256 K. Hofmann:

6. Mangan- Wismutbestimmung

Verwendete ICeagentien und Gerdite. ElektrolytlSsung, 115 g Tri~thanolamin, 114 g Kalinmhydroxid, 6 g Natriumsulfit, mit Wasser auf 1 1 verdiinnt; Salpeters~ure, konz.; Salz- s~ure, konz.; Reinstickstoff; Queeksilber; Elektrolysegef~B mit verstellbarer Gegenelektrode aus Quecksilber mit einem FassungsvermSgen yon etwa 2 ml.

Arbeitsvorschrifl. Die Mangan-Wismutschichtenwerden mit5 einigen Tropfen konz. Salpeters~ure in einem 25 ml-Becher- glas in LSsung gebraeht und nach Zufiigen yon etwa 1 ml konz. Salzs~ure auf dem Wasserbad vorsichtig eingedampft. Die eingedampfte Probe wird mit genau 1 ml verd. Elektro- lytlSsung (50 ml ElektrolytlSsung mit 50 ml Wasser ver- diinnen) aufgenommen, gut umgesehwenkt und mit einer Pipette in das Elektrolysegef/il3 iibergefiihrt. Man leitet 5--10 rain lang Stickstoff durch die LSsung und nimmt dann das Polarogramm auf. Die Eichkurven werden mit 5--50 ~zg Mangan und 10--100 ~g Wismut aufgenommen.

Die photometrisehen l~essungen wurden am Pulfrich- Photometer mit Elpho I I yore VEB Car] Zeiss Jena, die polarographischen Aufnahmen an einem ungarischen Polaro- graph Typ OH-102 durchgefiihrt.

IV. SchluBbetraehtung Die beschriebenen Analysenveffahren erfordern sau- bere Reagent icn, u m die Blindwerte niedrig zu halten. Deshalb wurden die verwendeten Chemil~alien, wenn es erforderlich erschien, zus~tzlich durch Destil lation bzw. Umkristall isieren gereinigt. Zur Herstel lung yon L5sungen wird bidest. Wasser verwendet. Die Reagen- t ien bewahr t m a n sorgffiltig, mSglichst in Poly- /ithylenflaschen, auf.

Neben der Unte rsuchung yon reinen Metall- sehichten k5nnen nach diesen Methoden auch Ferrit-

schichten, insbesondere Nickefferrite, un te rsuch t werden. Nur mug bier, /ihnliCh wie bei den Ferrit- untersuchungen [5], ein Bombenrohraufschlu$ durch- gefiihrt werden. Diese Oxidschichten kSnnen inner- halb yon 2 - - 3 h re_it 5 ml Schwefels/iure (1:3) bei 170~ yon der Unter lage abgelSst werden.

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Chem.-Ing. A. Funke Institutsteil fiir Magnetisehe Werkstoffe, Jena des Zentralinstituts fiir FestkSrperphysik und Werkstoff-Forschung der Deutschen Akademie der Wissenschaften zu Berlin DDR-69 Jena, Helmholtzweg 4

Z. Anal. Chem. 250, 256--259 (1970)

Beeinflussung der amperometrischen Titration von Sulfhydrylgruppen mit Silbernitrat durch Salze

K. H o ~ N

Institut fiir Chemie und Physik der Bundesanstalt fiir Fleisehforschung, Kulmbaeh

Eingegangen am 11. Dezember 1969

E//ect ol Salts on the Amperometric Titration ol Thiol Groups with Silver Nitrate. The following salts, which can be present in animal tissue and mea t products were s tudied: CaCI~, MgC12, ZnCI~, MnSOt, CuSOt, FeCla, NaC1, KC1, NAN02, NaaPO ~, A T P or lactate. They were added to reduced gluta thion in 0.14 tris buffer p H 7.4 before t i t rat ion. CuSOa caused a s trong decrease of the SH Content. This effect could be inhibited by the addit ion of 0,50/0 of E D T A in the presence of low concentrat ions of the copper salt. MnSO 4 also decreased the SH content . High concentrat ions of sodium chloride (0.1 M and more) caused a change in the

Beeinflussung der amperometrlschen Titration yon Suffhydrylgruppen 257

normal ti tration curve and, therefore, made the determination of the endpoint difficult. Titration in 0.6 M KC1 solution also yielded abnormal curves. The remaining salts investigated had no influence on the ampero- metric t i tration of SH groups in the concentrations used (up to 3 • 10 -a M).

Zusammen/assung. Im Hinbliek auf die Bestimmung yon Thiolgruppen in Muskelgewebe und Fleiseherzeug- nissen mit Hilfe der amperometrisehen Titration mit Sflbernitrat wurde der Einitul3 folgender Salze, die in dem Untersuchungsmaterial enthalten sein kSnnen, gepriift: CaC12, MgC12, ZnCl~, MnS04, CuS04, FeCI3, NaC1, KC1, NAN02, NaaP04, ATP und Laetat. Diese Salze wurden vor der Titration zu SH-Glutathion in 0,14 M Tris-Puffer pH 7,4 zugegeben. CuS04 verursaehte eine starke Erniedrigung des Stt-Gehaltes der LSsungen, die -- bei nicht zu hoher Konzentration an CuS04 -- dureh Zusatz yon 0,50/0 J4DTA verhindert werden konnte. In Gegenwart yon MnS04 t ra t ebenfalls eine Abnahme der vorgelegten SH-Menge ein. I~aC1 verursachte in Konzentrationen yon 0,1 M und hSher abnorm verlaufende Titrationskurven, wobei die graphisehe Ermittlung des ~quivalenzpunktes Schwierigkeiten bereitete. Die Titration yon SH-Gruppen in 0,6 M KC1-LSsung ergab ebenfalls abweiehende Titrationskurven, die das Ergebnis verf~lsehten. Die iibrigen untersuchten Salze fibten bei den angewendeten Konzentrationen (bis 3 �9 10 -a M) keinen signifikanten Einttul~ auf die amperometrische Titration der SH-Gruppen ans.

Zur rasehen und genauen Bestlmmung yon SH- Gruppen in Proteinen wird vielfaeh die ampero- metrisehe Titration mit Silbernitra~ herangezogen. Bei Anwendung auf biologisehes Material mul3 man jedoeh mit der MSgliehkeit rechnen, dal~ Begleit- substanzen, wie z .B . Sehwermetallspuren, die Be- stimmung beeinflussen oder stSren kSnnen. So wird naeh Kolthoff u. Stricks [4] die amperometrisehe Titration yon Cystein mit Silbernitrat in ammoniaka- fischer L5sung dureh Zink-, Kobalt-, Cadmium- und Kupferionen gest5rt, da diese Ionen mit Cystein sehwach dissoziierte Komplexe bilden. Ferner ist denkbar, dal3 Magnesium- und Caleiumionen ~hnlieh wie mit Sultldionen [2] aueh mit Thiolen Chelat- komplexe zu bilden vermSgen. WeiterMn kSnnen Ionen der Ubergangsmetalle die Oxydation der SH- Gruppen dureh Luftsauerstoff unter Bfldung yon Di- sulfidgruppen katalysieren. So wird die Autooxyda- tion der Stt-Gruppen yon reduzierter Takaamylase dureh die zweiwertigen Ionen yon Kobalt , Mangan, Eisen, Nickel und besonders Kupfer stark besehleu- nigt [6].

In der vorliegenden Arbeit wurde geprfift, ob die im Fleisch und in Fleischprodukten mSglieherweise vorkommenden Kationen und Anionen die ampero- metrisehe Titration yon SH-Gruppen mit Silbernitrat in Tris-Puffer pH 7,4 zu beeinflussen vermSgen. Zu diesem Zweck warden LSsungen mit bekanntem SH- Gehalt (Glutathion) in Gegenwart der betreffenden Ionen amperometrisch titriert. Die zu jeder Probe- 15sung zugesetzte Salz- bzw. Sauremenge wurde so ge- wahlt, dab sie dem maximalen Ionengehalt von 25 mg Fleiseh (der bei der vorliegenden Methode verwendeten Einwaagemenge) entspraeh oder dariiber lag.

17 Z. Anal. Chem., Bd. 250

1. Material and Methoden a) Reagentien Wg[3rlge Stamml6su~gen. 10 -a M LSsungen yon CaCI2, 1YfgC12, ZnCl2, MnSOa, CuSOa und FeC13, je 10 -2 l~I L6sungen yon Na3P04, ATP 1 und Milehs~ure, 30/0ige (~ 0,5 hi) NaCl- und 0,6 hi KC1-LSsung.

SH-Glutathion (ffir bioehemisehe Zweeke). 10 -3 i~I Stamm- 15sung. Der durch Titration ermittelte Gehalt des Pr~parats an SI-LGlutathion betrug 97,50/0 .

1 M Tris-Pu//er, pH 7,4, aus Tris(hydroxymethyl)-amino. methan und 20~ Salpeters~ure hergestellt.

b) TitrationsgerSt Die verwendete Apparatur zur amperometrisehen Titration der SH-Gruppen wurde bereits an anderer Stelle [3] beschrie- ben. Die wiehtigsten Teile sind folgende:

Stationgre Indicatorelektrode. Platindraht yon 0,5 mm und 1 em freier Li~nge; 100 ml-Steilbrustflasehe als Titra- tionsgef~B.

Bezugselektrode. Platindraht yon 0,5 mm ~ und 2 em freier Li~nge; rotes HgO/ges~tt. Ba(OH)~/Hg; Potential gegen die ges~tt. Kalomelelektrode: -- 0,1 V.

Automatische Mikrobi~rette. 0,01ml-Unterteilung, ver- l~ngerte Auslaufspitze in Titrationsgemiseh eintauehend.

Meflinstrument. Mikroamperometer (Fa. Norton GmbH., Frankfurt/Main) Modell 181 ~ AS; verwendeter ~el3bereieh: 3 t~A (1 Skalenteil _~ 0,05 ~A).

Magnetri~hrer mit Synehronmotor (Fa. H. Freye KG., Braunschweig, Typ 1203), hiagnetst~behen 4 • 35 mm mit Tefloniiberzug.

c) Arbeitsweise Zu dem vorgelegten Glutathion (s. Tabelle) warden 5 ml Tris- Puffer pH 7,4, verschiedene Mengen der besehriebenen Stamml5sungen (s. unter 1 a) und so viel Wasser zugesetzt, da0 das Endvoinmen des Titrationsgemisehes stets 36 ml be- trug (Endkonz. an Tris-Puffer: 0,14hi). Die resultierende Salzkonzentration der jeweiligen Vorlage ist in der Tabelle

1 Adenosin-5'-triphosphors~ure, Di-Natriumsalz.

258 K. Hofmann:

aufgefiihrt. Be• eines Ansatzes: 1 ml 10-aM Glutathion- 15sung, 5 ml Tris-Puffer, 29 ml Wasser, 1 ml 10 -2 ~ CaC12- L6sung. Die Gemische wurden entweder unmitt~lbar nach Zusammengabe der Komponenten oder nach einer bestimm- ten Wartezeit (s. Tabelle) amperometrisch titriert. Die Titration erfolgte in der Weise, dal~ man schrittweise alle 30 sec jeweils 0,10 ml einer genau 10 -2 M AgNOa-LSsung zusetzte und die entsprechenden Stromwerte an einem Mikroamperometer registrierte. Die Mel3werte, aufgetragen gegen die zugesetzten Mengen an Silbernitratl6sung, ergeben 2 sich schneidende gerado Linien (sog. umgekehrte L-Kurve, s. Abb.1), deren Schnittpunkt dem Aquivalenzpunkt der Titration entspricht.

2 . E r g e b n i s s e u n d D i s k u s s i o n

A u s d e n i n d e r T a b e l l e z u s a m m e n g e s t e l l t e n U n t e r -

s u c h u n g s e r g e b n i s s e n l a s sen s ich fo lgende Schlf isse

z i ehen :

1. Ca lc ium- , M a g n e s i u m - u n d Z i n k i o n e n ver -

u r s a c h e n be• K o n z e n t r a t i o n e n y o n 2 , 8 . 1 0 -5 u n d

2,8 �9 10 -4 g - A t o m ] l i m T i t r a t i o n s g e m i s c h ke ine St6-

r u n g de r a m p e r o m e t r i s c h e n T i t r a t i o n . D e r mayA-

m a l e Ca lc ium- u n d M a g n e s i u m g e h a l t des F le i sches

l i eg t be• 13 bzw. 27 rag /100 g [1]; d . h . be• e iner E i n -

w a a g e y o n 25 m g F l e i s ch p r o S H . B e s t i m m u n g l i eg t

die I o n e n k o n z e n t r a t i o n in d e r Vor l age (36 ml) h6ch- s t ens be• 0 , 2 . 1 0 -5 g - A t o m Ca/1 bzw. 0 , 8 . 1 0 - S g -

A t o m Mg/1 u n d d a m i t e r h e b l i c h n i ed r ige r als in

d ie sen M o d e l l u n t e r s u c h u n g e n . E i n e Bee in f lu s sung

de r a m p e r o m e t r i s c h e n S H - T i t r a t i o n d u r c h d ie ge-

w e b s e i g e n e n E r d a l k a l i m e t a l l e k o m m t d a h e r n i c h t in Betracht.

2. N a t r i u m p h o s p h a t , A d e n o s i n t r i p h o s p h a t und die

be• d e r G l y k o l y s e a u f t r e t e n d e Mi lchs~ure h a b e n

Tabelle. Einflufi yon Salzen au/ die amperometrische Titration von Glutathion ( GSH) mit 10 -2 M AgNO2 in O,l g M Tris-Puffer pH 7,4

Salz Konz. in der Einwirkungs- [~1~Iol GSH n Abweichung

Titr.-Vorlage dauer zugesetzt gefunden ~ 1 7 6 ~oI/1 rain ~ s

CaCI~ CaC12 MgCI2 YIgCl~ ZnC12 ZnC12 lVlnS04 M-uS04 NLuS04 CuS04 CuS 0 4 ~ CuS04 a CuSO 4 CuS04 ~ YeC12 NaC1

NaC1

2 ,8 .10 -5 2 ,8 .10 -4 2,8 �9 10 -5 2,8 �9 10 -4 2,8 �9 10 -~ 2,8 �9 10 -4 2,8 �9 10 -5 2,8 �9 10 -5 2,8 �9 10 -~ 2,8 10 -5 2,8 10 -5 2,8 10 -~ 2,8 10 -4 2,8 10 -4 2,8 10 -~ 4,0" 10 -2

0,1

NaCI 0,2

l~aC1 0,4

1,00 - - 0,78 - - 1 , 0 0

- - 0,78 10 1,27 10 1,27 - - 1,01 2 1,01

10 1,01 - - 1,02 2 1,01

10 1,01 2 1,01

10 1,01 - - 1,00 - - 1 , 2 0

- - 1 , 1 9

- - 1 , 1 8

- - 1 , 1 9

KC1 1,0" 10 -2 -- 1,17 KC1 0,6 - - 1,17 Iqal~O., 1,4" 10 -~ 10 0,50

NaNO 2 1,4 �9 10 -5 15, erh. 0,50 (100~

NaaPO 4 1,2- 10 -a - - 0,96 Na2PO a 1 ,4 .10 -a - - 0,96 ATP 0 ,5 .10 -a 60 0,90 ATP 1 ,4 .10 -2 60 0,90 Lactat 1,1 �9 10 -4 - - 0,96

1,00 4, 0,01 5 4. 0 0,79 -4- 0,Ol 5 + 1 0,99 4. 0,01 6 -- 1 0,80 4. 0,02 5 + 3 1,27 -4- 0,01 7 ~: 0 1,27 -4- 0,01 6 4. 0 0,94 4. 0,03 5 -- 7 0,90 4. 0,02 5 -- 11 0,76 4. 0,03 5 - - 25 0,34 4. 0,10 5 - - 67 1,00 -4- 0,01 5 -- 1 1,00 4" 0,02 5 -- 1 0,84 4" 0,04 4 -- 17 0,89 4" 0,01 3 -- 12 1,03 -4- 0,02 4 -~- 3 1,19 -4- 0,01 3 -- 1

a) 1,05 b - - 2 -- 12 b) 1,25 -- + 5

a) 0,97 4" 0,01 3 - - 18 5)1,194.0,01 + 1

a) 0,96 4, 0,02 5 -- 19 b) 1,17 4" 0,04 -- 2

1,17 4" 0,01 10 4" 0 0,90 -4- 0,03 2 -- 23 0,51 4" 0,01 4 + 2

0,50 4- 0,01 3 4- 0

0,97 4" 0,01 4 + 1 0,95 ~: 0,02 3 -- 1 0,91 4. 0,0t 3 -+- 1 0,90 4- 0,01 3 4, 0 0,95 4" 0,01 3 -- 1

a Die Vorlage enthielt 0,50/o ADTA. b Nieht normal verlaufende Titrationskurven nach Art yon Abb.2 erm6gliehten die Konstruktion zweier

~) Yerbindung der unteren, b) Verbindung der oberen Kurvenpunkte (nEheres siehe Text). Endpunkte:

Beeinflussung der amperometrischen Titration yon Sulfhydrylgruploen 259

24 -~

2o _~

16

12

8

4

0 ~ n O m[ AgNO 3

i ~ J i t i i J ~ , o o,4 o,8 ~,2 ~,6 2,o

A b b . l . Ti~srat ionskurve m i t reg~l l~rem ~erl&tl~. I n diesem ]~eispiel: r i t r~ { i o ]2 v o n ][,00 ~r S ] : I - ~ l u t a t h i o n m i t 10 -3

AgNO~-LSsung

- - selbst in 1Y[engen, die den natfirlichen Gehalt welt iibersteigen - - keinen Einflul3 auf die SH-Bestim- mung. Das gleiche triff~ auf dreiwertiges Eisen zu, das durch Dosenkorrosion in Fleischkonserven ge- langen kann (die Abweichung yon 3~ liegt noch im Bereich des Analysenfehlers).

3. lqatriumchlorid beeinfiul3t die amperometrische Titrat ion von St t -Gruppen bei Konzentrat ionen bis 4 - 10 -3 M in der Vorlage nicht 2. Auch eine 10 -3 M KC1-LSsung ist ohne EinfluI~. HShere NaC1-Konzen- trabionen (0,1 M und hSher), wie sie etwa in PSkel- laken vorkommen (eine 3~ NaC1-LSsung z .B . ist ca. 0,5 M), beeinflussen dagegen den Verlauf der Titrat ionskurven (s. Abb.2): I m steilen Kurventefl liegen die MeBpunkte nicht auf einer Geraden, wie bei einer regulgren Titrat ionskurve (Abb. 1), so da$ die graphische Ermit t lung des fi~quivalenzpunktes problematisch wird. Eine noch recht gute Uberein- s t immung zwischen dem ermit~elten und dem vor- gegebenen SH-Gehalt ergibt sich bei Berficksichti- gung nur der letz~en 4 Kurvenl0unkte (ausgezogene Gerade). Bei Verbindung der ersten 4 - -5 MeBpunkte im Kurvenanstieg (gestrichelte Gerade) resultiert da- gegen ein zu niedriger ~quivalenzpunkt.

Hohe Konzentrat ionen an KC1 stSren die Titra- tion ebenfalls. Daher verbieteg sich z.B. eine direkte amperometrisehe Titrat ion der SH-Gruploen yon Aetomyosin in 0,6 IV[ KC1-LSsung, in der das Protein 15slieh ist.

4. Natrinmm'tri t , das zum PSkeln yon Fleiseh ver- wendet wird, stSrt bei p H 7,4 die SH-Best immung

2 Selbs~ eine Konzentration yon 10~ NaC1 in der 25 mg- Probe wfirde noch nicht stSren, da sie sieh bei Yerteilung im Titrationsgemisch (36 ml) auf weniger als 2 �9 10 -3 M verrin- gert.

17"

20 ~ �9 bo

16

12

4

2 o ~

mL AgNO 3 i D i i i ~ i i i i

0 0,4 o,B t2 1,6 2,0

A b b . 2. f l_bweiohun~ der MeBlounkte v o m regu l~ren K R r v e n - v e r l a u f in fo ]ge zu ho l le r Ch lo r io I lenkonzent ra t io r l . D ie Vo r - lage enthielt 1,18 ~lRo] GSH und war 0,2 1R an NaC1

nicht. Auch nach 15 min Erhitzen auf 100~ finder man die vorgelegte Stt-Menge wieder. I n saurer L6sung dagegen reagiert Nitr i t bzw. die freigesetzte salloetrigo S~ure mit den SIt-Grulopen unter Bfldung yon Nitrosothiolen [5]. I m Analysengang ist daher bei Anwesenheit yon Nitr i t ein Ansguern - - z .B . zum Zwecko der EiweiBfgllung - - unbedingt zu ver- meiden.

5. CuSO 4 und MnS04 verursachten eine betr/~cht- fiche Erniedrigung des SH-Gehaltes der t i tr ierten LSsungen, offenbar infolge einer katalyt isch be- schleunigten Oxydation der SH-Gruppen. I m Falle des Kupfersulfats, das einen starken Einflul~ ausfibt, betr/~gt der Verlust an StLGruppen bis zwei Drittel der vorgelegten SH-Menge. Bei einer Konzentrat ion yon 2,8 �9 10 -~ M CuSO 4 l~l~t sich dieser Verlust durch einen Zusatz yon 0,5~ :~I)TA vermeiden, bei der zehnfachen CuSO4-Konzentration jedoch nicht mehr. U m den SH-Gehalt yon zu titrierenden L6sungen mSglichst weitgehend zu stabflisieren, empfiehlt sich grunds~tzlich ein Zusatz yon ~DTA.

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Dr. K. Hofmann Bundesanstalt ffir l~leischforschung D-8650 Kulmbach, Blaich 4