(Aus dem Bacteriologischen Laboratorium, Paramaribo, Suriname).

B A C T E R I E N - H A E M A G G L U T I N A T I O N

H. U N S P E C I F I S C H E H E M M U N G D E R C O L I - H A E M A G G L U T I N A T I O N 1)

V01?.

W. A. COLLIER, SUE TSIEW WONG und J. C. DE MIRANDA (Eingegangen am 15. Juli 1954).

In der vorangehenden Arbeit haben COLLIER und JACOEB fiber die Haemagglutination durch einen Stature ,,65" yon E. coli be- richtet. Es war nunmehr yon Interesse zu untersuchen, ob diese Bacterien-Haemagglutination dutch einige Stoffe gehemmt werden konnte, die auch bei der Virus-Haemagglutination diese Eigen- schaft zeigten.

HIRST (1942) wies als erster darauf hin, dass menschliches Normal- serum eine unspecifische Hemmung der Virus-Haemagglutination verursachen kann. Diese Erscheinung wurde durch BEVERIDGE und LIND (1946), FRANCIS, SALK und BRACE (1946), BURNET und McCREA (1947), BURNET, McCREA und ANDERSON (1947), FRANCIS (.I947), HIRST, VILCHES, ROGERS und ROBBINS (1947), McCREA (1947) u.a. weiterhin untersucht. Ueber die Hemmungswirkung yon Erythrocyten- und Gewebsextracten berichteten sp~iter BOVARNICK und DE BURGH (1947), FRIEDEWALD, MILLER und \'VHATLEY (19~,7), GREEN und WOOLEY (1947) u.a. Ueber die unspeeifische Hemmung durch Allantoisfltissigkeit berichtete SVEDMYR (1946), durch Hfih- ner-Eiklaar LANNI und BEARD (1948) und durch Urin TAM~I und HORSFALL (1950).

Untersuchungen fiber die unspecifischen Hemmungsstoffe sind geeignet, n~ihere Einsichten fiber die Avidit~iten von Zeilreceptoren zu erm6glichen, auch bestimmte chemotherapeutische Probleme k6nnen dadurch gef6rdert werden. U.a. k6nnte auch die Phago- cytose ohne Beteiligung von Antistoffen, die WOOD (1947) und KNISLEu BLOCtI und WARNER (1948) ausffihrlich beleuchten, mit

i) Teil I: Antonie van Leeuwenhoek 21, 113, 1955.

Bacterien-Haemagglutination. II. 125

der Frage der Bindung von Zellreceptoren mit nicht-specifischen Eiweissverbindungen zusammenh~ingen.

T e c h n i k d e s H e m m u n g s v e r s u c h e s .

Wfihrend im Allgemeinen der durch COLLIER und JACOEB (1955) angegebenen Technik gefolgt wurde, ergaben sich bei der Unter- suchung der Hemnaungswirkung folgende Besonderheiten:

Von der Bacteriencultur wurde die einfache haemagglutinierende Dosis festgestellt. Von der zu untersuchenden Substanz wurden fallende Verdtinnungen in Zweierpotenzen hergestellt und zwar in einem Volumen yon 0,25 ml. Sollte nun die Hemnmngswirkung auf das 4-fache Multiplum der einfach haemagglutinierenden Dosis festgestellt werden, so wurde zu jedem RShrchen je 0,25 ml des 16-fachen Multiplums der einfach haemagglutinierenden Dosis zu- geftigt. Nach gutem Durchschiitteln wurde im Wasserbad oder Brutschrank von 37~ oder aber bei Zimlnertemperatur gebunden. Die Bindungszeit betrug in der Regel 30 Minuten. Hiernach kam zu jedem RShrchen 0,5 ml einer l%igen Htihnererythrocyten- Suspension, und nach 1�89 Stunden Stehen bei Zimmertemperatur wurde abgelesen.

Die Berechnung der Verdiinnungen usa,. erfolgte stets im Hin- blick auf das Gesamtvolumen. Wurden beispielsweise 0,25 ml einer Normalserumverd/innung von 1./5, 0,25 ml einer Bacteriensuspen- sion von 1/20 und 0,5 ml Blutsuspension gemengt, so wurde die Serumverdtinnung 1/20, und die Verdtinnung der Bacteriensuspe1~- sion 1/80 genannt.

H e m m u n g d u r c h e i n i g e C h e m i c a l i e n .

Durch Methylalcohol, Aethylalcohol, Formalin, Glycerin, Glycol, Acidum tartaricum, Acidmn lacticum, Acidum oxalicum, Natrium- chlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumchlorid, Calcimnchlorid, Subli- mat und Gummi arabicum wurde ill Concentrationen, dig auf Hiihnerblut keine toxische Einwirkung hatten, keine Hemmung der Haemagglutination beobachtet.

H e m m u n g d u r c h U r i n .

Bei der Untersuchung verschiedener menschlicher Urine zeigte es sich, dass sehr h'~iufig eine mehr oder weniger starke Hemmung der Haemagglutination zu verzeichnen war, gleichgtiltig ob in den

126 \V. A. Collier, Sue Tsiew \Vong und J. C. de Miranda,

Urinen mittels der gebr~iuchlichen Laborator iumsmethoden Eiweiss nachzuweisen war oder nicht. Saute Urine wurden vor Anstellen des Hemnmngsversuches neutralisiert .

H e i n m u n g d u r c h N o r m a l s e r a .

Es ergab sich, dass normale Htihnersera imstande waren, die Haemagglut inat ion zu hemmen. Sowohl das Serum des gIeichen Huhns, yon dem die Erythrocyten s tammten, als auch die Sera anderer Tiere hemmten deutlich die Reaction. In der Regel ergab sich complette Hemmung his zu einer Serum-Endverdf innung von 1/80, doch wurden auch h6here Werte erreicht.

Die gleiche Hemmungswirkung zeigte sich auch bei normalem Menschenserum. In der Tabelle I sind die Endverd t innungen yon 49 inactivierten Seren zusammengestellt , wodurch die 4-fach agglutinierende Dosis einer Bacteriencultur gehemmt wurde. Auch beim Menschenserum lag der Hemnmngs t i t e r meistenteils bei einer Endverdf innung von 1/80, doch kamen auch h6here und niedrigere Werte vor. Interessant ist vielleicht, dass 2 von 7 Seren mit einem Titer yon 1/40 und das einzige Serum mit einem Hemmungs t i te r von 1/20 von leberkranken Pat ienten stammte.

TABELLE 1. Hell]inung der Haemagglutination von Htih- nerblut durch E. coli, Stamm 65, durch 49

inactivierte Menschensera.

Endtiter der Menschensera Hemmung

1 Serum 2 Sera

38 Sera 7 Sera 1 Serum

1/320 1/160 l/S0 1/40 i) 1/2o ~)

1) hierbei 2 Sera von Leberpatienten 2) Serum eines Leberpatienten.

Eigenart ig war das Verhalten der Nonnalsera beina Erw~irmen. In der Tabelle 2 ist die Beeinflussung der Hemmungswirkung von 2 Menschenseren und einem Htihnerserum dutch Erw~irmen auf 70 ~ 80 ~ und 100 ~ zusammengestellt .

Im Menschenserum 1, das an sich schon stark hemmend wirkte,

Bacterien-Haemagglutination. II. 127

TABELLE 2.

Einfluss des Elav/irmens auf die Hemmung der Haemagglutination yon Htihnerblut durch E. coli, Stamm 65, durch Menschenserum und Hiihner-

s e r u n ~ .

Temperatuur und Zeit:

nativ 70 ~ 5'

10' 20' 30' 60'

120' 180'

Endtiter der Hemmung:

Menschen- serum 1

1/320 1/160 1/160 1/160 1/1280 1/1280 1/2560

Menschen- Htihner- serum 2 serum

1/40 1/160 1/160 1/320 1/40 1/40 1/40 1/320

]/320

1/2560 1/1280 1/2560 1/2560

80 ~ 5' 1/2560 1/20 10' 1/12S0 1/20 20' 1/10240 1/80 30' ]/2560 ]/80 60' > 1/20 1/640

120' > 1/20 1/12s0

1/640 1/2560 1/10240 1 / 10240 1/10240 1/lO24O

100 ~ 5 t

10' 15' 20'

1/5120 ]/320 1/2560 1/320

> 1/20 > 1/20 > 1/20 > ]/20

1/10240 1/10240

1/20

t ra t bei Erw~trmen auf 70 ~ nach 30' eine Zunahme der Hemmungs-

wirkung auf. Beim Erw~irmen auf 80 ~ war bereits nach 5' eine starke

Hemmungsste igerung zu sehen, aber nach 60' war jegliche Hem-

mung verloren gegangen. Bei Einwirkung yon 100 ~ war nach 5'

und 10' eine starke Hemmungsste igerung zu erkennen, aber nach

15' war die Wirkung verschwunden. Etwas anders war der Verlauf

bei dem schwach hemmenden Menschenserum 2. Hier war beim Erw~irmen auf 70 ~ schon nach 5' eine Hemmungsste igerung zu ver-

zeichnen, bei dem nach 30' und 60' en tnommenen Material eigen-

ttimlicherweise abet nicht, wohl aber wieder nach 120' und 180'.

Beim Erw~irmen auf 80 ~ begann hier die Wirkungssteigerung nach

20', um nach 120' ein Maximum erreicht zu haben. Beim Erwttrmen auf 100 ~ war nach anf/inglicher Hemmungss te igerung nach 15'

wieder jeder Einfluss verschwunden. Bei dem Hiihnerserum wurden

128 W.A. Collier, Sue Tsiew Wong und J. C. de Miranda,

gleichfalls tiberall starke Steigerungen des Hemmungseffectes und Verschwinden nach 20' Erw~irmen auf 100 ~ zu verzeichnen. Analoge Versuche verliefen in der Regel auf die gleiche Weise.

H e m m u n g d u r c h O r g a n e x t r a c t e .

Ftir die Herstellung der Organextracte wurden die Tiere durch Halsschnitt weitgehendst entblutet. Von den Organen wurden im M6rser 20~ Suspensionen in physiologischer Kochsalzl6sung hergestellt, die 24 Stunden im Eisschrank bewahrt wurden. Hierauf wurdei~ die Zellen abcentrifugiert, und die iiberstehende Flfissigkeit wurde im Helmnungsversuch untersucht. In der Tabelle 3 sind die Ergebnisse von 2 Versuchen mit Meerschweinchen- und 4 Versuche mit Mfiuse-Organextracten zusammengestellt, yon letzteren in 2 Ffillen. auch mit erwfirmten Organextracten.

Von den beiden Meerschweinchen zeigten die Herzextracte keine hemmende Wirkung in den untersuchten Concentrationen, auch die Lungenextracte waren nur schwach wirksam. Gut wirksam er- wiesen sich die Gehirnextracte.

Ebenso wie bei den beiden Meerschweinchen zeigten bei den M/iusen 2 Herzextracte in den untersuchten Concentrationen keinen hemmenden Einfluss. Alle 4 Milzextracte wirkten gut, yon den 4 Gehirnextracten 3.

Bei der Erw~irmung der Organextracte yon Maus 3 und 4 zeigte es sich, dass hierdurch die Hemmungswirkung zwar abgeschw~icht, in keinem Fall abet aufgehoben wurde. In keinem Fall wurde die Hemnmng verstfirkt.

\Veiterhin wurden yon M~iusegehirn und M~iuseleber 20~{,ige Extracte mit Aethylalcohol hergestellt und soweit eingedarnpft, dass 1 ml Extract I g Organgewicht entsprach. Diese Extracte hemmten niemals.

H e m m u n g d u r c h H i i h l f e r - E i k l a a r .

Htihnereiweiss wies eine sehr starke Hemmung auf die Haemag- glutination auf. Es zeigten sich zwar deutlich Unterschiede zwischen dem Material verschiedener Eier, aber in der Regel riefen Endver- diinnungen von 1/1600--1/6400 noch complette Hemmungen her- vor. Die Hemmung war auch bei Verwendung yon mehr als der 4-fach haemagglutinierenden Dosis sehr kr/iftig.

Durch Erw~irmen auf 56 ~ 63 ~ 70 ~ 80 ~ wurde weder eine nennens- werte Wirkungssteigerung noch \u erzielt,

B a c t e r i e n - H a e m a g g l u t i n a t i o n . ] [. l~g

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130 \V, A. Collier, Sue Tsiew \Vong und J. C. de Miranda,

sogar 60 Minuten langes Kochen war ziemlich ohne Einfluss auf den Hemmungstiter. In einem Versuch hemmte beispielsweise natives Htihner-Eiklaar in der Verdfinnung yon 1/6400, nach 30' 100 ~ in einer solchen von 1/6400 und nach 60' 100 ~ in einer Ver- dtinnung yon 1/3200.

Verschiedene Versuche, den hemmenden Factor aus dem Eiklaar zu entfernen, erwiesen sich als vergeblich. In der Tabelle 4 ist ein Tell dieser Versuche wiedergegeben: Eine L6sung von 4% Hfihner- Eiklaar in physiologischer Koehsalzl6sung wurde mit 20% n HC1, 10% Acidum aceticum glaciale, 10% Esbach-Reagens, 10%, 30% und 50% Aethylaleohol, 10% , 30% und 50% Methylalcohol, 1% Formalin und 20% Kochsalz (cryst.) versetzt und 24 Stunden im Eisschrank bewahrt. Hierauf wurden die sauren L6sungen neutrali- siert, und aufgetretene Niederschl~ige wurden abcentrifugiert. Die klaren Flfissigkeiten wurden im Hemmungsversuch gepriift. Es zeigte sich, dass nut durch 50% Aethylalcohol mad 50% Methyl- alcohol eine merkliche Abschw/ichung eingetreten war, verschwun- den war die Hemmungswirkung aber keineswegs. Die Alcohol- niederschl~ige waren wirkungslos.

TABELLE 4.

Henmmng tier 4-[ach agglutinierenden ])osis yon E. coli, Stature 65, gegentiber Htihnerblut durch chemisch vorbe-

handeltes Htihner-Eiweiss.

Vorbehandlung yon Hiihnereiweiss

durch: Haemagglutinations-

titer:

nativ 10~ Methylalcohol 3o% 50% ,, hiervon Niederschlag 10% Aethylalcohol 30% , ,

50% ,, hiervon Niederschlag 20% normal HC1 10% Acid. aceticum 10% Esbach-Reagens 20% NaC1 1% Formalin

1/32oo 1/1600 1/1600 1/soo 1/100 negativ ! 1/32oo 1/3200 1/400 1/100 negativ ! 1/3200 1) 1/1600 1) 1/1600 1) 1/16oo 1/1600

1) nach Neutralisierung.

B a c t e r i e n - H a e m a g g h l t i n a t i o n . 11. 131

B e s p r e c h u n g d e r E r g e b n i s s e .

Besonders interessant ist der hemnlende Factor im normalen Hfihner-bzw. Menschenserum. Dieser erwies sich nicht nur als ziem- lich weitgehend thermostabil, sondern es zeigte sich auch im An- schluss an das Erwfirmen fast stets eine deutliche Zunahme des Hemmungstiters. Die Regelm$issigkeit dieser Erscheinung, zusam- men mit dem v611igen Verschwinden der Hemmung nach 15--20' Kochen, erweckt den Eindruck, dasses sich nicht um einen ein- fachen, sondern um einen complexen Factor handeln dfirfte. Die eigentlich hemmende Componente ist relativ thermostabil, und wird normalerweise durch eine thermolabilere, antagonistisch wirkende zweite Componente in ihrer Wirkungskraft beschrfinkt. Durch kurz- dauerndes Erwfirmen wird dieser Antagonist zerstOrt, und somit steigt die hemmende Wirkung der thermostabilen Componente. Erst durch l~ingeres Erw~irmen wird auch diese schliesslich vernichtet.

Der Hemmungsfactor in den M~iuse- und Meerschweinchenorgan- extracten ist sicher mit dem im Normalserum yon Mensch und Huhn

�9 vorhandenen nicht identisch, da er sich dem Erw~irmen gegentiber anders verh~ilt. Er gleicht viel eher dem wirksamen Hemmungs- factor im Htihner-Eiklaar.

Z u s a m i n e n f a s s u n g .

Die Haemagglutination von Hfihner-Erythrocyten durch E. coli (Stamm 65) wird dutch Urin, Normalsera yon Huhn und Mensch, durch Organextracte von Maus und Meerschweinchen und durch Hiihner-Eiklaar gehemmt. Bei der Serum-Hemmung scheint der wirksame Factor seinerseits durch eine thermolabile antagonistische Componente beeinflusst zu werden. Aus Htihner-Eiklaar liess sich der hemmende Factor, der weitgehend thermostabil ist, durch chemische Einwirkung in keinem Fall vOllig entfernen.

L i t e r a t u . r .

BEVERIDGE, \'V. I. B. und LIND, P. E. 194g. Aus t r . J. exp. Biol. med. Sci. 24, 127.

BOVARNICK, ~'I. u n d DE BURG, P. I=V~. 1947. Science 105, 550.' BLIRNET, F. M. u n d McCREA, J. F. 1947. Aus t r . J. exp. Biol. reed. Sci. 24,

277. BURNET, F. 1~'[., ~IcCREA, J. F. und ANDERSON, S. G. 1947. Na tu r e 160,

404.

132 \V. A. Collier, Sue Tsiew \Vong und J. C. de Miranda.

COLLIER, \u A. und JACOEB, M. 1955. Aaltonie van Leeuwenhoek 21, 113. FRANCIS, JR., T. ]947. J. Exp. Med. 85, 1. FRANCIS, JR., T., SALK, J. E. und BRACE, Xu M. 1946. J. Amer. h'Ied. Ass.

131, 275. FRIEDEXVALD, W. F., MILLER, E. S. und X,VHATLEY, j . R. 1947. J. Exp.

Med. 85, 65. GREEN, R. H. und WOOLEY, I). W. 1947. J. Exp. Med. 86, 55. HIRST, G. K. 1942. J. Exp. Med. 75, 4:9. HIRST, G. K., VILCHES, A., ROGERS, O. und ROBBtNS, C. L. 1947. Amer.

J. Hyg. 45, 96. Is M. H., BLOCI.I, E. H. und WARNER, L. 1948. I(.ong. Danske

Videnskap. Selskab, Biol. Skrifter IV, No. 7, p. 1--93. LANNI, F. und BEARD, J. W. 1948. Proc. Soc. exp. Biol. Med. 68, 312. McCREA, J. F. 1947. Austr. J. exp. Biol. med. Sci. 24, 283. SVEDMYR, A. 1946. Archly. f. Kemi 24 B, Nr 11. T,tMM, I. und HORSFALL, JR., F. L. 1950. Proc. Soc. exp. Biol. Med. 74, 108. ~rOOD, "vV. 13. 1947. Ann. Int. Med. 27, 347.