Beteiligung der glyzinergen Neurotransmission an der ... · Heute ist die Behandlung chronischer, neuropathischer Schmerzen im klinischen und praktischen Alltag immer noch ein Problem,

Aus dem Institut für Versuchstierkunde

und zentralem Tierlaboratorium

(Geschäftsführender Vorstand: Prof. Dr. H. Hedrich)

der Medizinischen Hochschule Hannover

und

Klinik für Anästhesiologie

der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf

Beteiligung der glyzinergen Neurotransmission

an der Lidocain vermittelten spinalen Antinozizeption

bei neuropathischen Schmerzen der Ratte

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung

des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Katrin Kollosche

aus München

Hannover 2006

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. H. Hedrich

Institut für Versuchstierkunde der MHH

Carl- Neuberg- Strasse 1

30625 Hannover

Dr. med. U. Muth-Selbach

Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf

Klinik für Anästhesiologie

Moorenstrasse 5

40225 Düsseldorf

1. Gutachter: Prof. Dr. H. Hedrich

2. Gutachter: Priv.-Doz. Dr. rer.nat. M. Gernert

Tag der mündlichen Prüfung: 22. Mai 2006

Gefördert und unterstützt von der Tierversuchsanlage der Heinrich-Heine Universität

Düsseldorf.

Inhaltsverzeichnis I

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ........................................................................................................... 1

2 Grundlagen ........................................................................................................ 4

2.1 Neuropathischer Schmerz infolge peripherer Nervenläsion ......................... 4

2.2 Tiermodell für den neuropathischen Schmerz.............................................. 8

3 Methoden und Materialien ...............................................................................12

3.1 Installation des intrathekalen Katheters.......................................................12

3.2 Induktion einer Neuropathie nach dem Bennett- Modell..............................14

3.3 Installation des zentralen Venenzuganges..................................................15

3.4 Verhaltensbeobachtung und thermale Testung...........................................16

3.5 Lageüberprüfung des intrathekalen Katheters post mortem........................21

3.6 Auswertung und statistische Methoden.......................................................22

3.7 Verwendete Substanzen und deren Abkürzungen ......................................23

3.7.1 Lidocain.........................................................................................................23

3.7.2 D-Serin..........................................................................................................24

3.7.3 Strychnin .......................................................................................................25

3.7.4 CGP 78608 ...................................................................................................25

3.7.5 Natrium-Chlorid Lösung ................................................................................26

4 Ergebnisse ........................................................................................................27

4.1 Thermale Hyperalgesie nach Neuropathieinduktion....................................28

4.2 Lidocain-Dosisfindung und Blutkonzentration von 1% Lidocain in vivo bei

der Ratte ................................................................................................................38

4.3 Einfluß der applizierten Pharmaka auf die induzierte Hyperalgesie ............40

5 Diskussion ........................................................................................................41

6 Zusammenfassung...........................................................................................51

7 Summary...........................................................................................................53

8 Abbildungen und Tabellen ..............................................................................55

9 Literaturverzeichnis .........................................................................................70

10 Danksagung......................................................................................................79

1 Einleitung 1

1 Einleitung

„An unpleasant sensory and emotional experience associated with actual or potential

damage, or described in terms of such damage.“

(Definition des Schmerzes; aus: Task Force on Taxonomy, International Association

for the Study of Pain, 1979).

Heute ist die Behandlung chronischer, neuropathischer Schmerzen im klinischen und

praktischen Alltag immer noch ein Problem, da sie trotz vieler Fortschritte in der

Forschung häufig therapieresistent sind. Der neuropathische Schmerz hat im

Klinikalltag einen sehr hohen Stellenwert, etwa 40% aller Patienten in

Schmerzambulanzen und Schmerzkliniken leiden unter ihm.

Schmerz ist ein Bewußtseinsvorgang (HANDWERKER, 1999), der in vielen Teilen

des zentralen Nervensystems verarbeitet wird.

Die komplexen Zusammenhänge des neuropathischen Schmerzes sind bis heute

noch nicht genau geklärt (YAMAMOTO et. al.; 1991, SUGIMOTO et. al., 2000;

PARSONS, 2001, MUTH-SELBACH et al., 2004).

Die herkömlichen Therapien mit Opioiden (z. B. Fentanyl, Tramadol oder Morphin),

nicht-steroidalen Antiphlogistika (NSAID`s, z.B. Acetylsalicylsäure oder Diclofenac),

Antiepileptika oder anderen antiphlogistischen Therapeutika haben wegen der zum

Teil sehr komplexen Nebenwirkungen (Gewöhnung, Suchtpotential, Schläfrigkeit

oder systemische Nebenwirkungen als Beispiel, um nur einige zu erwähnen) ihre

Grenzen im Einsatz am Patienten. Opioide sollen wegen ihrer vielfälltigen

Nebenwirkungen nur im reduzierten Maße angewendet und durch verträglichere

Medikamente ersetzt werden.

Daraus ergibt sich die Forderung nach neuen Therapiemöglichkeiten. Der innovative

Gedanke der momentanen Schmerztherapieforschung ist eine selektive Blockade

1 Einleitung 2

von Teilen der schmerzweiterleitenden Elemente, zum Beispiel der N-methyl-D-

aspatat- (NMDA-) und Strychnin-sensitiven, inhibitorische Glycinrezeptoren.

Die selektive Antagonisierung entfaltet ihre antihyperalgetische Wirkung ohne die

vielfältigen systemischen Nebenwirkungen (zum Beispiel Schwindel, Husten,

Tremor) bei den Patienten (PARSONS et al., 1997). Die Manipulation des

Glycintransportes in Zusammenhang mit der extrazellulären Konzentration von

Neurotransmittern und die genaue Funktionsweise der Rezeptoren sind ein guter

Ansatzpunkt, um eine effektive und nebenwirkungsreduzierte Schmerztherapie

durchzuführen (WHITEHEAD et al., 2004). In der Literatur wird Glycin eine

inhibitorische (über strychnin-sensitive Glyzinrezeptoren) und eine exzitatorische (als

Co-Agonist am NMDA-Rezeptor) Wirkungsweise im zentralen Nervensystem

zugesprochen. Doch die genaue Wirkungsweise und die Frequenz der Aktivierung

der einzelnen Rezeptortypen ist noch ungeklärt.

Die vorliegende Arbeit soll in vivo weitere Einblicke in die Funktionsweise der

glycinergen Transmission am NMDA-Rezeptor erbringen.

BIELLA et al. haben 1993 in ihren Arbeiten an isolierten WDR-Neuronen („wide

dynamic range neurons“) durch Iontophorese versucht darzustellen, wie bestimmte

Agonisten und Antagonisten am NMDA-Rezeptor einzeln und in Kombination

miteinander an der Signalübertragung bei chronischen Schmerzen beteiligt sind.

Aufbauend auf dieser Dissertation soll dieser Grundgedanke auf das lebende, in

Ganzheit bestehende Tier übertragen werden.

Mit gezielter Antagonisierung und Agonisierung der Rezeptoren soll versucht

werden, die Funktionsweise bei spinaler Schmerztransmission besser zu verstehen,

um so Rückschlüsse für eine gezielte Schmerztherapie zu erhalten.

Wegen der Komplexität des NMDA-Rezeptors und dessen vielfältigen Aufgaben,

würde eine Blockierung des ganzen Rezeptors viele Nebenwirkungen hervorrufen,

wie zum Beispiel psychomimetische Effekte, Beeinträchtigung des

Erinnerungsvermögens, Ataxie und Beeinträchtigung der motorischen Koordination

(PARSONS, 2001).

1 Einleitung 3

Eine teilweise Hemmung des NMDA-Rezeptors durch pharmakologische Substanzen

würde der Transmission des Schmerzes entgegenwirken und die oben genannten

Nebenwirkungen reduzieren.

Ein weiteres Ziel der Arbeit ist es, zu untersuchen, ob die analgetische Wirkung eines

niedrig dosierten, systemisch gegebenen Lidocains zu bestimmten Teilen über

glycinerge Mechanismen vermittelt wird. Lidocain ist in der Klinik und in der Praxis

ein bevorzugtes Medikament bei der neuropathischen Schmerztherapie

(MARCHETTINI et al., 1992; SOTGIU et al., 1992), da es die verschiedenen Phasen

des Schmerzes blockieren und dem Patienten so Erleichterung verschaffen kann.

Als Grundlage für diese Dissertation diente das Schmerzmodell, welches BENNETT

und XIE 1987 etabliert haben. Es ist eine gute Möglichkeit am wachen, nicht fixierten

und manipulierten Gesamtorganismus die Frage der Schmerzmodulation zu klären

2 Grundlagen 4

2 Grundlagen

2.1 Neuropathischer Schmerz infolge peripherer Nervenläsion

Die Behandlung chronischer, neuropathischer Schmerzen ist im klinischen und

praktischen Alltag immer noch ein Problem, da sie trotz vieler Fortschritte in der

Forschung häufig therapieresistent sind.

Neuropathischer Schmerz:

Im Gegensatz zu einem Nozizeptorschmerz, bei dem nach einem Gewebstrauma

periphere und zentrale neuronale Strukturen der Nozizeption und des Schmerzes

intakt sind, kommt es bei neuropathischen Schmerzen zu einer Schädigung der

reizaufnehmenden und –verarbeitenden Strukturen. Diese Schädigungen können

sowohl reversibel sein als auch einen Chronifizierungsprozess durchlaufen, d. h. es

kommt zu degenerativen Prozessen in den geschädigten Strukturen. Diesen Prozess

nennt man zentrale Sensibilisierung (JONES et al., 2001).

Die Sensibilisierung ist ein Phänomen der Nozizeption. Anders als bei taktilen oder

thermischen Reizen, die nach mehrmaliger Stimulation eine Gewöhnung oder

Habituation nach sich ziehen, spricht man bei lang anhaltender Aktivierung von

Nozizeptoren, z.B. bei Entzündung oder schweren Gewebstraumata, von einer

synaptischen Sensibilisierung in Form des „wind-up-Phänomens“.

In diesem Zusammenhang sind WDR (wide dynamic range) Neurone von

Bedeutung, die im zentralen Bereich des Rückenmarkes zu finden sind. Sie sind

nicht spezifisch für eine Reizart sensibel, sondern haben einen weiten dynamischen

Antwortbereich, in dem alle Arten von Reizen (Berührungen, Druck, Hitze) durch

spezifische Entladungsfrequenzen codiert werden (BIELLA et al., 1992).

Bei der synaptischen Sensibilisierung werden repetitive Reize über C-Fasern in

zentrale Bereiche geleitet und die überdimensionale postsynaptische Antwort über

NMDA (N-methyl-D-aspatat)-Rezeptoren vermittelt. In diesem Stadium der

Schmerzentwicklung kommt es durch erhöhtes, intrazelluläres Kalzium (einem

2 Grundlagen 5

second messenger) zu einer veränderten Genexpression. Rezeptoren, Transmitter

und Kanalproteine werden verändert exprimiert. Werden solche Veränderungen

beobachtet, spricht man von einer zentralen Sensibilisierung (MANNION und

WOOLF, 1999; EIDE et al., 2000).

Die Entstehung und Verarbeitung eines Schmerzes ist ein komplexer und

zusammenhängender Ablauf. Das Schmerzsignal wird nach Einwirkung der Noxe

zunächst in der Peripherie, dann im zentralen Nervensystem kodiert.

Der Reiz wird von freien sensorischen Nervenendigungen aufgenommen und in

Form von Axonmembranpotentialen (nach Transduktion) weitergeleitet. Verschieden

dicke (proportional der Leitungsgeschwindigkeit), primäre, afferente Nervenfasern

(v.a. C-und A-Delta-Fasern) kodieren das Signal und übertragen es über die

Hinterwurzel zum Tractus spinosus und zum Thalamus. Diese Signale werden im

parietalen Cortex, im limbischen System, in bestimmten Hirnstammstrukturen und im

Cerebellum weiter verarbeitet.

Durch die Änderung der Membranpotentiale in den betroffenen Gebieten beginnt

eine Sekretion von kaskadenartig freigesetzten Neurotransmittern. Es sind

Neuropeptide wie Calcitonin-Gen-related-peptide (CGRP), Substanz P (SP) oder

exzitatorisch wirksame Aminosäuren, wie zum Beispiel Glutamat oder Aspartat,

welche über AMPA- (Amino-OH-Methyl-Isoxazol-Propionsäure) und NMDA- (N-

Methyl-D-Aspartat) Rezeptoren, beide aus der Klasse der Glutamat-Rezeptoren, die

weiteren Reaktionen in den betroffenen Geweben kodieren (Handwerker et al., 1998;

STEGMANN et al., 2001).

Die Glycinrezeptoren:

NMDA-Rezeptoren spielen in der Transmission von Schmerzimpulsen eine wichtige

Rolle (IKEDA et al., 2003), auch bei der zentralen Sensibilisierung und Entwicklung

von chronischen Schmerzen steht dieser Rezeptor im Mittelpunkt der

Schmerzverarbeitung (DUOBELL et al., 1999). In der Literatur wird er auch „non-

strychnine-sensitive glycine receptor“ genannt (BREITINGER und BECKER; 2002).

Der NMDA-Rezeptor besteht aus mehreren Untereinheiten. Zunächst die

Transmitterbindungsstelle, die kompetitiv Liganden bindet. Desweiteren eine

2 Grundlagen 6

strychnin-unsensible Glycinbindungsstelle, die in der Literatur „Glycine-B site“

genannt wird. Die Polyamin- (NR2) und die Phencylidinbindungsstelle des Rezeptors

liegen innerhalb des Kationenkanales und binden selektiv ihre kompatiblen Liganden

(PARSONS, 2001).

Die Transmitterseite und „Glycine-B site“ benötigt obligatorisch extrazelluläres Glycin

oder D-Serin als Co-Agonist, welches an der Glycin-Bindungsstelle (der NR1) des

Rezeptors andockt und so den Rezeptor voll aktiviert.

Ein weiterer wichtiger Rezeptor in der Schmerzweiterleitung ist der strychnin-

sensitive, inhibitorische Glycinrezeptor, der in Rückenmark und Hirnstamm lokalisiert

ist (BREITINGER und BECKER, 2002). Er gehört zur Gruppe der Liganden-

gesteuerten Ionenkanäle, die durch das Andocken von vier Liganden aktiviert

werden. Es folgt so eine Öffnung der spannungsgesteuerten Kanäle, Chloridionen

strömen in das Innere der Zelle und es kommt zur Hyperpolarisation, eine

inhibitorische Wirkung im Schmerzverhalten ist festzustellen. Diese Reaktion kann

durch Strychnin antagonisiert werden (WERMAN et al., 1967). Glycin wirkt als Ligand

an diesem Rezeptor und ist einer der wichtigsten inhibitorischen Neurotransmitter

(ARAGON und LOPEZ-CORCUERA, 2003).

Beide Rezeptortypen sind von der An- und Abwesenheit von Liganden und

Kofaktoren, sowie von stabilen intrazellulären Verhältnissen abhängig.

Lidocain:

Lidocain ist ein in der humanen neuropathischen Schmerztherapie schon lang

bewährtes und oft verwendetes Medikament (MAO und CHEN, 2000). Es reduziert in

niedriger, nicht nervenblockierender Konzentration Hyperalgesie nach

Gewebsverletzungen und Entzündungen, sowohl beim Tier (SOTGIU et al., 1992;

ABRAM und YAKSH, 1994) als auch beim Menschen (MARCHETTINI et al., 1992;

HOLTHUSEN et al., 2000).

Bei Lidocain wird eine zentrale wie periphere Wirkung vermutet. In der Peripherie

wirkt Lidocain an den Natriumkanälen, blockiert diese und verhindert so reversibel

die Weiterleitung der nervalen Aktionspotentiale (LÖSCHER et al., 1997;

SUGIMOTO et al., 2003).

2 Grundlagen 7

In vorangegangenen Tierversuchen wurde die zentralnervöse, antinozizeptive

Wirkung von niedrig dosiertem, systemisch appliziertem Lidocain bestätigt. Die

genaue Wirkung ist bis heute nicht geklärt (FAN et al., 1995; HARA et al., 1995,

SUGIMOTO et al., 2003). Ein möglicher Mechanismus könnte die Beeinflussung der

glutamatergen Neurotransmission über NMDA-Rezeptoren sein. So hemmt Lidocain

beispielsweise die NMDA- und Neurokinin-Rezeptor vermittelte postsynaptische

Depolarisation (NAGY und WOLF, 1996), sowie die durch Glutamat evozierte

Aktivität (BIELLA und SOTGIU; 1993) in den WDR-Neuronen.

BIELLA et al. haben in ihren Arbeiten an anästhesierten und paralysierten Ratten

durch Iontophorese Glutamat, NMDA (es greift an exzitatorischen NMDA-Rezeptoren

an) und Quisqualinsäure (QUIS, eine exzitatorische Substanz, die an NMDA- und

nicht-NMDA-Rezeptoren angreift) an das Rückenmark der Ratte appliziert und die

Wirkung der einzelenen Stoffe dokumentiert. Bei zusätzlicher Gabe von Lidocain

hemmte das Lokalanästhetikum die Glutamatausschüttung (dies wurde durch

Strychnin wieder antagonisiert) und es reduzierte die Exzitation von Quisqualin (auch

diese Reaktion konnte durch Strychnin antagonisiert werden).

Auch SUGIMOTO et al. (2003) hat durch Genmutationen an Oozyten von Fröschen

(Xenopus spp.) gezeigt, dass NMDA-Rezeptoren an der Translation von Nozizeption

beteiligt sind, und dass Lidocain über diese glycinergen Rezeptoren seine reversible,

analgetische Wirkung hat.

Weitere Studien lassen die Vermutung zu, dass Glycin eine Schlüsselrolle in der

Entwicklung von chronischen, neuropathischen Schmerzen spielt (AHMADI et al.,

2003; MUTH-SELBACH et al., 2004)

In der Phase des akuten wie chronischen Schmerzes kommt es zu dem

sogenannten „spillover“. Bei diesem Phänomen führt eine hohe präsynaptische

Aktivität zu einer erhöhten Freisetzung von Glycin aus inhibitorischen Neuronen

(AHMADI et al., 2003). Diese erhöhte Glycinmenge aktiviert nicht nur die NMDA-

Rezeptoren am synaptischen Spalt, sondern ebenfalls NMDA-Rezeptoren in

entfernteren Geweben. Der „spillover“ ist somit ein Mechanismus der

Signalverstärkung, der vermehrten Nozizeption und der spinalen Sensibilisierung.

Glycin ist so pronozizeptiv.

2 Grundlagen 8

Um eine überschießende, exzitatorische Reaktion der afferenten und efferenten

Axone zu vermeiden, gibt es Kontrollsubstanzen, welche die zentrale

Schmerzschwelle regulieren. Substanzen wie Serotonin, Noradrenalin, Gamma-

aminobuttersäure (GABA) und Glycin wirken inhibitorisch auf die exzitatorische

Neurotransmitterfreisetzung, prä- wie postsynaptisch. GABAerge Interneurone üben

eine tonische Inhibition im Hinterhorn aus. So existiert physiologisch ein negatives

Feedback, welches die zentrale Schmerzschwelle reguliert.

Dementsprechend wirken Glycin oder GABA antihyperalgetisch,

(ZIEGLGÄNSBERGER und HERZ, 1971) und GABA- oder Glycin-Antagonisten

sensibilisierend (YAKSH, 1989; SIVILOTTI und WOOLF, 1994). Ein möglicher

Ansatz der Schmerztherapie, sowie ebenfalls der Therapie von Schizophrenie und

Epilepsie wäre die selektive Blockierung der Glycin-Bindungsstelle oder die

Reduzierung der Glycinmenge im synaptischen Spalt (ARAGON und LOPEZ-

CORCUERA, 2003). So könnte auch der „spillover“ (AHMADI et al., 2003)

unterbrochen werden.

Die vorliegende Arbeit soll in vivo weitere Einblicke in die Funktionsweise der

glycinergen Transmission am NMDA-Rezeptor erbringen.

Es soll untersucht werden, ob die Wirkung eines niedrig dosierten, systemisch

gegebenen Lidocains wenigstens zu bestimmten Teilen über glycinerge

Mechanismen vermittelt wird.

2.2 Tiermodell für den neuropathischen Schmerz

Um die Entstehung dieses Schmerzsyndromes besser nachvollziehen zu können,

wurde in Tierexperimenten versucht, die zugrunde liegenden Mechanismen auf Tiere

zu übertragen. Dabei haben sich drei Methoden zur Erzeugung von Nervenläsionen

durchgesetzt, um bei Ratten neuropathisches Schmerzverhalten auszulösen.

Bei den im Folgenden erläuterten Schmerzmodellen (STEGMANN et al., 2001)

werden die physiologisch unterschiedlichen Leitungsgeschwindigkeiten der

2 Grundlagen 9

Nervenfasern berücksichtigt, die durch die unterschiedlichen Durchmesser bedingt

sind.

Die in dieser Arbeit im Vordergrund stehende Transmission von thermischen und

schmerzhaften Reizen wird vor allem über langsam leitende marklose C-Fasern

(Leitungsgeschwindigkeit 0,5-2 m/s) und über schwach myelinisierte A-Delta-

Afferenzen (Leitungsgeschwindigkeit 10-30 m/s) geleitet.

Schnelleitende A-Beta-Afferenzen haben eine Leitungsgeschwindigkeit von 25-70

m/s und kodieren über niederschwellige Mechanorezeptoren vor allem

Berührungsreize. Die schnell leitenden Fasern spielen eine wichtige Rolle bei der

synaptischen Reorganisation im zentralen Nervensystem infolge Degeneration

primär afferenter C-Nozizeptoren.

Zunächst sei die SNL (Spinal Nerve Ligation, KIM und CHUNG, 1992) genannt, ein

Verfahren, bei dem die spinalen Nervenwurzeln vom fünften und sechsten

Lendenwirbel durchschnitten werden und der proximale Stumpf der Wurzel ligiert

wird. Als Folge degenerieren alle beteiligten Fasertypen, Allodynie und Hyperalgesie

entwickeln sich in wenigen Stunden.

Das PNL (Partial Nerve Ligation, SELTZER und DUBNER, 1990) ist ein weiteres

Schmerzmodell, bei dem der Nervus ischiadicus durchstochen und ligiert wird. Mit

der Ligatur wird der Durchmesser des Nervs auf die Hälfte reduziert. Auch hier

entwickeln sich Allodynie und Hyperalgesie in wenigen Stunden.

Das CCI-Modell (Chronic Constriction Injury, BENNETT und XIE, 1988) ist im Falle

dieser Arbeit die Methode der Wahl, um an einem Tiermodell die Auswirkungen von

Medikamenten bei neuropathischen Schmerzen näher zu beleuchten.

Bei dieser Methode bleiben die für die Arbeit interessanten langsamen C-

Nervenfasern intakt, sie sind für die Beurteilung der Nozizeption nach Medikation der

einzelnen Tiere essentiell. Durch vier lockere Ligaturen um den Nervus ischiadicus

kommt es durch eine langsame Ödem-bedingte Einschnürung zur völligen

2 Grundlagen 10

Degeneration der A-Beta- und A-Delta-Fasern. Es folgen morphologische

Veränderungen in dem betroffenen Gebiet, der endoneurale Druck steigt an.

Der Durchmesser des Nervs wird durch die einzelnen Knoten zwar nur minimal

verkleinert, doch durch diese Verkleinerung des Durchmessers kann es zu

ektopischer Impulsweiterleitung kommen, die vom veränderten Nervengewebe selber

ausgeht. Die Spontanaktivität nimmt zu.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der CCI-Operation.

Diese beschriebenen Vorgänge bleiben nicht lokal auf den verletzten Nerv

beschränkt, es kommt zu einer Ausbreitung über die Afferenzen zum dorsalen

Wurzelganglion, sowie zum ipsilateralen Dorsalhorn der ligierten Seite, wenn weitere

nozizeptive Stimuli folgen („wind up“; ABRAM et al., 1994; SUGIMOTO et al., 2003).

Die genaue Art und Weise der Ausbreitung ist noch nicht geklärt.

Bei Patienten, die unter chronisch neuropathischen Schmerzen leiden, kann man

folgende Schmerzzustände beobachten:

Berührt man zum Beispiel Patienten an betroffenen Gliedmassen, kann diese sonst

nicht schmerzhafte Berührung als sehr schmerzhaft empfunden werden. Diesen

Zustand nennt man Allodynie. Sie entsteht in Folge einer Chronifizierung, es kommt

nach dem Untergang nozizeptiver Neurone zur Umorganisation synaptischer

Strukturen im Hinterhorn. Noch intakte Afferenzen bilden so ein neues Netzwerk mit

L5

L4

L6

N. ischiadicus

Ligaturen

• vier lockere Ligaturen um N. ischiadicus

• Ausbildung eines Ödems

• Degeneration von v.a. myelinisierten Fasern

• stabile thermale Hyperalgesie für 21 Tage

2 Grundlagen 11

zentralen nozizeptiven Neuronen, bei dem es zu Fehlverschaltungen kommt

(STEGMANN et al., 2001). Patienten können ebenso eine gesteigerte

Empfindlichkeit auf primär schmerzhafte Stimuli auf einem oder mehreren

Hautgebieten zeigen, dies nennt man Hyperalgesie. Man kann zwischen primärer

und sekundärer Hyperalgesie unterscheiden. Bei der primären Hyperalgesie ist das

Schmerzempfinden am Reiz- oder Verletzungsort lokalisiert, es beruht auf periphere

Mechanismen (WEIS et al., 1995). Die Reizschwelle ist für die Nozizeption reduziert.

Bei der sekundären Hyperalgesie wird die gesteigerte Schmerzempfindlichkeit

gegenüber mechanischen Reizen in der Umgebung des Reiz- oder Verletzungsortes

empfunden (TREEDE, 1999).

Bleibt die zentrale Sensibilisierung länger bestehen, d. h. wird der Schmerz beim

Patienten chronisch, werden die vermittelnden C-Fasern verlängert aktiviert. Es

kommt zu einer Sensibilisierung der zentralen Synapsen. Es resultiert eine Zunahme

der Spontanaktivität, Neurone geben eine veränderte Reizantwort und es

vergrössern sich die rezeptiven Felder der versorgenden Neurone. Die vom

Patienten empfundene Schwelle gegenüber schmerzhaften Stimuli wird herabgesetzt

und es entwickelt sich eine Hyperalgesie.

Allodynie und Hyperalgesie in Form einer Schwellenerniedrigung der thermischen

Reizschwelle konnten auch bei den Versuchstieren beobachtet werden, nachdem bei

ihnen eines der Schmerzmodelle etabliert worden war (PARSONS et al., 1998;

SUGUMOTO et al., 2000; WHITEHEAD et al., 2004).

Dieses Verhalten ist Grundlage der standarisierten Schmerzmessung der

vorliegenden Arbeit.

3 Methoden und Materialien 12

3 Methoden und Materialien

3.1 Installation des intrathekalen Katheters

Männliche Wistarraten (Tac:WIST; Wistar Hannover, GALAS) mit einem

Lebendgewicht von 360-380 g wurden mit 60 mg/kg Pentobarbital (Narcoren®)

intraperitoneal narkotisiert. Diese Tiere entsprachen dem SPF-Status (spezifisch

pathogen frei) und wurden gemäß FELASA auf endo- und ektoparasitären Befall

untersucht, waren Virusantikörpertiterfrei und waren frei von bestimmten Bakterien.

In dieser Arbeit wurde Pentobarbital verwendet, da diese Substanz keinen

messbaren Einfluss auf die Entwicklung der Neuropathie hat (MUTH-SELBACH et

al., 2004).

Ketamin, welches wie Pentobarbital zu der Gruppe der Barbiturat gehört, ist ein

NMDA-Rezeptor-Antagonist. Es hat aber, wie Opioide zum Beispiel, durch seine

Wirkungsweise Einfluss auf die Entwicklung der induzierten Neuropathie und

verändert so die zu messende Schmerzschwelle. Nach Ketaminanwendungen wird

häufig Katalepsie dokumentiert, da dieses Injektionsnarkotikum das limbische

System zum Beispiel erregt (LÖSCHER et al., 1997).

Die nachfolgende Operation wurde unter Einhaltung steriler Kautelen durchgeführt.

Während der Operation wurde die Körpertemperatur der Tiere durch eine

Wärmematte konstant auf 38,5°C Körperinnentemperatur gehalten, um eine

Hypothermie zu vermeiden.

In Seitenlage wurde mit Hilfe des Flexorreflexes an den Hinterextremitäten die

ausreichende Narkosetiefe getestet.

Zur Fixierung des Tieres in Bauchlage diente ein Stereotakt.

Zunächst wurde der Nackenbereich der Tiere geschoren, rasiert und desinfiziert.

Nach Präparation des Operationsfeldes am Nacken durch einen Hautschnitt und

Durchstechen der Membrana atlantooccipitalis war der Duralraum frei einsehbar.

Nun wurde ein 13 cm langer Polyäthylen-Schlauch mit einem Innendurchmesser von

0,28 mm und einem Außendurchmesser von 0,61mm (SX 01, Firma Hartenstein) von


cranial nach caudal langsam bis zur rostralen Lumbalsschwellung im Duralraum

vorgeschoben. Vor der Operation wurde am Katheter eine farbliche Markierung auf

der Höhe von acht Zentimeter gemacht. Der Katheter wurde soweit vorgeschoben,

bis die farbliche Markierung auf Höhe der Membrana atlantaoccipitalis zum Liegen

kam.

Abbildung 2: Schematische Darstellung der Lage des intratheklen Katheters.

An dieser Stelle der Operation erfolgte keine Lagekontrolle des Katheters durch zum

Beispiel Röntgenaufnahmen, da dies einen zu hohen technischen Aufwand

dargestellt hätte. Desweiteren war es dem Operateur nach kurzer Einarbeitungszeit

möglich, die it-Katheterisierung sicher und reproduzierbar durchzuführen.

Die weiter unten im Text dargestellte Sektion der verwendeten Tiere diente der

Kontrolle, so konnte die Unversehrtheit des Rückenmarkes kontrolliert werden.

Um ein Herausziehen des Katheters durch das Tier selber zu verhindern, wurde

dieser mit einem Dentalkleber am Schädel des Tieres befestigt.

Es folgte eine Muskelnaht durch Einzelhefte und fortlaufende Hautnaht mit 3-0

Vicryl®-Faden. Eine thermische Versiegelung mit Hilfe eines Feuerzeuges und eines

Nadelhalters verschloss das herausragende Ende des Katheters. Um in den

folgenden Versuchen die Medikamente durch den Kathetet zu applizieren, wurde das

versiegelte Ende mit einem Scherenschlag geöffnet und nach der Applikation erneut

thermisch versiegelt. So wurde das Eindringen von Einstreu und Dreck in den

Katheter, und somit in das Rückenmark verhindert.

An diese Operation schloß sich die Nervenläsion nach dem Bennett- Modell (CCI)

an.


3.2 Induktion einer Neuropathie nach dem Bennett- Modell

Diese Operationstechnik wird in der Literatur mit CCI (chronic constriction injury)

abgekürzt, und wurde 1988 von BENNETT und XIE als chronisches Schmerzmodell

etabliert.

Das Tier wurde in Seitenlage gebracht. Als anatomischer Anhaltspunkt diente das

Tuber ischiadicum. Durch einen distal davon gelegten craniocaudalen Hautschnitt

von zwei Zentimeter Länge wurde die darunter liegende Muskulatur freigelegt. Es

folgte eine stumpfe Präparation der Muskelfazien des Musculus biceps femoris, bis

der darunter liegende Nervus ischiadicus auf Höhe der Trifurkation sichtbar war.

Nach dieser Mobilisation des Nerven wurden mit Hilfe einer gebogenen Pinzette vier

ca. zwei cm lange Stücke eines 3-0 Catgut®- Fadens um den Nervus ischiadicus

geschlungen und dieser von proximal nach distal in einem Abstand je ein bis zwei

mm vier mal ligiert. Während des Ligierens zeigte ein kurzes Zucken der Pfote an,

dass der gewünschte Grad der Nervenkonstriktion erreicht war. Die Muskulatur

wurde mit einem Einzelheft adaptiert, die Haut durch eine fortlaufende Naht mit

einem 3-0 Vicryl® verschlossen.

Nach der Operation erholten sich die Tiere in Einzelkäfigen (Makrolonkäfige des Typ

III R). Als Einstreu wurde Holzgranulat verwendet. Futter und Wasser stand allen

Tieren ad libitum zur Verfügung.

Alle Tiere wurden bei konstanter Raumtemperatur von 22 °C +/- 2 °C, einer relativen

Luftfeuchtigkeit von 55 % +/- 5 % und unter künstlicher Beleuchtung mit 320 lux von

6- 18 h in einem separaten Raum gehalten.

Lockere Ligaturen rufen ein intraneurales Ödem hervor, das zu einer

Selbststrangulierung des Nerven führt. BENNETT und XIE, (1988) prägten hierfür

den feststehenden Begriff des „Chronic constriction injury“- Modells.

Tiere mit einer solchen peripheren Nervenschädigung entwickeln neben einer

mechanischen Allodynie auch eine thermische und mechanische Hyperalgesie.


An dem ligierten Bein zeigten die Tiere eine leichte Flexion der Gliedmasse, auch die

einzelnen Zehen wurden leicht gekrümmt gehalten. Ein häufiges Belecken der

betroffenen Pfote wurde ebenfalls beobachtet.

3.3 Installation des zentralen Venenzuganges

Zehn Tage nach den unter 3.2 beschriebenen Operationen erfolgte ein erneuter

Eingriff bei den gleichen Tieren, wieder unter Narkose mit Pentobarbital (Narcoren®,

60 mg/ kg) intraperitoneal.

Der Hautschnitt war ca. zwei cm lang und reichte von der Mitte des Halses bis zum

Anfang des Sternums. Mit einer Metzenbaum-Schere wurde die Glandula parotis

stumpf von dem darunter liegenden Gewebe frei präpariert und mit Hilfe eines

Wundspreitzers nach cranial verlagert.

Durch die stumpfe Trennung ließ sich die Vena jugularis gut darstellen. Das Gefäss

wurde auf einer Länge von ca. acht mm mit Hilfe von mikrochirurgischen

Instrumenten vorsichtig mobilisiert. Nach Mobilisation der Vene wurden zwei ca.

zwölf Zentimeter lange Fäden (3-0 Vicryl®) unter der Vene entlang geführt; einer so

weit wie möglich cranial, der andere so weit wie möglich caudal des mobilisierten

Stückes der Vena jugularis.

Der Venenkatheter mit einem Innendurchmesser von 1,5 mm bestand aus

Polyethylen (Firma Hartstein, Deutschland), war ca. acht cm lang und hatte auf einer

Höhe von drei cm eine Markierung mit Dentalkleber. Er wurde vom

Versuchsdurchführenden selber hergestellt.

Nach dem Einführen des selbst gebauten Katheters in die Vene fixierte der caudale

Faden den künstlichen Zugang durch einen chirugischen Knoten an dem restlichen

Gefäss, um so ein Herausrutschen des Katheters zu verhindern.

Das freie Ende des Zuganges wurde mit Hilfe einer Venenverweilkanüle (Vasocan

Braunüle, Firma Braun, Deutschland) subcutan zur Nackenmitte geführt, dort die

Haut des Tieres durchstochen und der Katheter durch die Braunüle nach aussen

geschoben. Es folgte ein reversibler Verschluss des Ein- bzw. Ausganges.


Die Glandula parotis wurde mit einem Einzelheft in die ursprüngliche Lage verbracht,

die Haut wurde mit demselben Faden (3-0 Vicryl®) verschlossen.

3.4 Verhaltensbeobachtung und thermale Testung

Die Verhaltensversuche wurden tiergerecht durchgeführt. Die Versuche waren von

der Regierung des Landes NRW mit der Tierversuchsnummer AZ 23.05-230-3-

20100 genehmigt.

Die Verhaltenstests wurden in dem Raum durchgeführt, in dem die Ratten gehalten

wurden und der ihnen vertraut war. Die Ratten wurden zufällig den verschiedenen

Versuchsansätzen mit je sechs Tieren zugeteilt.

Alle getesteten Substanzen wurden zwischen dem 6. und 10. postoperativen Tag

appliziert, da innerhalb dieses Zeitfensters die Reaktionen der Tiere auf die

experimentell provozierte Neuropathie am stärksten ausgeprägt sein sollten

(BENNETT und XIE, 1988; ATTAL et al.; 1990; JASIM et al., 1998).

Abbildung 3: Allgemeiner Zeitablauf von Versuchsbeginn bis Versuchsende

bzw. Euthanasie der Tiere (Tag 0 bis Tag 10 post op).

Tag 0 Tag 1 Tag 6 Tag 10 Tag 7 Tag 8

Thermale Nullwert-bestimmung vor CCI

CCI Operation und intrathekaler Katheter

Thermale Nullwert-bestimmung nach CCI

Intravenöser Katheter

Versuch und anschl. Euthanasie


Die thermale Stimulation wurde bei den Versuchen mit Hilfe einer „Hotplate“

(Plantartest, Firma Ugo Basile; Italien) durchgeführt. Dies ist eine etablierte Methode

zur Dokumentation von veränderter thermaler Wahrnehmung von Versuchstieren in

Folge von chronischen Schmerzmodellen (SIMPSON et al., 1996).

Nach Abschluss der Verhaltensversuche schloss sich die Euthanasie der Tiere durch

eine intravenös verabreichte Überdosis von Pentobarbital an.

Durch eine Injektion von Methylenblau in den noch im Tier liegenden Katheter und

eine anschliesende Laminektomie kontrollierte man die ordnungsgemäße Lage

desselben. Desweiteren wurden in der Sektion die morphologischen Veränderungen

am Nervus ischiadicus begutachtet. Dort wurde das sogenannte

„Perlschnurphänomen“ dokumentiert, welches durch das intraneurale Ödem und die

Strangulierung des Nervs durch die gesetzten Ligaturen hervorgerufen wurde.

Es wurden nur die Daten der Tiere verwendet, die nach der CCI-Operation eine

Schwellenverschiebung in der thermalen Empfindlichkeit zeigten, die keinerlei

Einschränkungen im Allgemeinbefinden zeigten, und die ein „Perlschnurphänomen“

ausbildeten.


Für die thermale Testung wurden die verwendeten Tiere in randomisierten und

verblindeten Gruppen wie folgt aufgeteilt:

Tabelle 1: Einteilung der Versuchsgruppen für die thermische Testung

Gruppe Intravenöse Applikation

(iv)

Intrathekale Applikation

(it)

A NaCl-Lösung NaCl-Lösung

B Lidocain 1% NaCl-Lösung

C NaCl-Lösung D-Serin

D Lidocain 1% D-Serin

E NaCl-Lösung Strychnin

F Lidocain 1% Strychnin

G NaCl-Lösung CGP 78608

H Lidocain 1% CGP 78608

I Lidocain 2% NaCl-Lösung

J Lidocain 2% D-Serin

Gruppengröße n=6.

Tabelle 2: Übersicht der Dosierungen der applizierten Substanzen

Verwendete Substanz Dosierung und Menge Applikationsart

NaCl-Lösung 0,35 ml, 0,9%, isoton intravenös

Lidocain 1% Bolus: 0,35 ml, 10mg/kg

Infusion: 180 µg/kg/min

intravenös

Lidocain 2% Infusion: 180 µg/kg/min intravenös

D-Serin 100 µg/10 µl NaCl intrathekal

Strychnin 3 µg/10 µl NaCl intrathekal

CGP 78608 100 pmol/ 10µl NaCl intrathekal


Bei der im Rahmen dieser Dissertationsschrift verwendeten Versuchsapparatur

handelte es sich um einen Plantartest® der Firma Ugo Basile, Italien (siehe

Abbildung 18, Kapitel 8).

Unter dem Aufbau der Apparatur befand sich eine Lichtquelle, die halogeniertes Licht

durch ein Linsensystem zum Boden des darüber liegenden Aufbaues schickte. Das

Licht produzierte eine ansteigende Temperatur von 15 ° bis auf 30° Celsius, je nach

Dauer der einzelnen Testung. Je länger das Tier seine Pfote auf dem Kontakt der

Wärmelampe sitzen liess, desto wärmer wurde die applizierte Temperatur an der

fokussierten Hintergliedmaße. Hob das Tier die Pfote an, wurde der Kontakt der

Lampe unterbrochen, die gemessene Zeit bleibt auf der digitalen Anzeige der

Messapparatur stehen.

Die sich anschliessende intravenöse Dauerinfusion von Lidocain während der

Versuche wurde über eine Pumpe der Firma CMA (Microdialyse Pump Type 8713®)

gewährleistet, es wurde eine Infusionsrate von sechs µl pro Minute gewählt.

Die verwendeten Tiere bewegten sich während der gesamten Zeit frei in dem Käfig,

der Boden war eben und die Tiere hatten alle vier Gliedmaßen gleichmässig auf dem

Plexiglasboden aufliegen (siehe Abbildung 19, Kapitel 8).

Das Tier zeigte durch Wegziehen der jeweiligen Pfote, wann die individuelle

Schmerzgrenze erreicht war. Das Wegziehen der Hintergliedmaße unterbrach den

Kontakt der Licht- und Wärmequelle, die Zeit wurde angehalten. Das Gerät schaltete

darüber hinaus nach einer Hitzeapplikation von 20 Sekunden ab, um einen

Gewebeschaden zu vermeiden.

Die Latenzzeiten, mit denen die rechte und linke Hinterpfote der Hitzeeinwirkung

entzogen wurden, wurden jeweils drei Mal innerhalb von zehn Minuten unabhängig

voneinander gemessen und anschliessend die Werte für die jeweilige Pfote gemittelt.

Nur Ratten, die eine Erniedrigung der thermischen Reizschwelle nach der CCI-

Intervention zeigten, wurden in die Messung einbezogen. Die Erniedrigung der

thermischen Reizschwelle wurde durch den Vergleich der Latenzzeit vor und nach

der CCI-Operation festgestellt. Waren die Zeitwerte nach der Operation im Vergleich

zu den Werten vor der Operation bei den einzelnen Tieren erniedrigt, so hatte sich

eine chronische Neuropathie bei diesen ausgebildet.


Zur Testung: vor der ersten Operation saß jeweils ein Tier in einer Abteilung des

Plexiglas-Aufbaues und jedes Tier hatte eine Gewöhnungsphase von ca. 30 Minuten.

Die Wärmequelle wurde unter der zu testenden Gliedmaße positioniert, mit dem

Mittelpunkt auf dem hinteren Teil der Pfote; die Messung begann.

Bei den Versuchen mit 1% Lidocain wurde zuerst der „prä Op-Wert“ bestimmt, es

folgte die CCI-Operation. Nach entsprechender Rekonvaleszenzphase wurde am

Tag der Testung der „prä-Bolus-Wert“ ermittelt. Nun folgte die intrathekale

Applikation der jeweiligen Substanz. Die gelösten Substanzen, mit einem

Gesamtvolumen von zehn µl, applizierte man mit einer Mikroliterspritze mit stumpfer

Spitze in den intrathekalen Katheter, und so an die Lumbalschwellung im

Rückenmarkskanal.

Nach zwei Minuten wurde der Lidocainbolus über eine Zeitdauer von drei Minuten

per Hand intravenös vom Untersuchenden appliziert. Nach insgesamt zehn Minuten

wurde der „post-Bolus-Wert“ gemessen.

Im weiteren Versuchsablauf wurden nach 10, 20, 30, 40 und 50 Minuten jeweils ein

Mittelwert ermittelt.

Abbildung 4: Versuchsablauf mit Lidocain 1% 8-10 Tage nach der CCI-

Operation

Min. 0 Min. 5 Min. 7 Min. 50 Min. 20 Min. 30

Prä-Boluswert


Lidocain-Bolus

Erfassung der Messwerte im 10 min. Abstand

Min. 40 Min. 10

Post-Boluswert


Bei den Versuchen mit 2% Lidocain wurde die Messung variiert, da bei diesem

Versuchsansatz die verlängerte analgetische Wirkung des Lidocains im Zentrum der

Fragestellung stand.

Wie oben erklärt, wurde ein „prä OP“-, ein „prä Bolus“- und ein „post Bolus“ Wert für

die jeweiligen Tiere ermittelt, dann folgte die intrathekale Applikation von D-Serin und

nach zehn Minuten begann die Messung der Schmerzschwellen.

Abbildung 5: Versuchsablauf mit Lidocain 2% 8-10 Tage nach der CCI-

Operation.

Nach den Messungen verblieben die Tiere in ihren Einzelkäfigen (siehe Abbildung

20, Kapitel 8).

3.5 Lageüberprüfung des intrathekalen Katheters post mortem

Um die korrekte Lage des intrathekalen Katheters zu überprüfen, folgte die Sektion

der Tiere, welche die Testreihe durchlaufen hatten.

Die Ratten wurden entweder durch eine intraperitoneale oder intravenöse Injektion

mit Pentobarbital schmerzfrei euthanasiert (Eutha 77®, Firma Essex).

Der intrathekale Katheter wurde mit ca. 30 µl einer Metylen- Blau Lösung gespült.

Min. 0 Min. 5 Min. 8 Min. 50 Min. 20 Min. 30

Prä-Boluswert

Lidocain-Bolus 2%

Post-Bolus Erfassung der Messwerte im 10 min. Abstand

Min. 40 Min. 11



Ein ca. acht cm langer Hautschnitt auf dem Rücken des Tier legte die darunter

liegende Wirbelsäule frei.

Mit einem Scherenschlag wurde auf Höhe des dritten und vierten Lendenwirbels die

Wirbelsäule durchtrennt. Im cranialen Verlauf der Wirbelsäule führte man eine

Laminektomie durch, so dass das darunter liegende Rückenmark sichtbar wurde.

Anhand der ausgetretenen blauen Flüssigkeit konnte beurteilt werden, ob der

Katheter optimal lag und so im Versuch applizierte Substanzen ihren Zielort an der

Lumbalschwellung wirklich erreicht hatten.

3.6 Auswertung und statistische Methoden

Die Gruppendaten wurden als Mittelwert ± Standardfehler (sem) dargestellt.

Latenzen beim Wegziehen der Pfoten als Reaktion auf einen Hitzereiz wurden einer

Varianzanalyse unterzogen. Diese Varianzanalyse wurde mit SAS (SAS= Statistical

Analysis Software) erstellt. Es handelte sich um einen RM (= repeated measurement)

ANOVA (Analysis of Variance) Test, gefolgt von Bonferroni post hoc Test.

P ≤ 0,05 wurde als signifikant angenommen.

Es wurden neun Vergleiche zu sechs Zeitpunkten von der Kontrollgruppe gemacht.

Weiter wurden vier Vergleiche zu sechs Zeitpunkten gemacht, um die nur mit

Lidocain infundierten Tiere mit den Tieren zu vergleichen, die Lidocain plus D-Serin,

Strychnin oder CGP 78608 bekommen hatten.

In den Versuchen mit 2% Lidocain (360µg/kg/min) unter der späteren D-Seringabe

wurden drei Vergleiche zu sechs Zeitpunkten gemacht.


3.7 Verwendete Substanzen und deren Abkürzungen

3.7.1 Lidocain

Lidocain ist ein in der Praxis sehr häufig verwendetes Lokalanästhetikum vom

Amidtyp.

Es senkt reversibel die Permeabilität der spannungsgesteuerten Natriumkanäle an

Nervenfasern. Dadurch wird eine Weiterleitung der Aktionspotentiale verhindert und

die Reizfortleitung unterbrochen.

Die systemische Wirkung ist dosisabhängig. Je nach Konzentration kann es zentral

sedativ und antikonvulsiv wirken. Bei höheren Konzentrationen folgen motorische

Stimulation, Erbrechen, Tremor, klonische Krämpfe bis zur zentralen Atemlähmung.

Die lokalanästhetische Wirkung steigt proportional mit der Toxizität (W.LÖSCHER,

S.R. UNGEMACH, R. KROKER, 1997).

Eine niedrig dosierte systemische Lidocaingabe, die noch nicht die Natriumkanäle

blockiert, kann dosisabhängig zu einer Analgesie bei neuropathischen Schmerzen

führen (BIELLA et al., 1993). Der genaue Mechanismus ist zur Zeit noch nicht

geklärt, aber es scheint, dass unter anderem spontane Impulse der verletzten

Nerven blockiert werden.

Da diese Analgesie auch bei polysynaptischen Reflexbögen reproduzierbar ist, ist

anzunehmen, dass Lidocain eine zentralnervöse inhibitorische Wirkung am

Rückenmark selber hat. Dieser Vorgang kann vor allem schon bei niedrigen

Plasmakonzentrationen nachgewiesen werden, was den Vorteil hat, dass die sonst

dokumentierten Nebenwirkungen des systemisch gegebenen Lidocains (Schwindel,

Husten, Tinnitus, Tremor) vernachlässigt werden können (ABRAM et al., 1994).

Da die genaue Wirkung des Lidocains noch nicht genau geklärt ist, werden in der

Literatur zwei Ansätze dazu diskutiert.

Es wird davon ausgegangen, dass Lidocain durch Bindung an den NMDA-Rezeptor

die postsynaptische Depolarisation (NAGY und WOOLF, 1995) und damit die weitere

Neurotransmission am Rezeptor hemmt und antihyperalgetisch wirkt.


Die Wirkung von Lidocain an postsynaptischen, inhibitorischen Neuronen wird über

Strychnin-sensitive Glycinrezeptoren kodiert, die eigentlich von Glycin als

inhibitorischer Transmitter aktiviert werden. Es wird aber vermutet, dass Lidocain

oder seine Metaboliten dies ebenfalls können und so antihyperalgetisch wirken

(NAGY und WOOLF, 1995).

In den Versuchen wurde ein- und zwei- prozentiges Lidocain der Firma Braun,

Deutschland verwendet. Bei dem 1% Lidocain wurde eine Dosierung von 10 mg/kg in

drei Minuten als Bolus appliziert, es folgte eine Dauerinfusion von 180µg/kg/min in

einer Stunde. Beim 2% Lidocain waren es nach Bolusgabe 360µg/kg/min in der

Stunde.

3.7.2 D-Serin

D-Serin ist ein endogener Neurotransmitter, der unter anderem von Astrozyten

synthetisiert wird. Es ist obligatorischer Co-Agonist an exzitatorischen NMDA-

Rezeptoren. Als Agonist fungiert das Glutamat.

In Astrozyten wird L-Serin gespeichert, ein Isomer des späteren D-Serin. Durch das

zelleigene Enzym Serin-Racemase entsteht durch Katalyse D-Serin.

Nach einem Schmerzimpuls wird am präsynaptischen Spalt durch die eingehenden

Impulse Glutamat in den synaptischen Spalt frei gegeben. Glutamat ist ein Salz der

körpereigenen Glutaminsäure, das an der Übertragung von Schmerzimpulsen

massgeblich beteiligt ist. Es muss an den Rezeptoren ebenfalls vorhanden sein,

sonst ist es Glycin nicht möglich, am NMDA-Rezeptor zu binden.

Durch den Glutamatanstieg wird das fertige D-Serin aus den Astrozyten

ausgeschleusst und es diffundiert zum NMDA-Rezeptor.

D-Serin ist potenter als Glycin, welches als Co-Agonist am NMDA-Rezeptor die

Signalübertragung vermittelt. Beide Substanzen, Glycin und D-Serin, binden mit

gleich hoher Affinität am zu aktivierenden Rezeptor (MOTHET et al., 2000). Beide

binden am Glycin B Teil des NMDA-Rezeptors (NONG et al., 2003) und haben so

eine exzitatorische Wirkungsweise.

Die Chemikalie wurde von der Firma Sigma (Deisenhofen, Deutschland) bezogen.

Es wurden 100µg D-Serin gelöst in zehn µl NaCl intrathekal appliziert.


3.7.3 Strychnin

Strychnin ist ein pflanzliches Gift der Strychnos nux-vomica. Es ist eine toxische

Substanz, die am postsynaptischen, inhibitorischen Strychnin-sensitiven

Glycinrezeptor angreift und so eine zunächst inhibitorische, dann exzitatorische

Wirkungsweise hat.

Dosisabhängig antagonisiert es die inhibitorische Wirkung von Lidocain und es

fördert die Ausschüttung von Glutamat am präsynaptischen Spalt, was eine

exzitatorische Reaktion nach sich zieht (BIELLA et al., 1993).

Bei Anwesenheit von Strychnin in Rezeptornähe antagonisiert es die glycinerge

Aktivität, stört die Koordination der Rezeptoraktivierung, beeinträchtigt die Formation

der Synapsen und deren Erhaltung (BREITINDER und BECKER, 2002).

In früheren Anwendungen wurde Strychnin als Rückenmarkskonvulsivum

bezeichnet, Dosisabhängig kommt es zur Blockierung hemmender Neuronen, was

sich klinisch in Form von erhöhter Reflexbereitschaft bis zu Streckkrämpfen zeigt. Es

droht Erstickungsgefahr.

Strychnin wurde von der Firma Sigma (Deisenhofen, Deutschland) bezogen.

Es wurden 3µg Strychnin in 10 µl NaCl gelöst und intrathekal appliziert.

3.7.4 CGP 78608

CGP 78608 ([(1S)-1-[[7-Bromo-1,2,3,4-Tetrahydo-2,3-Dioxo-5Quinoxalinyl) Methyl]

Ethyl] Phosphonat) ist ein potenter und selektiver NMDA-Antagonist, welcher mit

einer hohen Affinität an der Glycin-B site des Rezeptors angreift. Bei systemischer

Gabe in vivo wirkt er antikonvulsiv, in dem er die stimulierenden Effekte am NMDA-

Rezeptor im ZNS verhindert (HILGIER et al., 2004).

Diese Substanz wurde von Novartis Pharma AG, Deutschland, bezogen.

Eine 100pmol Lösung wurde verwendet.


3.7.5 Natrium-Chlorid Lösung

Physiologische Kochsalzlösung wurde in dieser Versuchsreihe in den

Kontrollgruppen verwendet. Es wurde intravenös und intrathekal appliziert.

Diese Lösung wurde bei der Firma Braun, Deutschland, bezogen.

Alle oben aufgeführten Chemikalien wurden in 0,9% NaCl–Lösung gelöst und bei 20

C° Raumtemperatur aufbewahrt. Am Tag der Testung wurden die einzelnen

Substanzen frisch gelöst und sofort verabreicht.

4 Ergebnisse 27

4 Ergebnisse

Eines der Tiere zeigte am folgenden Tag nach der Operation eine stärkere Flexion

der linken Hinterpfote als die anderen untersuchten Tiere. Am fünften Tage nach der

Operation war bei diesem Tier eine ausgeprägte Form der Automutilation

festzustellen: alle Zehen der linken Pfote waren bis auf den Mittelknochen

abgefressen. Dieses Tier wurde umgehend euthanasiert.

Bei Versuchsbeginn bekam das zu testende Tier einen 0,35 ml Bolus von entweder

ein- oder zwei- prozentigem Lidocain über eine Zeit von drei Minuten, das entsprach

einer Wirkstoffmenge von 10mg pro Kilogramm Körpermasse. Bei der Infusion über

eine Stunde Versuchsablauf wurde eine Lidocainmenge von 6µl per Dauerperfusor

intravenös appliziert. Diese Menge entsprach 180 µg Wirkstoff bei 1% Lidocain oder

360 µg bei 2% Lidocain pro Kilogramm Körpermasse und Stunde.

In den Versuchen mit 1% Lidocain zeigte sich das Wirkmaximum von Lidocain

unmittelbar nach Applikation des Bolus, um innerhalb von zehn bis zwanzig Minuten

wieder auf das Ausgangsniveau abzusinken. Da in dieser Arbeit in vivo die Effekte

verschiedener Agonisten und Antagonisten an der Glycin-sensitiven Seite des

NMDA-Rezeptors auf die Analgesie durch intravenös appliziertes Lidocain untersucht

werden sollte, beschränkt sich die statistische Analyse auf den Zeitpunkt dieses

Wirkmaximums, der weitere Zeitverlauf wird nur deskriptiv erwähnt.

Die verschiedenen Untersuchungsgruppen wurden mittels ANOVA (Analysis of

variances) verglichen, gefolgt von einem Bonferroni post hoc Test. P ≤ 0,05 wurde

als signifikant angenommen.

Im Einzelnen wurde der Effekt jedes einzelnen Pharmakons (Lidocain intravenös, D-

Serin, Strychnin, CGP jeweils intrathekal, mit NaCl-Applikation iv und it) im Vergleich

zur Kontrollgruppe (NaCl Lösung iv und it appliziert) statistisch untersucht.

Angelehnt an die Fragestellung dieser Arbeit, ob die durch Lidocain induzierte

Analgesie durch it applizierte Pharmaka antagonisiert werden kann, wurde die Ko-

4 Ergebnisse 28

Applikation von D-Serin, Strychnin und CGP mit Lidocain im Vergleich zur reinen

Lidocain iv-Applikation statistisch untersucht.

Daraus folgt eine Untersuchung mit vier Vergleichen zu einem Zeitpunkt und drei

Vergleichen zu einem Zeitpunkt.

Bei der Testung mit 2% Lidocain, welches eine verlängerte analgetische Wirkung

hat, sollte die Wirkung von D-Serin im Versuchsverlauf untersucht werden. Die

Gruppen wurden mittels RM ANOVA (repeated measurement anova) und folgendem

Bonferroni post hoc-Test verglichen. Die Gruppe Lidocain iv + NaCl it wurde mit der

Gruppe Lidocain iv + D-Serin it, sowie mit der Gruppe NaCl iv + Nacl it verglichen,

es wurden so zwei Vergleiche zu vier Zeitpunkten gezogen.

4.1 Thermale Hyperalgesie nach Neuropathieinduktion

Bei dem Vergleich der verschiedenen Gruppen kam es bei allen Tieren zu einer

thermalen Schwellenverschiebung im Vergleich der rechten zur linken

Hintergliedmaße: alle verwendeten Tiere entwickelten eine signifikante thermale

Hyperalgesie an der linken Pfote nach der CCI-Operation.

An der rechten Pfote kam es zu keiner signifikanten Verschiebung in der thermischen

Empfindlichkeit, aber der prä-Bolus Wert vor jeglicher Manipulation lag bei allen

Tieren höher als nach der CCI-Operation.

4 Ergebnisse 29

Tabelle 3: Zusammenfassende Darstellung der einzelnen iv und it applizierten

Substanzen in ihrer Auswirkung auf das thermale Schmerzverhalten an der

linken,operierten Hintergliedmaße. Bewertung zum post Bolus-Wert.

Linkes Bein

Intravenös

NaCl Lidocain 1% Lidocain 2%

NaCl +/- ++ +

D-Serin - + -

Strychnin - + n.d.

Intr

athe

kal

CGP 78608 ++ + n.d.

+/-: keinerlei Schwellenverschiebung dokumentiert.

+: im Vergleich zu NaCl eine schwache Analgesie dokumentiert

(Schwellemerhöhung).

++: im Vergleich zu NaCl eine stärkere Analgesie dokumentiert.

-: im Vergleich zu NaCl eine gering Hyperalgesie dokumentiert.

(Schwellenerniedrigung).

--: im Vergleich zu NaCl eine starke Hyperalgesie dokumentiert


n.d.: nicht durchgeführt.

4 Ergebnisse 30

Tabelle 4: Zusammenfassende Darstellung der einzelnen iv und it applizierten

Substanzen in ihrer Auswirkung auf das thermale Schmerzverhalten an der

rechten, nicht operierten Hintergliedmaße.

Rechtes Bein

Intravenös

NaCl Lidocain 1% Lidocain 2%

NaCl +/- ++ +

D-Serin - + -

Strychnin - + n.d.

Intr

athe

kal

CGP 78608 ++ + n.d.

+/-: keinerlei Schwellenverschiebung dokumentiert.

+: im Vergleich zu NaCl eine schwache Analgesie dokumentiert

(Schwellemerhöhung).

++: im Vergleich zu NaCl eine stärkere Analgesie dokumentiert.

-: im Vergleich zu NaCl eine gering Hyperalgesie dokumentiert.


--: im Vergleich zu NaCl eine starke Hyperalgesie dokumentiert


n.d.: nicht durchgeführt.

4 Ergebnisse 31

Thermische Schwellenverschiebung an der rechten Hinterpfote (kontralateral zur

CCI-Operation); Lidocain 1% iv und D-Serin it, Abbildung 6:

An der rechten, nicht operierten Gliedmaße hatte Lidocain 1% iv + NaCl it den

höchsten post Bolus Wert, nach zehn Minuten fiel die Schwelle auf 13,4 ± 0,6

Sekunden, um sich nach 20 Minuten mit den anderen Kurvenverläufen bei

Reaktionszeiten zwischen 10 und 11 Sekunden einzupendeln. Bei zusätzlicher Gabe

von D-Serin it war die Wirkung von Lidocain 1% bei einem post Bolus Wert von 13,5

± 0,5 Sekunden schwächer, nach 30 Minuten war der prä Bolus Wert erreicht.

Die Tiere, bei denen NaCl iv und NaCl it appliziert wurde, dienten als Kontrollgruppe.

Die Kurve verlief gleichbleibend flach, ohne einen nennenswerten An- oder Abstieg

nach Applikation des Bolus.

Der Kurve der Gruppe NaCl iv + D-Serin it hatte einen post Bolus Wert (9,5 ± 0,6

Sekunden), der minimal unter dem prä Bolus Wert (11,9 ± 0,3 Sekunden) lag, die

Kurve stieg im Versuchsverlauf wieder auf Werte um zehn Sekunden an.

Thermische Schwellenverschiebung an der linken Hinterpfote (mit CCI-Operation);

Lidocain 1% iv und D-Serin it, Abbildung 7:

An der linken Gliedmaße war ein ähnlicher Verlauf der Schwellenverschiebung zu

beobachten in Bezug auf den post Bolus Wert. Die Schwellenwerte lagen höher als

an der rechten Pfote, die einzelnen Tiergruppen zeigten bei ausschließlicher 1%

Lidocaingabe den höchsten post Bolus Wert (18,8 ± 1,2 Sekunden), was einem

Wirkmaximum entspricht, kehrte aber im weitern Zeitverlauf wieder auf den

Ausgangswert von 12,8 ± 1,1 Sekunden zurück.

Diesem Kurvenverlauf folgte die Gruppe Lidocain 1% iv + D-Serin it (13 ± 9

Sekunden) und NaCl iv + NaCl it (10,3 ± 0,2 Sekunden). NaCl iv + D-Serin it hatte

den geringsten Schwellenwert mit 9,1 ± 0,6 Sekunden post Bolus.

Die thermale Schwelle verschob sich bei 1% Lidocain iv + NaCl it am rechten, nicht

operierten Bein vor dem Bolus von 11,3 ± 0,4, auf 16,6 ± 01,2 Sekunden, hatte hier

das Wirkungsmaximum und kehrte nach 30 Minuten wieder auf den Ausgangswert

von 11,2 ± 0,7 Sekunden zurück.

4 Ergebnisse 32

Zur Signifikanz:

Im Vergleich NaCl iv + NaCl it versus Lidocain 1% iv + NaCl it waren linke wie rechte

Pfote im Wirkmaximum signifikant unterschiedlich (p < 0,01, n = 6) mit einem

Wirkmaximum links 10,3 ± 0,2 versus 18,8 ± 1,2 Sekunden und rechts 11,3 ± 0,6

versus 16,6 ± 1,2 Sekunden.

Beim Vergleich NaCl iv + NaCl it versus D-Serin waren die Schwellenverschiebungen

weder links noch rechts signifikant, links 10,3 ± 0,2 versus 9,1 ± 0,6 Sekunden,

rechts11,3 ± 0,6 versus 9,5 ± 0,6 Sekunden. Beide Kurvenverläufe zeigten sowohl

links als auch rechts nach 30 Minuten einen abfallenden Verlauf, um nach 50

Minuten auf den Ausgangswert zurückzukehren.


CCI-Operation); Lidocain 1% iv und Strychnin it, Abbildung 8:

An der rechten, nicht operierten Pfote hatte die Gruppe Lidocain 1% iv + NaCl it den

höchsten post Bolus Wert (16,6 ± 1,2 Sekunden), fiel aber nach 30 Minuten

Versuchsdauer auf Werte um zehn bis elf Sekunden ab. Lidocain 1% iv + Strychnin it

hatte den zweit höchsten post Bolus Wert (12,6 ± 0,8 Sekunden), erreichte nach 30

Minuten seinen tiefsten Wert bei 9,3 ± 0,4 Sekunden, und stieg bis 50 Minuten nach

Versuchsbeginn auf den prä Bolus Wert an.

Die Kontrollgruppe NaCl iv + NaCl it hatte einen gleichbleibenden Kurvenverlauf, wie

oben erwähnt. Die Tiere mit NaCl iv und Strychnin it zeigten eine deutlich

herabgesetzte thermale Schwelle, alle Werte lagen deutlich unter denen der anderen

Gruppen und hatten nach Versuchsende den prä Bolus Wert nicht wieder erreicht.

Thermische Schwellenverschiebung an der linken Hinterpfote (mit CCI-Operation),

Lidocain 1% iv und Strychnin it, Abbildung 9:

An der linken Pfote fiel erneut auf, dass die reine 1% Lidocaingruppe die höchsten

thermalen Schwellen nach dem Bolus hatte. Die Gruppen Lidocain 1% iv + Strychnin

it und die NaCl-Kontrollgruppe hatten eine ähnlichen Verlauf mit Werten, die eng

zusammen lagen, der Kurvenverlauf war ohne grosse Schwankungen.

4 Ergebnisse 33

Die Gruppe NaCl iv + Strychnin it dagegen hatte post Bolus eine deutliche

Schwellenerniedrigung mit einem Wert von 5,8 ± 0,2 Sekunden und verblieb bis

Versuchsende auf diesem niedrigen Niveau.

Zur Signifikanz:

Bei den Gruppen NaCl iv + NaCl it versus Strychnin kam es an der rechten Pfote zu

einer nicht signifikanten Verschiebung post Bolus, 11,3 ± 0,6 versus 9,0 ± 0,8

Sekunden. An der linken Hintergliedmaße verlief der Kurvenverlauf signifikant, 10,3 ±

0,2 versus 5,8 ± 0,2 Sekunden bei p< 0,05 und n = 6.

Die Verlaufskurve des Strychnins dokumentierte links wie rechts eine starke

Schwellenverschiebung unter den Ausgangswert, und dieser erreichte nach 50

Minuten Versuchsverlauf nicht wieder den Wert vor Bolusgabe.


CCI-Operation), Lidocain 1% iv und CGP 78608 it, Abbildung 10:

An der rechten Pfote hatte Lidocain 1% iv + NaCl it das Wirkmaximum bei 16,6 ± 1,2

Sekunden und hatte nach Versuchsdauer 10,5 ± 0,5 Sekunden das Wirkminimum.

Die Kontrollgruppe hatte einen gleichbleibenden flachen Verlauf, wie oben erwähnt.

NaCl iv + CGP 78608 it hat im Vergleich zu Lidocain 1% iv + CGP 78608 it einen

höheren post Bolus Wert (15,5 ±0,6 Sekunden). Die Wirkung des Pharmakons hielt

im Versuchsverlauf länger an als bei den anderen Gruppen, fiel aber nach 30

Minuten auf prä Bolus- Werte ab.

Die thermalen Schwellenwerte der Gruppe mit Lidocain 1% iv + CGP 78608 it hatte

bei Minute 10 ihr Wirkmaximum, bei Minute 30 war das Ausgangsniveau wieder

erreicht. Lidocain 1% iv + NaCl it hatte das höchste Wirkungsmaximum, gefolgt von

NaCl iv + CGP 78608 it. Lidocain 1% iv + CGP 78608 it hatte im Vergleich mit den

erwähnten Gruppen einen deutlich niedrigeren post Bolus Wert.


Lidocain 1% iv und CGP 78608 it, Abbildung 11:

An der linken Pfote stellten sich die Verläufe der Werte der verschiedenen Gruppe

ähnlich dar: sie hatten alle, mit Ausnahmen der Kontrollgruppe, ein

4 Ergebnisse 34

Wirkungsmaximum nach der Bolusgabe und im Verlauf des Versuches sanken die

thermalen Schwellenwerte auf prä Bolus Werte.

Lidocain 1% iv + NaCl it hatte das höchste Wirkungsmaximum, gefolgt von NaCl iv +

CGP 78608 it. Lidocain 1% iv + CGP 78608 it hatte also im Vergleich mit den

erwähnten Gruppen einen deutlich niedrigeren post Bolus Wert.

Die Kontrollgruppe hatte das geringste Wirkungsmaximum und einen

gleichbleibenden Kurvenverlauf.

Zur Signifikanz:

Bei dem Vergleich NaCl iv + NaCl it versus CGP 78608 it waren die Werte

signifikant, rechte Pfote p< 0,01, linke Pfote p< 0,05 bei n =6. Post Bolus hatten

beide Werte ihr Wirkmaximum rechts 11,3 ± 0,6 versus 15,5 ± 0,6, links 10,3 ± 0,2

versus 13,8 ± 1,2 Sekunden. Der Kurvenverlauf des CGP 78608 lag während der

gesamten Versuchsdauer über dem des NaCl, beide näherten sich bei 50 Minuten

dem prä Bolus Wert wieder an.


CCI-Operation); Lidocain 2% iv und D-Serin it, Abbildung 12:

Bei den Versuchen mit 2% Lidocain wurde das D-Serin nach dem Lidocain- Bolus

appliziert und so die Wirkung der applizierten Pharmaka zehn Minuten nach der

Bolusgabe untersucht.

Lidocain 1% iv + NaCl it hatte mit 13,4 ±0,6 Sekunden das höchste Wirkmaximum,

gefolgt von Lidocain 2% iv + NaCl it (13,1 ±0,4 Sekunden), doch die

Schwellenwerterhöhung blieb im Versuchsverlauf bei 2% Lidocain länger bestehen

als bei Lidocain 1%.

2% Lidocain iv + D-Serin it hatte mit 9,5 ± 0,3 Sekunden die grösste

Schwellenerniedrigung, die sich bis Versuchsende an den prä Bolus Wert wieder

annäherte (10,7 ± 0,2 Sekunden). Die Kontrollgruppe hatte kein Wirkmaximum, die

Kurve verlief gleichbleibend flach.

Auffallend war bei den ersten Gruppen (Lidocain 1% iv + NaCl it und Lidocain 2% +

Nacl it) eine Schwellenerhöhung nach zehn Minuten, bei den anderen Gruppen

(Lidocain 2% + D-Serin it und NaCl iv + NaCl it) eine thermische

4 Ergebnisse 35

Schwellenerniedrigung. Alle vier Gruppen näherten sich im weiteren Kurvenverlauf

wieder ihren postoperativen Ausgangswerten an.


Lidocain 2% iv und D-Serin it, Abbildung 13:

Auffallend war, dass im Gegensatz zur rechten Hinterpfote die Schwellenerhöhung

des Lidocain 1% iv + NaCl it links höher ausfiel als Lidocain 2% iv + NaCl it. Nach

zehn Minuten hatte das Lidocain 1% eine Schwelle mit 13,8 ± 0,5 Sekunden,

Lidocain 2% dagegen 12,6 ± 0,5 Sekunden. Diese Schwellenverteilung blieb bis

Versuchsende bestehen, der jeweilige prä Bolus Wert wurde nicht wieder erreicht.

2% Lidocain iv + D-Serin hatte im Vergleich zum prä Bolus Wert von 9,8 ±0,2

Sekunden eine Schwellenerniedrigung auf 9,0 ± 0,2 Sekunden nach zehn Minuten

Versuchsablauf. Die antagonisierende Wirkung des D-Serin ließ während des

Versuches nach und der prä Bolus Wert war nach 40 Minuten erreicht.

Die Kontrollgruppe hatte, wie oben erwähnt, einen flachen Verlauf.

Zur Signifikanz:

In der Versuchsreihe wurde die unterschiedliche Konzentration (1% und 2%) des

Lidocains in Bezug auf das veränderte Schmerzverhalten genauer betrachtet.

Allgemein war festzustellen, dass eine Gabe von Lidocain 2% iv + NaCl it im

Vergleich zu Lidocain 1% iv + NaCl it zu einer länger erhöhten thermischen Schwelle

geführt hatte. Diese erhöhten Schwellen konnten durch eine Gabe von D-Serin

intrathekal antagonisiert werden, welches durch signifikant unterschiedliche

Kurvenverläufe deutlich wurde.

Die berechneten Signifikanzen wurden in Tabelle 6 im Anhang dargestellt.

Nach zehn Minuten waren alle gemessenen Werte an der linken und rechten Pfote

mit p< 0,01 bei n = 6 signifikant unterschiedlich. Lidocain 2 % iv + NaCl it versus

NaCl iv + NaCl it rechts 13,1 ± 0,4 versus 10,5 ±0,2 Sekunden, links 12,6 ± 0,5

versus 9,7 ± 0,3 Sekunden.

4 Ergebnisse 36

Lidocain 2% iv + NaCl it versus Lidocain 2% iv + D-Serin it zeigten rechts ein

Wirkmaximum von 13,1 ± 0,4 versus 9,5 ± 0,3, links 12,6 ± 0,5 versus 9,0 ± 0,2

Sekunden, im weiteren Verlauf zeigte sich, dass die Kurve von Lidocain 2% iv + D-

Serin im weiteren Versuchsverlauf Richtung Ausgangswert strebte.

Nach 20 Minuten waren bei beiden Gruppen erneut die Werte der linken und rechten

Pfote signifikant unterschiedlich mit p < 0,01 bei n = 6. Rechte Pfote Lidocain 2% iv +

NaCl it versus NaCl iv + NaCl it mit 13,1 ± 0,5 versus 10,7 ± 0,3 Sekunden, linke

Pfote 12,3 ± 0,4 versus 9,2 ± 0,4 Sekunden. Im weiteren Vergleich rechte Pfote

Lidocain 2% iv + NaCl it versus Lidocain 2% iv + D-Serin it mit 13,1 ± 0,5 versus 10,7

± 0,1 Sekunden, linke Pfote 12,3 ± 0,4 versus 9,2 ± 0,2 Sekunden.

Nach 30 Minuten waren an der rechten Pfote bei beiden zu vergleichenden Gruppen

die Schwellenverschiebungen mit p < 0,05 bei n = 6 signifikant: Lidocain 2% iv +

NaCl it versus NaCl iv + NaCl it mit 13,3 ± 0,4 versus 10,9 ± 0,3 Sekunden, Lidocain

2% iv + NaCl it versus Lidocain 2% iv + D-Serin it mit 13,3 ± 0,4 versus 11,0 ± 0,2

Sekunden. An der linken Pfote waren bei der Kontrollgruppe Lidocain 2% iv + NaCl it

versus NaCl iv + NaCl it die Daten mit 12,1 ± 0,3 versus 9,6± 0,3 Sekunden

signifikant unterschiedlich, bei p< 0,05 mit n = 6, und näherten sich im

Versuchsverlauf dem Ausgangswert wieder an.

Bei der Gruppe Lidocain 2% iv + NaCl it versus Lidocain 2% iv + D-Serin it mit 12,1 ±

0,3 versus 9,7 ± 0,3 Sekunden war bei p< 0,01 mit n= 6 der Vergleich der

Schmerzschwelle signifikant unterschiedlich.

Nach 40 Minuten Versuchsablauf hatten beide Gruppen an der rechten und linken

Pfote den Ausgangswert wieder erreicht.

Der analgetische Effekt von Lidocain 1% war an der linken, operierten Gliedmaße

stärker und länger ausgebildet, als an der rechten, nicht operierten Gliedmaße. Bei

den Tieren, die nur 1% Lidocain erhielten erfolgte fünf Minuten nach dem Beginn der

Lidocaininfusion an der linken, operierten Pfote das Wegziehen der Pfote nach 18,8

±1,2 sec. (rechte, nicht operierte Pfote 16,6 ±1,2 sec.). Bei der Kontrollgruppe wurde

nach 10,3 ±0,2 sec. die linke Pfote, und nach 11,3 ± 0,6 sec. die rechte Pfote

weggezogen (p ≤ 0,01. n= 6).

4 Ergebnisse 37

Die thermale Latenzzeit bis zum Wegziehen der Pfote bei den 1% Lidocaintieren

kehrte an der linken Pfote nach 50 Minuten, an der rechten Pfote nach 20 Minuten

auf den Ausgangswert vor der intravenösen Infusion zurück (Abbildung 1-8).

Die zusätzliche Gabe von D-Serin (100µg/ Ratte) reduzierte an der linken Pfote die

Lidocain-vermittelte Antinozizeption nach fünf Minuten ab der 1% Lidocaininfusion.

An der rechten Pfote konnte trotz D-Serin kein signifikanter Unterschied im

Schmerzempfinden festgestellt werden (13,3 ±0,9 sec. vs. 18,8 ±1,2 sec. an der

linken Pfote und 13,5 ≤0,6 sec. vs. 16,6 ±1,2 sec. an der rechten Pfote, 1% Lidocain

plus D-Serin vs. 1% Lidocain allein, p ≤ 0,05 und nicht signifikant, n=6). An beiden

Hintergliedmaßen war der Effekt von D-Serin nur geringfügig zu erkennen. Die

Latenzzeit zehn Minuten nach Beginn der 1% Lidocaininfusion lag bei 12,9 ±1 sec.

(linkes Bein) und 11,9 ±0,4 sec. (rechtes Bein) bei Tieren, die D-Serin plus 1%

Lidocain bekamen. Bei Tieren, die nur 1% Lidocain erhielten war links eine

Latenzzeit von 13,8 ±0,5 sec., und rechts eine Latenzzeit von 13,4 ±0,6 sec. zu

messen. Im gesamten Versuchsablauf (bis 50 Minuten nach 1% Infusionsbeginn)

konnte kein signifikanter Unterschied festgestellt werden zwischen den Tieren, die

einerseits D-Serin plus Lidocain, andererseits nur 1% Lidocain bekamen.

Jedoch konnte bei den Versuchen mit 2% Lidocain (10 mg/kg 1% Lidocain in drei

Minuten, nach fünf Minuten Beginn der Dauerinfusion mit 360 mg/kg/Stunde, nach

fünf Minuten 100µg D-Serin intrathekal) dokumentiert werden, dass die lidocain-

vermittelte Antinozizeption durch D-Serin an linker und rechter Hinterpfote reduziert

wurde (Abbildung 6 u. 7). Zehn Minuten nach 2% Lidocaininfusion lag die thermale

Latenzzeit bei der Gruppe D-Serin plus Lidocain links bei 9,3 ±0,4 sec. und rechts bei

p ≤ 0,05 10,3 ±0,7 sec. Bei der Gruppe, die nur 2% Lidocain erhielt waren links Werte

von 12,4 ±0,5 sec., und rechts von 13,4 ±0,4 sec. (p ≤ 0,05, n=6) zu messen. D-Serin

hatte weder einen pro- noch einen antinozizeptiven Effekt, wenn es allein appliziert

wurde.

Bei intrathekaler Applikation von Strychnin (3 µg/ Ratte) wurde bei der 1%

Lidocaininfusion die antinozizeptive Wirkung des Lokalanästhetikums an der linken,

wie rechten Pfote aufgehoben, es wirkte deutlich stärker und länger pronozizeptiv als

D-Serin (Abbildung 2 und 4). Fünf Minuten nach Beginn der 1% Lidocain Infusion

4 Ergebnisse 38

konnten an der linken Pfote bei Strychnin plus Lidocain Werte von 12,6 ±0,8 sec. vs.

18,8±1,2 sec. bei alleinigem Lidocain gemessen werden (p ≤0,01, n= 6). An der

rechten Pfote waren es 12,8±0,8 sec. vs. 16,6±1,2 sec. (p ≤0,05, n=6). Im

Gegensatz zu D-Serin konnte Strychnin an beiden Hinterpfoten bei alleiniger Gabe

die Pronozizeption verstärken und verlängern (Abbildung 3 und 4).

Bei der Applikation von CGP 78608 (100pmol/Ratte) wurde bei den Messwerten an

beiden Hinterpfoten deutlich, dass fünf und zehn Minuten nach Infusionsbeginn die

thermale Latenzzeit reduziert wurde (linke Pfote: 11,8. ±1,5 sec. vs. 18,8 ±1,2 sec.

bei alleiniger 1% Lidocaingabe; rechte Pfote: 12 ± 1,4 sec. vs. 16,6 ±1,2 sec. bei

alleiniger 1% Lidocaingabe, p ≤0,01 und p ≤0,05 bei n=6). CGP 78608 hat bei

alleiniger Gabe eine antinozizeptive Wirkung (Abbildung 5 und 6).

4.2 Lidocain-Dosisfindung und Blutkonzentration von 1% Lidocain in vivo bei

der Ratte

Um eine genaue Aussage über die Kinetik des Lidocains machen zu können, wurde

an drei männlichen Wistar-Ratten (Tac:WIST, Wistar Hannover, GALAS) eine

Bestimmung der Blutserumkonzentration von Lidocain durchgeführt (siehe Abbildung

17, Kapitel 8).

Dazu wurden die Ratten mit 60 mg Pentobarbital (Narcoren®) pro Kilogramm

Körpergewicht in Narkose gelegt. Wie unter 3.3 beschrieben, wurde jedem Tier auf

der linken Halsseite ein zentraler Venenzugang gelegt.

Durch diesen Venenzugang wurden 0,8 ml Blutes entnommen und in EDTA-

Röhrchen verbracht. Diese Probe entsprach dem Nullwert oder dem „prä OP“ Wert.

Wie in den vorangegangen Versuchsreihen bekam das in Narkose liegende Tier

einen Bolus von 0,35 ml des 1% Lidocains (Lidocain 1%®, der Firma Braun,

Deutschland) verabreicht, es folgte eine einstündige permanente Infusion von 1%

Lidocain in einer Menge von 6 µl in der Minute.

4 Ergebnisse 39

Die Probe wurde mit Hilfe einer Pasteur-Pipette aus dem periorbitalen Venenplexus

entnommen, je zwei Mal am linken und am rechten Auge. Die Blutprobe wurde nicht

aus dem Venenkatheter gewonnen, da so die Dauerinfusion unterbrochen werden

müsste. Einen zweiten Venenkatheter in die andere Vena jugularis zu installiern,

erschien zu arbeits- und zeitintensiv.

Nach dem Nullwert folgte eine Probe gleich nach der Bolusgabe mit 1% Lidocain,

dann nach 20, 40 und 50 Minuten bei laufender Zeitmessung. Diese Abfolge der

Probenentnahme wurde gewählt, damit über den gesamten Versuchsablauf eine

zusammenhängende Konzentration dokumentiert werden konnte.

Die EDTA-Proben wurden zehn Minuten bei 3000 Umdrehungen in der Minute

zentrifugiert und bis zur weiteren Analyse eingefroren.

Nach der letzten Probenentnahme wurden die Tiere mit 0,5 ml einer

Pentobarbitallösung (Eutha 77®, Firma Essex) schmerzfrei euthanasiert.

Die Konzentration von Lidocain im Serum wurde mit Hilfe einer Gaschromatographie

mit Massenspektrometrie (GCMS) durch Dipl. Ing. Susanto,

Diabetesforschungsinstitut, Düsseldorf bestimmt.

Tabelle 5: Darstellung der Konzentration von Lidocain im Serum [µl/ml Serum]

Probenummer Tier 1 Tier 2 Tier 3

1 (Nullwert) 0,0 0,0 0,0

2 (nach Bolus) 2,09 3,43 6,02

3 (nach 20 min.) 3,77 8,65 8,29

4 (nach 40 min.) 4,82 6,74 7,9

5 (nach 50 min.) 5,99 2,24 4,09

4 Ergebnisse 40

4.3 Einfluß der applizierten Pharmaka auf die induzierte Hyperalgesie

Lidocain ist ein Lokalanästhetikum, welches im Rahmen dieser Arbeit systemisch

appliziert wurde. Dieses Pharmakon hat im applizierten Dosisbereich der

vorliegenden Arbeit eine zentral nervöse, inhibitorische Wirkung (BIELLA et. al,

1993). Es kommt bei alleiniger Applikation nach CCI-Operation zu einer

Schwellenerhöhung der Nozizeption bei den Tieren am linken, operierten wie auch

am rechten, nicht operierten Bein.

Dieser antinozizeptive Effekt wird sowohl durch D-Serin als Co-Agonisten von

Glutamat am (exzitatorischen) NMDA-Rezeptor, als auch durch Strychnin als

Antagonisten am strychnin-sensitiven inhibitorischen Glycinrezeptor antagonisiert.

Erstaunlicherweise antagonisiert auch ein Antagonist an der Glyzin-B-Site des

NMDA-Rezeptors die durch Lidocain induzierte Antinozizeption.

5 Diskussion 41

5 Diskussion

Im Rahmen dieser Arbeit sollte anhand von einem thermalen Verhaltensexperiment

geklärt werden, ob die durch systemisch appliziertes Lidocain erzeugte Analgesie

über spinale glyzinerge Mechanismen vermittelt ist.

Die Versuche wurden in vivo durchgeführt. Die in der Literatur beschriebenen

vorangegangenen, in vitro durchgeführten Experimente (BENNETT und XIE, 1988;

BIELLA und SOTGIU, 1993; STEPHEN et al., 1994; NAGY und WOOLF, 1998)

wurden in dieser Dissertationsschrift am sich frei bewegenden Tier nachvollzogen.

Die Ergebnisse aus Iontophorese und ähnlichen Versuchen sollten auf das ganze,

lebende Tier übertragen werden.

Da die Versuche am wachen, nicht narkotisierten Tier durchgeführt wurden, konnte

der physiologische Ablauf der Schmerztransmission beurteilt werden. WHITEHEAD

et al. (2004) haben in ihrer Studie darauf hingewiesen, dass Untersuchungen zum

Schmerzverhalten durch die Anwesenheit allgemein anästhesierender Substanzen

die neuronale Aktivität, sowie die nozizeptive Stimulierung beim Tier beeinflussen

und so einige der gemachten Beobachtungen nicht alle regulierenden Mechanismen

widerspiegeln. Auch JONES et al. (2001) haben in ihrer in vitro durchgeführten Arbeit

darauf hingewiesen, dass Faktoren, wie zum Beispiel Temperatur, Ionenverhältnisse

in Rezeptornähe oder die Anwesenheit von anderen modulierenden Substanzen am

wachen Tier mit hoher Wahrscheinlichkeit anders zu bewerten sind, als bei

Versuchen, die in vitro durchgeführt wurden.

Die verwendeten Substanzen, die mittels des intrathekalen Katheters direkt an der

Lumbalschwellung und so in der Region des Dorsalhorns appliziert werden konnten,

sind selektive Agonisten sowie Antagonisten am NMDA-Rezeptor, sowie ein

Antagonist am inhibitorischen Strychnin-sensitiven Glycinrezeptor.

In vorangegegangenen Studien hat sich gezeigt, dass selektive Antagonisten an den

synergistischen Teilen der betroffenen Rezeptoren (NMDA- und inhibitorische

Strychnin-sensitive Glycinrezeptoren) geringere Nebenwirkungen bei den Patienten

5 Diskussion 42

hervorrufen, als komplett blockierende Substanzen. Die Blut-Hirnschranke wird nicht

passiert und eine Gewöhnung, wie zum Beispiel bei vergleichbaren Opioiden, bleibt

aus. Es ist bewiesen, dass moderat wirkende, selektive Antagonisten bei

chronischen Schmerzmodellen mehr Erleichterung für den Patienten schaffen, als

Antagonisten, die den gesamten Rezeptor blocken. Auch das Zusammenspiel von

Antagonisten und Teilen des NMDA-Rezeptors bei parietalen und viszeralen

Schmerzen in der Peripherie sind möglicherweise in Zukunft ein Angriffspunkt einer

effizienten Schmerztherapie (PARSONS, 2001).

Beide Rezeptoren, der NMDA-Rezeptor, sowie der inhibitorische strychnin-sensitive

Glycinrezeptor spielen bei der Transmission von chronischen Schmerzen eine

grosse Rolle, wobei ihre Aktivierung und die Hintergründe einer selektiven oder

gekoppelten Beeinflussung nicht genau geklärt sind.

Glycin ist einer der wichtigsten inhibitorischen Neurotransmitter im zentralen

Nervensytem. AHMADI et al. (2003) haben in ihrer Arbeit festgestellt, dass Glycin als

obligatorischer Co-Agonist am NMDA-Rezeptor in der chronischen

Schmerzentwicklung eine sehr wichtige Rolle spielt. Somit wäre auch eine

Beeinflussung der Glycinmenge ein möglicher Ansatz für eine effektivere

Schmerztheraphie.

KISHIMOTO et al. (1981) und BECKER et al. (1988) haben bewiesen, dass der

NMDA-Rezeptor eine höhere Affinität für Glycin hat als der inhibitorische strychnin-

sensitive Glycinrezeptor. Die Ansprechbarkeit der Rezeptoren ist von der

Glycinkonzentration im synaptischen Spalt abhängig. Glycin und Glutamat als Co-

Agonisten müssen ausreichend vorhanden sein, um die Rezeptoren voll zu

aktivieren. Der Glycintransport im Dorsalhorn des ZNS durch Typ 1 und 2

Glycintransporter hat ebenfalls Einfluss auf die Aktivierung der Rezeptoren. Es

können entfernte Rezeptoren durch den oben erklärten „spillover“ (siehe Einleitung,

S. 7) aktiviert werden. Durch Diffusion und gezielten Transport verlässt Glycin den

synaptischen Spalt und steht so nicht mehr zur Aktivierung in der Nähe liegender

Rezeptoren zur Verfügung.

5 Diskussion 43

Wirkung von Lidocain

Systemisch appliziertes niedrig dosiertes Lidocain ruft eine temporäre, reversible

Analgesie hervor. Dies wurden in vielen vorangegangenen experimentellen und

klinischen Versuchen bei Menschen und Tieren untersucht (MARCHETTINI et al.,

1992; ABRAM und YAKSH, 1994; MAO und CHEN, 2000; SMITH et al., 2002;

ARAUJO et al., 2003 und FINNERUP et al., 2005). Die systemische, analgetische

Wirkung des Lidocain konnte auch im Rahmen dieser Arbeit im neuropathischen

Schmerzmodell bestätigt werden.

Es hemmt die NMDA- und Neurokinin-Rezeptor-vermittelte postsynaptische

Depolarisation (NAGY und WOOLF, 1996), sowie die durch Glutamat evozierte

Aktivität (BIELLA und SOTGIU, 1993) in bestimmten Hinterhornneuronen (WDR-

Neurone). Es hat eine wie schon im Vorangegangen erklärte, zentralnervöse,

inhibitorische Wirkung (STEPHEN et al., 1994).

Bei der Katalyse am Rezeptor hemmt Lidocain die Glutamatausschüttung und wirkt

so inhibitorisch auf die Signalweiterleitung (BIELLA et al., 1993).

WALLACE et al. (2000) stellten fest, dass Lidocain vor allem bei Patienten mit

neuropathischen Schmerzen Erleichterung verschaffen konnte. Bei Patienten mit

akuten Schmerzen zeigte es keinerlei Wirkung. Er stellte die Vermutung auf, dass es

nach einem Trauma zu morphologischen Veränderungen an den Afferenzen kommt.

Die Anzahl von spannungsgesteuerten Natrium-Kanälen nimmt in diesen Gebieten

zu, auch in Gebieten des dorsalen Wurzelganglions wurde eine Zunahme der Kanäle

dokumentiert.

Wie in vorangegangenen Studien ließ sich die analgetische Wirkung des Lidocains in

den Versuchen der vorliegenden Arbeit bestätigen. Die thermale Schwelle der Tiere

war bei alleiniger intravenöser Applikation an linker und rechter Hinterpfote stark

erhöht. Wie erwartet wirkt Lidocain im CCI-Modell antinozizeptiv.

BIELLA et al. (1993) vermuteten anhand von in vitro-Experimenten an „wide dynamic

range-Neuronen“ des spinalen Hinterhorns von Ratten, dass die Wirkung des

Lidocains möglicherweise über den NMDA-Rezeptor vermittelt wird, der Glycinrest

des Lidocain bindet an der Glycin B-site und verhindert die weitere

Glutamatausschüttung. Lidocain hätte demzufolge an der Glycin B-site eine

5 Diskussion 44

antagonistische Wirkung zu Glycin, aber auch Metaboliten der Substanz könnten

eine ähnliche, antinozizeptive Wirkung haben.

Wirkung von D-Serin

D-Serin ist ein potenter (Co)-Agonist an der Glycin-B site des NMDA-Rezeptors mit

entsprechender exzitatorischer Wirkungsweise, aber inaktiv am inhibitorischen

strychnin-sensitiven Glycinrezeptor (BARANANO et al., 2001). In der vorliegenden

Arbeit wurde D-Serin in einer Dosis (100 µg/Ratte) intrathekal appliziert, die bei

alleiniger Applikation zu keiner exzitatorischen Wirkung führt (s.a. MUTH-SELBACH

et al., 2002).

Bei der Applikation von Lidocain iv und D-Serin it wurde das Wirkungsmaximum von

Lidocain an der linken und rechten Pfote herabgesetzt. D-Serin antagonisiert folglich

die antinozizeptive Wirkung von systemisch appliziertem, niedrig dosiertem Lidocain.

Die Ergebnisse unterstützen die Hypothese von BIELLA et al. (1993), dass Lidocain

an der Glycin-B-site des NMDA-Rezeptors antagonistisch wirkt und über diesen Weg

zumindest teilweise seine Antinozizeption vermittelt. D-Serin verdrängt Lidocain

(oder Metabolite mit Glycinrest) vom Rezeptor, entfaltet (co-)agonistische Aktivität

und hebt damit die Blockade des NMDA-Rezeptors auf, was in einer wieder

verstärkten Pronozizeption mündet. Der pronozizeptive Effekt hielt bis 30 Minuten

nach der intrathekalen Applikation an.

Dieses Ergebniss zeigt, dass an der antinozizeptiven Wirkung von Lidocain bei

chronischen, neuropathischen Schmerzen der Ratte die Glycin-Bindungsstelle

spinaler NMDA-Rezeptoren beteiligt ist.

Wirkung von Strychnin

Strychnin ist ein selektiver Glycin-Antagonist, der mit gleicher Affinität wie Glycin an

inhibitorischen strychnin-sensitiven Glycin-Rezeptoren bindet (BREITINGER u.

BECKER, 2002; ARAGON u. LOPEZ-CORCUERA, 2003). Ausserdem vermindert es

die Glycinkonzentration im synaptischen Spalt, was eine verminderte Aktivierung des

NMDA-Rezeptors nach sich ziehen kann. Diese beiden Angriffspunkte an den

verschiedenen Rezeptoren machen deutlich, dass Strychnin inhibitorisch, wie

5 Diskussion 45

exzitatorisch wirken kann. Die Doppelrolle des Glycins im ZNS im Zusammenhang

mit neuropathischen Schmerzen wurde 1996 von SIMPSON et al. bestätigt.

In der Iontophorese hemmt Lidocain die Glutamatausschüttung, dies konnte durch

Strychnin zum Teil wieder aufgehoben werden (BIELLA und SOTGIU, 1992).

KHANDWALA et al. (1997) haben in ihrer Arbeit mit intrathekaler

Strychninapplikation eine reversible Allodynie induzieren können, ohne ein

chronisches Schmerzmodell an den Tieren zu etablieren. Sie stellten fest, dass in

Anwesenheit von

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