Bestimmung von Cobalt in Blut mit Hilfe der elektrothermalen Atomabsorptionsspektrometrie

J. Angerer und R. Heinrich

Ordinariat ffir Arbeitsmedizin der Universitfit und Zentralinstitut ftir Arbeitsmedizin der Gesundheitsbeh6rde der Freien und Hansestadt Hamburg, Adolph-Sch6nfelder-Str. 5, D-2000 Hamburg, Bundesrepublik Deutschland

Determination of Cobalt in Blood by Electrothermal Atomic Absorption

Summary. A reliable atomic absorption method for the direct determination of cobalt in blood is described. By means of a "three-step" mineralization programme and an eightfold dissolution of the blood it permits the mineralization and volatilization of the organic components under controlled conditions and the elimination of interference factors. A detection limit of 2 I~g/l allows the determination of elevated cobalt levels in blood which perhaps are caused by occu- pational exposure. In-series and between-day imprecision of the method were between 1 and 4 % or 6 %, respectively. The accuracy of the method was tested by recovery experiments and by comparison with an independent polarographic method. With the aid of blood samples of occupationally exposed persons it could be shown that the atomic absorption as well as the polarographic method lead to results being within the range of the methods' imprecision.

Zusammenfassung. Es wird ein analytisch zuverl/issiges atomabsorptionsspektrometrisches Direktverfahren zur Be- stimmung der Cobaltkonzentration in Vollblut beschrieben. Durch die Anwendung eines dreistufigen Mineralisierungs- programms und durch eine achtfache Verdiinnung des Blutes gelingt es, die Veraschung und Verfltichtigung der organi- schen Bestandteile kontrolliert ablaufen zu lassen und St6reinflfisse der biologischen Matrix auf das Endergebnis zu eliminieren. Bei einer Nachweisgrenze yon 2 gg/1 erlaubt diese Methode die Bestimmung erh6hter Cobaltspiegel in Blut, wie sie z.B. infolge beruflicher Belastungen auftreten. Die unter Wiederholungsbedingungen in der Serie und von Tag zu Tag ermittelte Unpr/izision der Methode liegt zwischen 1 und 4 % bzw. bei 6 %. Die Richtigkeit des Verfahrens wurde sowohl dutch Wiederfindungsversuche wie insbesondere durch Ver- gleich mit einem unabhfingigen polarographischen Verfahren iiberprtift. An Blutproben beruflich Cobalt-exponierter Per- sonen konnte gezeigt werden, dab das atomabsorptionsspek- trometrische und das polarographische Verfahren zu Ergeb- nissen ffihren, die innerhalb der Fehlergrenzen als identisch anzusehen sin&

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Einleitung

Cobalt und viele seiner Verbindungen finden in der Industrie vielffiltige Verwendung, u.a. als Bestandteil von Hartmetal- len, als Katalysator verschiedener organischer Synthesen, bei der Herstellung keramischer Farben usw.

Einer kfirzlich erfolgten Umfrage der Berufsgenossen- schaft der chemischen Industrie [1] zufolge sollen allein in der Bundesrepublik Deutschland 2300 Personen in 70 Betrieben beruflich gegen Cobalt exponiert sein. Wegen seiner verbrei- teten Anwendung in der Industrie und insbesondere weil sich dieses Metall im Tierversuch als cancerogen erwiesen hat [2], kommt deshalb dem vorbeugenden Gesundheitsschutz beruf- lich Cobalt-exponierter Personen besondere Bedeutung zu.

Bei der Pr/ivention berufsbedingter Erkrankungen stellt die laufende Kontrolle der Schadstoff- bzw. Metabolitenkon- zentration in den K6rperfliissigkeiten, das sog. Biological Monitoring, die beste M6glichkeit dar, das Gesundheitsrisiko des Individuums zu beurteilen. Wfihrend wir ftir die Bestim- mung der Cobaltkonzentration im Harn ein /iuBerst lei- stungsffihiges Verfahren vorlegen konnten [3, 4], fehlt bis heute eine Methode, die fiir die routinemfiBige Bestimmung der Cobaltkonzentration des Blutes geeignet erscheint. Die bisher beschriebenen atomabsorptionsspektrometrischen Methoden setzen in der Regel eine Mineralisierung der biologischen Matrix voraus, der dann vor der eigentlichen Bestimmung noch ein Anreicherungsschritt folgt [5, 6].

Wir haben deshalb ein Direktverfahren zur atomabsorp- tionsspektrometrischen Cobaltbestimmung im Vollblut ent- wickelt, das neben der analytischen Zuverlfissigkeit auch dem Anliegen der routinemN3igen Anwendbarkeit Rechnung trfigt.

Experimenteller Teii

Ger~iteparameter

Atomabsorptionsspektrometer: Typ 4000 der Fa. Perkin- Elmer; Absorptionswellenl/inge : 240,7 nm; Spektrale Bandbreite : 0,2 nm (low) ; Stromstfirke der Cobalthohlkathodenlampe: 3 0 - 40 mA; Untergrundkompensation: Deuteriumlampe; MeBsignal: Extinktion der gr6Bten Peakh6he w/ihrend der Atomisierungsphase; Graphitrohrkfivette: Typ 500 der Fa. Perkin-Elmer; Rohrtyp: pyrolytisch beschichtetes Graphitrohr; Probenaufgabe: manuell; Injiziertes Volumen : 25 btl; Schutzgas: nachgereinigtes Argon.

Fresenius Z Anal Chem (1984) 318:37 40 ~{! Springer-Verlag 1984

Temperatur-Zeitprogramm der Graphitrohrkiivette

Trocknen Mineralisieren Atomi- Kon- sieren ditio-

I II III nieren

Temperatur [~ 100 350 500 1000 2650 2700 Anstiegzeit [s] 10 15 20 5 0 1 Phasendauer [s] 25 15 15 15 15 2 GasfluB [ml/min] 300 300 300 300 30 300

Kalibrierung

Die Kalibrierung erfolgt nach dem Standardadditionsverfah- ren. Man bestimmt die Extinktionen der undotierten wie der drei mit steigenden Cobaltmengen versetzten Blutproben. Diese Extinktionen werden um einen eventuell auftretenden Reagentienleerwert vermindert und gegen die auf das ein- gesetzte Blutvolumen bezogenen Cobaltkonzentrationen der Vergleichsstandardl6sung (20, 50 und 80 gg/1) aufgetragen. Das MeBergebnis ergibt sich graphisch aus dem Schnittpunkt der Kalibriergeraden mit der Abszisse.

Ldsungen

0,01 M Salpetersfiure: aus Salpeters/iure Suprapur 65% (Merck Nr. 441); 0,001%ige Triton-X-100-L6sung (wfil3rig) : aus Triton-X-100 (Merck Nr. 11869).

Vergleichsstandardl6sungen

Eine CobaltmaB16sung 0,1g (Fixanal, Riedel-de Hahn Nr. 38607) wird mit Aqua bidest, in einen 1-1-MeBkolben tiberffihrt, der zur Marke aufgeffillt wird. Aus dieser Stamm- 16sung stellt man durch Verdfinnen mit 0,01 M Salpetersfiure VergleichslSsungen her, die 100, 250 und 400~tg Cobalt/1 enthalten.

Probenaufbereitung

Die Blutproben werden mit einem Einmalbesteck durch Punktion der Armvene gewonnen. Als Entnahmegef~iBe dienen KunststoffrShrchen (ca. 10ml Inhalt), die Kalium- EDTA als Antikoagulans enthalten (Fa. Sarstedt). Die Kontaminationsfreiheit dieser Gef~Be muB durch laufende Stichproben gesichert werden. In diesen Geffil3en kann das Blut versandt und gelagert werden. Die Lagerung kann bis zu sieben Tagen im Kfihlschrank erfolgen. Eine fiber diese Zeit hinaus erforderliche Lagerung sollte in der Tiefkiihltruhe vorgenommen werden. Alle im folgenden beschriebenen Pipettierungsvorg~inge werden mit automatischen Pipetten und Einwegpipettenspitzen durchgeffihrt.

Zur Analyse einer Blutprobe werden vier Polyethylen- r6hrchen ben6tigt, die mit 1 M Salpetersiiure und an- schlieBend mit Aqua bidest, gespfilt werden.

In diesen R6hrchen werden 850 gl 0,001%ige Triton-X- 100-LSsung vorgelegt, die mit einem Tropfen n-Octanol versetzt werden. Zu dieser L6sung pipettiert man langsam 125 gl Blut, die man an der Wandung des Geffil3es abfliel3en lfiBt. Um das Blut mSglichst quantitativ der MeB15sung zuzuffihren, wird die Pipettenspitze durch Aufziehen der im R6hrchen befindlichen LSsung ausgespfilt. Das Gemisch wird anschliel3end auf einem (Vortex-)Riittler 20 s grfindlich homogenisiert. Drei der so vorbereiteten Blutproben werden mit je 25 ~tl einer der drei wfiBrigen Vergleichsstandardl6sun- gen (100, 250, 400 gg/1) versetzt. Zu der vierten Probe gibt man statt dessen 25 lal 0,01 M Salpetersfiure. Nacb Zugabe der StandardlSsungen durchmischt man die Proben nochmals 20 s auf dem Intensivmischer.

Bei jeder Probenserie wird ein Reagentienleerwert mit- analysiert, der statt Blut 125 gl Aqua bidest, enthNt.

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Ergebnisse und Diskussion

Mit der hier beschriebenen elektrothermalen atomabsorp- tionsspektrometrischen Methode kann Cobalt direkt und ohne weitere Probenaufbereitung im Vollblut bestimmt wer- den.

DaB es gelingt, den Cobaltspiegel st6rungsfrei mit dieser I3irektmethode zu erfassen, beruht

- auf der groBen - achtfachen - Verdtinnung der biologi- schen Matrix - und auf dem fiber drei Temperaturstufen ftihrenden Mineralisierungsprogramm.

Die groBe Verdfinnung des Blutes bewirkt eine drastische Reduzierung der vonder biologischen Matrix ausgehenden StSreinflfisse auf die atomabsorptionsspektrometrische Mes- sung [7]. Mit der Verminderung der Matrixeffekte geht gleichzeitig eine ErhShung der Lebensdauer von Graphitroh- ren und Kontakten einher. Zwar ist mit der Verdfinnung des Blutes natfirlich eine Erh6hung der Nachweisgrenze verbun- den, diese kann jedoch in Kauf genommen werden, wenn erh6hte, arbeitsmedizinisch relevante Cobaltkonzentrationen zu erfassen sind. Es hat sich bew~ihrt, den Emulgator Triton- X-100 in einer ungewShnlich geringen Konzentration yon 0,001% einzusetzen, weil so das Einbringen der Probe in das Graphitrohr sehr erleichtert wird. Darfiber hinaus wird dadurch und durch den Zusatz yon n-Octanol zur Blutver- dfinnung eine fiberm/iBige Schaumbildung in der Graphit- rohrkfivette wfihrend des Temperatur-Zeitprogramms ver- hindert.

Durch die Anwendung des ,,dreistufigen Mineralisie- rungsprogramms" gelingt es auBerdem, Veraschung und Verflfichtigung der organischen Bestandteile so kontrolliert ablaufen zu lassen, dab Cobaltverluste nicht auftreten. Auf diese Weise wird eine unkontrollierte Bildung yon Rauch vermieden, der nach unseren Erfahrungen groBe Teile des in der Probe vorhandenen Cobalts mechanisch mitreigen und so der Bestimmung entziehen kann.

Die Endtemperatur des Mineralisierungsprogramms schlieglich liegt mit 1000~ hoch genug, um alle organischen Bestandteile, die die atomabsorptionsspektrometrische Be- stimmung st6ren k6nnten, zu mineralisieren bzw. zu verflfich- tigen, ohne dab auf der anderen Seite bei dieser Temperatur Cobaltverluste zu befiirchten wS~ren.

Die Kriterien der analytischen Zuverl~issigkeit dieser Methode haben wit zun/ichst an Humanblut untersucht, das wit zu diesem Zweck mit definierten Cobaltkonzentrationen versetzt haben.

Die ffir die PrS.zision und die Wiederfindungsrate erhalte- nen Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaBt. Es zeigt sich, dab dieses Verfahren im Bereich yon Cobaltkonzentra- tionen, die gegenfiber den bei der Normalbev61kerung gefun-

Tabelle 1. Prfizision und Wiederfindungsraten, ermittelt in der Serie und von Tag zu Tag bei Cobalt-dotierten Humanblutproben. n= 10 Bestimmungen; s s=Standardabweichung; VK = Variationskoeffizient

Sollwert Istwert (Leerwert + zuges. Konz.) [gg/1] [gg/1]

Wieder- findungs-

s VK rate [~tg/1] [ %] [ %]

0,13 7,1 63,3 0,24 4,2 95,0 0,13 1,2 103,6

0,70 6,2 102,7

Serie 1,0" + 2,0 1,9 1,0" + 5,0 5,7 1,0 ~ + 10,0 11,4

TagzuTag 1,0 ~+10,0 11,3

Ffir die Cobaltkonzentration der undotierten Blutprobe ist die halbe Nachweisgrenze angegeben

denen Werten deutlich erh6ht sind, analytisch valide Ergeb- nisse liefert. Eine von Tag zu Tag auftretende Unprfizision yon ca. 6 ~ erfiillt die Anforderungen der statistischen Qualit/itssicherung ebenso wie die Wiederfindungsraten, die zwischen 95 und 104~ liegen. Bei Cobaltkonzentrationen zwischen 2 und 3 gg/1 werden bei einer Wiederfindungsrate yon nur 63 ~ (Tabelle 1) die Grenzen dieser Methode deut- lich. Diese Konzentration liegt in der Gr6genordnung der Nachweisgrenze des Verfahrens, die mit ca. 2 btg/1 angegeben werden kann. Eine Cobaltblutkonzentration in dieser H6he liefert unter den von uns gewfihlten Bedingungen der Proben- aufbereitung und der apparativen Gegebenheiten eine Ex- tinktion von 0,004 Einheiten, die gemeinhin zur Berechnung der Nachweisgrenze in der Atomabsorptionsspektrometrie herangezogen wird.

Die analytische Zuverlfissigkeit dieser Methode haben wir auger an dotiertem Blut auch an Blutproben von exponierten Personen erprobt, die an ihrem Arbeitsplatz einer Belastung durch metallisches Cobalt bzw. durch Cobaltsalze ausgesetzt waren.

Zur Bestimmung der Pr/izision der Methode wurden zw61f solcher Blutproben, die Cobaltgehalte zwischen <2gg/1 und 31,1~tg/1, im Mittel 10,8lag/1 aufwiesen, in Doppelanalysen aufgearbeitet. Aus den Differenzen der Doppelbestimmungen 1/il3t sich eine Standardabweichung von 0,3 lag/1 berechnen. Bezogen auf die mittlere Cobalt- konzentration der Proben entspr~iche dies einem Variations- koeffizienten von 2,8 ~. Die durch Wiederfindungsversuche an dotiertem Humanblut abgeschgtzte Unprgzision der Methode findet damit ihre Bestfitigung.

Die Richtigkeit des hier beschriebenen Verfahrens wurde mit einer unabh~tngigen voltammetrischen Analysenmethode tiberprfift [8]. Dazu wurden die Cobaltkonzentrationen in Blut von 25 weiteren Arbeitern und Rentnern des bereits erwghnten Betriebes nach beiden Verfahren bestimmt. Wie die Abb. 1 zeigt, korrelieren die mit beiden Methoden erhalte- nen Ergebnisse fiugerst straff(r = 0,985). Dem Steigungskoef- fizienten, der bei nahezu 1 liegt, ist zu entnehmen, dab beide Verfahren zu Ergebnissen ftihren, die innerhalb der Fehler- grenzen als identisch angesehen werden k6nnen. Ihre Bestfiti- gung durch ein unabh~ingiges Analysenverfahren deutet auf die Richtigkeit der mit der elektrothermalen Atomabsorp- tionsspektrometrie erhaltenen Werte hin. Da der voltamme- trischen Bestimmung eine totale Mineralisierung des Blutes vorangeht, zeigen diese Ergebnisse augerdem, dab mit der atomabsorptionsspektrometrischen Direktbestimmung das

~=~ 6O

=. UJ -~ 5 50 (3. N

t Y c 4 0

Iz ~ 3o

N

O ,=2o o o

10

/ r = 0 , 9 8 5 ~? ~=t~ �9 y = O 8 3 + 0 9 7 x /

0 ~ / ~ i 210 i i i i 10 3 0 4 0 5 0 6 0

Co Konzen t ra t i on in Blut [pg / I ]

E T A A S

Abb. 1. Vergleich der mit zwei voneinander unabh/ingigen Methoden ermittelten Cobaltkonzentrationen in Blut yon 25 Personen, die beruflich Cobalt-exponiert sind bzw. waren

gesamte im Blut vorhandene Cobalt erfagt wird, unabhfingig vonder Art seiner chemischen Bindung.

Wie die geschilderten Ergebnisse zeigen, ist das bier vorgestellte Verfahren filteren Methoden [9, 10] zur Analyse von Blutplasma hinsichtlich Nachweisverm6gen und analyti- scher Zuverlfissigkeit fiberlegen. In einem vor kurzem von Delves u. a. [11] publizierten Verfahren, das uns erst nach der Entwicklung unserer Methode bekannt wurde, wird Vollblut nach Verdtinnung mit Salzs~iure und Ammoniumdihydro- genphosphat-L6sung (1 + 1 + 1) ebenfalls direkt mit Hilfe der elektrothermalen Atomabsorptionsspektrometrie analy- siert. Dabei soll eine Nachweisgrenze von 0,2 gg/1 erreicht werden. Allerdings mug zur Reduzierung der molekularen Absorption w/ihrend des Veraschungsschrittes in die Gra- phitrohrk/jvette gasf6rmiger Sauerstoff geleitet werden, was neben eines zusfitzlichen apparativen Aufwandes zu einer verringerten Lebensdauer yon Graphitrohren und Kontakten fiihren dtirfte.

Zusammenfassend ergibt sich, dab mit der vorliegenden Methode der Cobaltgehalt des Blutes analytisch zuverlfissig erfagt werden kann. Dies gilt f/jr Cobaltspiegel, die z.B. infolge einer beruflichen Belastung erh6ht sind. Der Bereich physiologischer Cobaltkonzentrationen in Blut, der nach unseren Untersuchungen unter der bier erzielten Nachweis- grenze yon 2lag/1 liegt, kann mit diesem Verfahren nicht erfal3t werden. Zur Bestimmung des arbeitsmedizinisch be- deutsamen Konzentrationsbereiches jedoch ist es seiner ana- lytischen Zuverl/issigkeit wegen augerordentlich gut geeignet. Insbesondere der Fortfall aufwendiger Schritte der Proben- vorbereitung, vor allem einer vorangehenden Mineralisierung der Probenmatrix, macht dieses Verfahren f/Jr die gesetz- lich vorgeschriebenen routinem/igigen Uberwachungsunter- suchungen beruflich Cobalt-exponierter Personen aul3er- ordentlich wertvoll.

L i t e r a t u r

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