl insbesondere die Keramiksonde bei Einsatz von Puffer-

lösungen eine deutliche Adsorption der Tetracycline zeigte, wurden diese unter praxisnahen

Bedingungen durch Matrixeffekte des verwendeten oberflächennahen Grundwassers annä-

hernd kompensiert. Unter diesen Bedingungen zeigte die Nylon-Membran die besten Eigen-

schaften und war somit für die folgenden Sickerwasseruntersuchungen das Saugsondenmate-

rial der Wahl. Für die Gewinnung der Grundwasserproben erwiesen sich die bereits bei den

Pilotstudien eingesetzten Teflonsonden als unproblematisch bzgl. der Sorption von Tetracy-

clinen (siehe Abbildungen 5 und 6 aus Publikation 3).


An den beiden Boden-Dauerbeobachtungsflächen, an denen umfangreiche Bodenunter-

suchungen durchgeführt worden waren, wurden ebenfalls Grundwasseruntersuchungen

vorgenommen. Die Probenahme erfolgte an drei bzw. vier verschiedenen Entnahmestellen in

ca. 5 m Abstand, so dass eine repräsentative Probenahme über die Fläche gewährleistet war.

Die hier untersuchte BDF 01 wird einschließlich der Pilotstudie nunmehr seit fast drei Jahren

regelmäßig beprobt. Trotz einer hohen Exposition mit einer mittleren Tetracyclinkonzen-

tration von ca. 160 µg/kg Boden, waren die Tetracyclinkonzentrationen in mittels Nylon- und

Borosilikat-Saugsonden beprobtem Grundwasser auch in Frühjahr und Herbst 2002 stets

unterhalb der Nachweisgrenze von 0,05 µg/L (siehe Tabellen 5–7 in Publikation 3).

Aus Peilbrunnen gewonnenes, oberflächennahes Grundwasser wurde am Standort BDF 02

untersucht. Auch hier wurde trotz worst-case-Bedingungen (oberflächennahes Grundwasser,

Tiefe 2,5 m unter Flur) kein Übergang von Tetracyclinen in das Sicker- oder Grundwasser

oberhalb der Nachweisgrenze von 0,05 µg/L nachgewiesen.

Abschließend ist aufgrund der Untersuchungen in diesem Projekt festzustellen, dass Tetra-

cycline nach Ausbringung über die Gülle insbesondere im humusreichen Oberboden adsor-

biert werden und dort auch in verhältnismäßig hohen Konzentrationen persistieren. Ein

Eintrag in den Unterboden oder in die aquatische Umwelt konnte im Rahmen dieser Feldstu-

dien nicht festgestellt werden.


3.1.3 Kopplung HPLC/mikrobiologischer Assay und ESI-MS-MS zum Nachweis von

Tetracyclinen in Umweltmatrices und Hühnereiern

(siehe Publikation 6: Residue analysis of tetracyclines and their metabolites in eggs and in the

environment by HPLC coupled with a microbiological assay and tandem mass spectrometry)

Die Kopplung der HPLC mit einem immunologischen (z. B. Radioimmunoassay, Enzym-

immunoassay) oder einem funktionellen Assay (z. B. mikrobiologischer Assay) erlaubt in der

Regel einen empfindlichen sowie sehr selektiven Nachweis von biologisch aktiven Substan-

zen wie Peptiden (siehe Feurle et al. 1992, Hamscher et al. 1996) oder Vitaminen (Nau und

Belz 1998) im Bereich weniger Pikogramm Analyt. Darüber hinaus lassen sich auch biolo-

gisch aktive Metabolite dieser Stoffe nachweisen, die aufgrund auch von geringsten Polari-

tätsunterschieden flüssigkeitschromatographisch getrennt werden können.

Nachdem eine HPLC-Trennung für die verschiedenen Tetracycline entwickelt war (Publika-

tion 2), musste als ein wichtiger Schritt, die Probenvorbereitung auf die Matrix Hühnerei

adaptiert werden. Die von Cooper et al. (1998) beschriebene Probenvorbereitung wurde

dahingehend modifiziert, dass nach dem Zusatz von 1 M Citratpuffer bei pH 5 durch eine ein-

fache Acetonitrilextraktion die Tetracycline in hohen Ausbeuten extrahiert werden konnten.

Anschließend erfolgte die Kopplung mit einem mikrobiologischen Assay, der einen tetra-

cyclinsensitiven staphylococcus aureus Stamm als Testkeim einsetzt. Die HPLC-Eluate wur-

den fraktioniert in Mikrotiterplatten gesammelt. Wichtig hierbei war wiederum auch, dass in

den Vertiefungen der Platten zuvor eine Tween-20-Lösung vorgelegt wurde, um eine

Adsorption der Tetracycline beim nachgeschalteten Lyophilisierungsschritt zu verhindern

(Publikation 6).

Die Bestimmungsgrenze des so etablierten Verfahrens wurde für die Matrix Hühnerei ermit-

telt. Ein sichere Bestimmung aller untersuchten Tetracycline gelang ab einer Konzentration

von 150 µg/kg, d. h. Überschreitungen des derzeitigen MRL-Wertes von 200 µg/kg Hühnerei

können mit dieser Methode festgestellt werden.

Die Kopplungs-Methode ist ebenfalls dazu geeignet, Bodenproben sowie Güllen und Gülle-

krusten auf Tetracycline und möglicherweise vorhandene antibiotisch aktive Tetracyclin-

Metabolite hin zu untersuchen. Ein wesentliches Ergebnis dieser Untersuchungen war, dass

neben den Muttersubstanzen und ihren Epimeren keine weiteren mikrobiologisch aktiven

Tetracycline detektiert werden konnten. Eine relativ schwach mikrobiologisch aktive Frak-

tion, die vor dem Oxytetracyclin eluierte (siehe Abbildung 3 in Publikation 6) konnte durch


weitergehende massenspektrometrische Untersuchungen nicht als Tetracyclin bzw. Tetra-

cyclin-Metabolit identifiziert werden.

Mit der für den mikrobiologischen Assay entwickelten Probenvorbereitung ließ sich das glei-

che ESI-MS-MS-Verfahren wie bereits für die Umweltproben beschrieben durchführen. Da

nur 10% des Eluentenstromes hierfür benötigt werden, konnten Massenspektrometrie und

mikrobiologischer Assay parallel betrieben werden. Das MS-MS-Verfahren gestattete

Bestimmungsgrenzen für Tetracycline im Bereich von einem Zehntel des derzeitigen Grenz-

wertes der EU-Verordnung 2377/90 in Eiern (200 µg/kg). Die Bestimmungsgrenze des

Verfahrens liegt für alle untersuchten Tetracycline bei 20 µg/kg, die Nachweisgrenze bei

4 µg/kg, die mittlere Wiederfindung lag im Bereich 20–400 µg/kg bei 84,3% (OTC), 95,5%

(TC) bzw. 84,1% (CTC). Darüber hinaus konnten im Falle des Chlortetracyclins mit der

Massenspektrometrie auch die mikrobiologisch nicht aktiven iso-Verbindungen nachgewiesen

werden (siehe Abbildung 5 in Publikation 6).


3.1.4 HPLC-ESI-MS-MS-Verfahren zum Nachweis von Sulfonamiden in Gülle, Boden,

Sicker- und Grundwasser und Untersuchungen von Feldproben

(siehe Publikation 4: Eintrag und Verbleib von Tierarzneimittelwirkstoffen in Böden und

Publikation 5: Different behavior of tetracyclines and sulfonamides in sandy soils after

repeated fertilization with liquid manure)

Basierend auf der Methodik für Tetracycline wurden auch Verfahren zum Nachweis von

sieben verschiedenen Sulfonamiden in den Matrices Gülle, Boden und Sickerwasser ent-

wickelt. Es zeigte sich, dass die hierfür entwickelten Extraktionsverfahren größtenteils auch

für die Analytik der Sulfonamide übernommen werden konnten (Publikation 5).

Gülle- und Bodenproben können exakt der gleichen Aufarbeitungsprozedur unterzogen

werden wie zur Tetracyclin-Bestimmung. Im Falle von Sicker- und Grundwasserproben

müssen bei der Festphasensäulenextraktion die Sulfonamide mit Methanol und Acetonitril

eluiert werden. Obwohl die erhaltenen Extrakte nunmehr matrixbelasteter als die für die

Tetracyclinanalytik erhaltenen sind, ist eine empfindliche Detektion weiterhin gewährleistet.

Für die anschließende HPLC- und MS-Bestimmung wurde das Gradientensystem unter

Beibehaltung des Fließmittelsystems leicht modifiziert und so gelang es nach Optimierung

sulfonamidspezifischer MS-MS-Parameter, sieben Sulfonamide in 14 min zu trennen (siehe

Abbildung 2 in Publikation 5).

Die Bestimmungs- und Nachweisgrenzen für Sulfonamide liegen z. T. noch unter den für die

Tetracycline erreichten. So wurden für das häufig verwendete Sulfamethazin Nachweisgren-

zen von 0,5 µg/kg im Boden und 0,01 µg/L im Grundwasser ermittelt (siehe Publikation 4).

Untersuchungen der bereits auf Tetracycline untersuchten sieben Gülleproben und des

Hühnerfestmistes zeigten, dass in fünf der untersuchten Proben Sulfadiazin und Sulfametha-

zin in Konzentrationen zwischen 0,3–2,9 mg/L nachweisbar waren (siehe Tabelle 1 in Publi-

kation 4). Fasst man die Untersuchungen auf die verschiedenen Antibiotika zusammen, so

ließen sich in sieben von acht Proben bis zu vier verschiedene Substanzen nachweisen.

Erstmalige Untersuchungen von vierzehn BDFs auf verschiedene Sulfonamide zeigten, dass

von sieben untersuchten Substanzen nur Sulfamethazin in vier Proben mit einer maximalen

Konzentrationen von 11 µg/kg Boden nachweisbar war (siehe Tabelle 2 in Publikation 4,

Sulfadimidin = Sulfamethazin). Weitere Untersuchungen der Boden-Dauerbeobachtungs-

fläche aus den Publikationen 2 und 5, die eine hohe Tetracyclinexposition aufwies, zeigten


relativ geringe mittlere Sulfamethazin-Konzentrationen von unter 2 µg/kg im Oberboden

(siehe Tabelle 2 in Publikation 5).

In oberflächennahem Grundwasser dieser BDF (1,40 m Tiefe) konnte Sulfamethazin mit einer

maximalen Konzentration von 0,24 µg/L an allen sechs Probenahmezeiten 2002 nachgewie-

sen werden. Auch in der ersten Probenahme 2003 war die Substanz noch im Grundwasser zu

finden (siehe Tabelle 4 in Publikation 5).


3.1.5 HPLC-ESI-MS-MS-Verfahren zum Nachweis von Tetracyclinen, Tylosin, Sulfon-

amiden und Chloramphenicol in Stallstaub und Untersuchungen von Feldproben

(siehe Publikation 7: Antibiotics in dust originating from a pig fattening farm: a new source of

health hazard for farmers?)

Auch für die Staubanalytik wurde das Extraktionsverfahren, dass bereits für den Tetracyclin-

und Sulfonamidnachweis in Boden- und Gülleproben eingesetzt wurde, als Methode der Wahl

eingesetzt. Staub stellt eine heterogen zusammengesetzte Matrix dar, die vor allem durch

einen hohen organischen Anteil von fast 90% gekennzeichnet ist. Bedingt durch den geringen

Wassergehalt musste daher in der Probenvorbereitung eine Verdünnung des Analyten in Kauf

genommen werden, da letztendlich 0,1 g Probe in 1 mL Lösungsmittel aufgenommen wurden.

Die HPLC- und massenspektrometrischen Parameter konnten aus den bereits entwickelten

Methoden für Boden, Gülle und Wasser übernommen werden. Da die Belastung der Stäube

im Bereich von 0,1–10 mg/kg lag, zeigte das eingesetzte Verfahren immer noch eine ausrei-

chende Empfindlichkeit für den beabsichtigten Einsatz.

Darüber hinaus wurde das Verfahren auch für den Nachweis von Chloramphenicol erweitert.

Aufgrund von Matrixeffekten musste die Quantifizierung mit der Methode des Standardaddi-

tionsverfahrens durchgeführt werden (siehe Publikation 7).

Staubproben, die in einem Schweinestall kontinuierlich über die Jahre 1981–2000 gesammelt

und bei 4 °C gelagert worden waren, wurden retrospektiv mittels HPLC-MS-MS auf elf

verschiedene Substanzen untersucht. Erstmalig wurde der Nachweis erbracht, dass Antibio-

tika auch in den Staub von Tierställen gelangen können. Hierdurch können Antibiotika einer-

seits durch den Landwirt inhaliert werden und andererseits durch die Abluft auch in die

Umgebung von Tierställen gelangen.

Die Gesamtgehalte an Antibiotika in Staubproben aus einem Schweinemastbetrieb mit einer

Besatzdichte zwischen 350 und 420 Tieren in den Jahren 1981–2000 betrugen bis zu

12,5 mg/kg Staub. In 90% der Proben wurden bis zu fünf verschiedene Substanzen nach-

gewiesen, die häufigsten Einzelnachweise erfolgten für Tylosin in 80% und für Sulfamethazin

in 65% der Proben (siehe Tabelle 2 in Publikation 7).


3.2 Entwicklung und Einsatz neuer rückstandsanalytischer Nachweisverfahren für

Antiparasitika in Lebensmittel- und Umweltproben

3.2.1 HPLC-DAD-Verfahrens zum Nachweis des Carbamates Propoxur in Hühner-

eiern, Luft- und Staubproben

(siehe Publikation 8: Determination of propoxur residues in eggs with HPLC-DAD after

treatment of stocked housing facilities for the poultry red mite (Dermanyssus gallinae))

Die Extraktion von Propoxur aus dem Hühnerei gelang nur nach sehr aufwändiger Proben-

vorbereitung, die sowohl eine Flüssig-Flüssig-Extraktion als auch eine säulenchromatogra-

phische Aufreinigung an Kieselgel beinhaltete. Der eigentliche Nachweis der Substanz wurde

nach HPLC-Gradientenelution mittels Diodenarray-Detektion realisiert. Die Bestimmungs-

grenze des Verfahrens lag bei 5 µg/kg, die Nachweisgrenze bei 2 µg/kg und die mittlere

Wiederfindung im Bereich 5–100 µg/kg bei 87,4%. Positive Rückstandsbefunde konnten über

ein UV-Spektrum abgesichert werden. Damit wurde ein Verfahren entwickelt, dass eine

sichere Detektion des Analyten im Bereich von einem Zehntel des derzeitigen Grenzwertes

der Rückstands-Höchstmengenverordnung für Propoxur in Eiern (50 µg/kg) erlaubt.

Das entwickelte HPLC-Verfahren wurde auch für die Untersuchung von Staub- und Luftpro-

ben eingesetzt. Die Probenvorbereitung für diese beiden Matrices konnte wesentlich einfacher

durchgeführt werden als dies für die Matrix Hühnerei der Fall war. Luftproben wurden in

Flaschen, die mit eisgekühltem Essigsäureethylester beschickt waren, gesammelt. Nach

Entfernen des Lösungsmittels wurden die Proben in Methanol aufgenommen und mittels

HPLC-DAD analysiert. Staubproben wurden mit Essigsäureethylester extrahiert, abzentrifu-

giert und eingedampft. Der in Methanol aufgenommene Rückstand wurde mittels HPLC-

DAD analysiert. Trotz dieser einfachen Probenvorbereitung wurden keine Störsignale bei der

Analyse von Staub- und Luftproben im Bereich der Retentionszeit von Propoxur festgestellt

(Hamscher et al., in Vorbereitung).

Zur genaueren Untersuchung des Rückstandsverhaltens von Propoxur wurden Legehennen-

ställe mit drei verschiedenen Haltungsformen (Käfighaltung, ausgestalteter Käfig, Volieren-

haltung) an Tag 0, an Tag 7 und an Tag 14 der Studie mit einer Propoxurlösung (Hersteller-

bezeichnung: CBM-8�) so behandelt, dass vor allem die Verstecke der Milben erfasst wurden.

Sechs Kontrolleier aus jeder Haltungsform wurden an Tag -3 und Tag -1 vor der ersten

Behandlung gesammelt. Sechs Eier aus jeder Haltungsform wurden an den Tagen 1, 3, 5, 8,


10, 12, 15, 17, 19, 24, 29, 34 und 39 nach der Behandlung gesammelt und bei -20 °C bis zur

Untersuchung gelagert.

Propoxurrückstände oberhalb von 2 µg/kg ließen sich von Tag 1 bis Tag 39 im Hühnerei

nachweisen, der höchste Mittelwert (n = 6) wurde an Tag 8 (36,9 µg/kg) bei den Eiern aus

Käfighaltung gefunden. Bei insgesamt 234 untersuchten Proben wurde in sechs Fällen der

Grenzwert der Rückstands-Höchstmengenverordnung für Propoxur in Eiern (50 µg/kg) über-

schritten, wobei fünf dieser Proben aus Käfighaltung stammten. In Tabelle 3 von Publika-

tion 8 sind die Ergebnisse der Untersuchungen zusammenfassend dargestellt. Die statistische

Analyse der Daten zeigte, dass in der Käfighaltung signifikant höhere Rückstände auftreten

als in den ausgestalteten Käfigen und in der Volierenhaltung (p < 0,05). Darüber hinaus

wurden in den ausgestalteten Käfigen signifikant höhere Werte gemessen als in der Volieren-

haltung (p < 0,05).

Erste vorläufige Ergebnisse der untersuchten Luft- und Staubproben zeigten, dass Propoxur

24 Stunden nach der Ausbringung in einer mittleren Konzentration von 67 µg/m³ nachweisbar

war. Drei Tage später fielen die Luftkonzentrationen von Propoxur auf ca. ein Zehntel dieses

Wertes. In den ersten untersuchten Staubproben fanden sich mittlere Konzentrationen von 0,8

mg/kg (Hamscher et al., in Vorbereitung).


3.2.2 HPLC-DAD-Verfahren zum Nachweis des Thiophosphorsäureesters Phoxim in

Hühnereiern

Die Extraktion von Phoxim aus Hühnereiern gelang unter Berücksichtigung einer Methode

für die Bestimmung von Phoxim in verschiedenen Geweben des Schweines (Krebber und

Heukamp 1995) und nach geringfügigen Modifikationen des in Publikation 8 dargestellten

Propoxur-Verfahrens. Eine detaillierte Zusammenstellung der erforderlichen Modifikationen

im Bereich der säulenchromatographischen Vorreinigung und bezüglich des eingesetzten

HPLC-Gradientenprogrammes ist in Tabelle 2 dargestellt.

Tab. 2: Erforderliche Modifizierungen zur Bestimmung von Phoxim oder Deltamethrin inHühnereiern bei Anwendung des in Publikation 8 beschriebenen Nachweisverfahrens fürPropoxur.

Arbeitsschritt Phoxim-Methode Deltamethrin-Methode

Extraktion Probe mit 550 µL 1 M Salzsäureversetzen

Acetonitrilphasen mit 25 mLn-Hexan partitionieren

Säulenchro-matographie

nicht deaktiviertes KieselgelSäule nach dem Spülschritt mit20 mL n-Hexan/Dichlormethan(50/50, vol/vol) eluieren

3 g nicht deaktiviertes Kieselgel

Säule mit 10 mL n-Hexan und mit10 mL n-Hexan/Dichlormethan(75/25, vol/vol) spülen

Säule mit 20 mL n-Hexan/Dichlor-methan (50/50, vol/vol) eluieren

HPLC

Gradient Zeit [min] H2O [%] ACN [%] Zeit [min] H2O [%] ACN [%]

0151718212227

602525116060

40757599994040

0101220

20,532

1001

0,10,1100100

099

99,999,9

00

UV-Detektion λ = 281 nm λ = 220 nm


Die Bestimmungsgrenze des so modifizierten Verfahrens lag bei 5 µg/kg, die Nachweisgrenze

bei 2 µg/kg und die mittlere Wiederfindung im Bereich 5–50 µg/kg bei 81,3% (siehe

Tabelle 3). Eine ausgezeichnete Linearität der Methode in diesem Bereich ist gegeben (siehe

Abbildung 2 A). Positive Rückstandsbefunde können über ein UV-Spektrum abgesichert

werden.

Tab. 3: Wiederfindungsraten und relative Standardabweichungen für die Bestimmung vonPhoxim im Hühnerei.

Konzentration [µg/kg] n Wiederfindung [%] RSA [%]

5 4 79,8 ± 7,0 8,8

10 6 86,0 ± 12,1 14,1

25 6 78,5 ± 8,6 10,9

50 6 80,8 ± 4,5 5,6

Abb. 2: Linearität der Wiederfindung für den Nachweis von Phoxim (A) und Deltamethrin(B) im Hühnerei.

0 20 40 60 80 100Zusatz [µg/kg]

0

20

40

60

80

100Wiederfindung [µg/kg]

r² = 0,9994

B

0 10 20 30 40 50Zusatz [µg/kg]

0

10

20

30

40

50Wiederfindung [µg/kg]

r² = 0,9993

A


Phoxim ist bereits als Tierarzneimittel zur Behandlung von Schafen und Schweinen gegen

den Befall mit Ektoparasiten zugelassen (siehe Anhang I der VO (EWG) Nr. 2377/90).

Weiterhin liegen tierartenspezifische MRL-Werte für Fett (700 µg/kg), Muskel (20–50 µg/kg)

sowie Leber und Niere (20-50 µg/kg) vor. Die Zulassung als Tierarzneimittel zur Anwendung

im belegten Stall wird derzeit angestrebt (Heine und Pospischil 2003). Ein MRL-Wert in der

Größenordnung von 20 µg/kg für Hühnereier könnte möglicherweise festgesetzt werden. Das

hier vorgestellte Verfahren erlaubt eine sichere Bestimmung von Phoxim im Bereich von

einem Viertel dieses Wertes.

In der Rückstands-Höchstmengenverordnung wird Phoxim nicht als Einzelsubstanz aufge-

führt, daher muss für diesen Stoff – wenn z. B. ein Einsatz als Pestizid im nichtbelegten Stall

erfolgt – ein Grenzwert von 10 µg/kg für alle Lebensmittel berücksichtigt werden. Das vorge-

stellte Verfahren erlaubt in diesem Fall eine sichere Bestimmung von Phoxim im Bereich des

halben Grenzwertes.


3.2.3 HPLC-DAD-Verfahren zum Nachweis des Pyrethroides Deltamethrin in

Hühnereiern

Die Extraktion von Deltamethrin aus dem Hühnerei gelang ebenfalls nach geringfügigen

Modifikationen des in Publikation 8 dargestellten Verfahrens für Propoxur im Bereich der

Extraktion, der säulenchromatographischen Vorreinigung und bezüglich des eingesetzten

HPLC-Gradientenprogrammes (detaillierte Zusammenstellung der erforderlichen Modifika-

tionen siehe Tabelle 2).

Die Bestimmungsgrenze des Verfahrens lag bei 10 µg/kg, die Nachweisgrenze bei 5 µg/kg

und die mittlere Wiederfindung im Bereich 10–50 µg/kg bei 79,0% (siehe Tabelle 4). Eine

ausgezeichnete Linearität des Verfahrens für Deltamethrin in diesem Bereich ist ebenfalls

gegeben (siehe Abbildung 2 B). Positive Rückstandsbefunde können über ein UV-Spektrum

abgesichert werden.

Tab. 4: Wiederfindungsraten und relative Standardabweichungen für die Bestimmung vonDeltamethrin im Hühnerei.

Konzentration [µg/kg] n Wiederfindung [%] RSA [%]

10 6 81,2 ± 4,0 4,9

25 6 80,1 ± 9,1 11,3

50 6 76,1 ± 6,4 8,4

100 6 78,6 ± 6,9 8,8

Deltamethrin ist bereits als Tierarzneimittel zur Behandlung von Rindern, Schafen und

Fischen gegen den Befall mit Ektoparasiten zugelassen (siehe Anhang I der VO (EWG)

Nr. 2377/90). Demzufolge liegen tierartenspezifische MRL-Werte für Fett (50 µg/kg), Milch,

Muskel, Leber und Niere (10–20 µg/kg) vor. Es ist nicht bekannt, ob die Zulassung als Tier-

arzneimittel zur Anwendung im belegten Stall derzeit angestrebt wird.

Für Deltamethrin wird in der Rückstands-Höchstmengenverordnung ein Grenzwert von

50 µg/kg für Eier angeführt, falls diese Substanz z. B. als Pestizid im nichtbelegten Stall

eingesetzt wird. Das vorgestellte Verfahren erlaubt somit eine sichere Detektion des Analyten

im Bereich von einem Fünftel der Höchstmenge für Deltamethrin in Eiern.


4 Zusammenfassende Diskussion der Ergebnisse

4.1 Eintrag von Tierarzneimitteln in die Umwelt

In den vorgestellten Arbeiten wurden massenspektrometrische Verfahren zum empfindlichen

und selektiven Nachweis häufig verwendeter Antibiotika in den unterschiedlichsten Umwelt-

matrices entwickelt. Hierdurch konnte erstmalig umfangreiches Datenmaterial zum Eintrag

von Tetracyclinen und Sulfonamiden in Böden, die regelmäßig mit Gülle gedüngt werden,

erhoben werden. Am Beispiel von Sulfamethazin konnte der Eintragsweg eines Tierarznei-

mittels über die Gülle und den Boden bis in das Grundwasser nachgewiesen werden. Darüber

hinaus konnte mit diesen hochselektiven Verfahren auch erstmalig ein neuer Eintragspfad für

Tierarzneimittel über Stallstäube in die Umwelt beschrieben werden.

4.1.1 Eintrag von Tierarzneimitteln in die Gülle

Ein wesentlicher Vorteil des entwickelten Verfahrens für die Matrices Gülle und Boden

besteht darin, die mittels einer einfachen Probenvorbereitung gewonnenen Extrakte sowohl

für den Nachweis von Tetracyclinen als auch für die in der Praxis (zumindest in Deutschland)

am zweithäufigsten eingesetzten Sulfonamide verwenden zu können. Hierdurch ist es mög-

lich, mittels zwei HPLC-Trennungen elf Tierarzneimittel zu analysieren.

Durch den Einsatz dieser neuen Analysenverfahren konnte gezeigt werden, dass bis zu vier

verschiedene Antibiotika in einer Gülleprobe vorliegen können. Die nachgewiesenen Kon-

zentrationen betrugen für Tetracycline bis zu 45 mg/kg und für das Sulfdiazin bis zu

2,9 mg/kg (siehe Publikation 4). Bislang sind hinsichtlich Spezifität und Selektivität keine

vergleichbaren Verfahren für den Tetracyclinnachweis in der Gülle beschrieben worden. Für

den Nachweis verschiedener Sulfonamide in der Gülle erschienen 2002 zwei Arbeiten: Haller

et al. stellten ein HPLC-MS-Verfahren vor, in einer Arbeit von Pfeifer et al. wird über ein

deutlich empfindlicheres HPLC-MS-MS-Verfahren berichtet. Die höhere Empfindlichkeit

dieser Methode beruht vor allem auf dem Einsatz eines Triple-Quadrupol-Massenspektro-

meters. In den vorliegenden eigenen Arbeiten stand für alle Untersuchungen ein Ion-Trap-

Massenspektrometer zur Verfügung, das systembedingt eine niedrigere Empfindlichkeit auf-

weist (ThermoQuest 2000). Insofern – das gilt auch für die nachfolgenden Ausführungen für

die Matrices Boden und Sicker-/Grundwasser – könnte durch die Kombination der dieser


Arbeit zugrunde liegenden Probenvorbereitungstechniken mit Triple-Quadrupol-Massen-

spektrometern eine weitere Verbesserung der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen erreicht

werden.

Antibiotika und insbesondere Tetracycline werden nur geringfügig im Tier metabolisiert und

gelangen in die Exkremente. Aus Modellrechnungen ergibt sich, dass Mastschweinegülle bei

einer Bestandsbehandlung über 10 Tage zwischen 23 und 52 mg/kg und Putenfestmist

zwischen 91 und 878 mg/kg Tetracyclin enthalten kann. Untersuchungen an

181 Schweinegülleproben ergaben Positivbefunde (Nachweisgrenze: 0,6 mg/kg) in 24% der

Fälle. Es wurden Gehalte bis 66 mg/kg gemessen (Winckler und Grafe 2001).

Auch für die Substanzgruppe der Sulfonamide liegen nur wenige Untersuchungen zum

Eintrag in die Gülle vor. Berger et al. (1986) zeigten, dass 46% des Schweinen verabreichten

Sulfamethazins in die Gülle gelangten, 50% davon als N4-Acetyl-Sulfamethazin. Darauf

aufbauende Untersuchungen von Langhammer et al. (1988) ergaben, dass nach 8-tägiger

Medikation von Schweinen mit Sulfamethazin/Sulfathiazol Rückstände der beiden Wirkstoffe

von 39 mg/kg Gülle auftreten. Aktuelle Untersuchungen in der Schweiz von Haller et al.

(2002) weisen Sulfamethazin, N4-Acetyl-Sulfamethazin und Sulfathiazol in fünf von sechs

Gülleproben nach (Summe der Wirkstoffe: 0,3–23,7 mg/kg).

In den USA werden Abwässer und Fäkalien in Mastbetrieben oftmals in sogenannten Gülle-

Lagunen gesammelt. Meyer et al. (2000) konnten Tetracyclin in allen 13 untersuchten Gülle-

Lagunen in Konzentrationen von 0,01–0,75 mg/kg nachweisen. Bestätigt wurden diese

Ergebnisse von Zhu et al. (2001), die ebenfalls Tetracyclin in 23 von 26 untersuchten Gülle-

Lagunen in Konzentrationen von 0,003–12 mg/kg nachweisen konnten.

Schlüsener et al. (2003) berichten über den Eintrag von Salinomycin (11 µg/kg) und Tiamulin

(43 µg/kg) in eine von vier untersuchten Schweinegüllen. Die tatsächlich ermittelten Konzen-

trationen lagen in dieser Studie deutlich unter den – basierend auf den Angaben des Land-

wirtes – errechneten Konzentrationen (2000 µg/kg) gemäß der EMEA-Leitlinie

EMEA/CVMP/055/96 (European Union 1996).

Zum Abbau von Tetracyclinen in der Gülle liegen wiederum nur wenige Arbeiten vor. Kühne

et al. (2000) ermittelten Halbwertzeiten für Tetracyclin in Gülle von 4,5–9 Tagen in 1-L-Ge-

fäßen, je nachdem ob der Ansatz belüftet oder unbelüftet gefahren wurde. Winckler und Grafe

(2000) wiesen eine hohe Persistenz von Tetracyclin in Schweinegülle in großvolumigen

Versuchsbehältern nach (in sieben Wochen ein maximal 50%iger Abbau). Die Ausgangs-


konzentration, die Umgebungstemperatur und der Lufteintrag zeigten keinen wesentlichen

Effekt auf die Abbaurate.

Langhammer et al. zeigten 1988 am Beispiel des Sulfamethazins, dass im Tier gebildete N-

acetylierte Sulfonamide in der Gülle gespalten werden können und es somit auch zu einem

kurzfristigen Konzentrationsanstieg der Muttersubstanz kommen kann. In weitergehenden

Untersuchungen wurde ein 40–60%iger Abbau von Sulfonamid-Rückständen (Sulfathiazol,

Sulfamethazin) in der Gülle nach fünf Wochen ermittelt.

Erste Untersuchungen zur Stabilität von Tylosin von Loke et al. (2000) deuten darauf hin,

dass die Halbwertzeit dieses Wirkstoffes in Gülle weniger als zwei Tage beträgt.

Die Untersuchungen zum Abbauverhalten verschiedener Antibiotika in Gülle zeigen, dass es

stoffspezifische Unterschiede gibt und dass sich Versuche im Labormaßstab nicht unmittelbar

auf die Bedingungen in der Praxis übertragen lassen. Zur Erfassung sämtlicher Antibiotika

und ihrer Abbauprodukte ist ein beträchtlicher analytischer Aufwand erforderlich.

Somit ist festzustellen, dass bislang nur wenige umfassende Studien zum Eintrag und zum

Abbauverhalten von Antibiotika in Gülle vorliegen. In den vorliegenden Untersuchungen ist

übereinstimmend festgestellt worden, dass sowohl Tetracycline als auch Sulfonamide nach

bestimmungsgemäßer Anwendung Rückstandskonzentrationen im mg/kg-Bereich in der

Gülle hinterlassen können und ein Abbau dieser beiden Substanzgruppen nur langsam erfolgt.

Tylosin, Tiamulin und Salinomycin scheinen nach ersten Untersuchungen einem schnelleren

Abbau in der Gülle zu unterliegen.

4.1.2 Eintrag von Tierarzneimitteln in den Boden

Die in Niedersachsen durchgeführten Untersuchungen landwirtschaftlich genutzter Boden-

Dauerbeobachtungsflächen und von Nutzflächen in deren unmittelbarer Umgebung zeigten

zum ersten Mal, dass Tetracycline über die Gülle in beträchtlichen Mengen in die Böden

gelangen, dort persistieren und auch akkumulieren können. Die ermittelten Konzentrationen

von z. T. deutlich über 10 µg/kg und das Vorkommen von Tetracyclin und Chlortetracyclin in

den meisten der untersuchten Proben deckte sich in qualitativer Hinsicht mit den von Winck-

ler et al. (2000) ermittelten Verbrauchserhebungen, aber auch in quantitativer Hinsicht mit

den hieraus abgeschätzten Konzentrationen im Boden. Insofern lassen sich auch die Negativ-

befunde für Oxytetracyclin und Tylosin anhand der sehr niedrigen Verbrauchsmengen in


dieser Region erklären. Im Falle des Tylosins muss aber auch ein relativ rascher Abbau dieses

Antibiotikums in der Gülle für die Negativbefunde diskutiert werden.

Die ausgewählten Flächen wurden praxisüblich bewirtschaftet und sind auch im Hinblick auf

die Bodenzusammensetzung repräsentativ für Nordwestdeutschland. Insofern sind die im

Rahmen der vorgestellten Arbeiten erhobenen Befunde auch auf landwirtschaftliche Flächen

mit vergleichbarer Nutzung und Bodengeologie übertragbar.

Die im Rahmen einer Pilotstudie gewonnenen Erkenntnisse (Publikation 1) wurden durch

räumlich und insbesondere zeitlich intensivierte Untersuchungen erweitert. Da besonders

Böden, die nachweislich mit Schweinegülle beaufschlagt wurden, die höchsten Antibiotika-

konzentrationen zeigten, wurde eine solche Fläche für eine Langzeituntersuchung ausgewählt.

Mittlerweile liegen die Daten für drei Jahre vor (Publikationen 2 und 3). Diese Fläche wurde

jeweils in vier verschiedenen Kernflächen untersucht und die Bodenproben in 10-cm-Seg-

menten von 0–90 cm unterhalb der Ackerkrume gezogen. Durch diese differenzierte Unter-

suchung ließen sich detailliertere Erkenntnisse als in der Pilostudie gewinnen.

Die erste Gülledüngung erfolgte im Frühjahr 2000 und die ersten Bodenproben wurden im

Mai und im November des Jahres gezogen. Ein signifikanter Abbau von Tetracyclin und

Chlortetracyclin konnte zwischen Mai und November 2000 nicht nachgewiesen werden. Nach

einer weiteren Gülledüngung im April 2001 waren die Werte im Mai 2001 signifikant höher

als im November und Mai des Vorjahres (p < 0,05), was den erstmaligen Hinweis auf eine

mögliche Akkumulation dieser Substanzen im Boden erbrachte. Eine Verlagerung der

Substanzen in tiefere Bodenschichten konnte nach zwölf Monaten nicht nachgewiesen

werden. Die Substanzen werden offensichtlich stark in der Ackerkrume festgehalten und ein

Eintrag in die obere Bodenschicht (0–30 cm) erfolgt durch das Unterpflügen der aufgebrach-

ten Gülle. Ein weiteres Ergebnis dieser Untersuchungen ist, dass zu allen drei Zeitpunkten in

den ersten 10 cm signifikant niedrigere Tetracyclinkonzentrationen gemessen wurden als in

den Schichten 10–20 cm und 20–30 cm (p < 0,05). Ob in diesem Segment ein partieller

Abbau durch Photolyse, höhere mikrobiologische Aktivität bedingt durch die etwas höheren

Bodentemperaturen oder durch unterschiedliche abiotische Faktoren stattfindet, kann zur Zeit

nicht beurteilt werden. Aber auch in dieser Schicht ist mit wiederholter Gülleausbringung ein

signifikanter Konzentrationsanstieg im Untersuchungszeitraum festzustellen, d. h. der

Neueintrag überwiegt den Abbau.


Eine erneute Untersuchung dieser Fläche erfolgte im November 2001. Es konnte – wie schon

im Vorjahr – gezeigt werden, dass bis November im Vergleich zum Mai kein signifikanter

Rückgang der Tetracyclin- und Chlortetracyclinkonzentrationen erfolgte. Darüber hinaus

wurden wiederum signifikant niedrigere Konzentrationen in der Schicht 0–10 cm im

Vergleich zu 10–20 cm festgestellt, allerdings nicht mehr in der Schicht 20–30 cm.

Interessant in dieser Hinsicht sind die Untersuchungen von Galvachin und Katz (1994). Sie

zeigten, dass Chlortetracyclin, das vermischt mit Hühnerkot in sehr hohen Konzentrationen

(5,6 mg/kg) in den Boden gebracht wird, eine temperaturabhängige Persistenz aufweist. Die

mittels mikrobiologischer Methoden bestimmte Aktivität des Chlortetracyclins reduzierte sich

nach 30 Tagen Inkubation (bei 30 ºC auf 44%, bei 20 ºC auf 88%) bzw. blieb unverändert (bei

4 ºC). In Publikation 2 konnte anhand von Lagerungsversuchen bei 4 ºC gezeigt werden, dass

Tetracyclin und Chlortetracyclin in Feldproben für zumindest sechs Monate keinem Abbau

unterliegen.

In der EMEA/CVMP/055/96-Leitlinie ist seit 1996 für die Zulassung neuer Tierarzneimittel

eine umfassende ökotoxikologische Prüfung dann vorgeschrieben, wenn sich eine auf worst-

case-Szenarien beruhende vorhersagbare Arzneimittel-Konzentration (PEC, predicted envi-

ronmental concentration) im Boden von über 100 µg/kg ergibt, die Halbwertzeit der Stoffe im

Boden länger als 60 Tage ist und weniger als 90% des Wirkstoffes innerhalb eines Jahres im

Boden abgebaut werden (European Union 1996). Die erhobenen Befunde mit maximalen

Tetracyclinkonzentrationen von mehr als 500 µg/kg Boden (siehe Publikation 3) sollten daher

Anlass sein, eine ökotoxikologische Neubewertung für die „Alt-Tierarzneimittel“ der Tetra-

cycline durchzuführen.

Mit den vorgestellten Untersuchungen konnte auch gezeigt werden, dass Boden-Dauer-

beobachtungsflächen mit gut dokumentierter Bodennutzung und Bodenbeschaffenheit die

Durchführung aussagekräftiger Feldstudien gewährleisten. So sind auch Langzeitunter-

suchungen, die insbesondere für eine Risikoabschätzung anthropogener Einträge in die

Umwelt unabdingbar sind, unter den hier etablierten und umfassend dokumentierten Freiland-

bedingungen optimal durchführbar und sollten auch in dem beschriebenen Umfang fortgesetzt

werden.

Erste Bodenuntersuchungen auf Sulfonamide ergaben, dass diese in der Regel in deutlich

niedrigeren Konzentrationen (maximal gefundene Sulfamethazin-Konzentration: 11 µg/kg)

vorkommen als Tetracycline. Insofern bestätigen diese erstmals durchgeführten Feldunter-


suchungen frühe Laboruntersuchungen von Langhammer und Büning-Pfaue (1989 und 1990)

zum Verhalten von Sulfamethazin im Boden. Es wurde gezeigt, dass Sulfamethazin im Boden

(abhängig vom pH-Wert und organischen Kohlenstoffgehalt) zum überwiegenden Teil adsor-

biert wird und wahrscheinlich biologisch nicht mehr verfügbar ist („bound residues“). In

diesen Modellversuchen konnten signifikante Einträge von Sulfamethazin aus hochbelasteter

Gülle (40 mg/kg) in Böden nicht nachgewiesen werden. Umfassende Tracerstudien zeigten

darüber hinaus eine geringe Aufnahme der Radioaktivität in die Wurzeln von Pflanzen (3–

15%) und eine sehr geringe Verlagerung in den Sproß (0,04%).

Im Rahmen der eigenen Felduntersuchungen wurde weiterhin nachgewiesen, dass die beiden

Flächen, auf denen keine Tetracycline zu finden waren, Spuren von Sulfamethazin (1–

2 µg/kg) enthielten. Insofern ist festzustellen, dass alle untersuchten Flächen (natürlich mit

Ausnahme der beiden Kontrollflächen) zumindest ein Antibiotikum enthielten.

4.1.3 Eintrag von Tierarzneimitteln in das Sicker- und Grundwasser

Von Frühjahr 2000 bis Frühjahr 2003 wurden regelmäßig Sicker- (80–120 cm Tiefe) und

oberflächennahe Grundwasserproben (140–200 cm Tiefe) der besonders hoch mit Tetracycli-

nen belasteten Dauer-Bodenbeobachtungsfläche untersucht. Weder im Sicker- noch im

Grundwasser ließen sich bislang Tetracycline oberhalb der Nachweisgrenze von 0,05 µg/L

bestimmen (Publikationen 1–5).

Nachdem die Methodik zum Nachweis von Sulfonamiden in Sicker- und Grundwasser zur

Verfügung stand, konnte das Untersuchungsspektrum auf diese Substanzklasse erweitert

werden. Es konnte erstmalig ein direkter Zusammenhang zwischen dem Eintrag von Sulfa-

methazin über die Gülle in den Boden und einem Eintrag in das oberflächennahe Grund-

wasser aufgezeigt werden. Obwohl der Boden nur mit sehr geringen Sulfamethazingehalten

belastet war (unterhalb 2 µg/kg) ließ sich die Substanz im oberflächennahen Grundwasser

über einen Zeitraum von mittlerweile einem Jahr in Konzentrationen bis maximal 0,24 µg/L

nachweisen. Durch diese Untersuchungen wurde erstmalig auch der kontinuierliche Eintrag

eines Tierarzneimittels über den Pfad Gülle-Boden-Grundwasser unter Feldbedingungen

nachgewiesen. Darüber hinaus wurde an dieser Boden-Dauerbeobachtungsfläche auch das

unterschiedliche Umweltverhalten von Tetracyclinen und Sulfonamiden demonstriert (siehe

Publikation 5).


Zur räumlichen Intensivierung auch der Wasseruntersuchungen wurden oberflächennahe

Brunnen aus dem Niedersächsischen Gewässerüberwachungsnetz (GÜN), die in der unmittel-

baren Nähe von Boden-Dauerbeobachtungsflächen liegen, herangezogen. Eine Zuordnung des

in den Brunnen gewonnenen Grundwassers zu einzelnen landwirtschaftlich genutzten Flächen

war nicht möglich. Allerdings konnten die Brunnen Gebieten mit regionalen Schwerpunkten

in der Viehhaltung zugeordnet werden. In keinem der Brunnen, die in Tiefen zwischen 2,5

und 7,8 m unter Flur filtern, konnten Tetracycline, Tylosin oder Sulfonamide nachgewiesen

werden (Publikation 4). Diese Wasseruntersuchungen zeigen – insbesondere im Zusammen-

hang mit den Untersuchungen der sulfamethazinhaltigen Boden-Dauerbeobachtungsfläche –

dass lokale Antibiotika-Kontaminationen („hot spots“) in zukünftige Risikobetrachtungen

einbezogen werden sollten.

Die Ergebnisse der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Grundwasser-Untersuchungen

decken sich im wesentlichen mit den Ergebnissen von Monitoring-Studien in Deutschland

und kürzlich erschienenen Daten aus den USA. Hirsch et al. (1999) fanden in keiner von

69 Grundwasserproben Tetracycline und in zwei von 69 Proben Sulfamethazin in einer

Konzentration von 0,26 µg/L. Weitere Untersuchungen der gleichen Grundwasserentnahme-

stellen konnten diese Befunde allerdings nicht bestätigen. Lindsey et al. wiesen 2001 Sulfon-

amide und Tetracycline in neun von 144 Grund- und Oberflächengewässern in Konzentra-

tionen von 0,07–15 µg/L nach. Nur in einem Fall, Sulfamethoxazol, wurde Grundwasser

positiv getestet (0,22 µg/L). Allerdings wird diese Substanz überwiegend in der Humanmedi-

zin eingesetzt. Tetracycline wurden nur in Oberflächengewässern nachgewiesen (0,15 µg/L

OTC, 0,07–1,34 µg/L TC und 0,11 µg/L CTC). Nach Ansicht dieser Autoren ist ein run-off

der Antibiotika in die Oberflächengewässer wahrscheinlicher als ein Eintrag in das Grund-

wasser durch Auswaschen der Böden.

Das in den USA weit verbreitete Anlegen von sogenannten Gülle-Lagunen stellt hinsichtlich

der Gefährdung des Grundwassers möglicherweise ein spezifisches lokales Risiko dar. Aller-

dings konnten weder Meyer et al. (2000) noch Zhu et al. (2001) im Grundwasser-Bereich

dieser Anlagen Tetracycline nachweisen. Auch diese beiden Arbeiten zeigen, dass Tetra-

cycline stark im Boden festgehalten werden und anscheinend auch unter worst-case-Bedin-

gungen nicht in das Grundwasser verlagert werden.


4.1.4 Eintrag von Tierarzneimitteln in den Stallstaub

Ein bislang unbekannter Eintrag von Antibiotika in die Umwelt mit einem möglicherweise

größeren Risiko für den Menschen wurde für Stäube aus der Schweinehaltung nachgewiesen

und dieser Eintragsweg wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmalig beschrieben (Publika-

tion 7). Die Belastung der Stäube mit bis zu fünf verschiedenen Substanzen konnte nach

entsprechender Probenvorbereitung ebenfalls mittels HPLC-ESI-MS-MS nachgewiesen

werden. Da bei dieser Studie Staubproben aus den Jahren 1981–2000 untersucht wurden,

konnte hierdurch eine langfristige Deposition über einen bislang nichtbeachteten Weg retro-

spektiv nachgewiesen werden.

In 80% der Proben konnte Tylosin und in 65% der Proben Sulfamethazin nachgewiesen

werden. Beide Stoffe sind als Allergene bekannt (Barbera und de la Cuadra 1989, Caraffini et

al. 1994, Choquet-Kastylevsky et al. 2002, Danese et al. 1994, Hjorth et al. 1980) und könn-

ten somit zu einer gesundheitlichen Beeinträchtigung des Landwirtes durch die Inhalation von

Stallstaub beitragen. Auch die zeitweilige Exposition gegenüber Chloramphenicol, dessen

Einsatz insbesondere wegen seines genotoxischen Potenzials seit 1994 EU-weit in der Tier-

haltung verboten ist, konnte über die Analyse von Staubproben nachgewiesen werden.

Bei der zukünftigen Beurteilung von gesundheitsrelevanten Stoffen in Stallstäuben sollten

daher neben Schimmelpilzen, Getreidemilben, Endotoxinen und mineralischen Partikeln

(Nowak 1998) auch Antibiotika Berücksichtigung finden.

4.1.5 Mögliche Risiken durch den Eintrag von Tierarzneimitteln in die Umwelt

Umfassende systematische Untersuchungen zu möglichen Effekten von Antibiotika in Böden

sind aufgrund der enorm hohen Komplexität des Lebensraumes Bodens bislang nicht durch-

geführt worden. Diskutierte Effekte von Antibiotika in Böden sind Änderungen der Struktur

bzw. der Funktion mikrobieller Biozönosen (Kümmerer 2003). Auch eine Erhöhung der

Antibiotika-Resistenzgene im Genpool der Bodenmikroorganismen mit weiteren Auswirkun-

gen auf die Zusammensetzung mikrobieller Gemeinschaften könnte auftreten (Nwosu 2001).

Diese Effekte sind allerdings nur dann möglich, wenn die Antibiotika auch bioverfügbar sind

(Tolls 2001). Wie bereits erwähnt, werden Tierarzneimittel stark in Böden sorbiert. Biotische

oder abiotische Faktoren, die gegebenenfalls ihre Remobilisierung bewirken, sind bislang

nicht bekannt. Im Falle des Sulfamethazins könnten allerdings die wiederholten Einträge in


das Grundwasser im subtherapeutischen Konzentrationsbereich zu einer Resistenzbildung bei

aquatischen Bakterien beitragen.

Da bereits in der Gülle von therapierten Tieren resistente Keime vorkommen, ist die Durch-

führung kontrollierter Studien, die einen möglichen Einfluss von Antibiotika in der Gülle auf

Bodenmikroorganismen zeigen könnten, weiter erschwert. Jensen et al. (2001) fanden zwar in

Bodenbakterien (Pseudomonas spp., Bacillus cereus) erhöhte Antibiotikaresistenzraten nach

der Ausbringung von Gülle. Es wurden allerdings keine Beweise für einen horizontalen

Gentransfer gefunden und die Erhöhung der Antibiotikaresistenzrate wurde lediglich auf das

Ausbringen der Gülle zurückgeführt.

Der erstmalig nachgewiesene Eintrag von Antibiotika über Stallstäube stellt möglicherweise –

im Gegensatz zu den Einträgen von Humanarzneimitteln in Gewässer und von Tierarznei-

mitteln in Böden – ein unmittelbares Risiko für den Menschen dar. Aufgrund der retrospektiv

analysierten Staubproben muss von einer langfristigen Exposition von Landwirten z. B.

gegenüber allergen wirksamen Stoffen wie Tylosin und Sulfonamiden sowie gegenüber dem

genotoxischen Chloramphenicol ausgegangen werden. Insofern sollten diese Erhebungen

Grundlage sein für weitergehende Untersuchungen z. B. bezüglich des Allergie- oder

Resistenzstatus von Personen, die im landwirtschaftlichen Bereich beschäftigt sind.

Ein betriebswirtschaftliches Risiko kann bei der Biogaserzeugung durch die Verwendung

antibiotikahaltiger Gülle entstehen. Wiederholt wurde über Störungen beim Betrieb von

Fermentern und Biogasanlagen bei der Verwendung antibiotikahaltiger Güllen berichtet

(Laalai et al. 2002, Massé et al. 2000). Da dies zu beträchtlichen wirtschaftlichen Schäden

führen kann, wäre auch von Betreiberseite her eine antibiotikaarme Gülle wünschenswert.

Eine weitere Möglichkeit bestände darin, antibiotikabelastete Gülle z. B. durch einen neuzu-

entwickelten Schnelltest vor Ort zu identifizieren und – mit ebenfalls noch neuzuentwickelten

Verfahren – nachzubehandeln.

Zusammenfassend ist festzustellen, dass Tierarzneimittel aufgrund ihrer hohen Einsatzmen-

gen, ihrer relativ geringen Metabolisierung im Organismus und ihrer Stabilität in der Gülle in

beträchtlichen Mengen in die Umwelt gelangen können. Da eine abschließende (öko-)toxiko-

logische Risikoabschätzung derzeit nicht möglich ist (siehe auch Boxall et al. 2003 und

2004), sollte im Sinne eines vorbeugenden Boden- und Grundwasserschutzes eine Reduzie-

rung des Antibiotikaeinsatzes in der Tierhaltung realisiert werden. Dies würde auch zu einer

Reduktion der Antibiotikagehalte in Stallstäuben führen. Einen wichtigen Beitrag hierzu


könnten die „Leitlinien für den sorgfältigen Umgang mit antimikrobiell wirksamen Tier-

arzneimitteln“, die von der Bundestierärztekammer und der Arbeitsgemeinschaft der Leiten-

den Veterinärbeamten erstellt wurden, liefern (Anonymus 2000). Diese Leitlinien beinhalten

wichtige Mindestanforderungen zum Einsatz von Antibiotika. Es werden die Auswahlkri-

terien für das richtige Antibiotikum festgelegt und Hinweise für die richtige Dosierung und

Therapiedauer gegeben. Darüber hinaus beinhalten sie auch allgemeine Empfehlungen, um

insbesondere die Ausbreitung von Antibiotika-Resistenzen zu vermindern.

4.2 Problematik der Bekämpfung der Roten Vogelmilbe (Dermanyssus gallinae) in

der Legehennenhaltung

Da es bislang kein zugelassenes Tierarzneimittel zur Bekämpfung der Roten Vogelmilbe

direkt am Tier gibt, wird unter der Auflage, dass nur die Stalleinrichtungen nicht aber die

Tiere behandelt werden, das Methylcarbamat Propoxur eingesetzt. Daten zur Rückstands-

belastung von Hühnereiern nach dem bestimmungsgemäßen Gebrauch von Propoxur werden

im Rahmen dieser Arbeit erstmalig vorgestellt. Grundvoraussetzung für die Durchführung der

Studien war wiederum die Entwicklung eines spurenanalytischen Nachweisverfahrens dieses

Stoffes im Hühnerei.

Bisher wurden verschiedene Verfahren zum Nachweis von Carbamaten in Lebensmittel- und

Umweltproben entwickelt. Die Methoden der Wahl zur Identifizierung und Quantifizierung

sind die Gaschromatographie (Delgado et al. 2001) und die HPLC (Ali et al. 1993,

Chaput 1988, Krause 1985). Die hier vorgestellte Methode stellt die zur Zeit empfindlichste

zur Bestimmung von Propoxur in Eiern dar. Eine im Jahre 2000 von Carabias-Martinez et al.

publizierte Methode erlaubt zwar einen sehr empfindlichen Nachweis (2–4 µg/kg) verschie-

denster Pestizide (u. a. Atrazin, Pirimicarb und Paraoxon) im Hühnerei, aufgrund von

Matrixinterferenzen ist diese Methode jedoch nicht geeignet für Propoxur.

Die höchsten mittleren Konzentrationen wurden in den Eiern aus der Käfighaltung gefunden,

die niedrigsten in denen aus der Volierenhaltung. Insgesamt sechs Proben wiesen Konzentra-

tionen oberhalb von 50 µg/kg Vollei auf, dem derzeitigen in der Rückstands-Höchstmengen-

verordnung festgesetzten Grenzwert für Propoxur in Hühnereiern (Anonymus 1999). Fünf

dieser am höchsten belasteten Eier stammten aus Käfighaltung. Eine mögliche Erklärung für

diesen Befund ist, dass die Tiere – insbesondere bei der Volierenhaltung – mehr Raum zur


Verfügung haben und eine Behandlung der Milbenverstecke daher in größerer Entfernung zu

den Tieren durchführbar ist als bei der Käfighaltung. Eine Akkumulation des Wirkstoffes im

Hühnerei durch Aufpicken beispielsweise von Einstreumitteln, Staub oder Kot bei der

Volierenhaltung konnte nicht festgestellt werden, obwohl die Substanz im Zuge der Milben-

behandlung dreimal ausgebracht wurde und erste Untersuchungen von Staubproben eine

Belastung mit Propoxur im unteren mg/kg-Bereich zeigten. Insofern zeigt Propoxur ein

anderes Rückstandsverhalten als beispielsweise Nicarbazin und Meticlorpindol, bei denen

eine Akkumulation der Substanzen in Hühnereiern aus Bodenhaltung nachgewiesen werden

konnte (Friedrich et al. 1985, Hafez et al. 1988).

Die Propoxur-Untersuchungen zeigten auch den möglichen Einfluss der Haltungsform auf die

Höhe der Kontaminationen. Allerdings sind die Unterschiede in der Regel nur unterhalb der

gesetzlichen Höchstmengen feststellbar und dies erfordert wiederum eine empfindliche

Analytik als Grundvoraussetzung für die Durchführung solcher Studien (Hamscher und

Nau 2003).

Obwohl auch eine zweifache Überschreitung des Propoxur-Grenzwertes weniger als 2% zur

duldbaren täglichen Aufnahme der Substanz beiträgt, sollte insbesondere der derzeitige

Einsatz von Propoxur in der Käfighaltung von weiteren Schutzmaßnahmen begleitet werden.

Im Sinne eines vorbeugenden Verbraucher- und Tierschutzes wäre allerdings die Zulassung

als Tierarzneimittel zu fordern, da ein Nichtbehandeln der Legehennen beim Versprühen des

Wirkstoffes im belegten Stall praktisch unmöglich ist.

Durch geringfügige Modifizierungen des Nachweisverfahrens für Propoxur gelang es, die

Methodik auch auf Phoxim und Deltamethrin zu übertragen und vergleichbare Nachweis- und

Bestimmungsgrenzen zu erhalten. Diese beiden Stoffe sind als Ektoparasitika für verschie-

dene lebensmittelliefernde Tiere zugelassen und daher prinzipiell ebenfalls geeignet, gegen

die Rote Vogelmilbe eingesetzt zu werden. Für eine Zulassung als Tierarzneimittel – und

damit für den Einsatz im belegten Stall – muss allerdings noch ein tierartenspezifisches MRL-

Verfahren durchlaufen werden. Dieses wird derzeit von der Bayer AG für Phoxim durchge-

führt (Heine und Pospischil 2003). Vielleicht steht in naher Zukunft ein wirksames Mittel

gegen die Rote Vogelmilbe zur Verfügung, das tierschutzgerecht eingesetzt werden kann und

gleichzeitig die hohen Anforderungen an den Verbraucherschutz bezüglich etwaiger Rück-

stände im Hühnerei erfüllt.

5 Zusammenfassung 45

5 Zusammenfassung

Die hier vorgestellten Untersuchungen zeigten, dass der Einsatz beträchtlicher Mengen Tier-

arzneimittel in der intensiven Tierhaltung zum Eintrag von Tetracyclinen und Sulfonamiden

insbesondere in die Gülle und in den Boden führen kann. Im Falle des Sulfamethazins wurde

auch ein Eintrag in das Grundwasser nachgewiesen. Darüber hinaus wurde entdeckt, dass

Antibiotika gebunden an Staubpartikel in die Stallluft gelangen können.

Mittels neuentwickelter HPLC-MS-MS-Verfahren wurden Tetracycline in landwirtschaft-

lichen Nutzflächen in Konzentrationen von mehreren Hundert µg/kg nachgewiesen. Tetra-

cycline können im Boden persistente Rückstände bilden und die wiederholte Gülleausbrin-

gung kann zu einer Akkumulation im Boden führen. Eine Verlagerung von Tetracyclinen in

tiefere Bodenschichten oder in das Grundwasser wurde nicht beobachtet, da die Antibiotika

im Oberboden stark sorbiert wurden. Untersuchungen an der gleichen Fläche zeigten, dass

Sulfamethazin im Oberboden nur in Konzentrationen von wenigen µg/kg detektierbar war.

Trotz dieser sehr geringen Konzentrationen im Boden konnte Sulfamethazin wiederholt in

Grundwasserproben in 1,40 m Tiefe nachgewiesen werden. Diese Studien zeigten zum ersten

Mal den kontinuierlichen Eintrag eines Tierarzneimittels vom Boden in das Grundwasser. Der

Eintrag verschiedener Antibiotika über Stallstäube im mg/kg-Bereich wurde im Rahmen

dieser Arbeit erstmalig beschrieben. Möglicherweise liegt hierin ein bislang nicht beachtetes

unmittelbares gesundheitliches Risiko für Landwirte durch die Inhalation antibiotikabelasteter

Stäube. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um ein besseres Verständnis des

Vorkommens, des Verbleibs und des Verhaltens sowie möglicher Effekte von Tierarznei-

mitteln in der Umwelt zu gewinnen.

Zur erstmaligen systematischen Untersuchung des Propoxureinsatzes im belegten Lege-

hennenstall wurde eine selektive Probenvorbereitung sowie ein sensitives HPLC-DAD-

Verfahren zur Bestimmung von Propoxur im Hühnerei entwickelt. Nach einer praxisüblichen

Behandlung des Stalls wurden in 2,6% der untersuchten Eier Propoxurrückstände oberhalb

des Grenzwertes der Rückstands-Höchstmengenverordnung von 50 µg/kg gefunden. Die

meisten Überschreitungen und höchsten mittleren Konzentrationen wurden in Eiern aus

Käfighaltung gemessen. Insofern sollte der derzeitige Einsatz von Propoxur insbesondere in

der Käfighaltung einer kritischen Neubewertung unterzogen werden. Nach geringfügigen

Modifizierungen kann die Methode auch zum Nachweis von Phoxim oder Deltamethrin in

Eiern eingesetzt werden.

6 Summary 46

6 Summary

The investigations presented here demonstrated that the use of high amounts of veterinary

drugs led primarily to residues of tetracycline and sulfonamide antibiotics in liquid manure

and soil, and – in the case of sulfamethazine – also in ground water. Another important find-

ing from this work was, that various antibiotics used as veterinary drugs can attach to dust

particles and spread through the air of pig confinement buildings.

Newly developed sophisticated analytical HPLC-MS-MS techniques led to the detection of

tetracyclines on farmed land at concentrations of up to several hundred µg/kg soil, demon-

strating that this group of antibiotics is persistent and may accumulate in soil after repeated

fertilization with liquid manure from intensive pig farming. These field studies gave no proof

of leaching of these compounds into deeper soil segments or into groundwater because of the

strong sorption of the drugs in topsoil. By investigating the same fields it could be shown that

sulfamethazine occurred in significantly lower concentrations (a few µg/kg) in the plough

layer. Although apparently present in soil at very low concentrations, sulfamethazine could be

detected in groundwater samples 1.40 m below soil surface. This provides the first direct

evidence for a continuous leaching of a veterinary drug from soil into groundwater under field

conditions. Furthermore, a new entrance route for veterinary drugs into the environment has

been discovered. Various antibiotics used as veterinary drugs can attach to dust particles in

the mg/kg-range and spread through the air of pig confinement buildings. This retrospective

study provides the first evidence of a heretofore unsuspected direct risk for human health

arising from the inhalation of dust contaminated with a cocktail of antibiotics. Further investi-

gations are highly recommended to obtain deeper insights into the occurrence, fate and

behaviour of veterinary drugs in the environment, as well as possible effects.

It was also demonstrated that HPLC-DAD combined with a selective sample cleanup is a

sensitive method for the detection of propoxur in eggs even at the low µg/kg level. The appli-

cation of the newly developed method demonstrated that the current use of this pesticide in

henhouses can lead to significant residues in eggs even above maximum residue levels.

Therefore, the present application of propoxur (especially in battery cages) should be criti-

cally reevaluated. With slight modifications, the method developed here can also be succes-

fully applied to the detection of phoxim and deltamethrin in eggs.


7 Literaturverzeichnis

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8 Darstellung des eigenen Anteils an den wissenschaftlichen Arbeiten

Der Anteil der beteiligten Autorinnen und Autoren an den Publikationen 1–8 wird wie folgt

differenziert:

1. Idee, Versuchsdesign

2. Methodenentwicklung

3. Versuchsdurchführung

4. Auswertung, Diskussion

5. Erstellen des Manuskripts

6. Korrespondierender Autor

Publikation 1:

Hamscher G, Sczesny S, Abu-Qare A, Höper H, Nau H (2000): Stoffe mit pharmakologischer

Wirkung einschließlich hormonell aktiver Substanzen in der Umwelt: Erster Nachweis von

Tetracyclinen in güllegedüngten Böden. Deutsche Tierärztliche Wochenschrift 107, 332–334.

1. Idee, Versuchsdesign: Hamscher, Höper, Abu-Qare

2. Methodenentwicklung: Hamscher, Sczesny

3. Versuchsdurchführung: Hamscher, Sczesny

4. Auswertung, Diskussion: Hamscher, Sczesny, Höper, Nau

5. Erstellen des Manuskripts: Hamscher

6. Korrespondierender Autor: Hamscher

Publikation 2:

Hamscher G, Sczesny S, Höper H, Nau H (2002): Determination of persistent tetracycline

residues in soil fertilized with liquid manure by high-performance liquid chromatography

with electrospray ionization tandem mass spectrometry. Analytical Chemistry 74, 1509–1518.

1. Idee, Versuchsdesign: Hamscher, Höper


3. Versuchsdurchführung: Hamscher, Sczesny

4. Auswertung, Diskussion: Hamscher, Sczesny, Höper, Nau




Publikation 3:

Hamscher G, Pawelzick HT, Höper H. (2003): Abschlussbericht des UBA-Forschungs-

projektes Tierarzneimittelanalysen gemäß BLAC-Untersuchungsprogramm“ (FKZ 201 91

217). Eingereicht: Umweltbundesamt


2. Methodenentwicklung: Hamscher

3. Versuchsdurchführung: Pawelzick, Hamscher

4. Auswertung, Diskussion: Hamscher, Pawelzick, Höper

5. Erstellen des Manuskripts: Hamscher, Pawelzick


Publikation 4:

Höper H, Kues J, Nau H, Hamscher G (2002): Eintrag und Verbleib von Tierarzneimittel-

wirkstoffen in Böden. Bodenschutz 7, 141–148.



3. Versuchsdurchführung: Hamscher

4. Auswertung, Diskussion: Hamscher, Höper, Kues, Nau

5. Erstellen des Manuskripts: Höper, Hamscher

6. Korrespondierender Autor: Höper

Publikation 5:

Hamscher G, Pawelzick HT, Höper H, Nau H (2003): Different behavior of tetracyclines and

sulfonamides in sandy soils after repeated fertilization with liquid manure. Eingereicht: Envi-

ronmental Toxicology and Chemistry (September 2003)


2. Methodenentwicklung: Hamscher, Pawelzick


4. Auswertung, Diskussion: Hamscher, Pawelzick, Höper, Nau




Publikation 6:

Sczesny S, Nau H, Hamscher G (2003): Residue analysis of tetracyclines and their metabo-

lites in eggs and in the environment by HPLC coupled with a microbiological assay and

tandem mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry 51, 697–703.

1. Idee, Versuchsdesign: Hamscher, Nau


3. Versuchsdurchführung: Sczesny, Hamscher

4. Auswertung, Diskussion: Hamscher, Sczesny, Nau

5. Erstellen des Manuskripts: Sczesny, Hamscher


Publikation 7:

Hamscher G, Pawelzick HT, Sczesny S, Nau H, Hartung J. (2003):

Antibiotics in dust originating from a pig fattening farm: a new source of health hazard for

farmers? Environmental Health Perspectives 111, 1590–1594.

1. Idee, Versuchsdesign: Hamscher, Hartung

2. Methodenentwicklung: Hamscher, Pawelzick, Sczesny


4. Auswertung, Diskussion: Hamscher, Pawelzick, Hartung, Nau



Publikation 8:

Hamscher G, Prieß B, Hartung J, Nogossek MI, Glünder G, Nau H (2003): Determination of

propoxur residues in eggs with HPLC-DAD after treatment of stocked housing facilities for

the poultry red mite (Dermanyssus gallinae). Analytica Chimica Acta 483, 19–26.

1. Idee, Versuchsdesign: Hamscher, Hartung, Nau


3. Versuchsdurchführung: Prieß, Hamscher, Nogossek, Glünder

4. Auswertung, Diskussion: Hamscher, Nau



9 Ausführliche Darstellung der Ergebnisse (Publikationen 1–8) 55

9 Ausführliche Darstellung der Ergebnisse (Publikationen 1–8)

Publikation 1

Hamscher G, Sczesny S, Abu-Qare A, Höper H, Nau H (2000):

Stoffe mit pharmakologischer Wirkung einschließlich hormonell aktiver Substan-

zen in der Umwelt: Erster Nachweis von Tetracyclinen in güllegedüngten Böden.

Deutsche Tierärztliche Wochenschrift 107, 332–334.

Publikation 2

Hamscher G, Sczesny S, Höper H, Nau H (2002):

Determination of persistent tetracycline residues in soil fertilized with liquid

manure by high-performance liquid chromatography with electrospray ioniza-

tion tandem mass spectrometry.

Analytical Chemistry 74, 1509–1518.

Determination of Persistent Tetracycline Residuesin Soil Fertilized with Liquid Manure byHigh-Performance Liquid Chromatography withElectrospray Ionization Tandem MassSpectrometryGerd Hamscher,*,† Silke Sczesny,† Heinrich Ho1per,‡ and Heinz Nau†

Department of Food Toxicology, School of Veterinary Medicine, Bischofsholer Damm 15, D-30173 Hannover, Germany, andInstitute of Soil Technology Bremen, Geological Survey of Lower Saxony (NLfB), Friedrich-Missler-Strasse 46/48,D-28211 Bremen, Germany

Little is known about the occurrence and the fate ofveterinary drugs in the environment. Therefore, a liquidchromatography/tandem mass spectrometry method wasdeveloped and employed to investigate in detail thedistribution and persistence of the frequently used tetra-cyclines and tylosin in a field fertilized with liquid manureon April 2000 and April 2001; soil sampling was per-formed in May 2000, November 2000, and May 2001.We detected 4.0 mg/kg tetracycline and 0.1 mg/kgchlortetracycline in the liquid manure of April 2000, aswell as comparable amounts in the liquid manure of April2001. In the soil samples of May 2001, the highestaverage concentrations of 86.2 (0-10 cm), 198.7 (10-20 cm), and 171.7 µg/kg (20-30 cm) tetracycline and4.6-7.3 µg/kg chlortetracycline (all three sublayers) werefound. At soil depths between 30 and 90 cm, as well asin soil or groundwater, tetracyclines could not be detected.In addition, oxytetracycline and tylosin could not bedetected in any sample investigated. We conclude thattetracyclines enter the environment in significant concen-trations via repeated fertilizations with liquid manure,build up persistent residues, and accumulate in soil.Therefore, tetracyclines may have a potential risk andinvestigations on the environmental effects of these anti-biotics are necessary.

Pharmaceuticals in the environment are of growing scientificinterest worldwide.1 In both human and veterinary medicine, alarge number of drugs are used extensively. Substance classeswith a possible environmental impact include antibiotics, antipara-sitic agents, and hormones. Estimations of the European Federa-tion of Animal Health (FEDESA) reveal that, in 1999, approxi-mately 8500 tons of antibiotics in human medicine and 4700 tonsin veterinary medicine were used in the European Union (includ-

ing Switzerland).2 After excretion, these drugs and their metabo-lites can enter the environment via several pathways.3 In certaininstances, drugs used in human medicine are most frequentlyreleased by passing sewage treatment plants and reaching surfacewaters. Investigations performed during the last two decades showthat more than 40 different drugs can be found in river water, ingroundwater, and even in drinking water sources from thenanogram per liter to the microgram per liter range (for extensivereview, see refs 1, 4, and 5). Currently, intense work has beenundertaken toward the development of analytical methods espe-cially for the detection of various antibiotics (originating fromhuman and veterinary medicine) in the aquatic environmentincluding urban wastewater.6,7 These methods and the obtaineddata are urgently needed for a sound risk assessment of drugs inthe environment.

Veterinary drugs can also enter the environment directly byspreading liquid manure used as fertilizer. Recently, it was shownthat tetracycline and sulfadimidine are present in liquid manureat concentrations up to 20 and 40 mg/L, respectively, afterapplication of these drugs in recommended dosages.8-9 Despitethese observations, there is still very little known about theconcentrations and the fate of these veterinary drugs in soil.Chlortetracycline has been shown to persist in soil; however, thiswas dependent on temperature. In one particular study, a standardsolution of chlortetracycline was mixed with chicken feces toobtain a final concentration of 5.6 mg/kg in soil, and after 30 days,44% remained at 30 °C, 88% at 20 °C, and no degradation occurred

* Corresponding author: (tel) (++49)(+511)-856-7784; (fax) (++49)(+511)-856-7680; (e-mail) [email protected].

† School of Veterinary Medicine.‡ Institute of Soil Technology Bremen.

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at 4 °C.10 In laboratory studies, it was demonstrated that oxytetra-cycline is strongly adsorbed to soil and thus leaching of thiscompound into deeper soil segments seems to be unlikely.11

At present, there are no existing field studies that haveobserved the accumulation of antibiotics such as tetracyclines insoil and the possible contamination of groundwater after fertiliza-tion with liquid manure. One reason for this lack of knowledge isthat there is no reliable method available to selectively detect thesedrugs in liquid manure, soil, and soil water in the microgram perkilogram range. Therefore, a method was developed for themeasurement of tetracyclines and tylosin (molecular structuresshown in Figure 1) in these compartments. In a pilot study usingthe newly developed high-performance liquid chromatographycombined with electrospray ionization tandem mass spectrometry(LC-ESI-MS-MS) methodology (the latter was recently dem-onstrated as a very useful method for the detection of varioustetracyclines12), tetracycline and chlortetracycline were detectedin agricultural fields of several so-called “long-term soil monitoringareas” fertilized with liquid manure.13,14 The samples were obtainedin February, about 4-5 months after the last application of liquidmanure. These preliminary findings revealed that tetracyclinesoccur in the environment and that the detected amounts in several

areas were higher than the so-called “phase I trigger value” of 10µg/kg soil as recommended by the European Agency for theEvaluation of Medicinal Products (EMEA) until May 2001.According to this recommendation, ecotoxicological tests mustbe carried out prior to the final registration of a new veterinarydrug, when this trigger value is exceeded.15

In the present paper, we provide a description of the methodsdeveloped for the extraction and determination of frequently useddrugs oxytetracycline, tetracycline, chlortetracycline, and tylosinin various matrixes including soil, liquid manure, soil water, andgroundwater. Another aim of this work involved the detailed andrepeated investigation of an agricultural field that was mainlyfertilized with liquid manure originating from a pig-fattening farm.In addition, the persistence of tetracycline and chlortetracyclinein the soil stored for up to 12 months under defined conditionswas determined. In the last part of this investigation, analysis oftetracyclines in air-dried liquid manure aggregates was under-taken. This was primarily achieved in order to observe whetherhigher concentrations of antibiotics could be expected in theseaggregate samples compared to bulk soil.

EXPERIMENTAL SECTIONChemicals. Acetonitrile (J.T. Baker, Griesheim, Germany) and

ethyl acetate (Aldrich, Munich, Germany) were of HPLC grade,and ammonium acetate, citric acid, formic acid, sodium hydroxide(all obtained from Merck, Darmstadt, Germany), and disodiumethylenediaminetetraacetate (Sigma, Munich, Germany) were ofanalytical reagent grade. Water was prepared in-house by a Milli-Qsystem (Millipore, Eschborn, Germany). Oxytetracycline, tetra-cycline, and chlortetracycline (as their hydrochlorides) and tylosintartrate were obtained from Sigma. Stock solutions of all standardswere prepared by dissolving 1 mg of each drug in 1 mL ofmethanol. The stock solutions were stored at -80 °C and werestable for at least 2 months. Working dilutions were preparedfreshly on the day of use.

Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry andLiquid Chromatography-MS(3) Spectrometry and Quantifica-tion. Mass spectrometry was carried out using a LCQ ion trapwith an electrospray ionization source (Finnigan Mat, San Jose,CA). Standard compounds (10 ng/µL) were infused through anintegrated syringe pump at a flow rate of 10 µL/min for tuningthe mass spectrometer and optimizing capillary temperature,sheath gas, and auxiliary gas flow rates. The source polarity wasset positive for all compounds; the spray needle voltage was 5kV. Drying gas was nitrogen generated from pressurized air inan Ecoinert 2 ESP nitrogen generator (DWT-GmbH, Gelsen-kirchen, Germany). The optimized conditions were as follows:sheath gas flow was set at 100 units, the auxiliary gas was turnedoff, and the capillary temperature was 150 °C. LC, MS-MS, andMS(3) parameters are summarized in Table 1. MS(3) is a techniquethat can be exclusively performed on ion trap mass spectrometers.Briefly, a product ion resulting from a MS-MS experiment canbe trapped, once more fragmented, and the obtained ions areregistered.(10) Gavalchin, J.; Katz, S. E. J. AOAC Int. 1994, 77, 481-485.

(11) Rabølle, M.; Spliid, N. H. Chemosphere 2000, 40, 715-722.(12) Kamel, A. M.; Brown, P. R.; Munson, B. Anal. Chem. 1999, 71, 968-977.(13) Kleefisch, B.; Kues, J. Arbeitshefte Boden 1997, 2, 1-122.(14) Hamscher, G.; Sczesny, S.; Abu-Qare, A.; Hoper, H.; Nau, H. Deut. Tierarztl.

Woch. 2000, 8, 332-334.

(15) European Union. Note for guidance: environmental risk assessment ofveterinary medical products other than GMO-containing and immunologicalproducts. EMEA/CVMP/055/96; EMEA, London, 1996.

Figure 1. Molecular structures of the three investigated tetra-cyclines, their corresponding reversible epimers, and tylosin.

1510 Analytical Chemistry, Vol. 74, No. 7, April 1, 2002

The HPLC system employed was a gradient system consistingof a Thermoquest P4000 pump, an AS3000 autosampler (San Jose,CA, and a Puresil C18 column (5 µm, 4.6 × 150 mm, Waters Corp.,Milford, MA) operated at 23 °C. The flow of 1 mL/min was split1:10 before entrance into the mass spectrometer. The mobilephase consisted of 0.5% formic acid in water with 1 mM am-monium acetate (solvent A, pH 2.5), and acetonitrile (solvent B).The gradient run was 0-50% B in 9 min and then held at 50% Bfor 1 min. After each run, the column was rinsed for 3 min with99% acetonitrile and reequilibrated for 12 min with solvent A. Theinjection volume was 8 µL for soil and water samples and 1-2 µLfor liquid manure samples. The autosampler was rinsed after eachinjection with 3 mL of 90% methanol/10% 10 mM oxalic acid inwater.

Calibration curves constructed for oxytetracycline, tetracycline,chlortetracycline, and tylosin ranged from 0.1 to 10 ng per injectionand were linear, with r2 > 0.99 for the MS-MS procedure.Quantification was obtained by comparing the peak areas of thesample with that of the external calibration curves, and all datawere corrected for recovery.

Sampling of Soil, Dried Liquid Manure Aggregates, SoilWater, and Groundwater. In May 2000, November 2000, andMay 2001, soil samples were collected from an agricultural fieldin an area with intensive livestock farming in northern Germany.The site is part of the soil monitoring project of Lower Saxony,and soil properties and land use are well documented since 1993.13

The sandy soil has sand, clay, and organic carbon contents of91.6, 2.4, and 1.8%, respectively. The pH(CaCl2) is 4.5. Corn for silagewas grown in the years from 1999 to 2001. The field is regularlyfertilized with liquid manure at a rate of 30-50 m3/ha per year. Afew weeks prior to the spring samplings, the field was fertilizedwith approximately 40 and 30 m3 liquid manure, respectively.Between April 2000 and April 2001, no liquid manure fertilizationoccurred. Samples were collected in four specifically marked areasof 16 × 16 m (see Figure 2) at depths of 0-10, 10-20, 20-30,30-60, and 60-90 cm below the soil surface. For subsoil sampling(30-90 cm), the material of the plough layer was removed to avoidcontamination of the samples with antibiotic-containing topsoil.After an intensive soil survey of the field in a 25 × 25 m grid,subplots were chosen with similar soil properties, especiallyconcerning the soil profile, and were positioned at least 100 maway from the field border.

Samples were immediately transported under cooled conditionsto the laboratory and stored in the dark at 4 °C prior to analysis.In addition, samples of the liquid manure from April 2000 and2001 were analyzed for antibiotics. To investigate the possibledegradation of the antibiotics under laboratory conditions, the soilsampled in May 2000 was stored for 6 and 12 months at 4 °C inthe dark before analysis.

In May 2000, dried liquid manure aggregates from the soilsurface, as well as soil samples underneath the aggregates at0-10-, 10-20-, and 20-30-cm depths, were also obtained asdescribed above. However, these samples were from another threefields recently fertilized with liquid manure originating from pigs(areas A and B) or cattle (area C) in the neighborhood of thesoil-monitoring plot.

Groundwater was sampled at a depth of 200-240 cm belowthe surface using a PTFE cylinder (outer diameter 20 mm, innerdiameter 8 mm, and 150-mm length with slits at a width of 0.5mm on the sides, closed on the bottom, and with a tube connectionon top) and a PTFE tube (300-cm length, 4-mm inner diameter)connected to a vacuum pump. Groundwater was sampled in May2000, November 2000, and June 2001. The brown glass bottles

Table 1.

(A) Retention Times (RT) and Optimized MS-MS Parameters for the Determination ofVarious Tetracyclines and Tylosin in Liquid Manure, Soil, Soil Water, and Groundwater

compoundRT

(min)precursor

mass (m/z)collision

energy (%)product ions (m/z)

(rel abundance in %)

oxytetracycline 7.06 461 20 426 (8), 443 (100), 444 (8)tetracycline 7.39 445 20 410 (6), 427 (100), 428 (5)chlortetracycline 8.35 479 27 444 (70), 461 (56), 462 (100)tylosin 9.47 917 28 772(100), 773 (4)

(B) Optimized LC-MS(3) Parameters for the Confirmation ofVarious Tetracyclines in Liquid Manure and Soil

compoundprecursor

mass 1 (m/z)collision

energy (%)precursor

mass 2 (m/z)collision

energy (%)

oxytetracycline 461 45 426 27tetracycline 445 45 410 27chlortetracycline 479 45 444 27

Figure 2. Diagrammatical representation of the soil-monitoring plot(100 × 100 m) within a field of ∼5 ha. The marked areas indicate thefour specific subplots (numbered 1-4) of 16 × 16 m from whichsamples were collected for analysis.

Analytical Chemistry, Vol. 74, No. 7, April 1, 2002 1511

contained 2.5 mL of 5 M ammonium acetate. The initial fractionof 250 mL was rejected before sampling 250 mL for analysis.

Soil water was sampled at a depth of 80 cm below the surfaceusing P80 ceramic suction samplers (Staatliche Porzellan Manu-factur, Berlin, Germany). The samplers were placed in the fieldin autumn. In May and October 2000, 100 mL of soil water waspumped into glass bottles containing 1 mL of 5 M ammoniumacetate using a vacuum of 200-400 hPa.

Extraction Procedures. General Remarks. Tetracyclinesare well known to form chelate complexes with metal ions andbind to proteins and silanol groups.16 Therefore, all glassware usedwas heated for 2 h at 450 °C, cooled, rinsed with 2.5 mL of asaturated methanolic EDTA solution, and air-dried prior toanalysis. Sample preparation and measurement were performedon the same day because the solubility of the extracted tetracy-clines during freezing and thawing was variable.

Extraction of Soil and Liquid Manure Samples. Prior tothe extraction of soil, the dry weight was investigated as follows:20 g of each soil sample was incubated at 100 °C for ∼24 h untilconstant weight was reached. The extraction procedure for thesoil and liquid manure samples was developed based on a methodfor the extraction of tetracyclines from food.17 One gram of soilor liquid manure was intensively vortexed with 1.2 mL of 1 Mcitrate buffer (pH 4.7) in a 10-mL glass tube for 1 min. Sixmilliliters of ethyl acetate was added, again intensively vortexedfor 1 min, and then kept for another 15 min in an automatic shaker(KS 125 basic, IKA Labortechnik, Staufen, Germany). The samplewas centrifuged for 10 min at 1000g, and the organic phase wastransferred into a 25-mL flask. The extraction procedure wasrepeated with another 6 mL of ethyl acetate, and the combinedorganic phases were evaporated to dryness under vacuum at 40°C. The dry residue was redissolved in 200 µL (1 mL for liquidmanure samples) of 90% acetonitrile/10% 100 mM ammoniumacetate in water. Prior to LC-MS-MS analysis, the samples werekept at 10 °C in the autosampler.

Recovery studies were carried out with control sandy soilspiked at the 5, 10, 25, 50, and 100 µg/kg level. The control soilwas prepared from 10 antibiotic-free sandy soil samples taken atdepths of 0-10, 20-30, and 20-30 cm. Therefore, aliquots of 50g of each sample were carefully mixed. The mean total organiccontent of the control sandy soil was 2% and close to that of theareas investigated. The recovery rate was calculated as an averageof eight experiments at each concentration.

Day-to-day variation of the method was tested with eight sandysoil samples containing tetracycline (average concentrations from9.1 to 203 µg/kg) and chlortetracycline (average concentrationsfrom 6.0 to 69.9 µg/kg). The day-to-day variation was calculatedusing five to six independent experiments.

Recovery studies for liquid manure were carried out with aresidue-free liquid manure at the 0.2 and 1 mg/kg level originatingfrom a pig-fattening farm. The recovery rate was calculated as anaverage of eight experiments at both concentrations.

Extraction of Water Samples. Sample preparation wasperformed on a Baker column processing system SPE-12G using200 mg of Baker SDB 1 solid-phase cartridges (Baker, Griesheim,Germany). The cartridges were conditioned with 10 mL of

methanol, pH 2.5 (the pH was adjusted with acetic acid), followedby 5 mL of methanol and equilibrated with 10 mL of 0.5 M citricacid buffer. A 25-50-mL aliquot of soil water or groundwatersamples was diluted with the same volume of 1 M citric acid buffer(pH 4.7), and the resultant mixture was stirred for 1 min. Theloaded cartridge was washed with 10 mL of distilled water followedby 2 mL of methanol. The elution of the retained antibiotics wasperformed with 10 mL of acidified methanol. The eluate wasevaporated to dryness and the residue dissolved in 200 µL ofmethanol. Recovery studies were carried out with a mixture of10 antibiotic-free soil water samples at the 0.2 and 1 µg/L level.The recovery rate was calculated as an average of eight experi-ments at each concentration.

Statistical Analysis. Two comparisons were carried out toinvestigate the potential influence of soil depth and sampling orstorage time on the antibiotic concentration in the soil. First, thesoil samples of May 2000, November 2000, and May 2001 werecompared between the varying soil depths and sampling times.Second, the soil samples of May 2000 were compared after storagefor 6 and 12 months. All comparisons were tested with two-wayanalysis of variance (ANOVA) using the Sigma Stat software(Program version 2.0, Build 2.0173, Jandel Corp., San Rafael, CA).The Student-Newman-Keuls method was employed as a post-ANOVA test with the level of significance set at P < 0.05.

RESULTS AND DISCUSSIONAccuracy, Precision, Quantification, and Detection Limits

for LC-MS-MS. HPLC employing a simple gradient systemcombined with ESI-MS-MS allowed the sensitive and selectivedetermination of the investigated antibiotics in soil, liquid manure,and water samples. The mean recoveries and the standarddeviations for the various matrixes tested are given in Table 2.

The limit of quantification based on a signal-to-noise ratiogreater than 6 was 5 µg/kg for all compounds in soil, and thelimits of detection based on a signal-to-noise ratio greater than 3were approximately 2 µg/kg for chlortetracycline and 1 µg/kgfor the other compounds. In Figure 3a and b, LC-MS-MSchromatograms and tandem mass spectra of a standard sample(representing 0.5 ng of each compound on column) and a soilsample respectively containing tetracycline and chlortetracyclineare shown. There were no soil samples from our field studieswhere oxytetracycline or tylosin could be detected. Consequently,the variations from day to day were determined in eight soilsamples containing tetracycline and chlortetracycline only (Table3). The relative standard deviations (RSDs) calculated from theseexperiments ranged from 10.1 to 49.7% and were independent ofthe concentration range. It should be noted that soil is not sucha homogeneous matrix compared to water, and due to theadsorptive nature of tetracyclines, local peak concentrations inthe soil could not be excluded. Taking this into account, fourindependent samples from four marked areas within the field wereinvestigated for each data point in Table 4. The RSDs obtainedwith this sampling procedure for the field samples were in acomparable range when directly measured.

In water samples (including groundwater and matrix-rich soilwater), the limit of quantification based on a signal-to-noise ratiogreater than 6 of 0.1 µg/L for all compounds was obtained. Thepre-elution of the SDB-1 cartridges with methanol led to very cleanextracts for the final LC-MS-MS analysis. During sample

(16) Oka, H.; Ito, Y.; Matsumoto, H. J. Chromatogr., A 2000, 882, 109-33.(17) Cooper, A. D.; Stubbings, G. W. F.; Kelly, M.; Tarbin, J. A.; Farrington, W.

H. H.; Shearer, G. J. Chromatogr., A 1998, 812, 312-326.


preparation, a significant epimerization of tetracycline and chlo-rtetracycline occurs; therefore, these epimers were taken intoconsideration when the water was analyzed. The limit of detectionbased on a signal-to-noise ratio greater than 3 was 0.05 µg/L forall compounds in the water samples. Recently, comparablemethods based on solid-phase extraction (as a powerful samplepretreatment step) were developed for the analysis of tetracyclinesand sulfonamides in groundwater and surface water employingLC-MS18 and for the analysis of tetracyclines in groundwater andlagoon water employing LC-MS-MS.19 Lindsey et al.18 obtaineda limit of quantitation of 0.1 µg/L for each tetracycline, and Zhuet al.19 reported method detection limits for the tetracyclines from0.2 to 0.28 µg/L.

The limit of quantification for liquid manure based on a signal-to-noise ratio greater than 6 was 0.05 mg/kg for the tetracyclinesand the limit of detection was ∼0.02 mg/kg. In addition totetracycline, 15-20% of the epimer 4-epi-tetracycline was foundin the liquid manure samples (Figure 4). Due to the very lowrecoveries in liquid manure, the sample pretreatment for tetra-cyclines cannot be recommended for tylosin in this matrix.

In the case of liquid manure, an example is shown for theemployment of the highly selective LC-MS(3) procedure as furtherconfirmation of the findings from the MS-MS method (Figure

4). As a result of the analytical system, LC-MS(3) is ∼7-fold lesssensitive than a comparable MS-MS technique and is onlyrecommended, for example, for the confirmation of tetracyclineconcentrations greater than 40 µg/kg in soil.

Optimization and Applicability of the Method. The highrecovery rates of about 60-70% for oxytetracycline, chlortetra-cycline, and tylosin in such a difficult matrix as soil, in combinationwith RSDs of less than 30% in spiked soils, makes this methodvery useful for the analysis of antibiotics in soil even in the low-microgram per kilogram range. A mean recovery rate fortetracycline of 38% may be the result of a much stronger or amore specific adsorption of this compound to the soil matrixcompared to oxytetracycline and chlortetracycline.

During method development, it was established that agentssuch as EDTA or strong acids such as hydrochloric acidswhichdestroy the chelate-binding properties of tetracycline to metallicionssdid not affect the recovery rates in soil. The final modifiedextraction procedure (using a high molar citric acid buffer at pH4.7) was based on a method recently developed for the analysisof tetracyclines in food.17 It may therefore be that tetracycliness

like sulfonamides20sare mainly adsorbed to organic constituentsof soil, e.g., to humic materials as demonstrated by Sithole andGuy.21 This specific binding in soil would also explain the generallyvery good recoveries of tetracyclines in liquid manure. Further

(18) Lindsey, M. E.; Meyer, M.; Thurman, E. M. Anal. Chem. 2001, 73, 4640-4646.

(19) Zhu, J.; Snow, D. D.; Cassada, D. A.; Monson, S. J.; Spalding, R. F. 2001,J. Chromatogr., A 928, 177-86.

(20) Langhammer, P. J.; Buning-Pfaue, H. Lebensmittelchem. Gerichtl. Chem.1989, 43, 108.

(21) Sithole, B. B.; Guy, R. D. Water, Air, Soil Pollut. 1987, 32, 315-321.

Table 2. Recoveries ( Standard Deviations and the Corresponding Relative Standard Deviations of the StudiedCompounds in Soil, Water, and Liquid Manurea

oxytetracycline tetracycline chlortetracycline tylosin

concnrecovery

(%)RSD(%)

recovery(%)

RSD(%)

recovery(%)

RSD(%)

recovery(%)

RSD(%)

In Soil5 µg/kg 66.7 ( 19.2 28.8 33.8 ( 9.7 28.6 76.0 ( 15.8 20.8 63.9 ( 8.2 12.910 µg/kg 74.2 ( 15.1 20.3 33.7 ( 8.0 23.6 57.3 ( 11.0 19.2 67.4 ( 8.4 12.425 µg/kg 85.9 ( 14.7 17.1 46.5 ( 5.1 11.1 66.4 ( 10.0 15.0 63.2 ( 9.6 15.250 µg/kg 71.2 ( 6.1 8.5 33.2 ( 2.5 7.5 72.1 ( 4.7 6.5 66.1 ( 2.5 3.8100 µg/kg 73.0 ( 8.4 11.6 41.2 ( 3.5 8.6 75.7 ( 5.8 7.7 60.3 ( 4.8 7.9

In Water0.2 µg/L 90.0 ( 17.4 19.3 98.2 ( 11.0b 11.2 86.6 ( 15.2b 17.6 68.6 ( 11.1 16.21 µg/L 76.9 ( 9.5 12.4 86.1 ( 14.2b 16.5 89.7 ( 9.2b 10.3 72.0 ( 13.0 18.1

In Liquid Manure0.2 mg/kg 87.3 ( 6.0 6.9 82.3 ( 5.9b 7.2 94.1 ( 8.5b 9.1 c c1 mg/kg 100.2 ( 2.1 2.1 104.2 ( 3.4b 3.3 127.1 ( 9.7b 7.6 c c

a Values are the mean of eight independent determinations at each concentration. b Including their 4-epimers. c The extraction procedure appliedfor the analysis of tetracyclines is not suitable for the analysis of tylosin in liquid manure.

Table 3. Day-to-Day Variation of the LC-MS-MS Method in Soil Samples Containing Tetracycline andChlortetracycline in Various Amounts

sample ntetracycline

(µg/kg)RSD(%) sample n

chlortetracycline(µg/kg)

RSD(%)

S0062 6 9.1 ( 4.4 48.9 S0016 6 6.0 ( 1.4 23.4S0106 6 9.4 ( 3.5 36.9 S0015 6 7.4 ( 2.3 31.0S0107 5 12.8 ( 6.1 47.2 S0023 5 7.7 ( 0.8 10.1S0082 6 35.5 ( 10.9 30.8 S0030 6 8.1 ( 0.8 10.4S0015 6 54.8 ( 23.5 43.0 S0062 6 13.9 ( 4.5 32.2S0016 6 66.2 ( 13.6 20.5 S0106 6 27.3 ( 7.7 28.1S0030 6 135.6 ( 53.9 39.7 S0107 5 38.8 ( 19.3 49.7S0023 5 203.0 ( 60.5 29.8 S0082 6 69.9 ( 26.7 38.2


Figure 3. (a) Left panel: reconstructed ion chromatograms of oxytetracycline (OTC), tetracycline (TC), chlortetracycline (CTC), and tylosin(TYL) in a standard solution with 0.5 ng of each compound on column analyzed with LC-MS-MS (NL, normalized level). Right panel: thecorresponding tandem mass spectra of OTC, TC, CTC, and TYL. (b) Left panel: reconstructed ion chromatograms of TC and CTC in a soilsample containing 92.7 µg/kg TC and 5.4 µg/kg CTC, where oxytetracycline and tylosin were not detectable, analyzed with LC-MS-MS. Rightpanel: the corresponding tandem mass spectra of TC and CTC.


experiments will be performed to validate these findings and toobserve the mechanisms by which tetracyclines may be specifi-cally desorbed. Nevertheless, the RSDs for the analysis oftetracyclines in soil are at an acceptable level over a broadconcentration range. Suitable sample preparation was also devel-oped for soil water and liquid manure. Good recovery rates (withthe exception of tylosin in liquid manure) and clear MS-MSspectra were obtained in the analysis of these environmentalsamples (Figures 3b and 4). Further confirmation of the concen-trations of tetracycline and its epimer can be obtained in ion trapmass analyzers with LC-MS(3) procedures. Although the spectrafor tetracycline and its epimer look very similar in the MS-MSmode, very selective information about the compounds is availablein the LC-MS(3) mode (Figure 4b). This impressive tool for thefurther confirmation of tetracycline residues in various environ-mental samples should also have applicability to other samplematrixes, e.g., food samples.

Occurrence, Distribution and Fate of Tetracyclines andTylosin in Liquid Manure and Soil. The data presented heredemonstrate, for the first time, that tetracyclines not only occurin significant amounts in soil after repeated fertilizations with liquidmanure but also persist and accumulate in the environment.

Oxytetracycline and tylosin could not be detected in any liquidmanure or soil sample investigated. The liquid manure sampledin April 2000 contained 4.0 mg/kg tetracycline and 0.1 mg/kgchlortetracycline, which was similar to the concentrations of theliquid manure sampled in April 2001 (i.e., 3.2 mg/kg tetracyclineand 0.09 mg/kg chlortetracycline).

Our investigations show that the antibiotics are spread evenlyover the whole field: the RSDs between the four subplots variedbetween 17.7 and 72.4% for tetracycline and 6.4 and 55.2% forchlortetracycline (calculated from Table 4). This was similar to

the day-to-day variation between analyses of comparable samplesfrom the same subplot, which ranged from 21 to 49% fortetracycline and 10 to 50% for chlortetracycline (Table 3).Considering the crude method of applying and mixing the liquidmanure into the soil by the farmer, these variations in the fieldare surprisingly low.

There was no statistically significant difference between thetetracycline concentrations in the field in May and November 2000,indicating that there had been no observable degradation of thiscompound during the summer months, when no liquid manurefertilization had occurred. After the liquid manure fertilization inApril 2001, the tetracycline concentrations were significantlyhigher than in November 2000 and May 2000 (p < 0.05). Thehighest mean concentrations of tetracycline in the soil of up to198.7 µg/kg were also detected in May 2001 (Table 4). Themaximum concentration in one of the specifically marked areaswas 307.4 µg/kg.

At all three sampling dates, the antibiotics were only found inthe first 30 cm of the topsoil. This indicates that the compounds,spread on the soil surface by liquid manure amendment, areincorporated into the topsoil and that no tetracyclines aretransferred into the subsoil, e.g., by infiltration water. Thechlortetracycline concentrations were up to 50-fold lower than thetetracycline concentrations and did not differ between the threesampling dates when the samples were immediately analyzed.

Storage for 12 months at 4 °C had no statistically significanteffect on the tetracycline concentrations. However, this was notthe case for chlortetracycline concentrations (p < 0.05). Therewas an obvious but nonsignificant increase in tetracycline con-centration of samples stored for 12 months at 4 °C compared tothose obtained immediately after sampling or after storage for 6months. In light of this observation, a release of tetracyclines

Table 4. Investigation of a Long-Term Soil Monitoring Area with LC-MS-MS after Repeated Fertilization with LiquidManure Containing 4 mg/L Tetracycline and 0.1 mg/L Chlortetracycline in April 2000 and 3.2 mg/kg TC and 0.09mg/kg CTC in April 2001a,b

sample collection

soil depth (cm) in May 2000 in Nov 2000 in May 2001

in May 2000,stored for 6

months at 4 °C

in May 2000,stored for 12

months at 4 °C

Tetracycline (µg/kg)c,d

0-10 56.4 ( 20.1 43.4 ( 22.2 86.2 ( 15.3 49.8 ( 11.3 73.6 ( 19.710-20 100.5 ( 68.8 94.2 ( 40.3 198.7 ( 84.0 61.8 ( 22.6 119.4 ( 86.520-30 90.5 ( 35.4 59.0 ( 21.7 171.7 ( 65.4 101.5 ( 51.5 141.3 ( 82.630-60 ndf nd nd nd nd60-90 nd nd nd nd nd

Chlortetracycline (µg/kg)e

0-10 4.6 ( 1.1 5.1 ( 1.4 6.1 ( 2.0 3.7 ( 1.0 6.6 ( 1.410-20 4.7 ( 0.3 6.0 ( 1.2 7.1 ( 3.4 4.4 ( 1.0 6.8 ( 1.520-30 4.8 ( 1.2 5.0 ( 1.0 5.8 ( 3.2 4.2 ( 1.4 7.3 ( 3.230-60 nd nd nd nd nd60-90 nd nd nd nd nd

a The values (µg/kg of dry soil) represent the means ( standard deviations of four samples taken from four specifically marked areas, whichhave been corrected for mean recovery (37.7% for TC, 69.2% for CTC). Oxytetracycline and tylosin were not detectable in any sample. b Results ofthe two-way ANOVA analysis for the factors of time (May 2000, November 2000, and May 2001) and soil depth (0-10, 10-20, and 20-30 cm)followed by the post-ANOVA Student-Newman-Keuls method. Mean values and the standard error of the mean (in µg/kg) are given in parenthesesin footnotes c-e. TC and CTC at depths of 30-90 cm were not detectable and not included into the calculations. c The concentrations of TC insamples collected in May 2001 (152.2 ( 13.7) at 0-10, 10-20, and 20-30 cm were significantly higher (p < 0.05) than for those samples collectedin May 2000 (82.3 ( 13.7) and November 2000 (65.5. ( 13.7). d The concentrations of TC in samples collected in May 2000, in November 2000,and in May 2001 at 0-10 cm (62.0 ( 13.7) were at all times significantly lower (p < 0.05) than in the soil depths of 10-20 (131.0 ( 13.7) and 20-30cm (107.1 ( 13.7). e The concentrations of CTC in samples of May 2000 stored for 12 months (6.9 ( 0.4) at 0-10, 10-20, and 20-30 cm weresignificantly higher (p < 0.05) than that of May 2000 without storage (4.7 ( 0.4) and with storage for 6 months (4.1 ( 0.4). f nd, not detected.


during sample storage cannot be excluded and may be due tothe further degradation of the organic material in the soil, shiftsin the microorganism population, or variations of the pH and redoxpotential. Furthermore, the adsorption of tetracyclines to the soilmay be reversible. This is of ecotoxicological importance, sincethe possibility of “bound” antibiotics being released under naturalsoil conditions (e.g., by acidification or by a reduction of the redoxpotential after water saturation of the soil) is apparent. If this

release of bound tetracycline residues can also occur in nature,part of the higher concentration found in May 2001 could beattributed to this effect.

The ecological impact of antibiotics widely distributed over awhole field in subtherapeutic concentrations over a long periodwith regard to the development of antibiotic resistance of bacteriacannot be estimated at present. On one hand, no effect on soilrespiration was found at high concentrations (50 mg/kg of soil)

Figure 4. (a) Investigation of liquid manure with LC-MS-MS. Left panel: Reconstructed ion chromatograms of 4-epi-tetracycline (epi-TC)and TC. Central and right panel: the corresponding tandem mass spectra of 4-epi-TC and TC, respectively. (b) Investigation of liquid manurewith LC-MS(3). Left panel: Reconstructed ion chromatograms of epi-TC and TC. Central and right panels: the corresponding MS-MS-MSspectra of 4-epi-TC and TC, respectively.


of chlortetracycline.22 On the other hand, tetracyclines were foundhighly toxic with EC50 values of 0.05 mg/L for chlortetracyclineand 0.09 mg/L for tetracycline when the freshwater cyanobacteriaM. aeruginosa was tested.23 Even if a general link betweenantibiotic use and percentage of resistant strains of soil bacteriais supposed,24 it is unclear at which threshold concentration insoil a shift toward an increase in the percentage of tetracyclineresistant strains has to be expected.

One important tool for the risk assessment of veterinary drugsin the soil is the estimation of the predicted environmentalconcentrations based on guidelines recently published by EMEA.15

The detected tetracycline concentration in liquid manure of 4 mg/kg and the amount of liquid manure added (i.e., 40 m3/ha) wereused for these calculations for the year 2000. When certain factorsare taken into account such as ploughing of soil and dilution ofthe compoundssthe liquid manure is usually mixed into a depthof 30 cmsthe mean concentration in the plough layer should be∼36 µg/kg. In comparison, the data from the field samples andthe calculations in Table 4 reveal that the tetracyclines arequantitatively transferred into the soil. Furthermore, antibioticresidues from past liquid manure fertilizations were still presentin the soil and, thus, were only partly degraded. This observationis strengthened by the results from May 2001; further fertilizationwith liquid manure containing amounts of tetracycline similar tothe previous year led to significantly higher tetracycline concen-trations in the soil layers at 0-30 cm. The observed increase of40-110 µg/kg between November 2000 and May 2001 was evenhigher than the expected increase from the liquid manureapplication (30 m3 with 3.2 mg/kg tetracycline incorporated intothe 30-cm soil corresponds to 21 µg/kg of soil). One possiblereason for this deviation in the field samples could be theadditional release of tetracyclines (as already mentioned above)from November 2000 until the sampling time. Nevertheless, anaccumulation of the drug in soil occurs as evidenced by the overalldata and the fact that the annual supply rate of tetracyclines byorganic fertilization is higher than the degradation rate in the soil.

For all three sampling times, the mean concentration oftetracycline in the upper soil layer (0-10 cm) was significantlylower than in the two layers below (p < 0.05). From these findings,it was concluded that a degradation of tetracycline occurs.Tetracycline has been shown to be readily photodegraded inwater,25 and this may also occur at the soil surface. Nevertheless,photodegradation could only be effective in the first millimeter ofthe topsoil, where the light can penetrate.26 Therefore, a completedegradation of the drug is not likely and was not shown in thefield samples.

In an initial study, we screened several samples for the possiblereversible degradation product, 4-epi-tetracycline. Significant con-centrations of 4-epi-tetracycline were found in the soil amountingto 10-15% of the parent drug (data not shown). An equal ratio ofthe drug and its epimer was obtained in the analysis of liquidmanure (Figure 4). Therefore, we conclude that the 4-epimer istransferred from the liquid manure into the soil. To elucidate the

formation of other degradation products of tetracycline, laboratorystudies employing soil enriched with the pure drugs will beperformed.

Acute problems may arise with the high concentrations ofantibiotics found in the dried liquid manure aggregates at the soilsurface where 0.35 mg/kg tetracycline and 1.44 mg/kg chlortet-racycline were detected (Table 5). These aggregates can remainintact after incorporation into the soil and create spots with highantibiotic concentration in the soil matrix. Consequently, soilbacteria exposed to these concentrations, which fall within theminimal inhibitory concentration (0.5-2 mg/L27) for variousbacteria, may cause acute toxic effects and lead to a reduction inthe biodiversity of soil microorganisms.

In June 2001, the Steering Committee of the VeterinaryInternational Committee on Harmonization (VICH) increased thetrigger value for antibiotic concentrations in soil from 10 to 100µg/kg.28 Our investigations show that, for the “old” veterinary drugtetracycline, the new and 10-fold higher trigger value is stillexceeded in soils that are regularly fertilized with liquid manure.Furthermore, the rate of tetracycline application to soils exceedsthe degradation rate of this compound such that further ac-cumulation is expected.

Several soils had tetracycline concentrations between 10 and100 µg/kg (Tables 3 and 4).14 Even if these concentrations fallbelow the actual trigger value for risk assessment, it cannot bepresently ruled out that the microbial soil community is affectedand antibiotic resistance is occurring at these subtherapeuticconcentrations. Thus, tetracyclines have a potential risk for theenvironment and additional investigations on the environmentaleffects of this drug are urgently needed.

Antibiotics in Soil Water and Groundwater. Neither tetra-cyclines nor tylosin was detected in any water sample (i.e., soilwater obtained in May and October 2000 at a depth of 80 cm orgroundwater sampled in May 2000, November 2000, and June 2001(22) Warman, P. R.; Thomas, R. L. Can. J. Soil Sci. 1981, 61, 161-163.

(23) Halling-Sørensen, B. Chemosphere 2000, 40, 731-739.(24) Nwosu, V. C. Res. Microbiol. 2001, 152, 421-430.(25) Oka, H.; Ikai, Y.; Kawamura, N.; Yamada, M.; Harada, K.; Ito, S.; Suzuki,

M. J. Agric. Food Chem. 1989, 37, 226-231.(26) Balmer, M. E.; Goss, K. U.; Schwarzenbach, R. P. Environ. Sci. Technol.

2000, 34, 1240-1245.

(27) Frey, H. H.; Loscher, W. Lehrbuch der Pharmakologie und Toxikologie furdie Veterinarmedizin, 1st ed.; Ferdinand Enke Verlag: Stuttgart, 1996;Chapter 16.4.3.

(28) VICH Environmental impact assessments (EIAs) for veterinary medicalproducts (VMPs): Phase I. VICH 2000, available at: www:\\vich.eudra.org.

Table 5. Tetracycline and ChlortetracyclineConcentrations Determined by LC-MS-MS in DriedLiquid Manure Aggregates and in the Underlying SoilObtained from Three Different Areasa

dried liquid manure/soil depth (cm)

tetracycline(µg/kg)

chlortetracycline(µg/kg)

area Ab 349.3 1435.00-10 33.2 59.910-20 50.1 12.020-30 30.3 14.9area Bb 117.1 4.90-10 4.0 1.710-20 2.6 2.620-30 2.6 2.9area C (n ) 4) 6.6 ( 3.2 10.9 ( 3.90-10 5.0 7.210-20 4.6 6.620-30 2.3 3.3

a All values are µg/kg of dry soil and corrected for mean recovery.b There was only one dried liquid manure aggregate found in the field.


at a depth of 200-240 cm below soil surface). Rabølle and Spliid11

did not find any oxytetracycline in the leachate of soil columns,and our results from the various field studies support thesefindings for tetracycline and chlortetracycline; even with thespecific and sensitive analytical procedures, antibiotics below 30cm in the soil and residues in soil water and groundwater couldnot be detected. Further confirmation of our findings are sup-ported by Lindsey et al.18 and Zhu et al.19 Both groups did notdetect any tetracyclines in groundwater sites in areas of animalhusbandry within the United States.

CONCLUSIONSWe have demonstrated that LC-MS-MS, combined with a

rather simple but very effective sample cleanup, is the method ofchoice for the detection of tetracyclines in various environmentalsamples. The application of the newly developed methods madethe detection of significant amounts of persistent tetracyclines inliquid manure and in the soil possible. We detected thesecompounds not only in subtherapeutic concentrations but also inthe range of the minimum inhibitory concentration for relevant

bacterial species in the environment. Ecotoxicological studiesespecially on soil microorganisms should be performed, toestimate the risk for the soil flora and the spread of antibioticresistance.

ACKNOWLEDGMENTS.S. was supported by a grant of the Wilhelm-Schaumann-

Stiftung, Germany. The authors are grateful to the Volkswagen-stiftung, Germany, for financial support to build up the laboratoryfor residue analysis in the Department of Food Toxicology. Wethank Beate Priess for excellent technical help and Dr. BerndKleefisch and Hubert Groh of the Lower Saxony soil monitoringproject for soil, water, and liquid manure sampling, as well as soiland land use information on the investigated site. We are obligedto Prof. Mohamed Elmazar for a critical review and to Dr. MelissaMock for careful proofreading of the manuscript.

Received for review August 8, 2001. Accepted January 24,2002.

AC015588M


Publikation 3

Hamscher G, Pawelzick HT, Höper H (2003):

Abschlussbericht des UBA-Forschungsprojektes „Tierarzneimittelanalysen

gemäß BLAC-Untersuchungsprogramm“ (FKZ 201 91 217).

Eingereicht: Umweltbundesamt, Juni 2003.

Umweltforschungsplan

des Bundesministeriums für Umwelt,

Naturschutz und Reaktorsicherheit

Bodenschutz

Förderkennzeichen 201 91 217

Ermittlung von Tierarzneimittelkonzentrationen in Gülle, Böden

und Grundwasser im Rahmen des Bund-/Länder Untersuchungs-programms

– Arzneimittel in der Umwelt – Konzept für ein Untersuchungsprogramm –

UMK-Beschluss vom 27./28. Oktober 1999

von

Dr. Gerd Hamscher1

Heike T. Pawelzick1

Dr. Heinrich Höper2

1) Zentrumsabteilung für Lebensmitteltoxikologieder Tierärztlichen Hochschule Hannover

Direktor: Prof. Dr. Dr. h.c. Heinz Nau

2) Bodentechnologisches Institut Bremendes Niedersächsischen Landesamt für Bodenforschung

Direktor und Professor: Dr. Jörg Kues

IM AUFTRAG

DES UMWELTBUNDESAMTES

Juni 2003

Zusammenfassung

Im Rahmen des Bund-/Länder Untersuchungsprogramms „Arzneimittel in der

Umwelt“ wurden Gülleproben, Böden und potenziell exponiertes Grundwasser auf

Tierarzneimittelwirkstoffe untersucht. Als Leitsubstanz dienten hier die mengenmäßig

bedeutsamen Tetracycline, die nach matrixspezifischer Probenvorbereitung mittels

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandemmassen-spektrometrie

detektiert wurden. An Hand von zwei Boden-Dauerbeobachtungsflächen und 14

weiteren landwirtschaftlichen Nutzflächen in der Region Weser-Ems wurde

festgestellt, dass Tetracycline nach Ausbringung über die Gülle insbesondere im

Oberboden adsorbiert werden und dort auch in verhältnismäßig hohen Konzentrationen

persistieren können (über 500 µg/kg). Ein Eintrag von Tetracyclinen in den Unterboden

oder in oberflächennahes Grundwasser oberhalb der Nachweisgrenzen konnte im

Rahmen dieser Feldstudien nicht festgestellt werden.

Abstract

Within the German nation-wide monitoring program “Pharmaceuticals in the

environment” liquid manure, soil and ground water samples were investigated for the

occurrence of veterinary drugs. Tetracyclines were chosen as target compounds due to

their frequent use in high amounts. The detection was performed after a matrixspecific

sample clean-up procedure with high perfomance liquid chromatography combined

with tandem mass spectrometry. Regarding two sites of the Lower Saxony Soil

Monitoring Program and 14 adjacent fields in the district Weser-Ems, it could be

shown, that tetracyclines enter via repeated fertilizations with liquid manure into the

topsoil and build up persistent residues in relatively high concentrations (more than 500

µg/kg). Transfer of tetracyclines into subsoil or groundwater at concentrations above

the detection limit was not observed during our field investigations.

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis ............................................................................................................III

1 Problemstellung........................................................................................................ 1

2 Stand des Wissens .................................................................................................... 2

2.1 Rechtliche Grundlagen ......................................................................................... 2

2.2 Kenntnisstand ....................................................................................................... 3

2.3 Notwendigkeit ...................................................................................................... 7

2.4 Planung und Ablauf des Vorhabens ..................................................................... 9

2.4.1 Ziel der Arbeiten........................................................................................... 9

2.4.2 Aufgabenstellung und Lösungsweg.............................................................. 9

2.4.3 Zeitliche und technische Aufgliederung des Vorhabens .............................. 9

2.4.3.1 Zeitlich und räumlich intensiviertes Monitoring ausgewählter Boden-

Dauerbeobachtungsflächen in Norddeutschland .................................................. 9

2.4.3.2 Weiterentwicklung der Probenahme speziell für Tetracycline............... 10

2.4.3.3 Untersuchung von Sickerwasser und oberflächennahem Grundwasser . 10

3 Experimenteller Teil ............................................................................................... 11

3.1 Nachweis und Quantifizierung mittels

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Elektrospray-

Tandemmassenspektrometrie ..................................................................................... 11

3.2 Weiterentwicklung der Sicker- und Grundwasserprobenahme speziell für

Tetracycline ................................................................................................................ 13

3.2.1 Versuchsdesign........................................................................................... 13

3.2.2 Analysenverfahren und Auswertung .......................................................... 13

3.3 Untersuchung von Grundwasserproben.............................................................. 14

3.3.1 Standorte..................................................................................................... 14

3.3.2 Probenahme ................................................................................................ 14

3.3.3 Zeitpunkte der Probenahme........................................................................ 15


3.4 Untersuchung der Bodenproben ......................................................................... 15

3.4.1 Standorte..................................................................................................... 15

IV

3.4.2 Probenahme ................................................................................................ 16


3.5 Untersuchung der Gülleproben........................................................................... 17

3.5.1 Probenahme ................................................................................................ 17

3.5.2 Analyse und Auswertung............................................................................ 17

4 Ergebnisse............................................................................................................... 18

4.1 Weiterentwicklung der Sicker- und Grundwasserprobenahme speziell für

Tetracycline ................................................................................................................ 18

4.2 Ergebnisse der Grundwasseruntersuchungen ..................................................... 21

4.3 Zeitlich und räumlich intensiviertes Monitoring ausgewählter Boden-

Dauerbeobachtungsflächen in Norddeutschland ........................................................ 24

4.3.1 Standort BDF 01......................................................................................... 24

4.3.1.1 Ergebnisse Standort BDF 01 Juni 2001.................................................. 24

4.3.1.2 Ergebnisse Standort BDF 01 November 2001 ....................................... 25

4.3.1.3 Ergebnisse Standort BDF 01 Mai 2002.................................................. 25


4.3.1.5 Gesamtergebnisse Standort BDF 01....................................................... 27

4.3.2 Standort BDF 02......................................................................................... 30


4.3.2.2 Ergebnisse Standort BDF 02 Juni 2002.................................................. 31


4.3.2.4 Gesamtergebnisse Standort BDF 02....................................................... 32

4.3.3 Flächenscreening ........................................................................................ 35

4.4 Gülleproben ........................................................................................................ 37

5 Diskussion .............................................................................................................. 38

5.1 Untersuchung von Grundwasserproben.............................................................. 38

5.2 Bodenuntersuchungen ........................................................................................ 41

5.2.1 Boden-Dauerbeobachtungsflächen............................................................. 41

5.2.1.1 Standort BDF 01..................................................................................... 42

5.2.1.2 Standort BDF 02..................................................................................... 42

5.2.2 Flächenscreening ........................................................................................ 43

V

5.2.3 Bewertung der Bodenuntersuchungen........................................................ 43

5.3 Gülle ................................................................................................................... 44

6 Literatur .................................................................................................................. 45

1

1 Problemstellung

Erste Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe haben am Beispiel der Tetracycline (TCs)

gezeigt, dass Antibiotika aus der intensiven Tierhaltung über die Gülle in den Acker-

boden gelangen können und dort auch persistent sind. Ein Übergang dieser Substanz-

klasse in das Sicker- und Grundwasser konnte bislang nicht nachgewiesen werden. In

diesem Folgeprojekt sollte nunmehr die Datenlage erweitert werden. Hierzu wurden

zwei landwirtschaftliche Nutzflächen, die mit unterschiedlichen Wirtschaftsdüngern

(Schweine- und Rindergülle) beaufschlagt wurden, über einen Zeitraum von 18 Mona-

ten im Ober- und Unterboden (0–90 cm) beprobt und auf Tetracycline hin untersucht.

Darüber hinaus sollten 14 weitere Flächen in der gleichen Region, die regelmäßig mit

Wirtschaftsdüngern beaufschlagt wurden, auf Tetracycline im Oberboden (0–30 cm)

untersucht werden. Des Weiteren wurde in Laborversuchen die optimale Probenahme

für Sicker- und Grundwasser für Tetracycline ermittelt. Unter Berücksichtigung der

hieraus gewonnenen Erkenntnisse sollten im weiteren Verlauf des Projektes erneut

Sicker- und Grundwasserproben auf Tetracycline hin untersucht werden.

2

2 Stand des Wissens

2.1 Rechtliche Grundlagen

Aufgrund eines Berichtes des Bund-Länderausschusses Chemikaliensicherheit (BLAC,

1998) zu „Auswirkungen der Anwendung von Clofibrinsäure und anderer Arzneimittel

auf die Umwelt und Trinkwasserversorgung / Überführung der Futtermittelzusatzstoffe

mit pharmakologischer Wirkung in das Arzneimittelrecht“ hat die 51. Umweltminister-

konferenz (UMK) 1998 den BLAC beauftragt, ein Konzept für ein bundesweites Unter-

suchungsprogramm auf Arzneistoffe in Wasser, Boden und den maßgeblichen Eintrags-

pfaden zu entwickeln. Ein entsprechender Vorschlag des BLAC für ein Untersuchungs-

programm wurde von der 53. UMK im Oktober 1999 akzeptiert (BLAC, 1999).

Der BLAC wurde beauftragt, ein einjähriges Untersuchungsprogramm durchzuführen.

Damit soll „das Auftreten von Arzneistoffen aus der Verwendung von Human- und

Tierarzneimitteln sowie pharmakologisch wirksamen Futterzusatzstoffen“ ermittelt

werden. Das Umweltbundesamt (UBA) wurde seitens des Bundes-Umweltministeriums

beauftragt, Daten über den Verbrauch von Wirkstoffen in Tierarzneimitteln und phar-

makologisch wirksamen Futtermittelzusatzstoffen zu erheben. Hierbei werden die

Umweltmedien Wasser und Boden berücksichtigt. Während für den Wasserpfad vor-

wiegend Humanarzneimittel eine Rolle spielen, sind für den Stoffeintrag in die Böden

neben den Humanpharmaka (via Klärschlamm) in erster Linie Wirkstoffe aus Tier-

arzneimitteln und Futtermittelzusatzstoffen von Interesse. Das Messprogramm wurde

von September 2000 bis August 2001 durchgeführt. Die Auswertung und Bericht-

erstellung erfolgt zurzeit durch eine Arbeitsgruppe des BLAC (BLAC, 2002).

Seit 1998 ist für die Neuzulassung von Tierarzneimitteln eine Prüfung ihrer umwelt-

relevanten Eigenschaften erforderlich (EUROPEAN UNION, 1996; AMG, 2000). Viele

Wirkstoffe sind jedoch vor 1998 zugelassen worden und daher häufig nicht oder nur

unvollständig auf ihre Umwelteigenschaften untersucht worden. Insofern besteht für die

Tierarzneimittelhersteller zurzeit nur Handlungsbedarf für neu zuzulassende Wirkstoffe.

Der größte Anteil der momentan eingesetzten Stoffe – einschließlich der Tetracycline –

3

gehört allerdings ausnahmslos zu den „Alt-Tierarzneimitteln“ für die bislang keine

Prüfung auf das Umweltverhalten vorgeschrieben ist.

2.2 Kenntnisstand

Im Rahmen einer Kooperation des Niedersächsischen Landesamtes für Bodenforschung

(NLfB) und der Tierärztlichen Hochschule Hannover (TiHo) wurden im Jahre 2000

landwirtschaftliche Nutzflächen und Kontrollflächen auf mengenmäßig bedeutend ein-

gesetzte Tierarzneimittel wie Tetracycline und Tylosin hin untersucht. Hierzu wurde ein

hochspezifisches Extraktionsverfahren in Kombination mit einem selektiven und sensi-

tiven Nachweisverfahren entwickelt (HPLC-ESI-MS-MS). In einer Pilotstudie ist es

erstmals gelungen, Tetracyclin und Chlortetracyclin in güllegedüngten Böden nachzu-

weisen (HAMSCHER et al., 2000).

Untersucht wurden vier Flächen aus dem Programm zur Boden-Dauerbeobachtung in

Niedersachsen, davon zwei Flächen mit regelmäßiger Ausbringung von Schweine- oder

Rindergülle (BDF 01–02), zwei Kontrollflächen ohne Gülledüngung (BDF 03–04)

sowie zehn Standorte in einer Region mit intensiver Tierhaltung (SCR 01–10). Es zeigte

sich, dass maximale Konzentrationen von 85,5 µg/kg für Tetracyclin und 37,8 µg/kg für

Chlortetracyclin nur in der obersten humusreichen Bodenschicht (0–40 cm) zu detek-

tieren sind (s. Abb. 1–4, Werte korrigiert um die mittlere Wiederfindung). Tylosin und

Oxytetracyclin konnten in keiner Probe sicher identifiziert werden. Keine Rückstände

ließen sich in der unteren sandigen Bodenschicht (40–90 cm) nachweisen.

Bemerkenswert ist auch die Tatsache, dass auf den Boden-Dauerbeobachtungsflächen

die letzte Begüllung über vier Monate zurücklag, d. h. die Tetracycline scheinen

gebunden an Bodenbestandteile eine gewisse Persistenz zu haben.

4

Bodentiefe [cm]

Tetra

cycl

in [µ

g/kg

]

0

10

20

30

40

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BDF 01 BDF 02 BDF 03 BDF 04v.a. Schweinegülle v.a. Rindergülle Mineralstoffdüngung Extensivierungsfläche

Triggerwert Ökotoxikologie (2001)


Bodentiefe [cm]

Chl

orte

tracy

clin

[µg/

kg]

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BDF 01 BDF 02 BDF 03 BDF 04v.a. Schweinegülle v.a. Rindergülle Mineralstoffdüngung Extensivierungsfläche



Abb. 1: Tetracyclinkonzentrationen im Boden der BDF 01–04.

5

SCR 01 SCR 02 SCR 03 SCR 04 SCR 05 SCR 06 SCR 07 SCR 08 SCR 09 SCR 10

00-1

010

-20

20-3

0

00-1

010

-20

20-3

0

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0

Bodentiefe [cm]

Chl

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kg]

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100Triggerwert Ökotoxikologie (2001)

TriggerwertÖkotoxikologie (1996)

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20-3

0

Bodentiefe [cm]

Tetra

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80

90

100Triggerwert Ökotoxikologie (2001)

SCR 01 SCR 02 SCR 03 SCR 04 SCR 05 SCR 06 SCR 07 SCR 08 SCR 09 SCR 10


Abb. 2: Chlortetracyclinkonzentrationen im Boden der BDF 01–04.

Abb. 3: Tetracyclinkonzentrationen im Boden der Screeningflächen 01–10.

6

Abb. 4: Chlortetracyclinkonzentrationen im Boden der Screeningflächen 01–10.

In der EMEA/CVMP/055/96-Leitlinie (EUROPEAN UNION, 1996) ist seit 1996 für

die Zulassung neuer Tierarzneimittel eine umfassende ökotoxikologische Prüfung dann

vorgeschrieben, wenn sich eine auf Worst-case-Szenarien vorhersagbare Arzneimittel-

konzentration (PEC, predicted environmental concentration) im Boden von > 10 µg/kg

ergibt („Triggerwert Ökotoxikologie“, ab 01.06.01 100 µg/kg). Die tatsächlich ermit-

telten Konzentrationen für Tetracyclin und Chlortetracyclin lagen in 4 von 14 Böden

bzw. in 2 von 14 Böden teilweise deutlich über 10 µg/kg. Somit scheinen die von uns

vorgestellten Ergebnisse auch ökotoxikologische Bedeutung zu haben.

Von den Boden-Dauerbeobachtungsflächen 01 und 04 wurde auch Grundwasser in die

Untersuchungen einbezogen. Diese Proben wurden über Festphasenextraktion ange-

reichert und ebenfalls mittels HPLC-ESI-MS-MS untersucht. Alle Proben lagen unter-

halb der Nachweisgrenze (0,05 µg/L) des eingesetzten Verfahrens. Die Probenahme

erfolgte an allen Standorten mit Keramikkerzen (Typ P80), die über eine Polypropylen-

leitung mit Glasflaschen verbunden waren. Es ist durchaus möglich, dass insbesondere

Keramikkerzen ungeeignet sind, um tetracyclinhaltige Wasserproben zu gewinnen.

Tetracycline können Chelate bilden und neigen auch zur Adsorption an Glas- und

Kunststoffoberflächen. Es müssen daher grundlegende Untersuchungen zur Opti-

mierung der Probenahme durchgeführt werden.

7

2.3 Notwendigkeit

Das Umweltbundesamt hat eine Studie zur Abschätzung der in die Umwelt einge-

tragenen Wirkstoffmengen von Tierarzneimitteln beauftragt (WINCKLER und GRAFE,

2000). Die hierbei erarbeiteten Daten bilden eine wichtige Grundlage für die Beur-

teilung der ökotoxikologischen Relevanz einzelner Stoffgruppen im Zusammenhang mit

Fragen des Boden- und Gewässerschutzes. Für die Region Weser-Ems sind danach ins-

besondere Tetracycline quantitativ von Bedeutung.

Tetracycline werden im Tier nur geringfügig metabolisiert und im Wirtschaftsdünger

nur langsam abgebaut. In Fütterungsversuchen mit Tetracyclin an Schweinen wurden

Ausscheidungsraten von bis zu 80 % ermittelt (KROKER, 1983; WINCKLER und

GRAFE, 2000). Obwohl KÜHNE et al. (2000) in belüfteteten Versuchsbehältern im

Labormaßstab Halbwertzeiten von 4,5 Tagen für Tetracyclin in Schweinegülle fanden,

deuten die Untersuchungen von WINCKLER und GRAFE (2000) auf deutlich längere

Halbwertzeiten in dieser Matrix hin. In relativ großvolumigen Versuchsbehältern unter

kontrollierten Bedingungen fanden WINCKLER und GRAFE (2000) bei einer

Lagerungstemperatur von 8 ºC Halbwertzeiten von über sieben Wochen.

Unter Freilandbedingungen wurde nur sehr wenig Tetracyclin in der Gülle abgebaut. Im

Hühnerkot reduzierte sich der Tetracyclingehalt in 12 Wochen um 35 % (JAGNOW,

1977). In einem anonymen Screening von Schweinegülleproben wurden in 15 % der

Fälle Tetracyclinkonzentrationen (einschließlich des Epimers 4-Epi-Tetracyclin) von

über 5 mg/kg und eine maximale Konzentration von 24 mg/kg nachgewiesen

(WINCKLER und GRAFE, 2000).

WINCKLER und GRAFE (2000) nehmen auch eine Expositionsabschätzung nach

Phase I der EMEA-Leitlinie EMEA/CVMP/055/96 (EUROPEAN UNION, 1996) für

Tetracyclin bei Schweinegülle und für Chlortetracyclin bei Putenkot vor und berechnen

PEC-Werte (Predicted Environmental Concentration) für Gülle und Boden.

Für Schweinegülle ermitteln sie PEC-Werte in der Gülle für Tetracyclin im Mittel von

23 mg/kg und im Maximum von 52 mg/kg. Bei der Einarbeitung einer Menge an

Schweinegülle entsprechend 170 kg Stickstoff auf eine Tiefe von 5 cm berechnen sie

8

für Schweinegülle PEC-Werte (Boden) im Mittel von 0,9 mg/kg und im Maximum von

2,1 mg/kg.

Die geschätzten Konzentrationen in Boden und Wirtschaftsdünger liegen, unter der An-

nahme einer vollständigen Verfügbarkeit, im Bereich der minimalen Hemmkon-

zentrationen von gesundheitsrelevanten Keimen, die von FORTH et al. (1996) mit 0,5

bis 2 mg/L angegeben werden. Auch wenn hieraus die Wirkungen auf Bodenorganis-

men nicht direkt abgeleitet werden können, zeigt dieser Aspekt jedoch ein gewisses

Potenzial der betrachteten Wirkstoffe im Hinblick auf eine ökotoxikologische Wirkung

auf. Sowohl in der Gülle als auch im Boden werden die ökotoxikologischen Trigger-

werte der EMEA (EUROPEAN UNION, 1996) überschritten (0,01 mg/kg Boden;

0,1 mg/kg Gülle, ab Sommer 2001: 0,1 mg/kg Boden; s. VICH, 2000). Bei einer hypo-

thetischen Neuzulassung dieser Tierarzneimittel wären bei Überschreiten dieser Trig-

gerwerte damit Untersuchungen im Hinblick auf ihr Umweltverhalten durchzuführen.

Diese weitergehenden ökotoxikologischen Untersuchungen wären dann erforderlich,

wenn die Halbwertzeit der Stoffe länger als 60 Tage ist, und nicht mehr als 90 % des

Wirkstoffes innerhalb eines Jahres abgebaut werden.

Im Rahmen der von Juni 2001 bis November 2002 durchgeführten Untersuchungen

sollte daher das bereits vorliegende Datenmaterial aus der beschriebenen Pilotstudie

zum Vorkommen von Tetracyclinen in der Umwelt sowohl in zeitlicher als auch in

räumlicher Hinsicht erweitert werden. Ein weiterer wichtiger Aspekt des Vorhabens war

die Optimierung der Probenahme für Sicker- und Grundwasser sowie eine Lang-

zeitstudie zur Untersuchung eines möglichen Eintrages von Tetracyclinen in das Sicker-

und Grundwasser.

9

2.4 Planung und Ablauf des Vorhabens

2.4.1 Ziel der Arbeiten

Die Arbeiten sollten weitere Daten zur Belastung von Böden mit Tetracyclinen aus

Regionen mit intensiver Tierhaltung liefern und auch Aussagen zum Abbauverhalten

dieser Stoffe in der Umwelt ermöglichen. Darüber hinaus sollte auch die Frage geklärt

werden, ob Tetracycline in das Grundwasser verlagert werden können.

2.4.2 Aufgabenstellung und Lösungsweg

Durch ein zeitlich und räumlich intensiviertes Monitoring ausgewählter Boden-Dauer-

beobachtungsflächen (BDFs) in Norddeutschland sollte ein Teilaspekt des Vorhabens

bearbeitet werden. Laborversuche mit unterschiedlichen Saugsonden stellten die

Grundlage für eine optimierte Probenahme von Sicker- und Grundwasser unter Feldbe-

dingen dar. Die Tetracycline wurden mittels bereits erarbeiteter analytischer Verfahren

bestimmt (HAMSCHER et al., 2002).

2.4.3 Zeitliche und technische Aufgliederung des Vorhabens

Prinzipiell gliederte sich das Vorhaben in drei Teilaspekte: Monitoring ausgewählter

Boden-Dauerbeobachtungsflächen in Norddeutschland, Optimierung der Wasserprobe-

nahme und Untersuchung von oberflächennahem Grundwasser an ausgewählten Stand-

orten.

2.4.3.1 Zeitlich und räumlich intensiviertes Monitoring ausgewählter Boden-

Dauerbeobachtungsflächen in Norddeutschland

Die bisher durchgeführten Einzeluntersuchungen stellten lediglich eine Momentauf-

nahme dar, die sowohl zeitlich als auch räumlich intensiviert werden mussten. Es wurde

daher geplant, ab Juni 2001 zwei Flächen in halbjährlichem Abstand zu beproben. Die

Gesamtdauer der Untersuchungen wurde mit 18 Monaten angesetzt. Ausgewählt wur-

den zwei Boden-Dauerbeobachtungsflächen, die überwiegend mit Schweine- oder

Mischgülle (Rind und Schwein) gedüngt werden.

10

Es wurde jeweils eine Mischprobe aus 16 Einstichen mit einem Kernbohrer auf jeder

der vier Kernflächen der oberen Ackerkrume (0–30 cm) sowie der unteren

Bodenschicht (30–90 cm) gezogen, die auf Oxytetracyclin, Tetracyclin und

Chlortetracyclin hin untersucht wurde. Die aufgebrachte Gülle sollte ebenfalls, parallel

zu den Boden-Probenahmezeitpunkten, gesammelt und analysiert werden. Eine

Probenahme war schließlich nur im Herbst 2002 möglich.

2.4.3.2 Weiterentwicklung der Probenahme speziell für Tetracycline

Da bislang keine Verlagerung der Tetracycline mit dem Sickerwasser in das Grundwas-

ser festgestellt werden konnte, sollte an Hand von Modellversuchen die Möglichkeit der

Adsorption dieser Substanzen an die Probenahmevorrichtung getestet werden. Es war

geplant, drei verschiedene Saugkerzen aus Keramik, Borosilikatglas und Nylon-Kunst-

stoff praxisnah zu testen. In diese Untersuchungen wurde auch eine Teflonsonde zur

direkten Entnahme von Grundwasser einbezogen. Die jeweiligen Versuche wurden in

doppelter Wiederholung durchgeführt. Der Sondendurchfluss wurde in vier Fraktionen

gesammelt, um eventuelle Sättigungseffekte der Sonden besser beurteilen zu können.

2.4.3.3 Untersuchung von Sickerwasser und oberflächennahem Grundwasser

Unmittelbar vor und ca. vier Wochen nach Güllegabe sollten Sickerwasser- und

Grundwasserproben an vier Standorten (zwei Standorte ohne Güllezufuhr, ein Standort

mit Schweine- und ein Standort mit Mischgülle aus Rinder- und Schweinegülle) gezo-

gen und analysiert werden. Durchgeführt wurden die Untersuchungen letztlich an den

zwei Standorten mit Güllezufuhr (BDF 01 und BDF 02) (s. 3.3). Aufgrund der hohen

Grundwasserstände auf BDF 01 befanden sich die Saugsonden sowohl während der

Beprobung im Frühjahr als auch im Herbst bereits im Grundwasser, so dass kein

Sickerwasser gewonnen werden konnte. Dennoch ist davon auszugehen, dass das hier in

1,4 m Tiefe gewonnene, oberflächennahe Grundwasser von seiner Zusammensetzung

dem Sickerwasser sehr nahe kommt.

11

3 Experimenteller Teil

3.1 Nachweis und Quantifizierung mittels Hochleistungsflüssigkeits-

chromatographie gekoppelt mit Elektrospray-Tandemmassenspektro-

metrie

Nachweis und Quantifizierung der Tetracycline erfolgte mit dem bei HAMSCHER et

al. (2002) beschriebenen HPLC-ESI-MS-MS-Verfahren. Die Analyten wurden an einer

RP-C18-Phase (Puresil C18, 5 µm, 4,6 x 150 mm, Waters Corp., Milford, MA) mittels

eines linearen Gradientensystems (Fließmittel A: 0,5 % Ameisensäure in Wasser mit

1 mM Ammoniumacetat, pH 2,5; Fließmittel B: Acetonitril; Gradient: 0–50 % B in

9 min, 50 % B für 1 min, 99 % B für 3 min, reäqulibrieren bei 100 % A für 12 min)

getrennt. Der Fluß von 1 mL/min wurde vor Einlass in das Massenspektrometer 1:10

gesplittet. Massenspektrometrie wurde an einer LCQ Ionenfalle (Finnigan Mat, San

Jose, CA) durchgeführt. Die Kopplung erfolgte über ein Elektrospray-Interface, das im

Positivmodus betrieben wurde. Die Analyten wurden an Hand der Retentionszeiten und

der substanzspezifischen Massenspektren qualifiziert und über die Summe der

intensivsten Fragmentionen (s. Tab. 1) durch Vergleich der Peakflächen mit der eines

externen Standards quantifiziert. Für alle Substanzen lag der lineare Bereich bei 0,1–

10 ng pro Injektion (r2 > 0,99).

Tab. 1: Retentionszeiten, optimierte MS-MS Parameter und charakteristischeFragmentionen zum Nachweis und zur Bestimmung verschiedener Antibiotika inBoden, Wasser und Gülle.

SubstanzRT

[min]

[M+H]+

[m/z]

Stoßenergie

[%]

Fragmentionen [m/z]

(rel. Intensität [%])

OTC 7,21 461 20 426 (7), 443* (100), 444 (9)

4-Epi-TC 7,17 445 20 410 (6), 427* (100), 428 (13)

TC 7,52 445 20 410 (4), 427* (100), 428 (7)

4-Epi-CTC 8,07 479 27 444* (68), 461* (51), 462* (100)

CTC 8,48 479 27 444* (51), 461* (54), 462* (100)

*Ionen, die zur Quantifizierung aufsummiert wurden

12

Die Bestimmungs- und Nachweisgrenzen wurden an Hand des Signal-Rausch-

Verhältnisses (S/N, signal to noise ratio) ermittelt (BG: S/N = 6, NG: S/N = 3). In einem

antibiotikafreien Kontrollboden lag die Bestimmungsgrenze für alle Substanzen bei

5 µg/kg (s. Tab. 2); noch nachweisbar waren in diesem Boden 2 µg/kg CTC und

1 µg/kg aller anderen Substanzen (s. Tab. 2). Im Wasser galt für alle Substanzen die

Bestimmungsgrenze von 0,1 µg/L und die Nachweisgrenze von 0,05 µg/L (s. Tab. 2).

Tetracycline konnten in Gülle bis zu einer Konzentration von 50 µg/kg quantifiziert und

bis zur einer Konzentration von ~20 µg/kg qualifiziert werden (s. Tab. 2). Werte, die

zwischen Nachweis- und Bestimmungsgrenze lagen, wurden bei Übereinstimmung der

Retentionszeit und des Massenspektrums noch ausgewertet.

Da es bei der Extraktion, insbesondere bei der Aufarbeitung von Wasserproben, zu einer

signifikanten Epimerisierung von Tetracyclin und Chlortetracyclin kommen kann, wur-

den die entsprechenden 4-Epimere bei der Analyse berücksichtigt. Alle Daten wurden

um die substanzspezifischen und matrixabhängigen Wiederfindungen korrigiert

(s. Tab. 2).

Tab. 2: Substanzspezifische mittlere Wiederfindungsraten innerhalb des angege-benen Konzentrationsbereiches in den verschiedenen Matrices.

Substanz Sandboden1

[5–100 µg/kg]

Gülle2

[200–1000 µg/kg]

Wasser3

[0,2–1 µg/L]

Wiederfindungsrate [%]

OTC 74,2 % 93,7 % 83,5 %

TC 37,7 % 93,2 % 92,1 %

CTC 69,8 % 110,6 % 88,2 %

Bestimmungsgrenzen (Nachweisgrenzen)

OTC 5 (1) 50 (20) 0,1 (0,05)

TC 5 (1) 50 (20) 0,1 (0,05)

CTC 5 (2) 50 (20) 0,1 (0,05)1Mischprobe aus 10 Böden aus der Region um Standort BDF 01, antibiotikafrei, mitvergleichbaren Bodenparametern (Corg ~2%), (s. HAMSCHER et al., 2002); 2Rück-standsfreie Schweinegülle aus dem Lehr- und Forschungsgut Ruthe, TiHo Hannover;3Mischprobe aus 10 Sickerwässern aus der Region um Standort BDF 01.

13

3.2 Weiterentwicklung der Sicker- und Grundwasserprobenahme speziell

für Tetracycline

Da bislang kein Übergang der Tetracycline in Sicker- und Grundwasser festgestellt

werden konnte, wurde mittels Modellversuchen die Möglichkeit der Adsorption dieser

Substanzen an die Probenahmevorrichtung getestet.

3.2.1 Versuchsdesign

Es wurden drei verschiedene Saugkerzen aus Keramik (P80, Umwelt-Geräte-Technik

GmbH, UGT, Müncheberg, Länge 50 mm, Durchmesser 20 mm, lfd. Nr. 1), Boro-

silikatglas (Ecotech, Bonn, Porenweite ca. 1 µm, Länge 60 mm, Durchmesser 32 mm,

lfd. Nr. 4) und Kunststoff (UGT, Müncheberg, gesintertes hydrophiles Polyethylen mit

Nylon-Membran, Porenweite 0,45 µm, Länge 50 mm, Durchmesser 25 mm, lfd. Nr. 3)

zur Entnahme von Sickerwasser praxisnah getestet. In diese Untersuchungen wurde

auch die zurzeit verwendete Teflonsonde (lfd. Nr. 2) zur Entnahme von Grundwasser-

proben einbezogen. Die Versuche wurden in zwei unabhängigen Reihen mit zwei ver-

schiedenen Testlösungen durchgeführt: Testlösung 1 bestand aus 50 mM Ammonium-

acetatpuffer, Testlösung 2 aus tetracyclinfreiem, oberflächennahem, matrixreichem

Grundwasser. Die Testsubstanzen Oxytetracyclin, Tetracyclin und Chlortetracyclin

wurden in einer umweltrelevanten Konzentration von 1 µg/L zugesetzt. Der

Sondendurchfluss wurde in vier Fraktionen à 250 mL gesammelt. Hierdurch konnten

mögliche Sättigungseffekte der Sonden nachgewiesen werden.

3.2.2 Analysenverfahren und Auswertung

Die Wasserprobe (25 mL) wurde mit der gleichen Menge 1 M Citratpuffer (pH 4,7)

intensiv gerührt und dann mittels Festphasenextraktion an SDB 1 Kartuschen (Baker,

Griesheim) vorgereinigt. Die Festphase wurde mit Wasser und Methanol gewaschen,

die Elution der Wirkstoffe erfolgte mit essigsaurem Methanol (pH 2,5). Das Eluat

wurde zur Trockene eingedampft und in 200 µL Methanol aufgenommen. Die

Bestimmung der Antibiotika erfolgte wie unter 3.1 beschrieben. Alle Daten wurden um

die substanzspezifischen Wiederfindungen korrigiert (s. Tab. 2).

14

Um mögliche unspezifische Adsorptionen an Glasoberflächen oder die Bildung von

unlöslichen Komplexen bereits in den Testlösungen zu berücksichtigen, wurden die

eingesetzten Lösungen nach Versuchsende analog den fraktionierten Wasserproben

gelagert und gemessen. Die angegebene Wiederfindung bezieht sich somit auf den in

der Ausgangslösung nach Versuchsende ermittelten Gehalt.

3.3 Untersuchung von Grundwasserproben

3.3.1 Standorte

Tabelle 3 gibt einen Überblick über Boden- und Standorteigenschaften der beiden unter-

suchten Boden-Dauerbeobachtungsflächen.

Tab. 3: Boden- und Standortparameter der untersuchten Boden-Dauer-beobachtungsflächen. Bodenparameter sind Mittelwerte aus den Untersuchungenvon vier Kernflächen à 256 m².

Parameter Einheit BDF 01 BDF 02

Bodentyp Gley-Podsol Podsol

Sand Gewichts-% 91,5 82,6

Schluff Gewichts-% 6,1 15,1

Ton Gewichts-% 2,4 2,3

Corg Gewichts-% 1,55 3,38

Nt Gewichts-% 0,11 0,12

KAK-pot1 mmolc/kg 106 167

pH (CaCl2) 4,6 4,8

Winter-GW2 cm unter Flur ca. 70–80 ca. 180–190

Sommer-GW cm unter Flur ca. 140–150 > 2001Potenzielle Kationenaustauschkapazität bei pH 8,1; 2Grundwasserstand

3.3.2 Probenahme

Grundwasserproben wurden von einem Standort mit Zufuhr von Schweinegülle

(BDF 01) und von einem Standort mit Zufuhr von Mischgülle aus Rinder- und Schwei-

negülle (BDF 02) gezogen. Die Probenahme des oberflächennahen Grundwassers

15

erfolgte auf BDF 01 mittels Nylon- und Borosilikatsonden in 1,4 m Tiefe an vier ver-

schiedenen Entnahmestellen. Auf BDF 02 wurden Grundwasserproben aus einer Tiefe

von 2,5 m an drei verschiedenen Peilbrunnen gezogen. Der Grundwasserstand lag bei

2 m unter Gelände.

3.3.3 Zeitpunkte der Probenahme

Die Grundwasserproben auf BDF 01 wurden zwischen Ende April und Anfang Juni

2002 an vier Terminen und im November 2002 an zwei Terminen gezogen. Weitere

Probenahmen waren im Dezember aufgrund eingefrorener Probenahmevorrichtungen

nicht möglich. Auf BDF 02 wurde im November 2002 einmalig von drei Peilbrunnen

oberflächennahes Grundwasser gewonnen.


Die Wasserproben wurden wie beschrieben (s. 3.2.2) aufgearbeitet und die Extrakte

mittels HPLC-ESI-MS-MS auf Tetracycline (Oxytetracyclin, Tetracyclin, Chlortetra-

cyclin) hin untersucht. Die Identifizierung der Substanzen erfolgte über die Retentions-

zeit und das Massenspektrum, die Quantifizierung über die intensivsten Fragmentionen

(s. 3.1).

3.4 Untersuchung der Bodenproben

Die im Rahmen des Projektes untersuchten Bodenproben stammten von zwei Boden-

Dauerbeobachtungsflächen sowie von 14 Screeningflächen. Die Proben stellten jeweils

eine Mischprobe (n = 16 Einstiche) von jeder der vier definierten Kernflächen dar. Für

die Screeningflächen wurde eine Mischprobe aus 16 zufällig ausgewählten Entnahme-

stellen auf einer Teilfläche von ca. 400 m² hergestellt.

3.4.1 Standorte

Die Standort- und Bodeneigenschaften der beiden Boden-Dauerbeobachtungsflächen

sind in Tabelle 3 aufgeführt. Eine Übersicht über die Screeningflächen gibt Tabelle 4.

Die Flächen sind im Umfeld von BDF 01 angesiedelt (Abstand Luftlinie zwischen

200 m und 5 km). Es handelt sich hier um sandige Standorte mit relativ hohen Grund-

16

wasserständen, so dass bezogen auf eine mögliche Verlagerung von Stoffen in das

Grundwasser Worst-case Bedingungen vorliegen. Der Anbau von Mais zeigt zudem an,

dass es sich um Flächen viehhaltender Betriebe handelt. Die Flächen SCR 01–10

werden seit November 1999 und die Flächen SCR 11–14 seit November 2000 jährlich

beprobt. Alle Flächen außer SCR 02 und SCR 04 waren zum Termin der ersten

Probennahme frisch begüllt (i. d. R. am selben Tag) und die Gülle noch nicht in den

Boden eingearbeitet worden.

Tab. 4: Bodenparameter und bei der Beprobung vorhandene Feldfrüchte für dieScreeningflächen.

Fläche Bodentyp Bodenart1 Feldfrucht

SCR 01 Gley-Podsol Ss Mais

SCR 02 Gley-Podsol Ss Getreide

SCR 03 Gley Ss Mais

SCR 04 Plaggenesch über Gley Ss Mais

SCR 05 Gley Ss Mais






SCR 11 Plaggenesch über Gley Sl2 Getreide

SCR 12 Gley-Podsol Ss Getreide

SCR 13 Gley-Podsol Sl4 Getreide

SCR 14 Gley-Podsol Ss Mais1Bodenartbezeichnung nach AG BODEN (1996)

3.4.2 Probenahme

Für alle Standorte erfolgte die Beprobung des Oberbodens jeweils in 10 cm Segmenten.

Auf dem Standort BDF 02 wurde die Probenahme einmalig im Bereich des Oberbodens

und generell im Unterboden in 30 cm Segmenten vorgenommen.

17


Die Bodenprobe wurde sorgfältig durchmischt. Ein Gramm Boden wurde dann mit 1 M

Citratpuffer (pH 4,7) aufgeschlämmt und anschließend zweimal mit Essigsäureethyl-

ester extrahiert. Die vereinigten organischen Überstände wurden zur Trockene einge-

dampft und in 200 µL Acetonitril/Wasser mit 100 mM Ammoniumacetat (9:1; v/v)

aufgenommen. Die Bestimmung der Antibiotika erfolgte wie unter 3.1 beschrieben.

Zur Bestimmung des Trockengewichtes wurden 20 g Boden bei 100 °C im

Trockenschrank bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Die mittlere Wiederfindung der

Tetracycline in einem vergleichbaren Sandboden wurde bei der Berechnung der

Ergebnisse berücksichtigt (s. Tab. 2). Alle Werte wurden auf das Trockengewicht des

Bodens bezogen.

3.5 Untersuchung der Gülleproben

3.5.1 Probenahme

Die Gülleproben wurden uns von der Landwirtschaftskammer Weser-Ems zur Verfü-

gung gestellt. Sie stammen von den Standorten der untersuchten Boden-Dauer-

beobachtungsflächen (BDF 01 und BDF 02).

3.5.2 Analyse und Auswertung

Die Gülleprobe wurde sorgfältig durchmischt. Ein Gramm Gülle wurde dann mit 1 M

Citratpuffer (pH 4,7) aufgeschlämmt und anschließend zweimal mit Essigsäureethyl-

ester extrahiert. Die vereinigten organischen Überstände wurden zur Trockene einge-

dampft und in 1 mL Acetonitril/Wasser mit 100 mM Ammoniumacetat (9/1; v/v) aufge-

nommen. Die Bestimmung der Antibiotika erfolgte wie unter 3.1 beschrieben. Die

mittlere Wiederfindung der Tetracycline in Gülle wurde bei der Berechnung der

Ergebnisse berücksichtigt (s. Tab. 2). Alle Werte beziehen sich auf das Feuchtgewicht

der Proben.

18

4 Ergebnisse

4.1 Weiterentwicklung der Sicker- und Grundwasserprobenahme speziell

für Tetracycline

Die Ergebnisse der Sondentests sind in Abbildung 5 und 6 dargestellt. Es zeigte sich,

dass die P80-Sonde aus der Pufferlösung die drei getesteten Tetracycline nahezu voll-

ständig adsorbiert (s. Abb. 5) und unter praxisnahen Bedingungen (Grundwasserproben)

zumindest für Chlortetracyclin eine starke Adsorption stattfindet (s. Abb. 6). Die Boro-

silikatsonde zeigt unter Praxisbedingungen, beim Test mit dotiertem Grundwasser, eine

deutliche Adsorption aller drei zugesetzten Substanzen. Die Nylon-Membran-Sonde

zeichnet sich, insbesondere unter praxisnahen Bedingungen, durch die höchsten

Wiederfindungen der getesteten Sonden für die Sickerwasserbeprobung aus. Die

Teflonsonde zur Beprobung von Grundwasser zeigt unter beiden Testbedingungen hohe

Wiederfindungen aller zugesetzten Wirkstoffe. Zusammenfassend lässt sich feststellen,

dass Kunststoffmaterialien zur Probenahme ggf. tetracyclinhaltiger Sicker- und

Grundwässer am besten geeignet sind.

19

Abb. 5: Wiederfindung (% WDF) in Sondentests mit Pufferlösung (50 mM Am-moniumacetat in Wasser). OTC, TC und CTC wurden in einer Konzentration von1 µg/L zugesetzt. Dargestellt sind die Mittelwerte aus zwei unabhängigen Versu-chen.

Sonde 1 (P80 Keramik)

0-250 mL 250-500 mL 500-750 mL 750-1000 mL0

20

40

60

80

100

OTC TC CTC

Sonde 2 (Teflon)

0-250 mL 250-500 mL 500-750 mL 750-1000 mL0

20

40

60

80

100

OTC TC CTC

Sonde 3 (Nylon-Membran)

0-250 mL 250-500 mL 500-750 mL 750-1000 mL0

20

40

60

80

100

OTC TC CTC

Sonde 4 (Borosilikatglas)

A B C D0

20

40

60

80

100

OTC TC CTC

20

Abb. 6: Wiederfindung (% WDF) in Sondentests mit Grundwasser (tetracyclinfrei,oberflächennah, matrixreich). OTC, TC und CTC wurden in einer Konzentrationvon 1 µg/L zugesetzt. Dargestellt sind die Mittelwerte aus zwei unabhängigen Ver-suchen.

Sonde 4 (Borosilikatglas)

A B C D0

20

40

60

80

100

OTC TC CTC

Sonde 3 (Nylon-Membran)

0-250 mL 250-500 mL 500-750 mL 750-1000 mL0

20

40

60

80

100

OTC TC CTC

Sonde 1 (P80 Keramik)

0-250 mL 250-500 mL 500-750 mL 750-1000 mL0

20

40

60

80

100

OTC TC CTC

Sonde 2 (Teflon)

0-250 mL 250-500 mL 500-750 mL 750-1000 mL0

20

40

60

80

100

OTC TC CTC

21

4.2 Ergebnisse der Grundwasseruntersuchungen

Eine Entnahme von Sickerwasser war aufgrund der hohen Grundwasserstände auf

BDF 01 sowohl während der Beprobung im Frühjahr als auch im Herbst nicht möglich

(s. 2.4.3.3). Insofern sollte das in 1,4 m Tiefe gewonnene, oberflächennahe Grundwas-

ser von seiner Zusammensetzung her Sickerwasser sehr nahe kommen. Allerdings lässt

sich eine Verdünnung möglicher Antibiotikaeinträge in den Wasserpfad durch diese

speziellen Gegebenheiten im Jahre 2002 nicht ausschließen.

Die Ergebnisse dieser Untersuchungen an oberflächennahem Grundwasser, das mit

Saugsonden in 1,4 m Bodentiefe auf BDF 01 gewonnen wurde, sind in Tabelle 5 und 6

dargestellt. In den Wasserproben lassen sich trotz optimierter Probenahme keine Tetra-

cycline oberhalb der Nachweisgrenze von 0,05 µg/L detektieren. Ein Vergleich der bei-

den eingesetzten Sondenmaterialien kann aufgrund der Negativbefunde nicht vorge-

nommen werden. Auch in den untersuchten Proben des oberflächennahen Grundwassers

von BDF 02, dargestellt in Tabelle 7, die in einer Tiefe von 2,5 m unter der Gelände-

oberfläche gesammelt wurden, konnten keine Tetracycline nachgewiesen werden. Ein

Nachweis für den Eintrag von Tetracyclinen in das Grundwasser in Konzentrationen

> 0,05 µg/L kann somit nicht erbracht werden.

22

Tab. 5: Ergebnisse der Grundwasserbeprobung mit Saugsonden im Frühjahr 2002am Standort BDF 01.

Probenahme Sonde Sondenart OTC[µg/L]

TC[µg/L]

CTC[µg/L]

30.04.02 1G Borosilikat < 0,05 < 0,05 < 0,0530.04.02 2G Borosilikat < 0,05 < 0,05 < 0,0530.04.02 3G Borosilikat < 0,05 < 0,05 < 0,0530.04.02 4G Borosilikat < 0,05 < 0,05 < 0,0530.04.02 1K Nylon < 0,05 < 0,05 < 0,0530.04.02 2K Nylon < 0,05 < 0,05 < 0,0530.04.02 3K Nylon < 0,05 < 0,05 < 0,0530.04.02 4K Nylon < 0,05 < 0,05 < 0,0513.05.02 1G Borosilikat < 0,05 < 0,05 < 0,0513.05.02 2G Borosilikat < 0,05 < 0,05 < 0,0513.05.02 3G Borosilikat < 0,05 < 0,05 < 0,0513.05.02 4G Borosilikat < 0,05 < 0,05 < 0,0513.05.02 1K Nylon < 0,05 < 0,05 < 0,0513.05.02 2K Nylon < 0,05 < 0,05 < 0,0513.05.02 3K Nylon < 0,05 < 0,05 < 0,0513.05.02 4K Nylon < 0,05 < 0,05 < 0,0522.05.02 1G Borosilikat < 0,05 < 0,05 < 0,0522.05.02 2G Borosilikat < 0,05 < 0,05 < 0,0522.05.02 3G Borosilikat < 0,05 < 0,05 < 0,0522.05.02 4G Borosilikat < 0,05 < 0,05 < 0,0522.05.02 1K Nylon < 0,05 < 0,05 < 0,0522.05.02 2K Nylon < 0,05 < 0,05 < 0,0522.05.02 3K Nylon < 0,05 < 0,05 < 0,0522.05.02 4K Nylon < 0,05 < 0,05 < 0,0506.06.02 1G Borosilikat < 0,05 < 0,05 < 0,0506.06.02 2G Borosilikat < 0,05 < 0,05 < 0,0506.06.02 3G Borosilikat < 0,05 < 0,05 < 0,0506.06.02 4G Borosilikat < 0,05 < 0,05 < 0,0506.06.02 1K Nylon < 0,05 < 0,05 < 0,0506.06.02 2K Nylon < 0,05 < 0,05 < 0,0506.06.02 3K Nylon < 0,05 < 0,05 < 0,0506.06.02 4K Nylon < 0,05 < 0,05 < 0,05

23

Tab. 6: Ergebnisse der Grundwasserbeprobung mit Saugsonden im Herbst 2002am Standort BDF 01.


TC[µg/L]

CTC[µg/L]

11.11.02 1K Nylon < 0,05 < 0,05 < 0,0511.11.02 2K Nylon < 0,05 < 0,05 < 0,0511.11.02 3K Nylon < 0,05 < 0,05 < 0,0511.11.02 4K Nylon < 0,05 < 0,05 < 0,0525.11.02 1K Nylon < 0,05 < 0,05 < 0,0525.11.02 2K Nylon < 0,05 < 0,05 < 0,0525.11.02 3K Nylon < 0,05 < 0,05 < 0,0525.11.02 4K Nylon < 0,05 < 0,05 < 0,05

Tab. 7: Ergebnisse der Grundwasserbeprobung über Peilbrunnen im Herbst 2002am Standort BDF 02.


TC[µg/L]

CTC[µg/L]

19.11.02 P1 Teflon < 0,05 < 0,05 < 0,0519.11.02 P2 Teflon < 0,05 < 0,05 < 0,0519.11.02 P3 Teflon < 0,05 < 0,05 < 0,05

24

4.3 Zeitlich und räumlich intensiviertes Monitoring ausgewählter Boden-

Dauerbeobachtungsflächen in Norddeutschland

4.3.1 Standort BDF 01

Für alle Probenahmezeitpunkte konnten die Substanzen Tetracyclin und Chlortetra-

cyclin nachgewiesen werden. Die Rückstände wurden jeweils im humusreichen Ober-

boden des Pflughorizontes detektiert. Im Unterboden ließen sich weder Tetracyclin

noch Chlortetracyclin nachweisen. Rückstände von Oxytetracyclin wurden in keiner

Probe nachgewiesen. Alle Werte wurden um die mittlere Wiederfindung im Boden kor-

rigiert (s. Tab. 2) und auf das Trockengewicht bezogen. Die Konzentrationen für Tetra-

cyclin stellen die Summe aus Tetracyclin und 4-Epi-Tetracyclin dar.

4.3.1.1 Ergebnisse Standort BDF 01 Juni 2001

Die Ergebnisse der Bodenuntersuchungen bezüglich Tetracyclin und Chlortetracyclin

sind in Abbildung 7 dargestellt. In den einzelnen Segmenten des Oberbodens wurde

Tetracyclin in Konzentrationen von 62,8 µg/kg bis 440,6 µg/kg nachgewiesen; bei acht

von zwölf Proben lagen die Konzentrationen über 100 µg/kg. Tendenziell sind die Kon-

zentrationen für Tetracyclin in den ersten 10 cm niedriger als in den tieferen Schichten.

Die Gehalte an Chlortetracyclin waren deutlich niedriger und lagen im Mittel bei

5,2 µg/kg.

Abb. 7: Tetracyclin- und Chlortetracyclinkonzentrationen im Boden der BDF 01(Probenahme 19. Jun 01). Dargestellt sind die Mittelwerte � Standardabwei–chungen aus vier unabhängigen Beprobungen (Kernflächen 1–4).

Bodentiefe [cm]

00-10 10-20 20-30 30-40 40-50 50-60 60-70 70-80 80-90

Tetra

cycl

in [µ

g/kg

]

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

MW(KF1-KF4) Jun 2001

Bodentiefe [cm]

00-10 10-20 20-30 30-40 40-50 50-60 60-70 70-80 80-90

Chl

orte

tracy

clin

[µg/

kg]

0

5

10

250

300

350

400

450


n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n.

25

4.3.1.2 Ergebnisse Standort BDF 01 November 2001

Die Ergebnisse der Bodenuntersuchungen bezüglich Tetracyclin und Chlortetracyclin

sind in Abbildung 8 dargestellt. In den einzelnen Segmenten des Oberbodens wurde

Tetracyclin in Konzentrationen von 58,9 µg/kg bis 212,5 µg/kg nachgewiesen; bei sechs

von zwölf Proben wurden Konzentrationen über 100 µg/kg gemessen. Die Gehalte an

Chlortetracyclin lagen im Mittel bei 5,6 µg/kg. Aufgrund der Fruchtfolge und einer

mechanischen Ackerbehandlung im Herbst, welche in erster Linie eine Durchmischung

des Oberbodens zur Folge hat, kann eine Aussage über eine mögliche An- oder Ab-

reicherung in den einzelnen Bodensegmenten nicht getroffen werden.

Abb. 8: Tetracyclin- und Chlortetracyclinkonzentrationen im Boden der BDF 01(Probenahme 20. Nov 01). Dargestellt sind die Mittelwerte � Standardabwei–chungen aus vier unabhängigen Beprobungen (Kernflächen 1–4).

4.3.1.3 Ergebnisse Standort BDF 01 Mai 2002

Die Ergebnisse der beprobten Fläche bezüglich Tetracyclin und Chlortetracyclin sind in

Abbildung 9 dargestellt. Erstmals wurden auch im 30–40 cm Segment Rückstände

detektiert. Letzteres ist möglicherweise darauf zurückzuführen, dass nach der Boden-

bearbeitung im Frühjahr und der damit verbundenen Bodenlockerung der Pflughorizont

über 30 cm mächtig war und in der Schicht 30–40 cm ein Teil des Bodenmaterials aus

der Ackerkrume und ein Teil aus dem Unterboden stammte. Die Werte liegen in der Tat

etwa bei 50 % der Werte der Schichte zwischen 0 und 30 cm, was in etwa auf eine

1:1-Mischung von Ober- und Unterbodenmaterial hindeutet. In den einzelnen

Segmenten bis 40 cm Bodentiefe wurde Tetracyclin in Konzentrationen von 35,1 µg/kg

Bodentiefe [cm]

00-10 10-20 20-30 30-40 40-50 50-60 60-70 70-80 80-90

Tetra

cycl

in [µ

g/kg

]

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

MW(KF1-KF4) Nov 2001

Bodentiefe [cm]

00-10 10-20 20-30 30-40 40-50 50-60 60-70 70-80 80-90

Chl

orte

tracy

clin

[µg/

kg]

0

5

10

250

300

350

400

450


n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n.

26

Bodentiefe [cm]

0-10 10-20 20-30 30-40 40-50 50-60

Tetra

cycl

in [µ

g/kg

]

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450


n.n. n.n. n.n.

Bodentiefe [cm]

0-10 10-20 20-30 30-40 40-50 50-60

Chl

orte

tracy

clin

[µg/

kg]

0

5

10

250

300

350

400

450


n.n. n.n. n.n.

bis 529,8 µg/kg nachgewiesen; bei 11 von 16 Proben lagen die Konzentrationen über

100 µg/kg. Die Gehalte an Chlortetracyclin waren deutlich niedriger und lagen im

Mittel bei 5,7 µg/kg.

Abb. 9: Tetracyclin- und Chlortetracyclinkonzentrationen im Boden der BDF 01(Probenahme 30. Mai 02). Dargestellt sind die Mittelwerte � Standardabwei-chungen aus vier unabhängigen Beprobungen (Kernflächen 1–4).


Die Ergebnisse der im November beprobten Flächen sind in Abbildung 10 dargestellt.

Abb. 10: Tetracyclin- und Chlortetracyclinkonzentrationen im Boden der BDF 01(Probenahme 19./20. Nov 02). Dargestellt sind die Mittelwerte � Standardabwei-chungen aus vier unabhängigen Beprobungen (Kernflächen 1–4).

In den einzelnen Segmenten des Oberbodens wurde Tetracyclin in Konzentrationen von

23,4 µg/kg bis 350,8 µg/kg nachgewiesen. Diesmal lag lediglich bei drei von zwölf

Proben die Konzentration von Tetracyclin über 100 µg/kg. Erstmals ist das 0–10 cm

Bodentiefe [cm]

00-10 10-20 20-30 30-40 40-50 50-60 60-70 70-80 80-90

Tetra

cycl

in [µ

g/kg

]

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

MW(KF1-KF4) Mai 2002

Bodentiefe [cm]

00-10 10-20 20-30 30-40 40-50 50-60 60-70 70-80 80-90

Chl

orte

tracy

clin

[µg/

kg]

0

10

20

250

300

350

400

450

MW(KF1-KF4) Mai 2002

n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n.

27

Segment am höchsten belastet. Der mittlere Gehalt für Chlortetracyclin betrug

5,6 µg/kg. Im Gegensatz zur Probenahme Mai 2002 wurden keine Rückstände im 30–

40 cm Segment detektiert.

4.3.1.5 Gesamtergebnisse Standort BDF 01

Standort BDF 01, eine landwirtschaftliche Nutzfläche auf Sandboden, wurde während

des Untersuchungszeitraums vornehmlich mit Mais und/oder Wintergetreide kultiviert.

Abhängig von der Kultivierung, waren die einzelnen Kernflächen unterschiedlich oft

von Düngemaßnahmen betroffen. Die ausgetragene Gülle war Schweine- oder

Mischgülle. Die Termine für Entnahme der Bodenproben waren jeweils im Frühjahr

und im Herbst; beprobt wurde – für den Fall einer Begüllung – jeweils nach den

Düngemaßnahmen.

Bezogen auf den Oberboden (0–30 cm) traten die höchsten Werte im Frühjahr zu

Beginn einer Vegetationsperiode auf. Die bei den letzten drei Probenahmen

(20. Nov 01, 30. Mai 02 und 19./20. Nov 02) unterschiedliche Gülleausbringung auf

den jeweiligen Kernflächen (s. Tab. 8), spiegelte sich nicht in deren Einzelwerten

wieder. In der Tabelle wurden deshalb die Mittelwerte aller Kernflächen pro

Bodensegment angegeben.

Die Konzentrationen für Tetracyclin waren deutlich höher als für Chlortetracyclin, die

sich im Bereich der Bestimmungsgrenze von 5 µg/kg bewegten (s. Tab. 8). Insgesamt

wurde für Tetracyclin bei 54 % der positiven Einzelproben der Triggerwert

Ökotoxikologie von 100 µg/kg überschritten. Für die Mittelwerte der Kernflächen der

einzelnen Bodentiefen von 0–40 cm waren die Werte bei 10 von insgesamt 13 Boden-

segmenten größer als 100 µg/kg (s. Tab. 8). Betrachtet man die Gesamtbelastung des

Oberbodens (0–30 cm) an Tetracyclin, so lag diese für die alle vier Zeitpunkte über

diesem Triggerwert (s. Abb. 11). Die relative Abnahme der mittleren Tetracyclin-

Belastung im November betrug im Jahr 2001 37 % und im Jahr 2002 59 %.

28

Zeitpunkt der Probenahme

Jun 01 Nov 01 Mai 02 Nov 02

Konz

entra

tion

[µg/

kg]

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

TC (00-30 cm) CTC (00-30 cm)



Abb. 11: Tetracyclin- und Chlortetracyclinkonzentrationen im Boden der BDF 01(Probenahme Jun 01–Nov 01–Mai 02–Nov 02). Dargestellt sind die Mittelwerte �Standardabweichungen aus zwölf unabhängigen Beprobungen (Kernflächen 1–4;Bodensegmente 0–10, 10–20 und 20–30 cm).

29

Tab. 8: Gesamtergebnisse der Bodenuntersuchungen am Standort BDF 01. Ange-geben sind die Mittelwerte � Standardabweichungen aus vier unabhängigen Be-probungen (Kernflächen 1–4), zu vier verschiedenen Zeitpunkten mit denjeweiligen Düngemaßnahmen.

GülleausbringungGülle [m3/ha] 40 25 30 25

Zeitpunkt 23. Apr 01 11. Okt 01 17. Apr 02 20. Jul 02Kernflächen KF 1–4 KF 2/3 KF 1/4 KF 2/3

ProbenahmeBodentiefe

[cm] 19. Jun 01 20. Nov 01 30. Mai 02 19./20. Nov 02

TC [µg/kg]

0–10 87,2 � 25,6 118,6 � 47,3 226,5 � 208,1 181,4 � 165,010–20 266,8 � 146,1 113,2 � 70,3 295,3 � 127,9 91,7 � 11,720–30 182,2 � 110,4 104,2 � 38,3 234,7 � 204,1 35,1 � 8,430–40 < 1,0 < 1,0 116,8 � 93,5 < 1,050–60 < 1,0 < 1,0 < 1,0 < 1,060–70 < 1,0 < 1,0 < 1,0 n.d.*70–80 < 1,0 < 1,0 < 1,0 n.d.80–90 < 1,0 < 1,0 < 1,0 n.d.

ProbenahmeBodentiefe

[cm] 19. Jun 01 20. Nov 01 30. Mai 02 19./20. Nov 02

CTC [µg/kg]

0–10 5,3 � 1,1 6,5 � 1,4 6,0 � 0,9 6,3 � 2,610–20 5,7 � 0,5 4,8 � 1,5 6,1 � 1,7 5,1 � 2,420–30 4,7 � 2,5 5,7 � 1,3 6,5 � 0,9 5,6 � 1,630–40 < 2,0 < 2,0 4,4 � 1,5 < 2,050–60 < 2,0 < 2,0 < 2,0 < 2,060–70 < 2,0 < 2,0 < 2,0 n.d.70–80 < 2,0 < 2,0 < 2,0 n.d.80–90 < 2,0 < 2,0 < 2,0 n.d.

* n.d., nicht durchgeführt

30

Bodentiefe [cm]

00-30 30-40 30-60 60-90

Tetra

cycl

in [µ

g/kg

]

0

2

4

6

8

60

70

80

90

100

MW (KF1-KF4) Nov 2001

n.n. n.n. n.n.

Bodentiefe [cm]

00-30 30-40 30-60 60-90

Chl

orte

tracy

clin

[µg/

kg]

0

2

4

6

8

60

70

80

90

100


n.n. n.n. n.n.

4.3.2 Standort BDF 02

Für alle Probenahmezeitpunkte konnten die Substanzen Tetracyclin und Chlortetra-

cyclin nachgewiesen werden. Die Rückstände wurden jeweils im humusreichen Ober-

boden detektiert. Im Unterboden ließen sich weder Rückstände von Tetracyclin und

Chlortetracyclin, noch Oxytetracyclin nachweisen. Alle Werte wurden um die mittlere

Wiederfindung im Boden korrigiert (s. Tab. 2) und auf das Trockengewicht bezogen.

Die Konzentrationen für Tetracyclin stellen die Summe aus Tetracyclin und 4-Epi-

Tetracyclin dar.



Abbildung 12 dargestellt. Die Rückstandskonzentrationen betrugen für Tetracyclin im

Mittel 4,6 µg/kg und für Chlortetracyclin 6,0 µg/kg.

Abb. 12: Tetracyclin- und Chlortetracyclinkonzentrationen im Boden der BDF 02(Probenahme 20. Nov 01). Dargestellt sind die Mittelwerte � Standardabweichun-gen aus vier unabhängigen Beprobungen (Kernflächen 1–4).

31

4.3.2.2 Ergebnisse Standort BDF 02 Juni 2002


Abbildung 13 dargestellt. Tetracyclin und Chlortetracyclin wurden in Konzentrationen

von 3,3 bis 98,9 µg/kg bzw. 2,6 bis 89,3 µg/kg nachgewiesen. Für beide Substanzen

betrugen die Gehalte im 0–10 cm Segment ungefähr das 5-fache der tieferen Segmente

des Oberbodens. Zu diesem Zeitpunkt (14. Jun 2002) stand auf der Fläche Silomais, der

zuvor mit der Schleppschlauchtechnik begüllt worden war. Die Gülle konnte somit

nicht eingearbeitet werden. Die in der Gülle enthaltenen Tierarzneimittelwirkstoffe

konzentrierten sich daher auf die obere Bodenschicht.

Abb. 13: Tetracyclin- und Chlortetracyclinkonzentrationen im Boden der BDF 02(Probenahme 14. Jun 02). Dargestellt sind die Mittelwerte � Standardabweichun-gen aus vier unabhängigen Beprobungen (Kernflächen 1–4).



Abbildung 14 dargestellt. Die Rückstandskonzentrationen in den einzelnen Segmenten

des Oberbodens bewegten sich für Tetracyclin zwischen 7,7 und 18,0 µg/kg und für

Chlortetracyclin zwischen 7,2 und 13,6 µg/kg.

Bodentiefe [cm]

00-10 10-20 20-30 30-40 40-50 50-60

Tetra

cycl

in [µ

g/kg

]

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


Bodentiefe [cm]

00-10 10-20 20-30 30-40 40-50 50-60

Chl

orte

tracy

clin

[µg/

kg]

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n.

32

Bodentiefe [cm]

0-10 10-20 20-30 30-40 40-50 50-60

Tetra

cycl

in [µ

g/kg

]

0

5

10

15

20

60

70

80

90

100


n.n. n.n. n.n.

Bodentiefe [cm]

0-10 10-20 20-30 30-40 40-50 50-60

Chl

orte

tracy

clin

[µg/

kg]

0

5

10

15

20

60

70

80

90

100


n.n. n.n. n.n.

Abb. 14: Tetracyclin- und Chlortetracyclinkonzentrationen im Boden der BDF 02(Probenahme 19. Nov 02). Dargestellt sind die Mittelwerte � Standardabweichun-gen aus vier unabhängigen Beprobungen (Kernflächen 1–4).

4.3.2.4 Gesamtergebnisse Standort BDF 02

Im Gegensatz zum Standort BDF 01, wurden hier während des gesamten Unter-

suchungszeitraums wesentlich niedrigere Konzentrationen im Boden nachgewiesen.

Bezogen auf den Oberboden (0–30 cm) traten die höchsten Werte erwartungsgemäß im

Frühjahr nach der Gülleausbringung auf. Im Vergleich zu der Probenahme im Herbst

bestand kein signifikanter Unterschied (s. Abb. 15).

Tetracyclin und Chlortetracyclin wurden in nahezu gleichen Konzentrationen nachge-

wiesen. Die Mittelwerte der Kernflächen lagen meist nahe der Bestimmungsgrenze von

5 µg/kg (s. Tab. 9), dennoch lagen auch hier einzelne Proben mit sehr viel höheren

Konzentrationen vor (s. 4.3.2.2). Der Triggerwert Ökotoxikologie von 100 µg/kg wird

allerdings für keine der untersuchten Proben überschritten.

33

Abb. 15: Tetracyclin- und Chlortetracyclinkonzentrationen im Boden der BDF 02(Probenahme Nov 01–Jun 01–Nov 02). Dargestellt sind die Mittelwerte � Stan-dardabweichungen aus zwölf unabhängigen Beprobungen (Kernflächen 1–4;Bodensegmente 0–10, 10–20 und 20–30 cm).

Zeitpunkt der Probenahme

Nov 01 Jun 02 Nov 02

Konz

entra

tion

[µg/

kg]

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

TC (00-30 cm) CTC (00-30 cm)



34

Tab. 9: Gesamtergebnisse der Bodenuntersuchungen am Standort BDF 02. Ange-geben sind die Mittelwerte � Standardabweichungen aus vier unabhängigen Be-probungen (Kernflächen 1–4), zu vier verschiedenen Zeitpunkten mit denjeweiligen Düngemaßnahmen.

GülleausbringungGülle [m3/ha] 16/20 30/15

Zeitpunkt20. Feb 01/

10. Apr 01

23. Apr 02/

11./12. Jun 02Kernflächen KF 1–4 KF 1–4

Probenahme ProbenahmeBodentiefe

[cm] 20. Nov 01Bodentiefe

[cm] 14. Jun 02 19. Nov 02

TC [µg/kg] TC [µg/kg]

0–30 0–10 44,9 � 36,3 10,2 � 2,510–20 6,9 � 3,0 15,9 � 1,4

4,6 � 0,7

20–30 11,4 � 2,8 11,2 � 2,430–40 < 1,0 30–40 < 1,0 < 1,030–60 < 1,0 50–60 < 1,0 < 1,060–90 < 1,0 60–90 n.d.* n.d.

Probenahme ProbenahmeBodentiefe

[cm] 20. Nov 01Bodentiefe

[cm] 14. Jun 02 19. Nov 02

CTC [µg/kg] CTC [µg/kg]

0–30 6,0 � 1,7 0–10 41,1 � 33,1 9,0 � 1,710–20 6,9 � 4,8 12,5 � 1,320–30 7,7 � 1,2 10,4 � 1,3

30–40 < 2,0 30–40 < 2,0 < 2,030–60 < 2,0 50–60 < 2,0 < 2,060–90 < 2,0 60–90 n.d. n.d.

*n.d., nicht durchgeführt

35

FundortSCR 01

SCR 02SCR 03

SCR 04SCR 05

SCR 06SCR 07

SCR 08SCR 09

SCR 10SCR 11

SCR 12SCR 13

SCR 14

Konz

entra

tion

[µg/

kg]

0

50

100

150

200

250

300

TC 00-30 cmCTC 00-30 cm


TriggerwertÖkotoxikologie(1996)

4.3.3 Flächenscreening

Die Ergebnisse der beprobten Flächen sind in den Abbildungen 16–18 dargestellt.

Oxytetracyclin, das ebenfalls mit der Methode erfasst werden kann, wurde in keiner

Probe nachgewiesen. In 2 von 14 Flächen waren keine Tetracycline nachweisbar, in

allen anderen Flächen waren sowohl Tetracyclin als auch Chlortetracyclin nachweisbar.

Betrachtet man die Gesamtbelastung des Oberbodens (0–30 cm) an Tetracyclinen

(s. Abb. 16), so war die niedrigste mittlere Konzentration 4,6 µg/kg und die höchste

267,0 µg/kg. Bei zwei der untersuchten Flächen wurden Tetracyclinkonzentrationen von

über 100 µg/kg in mindestens einem der Segmente des Oberbodens detektiert

(s. Abb. 17). Die Chlortetracyclinkonzentrationen bewegten sich alle unter 100 µg/kg

(s. Abb. 18).

Abb. 16: Gesamtbelastung des Oberbodens an Tetracyclin und Chlortetracyclinder 14 Screeningflächen (Probenahme 24. Jun 02). Dargestellt ist die Summe derMittelwerte aus den Konzentrationen der Segmente 0–10, 10–20 und 20–30 cm.

36

Bodentiefe [cm]

Tetra

cycl

in [µ

g/kg

]

0

50

100

150

200

250

300

350

00-1

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0

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20-3

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20-3

0

00-1

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20-3

0

00-1

010

-20

20-3

0

00-1

010

-20

20-3

0

SCR 01 SCR 02 SCR 03 SCR 04 SCR 05 SCR 06 SCR 07 SCR 08 SCR 09 SCR 10 SCR11 SCR12 SCR 13 SCR 14



Bodentiefe [cm]

Chl

orte

tracy

clin

[µg/

kg]

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

10000

-10

10-2

020

-30

00-1

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20-3

0

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20-3

0

00-1

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0

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20-3

0

00-1

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-20

20-3

0

00-1

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20-3

0

00-1

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20-3

0

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20-3

0

00-1

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-20

20-3

0

00-1

010

-20

20-3

0

00-1

010

-20

20-3

0

SCR 01 SCR 02 SCR 03 SCR 04 SCR 05 SCR 06 SCR 07 SCR 08 SCR 09 SCR 10 SCR11 SCR12 SCR 13 SCR 14



Abb. 17: Tetracyclinkonzentrationen im Boden der 14 Screeningflächen (Probe-nahme 24. Jun 02). Dargestellt sind die Mittelwerte aus zwei unabhängigenBestimmungen für jedes Segment.

Abb. 18: Chlortetracyclinkonzentrationen im Boden der 14 Screeningflächen(Probenahme 24. Jun 02). Dargestellt sind die Mittelwerte aus zwei unabhängigenBestimmungen für jedes Segment.

37

4.4 Gülleproben

Die Ergebnisse der Untersuchung der Gülleproben sind in Tabelle 10 zusammengefasst.

Die Werte sind die Mittelwerte aus zwei unabhängigen Bestimmungen. Von den drei

Tetracyclinen konnten Tetracyclin (inkl. Epimer) und Chlortetracyclin nachgewiesen

werden. Der Anteil an 4-Epi-Tetracyclin betrug dabei 14–19 %.

Tab. 10: Tetracyclingehalte in Gülleproben im Herbst 2002.

Fundort [mg/kg]

4-Epi-TC TC CTC

BDF 01 0,17 � 0,10 1,01 � 0,02 < 0,02

BDF 02 0,19 � 0,10 1,21 � 0,36 0,60 � 0,21

38

5 Diskussion

5.1 Untersuchung von Grundwasserproben

Im Rahmen des bundesweiten Untersuchungsprogrammes „Arzneimittel in der

Umwelt“ des BLAC (BLAC, 1999) soll der Eintrag von Human- und Tierarzneimittel-

wirkstoffen in die aquatische Umwelt erfasst werden. Der Schwerpunkt liegt dabei auf

der Erfassung der Stoffströme. Bislang sind nur Screening-Untersuchungen zu der

Gefährdung von Grund- und Oberflächengewässern durch Tierarzneimittel durchgeführt

worden (HIRSCH et al., 1999; LINDSEY et al., 2001). Demgegenüber sind keine

Langzeitstudien über den Eintrag von Tierarzneimitteln in das Grundwasser unter Feld-

bedingungen bekannt. Im Rahmen dieses Projektes wurde nun erstmalig eine Langzeit-

studie über eine mögliche Verlagerung von Tetracyclinen aus dem Boden in das

Grundwasser durchgeführt.

Grundlage unserer Untersuchungen war eine Pilotstudie (HAMSCHER et al., 2000), bei

der sich möglicherweise die eingesetzten Keramiksonden als problematisch im Bezug

auf die Probenahme von tetracyclinhaltigen Wässern erweisen könnten. Daher wurden

Sondentests unter Laborbedingungen durchgeführt, um eine optimale Probenahme zu

garantieren. Getestet wurden drei verschiedene Saugsonden zur Entnahme von Grund-

oder Sickerwasser (aus Keramik, Nylon oder Borosilikat) und eine Teflonsonde für die

Grundwasserentnahme. Obwohl die Saugsonden bei Einsatz von Pufferlösungen durch-

aus Unterschiede zeigten (s. Abb. 5), wurden diese unter praxisnahen Bedingungen

durch Matrixeffekte des verwendeten oberflächenahen Grundwassers annähernd

kompensiert (s. Abb. 6). Unter diesen Bedingungen zeigte die Nylon-Membran die

höchsten Wiederfindungen und war somit für die folgenden Sickerwasser-

untersuchungen das Saugsondenmaterial der Wahl. Eingesetzt im Feldversuch wurden

schließlich sowohl Nylon- als auch Borosilikat-Sonden, um die im Labor erhobenen

Befunde auch in der Praxis abzusichern. Für die Gewinnung der Grundwasserproben

erwiesen sich die bereits in der Pilotstudie eingesetzten Teflonsonden als

unproblematisch.

39

Die gewählten Standorte der Grundwasseruntersuchungen waren landwirtschaftliche

Nutzflächen in der Region Weser-Ems mit vornehmlich Maisanbau. Standort BDF 01

wurde v. a. mit Schweinegülle gedüngt, wohingegen Standort BDF 02 mit Mischgülle

beaufschlagt wurde. Die Flächen wurden einmal jährlich im Frühjahr gedüngt, dabei

wurden ungefähr 30–50 m3 Gülle pro Hektar ausgebracht. Die Probenahme erfolgte an

drei bzw. vier verschiedenen Entnahmestellen in ca. 5 m Abstand, so dass eine repräsen-

tative Probenahme über die Fläche gewährleistet war.

Die innerhalb der Projektlaufzeit untersuchte BDF 01 wird einschließlich der Pilotstudie

nun seit fast drei Jahren regelmäßig beprobt. Trotz einer hohen Exposition mit einer

mittleren Tetracyclinkonzentration von ~160 µg/kg, waren die Tetracyclinkonzen-

trationen in Grundwasser, gewonnen mittels Saugkerzen, stets unterhalb der Nachweis-

grenze (< 0,05 µg/L).

Über Peilbrunnen fand eine direkte, einmalige Beprobung des oberflächennahen

Grundwassers am Standort BDF 02 statt. Auch hier wurden die Ergebnisse der Pilot-

studie bestätigt, denn trotz Worst-case-Bedingungen (oberflächennahes Grundwasser,

Tiefe 2,5 m) war kein Übergang von Tetracyclinen in das Grundwasser oberhalb der

Nachweisgrenze von 0,05 µg/L detektierbar.

Die von uns durchgeführten Untersuchungen an BDF 01–02 stehen im Einklang mit

Screening-Untersuchungen an Grund- und Oberflächengewässern in Deutschland und

den USA, die insbesondere eine Gefährdung des Grundwassers durch einen Eintrag von

Tetracyclinen bislang nicht nachweisen konnten.

HIRSCH et al. (1999) fanden in 2 von 59 untersuchten Grundwasserproben, die aus

Einzugsbebieten mit intensiver Tierhaltung in Hessen stammten, Sulfadimidin mit einer

maximalen Konzentration von 0,16 µg/L. Diese Befunde konnten allerdings durch

weitere Untersuchungen nicht bestätigt werden. Tetracycline wurden in keiner Probe

nachgewiesen bei einer Bestimmungsgrenze von 0,05 µg/L. Hieraus leiteten die

Autoren ab, dass Sulfonamide und Tetracycline aus der Veterinärmedizin kein

besonderes Risiko für das Grundwasser darstellen.

LINDSEY et al. (2001) zeigten, dass Sulfonamide und Tetracycline in 9 von 144

Grund- und Oberflächengewässern der USA in Konzentrationen von 0,07–15 µg/L

nachweisbar waren. Davon bezieht sich nur ein positiver Befund auf Grundwasser

40

(0,22 µg/L Sulfamethoxazol). Allerdings wird diese Substanz in der Regel nur in der

Humanmedizin eingesetzt. Tetracycline wurden nur in Oberflächengewässern nachge-

wiesen (OTC 0,15 µg/L, TC 0,07–1,34 µg/L und CTC 0,11 µg/L). Somit scheint nach

Ansicht dieser Autoren ein run-off der Substanzen in die Oberflächengewässer

wahrscheinlicher zu sein, als ein Eintrag in das Grundwasser durch Auswaschen der

Böden.

Das in den USA weit verbreitete Anlegen von sogenannten Gülle-Lagunen stellt hin-

sichtlich der Gefährdung des Grundwassers möglicherweise ein spezifisches lokales

Risiko dar. Allerdings konnten weder MEYER et al. (2000) noch ZHU et al. (2001) im

Grundwasser-Bereich dieser Anlagen Tetracycline nachweisen.

41

5.2 Bodenuntersuchungen

Die dem Projekt vorangegangenen Einzeluntersuchungen stellten lediglich eine

Momentaufnahme dar, die sowohl zeitlich als auch räumlich intensiviert werden

mussten. Die Untersuchungen sollten insbesondere Aufschluss darüber geben, ob Tetra-

cycline in der Ackerkrume persistent sind und ein Eintrag dieser Wirkstoffe in den

Unterboden stattfindet. Bei der Probenahme wurden weiterhin die saisonalen Arbeits-

zyklen der Landwirtschaft berücksichtigt. Während der Gesamtdauer des Projektes von

18 Monaten wurden die Befunde der Pilotstudie (HAMSCHER et al., 2000) durch die

erweiterte Screeningstudie und die Langzeitstudie sowohl in qualitativer als auch in

quantitativer Hinsicht bestätigt.

Keine Tetracyclinrückstände waren unter Berücksichtigung der Nachweisgrenzen in den

Bodenschichten unterhalb 40 cm nachweisbar, d. h. unterhalb des humusreichen Ober-

bodens und der Pfluggrenze. Insofern bestätigen sich hierdurch auch indirekt die

Negativbefunde im Grundwasser. Eine Verlagerung der Rückstände in die aquatische

Umwelt ist somit unwahrscheinlich.

Oxytetracyclin war in keiner Probe detektierbar, wohingegen zumindest Tetracyclin

oder Chlortetracyclin im Oberboden mit hoher Frequenz nachweisbar war.

Diese Ergebnisse stehen auch im Einklang mit der Verbrauchserhebung für Tierarznei-

mittel in der Region Weser-Ems, die von WINCKLER und GRAFE (2000) vorgestellt

wurde. Sowohl bei den Screeningflächen als auch bei den Boden-Dauerbeobachtungs-

flächen lässt sich das in dieser Region von den Reinwirkstoffmengen her selten einge-

setzte Oxytetracyclin nicht nachweisen.

5.2.1 Boden-Dauerbeobachtungsflächen

Die gewählten Standorte der Bodenuntersuchungen stammen aus dem niedersächsi-

schen Programm zur Boden-Dauerbeobachtung und sind landwirtschaftliche Nutz-

flächen in der Region Weser-Ems mit vornehmlich Maisanbau. Die Flächen wurden in

der Regel einmal jährlich im Frühjahr mit Gülle beaufschlagt, für den Standort BDF 01

v. a. mit Schweinegülle und für den Standort BDF 02 mit Rinder- und Schweinegülle.

42

5.2.1.1 Standort BDF 01

Für den Standort BDF 01 ließen sich sehr hohe Tetracyclinkonzentrationen nachweisen,

wohingegen die Chlortetracyclinkonzentrationen meist nahe der Bestimmungsgrenze

lagen. Dieses Rückstandsprofil blieb über den gesamten Untersuchungszeitraum erhal-

ten. Unsere Untersuchungen zeigen, dass diese landwirtschaftliche Nutzfläche auch

langfristig mit beträchtlichen Tetracyclinkonzentrationen exponiert ist. Die persistenten

Tetracyclinkonzentrationen im Oberboden (0–30 cm) liegen während der 18 Monate im

Mittel bei ~160 µg/kg und damit über den gesamten Untersuchungszeitraum deutlich

oberhalb des EMEA-Triggerwertes für Ökotoxikologie von 100 µg/kg. Bei Über-

schreitung dieses Triggerwertes im Boden sind seit dem 1. Juni 2001 bei der Zulassung

von neuen Tierarzneimitteln weitergehende ökotoxikologische Untersuchungen zum

Verhalten dieser Stoffe in der Umwelt erforderlich. Betrachtet man die Werte der

Einzelproben, so gibt es lokale Maxima, die über 500 µg/kg liegen. Unter Berück-

sichtigung der Gülleausbringung durch den Landwirt und das Unterpflügen ist jedoch

insgesamt von einer relativ homogenen Verteilung der Tetracyclinrückstände in der

gesamten Fläche auszugehen.

5.2.1.2 Standort BDF 02

Der Standort BDF 02 weist eine deutlich niedrigere Belastung an Tetracyclin dafür aber

eine etwas höhere an Chlortetracyclin auf. Dieses deutet auf ein unterschiedliches Ver-

hältnis der beiden Wirkstoffe beim Eintrag mit der Gülle, bestätigt durch die Gülle-

analyse, hin. Über den gesamten Untersuchungszeitraum liegt die mittlere

Tetracyclinkonzentration bei 13 µg/kg und die mittlere Chlortetracyclinkonzentration

bei 12 µg/kg. Obwohl die Belastung mit Tetracyclinen sehr viel geringer ist als bei

Standort BDF 01, ist auch hier ein kontinuierlicher Eintrag in den Boden feststellbar.

Aufgrund der geringen Konzentrationen im Oberboden (0–30 cm) kann keine Aussage

über eine An- oder Abreicherung der Substanzen getroffen werden. Dennoch kann man

auch hier von persistenten Rückständen sprechen.

43

5.2.2 Flächenscreening

Sowohl qualitativ als auch quantitativ konnten die Ergebnisse der Pilotstudie bestätigt

werden. Die Standorte der Pilotstudie wurden dabei um vier weitere Flächen ergänzt.

Das Rückstandsprofil entspricht eher dem des Standortes BDF 01, die Tetracyclin-

konzentrationen liegen im Allgemeinen deutlich über den Chlortetracyclinkonzentra-

tionen. Bezogen auf die Gesamtbelastung des Oberbodens (0–30 cm) an Tetracyclinen

überschreitet eine Fläche wiederum deutlich den Triggerwert von 100 µg/kg, 10 von 14

Flächen liegen zwischen 10–100 µg/kg und nur eine Fläche liegt unter 10 µg/kg. Die

Konzentrationen bei 2 von 14 Flächen liegen unter den Nachweisgrenzen von 2 µg/kg

für Chlortetracyclin und von 1 µg/kg für Tetracycline (TC, OTC).

5.2.3 Bewertung der Bodenuntersuchungen

In der EMEA/CVMP/055/96-Leitlinie (EUROPEAN UNION, 1996) ist seit 1996 für

die Zulassung neuer Tierarzneimittel eine umfassende ökotoxikologische Prüfung dann

vorgeschrieben, wenn sich eine auf Worst-case-Szenarien beruhende vorhersagbare

Arzneimittelkonzentration (PEC, predicted environmental concentration) im Boden von

über 100 µg/kg ergibt, die Halbwertzeit der Stoffe im Boden länger als 60 Tage ist und

weniger als 90 % des Wirkstoffes innerhalb eines Jahres im Boden abgebaut werden.

Die von uns erhobenen Befunde mit maximalen Tetracyclinkonzentrationen von mehr

als 500 µg/kg Boden sollten daher Anlass sein, eine ökotoxikologische Neubewertung

für die „Alt-Tierarzneimittel“ der Tetracycline durchzuführen.

Mit unseren Untersuchungen konnte auch gezeigt werden, dass Boden-Dauerbeobach-

tungsflächen mit gut dokumentierter Bodennutzung und Bodenbeschaffenheit die

Durchführung aussagekräftiger Feldstudien gewährleisten. So sind auch Langzeitunter-

suchungen, die insbesondere für eine Risikoabschätzung anthropogener Einträge in die

Umwelt unabdingbar sind, unter den hier etablierten und umfassend dokumentierten

Freilandbedingungen optimal durchführbar und sollten in dem beschriebenen Umfang

auch fortgesetzt werden.

44

5.3 Gülle

Die Gülleproben enthielten 1–1,2 mg/kg Tetracyclin und in der Probe der BDF 02

darüber hinaus 0,6 mg/kg Chlortetracyclin. In qualitativer Hinsicht entspricht dies für

BDF 02 auch den im Boden nachgewiesenen Substanzen. Für BDF 01 wurde kein

Chlortetracyclin gefunden, allerdings konnte diese Substanz bereits in den Gülleunter-

suchungen des Jahres 2000 und 2001 nur in geringen Konzentrationen (0,1 mg/kg)

nachgewiesen werden. Insofern sind die im Boden von BDF 01 nachgewiesenen Chlor-

tetracyclinkonzentrationen noch auf die Düngungen der Vorjahre zurückzuführen.

Die Berechnung der Umweltkonzentrationen im Boden bzgl. der gemessenen Kon-

zentrationen in den Gülleproben erfolgt nach der von WINCKLER und GRAFE (2000)

vorgestellten Abschätzung. Nach Düngeverordnung dürfen 170 kg-N-Äquivalent pro

Hektar Ackerland ausgebracht werden. Dies entspricht in etwa einer Güllemenge von

30,7 m3. Der Gülle legt man eine spezifische Dichte von 0,9 t/m3 zugrunde. Die Boden-

dichte wird mit 1.500 kg/m3 festgelegt, die Einarbeitungstiefe beträgt für die unter-

suchten Standorte 30 cm.

Für den Standort BDF 01 ergibt sich nach dieser Abschätzung für eine einmalige Zufuhr

eine theoretische Tetracyclinkonzentration von 7,5 µg/kg. Gemessen wurde im Novem-

ber 2002 mehr als das 10-fache, was auf höhere jährliche Einträge in der Vergangenheit

und eine Persistenz dieses Wirkstoffs im Boden hindeutet. Eine Berechnung der

Chlortetracyclinkonzentration kann aufgrund des Negativbefundes in der Gülle nicht

erfolgen. Auch korrelieren die Angaben der Landwirtschaftskammer Weser-Ems bzgl.

der Gülleausbringung auf einzelne Kernflächen zu bestimmten Zeitpunkten nicht mit

den analytischen Befunden.

Demgegenüber entsprechen für Standort BDF 02 die berechneten Tetracyclin- und

Chlortetracyclinkonzentrationen von 9,0 µg/kg bzw. 4,4 µg/kg in etwa den gemessenen

Werten. Dies ist ein Hinweis auf deutlich niedrigere Einträge in der Vergangenheit auf

dieser Fläche im Vergleich zu BDF 01, wobei allerdings auf BDF 02 ein Trend zu stei-

genden Konzentrationen zu erkennen ist.

45

6 Literatur

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46

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Bodenschutz 7, 141–148.

Bodenschutz 4 . 02 | 147

Publikation 5

Hamscher G, Pawelzick HT, Höper H, Nau H (2003):

Different behavior of tetracyclines and sulfonamides in sandy soils after repeated

fertilization with liquid manure.

Eingereicht: Environmental Toxicology and Chemistry (September 2003)

1

Different behavior of tetracyclines and sulfonamides in sandy soils after

repeated fertilization with liquid manure

Gerd Hamscher#, Heike Theresia Pawelzick#, Heinrich Höper§ and Heinz Nau#

#Department of Food Toxicology, School of Veterinary Medicine Hannover, Bischofsholer

Damm 15, D-30173 Hannover, Germany

§Institute of Soil Technology Bremen, Geological Survey of Lower Saxony (NLfB), Friedrich-

Missler-Str. 46/48, D-28211 Bremen, Germany.

Corresponding Author:

Gerd Hamscher

Department of Food Toxicology

School of Veterinary Medicine Hannover

Bischofsholer Damm 15

D-30173 Hannover, Germany

Tel : (++49)(+511)-856-7784

Fax : (++49)(+511)-856-7680

Email: [email protected]

2

Abstract

Recently we showed that tetracyclines persist and may accumulate in sandy soils after

repeated fertilizations with liquid manure. We continued these field investigations and

observed no further accumulation of tetracylines in soil, but found that the average

tetracycline exposition remained higher than 150 µg/kg soil over the last two years.

Nevertheless, no leaching of tetracyclines into deeper soil segments or groundwater was

observed. Furthermore, we developed new analytical methods for the detection of various

sulfonamides in liquid manure, soil, soil-water and ground-water. Investigation of the same

fields used in the tetracycline study showed that sulfamethazine occured in concentrations

approximately two orders of magnitude lower than that of tetracycline in the plough layer.

Although there were apparently very low concentrations of sulfamethazine in soil, we detected

it in suction probes at 1.4 m below soil surface in the spring of 2002. Further investigations

confirmed these findings. To our knowledge this is the first direct evidence of continuous

leaching of a veterinary drug from soil into groundwater under field conditions. We conclude

that tetracyclines and sulfonamides show distinctly different environmental behaviors. One

explanation may be their different sorption coefficients in soil, indicating (in part) their

different mobilities in this ecosystem.

Introduction

There has been a continously growing interest in the occurrence, fate and possible effects of

human and veterinary drug residues in the environment [1–6]. Studies with a special focus on

drugs used in human medicine have established that these compounds reach surface waters

mainly via the release of effluent from sewage treatment plants. Today, up to 80 compounds

have been identified and quantified in concentrations between the low range of nanograms up

to micrograms per litre [7]. Studies performed in the United Kingdom, Denmark, Germany

and the United States reveal that these agents represent a new class of organic environmental

contaminants world-wide [2–5, 8] There is concern about the effects of the entry of these

compounds into the environment, including the possibility of the spread of antibiotic

resistance [9–11] and/or effects on the endocrine system due to the ability of some of these

compounds to behave as hormones [2].

Veterinary drugs (e.g. various tetracyclines and sulfonamides, tylosin) are in use in large

amounts worldwide. The European Federation of Animal Health (FEDESA) estimates that

3

approximately 8,500 tons of antibiotics were used in human medicine and 4,700 tons in

veterinary medicine in the European Union (including Switzerland) in 1999 [12]. These drugs

are or have been in use for many years as feed additives, and for prophylactic, metaphylactic,

and therapeutic purposes. Although the topic has been intensively discussed in the scientific

community during the last couple of years, there is still a lack of knowledge, especially about

the behavior and fate of veterinary drugs in the environment under field conditions.

Recently, tetracyclines were detected on farmed land at concentrations of up to 300 µg/kg soil,

which demonstrating that this class of antibiotics used worldwide is persistent and may

accumulate in soil after repeated fertilization with liquid manure from intensive pig farming.

Furthermore, these initial field studies gave no evidence of leaching of these compounds into

deeper soil segments or into groundwater because of the strong sorption of the drugs in topsoil

[13, 14]. Field studies performed recently in Italy and the US confirmed the persistence of

tetracyclines in soil after the application of liquid manure [15, 16]. Preliminary results of a

screening study performed in 14 different soil-monitoring plots in Germany showed that the

only detectable sulfonamide in soil was sulfamethazine, which occured in four areas at a

maximum concentration of 11 µg/kg [17]. Using a highly sensitive LC-MS-MS method, other

investigators detected tiamulin in trace concentrations of 0.7 µg/kg in one of two investigated

soil samples [18].

Furthermore, it has very recently been shown that various antibiotics used as veterinary drugs

can attach to dust particles and spread through the air of pig confinement buildings [19]. This

retrospective study provided the first evidence of a heretofore unsuspected direct risk for

human health arising from the inhalation of dust contaminated with a cocktail of antibiotics

[19].

To obtain deeper insights into the exposition of farmland with antibiotics occuring after

regular soil amendment with liquid manure and into the behavior of the most important class

of veterinary drugs in the environment, we continued our initial investigations of tetracyclines

in a highly exposed soil-monitoring plot and also performed a more detailed subsampling

procedure. Furthermore, we developed LC-MS-MS methods for the detection of various

sulfonamides in liquid manure, soil, and soil-water and groundwater. Analysis of the same

field samples for the occurrence of this other important class of antibiotics made it possible to

make a comprehensive comparison of the environmental behavior of these compounds.

4

EXPERIMENTAL SECTION

Chemicals. HPLC-grade acetonitrile (J.T. Baker, Griesheim, Germany) and ethyl acetate

(Aldrich, Munich, Germany) were used here, as were analytical-reagent-grade ammonium

acetate, citric acid, sodium hydroxide (all from Merck, Darmstadt, Germany), formic acid

(Riedel de Haen, Seelze, Germany) and disodium-ethylenediaminetetraacetate (Sigma,

Munich, Germany). Water was prepared in house with a Milli-Q-System (Millipore,

Eschborn, Germany). The following substances were obtained from Sigma (Munich,

Germany): oxytetracycline, tetracycline and chlortetracycline (as their hydrochlorides), tylosin

tartrate and various sulfonamides (sulfadiazine (sodium salt), sulfathiazole, sulfamerazine,

sulfamethoxypyridazine, sulfamethazine (sodium salt), sulfamethoxazole and

sulfadimethoxine). Stock solutions (1mg/mL) of all standards were prepared with methanol.

The stock solutions were stored at -80 ºC and were stable for at least two months. Working

dilutions were prepared fresh on the day of use.

Liquid chromatography/tandem mass spectrometry and quantification. Mass

spectrometry was carried out using a LCQ ion trap with an electrospray ionization source

(Finnigan Mat, San Jose, CA, USA). Standard compounds (10 ng/µL) were infused through

an integrated syringe pump at a flow rate of 10 µL/min to tune the mass spectrometer and to

optimize capillary temperature, sheath gas, and auxillary gas flow rates. The source polarity

was set to positive for all compounds, and the spray needle voltage was 5 kV. Drying gas was

nitrogen generated from pressurized air in an Ecoinert 2 ESP nitrogen generator (DWT-

GmbH, Gelsenkirchen, Germany). The optimized conditions were: sheath gas flow set at 100

units, auxiliary gas turned off and capillary temperature 150 oC. More detailed LC and MS-

MS parameters have been reported previously for the tetracyclines and the sulfonamides [14,

19].

The HPLC system employed was a gradient system consisting of a Thermoquest P4000 pump,

an AS3000 autosampler (San Jose, CA, USA), and a Puresil C18 column (5 µm, 4.6 x 150

mm, Waters Corporation, Milford, MA, USA) operated at 23 �C. The flow of 1 mL/min was

split 1:10 before entrance into the mass spectrometer. The mobile phase consisted of 0.5%

formic acid in water with 1 mM ammonium acetate (solvent A, pH 2.5), and acetonitrile

(solvent B). The gradient run for the tetracyclines and tylosin increased from 0 to 50% B in 9

min, and was then held at 50% B for 1 min. After each run, the column was rinsed for 3 min

5

with 99% acetonitrile and re-equilibrated for 12 min with solvent A. In a second HPLC run

we baseline-separated and analyzed seven sulfonamides with a modified gradient system (i.e.

start: 100% Solvent A for 1 min, linear gradient to 25% B for 9 min, linear gradient to 50% B

for 1 min, and finally 50% B for 3 min). The same rinsing and reequilibration procedure

described for the tetrayclines was employed for the sulfonamides. The injection volume was 8

µL for soil and water samples, and 1–2 µL for liquid manure samples. The autosampler was

rinsed after each injection with 3 mL methanol / 10 mM oxalic acid (90/10, v/v).

Calibration curves constructed for oxytetracycline, tetracycline, chlortetracycline and tylosin

and the seven sulfonamides ranged from 0.1 to 10 ng per injection and were linear, with r2 >

0.99 for the MS-MS procedure. Quantification was obtained by comparing the peak areas of

the sample with that of the external calibration, and all data were corrected for recovery.

Sampling of soil, dried liquid manure aggregates, soil water and groundwater. Soil

samples were collected from an agricultural field in an area with intensive livestock farming

in northern Germany in June and November, 2001, May and November, 2002, and in May,

2003. The site is part of the Lower Saxony soil monitoring project, and soil properties and

land use have been well documented since 1993 [20]. This sandy soil consists of sand, clay

and organic carbon at 91.6%, 2.4%, and 1.8%, respectively. The pH(CaCl2) is 4.5. Corn was

grown for silage in the years from 1999 to 2002. The field is regularly fertilized with liquid

manure at rates of between 30 and 50 m³ per ha and year. Samples were collected in four

specifically marked areas of 16 x 16 m in 10-cm segments at depths of between 0 and 90 cm

below the soil surface. For subsoil sampling (30–90 cm), the material of the plough layer was

removed to avoid contamination of the samples with antibiotic-containing topsoil. After an

intensive soil survey of the field in a 25 x 25 m grid, subplots were chosen which had similar

soil properties, especially inregard to the soil profile, and which were at least 100 m away

from the field border. Samples were immediately transported under cooled conditions to the

laboratory and stored in the dark at 4 oC until analysis.

In addition, samples of the liquid manure from April, 2000 until April, 2002 were taken by the

farmer and analyzed for the antibiotics under investigation.

At the beginning of 2002, four polyamide membrane suction probes (Ecotech, Bonn) were

installed at a depth of 1.4 m. A mixture of approximately 1/3 soil-water and 2/3 groundwater

was sampled using a vacuum pump (200–400 hPa). The water was pumped into glass bottles

containing 1 mL of 5 M ammonium acetate.

6

Extraction procedures – general remarks. Tetracyclines are known to form chelate

complexes with metal ions and bind to proteins and silanol groups [21]. Therefore, all

glassware used was heated for 2 h at 450 ºC, cooled, rinsed with 2.5 mL of a saturated

methanolic EDTA solution and air dried prior to analysis. This procedure was also employed

during sulfonamide analysis because the final analytical method allowed the use of the same

extraction protocol for the analysis of both groups in soil and liquid manure.

Extraction of soil and liquid manure samples. Prior to the extraction of soil, the dry weight

was determined as follows: 20 g of each soil sample was incubated at 100 ºC for

approximately 24 h until constant weight was reached. The sample pretreatment performed for

the analysis of tetracyclines recently reported in detail [14] could be transfered without

changes to the analysis of sulfonamides in soil and liquid manure samples. Briefly, soil or

liquid manure were liquid-liquid extracted employing citrate buffer at pH 4.7 and ethyl

acetate. After evaporation of the organic phase to dryness the antibiotics were reconstituted

and subjected to LC-MS-MS analysis.

Recovery studies for the tetracyclines in soil and liquid manure have already been published

[14]. The recovery studies for the sulfonamides were carried out with control sandy soil

(similar to that used for the tertacyclines) spiked at the 5, 10, and 50 �g/kg levels. The

antibiotics were added in methanolic stock solution and extraction was performed after 5 min

equilibration. The control soil was prepared from ten sulfonamide-free sandy soil samples

taken at depths of 0–10 cm, 20–30 cm and 20–30 cm in the vicinity of the soil-monitoring plot

under investigation. Aliquots of 50 g of each sample were carefully mixed. At 2%, the mean

total organic content of the control sandy soil was very close to that of the area investigated.

The recovery rate was calculated as an average of eight experiments at each concentration.

The recovery studies for sulfonamides in liquid manure were carried out with a residue-free

liquid manure originating from a pig fattening farm. The extraction procedure was applied

after spiking the liquid manure with a methanolic stock solution of the seven sulfonamides to

obtain final concentrations of each compound of 0.2 and 1 mg/kg. Again, the recovery rate

was calculated as an average of eight experiments at both concentrations.

Extraction of water samples for the analysis of sulfonmaides. (Please note: as this

extraction procedure is slightly different from that recently reported for tetracyclines

7

[14], we therefore describe the procedure for sulfonamides in detail here.) Sample

preparation was performed on a Baker column processing system SPE-12G using 200-mg

Baker SDB 1 solid-phase cartridges (Baker, Griesheim, Germany). The cartridges were

conditioned with 10 mL of methanol pH 2.5 (adjusted with acetic acid), followed by 5 mL

methanol, and equilibrated with 12 mL 0.5 M citric acid buffer. Water samples of 25–50 mL

were diluted with the same volume of 1 M citric acid buffer (pH 4.7) and stirred for 1 min.

The loaded cartridge was washed with 10 mL distilled water. The retained sulfonamides were

eluted with 10 mL methanol and with 10 mL acetonitrile in a second step. The eluate was

evaporated to dryness and the residue dissolved in 200 µL methanol. Recovery studies were

carried out with antibiotic-free, matrix-rich groundwater obtained from a soil monitoring-plot

in the vicinity of the plot under investigation. The water was spiked with a methanolic stock

solution of the seven sulfonamides to give final concentrations of 0.2 and 1 µg/L. The

recovery rate was calculated as an average of eight experiments at each concentration.

RESULTS AND DISCUSSION

LC-MS-MS procedure for the analysis of sulfonamides in liquid manure, soil-water and

groundwater. HPLC employing a simple gradient system combined with ESI-MS-MS made

possible the sensitive and selective determination of the antibiotics in liquid manure, soil-

water and groundwater samples . The mean recoveries and the standard deviations for the

various sulfonamides in the matrices tested are given in Table 1. Due to a significantly higher

response in the ionization process, the sensitivity of the method for sulfamethazine is at least

two times greater than for the other sulfonamides.

The analytical procedure for the seven sulfonamides in liquid manure resulted in high

recovery rates for all compounds, with relative standard deviations generally below 10%. The

limit of quantification for liquid manure based on a signal-to-noise ratio greater than 6 was

0.02 mg/kg for sulfamethazine and 0.05 mg/kg for the other sulfonamides. Thus, recoveries

and detection limits can beobtained with the method developed here comparable to those

obtained with methods recently described [22, 23], but the extraction protocol presented here

is less laborious.

The limit of quantification based on a signal-to-noise ratio greater than 6 was 2 µg/kg for

sulfamethazine and 5 µg/kg for the six other sulfonamides in soil, and the limits of detection

8

based on a signal-to-noise ratio greater than 3 were approximately 0.5 µg/kg for

sulfamethazine and 1 µg/kg for all other sulfonamides under investigation here. With the

exception of sulfathiazole, the mean recovery rates were between 35 and 50%, with average

relative standard deviations below 20% comparable to that of tetracycline in soil as recently

reported [14]. This is in good accordance with several laboratory trials, demonstrating that,

due to their physicochemical properties, sulfonamides adsorb rapidly and strongly to soil [5,

24]. Figure 1 shows reconstructed LC-MS-MS chromatograms of a spiked soil sample

containing the seven sulfonamides at a concentration of 5 µg/kg. This figure demonstrates that

the LC-method developed here allows the baseline separation of six commenly used

sulfonamides in veterinary medicine with negligable noise, as well as the detection of

sulfamethoxazole, which is exclusively used in human medicine. Exposition of soils with this

drug may be observed when soil is amended with sewage sludge, which is likely to contain

sulfamethoxazole.

In water samples (including matrix-rich groundwater and soil-water) the limit of

quantification based on a signal-to-noise ratio greater than 6 was 0.05 µg/L for sulfamethazine

and 0.1 µg/L for all the other compounds. To obtain a high desorption of the sulfonamides

from the SDB-1 cartridge, further elution of the cartridge with acetonitrile must be preceded

by a preliminary elution step with methanol. The limit of detection based on a signal-to-noise

ratio greater than 3 was 0.01 µg/L for sulfamethazine and approximately 0.03 µg/L for the

other sulfonamides in the water samples. Thus, the method developed here produced reliable

results at low detection limits in a matrix similar to that of the field samples under

investigation. Recently, comparable methods based on solid-phase extraction (as a powerful

sample pretreatment step) have been developed for the analysis of tetracyclines and

sulfonamides in groundwater and surface water employing LC-MS [25], and for the analysis

of tetracyclines in groundwater and lagoon water employing LC-MS-MS [26]. Lindsey et al.

[25] obtained a limit of quantitation of 0.1 µg/L for each tetracycline and 0.05 µg/L for each

sulfonamide, while Zhu et al. [26] reported method detection limits from 0.20 to 0.28 µg/L for

the tetracyclines.

Applicability of the method. The validation data obtained in our recovery studies show that

this method, which was initially developed for the analysis of various tetracyclines, is also

suitable for the analysis of various sulfonamides in such difficult matrices as liquid manure

and soil, even in the low µg/kg range. This makes the method attractive for routine use, as it

9

permits the detection of the most important antibiotics used in veterinary medicine with a

single extraction procedure and two HPLC runs. The presented solid-phase extraction method

for the analysis of various sulfonamides, even in soilwater and matrix-rich groundwater, is

especially useful as a highly sensitive method to detect the veterinary drug sulfamethazine,

which is of great importance not only in Germany. For the further confirmation of

groundwater exposition to sulfamethazine in our field study, clear MS-MS spectra were

obtained applying the new method (Figure 3).

Occurrence, distribution and fate of tetracyclines and sulfonamides in liquid manure

and soil. The soil data presented here (Table 2) confirm our recent findings that tetracyclines

occur in relatively high concentrations and persist in the environment after repeated

fertilizations of farmland with liquid manure [14]. In addition, sulfamethazine was detectable

in very low concentrations just above the detection limit of this method. Furthermore, the

prolongation of these field studies revealed that, due to a moderate degradation of the

tetracylines during the summer months, there was no further accumulation of the drugs in soil

(Table 2). The average concentration of tetracycline (160 µg/kg calculated from Table 2)

remained at high levels for several years. These concentrations were even higher than the

trigger value of 100 µg/kg for these compounds in soil assessed by the Steering Committee of

the Veterinary International Committee on Harmonisation (VICH) [27]. A proper risk

assessment for this substance in soil is currently very difficult to perform. On the one hand,

the acute toxic risk for soil organisms arising from this exposition may be low due to the

strong binding of these substances to soil resulting in their limited bioavailability [28].

Furthermore, it should be noted that tetrayclines and several other antibiotics have relatively

low toxic potentials for the soil fauna should [29]. On the other hand, there is still a lack of

reliable methods to investigate the more subtle effects of subtherapeutic concentrations of

antibiotics over a long period, as this presents the optimal conditions for the development of

antibiotic resistance [11].

Three slurry samples from the farm where the experimental field is located were analyzed in

the years 2000 to 2002. Tetracycline was found in all three samples, and chlortetracycline and

sulfadiazine were detected in the samples of 2000 and 2001, whereas sulfamethazine was

found only found in the first sample, 2000 (see Table 2).

Assuming that the amended manure is incorporated into the first 30 cm of topsoil and that the

concentrations of veterinary drugs in the slurry were the same as those found in the analysis of

10

the samples provided by the farmer, the following concentrations in the soil after the three

disposals result: 73 µg/kg dry soil tetracycline, 1.7 µg/kg chlortetracycline, 12.8 µg/kg

sulfadiazine and 6.2 µg/kg sulfamethazine. Thus about ten applications would be necessary to

reach the tetracycline and chlortetracycline concentrations detected in the soil (see Table 3),

indicating the persistence of these substances. As shown before, tetracyclines tend to persist

and accumulate at low temperatures and under field conditions [14, 30]. Of the two

sulfonamides, sulfadiazine was detected in the liquid manure samples of 2000 and 2001 but

not in the soil, whereas sulfamethazine was only found in the liquid manure from 2000 but

was found in soil and ground water in 2002. The concentration of sulfamethazine in soil

measured in May 2002 (i.e. 1.8 µg/kg soil) corresponds to about 30% of the value calculated

from the input in 2000 (i.e. 6.2 µg/kg soil). Thus, sulfamethazine is degraded much more

rapidly in soil than are the tetracyclines. On the other hand, the results of the liquid manure

analyses show that sulfamethazine was used only until 2000 and degraded more slowly than

sulfadiazine. One may speculate that this indicates a higher degradation potential of the soil

for sulfadiazine than for sulfamethazine. However, as the liquid manure was sampled by the

farmer, it cannot completely be ruled out that the samples were not identical for the liquid

manure amended to the field.

These veterinary drugs were also found in the layer 30–40 cm below surface at one sampling

time (see Table 3). Due to the sampling of strictly-defined soil layers, material from the deep

plough horizon (about 30–35 cm below the surface) was also included into the sample. None

of the veterinary drugs analyzed here were detected in any of the 10-cm thick layers between

depths of 0.4 and 0.9 m above our detection limits.

Antibiotics in groundwater. No tetracyclines were found in the groundwater at a detection

limit of 0.05 µg/L in the suction probes at a depth of 1.4 m. This confirms the results of our

previous studies [13, 14]. The fact that tetracyclines are strongly adsorbed to the soil matrix,

with sorption coefficients (Kf) higher than 400 to 1000 mL/g [28, 31] accounts for the

negative findings in our samples. Further confirmation of our findings in the field are

supported by Hirsch et al. [32], Lindsey et al. [25] and Zhu et al. [26]. Neither group detected

any tetracyclines in groundwater sites in areas of animal husbandry in Germany and in the

United States.

Sulfamethazine, although present in the topsoil only at very low concentrations, was

repeatedly detected in the water of the four suction probes (see Table 4 and Figure 3), and in

11

several cases at concentrations above 0.1 µg/L. Hirsch et al. published the first report of

sulfamethazine in German groundwater in concentrations up to 0.16 µg/L in 2 of 59 samples

from a monitoring program in Germany [32]. However, that group could not confirm these

findings in samples taken several weeks later at the same sites or sites in close vicinity.

Therefore, they concluded that veterinary drugs pose only a minor risk for groundwater. Our

study provides the first evidence of the continuous leaching of a veterinary drug into

groundwater under field conditions. Therefore, the assessment of the risks of veterinray drugs

should include local groundwater contaminations (“hot spots”). A field study recently

performed in the UK with sulfachloropyridazine-spiked liquid manure revealed only a low

potential for this compound to leach into groundwater at a sandy site. However, that group

found pore water concentrations below or close to their detection limit of 0.25 µg/L in soil

[33].

In view of the available literature, we estimate the sorption coefficient (Kf) of sulfamethazine

as between 0.6 and 3.1 mL/mg [28]. Thus, under steady-state conditions, the equilibrium

concentration in the soil solution of the topsoil would be in the mean range between 0.4 and

1.8 µg/L. Taking dilution and biodegradation into consideration, it seems that the

concentrations found in groundwater are plausible and can be explained by leaching of

compounds from the topsoil into the subsoil. At present there is no legislation in Germany or

in the European Union concerning the occurrence of veterinary drugs in water. There is a

critical value of 0.1 µg/L for the occurrence of pesticides and biocides in drinking water [34].

The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products (EMEA) has also

recommended that a predicted environmental concentration of 0.1 µg/L in groundwater be

considered critical for the admission of a new veterinary medicinal product [35] and that

further testing be required if this limit is exceeded. Despite this recommendation, the

threshold value was recently raised to 1 µg/L [27].

Conclusions

A long-termc field study over three years revealed the exposition of soil to average tetracyline

concentrations higher than 150 µg/kg soil during the two years. There was no leaching of

tetracyclines into deeper soil segments or groundwater observed. To our knowledge, the

environemental exposition data for sulfamethazine provide for the first time evidence of the

leaching of a veterinary drug from soil into groundwater under field conditions. A direct

relationship was established between the occurrence of sulfamethazine in liquid manure,

12

which had been applied before this study, in soil and in shallowground water. Sulfadiazine,

although detected twice in pig slurry, was not found either in soils or in groundwater. These

findings suggest a higher degradation potential for this drug in the environment.

We conclude from our findings that tetracyclines and sulfonamides show distinctly different

environmental behaviors which may be explained by their different sorption coefficients in

soil, which in turn may partly be due to their different mobilities in that compartment.

Nevertheless, research on leaching of veterinary drugs should be intensified, as these

chemicals are very frequently detected in liquid manure [36] and in soils [13, 17];

furthermore, it must be expected that leaching occurs by miscible displacement and by

preferential flow in macro pores, as well.

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Acknowledgements

The field studies for the tetracyclines were supported in part by a grant from the Federal

Environmetal Agency of Germany (Project-No. FKZ Förderkennzeichen 201 91 217). The

authors are grateful to the Volkswagenstiftung, Germany, for financial support to equip the

laboratory for residue analysis in the Department of Food Toxicology of the School of

Veterinary Medicine Hannover. We thank Beate Priess for excellent technical support and Dr.

Bernd Kleefisch and Hubert Groh of the Lower Saxony soil monitoring project for soil, water

and liquid manure sampling, as well as for soil and land use information on the investigated

site. We are obliged to Dr. Judith McAlister-Hermann for careful proofreading of the

manuscript.

15

Tab

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19

Figure captions

Fig. 1: LC-ESI-MS-MS: Reconstructed ion chromatograms of 7 sulfonamides in a soil sample

spiked with 5 µg/kg of each veterinary drug.

Fig. 2: Molecular structures of the most frequently detected tetracyclines and sulfonamides in the

investigated liquid manure, soil and groundwater samples. The formation of reversible 4-epimers of

tetracycline and chlortetracycline occurs at this position (*).

Fig. 3: A: Left panel: reconstructed ion chromatograms of sulfamethazine in a water sample

containing 0.24 µgL, in which none of the other sulfonamides under investigation were detectable,

analyzed with LC-MS-MS (NL: normalized level). Right panel: the corresponding tandem mass

spectrum.

B: Standard of sulfamethazine representing 0.5 ng on column.

20

Figure 1

Tetracycline Chlortetracycline

Sulfamethazine

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21

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Sulfamerazinem/z: 265� 156 + 174

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Sulfamethazinem/z: 279 � 204

Sulfamethoxazolem/z: 254 � 147 + 156 + 188 + 190 + 194

Sulfadimethoxinem/z: 311 � 156 + 218 + 245

14

22

Figure 3

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2030

20

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100A 204

Publikation 6

Sczesny S, Nau H, Hamscher G (2003):

Residue Analysis of tetracyclines and their metabolites in eggs and in the envi-

ronment by HPLC coupled with a microbiological assay and tandem mass

spectrometry.

Journal of Agricultural and Food Chemistry 51, 697–703.

Residue Analysis of Tetracyclines and Their Metabolites inEggs and in the Environment by HPLC Coupled with aMicrobiological Assay and Tandem Mass Spectrometry

SILKE SCZESNY,† HEINZ NAU, AND GERD HAMSCHER*

Department of Food Toxicology, School of Veterinary Medicine,Bischofsholer Damm 15, D-30173 Hannover, Germany

Tetracyclines are widely used in farm animals. This can cause drug residues in products of animalorigin and, after excretion of these substances, in animal slurry and in soil fertilized with that slurry.In this paper, we present a method based on a microbiological assay coupled with HPLC for thedetection of oxytetracycline, tetracycline, and chlortetracycline in eggs. After a simple liquid extractionof the samples and HPLC separation, fractions were collected on microtiter plates, and the tetracyclineswere analyzed using the Staphylococcus aureus assay. This method was able to identify residues oftetracyclines in eggs at a level set by regulatory agencies (i.e., 200 µg/kg). In addition, it was shownthat the described microbiological method can be used as a screening assay for the detection oftetracyclines and possible biologically active metabolites in animal slurry and soil samples. Employingthe same extraction procedure, it was demonstrated that LC-MS-MS allowed the quantification of20-400 µg/kg in eggs with recoveries ranging from 71 to 109% and RSDs of 3-15%.

KEYWORDS: Tetracyclines; microbiological assay; LC -MS-MS; eggs, environmental samples

INTRODUCTION

Tetracyclines (TCs, molecular structures shown inFigure 1)are widely administered to farm animals as veterinary drugsbecause of their broad spectrum of activity and cost-effective-ness. The use of these substances may cause residues to be foundin meat and other products of animal origin. For this reason,the European Union has established maximum residue limits(MRLs) for oxytetracycline (OTC), tetracycline (TC), andchlortetracycline (CTC) (e.g., 200µg/kg in eggs). TCs are poorlymetabolized in animals (1). Therefore, significant amounts ofdrug residues can also occur in animal slurry. Recently, it wasshown that the application of contaminated slurry as fertilizercan result in drug residues in soil (2).

For the rapid detection of antibiotics in food, microbiologicalassays are routinely used because they are easy to perform andinexpensive. The main disadvantage of these tests is their lackof specificity; that is, they often detect growth inhibition of asensitive test strain, whether a substance with antimicrobialactivity is present or not. More sophisticated test systems allowthe detection of at least a substance group, but there is still nopossibility for identification or quantification of the residue. Thescreening of egg samples for the occurrence of antibioticresidues requires an appropriate sample pretreatment step, sincelysozyme (an endogenous antimicrobial substance in eggs)causes growth inhibition in microbiological screening tests. Such an assay was described for the detection of OTC in yolk and

albumen, where the limits of detection were 300 and 70µg/kg,respectively (3).

The method of choice for the identification and quantificationof tetracycline residues in eggs is HPLC coupled with either

* Corresponding author [telephone (++49) (+511)-856-7784, fax(++49)(+511)-856-7680, E-mail [email protected]].

† Present address: Department of Gastrointestinal Microbiology, GermanInstitute of Human Nutrition, 14558 Bergholz-Rehbru¨cke, Germany.

Figure 1. Molecular structures of the three investigated tetracyclines (leftpanel) and their corresponding reversible epimers (right panel).

J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 697−703 697

10.1021/jf0258407 CCC: $25.00 © 2003 American Chemical SocietyPublished on Web 00/00/0000

UV (4-6), fluorescence detection (5-7), or mass spectrometry(8). These methods require sample preparation of eggs mainlybased on a liquid extraction step followed by solid-phaseextraction. For this purpose, EDTA-McIlvaine buffer (8, 9) aswell as sodium succinate (10) or glycerine-HCl buffer (7) arerecommended. Aside from this, liquid-liquid extraction can beperformed using citrate buffer followed by ethyl acetate (4).Solid-phase extraction is mainly performed with reversed-phasematerials or by metal chelate affinity chromatography (4, 7).These sample preparation procedures are time-consuming andlabor-intensive. A sample pretreatment without these disadvan-tages involves an automated sample preparation based on onlinedialysis coupled with solid-phase extraction (5, 6, 11).

The analysis of TCs in soil in a milligrams per kilogram rangehas been reported in only a few methods. In particular, theapplication of microbiological assays for the analysis of CTC,following a simple liquid extraction of soil with aqueousmethanol (pH 8) or acidified acetone, has been described (12,13). The sensitive detection of OTC, CTC, and TC in sandysoil at a detection limit of 1-2.5µg/kg and employing a liquid-liquid extraction with citrate buffer and ethyl acetate combinedwith tandem mass spectrometry has been recently described (14).

This paper reports on a new method for the detection of TCsin eggs, animal slurry, and soil based on a microbiological assaycoupled with HPLC. There are two main advantages of thisprocedure: first, HPLC allows the identification of the threetetracyclines via their specific retention times, and second, themicrobiological assay allows for quantification via the selectivedetection of their antimicrobial activity. In addition, when usinga microbiological detection system, a reduced sample pretreat-ment is necessary in comparison to HPLC-UV or HPLC-fluorescence detection. Therefore, the microbiological assay canbe used as a sensitive and selective screening test for variousTCs in eggs within the MRL. For further confirmation and amore sensitive quantification of TC residues in food andenvironmental samples with LC-MS-MS, the describedsample cleanup is also recommended.

MATERIALS AND METHODS

Standard Substances.TC, CTC, and OTC (in hydrochloride form)were obtained from Sigma (Deisenhofen, Germany). Stock solutionsof these antibiotics were made by dissolving 1 mg/mL in methanol.These solutions were stored at-80 °C and were stable over a periodof at least 2 months. Working solutions in a concentration range of1-6 ng/10µL in methanol were prepared freshly on the day of use forthe microbiological assay. Standards for LC-MS-MS were used atconcentrations of 0.1-10 ng per injection. These standards were alsofreshly prepared on the day of use. To compensate for matrix effectsduring the analysis of TCs in eggs using LC-MS-MS, standards wereprepared by adding 10% of an extract of residue-free eggs.

Preparation of the Microbiological Assay. Assay medium wasprepared by dissolving 37 g of brain-heart broth (Merck, Darmstadt,Germany) in 1 L of distilled water prepared in-house by a Milli-Qsystem (Millipore, Eschborn, Germany). The broth was sterilized at133 °C and 3 bar for 15 min. The microbiological assay was carriedout using a cryopreservedStaphylococcus aureusstrain resistant tocolistin (S. aureusRU 4220) cultured in brain-heart broth with 0.011%colistin (a generous gift of Alpharm, Denmark) and adjusted to pH 5.9with acetic acetate (Sigma). For the preparation ofS. aureus,one well-isolated colony of the strain grown on blood agar was suspended inthe above-described medium and incubated for 24 h at 37°C. Thisbacterial growth was subcultured after 24 h by adding 300µL of theinitial broth culture to a second sterile aliquot of brain-heart broth(20 mL). This procedure was essential to ensure that the culture waspure. From the second culture, 2 mL was added to 40 mL of sterilemedia and incubated at 37°C. After 6 h, an equal volume of sterile

glycerol (Merck, 800 mL/L of H2O) was added to the culture and mixedthoroughly. The culture was then dispensed in 0.5-mL aliquots intosterile cryovials, shock-frozen in liquid nitrogen, and stored at-80 °Cprior to use. These cultures were stable for up to 2 years.

For the preparation of the assay, a 200-µL vial of rapidly thawedS.aureusstock culture was added to brain-heart medium (100 mL). Afterthorough mixing with a magnetic stirrer, 100µL of the inoculatedmedium was dispensed to each well of a 96-well microplate. Eightblank controls were created by dispensing medium without bacteria inthe first well of each lane of the microplates. Each plate was coveredwith a plate sealer (Dunn Labortechnik, Asbach, Germany), mixed byinversion, and incubated for 18 h at 37°C. The growth of the bacteriawas determined photometrically by measurement at 595 nm with amicroplate reader (Modell Benchmark, Bio-Rad, Munich, Germany)connected to a computer system (Microplate Manager version 4.0, Bio-Rad). Prior to measurement, the test plates were intensively shaken byhand.

Standard Curve of the Microbiological Assay.The calibration ofthe assay was performed using standards in a range of 1-6 ng on theHPLC column, equivalent to 100-600 ng/mL (injection volume 10µL). Each concentration was measured six times. Standard curves werecalculated from the mean at each concentration. To control thecalibration curve prior to analysis, standards at concentrations of 200,300, and 600 ng/mL were measured.

Processing of the Plate Data.Initially, the mean of the blankcontrols was subtracted from the measurements of the test wells. Thesedata were then calculated as percent growth inhibition, and a chro-matogram was constructed. Finally, tetracycline concentrations werecalculated using calibration curves described as a polynome of threedegrees.

Extraction of Tetracyclines from Whole Egg, Slurry, and SoilFollowed by HPLC Separation and Microbiological or TandemMass Spectrometry Detection.All glassware used was heated at 450°C, cooled, rinsed with HPLC gradient-grade methanol (Sigma)saturated with EDTA (Sigma), and then air-dried. Citrate buffer (1 M,pH 5 for egg samples, pH 4.7 for environmental samples) was preparedby dissolving 192 g of citric acid in approximately 800 mL of distilledwater, adjusting the pH with sodium hydroxide, and making up to 1 Lwith water.

Whole egg was homogenized using an Ultra Turrax homogenizer(T25 basic, IKA Labortechnik, Staufen, Germany). One gram of thehomogenate was mixed with 1.2 mL of 1 M citrate buffer (pH 5) in25-mL plastic tubes (Beckman, Munich, Germany) using a magneticstirrer. Ten milliliters of acetonitrile (HPLC gradient grade, J.T. Baker,Gross-Gerau, Germany) was then added, and the whole mixture wasstirred for another 15 min. The sample was centrifuged for 10 min at3000g. The resulting supernatant was transferred into glass flasks, andthe residue was mixed with 1.2 mL of distilled water. A further 10 mLof acetonitrile was added to the sample, and the extraction procedurewas repeated. The supernatants were combined and evaporated todryness under vacuum at 40°C. The dried sample was reconstitutedwith 400 µL of methanol.

Sample preparation of soil and slurry samples was performed witha liquid-liquid extraction. A 1-g sample was mixed with 1.2 mL ofcitrate buffer (pH 4.7) and extracted twice with 6 mL of ethyl acetateas previously described (14). Ethyl acetate was evaporated to dryness,and samples were reconstituted with 200µL of 90% acetonitrile/10%10 mM ammonium acetate.

HPLC separation was carried out on a Puresil C18 column (WatersCorp., Milford, MA) with a gradient solvent system consisting of 0.5%formic acid (Riedel-de Haen, Selze, Germany) in water containing 1mM ammonium acetate (Merck) (solvent A, pH 2.5) and acetonitrile(solvent B) using the method recently described (14). An injectionvolume of 10µL for egg samples, 8µL for soil samples, and 1-2 µLfor slurry samples was used.

For detection, the microbiological assay was used, and tandem massspectrometry was carried out employing an LCQ ion trap with anelectrospray ionization source (Finnigan MAT, San Jose, CA). Thesource polarity was set positive for all compounds, the spray needlevoltage was 5 kV. Drying gas was nitrogen generated from pressurizedair in an Ecoinert 2 ESP nitrogen generator (DWT-GmbH, Gelsen-

698 J. Agric. Food Chem., Vol. 51, No. 3, 2003 Sczesny et al.

kirchen, Germany). The optimized conditions were as follow: sheathgas flow was set at 100 units, the auxiliary gas was turned off, and thecapillary temperature was 150°C (for further details, refer to ref14).After HPLC separation, the solvent was split: 10% was used for tandemmass spectrometry, and 90% was fractionated in aliquots of 300µLinto microplates containing 30µL of 2% Tween 80 (Sigma) in waterin each well. After fractionation, the plates were covered with theoriginal plastic covers and immediately frozen at-80 °C andlyophilized overnight.

Recovery Studies.Recovery studies for the LC-MS-MS methodwere carried out with eggs from untreated laying hens at concentrationsof 20, 50, 100, 200 (the MRL), and 400µg/kg. The recovery rates forTC and CTC were calculated as the sum of the epimer and its parentdrug as an average of three individual experiments.

To demonstrate the performance of the microbiological assay coupledwith HPLC, TCs stock solutions were added to homogenized egg toobtain final concentrations of 100, 150, and 200µg/kg. Sampleextraction and measurement with the microbiological assay were carriedout as described above. The procedure was repeated four times at eachconcentration, and samples were analyzed in duplicate.

Samples.Lyophilised egg samples from an interlaboratory test underthe supervision of the University of Wuppertal (Prof. Dr. Petz,Department of Food Chemistry) were used in the initial testing of thesample extraction and measurement procedure. Due to the establishmentof the final procedure, these samples were stored for 1 year at-80 °Cprior to analysis. The eggs were taken from hens fed with TC (seriesC) or TC, OTC, and CTC (series E). In addition, eggs from untreatedhens were spiked with TC (series B). During reconstitution of thesamples, they were mixed with water and then allowed to soak for 2h at 4°C. After shaking, samples were then handled like fresh wholeegg samples.

In a further step, the described method was applied to slurry, driedslurry aggregates, and soil samples in order to build up a screeningmethod for TCs in samples of environmental impact. Soil samples weretaken from an agricultural field in northern Germany at a depth of 0-30cm and divided further into subsamples of 0-10, 10-20, and 20-30cm. Soil was also sampled at a depth of 0-90 cm, with subsamplesranging from 0-30, 30-60, and 60-90 cm. Two weeks beforesampling, the field was fertilized with pig slurry, which was alsoinvestigated. Dried slurry aggregates were picked up from the topsoilof an agricultural field previously fertilized approximately 4 weeksbefore. All environmental samples were obtained from the same area.

RESULTS AND DISCUSSION

Microbiological Assay.The microbiological assay describedhere is performed in microplates, and the bacteria are grown asa broth culture. This is an important difference from otherdescribed microbiological methods for the detection of antibioticresidues, which are based on agar diffusion tests (3, 15). Thesetests detect substances with antimicrobial activity by a growthinhibition zone surrounding the sample spot (16) or by alterationin the color of the growth agar due to changes in the pH causedby the production of bacterial waste. The growth inhibition ofbacteria used in an agar diffusion test depends not only on theconcentration of the antibiotic but also on the substance classinvestigated. In addition, the employed test strains usually evenshow different sensitivities to members of the same substanceclass (e.g., chlortetracycline, oxytetracycline, and tetracycline).Consequently, the accurate quantification of antimicrobialresidues is not possible.

The newly developed assay based on a photometric measure-ment of the bacterial growth allows for this quantification ofthe residue. Therefore, we used a spreadsheet (Microsoft Excel)to plot (nanograms per well on they axis, and growth inhibitionon thex axis) the calibration for the microplates. We could showthat the calibration curves were nonlinear and calculated apolynomial (third degree) equation (seeFigure 2). A similar

approach has recently been undertaken for the analysis ofmicrobiological folate in erythrocytes (17).

There are two additional advantages of the described assay:the simple assay preparation procedure and the use of cryopre-served cultures, which eliminates serial subculturing of thebacterial strain.

Coupling HPLC with a Microbiological Assay. The suc-cessful coupling of HPLC with a microbiological assay has somespecial requirements in the assay procedure. The HPLC eluentconsists of significant amounts of formic acid and acetonitrile,which are both highly toxic to the test organism. Therefore,the solvents need to be completely removed, for example, bylyophilization. Dispensing 2% Tween 80 into the wells prior toeluent fractionation prevents the adsorption of TCs to the surfaceof microplates and also facilitates the redissolving of freeze-dried fractions in the growth medium. Therefore, the identifica-tion of TCs is achieved on the basis of not only their retentiontimes but also the specific growth inhibition of a sensitive strain.

Assay Calibration. Typical calibration curves of CTC, OTC,and TC are shown inFigure 2. The three control samples(corresponding to 2, 3, and 6 ng on the HPLC column per 10-µL injection) demonstrated the fitting of the calibration curvein each sample series. The limited concentration range of thecalibration lines did not allow for the quantification of residuesat concentrations of more than 6 ng per 10µL injection. Usingthe described sample preparation for eggs, 5 ng on the HPLC

Figure 2. Calibration curves of the microbiological assay for chlortetra-cycline (CTC), oxytetracycline (OTC), and tetracycline (TC). The standarddeviations were 2−8% for chlortetracycline, 3−9% for oxytetracycline, and6−12% for tetracycline.

Residue Analysis of Tetracyclines and Their Metabolites J. Agric. Food Chem., Vol. 51, No. 3, 2003 699

column was equivalent to the MRL (200µg/kg). The measure-ment of higher concentrations required an appropriate dilutionor a reduction of the injection volume.

Quantification of 4-epi-TC and 4-epi-CTC was not possiblebecause of their low antimicrobial activity. Nevertheless, variouschromatograms illustrated some growth inhibition, with fractionscorresponding to 4-epi-CTC (as shown inFigure 3). This canbe explained by the fact that after 4-epi-CTC is separated viaHPLC, fractionated into the microplate, and then incubated, the4-epimer is partially converted back to the parent drug.Consequently, growth inhibition at the retention time of 4-epi-CTC is caused mainly by CTC itself. This growth inhibitionwas not used for quantification because the ratio between theepimer and its parent drug in the well was not known.

LC-MS-MS and Recovery Studies.Calibration curvesconstructed for OTC, TC, and CTC ranged from 0.1 to 10 ngper injection (10µL) and were linear, withr 2 ) 0.9998 forOTC, r 2 ) 0.9985 for TC, andr 2 ) 0.9971 for CTC for theMS-MS procedure. Quantification was obtained by comparingthe peak areas of the samples with those of the externalcalibration curves, and all data were corrected for recovery. Tocompensate for the signal enhancement effects resulting fromco-extracted matrix compounds, standards were prepared inmethanol containing 10% of a tetracycline-free egg extract.

The results of the recovery experiments at 20, 50, 100, 200,and 400µg/kg using LC-ESI-MS-MS are given inTable 1.The mean recovery is in the range of 71-109% for all TCs ineggs. The relative standard deviations were between 3 and 15%over all concentrations. These values are acceptable for such amethod and comparable to those obtained by another methodrecently described (4). The limit of quantification, defined asthe lowest level at which the method is valid, was 20µg/kg forall TCs. The limit of detection with a signal-to-noise ratio greaterthan 3 is approximately 5-fold lower for all TCs. Precursor and

product ions observed under MS-MS conditions were charac-teristic for TCs as recently described (14) and enabled identi-fication and confirmation of these compounds (seeTable 2).In light of all method validation parameters, the newly developedmethod including a rapid sample cleanup provides a high degreeof confidence, even at one-tenth of the actual maximum TCresidue level of 200µg/kg in eggs.

In addition, it could be shown that the microbiological assaycoupled with HPLC was able to detect TC residues in eggs ata concentration range between 150 and 200µg/kg. The meanconcentrations of TCs determined in these samples are providedin Table 3. This demonstrates that the newly developedmicrobiological assay detects TC residues in eggs at the levelset by regulatory agencies. The overestimation of OTC at aconcentration of 200µg/kg can be explained by a fractionationof epi-TC (epimer of TC) in the same well as OTC. Duringincubation, epi-TC is converted back to TC, resulting in growthinhibition at the retention time of OTC, which is caused by bothsubstances. At a concentration of 150µg/kg, co-fractionationof epi-TC and OTC leads to only a slight overestimation ofOTC. A concentration of 100µg/kg, which is equivalent to 2.5ng on the column, could not be detected. Injection of a standardat the same concentration led to a distinct growth inhibition inthe microbiological assay. An explanation for these differences

Figure 3. HPLC coupled with the microbiological assay. The analysis of a dried slurry aggregate containing tetracycline (TC), chlortetracycline (CTC),and 4-epi-chlortetracycline (4-epi-CTC) is shown.

Table 1. Recoveries ± Standard Deviations and the CorrespondingRelative Standard Deviations (RSD) of Oxytetracycline (OTC),Tetracycline (TC), and Chlortetracycline (CTC) in Whole Egg SamplesSpiked with 20, 50, 100, 200, and 400 µg/kg Using LC−MS−MSa

OTC TC + 4-epi-TC CTC + 4-epi-CTC

concn(µg/kg)

recovery(%)

RSD(%)

recovery(%)

RSD(%)

recovery(%)

RSD(%)

20 84 ± 8 10 85 ± 11 13 88 ± 3 450 71 ± 11 15 91 ± 3 3 73 ± 9 12

100 84 ± 8 9 109 ± 9 8 89 ± 11 13200 98 ± 10 10 105 ± 16 15 90 ± 13 14400 84 ± 5 6 88 ± 5 6 80 ± 4 4

a Values are the means of three independent determinations at each con-centration.

Table 2. Retention Times and Optimized MS−MS Parameters for theDetermination of Various Tetracyclines in Soil (Refer to Ref 14) and inWhole Egg

compoundtR

(min)precursor

mass (m/z)collision

energy (%)product ions (m/z)

(relative abundance, %)

oxytetracycline 7.06 461 20 426 (8), 443 (100), 444 (8)tetracycline 7.39 445 20 410 (6), 427 (100), 428 (5)chlortetracycline 8.35 479 27 444 (70), 461 (56), 462 (100)

Table 3. Mean Concentrations ± Standard Deviations and theCorresponding Relative Standard Deviations (RSD) of Oxytetracycline(OTC), Tetracycline (TC), and Chlortetracycline (CTC) in Whole EggSamples Spiked at 100, 150, and 200 µg/kg Using the MicrobiologicalAssay Coupled with HPLCa

OTC TC CTC

concn(µg/kg)

measured(µg/kg)

RSD(%)

measured(µg/kg)

RSD(%)

measured(µg/kg)

RSD(%)

100 nd nd nd150 172 ± 22 13 178 ± 23 13 125 ± 20 16200 nc 203 ± 28 14 198 ± 34 17

a Values are the means of eight independent determinations at each concentra-tion. nd, not detected; nc, not calculated, outside the linear range of the calibrationcurve.


might be the significant epimerization of the TCs during thesample preparation (refer to MS-MS data) or a lower avail-ability of TCs in the bacterial growth medium caused by co-fractionated egg substances.

Egg Samples.Egg samples from the interlaboratory test wereanalyzed using both described methods. Our results, as well asthe mean concentration of the values of all participants of thistest, are provided inTable 4. The findings of the MS-MSprocedure are documented for the parent drug, as well as thesum for the parent drug and its epimer. In addition, theconcentrations of iso-chlortetracycline (iso-CTC) and 4-epi-iso-chlortetracycline (4-epi-iso-CTC) are shown. Using the micro-biological assay, only the parent compounds were quantified.Using LC-MS-MS, the egg sample of series E was measuredthree times to detect parent substances and their 4-epimers andisomers (refer toFigure 5). The detection of all compoundswith antimicrobial activity required only a single HPLCseparation when the microbiological assay was used as a detector(refer toFigure 4). In conclusion, we demonstrate that HPLCcoupled with the described microbiological assay or tandemmass spectrometry is able to detect TC residues in eggs afterthe treatment of hens. Using the microbiological assay, detectionof TC residues at 93µg/kg in an egg sample from series C wasnot possible. This is in accordance with the recovery experimentsmentioned previously. Measuring samples of series B with themicrobiological assay coupled with HPLC and all samples usingLC-MS-MS demonstrated that data generated with thesemethods are comparable with the interlaboratory test data. Theseresults show that the microbiological assay can be used as ascreening method and provides the additional possibility toidentify TC residues in eggs. At the MRL level, the results of

this assay are comparable to those of existing analytical methods.However, in contrast to most described techniques, whichrequire labor-intensive sample preparation procedure, this assayneeds only a simple sample pretreatment. The LC-MS-MSmethod presented here is a useful and highly sensitive methodto identify and quantify TC residues and their epimers at a rangeof 20-400 µg/kg, without a sophisticated sample preparationprocedure. In addition, it is possible to detect iso-CTC and 4-epi-iso-CTC residues in eggs after the treatment of laying hens withCTC. Both substances are the main metabolites of CTC in eggs(18).

Environmental Samples. The described microbiologicalmethod was also employed for the detection of TCs in slurryand soil samples. Concentrations of 3.6 mg/kg TC and 0.18mg/kg CTC were detected in slurry, and LC-MS-MS alsoachieved similar values (4 mg/kg TC and 0.1 mg/kg CTC, referto 14). In addition, the slurry sample contained 0.5 mg/kg 4-epi-TC and less than 0.05 mg/kg each of iso-CTC and 4-epi-iso-CTC. The newly developed microbiological method was alsoused as a screening test to analyze soil samples taken from afield fertilized with the slurry as previously mentioned. In twosamples, this screening procedure showed detectable amountsof TC. In one sample taken at a depth of 0-30 cm, a TCconcentration of 214µg/kg was found. In the other sample,consisting of soil from a depth of 10-20 cm, the TC concentra-tion was 275 µg/kg. Quantification with MS-MS led toconcentrations of 254 and 195µg/kg for the same samples,respectively. A detailed investigation of the occurrence of TCsin this agricultural field has been recently described (14).

The dried slurry aggregates were of special interest becauseresidues may accumulate therein during the drying process.

Table 4. Egg Samples from an Interlaboratory Testa

OTC(µg/kg)

TC(µg/kg)

TC + 4-epi-TC(µg/kg)

CTC(µg/kg)

CTC + 4-epi-CTC(µg/kg)

iso-CTC(µg/kg)

4-epi-iso-CTC(µg/kg)

Series BLC−MS−MS 149 192HPLC−MA 127

Series CLC−MS−MS 93 153HPLC−MA ndmean interlaboratory test 166

Series ELC−MS−MS 172 195 317 120 174 288 219HPLC−MA 163 190 167mean interlaboratory test 184 275 142

a Comparison of LC−MS−MS and the microbiological assay coupled with HPLC results with the mean values of all participants of the interlaboratory test supervised bythe University of Wuppertal. Samples from series B were spiked with 200 µg/kg TC, samples from series C were taken from hens fed with TC, and samples from seriesE were obtained from hens fed with OTC, TC, and CTC. nd, not detected.

Figure 4. HPLC coupled with the microbiological assay. The analysis of an egg sample containing 200 µg/kg oxytetracycline (OTC), tetracycline (TC),and chlortetracycline (CTC) is shown.


During screening of these aggregates, a total growth inhibitionwas seen at the retention times of TC, 4-epi-CTC, and CTC.By reducing the injection volume, a TC concentration of 280µg/kg and a CTC concentration of 540µg/kg were calculated.In addition, a distinct growth inhibition at the retention time of4-epi-CTC could be seen (refer toFigure 3). Quantification ofthis compound, however, was not possible because 4-epi-CTChas very low antimicrobial activity and the ratio between 4-epi-CTC and CTC was unknown. At retention times between 5.5and 6.1 min, further growth inhibition could be detected. Toconfirm these findings and identify the unknown substance,tandem mass spectrometry was performed. Using this method,the occurrence of TC, 4-epi-CTC, and CTC was confirmed. Inaddition, 4-epi-TC, iso-CTC, and 4-epi-iso-CTC were detectedin the dried slurry aggregates. An identification of the unknownsubstance was not obtained; however, various MS-MS experi-ments showed that it seems highly unlikely that TCs ormicrobiologically active degradation products therof caused thisspecific growth inhibition.

After administration of TC and CTC to animals, thesesubstances and their metabolites, 4-epi-TC and 4-epi-CTC, areexcreted. Iso-CTC and 4-epi-iso-CTC are not known as majormammalian CTC metabolites (18), but CTC is known to bedegraded to its isomers under alkaline conditions. This mightbe the reason for degradation of CTC to iso-CTC and its4-epimer in slurry. These degradation products of CTC haveno antimicrobial activity (18) and are therefore undetectable inthe microbiological assay.

In conclusion, the newly developed microbiological assay isa powerful tool which can be employed to screen environmentalsamples for the occurrence of various active antimicrobialsubstances without a sophisticated sample preparation procedure.Microbiological screening of environmental samples withoutsample pretreatment is not possible for several reasons. First,the huge amount of bacteria naturally present in these samplescan lead to an overgrowth of the employed test strain. Second,the low water content in soil, when that is compared to foodsamples, and the adsorption of TCs to soil components (e.g.,humic materials) may reduce or prevent the diffusion of theanalytes into the growth medium. Microbiological methodscombined with a simple sample cleanup were described (12,

13). After a liquid extraction of soil samples enriched with CTC,only the detection of very high concentrations was possible withan agar diffusion test. One group detected CTC in soil samplesat a concentration range between 2.3 and 4.5 mg/kg (13). Otherswere able to detect CTC at a concentration of 5.6 mg/kg in soil(12). Both methods were not suitable to detect environmentalconcentrations of TCs occurring after the fertilization of soilwith animal slurry containing TCs (2, 14). In light of this, thescreening of environmental samples at concentrations down to100µg/kg can be achieved using the particular microbiologicalassay described here. For the confirmation of these findings andthe accurate quantification of tetracycline residues at much lowerconcentrations, LC-MS-MS is the method of choice.

NOTE ADDED AFTER ASAP

This article was released ASAP on 1/3/2003 before finalcorrections were made. The incorrect species name was givenin the abstract and incorrect versions of Figures 1 amd 3 wereincluded in the original posting. It has now been corrected inthis version posted 1/09/03.

ACKNOWLEDGMENT

We thank Dr. Heinrich Ho¨per, Dr. Bernd Kleefisch, and HubertGroh of the Lower Saxony soil monitoring project for soil andliquid manure sampling. We are obliged to Dr. Melissa Mockfor a critical review and for careful proofreading of themanuscript.

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Figure 5. LC−MS−MS analysis of an egg sample of series E. Three LC runs were performed to detect oxytetracycline (OTC), tetracycline (TC), andchlortetracycline (CTC) including their characteristic epimers and isomers.


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Received for review July 24, 2002. Revised manuscript receivedNovember 22, 2002. Accepted November 27, 2002. S.S. was supportedby a grant of the Wilhelm-Schaumann-Stiftung, Germany. The authorsare grateful to the Volkswagenstiftung, Germany, for financial supportto build up the laboratory for residue analysis in the Department ofFood Toxicology.

JF0258407


Publikation 7

Hamscher G, Pawelzick HT, Sczesny S, Nau H, Hartung J (2003):

Antibiotics in dust originating from a pig fattening farm: a new source of health

hazard for farmers?

Environmental Health Perspectives 111, 1590–1594.

1590 VOLUME 111 | NUMBER 13 | October 2003 • Environmental Health Perspectives

Research | Article

In recent years, there has been growing interestin the occurrence, fate, and possible effects ofhuman and veterinary drug residues in theenvironment (Daughton and Ternes 1999;Halling-Sørensen et al. 1998; Kümmerer2001; Witte 1998). Studies with a specialfocus on drugs used in human medicine haveestablished that these compounds mainly reachsurface waters via the release of effluent fromsewage treatment plants. Today, up to 80compounds have been identified and quanti-fied in the low range of nanograms to micro-grams per liter (Heberer 2002). Studiesperformed in the United Kingdom, Denmark,Germany, and the United States reveal thatthese agents represent a new class of organicenvironmental contaminants worldwide(Kümmerer 2001). There is concern abouteffects resulting from the entry of these com-pounds into the environment, including thepossibility of the spread of antibiotic resistance(Witte 1998) and/or effects on the endocrinesystem because of the ability of some of thesecompounds to behave as hormones (Daughtonand Ternes 1999).

At present there are very few establishedroutes for the entry of veterinary drugs intothe environment. Recently, sophisticated ana-lytical liquid chromatography combined withtandem mass spectrometry (LC-MS-MS) hasled to the detection of tetracyclines on farmedland at concentrations of up to 300 µg/kg soil,which demonstrated that this group of antibi-otics is persistent and can accumulate in soilafter repeated fertilization with liquid manurefrom intensive pig farming. Furthermore,these field studies gave no proof of leaching ofthese compounds into deeper soil segments orinto groundwater because of the strong sorp-tion of the drugs in topsoil (Hamscher et al.

2000, 2002). Presently, there is only limitedinformation available on the direct effects ofthese drugs on soil biota. Investigations inthis field are difficult to perform because thesoil microorganism community is a very com-plex system with at least 90% of the bacterialiving in this compartment unidentified(Nwosu 2001).

Large-scale use of tetracyclines and severalother veterinary drugs (e.g., various sulfon-amides, tylosin) in pig production is commonnot only within the European Union(Anonymous 2001) but also in the UnitedStates (Kolpin et al. 2002) and, to our bestknowledge, in China, Southeast Asia, andRussia. These drugs are in use or have been inuse for many years as feed additives and forprophylactic, metaphylactic, and therapeuticpurposes.

Large-scale pig production represents aconsiderable source of dust (Hartung 1997,1998; Pedersen et al. 2000). This results bothin high dust exposure for farmers and farmworkers in animal confinement buildings,causing respiratory health hazards (Iversen etal. 2000; Nowak 1998; Platz et al. 1995;Radon et al. 2002), and in emissions of dustparticles into the environment by way of theexhaust ventilation air (Hartung 1995;Seedorf and Hartung 2002). About 85% ofthe dust from animal confinement buildingsconsists of organic material, including protein(from pig skin), animal feed, endotoxins,fungi, and bacteria (concentrations of up to50 million colony-forming units per gram ofdust) (Hartung 1997). Today, there is nodoubt regarding the health hazards of dust inanimal confinement buildings, but there isstill little knowledge concerning the possiblerisk of specific substances in dust (Nowak

1998). To determine whether antibiotics mayalso be contaminants in dust from animalconfinement buildings, we undertook a retro-spective study to analyze dust samples col-lected from a pig-fattening farm during theyears 1981 to 2000 for the occurrence of vari-ous antibiotics, including tetracyclines, sulfon-amides, tylosin, and chloramphenicol.

Materials and Methods

Collection of dust samples. We studied sedi-mentation dust collected from 1981 to 2000 ina 350–420-head pig finishing unit (60–110 kglive weight) over periods of 14–30 days using astandardized metal frame with an effective sam-pling surface area of 3,002 cm2 (38 × 79 cm)covered with fresh aluminum foil. The sam-pling frame stood approximately in the middleof the pig house, where there was no exposureto high air currents, 1.5 m above the floor,which is the typical breathing height ofhumans. After the collecting period (each year10–15 samples were collected in the piggery,one of which was then randomly selected foranalysis in this study), technicians carefullysampled the dust from the aluminum foil usinga clean, new brush and placed it into glass vialssealed with tight stoppers. Before sampling, weremoved any remaining dead insects, spiders,and coarse particulate matter originating fromceiling materials. After the collection process,technicians covered the metal frame with freshaluminum foil for the next collecting periodand removed the glass containers to the labora-tory, where they were allowed to cool downgradually for storage at 4°C.

Sample preparation and measurement. Weremoved 0.1 g samples from each of the glass

Antibiotics in Dust Originating from a Pig-Fattening Farm: A New Source ofHealth Hazard for Farmers?

Gerd Hamscher,1 Heike Theresia Pawelzick,1 Silke Sczesny,1,* Heinz Nau,1 and Jörg Hartung2

1Department of Food Toxicology, and 2Institute for Animal Hygiene, Animal Welfare and Behaviour of Farm Animals, School ofVeterinary Medicine Hannover, Hannover, Germany

Address correspondence to G. Hamscher, Departmentof Food Toxicology, Center of Food Sciences, Schoolof Veterinary Medicine Hannover, BischofsholerDamm 15, D-30173 Hannover, Germany. Telephone:49-511-856-7784. Fax: 49-511-856-7680. E-mail:[email protected]

*Current address: Department of GastrointestinalMicrobiology, German Institute of Human Nutrition,Bergholz-Rehbrücke, Germany.

We thank M. Mock and J. McAlister-Hermann forcritical review and for careful proofreading of themanuscript.

S.S. was supported by a grant from the Wilhelm-Schaumann-Stiftung, Germany. We are grateful tothe Volkswagenstiftung, Germany, for financial sup-port to equip the laboratory for residue analysis inthe Department of Food Toxicology.

The authors declare they have no conflict of interest.Received 18 February 2003; accepted 17 June 2003.

Pig-house dust originates from feed, bedding, feces, and the animals themselves. If the animalsreceive drugs such as antibiotics, residues of these substances may occur in manure, in the air, oron surfaces of the respective animal house. In a retrospective study, we investigated dust samplescollected during two decades from the same piggery for the occurrence of various antibiotics. In90% of these samples, we detected up to five different antibiotics, including tylosin, various tetra-cyclines, sulfamethazine, and chloramphenicol, in total amounts up to 12.5 mg/kg dust. Highdust exposure in animal confinement buildings is believed to be a respiratory health hazardbecause of the high content of microorganisms, endotoxins, and allergens. Further risks may arisefrom the inhalation of dust contaminated with a cocktail of antibiotics. Apart from that, our dataprovide first evidence for a new route of entry for veterinary drugs in the environment. Key words:antibiotics, dust, farmer, liquid chromatography, mass spectrometry, pig fattening, veterinarydrugs. Environ Health Perspect 111:1590–1594 (2003). doi:10.1289/ehp.6288 available viahttp://dx.doi.org/ [Online 18 June 2003]

containers and mixed them with 1.0 mL citratebuffer (pH 4.7), twice-extracted with 6 mLethyl acetate as previously described for soiland liquid manure (Hamscher et al. 2002). Weevaporated ethyl acetate to dryness and recon-stituted samples with 1 mL 90% acetoni-trile/10% 100 mM ammonium acetate.

We conducted high-performance liquidchromatography (HPLC) separation on aPuresil C18 Column (Waters Corp., Milford,MA, USA) with a gradient solvent system con-sisting of 0.5% formic acid (Riedel-de Haen,Seelze, Germany) in water containing 1 mMammonium acetate (Merck, Darmstadt,Germany) (solvent A, pH 2.5) and acetonitrile(Baker, Griesheim, Germany) (solvent B),using an injection volume of 8 µL. We meas-ured all compounds under investigation usingtwo HPLC runs. First, we used the condi-tions recently described for the separation oftetracyclines, tylosin, and chloramphenicol(Hamscher et al. 2002). We baseline sepa-rated and analyzed seven sulfonamides with amodified gradient system for the second run(i.e., 100% solvent A for 1 min, linear gradi-ent to 25% solvent B for 9 min, linear gradi-ent to 50% solvent B for 1 min, and finally50% solvent B for 3 min). After elution of theantibiotics, we rinsed the column for 3 minwith 99% solvent B and reequilibrated it with100% solvent A for 8 min.

We performed tandem mass spectrometry(MS-MS) for detection using an LCQ iontrap with an electrospray ionization source(Finnigan Mat, San Jose, CA, USA), with thesource polarity set negative for chlorampheni-col and positive for all other compoundsinvestigated. The spray needle voltage was–5 kV for chloramphenicol and +5 kV for allother compounds. In the case of chloram-phenicol, we turned the source fragmentationon with a collision energy set at 10 V. Dryinggas was nitrogen generated from pressurizedair in an Ecoinert 2 ESP nitrogen generator(DWT-GmbH, Gelsenkirchen, Germany).We set the sheath gas flow at 100 units andturned off the auxiliary gas; the capillary tem-perature was 150°C (described in detail byHamscher et al. 2002). Table 1 contains theoptimized LC-MS-MS conditions.

Calibration curves constructed for thethree tetracyclines, tylosin, and the seven sul-fonamides ranged from 0.1 to 10 ng perinjection and were linear with r 2 > 0.99 forthe MS-MS procedure. We obtained quantifi-cation by comparing the peak areas of thesample with that of the external calibrationcurves and corrected all data for recovery.

Because of matrix effects (signal enhance-ment) during LC-MS-MS analysis, we basedcalculations for chloramphenicol on themethod of standard addition. Therefore, wespiked the sample from 1989 with chloram-phenicol standard additions of 1, 2.5, and

5 mg/kg and the samples from 1991 and1992 with chloramphenicol standard addi-tions of 1, 2.5, 5, and 10 mg/kg. Then weconstructed a linear regression curve. Finally,we calculated the concentration in the samplefrom the intercept of this regression curvewith the x-axis.

Recovery studies. We conducted recoverystudies with residue-free dust samples at con-centrations of 0.2, 0.5, and 1.0 mg/kg. Wecalculated the recovery rates as an average ofthree individual experiments. The limit ofquantification based on these studies was0.1 mg/kg for the tetracyclines and tylosin and0.05 mg/kg for the sulfonamides. The limit ofdetection was approximately 2-fold lower.

ResultsTable 2 shows the summary of all results forthis retrospective study, and Figure 1 presentsthe molecular structures of all detected anti-biotics. We detected up to five differentantibiotics at total concentrations rangingfrom 0.2 to 12.5 mg/kg dust in 18 of 20 sam-ples; chromatograms and mass spectra of asample containing five antibiotics are shownin Figure 2. Tylosin was present in 16 of 20samples, three of which had concentrations of> 5 mg/kg. In 13 samples, sulfamethazine waspresent at concentrations of up to 2.9 mg/kg,and several tetracyclines were present in 12samples (0.2–5.2 mg/kg). In another threesamples, we detected chloramphenicol—which

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Table 1. Characteristics of HPLC and MS-MS methods: retention times (RT), optimized MS-MS parameters,and product ions for the determination and quantification of various antibiotics in dust.

RT Precursor CollisionMethod/compound (min) mass (m/z) energy (%) Product ions, m/z (relative abundance, %)

HPLC method 1Oxytetracycline 7.21 461 20 426 (7), 443* (100), 444 (9)4-epi-Tetracycline 7.17 445 20 410 (6), 427* (100), 428 (13)Tetracycline 7.52 445 20 410 (4), 427* (100), 428 (7)4-epi-Chlortetracycline 8.07 479 27 444* (68), 461* (51), 462* (100)Chlortetracycline 8.48 479 27 444* (51), 461* (54), 462* (100)Tylosin 9.60 917 28 754 (3), 772* (100)Chloramphenicol 10.34 321 24 176 (9), 194* (100), 237* (8), 249* (13), 257 (10)

HPLC method 2Sulfadiazine 8.66 251 30 92 (7), 94 (10), 108 (10), 156* (68), 174* (100)Sulfathiazole 9.38 256 27 108 (5), 156* (100), 174 (2)Sulfamerazine 9.81 265 30 92 (5), 108 (5), 156* (19), 174* (56), 190* (100)Sulfamethazine 10.66 279 30 124 (6), 156 (3), 174 (4), 204* (100)Sulfamethoxypyridazine 11.42 281 30 108* (9), 126* (28), 156* (100), 188 (11), 215* (21)Sulfamethoxazole 13.20 254 34 108 (9), 147* (45), 156* (72), 188* (100), 190* (42),

194* (13)Sulfadimethoxine 13.73 311 33 108 (9), 156* (100), 218* (29), 245* (97)

*Ion used for quantification.

Table 2. Antibiotic residues in pig-house dust.

OTC TCa CTCa TYL CAP SMZ SumSampling year (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg)

1981 1.10 — — 0.42 — 1.85 3.371982 0.18 — — 0.09 — 0.06 0.331983 — 0.19 2.12 5.65 — 2.90 10.861984 — — — — — — —1985 — — — — — — —1986 — — — 12.18 — 0.32 12.501987 — — — 8.72 — 0.39 9.111988 — — — 0.72 — 0.43 1.151989 — — — 0.45 1.96 0.34 2.751990 — — — 0.14 — 0.09 0.231991 0.43 — 0.32 0.26 9.07 0.41 10.491992 — — — 0.35 5.49 0.05 5.891993 — 0.19 — 0.10 — 0.12 0.411994 — 0.23 — 0.37 — 0.12 0.721995 — 0.37 0.52 0.29 — — 1.181996 0.29 5.18 — 0.55 — 0.16 6.181997 — 0.47 — 0.16 — — 0.631998 — 0.50 — 0.20 — — 0.701999 — 0.61 — — — — 0.612000 — 0.19 — — — — 0.19

Abbreviations: —, not detectable; CAP, chloramphenicol; CTC, chlortetracycline; OTC, oxytetracycline; SMZ, sulfamethazine;TC, tetracycline; TYL, tylosin. The values (mg/kg dust) represent the means of two replicates per sample, which have beencorrected for mean recovery investigated in the concentration range of 0.2–1.0 mg/kg: 103 ± 21% for OTC, 89 ± 21% for TC,94 ± 18% for CTC, 27 ± 8% for TYL, and 49 ± 16% for SMZ. Calculations for CAP were based on the method of standard addi-tion as described in “Materials and Methods.” SMZ was the only sulfonamide that could be detected.aIncluding their 4-epimers.

has been prohibited for use in animal hus-bandry in the European Union since 1994—atlevels between 2.0 and 9.1 mg/kg.

Discussion

The use of high amounts of veterinary drugshas led to the occurrence of tetracycline andsulfonamide residues in liquid manure andsoil, as well as in surface water and, in the caseof sulfonamides, also in groundwater (Bergeret al. 1986; Hamscher et al. 2000, 2002;Langhammer et al. 1988; Lindsey et al. 2001;Winckler and Grafe 2001). The highest con-centrations occurred in liquid manure (mil-ligram per kilogram range) and in soil(microgram per kilogram range), with traceamounts in surface water and groundwatersamples (lower microgram per liter range). Incomparison, the present investigation showedthat dust originating from a pig-fattening farmrepresents a new route of entry into the envi-ronment for drugs applied in animal houses.The lower milligram per kilogram concentra-tion range and the number and frequency ofcompounds detected in dust may indicate apossible health risk for humans via this envi-ronmental source. The antibiotics in dust mayoriginate mainly from animal feed mixed withveterinary drugs, for example, for therapeuticuse. This feed is usually in powder or pelletform, which can release distinct amounts ofdust during handling. Another source of

antibiotics may be dried liquid manure parti-cles, which are regular constituents of dust inanimal confinement buildings (Donham1993). Because sulfonamides and tetracyclinesare poorly metabolized in pigs, high amountsof the parent drugs are therefore excreted, andthese substances build residues in liquidmanure (Berger et al. 1986; Donham 1993;Hamscher et al. 2002; Winckler and Grafe2001). We recently demonstrated the stabilityand accumulation of tetracyclines in dried liq-uid manure particles in environmental samples(Hamscher et al. 2002).

High dust exposure in animal confine-ment buildings may be a respiratory healthhazard mainly because of the high contents ofbacteria and endotoxins (Iversen et al. 2000;Nowak 1998; Platz et al. 1995; Radon et al.2002). Our investigation suggests that antibi-otics may play a novel and additional role inthe assessment of this health hazard. In thepresent study we found several widely usedveterinary drugs at substantial concentrationsin dust samples from the last 20 years. Thefact that these samples had been in storage at4°C for this period suggests the persistence ofthese drugs in dust. Therefore, these prelimi-nary results demonstrate the farmers’ expo-sure (at least for up to 20 years) to variousantibiotics via the contamination of dust.Consequently, allergic risks may arise fromthe occurrence of these compounds in the air.

In particular, tylosin and sulfamethazine, whichoccurred in 80% and 65% of the samples,respectively, are drugs with known allergicpotential (Barbera and de la Cuadra 1989;Caraffini et al. 1994; Choquet-Kastylevsky etal. 2002; Danese et al. 1994; Hjorth and Roed-Petersen 1980). In addition, farmers have beenexposed to chloramphenicol, an antibiotic withsevere side effects (Holt et al. 1993). Because ofthe genotoxicity of chloramphenicol and threeof its metabolites (nitroso-chloramphenicol,dehydro-chloramphenicol, dehydro-chloram-phenicol-base) in several in vitro and in vivo testsystems, it was not possible to confirm anacceptable daily intake [Joint Food andAgriculture Organization (FAO)/World HealthOrganization (WHO) Expert Committee onFood Additives (JECFA) 1994]. Therefore, theEuropean Union completely prohibited its usein livestock farming within its territory in 1994.

The development of antibiotic resistance isanother risk that may also arise from theinhalation of dust contaminated with a cocktailof antibiotics. A recent survey on dust in pig-fattening buildings in Europe revealed averageconcentrations of inhalable airborne dust of2.2 mg/m3 (Takai et al. 1998). Consequently,a farmer working 8 hr/day in a confined pigbuilding inhales about 6.3 mg of dust contami-nated with approximately 0.02 µg of variousantibiotics, assuming an average tidal volumeof 0.5 L, 12 breaths/minute under resting con-ditions, and a total concentration of 3.4 mg ofantibiotics per kilogram of dust (mean valuederived from Table 2). This example includesseveral variables and can only give an estimateof the amount of antibiotics entering the respi-ratory tract of humans. In practice, the concen-tration of the antibiotics in the dust can bethree times higher than that used in the calcu-lation (Table 2). Furthermore, the dust con-centration in the air is usually higher in winterthan in summer, and the breathing rate canalso be distinctly higher during work (up to45 L), resulting in distinctly higher inhaledamounts of inhaled dust and antibiotics.

Although the resulting local concentrationof antibiotics in the lung is far too low for anybacteriocidal or bacteriostatic effect, perma-nent exposure to subtherapeutic concentra-tions of various antibiotics represents optimalconditions for the development of antibioticresistance.

An additional conclusion drawn from ourstudy concerns the issue of dust as a source thatcan provide enormous amounts of informationabout the former and present use of veterinarydrugs in intense livestock production. In theearly 1980s, there was heavy use of tylosin inpig production, which is reflected in the ana-lytical data obtained for 1983 and 1986–1987.Following the growing knowledge of possibleallergic health hazards related to this com-pound (Barbera and de la Cuadra 1989;

Article | Hamscher et al.


Figure 1. Molecular structures of the antibiotics frequently occurring in dust samples originating from apig-fattening farm.

HO CH3

OHH N(CH3)2

OH

CONH2

OHOH

OH O O

OO

S

H2N

HN

N

N

OHOH

OH O O

HO CH3 H N(CH3)2

OH

CONH2

OHOH

OH O O

HO CH3 H N(CH3)2

OH

CONH2

Cl

O2N

OH

OH

HN

Cl

O

Cl

CH3

OHOCH3 OCH3

O

O

H2C

H3C

O

CH3O

HH2C

O

OH3C

O

OCH3

CH3

OH

OH

OOOHCH3OH

CH3

N(CH3)2

Oxytetracycline

Sulfamethazine

Tetracycline

Chloramphenicol

Chlortetracycline Tylosin

Caraffini et al. 1994; Danese et al. 1994;Hjorth and Roed-Petersen 1980) and its ulti-mate ban as a feed additive in the EuropeanUnion in 1998, tylosin was no longerdetectable in the dust samples collected in1999 and 2000. We found chloramphenicolin only three samples before its ban in 1994in intensive livestock farming in the EuropeanUnion. Farm records reveal reconstruction ofthe confinement building in 1984; subse-quently, no further use of antibiotics was nec-essary as a result of the animals’ health status.Accordingly, the results show that the dustsamples were free of any antibiotic compoundfor 1984 and 1985. Unfortunately, thisantibiotic-free period was not permanent, andthe data for 1986 show antibiotic use on aneven greater scale than in previous years.

Conclusions

A new entrance route for veterinary drugs intothe environment has been discovered. Wedetected substantial quantities of several antibi-otics in dust from a pig finishing unit. Furtherefforts should be undertaken to confirm thesepreliminary findings, including the investiga-tion of dust from larger pig production systems

and from henhouses, and with a higher sam-pling frequency.

Because there may be adverse effects onanimal and human health resulting from theexposure to dust contaminated with antibi-otics, future research should take this type ofexposure into consideration when assessinghealth risks to persons exposed to farm dust.This should include monitoring of humanhealth, including the state of antibiotic resis-tance in farmers to antibiotics they are fre-quently exposed to.

In order to minimize the possible risks ofantibiotics in dust, the use of antibiotics inlivestock farming should be reduced wheneverpossible.

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Figure 2. Chromatograms and mass spectra of compounds. (A) Reconstructed ion chromatograms of oxytetracycline (NL = 5.90 × 104; m/z = 443), chlortetracycline(NL = 7.34 × 104; m/z = 444 + 461 + 462), tylosin (NL = 6.43 × 104; m/z = 772), chloramphenicol (NL = 9.06 × 104; m/z = 194 + 237 + 249), and sulfamethazine (NL =1.88 × 104; m/z = 204) in a dust sample analyzed with LC-MS-MS. (B) Corresponding tandem mass spectra of these compounds. (C) Tandem mass spectra obtainedfrom a standard solution (representing 1 ng of each compound on column).

10.35Chloramphenicol

9.62

Time (min)

Tylosin

7.19

Time (min)

Oxytetracycline

8.50Chlortetracycline

Time (min)

10.69Sulfamethazine

m/z

461426 444

m/z

461479444

m/z

916

m/z

194 [M-H-C2H3Cl3NO]–

249321

-

176

m/z

279156124

m/z

279124 156

m/z

249 321176 237[M-H]–

257

m/z

916

461444

479

m/z

m/z

461426 444

100806040200

HPLC method 1

Rela

tive

abun

danc

e

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

100806040200

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Time (min)

Rela

tive

abun

danc

e

100806040200

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Rela

tive

abun

danc

e

100806040200

Time (min)0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Rela

tive

abun

danc

e

HPLC method 2100806040200

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Rela

tive

abun

danc

e

100806040200

[M+H-H2O-NH3]+

443 [M+H-H2O]+

[M+H-NH3]+

[M+H]+

410 415 420 425 430 435 440 445 450 455 460

Rela

tive

abun

danc

e

100806040200

[M+H-H2O-NH3]+ [M+H-H2O]+

462 [M+H-NH3]+

[M+H]+

430 435 440 445 450 455 460 465 470 475 480

100806040200

772 [M+H-C2H12O3]+

[M+H]+

700 720 740 760 780 800 820 840 860 880 900 920

100806040200

180 200 220 240 260 280 300 320

[194-H2O]–

[M-H-CHCl2]–

[M-H-2HCl]–

257 [M-H-CHClO]– [M-H]–

100806040200

80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300

[C6H8N3+2H]+ [C6H6NO2S]+

204 [M+H-C6H7N+H2O]+

[M+H]+

Rela

tive

abun

danc

eRe

lativ

eab

unda

nce

Rela

tive

abun

danc

eRe

lativ

eab

unda

nce

100806040200410 415 420 425 430 435 440 445 450 455 460

[M+H-H2O-NH3]+

443 [M+H-H2O]+

[M+H-NH3]+[M+H]+

Rela

tive

abun

danc

e

100806040200430 435 440 445 450 455 460 465 470 475 480

[M+H-H2O-NH3]+ [M+H-H2O]+462 [M+H-NH3]+

[M+H]+

100806040200

800 820 840 860 880 900 920700 720 740 760 780

772 [M+H-C2H12O3]+

[M+H]+

100806040200

100806040200

180 200 220 240 260 280 300 320

194 [M-H-C2H3Cl2NO]–

[194-H2O]–

[M-H-CHCl2]–[M-H-2HCl]– [M-H-CHClO]–

[C6H8N3+2H]+ [C6H6NO2S]+

204 [M+H-C6H7N+H2O]+

[M+H]+

Rela

tive

abun

danc

eRe

lativ

eab

unda

nce

Rela

tive

abun

danc

eRe

lativ

eab

unda

nce

80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300

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Article | Hamscher et al.


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Publikation 8

Hamscher G, Prieß B, Hartung J, Nogossek MI, Glünder G, Nau H (2003):

Determination of propoxur residues in eggs with HPLC-DAD after treatment of

stocked housing facilities for the poultry red mite (Dermanyssus gallinae).

Analytica Chimica Acta 483, 19–26.

Analytica Chimica Acta 483 (2003) 19–26

Determination of propoxur residues in eggs by liquidchromatography–diode array detection after treatment of stockedhousing facilities for the poultry red mite (Dermanyssus gallinae)

Gerd Hamschera,∗, Beate Prießa, Jörg Hartungb, Monika I. Nogossekc,Gerhard Glünderc, Heinz Naua

a Department of Food Toxicology, Center of Food Sciences, School of Veterinary Medicine, Bischofsholer Damm 15,D-30173 Hannover, Germany

b Institute for Animal Hygiene and Animal Welfare, School of Veterinary Medicine, Buerteweq 17p, 30559 Hannover, Germanyc Clinic for Poultry, School of Veterinary Medicine, Buerteweq 17, 30559 Hannover, Germany

Received 2 July 2002; received in revised form 5 September 2002; accepted 19 September 2002

Abstract

A sensitive and selective liquid chromatography–diode array detection method for the determination of propoxur in eggsis described. Eggs were homogenized, extracted with acetonitrile and partitioned withn-hexane. Further clean-up of theacetonitrile extract was undertaken using silica gel column chromatography. Quantitative detection was performed by liq-uid chromatography with UV detection at 220 nm and confirmation of the residue was achieved via diode array detection(200–350 nm). Recovery rates (performed at the 5–100�g kg−1 level) were in the range 84.9–92.5% with relative standarddeviations of 1.9–8.6%. The limit of detection of the assay based on a signal to noise ratio of 3 was approximately 2�g kg−1.The applicability of the method was demonstrated in eggs from laying hens kept in three different systems (i.e. battery cages,enriched cages and an aviary system). The henhouses were sprayed three times with CBM 8® (containing propoxur in a finalconcentration of 1%). In this study, propoxur residues could be detected from day 1 after the first treatment until day 39. Themean residue concentration found in the eggs obtained from the battery cages was significantly higher (P < 0.05) than thatof the enriched cages and the aviary system. In six eggs, residues above the actual maximal residue limits for eggs in theEuropean Union (50�g kg−1) were found.© 2002 Elsevier Science B.V. All rights reserved.

Keywords:Propoxur; Liquid chromatography; Diode array detection;Dermanyssus gallinae; Laying hens

1. Introduction

The poultry red miteDermanyssus gallinae(D.gallinae) represents the most important ectoparasiteof poultry in several European countries, including

∗ Corresponding author. Tel.:+49-511-856-7784;fax: +49-511-856-7680.E-mail address:[email protected] (G. Hamscher).

France, Switzerland, Sweden[1] and Germany[2].One problem in the fight againstD. gallinae is—from a toxicological point of view—the lack of safesubstances which may be used as veterinary drugsto directly treat hens. Another problem involves theability of these insects to hide within henhouses af-ter coming into contact (i.e. blood-sucking) with theanimals [3]. Therefore, one strategy against thesepests is to spray all crevices in the poultry house and

0003-2670/03/$ – see front matter © 2002 Elsevier Science B.V. All rights reserved.PII: S0003-2670(02)01022-X

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Fig. 1. Molecular structure of propoxur.

avoid direct contact of the hens with insecticide. Inregards to the reproduction cycle of the insect, thistreatment procedure must be repeated twice withintwo weeks. In Germany, the carbamate propoxur(2-isopropoxyphenyl-N-methylcarbamate; for chemi-cal structure refer toFig. 1) is licensed to be used asan insecticide within henhouses when the procedureas mentioned above is considered.

In order to investigate whether propoxur residuesare present in eggs from laying hens kept in hen-houses treated with this insecticide, we have developeda selective and sensitive liquid chromatography (LC)method for the determination of propoxur in eggs. Themethod was required to be suitable for the detection ofresidues far below the actual maximum residue levelof 50�g kg−1 in the European Union and in Germany[4], in order to provide an impression of the residueprofile up to 3 weeks after the last insecticide appli-cation. Another aim of our work was to compare theresidue levels in relation to different henhouse sys-tems (i.e. battery cages, enriched cages and an aviarysystem).

2. Experimental

2.1. Chemicals and equipment

Acetonitrile, dichloromethane andn-hexane wereof HPLC quality and obtained from J.T. Baker(Griesheim, Germany) and Sigma (Munich, Ger-many). Water was prepared in-house by a Milli-Qsystem (Millipore, Eschborn, Germany). Silica gel(35–70 mesh) was obtained from Fluka. LC solventA was 100% water and LC solvent B was 100% ace-tonitrile. A high speed blender (IKA Ultra-Turrax,Germany), a stirrer (IKA RCT basic, Germany), avacuum rotary evaporator with water bath (Laborata4002 Heidolph, Germany), a centrifuge and 200 mlcentrifuge tubes (Beckman CS-15R, Germany), chro-matographic glass columns (10 mm× 300 mm, LAT,

Germany), an ultrasonic bath (Bandelin, Germany),and a vortex mixer were used. A reference standardof propoxur was obtained from Promochem (Wesel,Germany).

2.2. Extraction and silica gel clean-up

Whole egg (without shells) was homogenized for1 min using a high speed blender. A 5 g sample ofthis homogenate was then stirred in a polypropylenecentrifuge tube for 1 min with 25 ml of acetonitrileand centrifuged at 3200× g for 2 min. The super-natant was decanted in a separatory funnel and theresidue was re-extracted with another 25 ml of ace-tonitrile. After centrifugation (for 8 min), the com-bined acetonitrile extracts were partitioned with 15 mlof n-hexane. Then-hexane phase was discarded andthe acetonitrile phase was drained into a 250 ml roundbottomed flask and rotary evaporated to dryness (at40◦C). For solid-phase extraction, chromatographycolumns (packed with a cotton wool plug, 10 ml ofn-hexane and 2 g of silica gel) were gently shaken toobtain homogeneous packing of the silica gel and thelevel ofn-hexane was then drained to a level just abovethe top of the silica gel. These columns were deacti-vated with 10% water prior to use. The evaporated ace-tonitrile extract was thoroughly dissolved three timesin 4 ml of n-hexane with ultrasonication for 1 min andfinally transferred to the column. Note that the ex-tract was slowly applied to the top of the silica gel.The column was washed with 10 ml ofn-hexane fol-lowed by 20 ml ofn-hexane/dichloromethane (40/60(v/v)). Final elution of the column was performed withdichloromethane and the eluate was collected into a25 ml tapered flask and evaporated to dryness as de-scribed above. The dry residue was finally dissolvedin 500�l of acetonitrile (with 1 min ultrasonication)and stored at−30◦C until analyzed by LC.

2.3. LC–diode array detection (DAD) analysis

A Shimadzu 10 VP system was used with the fol-lowing configuration: two LC 10 AD VP pumps, a SIL10 AD VP autoinjector, a CTO 10 A VP oven, a SPDM 10 A VP diode array detector, a GT-154 degasser, aSCL 10 A VP system controller and an analytical C18column (Lichrospher RP C18, 5�m, 250 mm×4 mm,VDS Optilab, Germany). The system was controlled

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and data were recorded using Class VP software (ver-sion 5.03). The injection volume was 20�l, the ovenwas set at 40◦C, and the flow rate was 1 ml min−1.The elution was performed with a gradient of water(A) and acetonitrile (B): start 20% B for 1 min, thena linear gradient from 20 to 45% B for 14 min. Afterthe elution of propoxur, the column was rinsed for2 min with 99% B and re-equilibrated with 20% B for6 min. The detection wavelength was 220 nm and theDAD recorded UV spectrum was from 200–350 nmwith a time constant of 1 s and a wave step of1 nm.

2.4. Quantification

A stock solution of propoxur was prepared by dis-solving 1 mg of the compound in 1 ml of acetonitrile.The stock solution was stored at 4◦C and was stablefor at least 3 months. Working dilutions were preparedfreshly on the day of use. A peak area calibration graphof propoxur was prepared in the range 1–50 ng perinjection. Quantification was obtained by comparingthe peak areas of the sample with that of the externalcalibration graph. All data were corrected for meanrecovery.

2.5. Validation of the analytical method

Linearity of detector response was checked from aset of six working standards ranging in concentrationfrom 50 to 2500�g ml−1 (which represents 1–50 ng oncolumn). Recovery studies were carried out with con-trol eggs from untreated hens spiked at the 5, 10, 25,50 and 100�g kg−1 level. The recovery rate was cal-culated as an average of three experiments. Day-to-dayvariation of the method was tested with eight eggscontaining propoxur residues ranging from 10.0 to118.5�g kg−1. The day-to-day variation was calcu-lated using six independent experiments performed onsix different days.

2.6. Application of CBM 8® in henhouses andegg sampling

Henhouses were sprayed with CBM 8® (synony-mous with Intermitox®, distributed by Interhygiene,Cuxhaven, Germany) in a final dilution containing10 g l−1 propoxur, according to the recommendations

of the manufacturers on days 0, 7 and 14 of the study.These recommendations implied that only the hen-houses but not the animals were sprayed. Hens werekept in three different systems: battery cages, enrichedcages and an aviary system. Six eggs of each investi-gated system were collected on days−3 and−1 (con-trols) before application of CBM 8® and on days 1,3, 5, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 24, 29, 34 and 39 after thefirst application of CBM 8®. After sampling, the eggswere immediately frozen and stored at−18◦C untilextraction and analysis.

2.7. Statistical analysis

A comparison was carried out to investigate the po-tential influence of the henhouse system and the sam-pling day on the residue concentration in the egg. Thecalculations were performed after square-root trans-formation of the data because the initial equal vari-ance test failed with the raw data. All data were testedwith two-way analysis of variance (ANOVA) usingthe Sigma Stat software (Program version 2.0, Build2.0173, Jandel Corporation, San Rafael, CA). TheTukey test was employed as a post ANOVA-test withthe level of significance set atP < 0.05.

3. Results and discussion

3.1. Validation data

The method presented here allowed for the sensi-tive and selective detection of propoxur residues ineggs. The LC–DAD method showed excellent lin-earity in the range of 1–50 ng per injection (r2 =0.99994). The mean recovery of fortified samples inthe 5–100�g kg−1 range was 84.9–92.5% (Table 1)and showed very good linearity over this concentration

Table 1Recoveries and the corresponding relative standard deviations(R.S.D.) of propoxur in eggs (n = 3)

Concentration (�g kg−1) Recovery (%) R.S.D. (%)

5 92.5± 2.2 2.410 88.7± 6.4 7.225 85.8± 7.3 8.650 84.9± 4.5 5.3

100 90.1± 2.1 1.9



Table 2Day-to-day variation of the LC–DAD method in samples contain-ing propoxur in various concentrations (n = 6)

Sample Propoxur (�g kg−1) R.S.D. (%)

E001 10.0± 0.8 8.0E002 13.4± 0.5 3.7E003 26.8± 1.0 3.6E004 30.1± 1.7 5.7E005 62.2± 4.2 6.8E006 67.0± 3.4 5.1E007 103.6± 4.7 4.5E008 118.5± 5.2 4.4

range (r2 = 0.99894, derived fromTable 1). Fromthis data, the limit of quantification of 5�g kg−1 wasestablished for this method. The smallest amountthat could be detected based on a signal to noiseratio of 3 (i.e. the limit of detection) was approxi-mately 2�g kg−1. The intra-laboratory method vali-dation demonstrated that the method should also behighly reproducible over a broad concentration range(Table 2). In addition, the unequivocal confirmation

Table 3Concentrations of propoxur in eggs (in�g kg−1) obtained from different housing systems (means± standard deviation,n = 6) and themain results of the statistical analysis

Day Battery cagesa,b

(BC)Enriched cagesa,c

(EC)Aviary systema

(AS)Statistical analysisd (comparison of mean values ofthe sampling days with post-ANOVA Tukey test)

BC vs. EC BC vs. AS EC vs. AS

−3 N.D. N.D. N.D. N.S. N.S. N.S.−1 N.D. N.D. N.D. N.S. N.S. N.S.

1 30.6± 18.6 18.9± 5.8 10.1± 8.8 N.S. P < 0.05 N.S.3 22.8± 21.9 10.2± 12.6 5.7± 5.0 N.S. P < 0.05 N.S.5 10.8± 7.1 8.0± 3.2 1.9± 1.6 N.S. N.S. N.S.8 36.5± 34.9 6.7± 6.0 3.0± 2.5 P < 0.05 P < 0.05 N.S.

10 15.1± 8.7 11.8± 5.0 4.3± 1.9 N.S. N.S. N.S.12 14.2± 4.8 16.2± 18.1 13.5± 8.8 N.S. N.S. N.S.15 36.1± 31.1 9.2± 3.3 12.7± 6.0 P < 0.05 P < 0.05 N.S.17 27.7± 10.5 19.5± 16.5 6.2± 5.2 N.S. P < 0.05 N.S.19 16.6± 5.6 12.8± 14.8 10.2± 6.5 N.S. N.S. N.S.24 32.0± 31.6 10.3± 4.6 5.2± 3.7 P < 0.05 P < 0.05 N.S.29 20.1± 7.7 3.9± 2.3 16.8± 18.0 P < 0.05 N.S. N.S.34 9.1± 5.5 3.3± 2.7 5.1± 9.3 N.S. N.S. N.S.39 11.4± 5.9 11.6± 6.7 11.9± 6.0 N.S. N.S. N.S.

N.D., not detected; N.S., not significant; vs., versus.a ANOVA detected a significant difference in the mean values of the three housing systems (P < 0.001).b The post-ANOVA Tukey test revealed significant higher values when compared to the enriched cages (P < 0.05) and the aviary

system (P < 0.05).c The post-ANOVA Tukey test revealed significant higher values when compared to the aviary system (P < 0.05).d ANOVA detected significant differences in the mean values of the sampling days (P < 0.001).

of propoxur residues can be obtained via DAD spectra(seeFigs. 2 and 3).

In the light of all method validation parameters,the newly developed method provides a high degreeof confidence, even at one-tenth of the actual max-imum propoxur residue level of 50�g kg−1 in eggsestablished for the European Union and Germany[4].

There have been several analytical techniques de-veloped for the determination of carbamates in vari-ous food and environmental samples. The techniquesof choice for the accurate determination and quantifi-cation of these insecticides are gas chromatography[5] and LC[6–8]. To our knowledge, the method pre-sented here, is the most sensitive one for the detectionof propoxur in eggs. A recently published methodemploying membrane separation coupled on-line toa LC system[9] revealed excellent detection limits(2–4�g kg−1) for various pesticides (e.g. atrazine,pirimicarb, paraoxon) in eggs, however, this proce-dure was not suitable—due to matrix interferences—for the analysis for propoxur. All these methods need


Fig. 3. Chromatogram of a blank egg sample obtained from battery cages on day−3 (A). Chromatogram of an egg sample (B) and thecorresponding UV spectrum (C) obtained from battery cages on day 15 (17.2 ng on column).


Fig. 4. Time profile of propoxur residues in eggs obtained from three different henhouse systems: (A) battery cages; (B) enriched cages;(C) aviary system. Shown are the original results of six eggs each per day. The applications of CBM 8® are marked with arrows. Thedotted lines indicate the mean value of the six samples.


laborious sample preparation, sometimes derivati-zation steps and a sophisticated chromatographicdetection system. Therefore, a new approach is thedevelopment of immunoassays for the rapid screen-ing of propoxur residues in food, soils, and the en-vironment allowing the determination at levels ofregulatory importance[10].

3.2. Application of CBM 8® in henhouses

The application of CBM 8® led to the discovery ofpropoxur residues in eggs obtained from all henhousesystems investigated (seeFig. 4). Significantly higher(P < 0.05) mean concentrations were found in batterycages when compared with enriched cages and theaviary system (seeTable 3). In addition, the enrichedcages showed significantly higher (P < 0.05) meanconcentrations when compared with the aviary system(seeTable 3).

In six eggs, the maximum residue level of50�g kg−1 was exceeded. Five of these eggs wereobtained in battery cages with a maximum concentra-tion of 101�g kg−1 and the last egg was sourced froman enriched cage (seeFig. 4). Average peak concen-trations were found in all systems usually 1–4 daysafter application of the insecticide (Fig. 4). Even 25days after the last application, propoxur residues werefound in each egg investigated with comparable—statistically not different—mean values of approx-imately 12�g kg−1 independent of the henhousesystem (Table 3).

The concentration pattern of the residues indicatesthat it is nearly impossible to avoid significant contam-ination of the hens during spraying in battery cages.This goal seems to be reached more easily in the en-riched cages and aviary system, where the animalshave more space to hide during the application. Un-fortunately, there are still no present alternatives (e.g.physical methods or vaccination) for chemical controlmethods to fightD. gallinae[1]. Therefore, the presentapplication of propoxur (especially in battery cages)should be critically re-evaluated. Additional precau-tions should be taking into consideration (e.g. usingcovers for the cages).

4. Conclusions

We have demonstrated that LC–DAD combinedwith an intensive sample clean-up provides an appro-priate method for the detection of propoxur in eggseven at the low�g kg−1 level. The application ofthe newly developed method demonstrated that thecurrent use of this insecticide in henhouses can leadto significant residues in eggs even above maximumresidue levels.

Acknowledgements

The authors are grateful to the Volkswagenstiftung,Germany, for financial support to build up the labo-ratory for residue analysis in the Department of FoodToxicology. We thank Nele Kitsche-Hohlstein forcareful egg sampling. We are obliged to Prof. Mo-hamed Elmazar for his helpful comments on the sta-tistical analysis and to Dr. Melissa Mock for carefulproofreading of the manuscript.

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