Bildung und Struktur der intranucleären Mikronucleusspindel des

Bildung und Struktur der intranucleären

Mikronucleusspindel des Ciliaten

Paramecium bursaria [FOCKE]

Dissertation

zur Erlangung des Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften

der Fakultät für Biologie an der

Ruhr-Universität Bochum

angefertigt am

Lehrstuhl für Zellmorphologie

vorgelegt von

Andreas Zabolitzky

aus

Hannover

Bochum 2000

i

1 Einleitung .............................................................................................. 1

2 Material und Methoden....................................................................... 11

2.1 Kulturhaltung..................................................................................................... 11

2.1.1 Kulturmedium........................................................................................................................ 11

2.1.2 Kulturhaltung von grünen Paramecium bursaria mit Chlorella als Endosymbionten .......... 12

2.1.3 Kulturhaltung von Endosymbionten-„freien“ weißen Paramecium bursaria ....................... 12

2.1.3.1 Erzeugung der Endosymbionten-„freien“ Kulturen .......................................................... 13

2.1.4 Anreicherung der Kulturen .................................................................................................... 13

2.2 Lichtmikroskopie............................................................................................... 13

2.2.1 Isolation der Mikronuclei ...................................................................................................... 13

2.2.2 Phasenkontrastmikroskopie ................................................................................................... 15

2.2.2.1 Lebenduntersuchungen ..................................................................................................... 15

2.2.3 Fluoreszenzmikroskopie........................................................................................................ 15

2.2.3.1 Aktin–Markierung bei isolierten Zellkernen..................................................................... 17

2.2.3.2 Bisbenzimid-Färbung isolierter Zellkerne ........................................................................ 18

2.2.3.3 Indirekte Immunfluoreszenz ............................................................................................. 18

2.3 Mikrotubuli–beeinflussende Substanzen........................................................... 21

2.3.1 Mikrotubuli-stabilisierende Agenzien ................................................................................... 21

2.3.1.1 Taxol ................................................................................................................................. 21

2.3.1.2 D2O ................................................................................................................................... 22

2.3.2 Mikrotubuli-destabilisierende Agenzien................................................................................ 22

2.3.2.1 Nocodazol ......................................................................................................................... 22

2.3.2.2 Colchicin ........................................................................................................................... 22

2.4 Transmissions–Elektronenmikroskopie............................................................. 22

2.4.1 Separation von Teilungszellen............................................................................................... 22

2.4.2 Standard–Fixierung ............................................................................................................... 23

2.4.3 Entwässerung und Standard–Einbettung in Epoxidharz (EPON).......................................... 24

2.4.4 Immunogoldmarkierungen für die Elektronenmikroskopie................................................... 24

2.4.4.1 Postembedding.................................................................................................................. 25

2.4.4.1.1 Fixierung für das Postembedding...................................................................................... 25

2.4.4.1.2 Einbettung für das Postembedding.................................................................................... 25

2.4.4.1.3 Fixierung und Einbettung in Epoxidharz mit anschließendem Ätzen der Präparate......... 26

2.4.4.1.4 Antikörper-Inkubation ...................................................................................................... 27

2.4.4.2 Preembedding ................................................................................................................... 28

2.4.4.2.1 Fixierung, Antikörperinkubation und Einbettung für das Preembedding ......................... 28

ii

2.4.5 Ultradünnschnittechnik und Kontrastierung.......................................................................... 29

2.4.6 Auswertung und Dokumentation........................................................................................... 29

2.5 Gelelektrophorese.............................................................................................. 29

2.5.1 Aufarbeitung der Proben ....................................................................................................... 29

2.5.1.1 Aufarbeitung ganzer Zellen............................................................................................... 29

2.5.1.2 Aufarbeitung von isolierten Mikronuclei .......................................................................... 30

2.5.1.3 Isolation und Aufarbeitung von Cilien.............................................................................. 30

2.5.2 SDS-Gelelektrophorese ......................................................................................................... 31

2.5.3 Western-Blot.......................................................................................................................... 33

2.6 Bezugsquellennachweis..................................................................................... 34

2.6.1 Antikörper ............................................................................................................................. 34

2.6.2 Chemikalien........................................................................................................................... 35

3 Ergebnisse ........................................................................................... 37

3.1 Struktur der Kerne unter Kontrollbedingungen................................................. 37

3.1.1 Ermittlung der Zellzyklusdauer ............................................................................................. 37

3.1.2 Allgemeine Strukturmerkmale............................................................................................... 39

3.1.3 Interphase .............................................................................................................................. 40

3.1.4 Prophase .................................................................................................................................. 1

3.1.5 Prometaphase......................................................................................................................... 42

3.1.6 Metaphase.............................................................................................................................. 43

3.1.7 Anaphase ............................................................................................................................... 44

3.1.8 Telophase............................................................................................................................... 47

3.2 Charakterisierung der Kernproteine .................................................................. 49

3.2.1 Tubulin-Modifikationen und ihre Verteilung im Kern .......................................................... 49

3.2.1.1 Nachweis des Gesamt - Tubulins ...................................................................................... 49

3.2.1.2 Nachweis des tyrosinierten/detyrosinierten Tubulins ....................................................... 50

3.2.1.3 Nachweis des acetylierten Tubulins.................................................................................. 50

3.2.1.4 Nachweis des β-Tubulins.................................................................................................. 53

3.2.2 Struktur und biochemische Zusammensetzung des Primärpols............................................. 54

3.2.2.1 Aktin ................................................................................................................................. 54

3.2.2.2 Centrin .............................................................................................................................. 55

3.2.2.3 Dynein............................................................................................................................... 55

3.2.2.4 Gamma-Tubulin und andere centrosomale Proteine ......................................................... 56

3.2.3 Parakristalline Strukturen ...................................................................................................... 58

3.3 Mikrotubuli- beeinflussende Agenzien ............................................................. 58

iii

3.3.1 Mikrotubuli destabilisierende Agenzien................................................................................ 59

3.3.1.1 Nocodazol ......................................................................................................................... 59

3.3.1.2 Colchicin ........................................................................................................................... 60

3.3.2 Stabilisierende Agenzien ....................................................................................................... 61

3.3.2.1 Taxol ................................................................................................................................. 61

3.3.2.2 D2O ................................................................................................................................... 62

4 Diskussion ........................................................................................... 64

4.1 Die Elemente des mikronucleären Spindelapparates......................................... 64

4.1.1 Die Funktion der Mikrolamellen ........................................................................................... 64

4.1.2 Der Zyklus der Filamente im Verlauf der Mitose.................................................................. 68

4.1.2.1 Das Erscheinungsbild der Filamente und Mikrotubuli in der Interphase und Prophase ... 68

4.1.2.2 Mikrotubuli und Filamente in der Prometa- und Metaphase............................................. 72

4.1.2.3 Der Mikronucleus im Verlauf der Ana- und Telophase.................................................... 78

4.1.3 Tubulin-Isoformen und posttranslationale Modifikationen mikronucleärer Mikrotubuli...... 90

4.2 Mikrotubuli-assoziierte Proteine im Mikronucleus ........................................... 99

4.2.1 Funktion des γ-Tubulins am Primärpol.................................................................................. 99

4.2.2 Funktion des Dyneins am Primärpol ................................................................................... 102

4.2.3 Funktion des Centrins im Mikronucleus.............................................................................. 103

4.2.4 Verschiebung des Mikrotubuli-Mikrofilament –Gehaltes durch Einsatz von stabilisierenden/destabilisierenden Agenzien ...................................................................... 105

4.2.4.1 Die Mikrotubuli-destabilisierenden Agenzien Nocodazol und Colchicin....................... 105

4.2.4.2 Die Mikrotubuli-stabilisierenden Agenzien Taxol und D2O........................................... 107

4.3 Mikrotubuli und Filamente.............................................................................. 110

4.3.1 Modellvorstellung zu Übergängen zwischen Mikrotubuli und Filamenten......................... 113

4.3.2 Die Bedeutung der Existenz von Filamenten für den Organismus ...................................... 115

5 Zusammenfassung.............................................................................117

6 Literatur.............................................................................................120 Lebenslauf

Danksagung

Abkürzungsverzeichnis

λ Wellenlänge A Adenin Ak Antikörper APS Ammoniumperoxodisulfat AS Aminosäure ATP Adenosin-5‘-Triphosphat BL Blockierlösung BSA-c Acetyliertes Rinderserumalbumin CDC Cell division cyclus, Zellteilungszyklus CD-R Compact disc recordable CENP Centromer-Protein CLSM Konfokales Laser-Scanning Mikroskop Cy2 Cyanin 2 D Dalton DDSA 2-Dodecyl-Bernsteinsäureanhydrid DMP-30 2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonucleinsäure DTAF 5-([4,6-Dichlorotriazin-2-yl]amino)fluorescein

Hydrochlorid EGTA Ethylen-bis-glykol-tetraessigsäure Fa. Firma FITC Fluoresceinisothiocyanat GDP Guanosin-5‘-Diphospat Glu Glutaminsäure Glu-Tubulin Detyrosiniertes Tubulin GTP Guanosin-5‘-Triphospat HC Schwere Kette HSP heat shock protein, Hitzeschockprotein IC Mittelschwere Kette IF Intermediärfilamente IIF Indirekte Immunfluoreszenz kMt Kinetochor-Mikrotubulus/-Mikrotubuli LC Leichte Kette LIC Leichte mittelschwere Kette mAk monoklonaler Antikörper MAP Mikrotubuli-assoziiertes Protein MCAK Mitotic centromere-associated kinesin

micDIF Die mikronucleäre Division induzierender Fak-tor

MNA Methylnadic Anhydrid MPF M-phase promoting factor Mt Mikrotubulus/Mikrotubuli MTOC Mikrotubuli-organisierendes Zentrum MWG Molekulargewicht NuMA Nucleäres Protein des mitotischen Apparates p para-

PBS Phosphatgepufferte Salzlösung PCM pericentrioläres Material RLP Rhodamin-konjugiertes Phalloidin RNA Ribonucleinsäure RSB Rinderserumalbumin RT Raumtemperatur SDS-PAGE Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-

Gelelektrophorese SMC Structural maintenance of chromosome, Struk-

turerhaltung der Chromosomen T Thymin TCP Tubulin-Carboxypeptidase TEMED N,N,N‘,N‘-Tetramethylethylendiamin TRITC Tetramethyl-Rhodamin-Isothiocyanat TTL Tubulin-Tyrosin-Ligase TuRC Tubulin Ringkomplex Tyr Tyrosin Tyr-Tubulin Tyrosiniertes Tubulin UE Untereinheit Upm Umdrehungen pro Minute v/v Volumen pro Volumen VE Vollentsalzt w/v Gewicht pro Volumen WL Waschlösung

Einleitung 1

1 Einleitung Die Weitergabe von Erbinformation erfolgt bei Protisten in der Regel durch vegetative

Fortpflanzung, wie sie sich in Zwei- oder Mehrfachteilung bzw. Knospung äußert. Bei

dieser Art der Fortpflanzung wird durch eine schlichte Mitose die Erbsubstanz des El-

ternindividuums unverändert an die Nachkommen übergeben. Bei den sexuellen Vor-

gängen hingegen, wie sie bei vielen Ciliaten ebenfalls vorkommen, vereinigen sich erb-

ungleiche Kerne zu einem neuen Genotypus. Dieser besonders hochentwickelte Mecha-

nismus wird als Konjugation bezeichnet.

Die Voraussetzungen zur Konjugation werden bei Ciliaten durch eine Besonderheit ge-

schaffen, die als ein auffälliges Merkmal im Reich der Protisten gilt: Sie sind im Besitz

zweier unterschiedlicher Kerne, die ihrer Größe entsprechend als Mikro- und Ma-

kronucleus bezeichnet werden (Raikov, 1982); gemäß deren jeweiliger Funktion finden

aber auch die Ausdrücke generativer Kern für den Mikronucleus und vegetativer oder

somatischer Kern für den Makronucleus Verwendung. Während im Makronucleus die

für stoffwechselphysiologische Vorgänge relevanten Gene zumeist stark amplifiziert

vorliegen, enthalten Mikronuclei in der Regel nur das diploide Genom.

Bei Paramecium aurelia spiegelt sich die starke Vervielfachung von Genen in dem im

Vergleich zum Mikronucleus bis zu 500fach höheren makronucleären DNA-Gehalt wi-

der (Freiburg, 1988), wohingegen mit nur einem 20fach höherem DNA-Gehalt der ve-

getative Kern von Paramecium bursaria eine vergleichsweise geringe Amplifizierungs-

rate aufweist (Cullis, 1973).

Der Makronucleus zerfällt und wird im Verlauf der Konjugation resorbiert. Er bildet

sich neu aus der Makronucleusanlage, die nach metagamen Teilungen dem Synkaryon

entstammt. Dieses entsteht durch Verschmelzen der vom jeweiligen Mikronucleus der

Konjugationspartner gebildeten Stationär- und Wanderkerne. Somit ist der Makronu-

cleus ein direkter Abkömmling des Mikronucleus, was bedeutet, daß die oben beschrie-

benen Anreicherungen der Gene erst im Verlauf postkonjugativer Differenzierungen

erfolgen können.

Das differentielle Amplifizieren der an stoffwechselphysiologischen Vorgängen betei-

ligten Gene im Makronucleus (Schwartz, 1978; Schwartz und Meister, 1975) führt da-

zu, daß zumindest bei Paramecium keine echte Polyploidie vorliegt, wie es in frühen

Untersuchungen der Ciliatenkerne oftmals angenommen wurde (Sonneborn, 1947) und

auch in heutiger Zeit noch Erwähnung findet (Preer, 1997).

Einleitung 2

Haploide Gametenkerne sind das Produkt der sexuellen Vorgänge im Verlauf der Kon-

jugation. Sie zieht aber keine direkte Vermehrung nach sich, da sich die Konjuganten

nach Austausch des genetischen Materials wieder voneinander trennen.

Die Zellvermehrung hingegen findet bei Ciliaten nach exakter Duplikation ihres Ge-

noms durch die Kernteilung oder Mitose statt, auf die in der Regel eine Zellteilung

folgt. Wie auch die Konjugation, besitzt die vegetative Vermehrung als Basis den Zell-

zyklus, der die genaue Abfolge von Wachstum, Replikation und Teilung beschreibt.

Viele regulatorische Elemente greifen in den Ablauf des Zellzyklus’ ein, wobei diese

Faktoren sowohl abiotischer als auch biotischer Natur sein können.

Bei Protisten unterliegen Mitosen einem variablen Erscheinungsbild. Während in den

offenen Mitosen der Metazoen spätestens zu Beginn der Prometaphase die Kernhülle

zerfällt, ist in der halboffenen Mitose die Kernhülle weiterhin vorhanden. Durch Lücken

an den Kernpolen treten hier beispielsweise bei Flagellaten Spindelfasern von einem

elektronendicht erscheinenden MTOC in das Cytoplasma aus (Lechtreck und Silflow,

1997).

In geschlossenen Mitosen, die überwiegend bei Ciliaten auftreten und denen im übrigen

ein besonders gestaltetes MTOC fehlt, bleibt die Kernhülle während des gesamten Ab-

laufs der Kernteilung erhalten. Somit ist eine Kompartimentierung in Nucleoplasma und

Cytoplasma auch während der Mitose gewährleistet.

Die vegetative Zellteilung stellt sich bei Paramecium, wie bei allen anderen Ciliaten,

aufgrund ihres Kerndualismus variabler dar, als es bei den meisten Organismen mit nur

einem Nucleus der Fall ist.

Während der Makronucleus im Verlauf der Konjugation degeneriert und erst zu einem

späteren Zeitpunkt aus der Makronucleusanlage neu entsteht, erfährt er in der Mitose

eine Zweiteilung, die als Amitose bezeichnet wird, da ein regelrechter Spindelapparat

nicht ausgebildet wird.

Die Initiation der makronucleären DNA-Synthese, die sogenannte S-Phase, gilt als er-

stes Anzeichen für die bevorstehende Zellteilung bei Paramecium und schließt sich ei-

ner ausgeprägten G1-Phase an. Die Amitose erfolgt unmittelbar nach Abschluß der S-

Phase, eine für den Zellzyklus typische G2-Phase ist nur kurz ausgeprägt oder fehlt völ-

lig (Berger, 1988).

Die im Verlauf der Kernteilung auch lichtmikroskopisch zu beobachtende enorme

Streckung des Makronucleus bedingt eine hantelförmige Gestalt des Kerns. Nach Kon-

Einleitung 3

striktion und Abschnüren im Äquatorialbereich entstehen 2 Makronuclei, deren DNA-

Gehalt in der Regel um 5-10% differiert (Berger und Schmidt, 1978). Lange Zeit war

die Existenz eines makronucleären Teilungsapparates umstritten, jedoch konnte

Schwartz (1957) eine doppelbrechende Substanz im sich teilenden somatischen Kern

nachweisen. Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigen, daß es sich hierbei um

Mikrotubuli handelt, die jedoch nicht die Ausprägung eines typischen Spindelapparates

annehmen.

Die Mitose des Mikronucleus hat bereits begonnen, während der Makronucleus noch

das Stadium der S-Phase durchläuft.

Die Bildung des Spindelapparates kann bei Ciliaten auf mannigfaltige Weise geschehen.

So wachsen in dem Suctor Heliophrya erhardi Mikrotubulibündel aus einem mikronu-

cleären Parakristall aus (Hanke-Bücker, 1992), wohingegen bei Paramecium aurelia

Mikrotubuli zuerst in einer fibrillären Region am Rande des Kerns polymerisieren (Ste-

venson und Lloyd, 1971a). Die Spindelelemente von Paramecium bursaria hingegen

bilden sich monopolar, von einem Kernpol beginnend, aus. Auch das Erscheinungsbild

der Metaphase variiert innerhalb der Ciliaten, indem sich Chromosomen mehr oder we-

niger ausgeprägt im Äquatorialbereich anordnen.

Die Anaphase wird in 2 Teilbereiche unterteilt, die als Anaphase A und B bezeichnet

werden. Während sich in der Anaphase A die Chromosomen unter Verkürzung der Ki-

netochor-Mikrotubuli zu den Kernpolen bewegen, weichen in der Anaphase B die Spin-

delpole auseinander. Der Anaphase A kommt besonders bei Ciliaten nur eine sehr un-

tergeordnete Rolle bei der Chromosomentrennung zu, wohingegen die Anaphase B die-

ser Zellen üblicherweise extrem ausgeprägt ist.

Dem telophasischen Abschnüren der Tochternuclei folgt die Cytokinese des Organis-

mus. Während Flagellaten eine Querteilung durchführen, geschieht die Durchschnürung

der Zelle bei Ciliaten senkrecht zur Längsachse.

Der Bildung eines neuen Oralapparates und sämtlicher damit assoziierter Strukturen

galt seit jeher besondere Aufmerksamkeit. Dieser komplizierte, als Stomatogenese be-

zeichnete Prozeß, umfaßt die Neubildung der Ciliatur und beginnt bei Paramecium be-

reits, wenn sich der Makronucleus noch in der S-Phase befindet (Berger, 1988).

Bei einer Vielzahl von Zelltypen kann die Induktion der Teilung auf einfachem Wege

geschehen. Frühe Untersuchungen von Kalmus (1935) zeigen, daß bereits geringe Tem-

peraturschwankungen von 1-2 °C eine Teilungsaktivität auslösen können.

Einleitung 4

Untersuchungen von Volm (1964) zeigen innerhalb gewisser Grenzen (18-30 °C) ein

temperaturunabhängiges Teilungsverhalten von Paramecium bursaria. Auch die Injek-

tion von Inositoltrisphosphat, ein als sekundärer Botenstoff in eine Vielzahl regulativer

Prozesse involviertes Molekül, besitzt keinen Einfluß auf die Teilung des auch als „grü-

nes Pantoffeltierchen“ bezeichneten Ciliaten (Miwa und Wada, 1995).

Dieses Wimperntierchen wurde erstmals von Ehrenberg 1831 als Loxodes bursaria be-

schrieben, ohne daß der Autor jedoch eine Abbildung veröffentlichte. 1836 folgte die

erste korrekte Beschreibung durch Focke (Zusammenfassung bei Foissner et al., 1994).

Der Protist tritt in freier Natur in einer als Endosymbiose umschriebenen Einheit mit

Grünalgen der Gattung Chlorella auf, welche der Zelle die charakteristische grüne Fär-

bung verleihen.

Obwohl symbiontenfreie Populationen bisher nicht im Freiland beobachtet werden

konnten (Foissner et al., 1994), liegt keine obligate Symbiose vor. Pringsheim (1928)

beschreibt die Züchtung algenfreier Stämme bei auf 30 °C erhöhter Temperatur, Nähr-

salzmangel und guter Fütterung. Reisser (1976b) berichtet von aus P. bursaria isolierten

Chlorella-Algen, die in geeignetem Medium kultiviert werden können.

Als ein weiteres Charakteristikum besitzt der in der Länge im Mittel 110 µm messende

Ciliat einen mit ca. 12 µm auffallend großen Mikronucleus, wohingegen der ellipsoid

geformte Makronucleus mit 30 µm im Vergleich zu anderen Ciliatenkernen eher be-

scheidene Abmessungen aufweist.

Als ein Vertreter der Holotrichia ist Paramecium bursaria mit ca. 60 longitudinalen

Wimpernreihen gleichmäßig bedeckt, nur auf der Ventralseite wird eine mediane Naht

gebildet. Am Hinterende besitzen die Zellen verlängerte und nahezu starre Cilien.

Der ungewöhnliche, birnenförmige und damit polare Bau des Mikronucleus, stellt sich

als besonders auffällig dar. Um so verwunderlicher ist es, daß das Interesse der For-

schung erst relativ spät auf die Untersuchung des Kerns gelenkt wurde. Zwar erfolgten

recht früh Berichte über den Konjugationsverlauf bei Paramecium bursaria (Chen,

1946a; Hamburger, 1904; Maupas, 1889), eine genaue Beschreibung des mikronucleä-

ren Spindelapparates erfolgte jedoch nicht.

Detaillierte Beschreibungen sowohl des Kerns als auch des mitotischen Spindelappara-

tes wurden erst 1964 von Schwartz vorgenommen. Als problematisch bei den lichtmi-

kroskopischen Untersuchungen des Kerns stellten sich die Nahrungsvakuolen und Chlo-

Einleitung 5

rella-Algen heraus, die den Kern oft überlagerten und eine Beobachtung nahezu un-

möglich machten. Durch Isolation des Zellkerns war es dem Autor möglich, genauere

morphologische Betrachtungen durchzuführen, wobei eine MgSO4-Lösung zu gequol-

lenen Chromosomen führte, die eine bessere Beobachtung des Spindelapparates zulie-

ßen. In diesen frühen Untersuchungen erwähnt der Autor ganz allgemein die Existenz

von Spindelfasern, ohne konkret auf deren Beschaffenheit einzugehen.

Erst elektronenmikroskopische Untersuchungen, von Hauser und Beinbrech (1973)

durchgeführt, decken die eigentliche ultrastrukturelle Besonderheit des Mikronucleus

auf: Neben Mikrotubuli im Kern kann erstmals auch die Existenz feinen, filamentösen

Materials nachgewiesen werden.

Nachfolgende Untersuchungen anderer Autoren konnten diese Filamente ebenfalls do-

kumentieren. Bei der Zuordnung der Filamente zu den einzelnen Phasen des Zellzyklus’

kommt es im Verlauf der Veröffentlichungen immer wieder zu sich widersprechenden

Äußerungen (Hauser und Beinbrech (1973) und Schwartz (1976); Schwartz (1976) und

Lewis (1989)).

Einzig in der Existenz von Mikrotubuli im Mikronucleus herrscht bei den oben er-

wähnten Autoren Übereinstimmung, jedoch auch hier nicht bezüglich ihres Auftretens

in einer bestimmten Phase des Zellzyklus’.

Um so erstaunlicher erscheint die Tatsache, daß keine weiteren Untersuchungen bezüg-

lich der Kerne und insbesondere der Natur dieser Filamente in der neueren Literatur zu

finden sind.

Spätere, gezielte ultrastrukturelle Untersuchungen der Kerne, erwähnen die interessante

morphologische Besonderheit des Mikronucleus hinsichtlich der Filamente nicht (Wa-

tanabe, 1997), beschreiben wohl aber die mikronucleären Mikrotubuli.

Mikrotubuli sind röhrenförmige Proteine mit einem äußeren Durchmesser von übli-

cherweise 25 nm, was einem Aufbau aus 13 kreisförmig angeordneten Reihen, den so-

genannten Protofilamenten, entspricht. Protofilamente wiederum werden durch einzeln

hintereinander liegende Tubulin-Moleküle gebildet.

Tubulin kann in vielfältigen polymorphen Zustandsformen auftreten: Die Existenz von

Tubulin-Ringen, Makrotubuli, kristallinen Ausprägungen, helikalen Filamenten und

anderen Erscheinungsformen sind gerade bei Protisten in großer Variationsbreite nach-

gewiesen (Übersicht bei Unger et al., 1990).

Einleitung 6

Wie auch das monomere G-Aktin, ist der Baustein der Mikrotubuli, das hantelförmige

Tubulin, von globulärer Form. Es tritt im Gegensatz zu Aktin vorwiegend als heterodi-

meres Protein auf, dessen Untereinheiten ein Molekulargewicht von jeweils ungefähr 50

kDa besitzen. Sowohl die α- als auch die β-Untereinheit besitzen die Fähigkeit, an einer

bestimmten Stelle GTP zu binden, wobei diese auf der α-Untereinheit als N-Stelle, auf

der β-Untereinheit als E-Stelle bezeichnet wird. GTP bindet nicht-reversibel an die N-

(nonexchangeable) Stelle der α-Untereinheit, ein Austausch kann nicht stattfinden.

Im Gegensatz hierzu ist die Bindung von GTP an die E- (exchangeable) Stelle reversi-

bel und für die Polymerisation der Heterodimere zu Mikrotubuli von Wichtigkeit, wo-

hingegen die Funktion des GTPs an der N-Stelle bislang unbekannt ist (Downing und

Nogales, 1998b).

Die beobachtete dynamische Instabilität (Mitchison und Kirschner, 1984) der Mikrotu-

buli ist die Folge einer verzögerten GTP-Hydrolyse. Wenn ein Mikrotubulus raschem

Wachstum unterliegt, werden Tubulin-Moleküle schneller eingebaut, als das an die E-

Stelle gebundene GTP hydrolysiert werden kann. Dies hat eine GTP- „Kappe“ am Ende

des Mikrotubulus zur Folge. Weil Tubulin-Moleküle mit gebundenem GTP eine höhere

Affinität zueinander besitzen, als zu Molekülen mit gebundenem GDP, ermöglicht die

GTP-Kappe ein weiteres, schnelles Mikrotubuli-Wachstum. Übertrifft hingegen die

Hydrolyse von GTP die Addition von Tubulin-Dimeren, führt dies zu einer Konforma-

tionsänderung der Moleküle und schließlich zum Abbau des Mikrotubulus (Caplow und

Shanks, 1996; Flyvberg et al., 1994).

Die beiden Enden eines Mikrotubulus unterscheiden sich hinsichtlich der Ein- und Ab-

baurate von Tubulinen. Während die schnellwachsende Seite als plus-Ende bezeichnet

wird, ist die langsamwachsende oder schrumpfende Seite das minus-Ende.

Mikrotubuli entstehen in vivo in der Regel nicht frei, sondern sind mit Mikrotubuli-or-

ganisierenden Zentren (MTOCs) assoziiert. Diese schützen die minus-Enden der Mi-

krotubuli vor Abbauprozessen (Kellog et al., 1994).

In den meisten Zellen bestehen MTOCs aus einem Centriolenpaar, das in eine elektro-

nendichte und oftmals fibrilläre Matrix eingebettet ist, die als pericentrioläres Material

(PCM) bezeichnet wird (Brinkley, 1985). Die Centriolen sind in ihrer Struktur nahezu

identisch mit den Basalkörpern, die besonders bei Einzellern als MTOC zur Bildung

von Cilien dienen. Aber auch die Flagellen der meisten Spermien besitzen Basalkörper,

die nach erfolgter Befruchtung als Centriolen für nachfolgende Kernteilungen der Zy-

gote fungieren (Sathananthan et al., 1991).

Einleitung 7

Häufig ist jedoch ein völliges Fehlen von Centriolen zu beobachten. So besitzen höhere

Pflanzen generell keine derartigen MTOCs, sind aber dennoch in der Lage, Mikrotubuli

in mitotischen und meiotischen Teilungen zu nucleieren. Nur das strukturell und im-

muncytochemisch mit dem PCM der Centriolen verwandte, elektronendichte Material

kann nachgewiesen werden. Aus diesem Grunde besteht die Vermutung, daß pericen-

trioläres Material allein die vollständige Potenz besitzt, Mikrotubuli in Teilungsspindeln

zu organisieren (Gould und Borisy, 1977). So werden z.B. die hochkomplexen Mikro-

tubuli-Muster der Axopodien bei centroheliden Heliozoen von einer trilamellaren,

scheibenförmigen Struktur initiiert, ohne daß klassische MTOCs nachzuweisen sind

(Zabolitzky, 1995).

Die Nucleations- und Organisationsfähigkeit des pericentriolären Materials ist bis heute

nur unzureichend verstanden. Untersuchungen weisen eine Fülle von Proteinen im PCM

nach, die dort entweder über den gesamten Zellzyklus, oder aber nur während der Zell-

teilung vorhanden sind (Übersicht bei Kalt und Schliwa, 1993).

Tubuline gelten im allgemeinen als stark konservierte Proteine (Doolittle, 1995) und

werden in den meisten Organismen von mehreren in unabhängiger Kopie existierenden

Genen codiert. Die entsprechenden Genprodukte differieren bezüglich ihrer Aminosäu-

resequenz in den meisten Fällen nicht erheblich. Eine Hypothese besagt, daß die Exi-

stenz von verschiedenen Modifikationen des Tubulins auf genetischer Ebene mit der

Funktion des Tubulins in unterschiedlichen Geweben oder Zelltypen eines Organismus

korreliert (Ludueña, 1993).

Ergänzend hierzu sind eine Reihe von Modifikationen des Tubulins bekannt, die sich

auf posttranslationaler Ebene vollziehen. Sie äußern sich im allgemeinen in hinzuge-

fügten, entfernten oder aber modifizierten Aminosäuren innerhalb oder am Ende des

Tubulinmoleküls und führen, wie auch die Modifikationen auf genetischer Ebene, zur

Bildung unterschiedlicher Mikrotubuli-Klassen.

Während die enzymatischen Vorgänge, die zu diesen Modifikationen führen, detailliert

erforscht sind, ist die exakte Bedeutung der posttranslationalen Umänderungen bislang

nicht verstanden. Mikrotubuli mit posttranslationalen Modifikationen, wie z.B. Tyrosi-

nierung oder Detyrosinierung, weisen ein geändertes Verhalten hinsichtlich ihrer Stabi-

lität auf. Vermutlich sind hierfür aber nicht die Modifikationen an sich verantwortlich,

Einleitung 8

sie dienen vielmehr als ein biochemisches Signal, das indirekt die eigentlichen Ände-

rungen der mikrotubulären Dynamik veranlaßt (Khawaja et al., 1988).

Eine Vielzahl von Mikrotubuli-assoziierten Proteinen (MAPs) binden in vivo an Mi-

krotubuli. MAPs gelten als Modulatoren der Dynamik zellulärer Mikrotubuli, indem sie

vorwiegend die Stabilität erhöhen (Kurz und Williams, 1995) oder die Polymerisation

fördern (Murphy et al., 1977). Manche Proteine hingegen bündeln Mikrotubuli, wie

MAP2 oder τ (Übersicht bei Maccioni und Cambiazo, 1995) und spielen auch bei der

Musterbildung eine Rolle.

Andere MAPs induzieren einen Mikrotubuli-abhängigen Transport und werden als Mo-

torproteine bezeichnet. Als die bekanntesten gelten Dynein, das einen zum minus-Ende

gerichteten Transport ausführt, und das in seiner Bewegung zum plus-Ende gerichtete

Kinesin.

Viele dieser MAPs ähneln sich hinsichtlich ihres strukturellen Aufbaus: Sie besitzen

zwei globuläre Domänen, von denen die eine an Mikrotubuli, die zweite Domäne hin-

gegen an andere zelluläre Komponenten, beispielsweise das Transportgut, bindet. Beide

Domänen sind durch eine längliche Stielregion assoziiert (Walker und Sheetz, 1993).

Die mikrotubuläre Dynamik ist von entscheidender Bedeutung für Kernteilungsvor-

gänge. Die Ausbildung eines Spindelkörpers ist unbedingte Voraussetzung, um Chro-

mosomen ordnungsgemäß zu trennen.

Obgleich eine Fülle von Daten zur Bildung von Mikrotubuli im Rahmen der Mitose

oder Meiose vorliegen, sind Untersuchungen auf diesem Gebiet noch nicht abgeschlos-

sen. Es ist weder genau bekannt, durch welchen Mechanismus Mikrotubuli an den Cen-

trosomen inserieren (Merdes und Cleveland, 1997), noch ist die Bindung an den Kine-

tochorregionen der Chromosomen eindeutig geklärt, obwohl bislang eine Vielzahl von

Centromer-Proteinen charakterisiert werden konnte (Cooke et al., 1997).

Auch die exakte Funktion von Motorproteinen bei der Chromosomensegregation ist

noch nicht hinreichend beantwortet (Compton, 1998; Gaglio et al., 1997).

Selbst die Frage, ob Mikrotubuli die einzigen Cytoskelettelemente darstellen, die an der

Ausbildung der Spindel und Trennung der Chromosomen beteiligt sind, ist weiterhin

offen.

So sind Proteine des Intermediärfilamenttyps regelmäßig im Nucleus lokalisiert, wo sie

der Kernhülle von innen anliegen und diese stützen (Loidl und Eberharter, 1995). Dar-

Einleitung 9

über hinaus berichten vereinzelt Untersuchungen über die Existenz von Intermediärfi-

lament-ähnlichen Bestandteilen in isolierten Spindeln (Rebhuhn und Palazzo, 1988).

Immunfluoreszenzmikroskopische Nachweise von Aktin in der Spindel konnte in eini-

gen Fällen erbracht werden. Nach einer Hypothese wird eine kontraktile Spindelmatrix

vermutet, die mit den Kinetochor-Mikrotubuli interagiert (Übersicht bei Pickett-Heaps

et al., 1996) und aus Aktin bestehen könnte. Auf der Basis immuncytochemischer Un-

tersuchungen konnte in einigen Fällen auch Myosin in den Kernen von Einzellern nach-

gewiesen werden (Hauser et al., 1975).

Vor dem Hintergrund der oben dargelegten Sachverhalte bezüglich der vermuteten

Spindelkomponenten erfolgen die in der vorliegenden Arbeit dargestellten Versuche.

Paramecium bursaria erschien als interessantes Untersuchungsobjekt, da die Mikronu-

clei dieser Zellen Filamente aufweisen, deren Nachweis abhängig vom Zellzyklus zu

sein scheint.

Im Gegensatz zu vielen anderen Objekten lassen sich gerade diese Filamente durch den

Einsatz geeigneter Puffer und Fixierungen elektronenmikroskopisch recht gut darstel-

len. In früheren Untersuchungen verschiedener Organismen können zwar durch immun-

fluoreszenzmikroskopische Methoden Proteine in Spindeln nachgewiesen werden, de-

ren Vorkommen als filamentöse Strukturen im Cytoplasma bekannt ist. Ein elektronen-

mikroskopischer Nachweis dieser Proteine im Kern kann aber in der Regel nicht er-

bracht werden. Im umgekehrten Fall ist zwar der ultrastrukturelle Nachweis von fila-

mentösem Material in Zellkernen möglich, jedoch erfolgte keine immuncytochemische

Charakterisierung.

Das Untersuchungsobjekt zeichnet sich durch eine Reihe weiterer Eigenschaften aus,

die es für die durchgeführten Experimente begünstigen: Der Mikronucleus von Para-

mecium bursaria kann auf relativ problemlosen Weg isoliert werden. Somit ist er Unter-

suchungen zugänglich, die ansonsten auch aufgrund des Epiplasmas unterhalb der Pelli-

cula des Ciliaten nicht oder nur sehr erschwert hätten durchgeführt werden können.

Markierungen mit anti-Tubulin Antikörpern können durchgeführt werden, ohne daß die

Ergebnisse durch Fluoreszenz der Basalkörper und Cilien beeinträchtigt werden. Dar-

über hinaus erweist es sich als günstig, daß die Zellkulturen nahezu Chlorella-frei

gehalten werden können, da diese Endosymbionten Kernisolationen oftmals verunreini-

gen und durch die Eigenfluoreszenz des Chlorophylls die Untersuchungen in der indi-

Einleitung 10

rekten Immunfluoreszenz beeinträchtigen. Der relativ große Mikronucleus erleichtert

hierbei die lichtmikroskopischen Analysen.

Diese Vorteile übertreffen die Nachteile des Untersuchungsobjektes, die in seinem recht

langen Zellzyklus bestehen, der zudem, wie auch bei anderen Paramecien-Arten, nicht

synchronisierbar ist (Curtenaz und Beisson, 1996).

Der schon im Lichtmikroskop erkennbare polare Aufbau des Mikronucleus und das

anfänglich monopolare Auswachsen der Spindel-Mikrotubuli von einem auch morpho-

logisch auffällig gestalteten Kernpol, lassen die Frage nach den mit diesem scheinbaren

MTOC assoziierten Komponenten aufkommen.

Paramecium bursaria ist aufgrund der oben erwähnten Eigenschaften ein geeignetes

Objekt um die Spindelbildung eines Ciliaten zu analysieren. Der Bedeutung und Natur

von Filamenten im Zusammenhang mit der Ausbildung von Mikrotubuli soll das beson-

dere Interesse der Untersuchungen in dieser Arbeit gewidmet sein.

Material und Methoden 11

2 Material und Methoden

2.1 Kulturhaltung Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden zwei verschiedene Kulturen des holotri-

chen Ciliaten Paramecium bursaria verwendet. Die Wildtyp-Kultur, die ursprünglich

aus einem Teich bei Tübingen isoliert worden ist (Prof. Grell, Tübingen), wurde ebenso

wie die weiße Kultur von Prof. Machemer (Bochum) zur Verfügung gestellt. Da es sich

bei der Kultur nicht um einen Klon handelt, kann dem Organismus keine Paarungstyp-

und Syngenzugehörigkeit zugewiesen werden.

2.1.1 Kulturmedium

Für das Wachstum der Tiere erwies sich Pringsheim-Lösung (Pringsheim, 1963) als

günstigstes Nährmedium; Versuche mit Tafelwasser (Volvic) oder Cerophyl-Medium

(Fa. Sigma) stellten sich als weniger geeignet heraus.

Pringsheim-Lösung: 2,5 ml 0,4 % MgSO4 ⋅ 7 H2O

2,5 ml 0,4 % Na2HPO4 ⋅ 2 H2O

2,5 ml 4 % Ca(NO3)2 ⋅ 4 H2O

2,5 ml 0,52 % KCl

2,5 ml 1,2 % NH4NO3

5 ml Sørensen Phospat–Puffer 151 M, pH 7.2

5 ml Erdabkochung

ad 1 l H2O

151 M Phosphatpuffer pH 7,2 nach Sørensen (1909):

Stammlösung A: 151 M KH2HPO4–Lösung

Stammlösung B: 151 M Na2HPO4–Lösung

100 ml Pufferlösung wurden durch Zugabe von 27,4 ml

Lösung A und 72,6 ml Lösung B erzeugt.

Erdabkochung: 300 g vorzugsweise sandhaltige Heideerde wurden in 2 l H2O 45 min

autoklaviert und anschließend abfiltriert. Durch nochmaliges Autoklavie-

ren wurde die Lösung erneut sterilisiert.


2.1.2 Kulturhaltung von grünen Paramecium bursaria mit Chlorella als Endo-symbionten

Die dem Erscheinungsbild in freier Natur entsprechenden grünen Paramecien wurden

bei einem Hell-Dunkel–Rhythmus von 12h:12h in einem Lichtschrank der Fa. WTB

Binder (KBW 240) bei konstant 18°C in 250 ml-Erlenmeyerkolben kultiviert. Einmal

wöchentlich fand die Fütterung der Zellen mit 1 ml frischer Chlorogonium–Suspension

statt.

Zur Gewinnung einer dichten Algensuspension wurden Chlorogonien (kultiviert in De-

Haller-Medium) bei 3000 Upm abzentrifugiert (Heraeus Biofuge primo) und der Über-

stand verworfen. Das so erhaltene Pellet wurde in Pringsheim-Lösung aufgenommen (s.

Kapitel 2.1.1), worauf sich ein weiterer Zentrifugationsschritt bei 3000 Upm anschloß.

Nach dreimaliger Wiederholung der Zentrifugation und Resuspension waren die Algen

zur weiteren Verwendung ausreichend gereinigt.

DeHaller-Medium: 3 g Natriumacetat

3 g Proteose-Pepton

6 g Bacto-Trypton

6 g Hefe-Extrakt (Fluka)

6,75 ml Erdabkochung

ad 3 l H2O, autoklavieren

2.1.3 Kulturhaltung von Endosymbionten-„freien“ weißen Paramecium bursaria

Das bei den weißen Paramecien, bedingt durch die nahezu vollständige Reduktion der

Endosymbionten, aufgetretene Kohlenhydratdefizit, (Reisser, 1976b) machte eine

zweimalige wöchentliche Fütterung mit 1 ml Chlorogonien-Suspension notwendig. Die

hierbei zwangsläufig erfolgende Exposition mit Licht wurde durch die Fütterung in ei-

nem abgedunkelten Raum so gering wie möglich gehalten, da bei keiner der unter Ka-

pitel 2.1.3.1 beschriebenen Methoden alle endosymbiontischen Algen vollständig ab-

starben. Zumindest ein Teil der Chloroplasten von Chlorella blieb in einer Leukoform

erhalten, die bei entsprechender Lichtexposition schnell wieder in photosynthetisch ak-

tive grüne Chloroplasten überging. Um diesen Zustand zu umgehen, wurden die Tiere

bei Raumtemperatur (RT) in Plastikpetrischalen (∅ 9cm, Firma Greiner, Sarstedt oder

Waldeck) im Dauerdunkel gehalten.


2.1.3.1 Erzeugung der Endosymbionten-„freien“ Kulturen Zur effektiven Züchtung nahezu algenfreier Paramecium bursaria bewährte sich die

folgende Methode: Die Tiere wurden 2 Wochen im Dauerdunkel bei gleichzeitigem

Futterentzug kultiviert, wobei dem Kulturmedium zusätzlich 5 ng/ml Cycloheximid

zugegeben wurde.

Nach Ablauf dieser Zeit erfolgte ein gründliches Waschen der nun farblosen Kulturen

mit Pringsheim-Lösung ohne Antibiotikumzusatz. Eine Behandlung mit 3-(3,4-Dich-

lorphenyl)-1,1-dimethylharnstoff (Reisser, 1976a) erwies sich im Vergleich zu obiger

Methode als weniger effektiv.

2.1.4 Anreicherung der Kulturen

Um eine für die nachfolgenden Untersuchungen ausreichende Zellzahl zu erlangen,

wurden die Organismen in den meisten Fällen angereichert. Hierzu erfolgte eine 5-mi-

nütige Zentrifugation der Tiere entweder in einer Heraeus Sepatech Labofuge A oder in

einer Hettich Universal 32–Tischzentrifuge unter Verwendung von 15, 25 oder 50 ml

spitzkonischen Zentrifugengläsern bei 1000 Upm.

2.2 Lichtmikroskopie

2.2.1 Isolation der Mikronuclei

Eine lichtmikroskopische Untersuchung der Mikronuclei war nur dann möglich, wenn

die Kerne im isolierten Zustand vorlagen. Je nach gewünschtem Grad der Reinheit ka-

men verschiedene Methoden der Kernisolation zum Einsatz:

Standardmethode (Hauser und Beinbrech, 1973):

Die Ciliaten wurden wie in Kapitel 2.1.4 beschrieben angereichert. Danach er-

folgte eine Resuspension des Pellets in ca. 5 ml Kulturlösung, so daß ein 10 ml

Zentrifugenröhrchen halb gefüllt war. Anschließend wurden die Tiere mit der

Schwingsonde (∅ 4 mm) eines Braun Sonic 125 Ultraschallhomogenisators be-

schallt. Die Dauer betrug – bei gleichmäßiger Auf- und Abwärtsbewegung des

Zentrifugenglases während der Beschallung – 1,5 min bei niedrigster Stufe und

anschließend 30s auf Stufe 30. Es schloß sich eine 10minütige Zentrifugation bei

140 g zur Pelletierung der Zellkerne an.


Lichtmikroskopische Phasenkontrast-Untersuchungen der Mikronuclei konnten

an dieser noch durch Makronuclei und Trichocysten verunreinigten Isolation

problemlos durchgeführt werden.

Kernisolation mit hoher Reinheit (kombiniert nach Skoczylas und Soldo (1975); Cum-

mings (1972); Keryer et al. (1990)):

Immunfluoreszenzmikroskopische Untersuchungen erforderten einen höheren

Reinheitsgrad der Kerne. Um eine Verunreinigung mit Zoochlorellen auszu-

schließen, fanden generell weiße Kulturen Verwendung, deren Kerne in Anleh-

nung an Protokolle verschiedener Autoren wie folgt isoliert wurden:

Nachdem das Kulturmedium der Zellen gegen PHEM-Puffer (Schliwa und Van

Blerkom (1981) ausgetauscht wurde, erfolgte eine erste Isolation der Mikronu-

clei analog dem unter „Standardmethode“ beschriebenen Verfahren. Das in einer

kleinen Menge PHEM-Puffer resuspendierte Kernpellet wurde anschließend auf

einen diskontinuierlichen Saccharose-Gradienten (1.4 M, 1.65 M, 1.82 M, 2.1

M, alle Lösungen in PHEM-Puffer angesetzt) aufgetragen und für 30 min bei

13.000 Upm (Sorvall RC–5B, Rotor SS 34) pelletiert. Alternativ zu den verwen-

deten Saccharose-Konzentrationen wurde zu einem späteren Zeitpunkt der Ar-

beit ein Percoll–Gradient (Fa. Sigma-Aldrich) verwendet. Die nach diesen Me-

thoden erhaltenen Mikronuclei wiesen nur noch einen geringen Grad an Verun-

reinigungen auf und eigneten sich vorzüglich zu Untersuchungen mit Hilfe der

indirekten Immunfluoreszenz. Wurde das erhaltene Pellet nochmals auf einen

Saccharose- bzw. Percoll-Gradienten von 0.5 M, 0.75 M, 1.0 M aufgetragen und

für 5 min bei 600g zentrifugiert, so wies das erhaltene Kernpellet einen noch ge-

ringeren Grad an zellulären Verunreinigungen auf, wobei sich allerdings die

Menge der isolierten Kerne erheblich verringerte. So gewonnene Nuclei wurden

allein für gelelektrophoretische Untersuchungen verwendet (s. Kapitel 2.5.1.2).

PHEM-Puffer: 60 mM Pipes

25 mM Hepes

2 mM MgCl2

pH 7,2 ad H2O


2.2.2 Phasenkontrastmikroskopie

Phasenkontrastmikroskopische Untersuchungen der Zellen wurden an einem Zeiss Pho-

tomikroskop II, ausgerüstet mit Planapochromatobjektiven bzw. einem mit Plan-

Neofluarobjektiven versehenen Zeiss Axiophot 1 durchgeführt. Die photografische Do-

kumentation erfolgte auf Negativ-Schwarz/Weiß-Film Tmax 100 der Marke Kodak, bei

Farbaufnahmen fand der Diapositivfilm Provia 100 des Herstellers Fuji Verwendung.

2.2.2.1 Lebenduntersuchungen Um lichtmikroskopische Vitaluntersuchungen der Zellen über einen längeren Zeitraum

durchführen zu können, wurde eine Inkubationskammer angefertigt: Auf einen zuvor

mit einem Ring aus inerter, mittelviskoser Silikonpaste (Baysilon der Firma Bayer, Le-

verkusen) versehenen Objektträger wurden die Untersuchungsobjekte in entsprechendes

Medium gegeben. Durch Auflegen eines Deckglases passender Größe wurde die Paste

dichtschließend zwischen den Glasflächen verteilt, so daß eine Beobachtung und Do-

kumentation der Zellen über einen längeren Zeitraum ohne eine Beeinträchtigung ihrer

Vitalität möglich war.

2.2.3 Fluoreszenzmikroskopie

Die fluoreszenzmikroskopische Untersuchung der Mikronuclei an intakten Zellen barg

einige Schwierigkeiten, da die – beim Einsatz entsprechender Antikörper – starke Fluo-

reszenz von Cilien und Basalkörpern des holotrichen Ciliaten die Auswertung der

Kernmarkierung erschwerte. Aus diesem Grunde fanden generell nur Kerne Verwen-

dung, die nach der in Kapitel 2.2.1 beschriebenen Methode isoliert wurden.

Durch Adhäsion auf mit Alcianblau-beschichteten Deckgläsern konnte ein Verlust der

Kerne während der verschiedenen Inkubationsschritte minimiert werden.

Um die Objekte vor dem Ausbleichen zu schützen, wurden sie nach der Immunmarkie-

rung mit der Präparatseite nach unten auf einen mit anti-Fading–Puffer versehenen Ob-

jektträger gegeben und mit Dentalwachs umrandet. Als anti-Fading–Substanz diente p-

Phenylendiamin, welches im Puffer enthalten war. Eine Alternative hierzu bot das in

wenigen Stunden aushärtende Einbettungsmittel Immu-Mount (Fa. Shandon, Pittsburgh,

USA), das keiner weiteren Antiquenchzusätze bedurfte. Alle so hergestellten Immun-

fluoreszenz-Präparate wurden lichtgeschützt je nach Lagerzeit bei 4°C oder -20°C ver-

wahrt.

Die Auswertung der Präparate wurde an einem Zeiss Photomikroskop II, versehen mit

einem Epifluoreszenzkondensor III RS oder einem Zeiss Axiophot 1, ausgestattet mit


einer Quecksilberdampfleuchte HB0 100, vorgenommen. Die entsprechenden Filter-

kombinationen zur Emittierung der den jeweiligen Fluoreszenzfarbstoffen entsprechen-

den Wellenlängen sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.

Fluoreszenzfarbstoff Erregerfilter,

Anregungs-λ [nm]

Farbteiler Langpaß-Sperrfilter,

Emmisions-λ [nm]

Cy2, DTAF, FITC BP 450-490 (blau) FT 510 LP 520 (grün)

TRITC, Rhodamin BP 546/12 (grün) FT 580 LP 590 (rot)

Bisbenzimid G 365/12 (UV) FT 395 LP 420 (blau)

Tabelle 1: Aufstellung der im Zusammenhang mit den jeweiligen Fluoreszenzfarbstoffen not-wendigen Filterkombinationen sowie der daraus resultierenden emittierten Wellenlängen und Spektralfarben.

Beide Mikroskope verfügten sowohl über Neofluar- als auch über planapochromatische

40× und 63× Ölimmersionsobjektive, wobei die Ergebnisse unter Verwendung des

Schwarz/Weiß Photomaterials Kodak T-Max 400 bzw. für Farbaufnahmen Fuji Sensia

400 dokumentiert wurden.

Um eine genauere räumliche Verteilung von Tubulinmodifikationen im Kern darstellen

zu können, wurden die Nuclei am konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop der Marke

Leica CLSM, ausgestattet mit einem Argon-Krypton-Laser, untersucht. Die Aufnahmen

wurden unter Verwendung eines 50× Objektives 1.00 WT durchgeführt.

Zur Dokumentation wurden die digitalen Bilder auf CD-R gespeichert. Bei dem dabei

verwendeten Bildverarbeitungsprogramm handelte es sich um Scan magic in der Ver-

sion 1.1. Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit gezeigten Ergebnisse wurden auf ei-

nem Farbdrucker ausgegeben.

Alcianblau: 0,1 % (w/v) Alcianblau 8GX

3 % (w/v) Essigsäure in Ethanol

Anti Fading-Puffer (Johnson und Nogueira Araujo, 1981):

0,1 g p-Phenylendiamin

9 ml PBS

90 ml Glycerin (87%)

pH 8.5, mit 0.5 M NaHCO3 eingestellt und mit PBS ad 100 ml aufgefüllt


PBS-Puffer nach Dulbecco, Ca2+–frei (1954): 8 g NaCl

1,43 g Na2HPO4 × 2 H2O

0,2 g KH2PO4

0,2 g KCl

0,1 g MgCl2 × 7 H2O

pH 7.2, ad 1 l H2O

2.2.3.1 Aktin–Markierung bei isolierten Zellkernen Phalloidin, ein Alkaloid des grünen Knollenblätterpilzes Amanita phalloides, bindet

spezifisch an filamentöses Aktin (F-Aktin) und verhindert so dessen Depolymerisation

(Wehland et al., 1980). In den durchgeführten Versuchen wurde mit dem Fluoreszenz-

farbstoff Rhodamin konjugiertes Phalloidin eingesetzt, um die Lokalisation von Aktin-

filamenten im Kern zu ermöglichen. Durch die Wahl von geeigneten Fixierungsbedin-

gungen konnte eine mögliche Depolymerisation des fragilen F-Aktin weitgehend ausge-

schlossen werden (Vitha et al., 1997).

Die nach Kapitel 2.2.1 isolierten Mikronuclei wurden auf Alcianblau-beschichtete

Deckgläser aufgebracht und für 20 min in 4% (w/v) p-Formaldehyd, gelöst in PEM-

Puffer, fixiert. Die Kerne wurden bei RT für 10 min in -20°C kaltes, reines Aceton

überführt, worauf sich eine 45-minütige Inkubation mit Rhodamin-konjugiertem Phal-

loidin (RLP) in einer feuchten Kammer anschloß. Zur Ermittlung der optimalen Kon-

zentration des RLP wurden Verdünnungen von 1:50 bis 1:500 in PBS angewendet, wo-

bei sowohl vor Beginn als auch nach Ende der Inkubation die Kerne 3 × 10min in PBS

gespült wurden.

Die Lagerung der RLP–Stammlösung (3,3 µM in Methanol), erfolgte bei -20°C.

PEM-Puffer: 100 mM Pipes

5 mM EGTA

2 mM MgCl2 × 6 H2O

0,2 % (w/v) Saponin

pH= 6,8 ad H2O


2.2.3.2 Bisbenzimid-Färbung isolierter Zellkerne Um die Verteilung der mikronucleären DNA im Zusammenhang mit der Verteilung von

Tubulin im Kern untersuchen zu können, schloß sich an eine Antikörper-Markierung

der Nuclei in der Regel eine Inkubation mit Bisbenzimid an.

Bisbenzimid lagert sich an vorwiegend A/T-reiche Sequenzen der DNA an und kann

somit einen direkten Aufschluß über deren räumliche Lokalisation geben. Es eignet sich

aufgrund einer Anregungswellenlänge von 365 nm zu Doppelmarkierungen mit han-

delsüblichen Zweitantikörpern, deren Fluoreszenzkonjugat in der Regel eine längere

Anregungswellenlänge benötigt.

Zusätzlich war es möglich, durch fluoreszenzmikroskopische Intensitätsmessungen der

markierten mikronucleären DNA einen Rückschluß auf die vorhandene relative DNA–

Menge zu ziehen und somit die mitotische Phase, in der sich der Kern innerhalb des

Mitose-Zyklus‘ befand, zu ermitteln. Zur genauen Messung wurde ein an das Zeiss-

Axiophot (s. Kapitel 2.2.3) angeschlossenes Mikroskop–Photometer MSP-20 verwen-

det. Ringblenden wurden so in den Strahlengang des Mikroskops eingebracht, daß eine

Verfälschung des Meßergebnisses bedingt durch störende Fremdstrahlung benachbarter

Kerne ausgeschlossen werden konnte.

Bisbenzimid (Synonym: Hoechst 33342; Pinset und Montarras, 1994 )

Z

5

p

2D

u

d

N

f

u

Stammlösung: 1mg/ml Bisbenzimid wurden in Ethanol gelöst und für 5 min. bei 3500g

zentrifugiert. Der Überstand wurde lichtgeschützt bei 4°C gelagert.

ur Markierung der Kerne wurden 150 µl 1µg/ml Bisbenzimid-Stammlösung für genau

s auf die an Deckgläser adhäsierten Kerne gegeben und danach wie im folgenden Ka-

itel beschrieben, ausgewaschen.

.2.3.3 Indirekte Immunfluoreszenz ie Untersuchung der Kerne bezüglich ihrer posttranslationalen Tubulinmodifikationen

nd die biochemische Charakterisierung des sogenannten Primärpols erfolgte mit Hilfe

er indirekten Immunfluoreszenz (IIF).

ach der im Kapitel 2.2.3 beschriebenen Adhäsion der Zellkerne auf Deckgläser er-

olgte eine Fixierung der Proben. Hierbei erwiesen sich die gebräuchlichen Methanol-

nd Acetonfixierungen für die Struktur- und Antigenizitäterhaltung als weniger günstig.


Gute Ergebnisse hingegen wurden mit einer Behandlung der Nuclei in Anlehnung an

Keryer et al. (1989) erlangt: Die Kerne wurden für 1 h mit 2% (w/v) p-Formaldehyd,

gelöst in PHEM-Puffer bei Raumtemperatur fixiert. In einigen Fällen wurde zusätzlich

0,5% Glutardialdehyd zur Fixierlösung gegeben, um ein eventuelles Auswaschen von

Proteinen zu vermeiden. Die fixierungsbedingte Autofluoreszenz machte es in diesen

Fällen notwendig, die Kerne anschließend für 20 min in 1 mg/ml NaBH4 in PHEM-Puf-

fer zu inkubieren.

Hierauf erfolgte in allen Fällen ein 10-minütiges Spülen der Kerne in modifiziertem

PBS (PBSmod), worauf sich ein zweiter Spülgang in PBSmod + 3% Rinderserumalbumin

(RSB) anschloß. Nach nochmaligem Überführen der Nuclei in PBSmod wurde die Er-

stantikörperinkubation in einer feuchten Kammer bei 37°C für mindestens 45 min vor-

genommen. Daraufhin erfolgte ein dreimaliges Waschen der Kerne und die Inkubation

mit dem entsprechenden Zweitantikörper über einen Zeitraum von ebenfalls mindestens

45 min bei 37°C in einer feuchten Reaktionskammer. Im Anschluß konnte optional eine

Bisbenzimid-Markierung (s. Kapitel 2.2.3.2) vorgenommen werden. Unabhängig davon

wurden die Präparate nach dreimaligem PBS-Spülen in anti-Fading-Puffer eingeschlos-

sen.

PHEM Puffer (Schliwa und Van Blerkom, 1981):

60 mM PIPES

25 mM HEPES

10 mM EGTA

5 mM MgCl2

pH = 6,9 ad H2O

Fixierlösung für die IIF (Wansink et al., 1994): 1 g p-Formaldehyd

50 ml PHEM-Puffer

Das p-Formaldehyd wurde auf 65 °C unter ständigem Rühren erwärmt. Durch max. fünfma-

lige Zugabe von 10 µl 1 N NaOH–Aliquots löste sich die Festsubstanz. Nach Abkühlung

wurde der pH auf 7,4 eingestellt

PBSmod (Keryer et al., 1989): 0,2 % (v/v) Tween 20

10 mM EGTA

pH 6,9 ad PBS-Puffer


Die Darstellung der räumlichen Verteilung verschiedener Tubulinmodifikationen und

die Charakterisierung des Primärpols erfolgte unter Verwendung folgender Antikörper:

Verdünnung Antikörper Typus Ursprungs-

organismus Antigen Spezifität WB IIF Referenzen

Anti-Tubulin IgG Kaninchen Tubulin aus

Hühnchen-Em-bryonen

α- und β-Tu-bulin 1:100 1:100 –

YOL 1/34 IgG2a Ratte Hefe-Tubulin α-Tubulin 1:100 1:100 Kilmartin et al., 1982

27C2 IgM Maus Tyr-Peptid Tyr-α-Tubulin 1:10 1:10 Wehland und Weber, 1987

YL 1/2 IgG Maus Tyr-Peptid Tyr-Tubulin 1:5 unverdünnt Wehland et al., 1984

TUB–1A2 IgG3 Maus

synthetisches Oligopeptid

entspr. C-Ter-minus α-Tubu-

lin

Tyr-Tubulin 1:100 1:100 Kreis, 1987

ID5 IgG1 Maus Glu-Peptid Glu-α-Tubulin 1:10 1:10 Wehland und Weber, 1987

anti-E ? Kaninchen Glu-Peptid Glu-α-Tubulin 1:250 – Xiang und MacRae, 1995

6–11B1 IgG2b Maus Seeigel-Tubulin acetyliertes α-Tubulin 1:100 1:50 Piperno und Fuller,

1985

3A5 IgG Maus Drosophila α-Tubulin

acetyliertes α-Tubulin – 1:20

Fukushige und Siddi-qui, 1995;

LeDizet und Piperno, 1986

Nr. 11 ? Maus β-Tubulin β-Tubulin 1:50 1:50 Koonce et al., 1986

WA3 ? Maus Rinderhirn β-Tubulin β-Tubulin 1:10 1:10 –

2-28-33 IgG1 Maus Seeigelspermi-en- Axoneme β-Tubulin 1:100 1:100 Siddiqui et al., 1989

anti Peptid G polyklonal Kaninchen


entpr. β-Tubulin Sequenzen der

GTP-Bindestelle

β-Tubulin 1:100 1:100 Pèrez et al., 1997

CTR 210 IgM Maus humane Lym-phoblasten-Centrosome

Centrosome, 1:20 1:20 Bailley et al., 1988 ; Keryer et al., 1990

anti γ–Tubulin polyklonal Kaninchen


entspr. konser-vativer γ-Tubu-

lin Sequenz

γ-Tubulin 1:100 1:20 Joshi et al., 1992

anti-Aktin ? Kaninchen Aktin Aktin 1:100 1:5 –

Anti-Centrin ? Maus Centrin aus

Spermatozopsis similis

Centrin 1:10 1:10 Salisbury und Baron, 1984, Salisbury und

Baron, 1988

Dynein 70.1 IgM Maus

Cytoplasm. Dynein aus Gehirn von


mittelschwere Kette des cyto-plasm. Dyneins

(~ 70 kD)

1:100 1:100 Steuer et al., 1990 ; Wordeman et al.,

1991


Verdünnung Antikörper Typus Ursprungs- organismus Antigen Spezifität WB IIF Referenzen

Dynein 440.4 IgG2a Maus

Cytoplasm. Dynein aus Gehirn von


schwere Kette des cytoplasm. Dyneins (440

kD)

1:100 1:100 Steuer et al., 1990 ; Wordeman et al.,

1991

Dynein C 18 IgG, polyklonal Ziege synthetisches

Oligopeptid cytoplasm.

Dynein 1:100 1:100 –

Tabelle 2: Übersicht der in der IIF verwendeten Erstantikörper

Die Markierung der Erstantikörper erfolgte mit folgenden Fluorochrom-konjugierten

polyklonalen Sekundärantikörpern: polyklonaler Zweit-Ak Typus Ursprungsor-

ganismus gegen Konju-gat

adsorbiert ge-gen

Verdün-nung

Dianova 112-015-062 IgG (H+L) Ziege Ratte IgG (H +L) DTAF Mensch, Rind, Pferd 1:50

Dianova 115-015-062 IgG (H+L) Ziege Maus IgG (H+L) DTAF Mensch, Rind, Pferd 1:50

Dianova 115-225-003 IgG (H+L) Ziege Maus IgG (H+L) Cy2 – 1:50

Sigma F-0511 IgG (H+L) Ziege Kaninchen IgG (H+L) FITC Mensch 1:50

Dianova 111-025-144 IgG (H+L) Ziege Kaninchen IgG (H+L) TRITC Mensch, Maus,

Ratte 1:50

Dianova 112-025-068 IgG (H+L) Ziege Ratte IgG (H +L) TRITC Mensch, Rind, Pferd 1:50

Sigma F-2016 IgG (H+L) Kaninchen Ziege FITC Mensch 1:50

Dianova 115-015-100 IgG (H+L) Ziege Maus IgG (H+L) DTAF Mensch, Rind, Pferd, Ratte 1:50

Tabelle 3: Übersicht der in der IIF verwendeten Zweitantikörper

2.3 Mikrotubuli-beeinflussende Substanzen Die Auswirkungen verschiedener Mt-beeinflussender Substanzen auf die Teilungsrate

sowie auf die Struktur des Kerns der Zellen wurde untersucht.

Grundsätzlich erfolgte eine erste Kontrolle der Paramecien nach der Inkubationszeit am

Lichtmikroskop bzw. der Stereolupe. Zur Aufklärung der mikronucleären Struktur fand

das Transmissions-Elektronenmikroskop Einsatz.

2.3.1 Mikrotubuli-stabilisierende Agenzien

2.3.1.1 Taxol Taxol, ein aus der pazifischen Eibe gewonnenes Diterpen, wurde aufgrund seiner gerin-

gen Wasserlöslichkeit in DMSO als 10mM–Stammlösung bei -20°C aufbewahrt, wobei

erst kurz vor Gebrauch die entsprechende Konzentration mit Kulturmedium eingestellt


wurde. Ein Einfluß des Dimethylsulfoxid auf die Taxolwirkung konnte ausgeschlossen

werden, da es im Rahmen der unter Kapitel 2.3.2.1 ausgetesteten Konzentration lag.

2.3.1.2 D2O Paramecium bursaria wurde für bis zu 48 h in 70% D2O (Deuteriumoxid), verdünnt mit

Kulturmedium, inkubiert. Um eine dem reinen Kulturmedium entsprechende Minerali-

enkonzentration zu gewährleisten, wurde eine entsprechend konzentrierte Pringsheim-

Lösung verwendet. Die Lagerung des D2O erfolgte bei RT in lichtgeschützten Flaschen.

2.3.2 Mikrotubuli-destabilisierende Agenzien

2.3.2.1 Nocodazol Nocodazol (MWG 301,3) wurde als Stammlösung der Konzentration 10 mg/ml in

DMSO bei 4°C gelagert und vor der Anwendung bis auf eine maximale Konzentration

von 30 µg/ml mit Kulturmedium verdünnt. Um einen Einfluß des DMSO auf die erhal-

tenen Ergebnisse ausschließen zu können, wurden in einem Kontrollversuch Tiere mit

der 10-fach erhöhten Konzentration an DMSO inkubiert. Hierbei ließen weder licht-

noch elektronenmikroskopische Untersuchungen eine Abnormität der Kerne erkennen.

Alle beobachteten Effekte sind somit allein auf die Wirkung des Nocodazols zurückzu-

führen.

2.3.2.2 Colchicin Colchicin (MWG 399,4), ein Alkaloid der Herbstzeitlosen (Colchicum autumnale) wur-

de bei RT gelagert und kurz vor der Inkubation der angereicherten Zellen auf Kon-

zentrationen zwischen 5 µM und 10 mM mit Kulturmedium verdünnt. Die Untersu-

chung der Zellen erfolgte in Blockschälchen, die bei längeren Inkubationszeiten mit

Hilfe eines Glasdeckels, dessen Rand zuvor mit Silikon versehen wurde, dicht ver-

schlossen werden konnten.

2.4 Transmissions-Elektronenmikroskopie

2.4.1 Separation von Teilungszellen

Aufgrund der relativ niedrigen Teilungsrate von Paramecium bursaria mußte eine Se-

parierung der Teilungszellen erfolgen, um eine effektive elektronenmikroskopische

Auswertung der Mitose zu ermöglichen. Da früheste Kernteilungsstadien des Ciliaten

nach äußeren Merkmalen der Zelle nicht zu unterscheiden waren, spätere jedoch sehr

wohl, fanden zwei unterschiedliche Methoden Verwendung:


Die 24 h vor der Isolation gut gefütterten Kulturen wurden angereichert und in ein Rea-

genzglas gegeben, das am unteren Ende mit einem Ablaufhahn versehen war. Die Zel-

len wurden mit 1 ml Ferritin–beschichteter Latexkugeln (Fok et al., (1996) des Durch-

messers 1µm (Fa. Seradyn, Indiana, USA) versetzt und darin für 10 min inkubiert. An-

schließend wurde ein das Reagenzglas dicht umschließender, ringförmiger Elektroma-

gnet am Gefäß befestigt und eingeschaltet. Im Anschluß an eine kurze Wartezeit konn-

ten diejenigen Zellen, die bedingt durch die bereits eingeleitete Stomatogenese in ihrer

Nahrungsaufnahme eingeschränkt waren und keine magnetischen Latexkugeln inge-

stiert hatten, vorsichtig abgelassen werden. Die anschließende Kontrolle des Durchflus-

ses unter der Stereolupe (Wild M5, Heerburg, CH) zeigte ein höheres Maß an Zellen,

die bereits eine Teilungsfurche ausgebildet hatten – was einem späten Kernteilungssta-

dium entsprach – die dann mit Hilfe einer fein ausgezogenen Pasteurpipette separiert

und einzeln eingebettet werden konnten.

Zur Untersuchung frühester Mitosestadien wurde der Umstand ausgenutzt, daß P. bur-

saria sich zu diesem Zeitpunkt durch eine eher taumelnde Schwimmweise auszeichnet

(Ehret und Powers, 1955). Zugleich besitzen die Zellen ein galvanotaktisches Verhalten

(Verworn, 1889; Machemer, 1988), welches sich dahingehend äußert, daß die Zellen bei

angelegter Gleichspannung in Richtung der Kathode schwimmen und dort akkumulie-

ren.

Zur Durchführung der Separierung wurden 2 Platindrähte an den jeweils gegenüberlie-

genden Seiten mit Dentalwachs an einem Blockschälchen befestigt, das anschließend

mit einer angereicherten Paramecium-Kultur versehen wurde. Die Tiere wurden kurz-

fristig einer Spannung zwischen 5-15 V ausgesetzt, die über ein handelsübliches Netz-

teil stufenlos reguliert werden konnte. Der Stromfluß wurde hierbei auf 30 mA be-

grenzt. Nach einer kurzer Wartezeit, die je nach angelegter Spannung maximal eine

Minute betrug, konnten diejenigen Zellen, die kein galvanotaktisches Verhalten aufwie-

sen, mit einer Pasteurpipette abgesammelt und eingebettet werden. Zu jedem Zeitpunkt

des Versuches erfolgte eine optische Kontrolle mit Hilfe der Stereolupe.

2.4.2 Standard-Fixierung

Elektronenmikroskopisch untersucht wurden Tiere, die entweder in normaler Kulturlö-

sung, oder aber in einer der im Kapitel 2.3 beschriebenen Substanzen inkubiert wurden.

Die Fixierung erfolgte für eine Stunde nach der Methode von Hauser und Beinbrech

(1973) in 2,5 % Glutardialdehyd mit 0,025 M s-Collidinpuffer (pH 7,2), der 0,02 mM

Sucrose enthielt. Nach 3 × 30minütigem Waschen im gleichen Puffer wurde mit 1%


OsO4 in Collidinpuffer nachfixiert, woraufhin sich ein weiterer Waschgang von 3 × 10

min anschloß.

Alle zum Austausch der Lösungen notwendigen Zentrifugationsschritte wurden entwe-

der wie in Kapitel 2.1.4 beschrieben oder in einer regelbaren Eppendorf-Tischzentrifuge

(Modell 5415) bei 2000 Upm vorgenommen.

2.4.3 Entwässerung und Standard-Einbettung in Epoxidharz (EPON)

Das Entwässern und Einbetten der Zellen erfolgte in Anlehnung an die von Luft (1961)

beschriebene Methode, wobei sowohl die Austauschzeiten als auch die Zusammenset-

zung des Epoxidharzes verändert wurden.

Eine Dehydrierung der Zellen wurde für jeweils 10 min über eine aufsteigende Ethanol-

reihe von 50%, 70%, 90%, 96% und 2 × 100% vorgenommen. Als Mediator für das

Epoxidharz diente Propylenoxid, in welchem die Zellen anschließend für 2 × 3 Minuten

inkubiert wurden. Hierauf schloß sich ein stufenweiser Austausch des Propylenoxids

gegen Epoxidharz wie folgt an:

Epon / Propylenoxid Zeit

1+3 ½ Stunde

1+1 1 Stunde

3+1 1½ Stunden

reines Epon 12 h

Harte Eponmischung: 22,2 ml Glycidether 100

7,5 ml DDSA

15,6 ml MNA

0,9 ml DMP 30

Die Präparate wurden anschließend in Beem-Kapseln überführt und in einer regelbaren

Eppendorf-Tischzentrifuge bei 4000 Upm abzentrifugiert.

Die vollständige Polymerisation des Epoxidharzes erfolgte für 3 Tage bei 70 °C.

2.4.4 Immunogoldmarkierungen für die Elektronenmikroskopie

Ziel der Immunogoldmarkierungen war es, mit Hilfe monoklonaler Antikörper Proteine

zu identifizieren und ihre strukturellen Merkmale zu charakterisieren. Hierzu wurde sich

sowohl des sogenannten Postembeddings als auch des Preembeddings bedient.


Während beim Postembedding die Antikörperinkubation erst am fertig vorliegenden

Ultradünnschnitt vorgenommen wird, erfolgt sie beim Preembedding nach der Fixie-

rung und entsprechender Lysis der Zellen, woran sich dann die Einbettung anschließt.

Die Immunogoldmarkierungen wurden mit einigen der in Tabelle 1 aufgeführten Primä-

rantikörpern durchgeführt. Die Gold-konjugierten Sekundärantikörper sind in Tabelle 4

verzeichnet.

polyklonaler Zweit-

Ak Typus Ursprungsor-

ganismus gegen Konjugat adsorbiert gegen

106.011 GAR EM 6nm

IgG Ziege Kaninchen 6 nm Rind, Hühnchen, Ziege, Maus, Mensch, Ratte, Schaf

810.011 GAR 10 nm

IgG Ziege Kaninchen 10 nm Rind, Hühnchen, Ziege, Maus, Mensch, Ratte, Schaf

106.044 GAM 6nm

IgG/M Ziege Maus 6 nm –

810.044 GAM 10 nm

IgG/M Ziege Maus 10 nm –

106.055 GARa 6 nm

IgG Ziege Ratte 6 nm Rind, Hühnchen, Ziege, Mensch, Maus, Schaf, Hamster

Tabelle 4: Verzeichnis der Gold-konjugierten Sekundärantikörper

2.4.4.1 Postembedding

2.4.4.1.1 Fixierung für das Postembedding

Die Fixierung für das Postembedding wich aufgrund der notwendigen Erhaltung der

Antigenizität von der Standardfixierung (s. Kapitel.2.4.2) ab. Die Zellen wurden für 1 h

in Fixierlösung bei RT fixiert und anschließend für 3 × 15 min in Cacodylatpuffer (0,05

M, pH 7,4) gewaschen. Hieran schloß sich die Dehydrierung in Ethanol für jeweils 10

min (50%, 70%, 90%, und 2 × 100%) an.

Alle Schritte wurden in einer Eppendorf-Zentrifuge bei 2000 Upm durchgeführt.

Fixierlösung (Klotz et al., (1997): 0,15 % (v/v) Glutardialdehyd

2 % (w/v) p-Formaldehyd

0,05 M Cacodylatpuffer

ad H2O pH 7,4

2.4.4.1.2 Einbettung für das Postembedding

Zur Erhaltung der Antigenizität der Proben wurden die Methacrylate Unicryl und LR-

White als Einbettungsmedium verwendet. Aufgrund seiner ungünstigen Schneideigen-


schaften fand Unicryl (British BioCell, Cardiff, GB) nur anfänglich Verwendung und

wurde zu einem späteren Zeitpunkt durch LR-White (London Resin Ltd, GB) ersetzt.

Die dehydrierten Proben wurden in eine 1:1 Mischung aus LR-White und Ethanol über-

führt und für ½ h auf dem Kippschüttler inkubiert. Nach dem Austausch gegen reines

LR-White wurden die Proben erneut 12 h inkubiert, und erneut gegen reines LR-White

ausgetauscht.

Anschließend wurden die Proben auf handelsübliche Gelatinekapseln aufgeteilt und bei

4000 Upm in einer regelbaren Eppendorf-Zentrifuge pelletiert.

Eine Polymerisation des Harzes erfolgte bei exakt 50 °C in den luftdicht verschlossenen

Kapseln, wobei den durch die Polymerisationreaktion evtl. auftretenden Spitzentempe-

raturen durch die Plazierung der Proben in entsprechenden Aussparungen eines massi-

ven Aluminiumblocks entgegengewirkt wurde.

Nach einer Polymerisationszeit von insgesamt 3 Tagen konnten die Proben wie üblich

ultradünn geschnitten werden.

2.4.4.1.3 Fixierung und Einbettung in Epoxidharz mit anschließendem Ätzen der Prä-parate

In einigen Fällen war es wünschenswert, als Einbettungsmedium für die Methode des

Postembeddings nicht Methacrylate, sondern Epoxidharze zu verwenden. Um die Epi-

tope der Proben den Antikörpern zugänglich zu machen, wurde die Methode des Ätzens

angewendet (British BioCell, 1997):

Die Präparate wurden wie in Kapitel 2.4.4.1.1 beschrieben fixiert, dehydriert und im

Anschluß an die Entwässerung mit Epon als Einbettungsmittel und Propylenoxid als

Mediator versetzt, analog der in Kapitel 2.4.3 beschriebenen Methode.

Anschließend wurden die Proben in Beem-Kapseln überführt und das Epon für 5 Tage

bei 50°C auspolymerisiert.

Die ultradünn-geschnittenen Proben wurden auf mit Formvar beschichtete und durch

Kohlebedampfung stabilisierte Nickelgrids aufgenommen. Danach wurden durch 30-

sekündige Inkubation in Natrium-Ethanolat die durch das umgebende Epon maskierten

Epitope freigeätzt. Nach gründlichem Spülen der Proben (6 × 5 min in H20) konnten

diese einer Antikörper-Inkubation unterzogen werden.


Herstellung des Natrium-Ethanolats:

2

D

ü

8

s

n

e

a

D

g

k

o

W

P

t

E

1

ü

-

-

granuliertes Natriumhydroxyd wurde bis zur Sättigung in 100% Ethanol gelöst. Nach anschlie

ßendem mehrfachen Filtrieren war die Lösung gebrauchsfertig und konnte innerhalb eines Zeit

raumes von 3 d verwendet werden.

.4.4.1.4 Antikörper-Inkubation

ie auf Nickelgrids vorliegenden Schnitte wurden zur Absättigung evtl. vorhandener

berschüssiger Aldehydgruppen 2 × 10 min in 0,05 M Glycin in PBS inkubiert (pH

,0). Anschließend wirkte die Blockierlösung für 15 min ein. Nach vorsichtigem Ab-

augen der Lösung vom Grid konnte der Primärantikörper in entsprechender Verdün-

ung mit Inkubationspuffer aufgetragen werden. Eine Inkubation bei 4°C für 12 h in

iner feuchten Kammer erwies sich als optimal, in wenigen Fällen wurde die Inkubation

uf 2 h bei RT verkürzt.

urch dreimaliges Spülen der Proben mit Waschlösung (jeweils 10 min) wurde nicht

ebundener Erstantikörper entfernt, und es konnte der mit Gold konjugierte Zweitanti-

örper aufgetragen werden. Hier erwies sich zur vollständigen Bindung eine Inkubati-

nszeit von 2 h bei RT als ausreichend.

iederum wurde 3 × 5 min in Waschlösung gespült, daraufhin zwei weitere Male in

BS (pH 8,0). Im Anschluß hieran wurde der Antikörperkomplex für 5 min in 2% Glu-

ardialdehyd nachfixiert und nochmals 3 × 5 min in Aqua bidest gespült.

in anschließendes Nachkontrastieren der Proben erfolgte wie üblich (s. Kapitel 2.4.5).

Inkubationspuffer (Leunissen, 1994): 0,1 % (v/v) BSA-c

0,1 %(v/v) Tween-20

ad PBS pH 8,0

Blockierlösung: 0,5 % (v/v) BSA-c

5 % (v/v) Normalserum1

ad PBS pH 8,0

Das Normalserum sollte dem Ursprungsorganismus des Sekundärantikörpers entsprechen, dies war

blicherweise Ziege.


Waschlösung: 0,1 % (v/v) BSA-c

ad PBS pH 8,0

2.4.4.2 Preembedding

2.4.4.2.1 Fixierung, Antikörperinkubation und Einbettung für das Preembedding

Die Fixierung für das Preembedding wurde analog der für das Postembedding beschrie-

benen Methode (s. Kapitel 2.4.4.1.1) an isolierten Zellkernen durchgeführt. Die folgen-

den Schritte erfolgten in Anlehnung an van Lookeren (1993).

Die Proben wurden für 2 × 15 min in PBSs (PBS + 0,02 mM Sucrose, pH 7,4) gewa-

schen. Die darauffolgende Lysis wurde für 15 min in Lysispuffer durchgeführt, an die

sich ein 10minütiges Absättigen der freien Aldehydgruppen in Sättigungspuffer an-

schloß (Ferrari, 1989). Nach Inkubation in Blockierlösung (BL) konnte der mit Inkuba-

tionspuffer verdünnte Erstantikörper aufgetragen werden, der für 12 h bei 4°C auf den

Proben belassen wurde. Es schloß sich ein gründliches Spülen in Waschlösung (WL) (4

×25 min) an, woraufhin der ebenfalls 1:10 mit Inkubationspuffer verdünnte Sekundä-

rantikörper aufgetragen werden konnte. Nach Ablauf von 3 h bei 37°C erfolgte ein

dreimaliges Waschen in WL für 25 min und nochmals 3maliges Spülen in PBSs.

Die Proben wurden daraufhin einer Nachfixierung mit 2,5 % (v/v) Glutardialdehyd in

PBSs unterzogen und drei weitere Male in PBSs gespült. Daraufhin wurden sie, wie

schon beschrieben, in einer aufsteigenden Ethanolreihe dehydriert, in Epon eingebettet

und entsprechend polymerisiert.

Nach Anfertigung der Ultradünnschnitte erfolgte die Nachkontrastierung.

Lysispuffer: 50 mM Glycin

0,1 % (v/v) Tween-20

in PBSs pH 7,4

Sättigungspuffer: 50 mM Glycin

in PBSs pH 7,4

Blockierlösung und: 0,1 % (v/v) BSA-c

Inkubationspuffer 0,1 % (v/v) cold water fish gelatine

1 % (v/v) Normalserum

in PBSs pH 7,4


Waschlösung: 0,1 % (v/v) BSA-c

0,1 % (v/v) Tween-20

1 % (v/v) Normalserum

in PBSs pH 7,4

2.4.5 Ultradünnschnittechnik und Kontrastierung

Nach erfolgter Aushärtung des jeweiligen Einbettungsmediums wurden an einem Ul-

tramikrotom (LKB Ultrotom III Typ 8802) unter Verwendung eines Diamantmessers

(Fa. Dehmer oder DDK) Ultradünnschnitte mit einer Dicke von 60-90 nm angefertigt.

Diese wurden auf Formvar-befilmte Kupfer–Grids (G2075C 75 Square Mesh, G2100C

100 Square Mesh) oder –Schlitzblenden (G2500C 2 × 1 mm) der Firma Agar aufge-

nommen. Eine Ausnahme bildeten lediglich die Schnittpräparate der Postembedding-

Versuche, bei denen Nickelgrids (G2300N 300 Square Mesh) Verwendung fanden.

Alle Ultradünschnitte wurden mit Hilfe des Synaptek Gridstick Kits (Plano, Wetzlar)

für 15 Minuten in Uranylacetat und – bis auf Ausnahmen bei einigen Postembedding-

Präparaten – für 10 Minuten mit Bleicitrat nachkontrastiert.

Formvar-Lösung: 0,3% (w/v) Formvar 15/95E in Chloroform

2.4.6 Auswertung und Dokumentation

Die Auswertung der Ultradünnschnittpräparate erfolgte an Elektronenmikroskopen der

Marke Philips (Typ 300 und 410) bzw. Zeiss (Typ 109). Die dort erhaltenen Ergebnisse

wurden auf 6,5 × 9 cm Planfilmen der Marken Bergger (MET-175), Agfa (Scientia)

oder Guilleminot (EG18) bzw. auf Rollfilm (6×9 cm) der Marke Kodak (Technical Pan)

dokumentiert.

2.5 Gelelektrophorese

2.5.1 Aufarbeitung der Proben

2.5.1.1 Aufarbeitung ganzer Zellen

Die zuvor angereicherten Paramecien wurden mit 600 µl Aufschlußlösung versetzt und

anschließend mit Hilfe des Ultraschallhomogenisators auf höchster Stufe für 1½ min


aufgeschlossen. Die so erhaltene Zellsuspension wurde nochmals für 20 min bei 10.000

g abzentrifugiert, um noch vorhandene Zelltrümmer zu entfernen. Nach Zufügen von

Probenpuffer (je nach Volumen der Probe 100-300 µl ) schloß sich ein 2-5 minütiges

Aufkochen im Wasserbad an, in dessen Anschluß die Proben auf das Gel aufgetragen

wurden.

Aufschlußlösung: 21,5 mg Protease-Inhibitor-Cocktail (Sigma P-8465)

100 µl DMSO

500 µl H2O

Probenpuffer: 0,75 g Tris-HCL

2 g SDS

10 mg Bromphenolblau

10 ml Glycerin 5 ml β-Mercaptoethanol

pH 6,7 ad 100 ml H2O

2.5.1.2 Aufarbeitung von isolierten Mikronuclei Die Isolation der Mikronuclei wurde wie in Kapitel 2.2.1 beschrieben, vorgenommen.

Der Aufschluß der Kerne erfolgte analog dem Aufschluß von ganzen Zellen.

Um die Proteinkonzentration zu erhöhen, konnten die Proben bei Bedarf auf eine 5

kDa-Dialysemembran aufgetragen (Centricon-Röhrchen der Fa. Millipore-Amicon,

Eschborn) und für 1 h bei 5000 g und 4°C eingeengt werden.

2.5.1.3 Isolation und Aufarbeitung von Cilien Die Isolation der Cilien erfolgte in Anlehnung an ein Protokoll von Nelson (1995):

Die Zellen wurden zweimal in 10mM Hepes (pH 7,0) gewaschen und anschließend in

HMS-Puffer resuspendiert. Nach Zugabe von 4 ml 25 mM Nupercain ist die Zellsus-

pension für 1-2 min vorsichtig verwirbelt worden. Nach lichtmikroskopischer Kontrolle,

ob eine vollständige Deciliierung stattgefunden hat, wurden 20 ml HSME-Puffer ad-

diert.

Die Zellkörper konnten durch Zentrifugation bei 850 g für 2 min pelletiert werden.

Durch Zentrifugation des Überstandes bei 28.000 g für 20 min pelletierten die Cilien,

die mit Probenpuffer versetzt und nach Aufkochen im Wasserbad auf ein Gel aufgetra-

gen wurden.


HMS-Puffer: 5 mM MgSO4

4 % Sucrose

25 mM Hepes

pH 7,0 ad H2O

HMSE-Puffer: HMS-Puffer + 1 mM EDTA

2.5.2 SDS-Gelelektrophorese

Zur genauen Charakterisierung und Auftrennung von Proteinen wurde die SDS-Gel-

elektrophorese nach der Methode von Laemmli (1970) eingesetzt. Die 10%-igen Gele

wiesen Taschen auf, die 10 µl Probe aufnehmen konnten. Sollten die präparativen Gele

aber weitere Verwendung im Western-Blot finden, so besaßen die Taschen eine Auf-

nahmekapazität von 200 µl Probe.

In der Regel wurden die Proben in einer Pharmacia „Biotech mighty small II SE 250/SE

260“ - Kammer bei konstant 20 mA für 1 h aufgetrennt.

Zur Bestimmung der Molekulargewichte wurde der Molekulargewichtsmarker SDS-6-H

(Fa. Sigma) verwendet, in einigen Fällen wurde der Marker „Benchmark prestained

protein ladder“ (Fa. GibcoBRL) eingesetzt.

Die Berechnung der Gewichte unbekannter Proteine konnte mit Hilfe des Programms

PROTMW (Dugglebey, 1994) vorgenommen werden.

Es wurden, je nach Bedarf, 6% ige und 10%ige Polyacrylamid-Trenngele verwendet.

Sammel-Gel, 6%ig: 1,69 ml Acrylamid 40 %ig

5 ml Saccharose 60%ig

1,82 ml H2O

2,65 ml 2 M Tris-HCL, pH 6,8

28,5 µl APS-Stammlösung

50 µl SDS 20%ig

10 µl TEMED


Trenn-Gel: 6%ig 10%ig Substanz/Lösung

1,5 ml 2,5 ml Acrylamid 40 %ig

2,5 ml 2,5 ml 2 M Tris-HCL, pH 8,8

– ml 2,5 ml Saccharose 60%ig

25 µl 25 µl APS 10%ig

25 µl 25 µl SDS 20%ig

5 µl 5 µl TEMED

5,95 ml 2,5 ml H2O

Laufpuffer: 3,0 g Tris-HCl

14,4 g Glycin

1,0 g SDS

pH 8,8 ad 1 l H2O

Die Gele wurden nach der Elektrophorese entweder mit Coomassie Blau oder Silber

gefärbt.

Coomassie-Färbung: Das Gel wurde mit 12,5 % Trichloressigsäure (v/v) in VE-Was-

ser für 20 min fixiert und anschließend in die Färbelösung überführt. Nach Ablauf einer

Stunde konnte der überschüssige Farbstoff in Entfärbelösung ausgewaschen werden.

Färbelösung: 1 Teil 0,2 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue R 250 in Metha-

nol

1 Teil 20 % (v/v) Eisessig in VE-Wasser

Entfärbelösung: 1 Teil 20 % (v/v) Eisessig in VE-Wasser

1 Teil 80 % (v/v) Methanol in VE-Wasser

Silber-Färbung: Nach 5minütigem Spülen in VE-Wasser wurde das Gel für 1 Stunde

fixiert und anschließend für 3 bis 12 Stunden rehydriert. An einen weiteren Spülgang

schloß sich eine 30minütige Inkubation in 10% (v/v) Glutardialdehyd in H2O an, wor-

aufhin das Gel erneut für 3 × 30 min in H2O gewaschen wurde.

Im Anschluß an eine 10minütige Inkubation in ammoniakalischer Silberlösung und an-

schließendem 3maligen Spülen erfolgte die Färbung des Gels in Entwicklerlösung bis


ein leichter Hintergrund aufgetreten war. Die Entwicklung konnte durch eine minde-

stens 15 min währende Inkubation in 5% (v/v) Essigsäure gestoppt werden. Zur Doku-

mentation wurden die Gele mit Hilfe eines Durchlichtscanners erfaßt und die Bilder

anschließend auf einem Drucker ausgegeben.

Fixierlösung: 40 ml Ethanol Rehydrierlösung: 10 ml Ethanol

10 ml Eisessig 10 ml Eisessig

50 ml H2O 180 ml H2O

Ammoniakalische Silbernitratlösung: 1 g AgNO3 in

5 ml H2O lösen und langsam in die ammoniakalische Stammlösung einrühren

ad 125 ml H2O

Ammoniakalische Stammlösung: 27 ml H2O

1,65 ml konzentriertes Ammoniumhydroxyd

0,25 ml 10 M NaOH

Entwicklerlösung: 10 mg Citronensäure-1-hydrat

100 µl 37% (w/v) p-Formaldehydlösung in 50% Methanol

100 ml H2O

2.5.3 Western-Blot

Der Western-Blot ist nach der Methode von Khyse-Andersen (1984) als Semi-Dry Blot

durchgeführt worden: Das präparative Trenngel wurde in Transferpuffer getränkt und

auf eine zuvor in Methanol äquilibrierte PVDF-Folie (Millipore Immobilon-P Trans-

fermembran mit 0,45 µm Poregröße) gelegt. Sowohl Gel als auch Folie waren in der

Blot-Apparatur durch mit Transferpuffer gesättigtem Elektrodenpapier (Electrode Paper

Novablot PKG/500, Fa. Pharmacia Biotech) dicht umschlossen.

Der Transfer der Proteine erfolgte innerhalb von 2 Stunden bei konstant 65 µA auf die

Folie, die nach einstündigem Absättigen in 1,5% Rinderserumalbumin und anschließen-

dem Spülen in PBS in Streifen geschnitten werden konnte. Diese Streifen konnten einer


weiteren Behandlung mit Primärantikörpern unterzogen werden, wobei die gleichen Er-

stantikörper wie in der IIF Verwendung fanden (s. Kapitel 2.2.3.3).

Die Inkubation mit den jeweiligen Erstantikörpern wurde für mindestens eine Stunde

auf einem Kippschüttler bei Raumtemperatur durchgeführt.

Im Anschluß an ein 3 × 5minütiges Spülen in Waschlösung (0,05% (v/v) Tween 20 in

PBS) erfolgte die Inkubation mit den entsprechenden Peroxidase-gekoppeltenen Zwei-

tantikörpern (1:1000 mit Ak -Lösung verdünnt) für ebenfalls eine Stunde bei Raumtem-

peratur auf dem Kippschüttler. Die Entwicklungsreaktion in Chloronaphtol mit H2O2 als

Substrat schloß sich einem weiteren gründlichem Spülen an.

Die Ergebnisse wurden mit Hilfe eines Scanners digitalisiert und für die vorliegende

Arbeit auf einem Drucker ausgegeben.

Transferpuffer: 1,51 g Tris-HCl

0,47 g Glycin

50 ml Methanol

pH 8,3 ad 500 ml H2O

Färbelösung: 1,2 g Amidoschwarz 10 B

225 ml Methanol

225 ml H2O

50 ml Eisessig

Ak -Lösung: 1 % BSA

0,05 % Nonidet P40

ad PBS pH 7,2

Entwicklerlösung: 1 Teil 3mg/ml 4-Chloronaphtol in Methanol

5 Teile PBS pH 7,2

0,025 % H2O2

2.6 Bezugsquellennachweis

2.6.1 Antikörper

Die Antikörper YL1/2, 27C2 und ID5 wurden freundlicherweise von Prof. Dr. Wehland

bereitgestellt. Der anti-Peptid G Antikörper ist ein Geschenk von Prof. Dr. Avila, von


Herrn Dr. Bornens stammt der Antikörper CTR 210. Fr. Dr. Euteneuer stellte die Anti-

körper Nr. 11 und WA3 zur Verfügung. Herr Dr. Joshi überließ uns den anti γ-Tubulin

Antikörper, Herrn Dr. Melkonian danken wir für die Überlassung des anti-Centrin Anti-

körpers. Prof. McIntosh sandte uns den Antikörper 3A5 zu, Herr Dr. MacRae den anti-E

Antikörper.

Bei der Firma Sigma (Deisenhofen) wurden die Antikörper Dynein 440.4, 70.1, 6 IIB1,

2-28-33, TUB–1A2 und anti-Aktin käuflich erworben, die Firma Calbiochem (Bad So-

den) vertreibt den Antikörper YOL1/34. Der Antikörper C-18 wurde von der Firma

Santa-Cruz Biotechnology (Heidelberg) bezogen.

Alle Peroxidase-gekoppelten Zweitantikörper entstammen dem Sortiment der Firma

DAKO (Hamburg), wohingegen alle verwendeten Gold-konjugierten Sekundärantikör-

per bei der Firma Biotrend (Köln) gekauft wurden.

2.6.2 Chemikalien

4-Chloronaphtol Sigma, Deisenhofen

Alcianblau 8 GX Sigma, Deisenhofen

Amidoschwarz 10 B Sigma, Deisenhofen

Cacodylat Roth, Karlsruhe

Coomassie Brilliant Blue R 250 Serva, Heidelberg

DMSO Mallinckrodt Baker, Griesheim

Formvar 15/95 E Sigma, Deisenhofen

Glycin Biomol, Hamburg

HEPES Biomol, Hamburg

Nocodazol Sigma, Deisenhofen

Nupercain Ciba-Geigy, Wehr/Baden

Osmiumtetoxid (OsO4) Degussa, Hanau

Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) Serva, Heidelberg

PIPES Roth, Karlsruhe

Polyethylenglykol Roth, Karlsruhe

Propylenoxid Serva, Heidelberg

p-Phenylendiamin Sigma, Deisenhofen

Rhodamin-konjugiertes Phalloidin Molecular Probes, Eugene (USA)

s-Collidin Fluka, Buchs (CH)

SDS-6-H Serva, Heidelberg


Taxol Sigma, Deisenhofen

Tris Serva, Heidelberg

Triton X-100 Sigma, Deisenhofen

Tween20 Fluka, Buchs (CH)

Vanadat Aldrich, Steinheim

Alle hier nicht aufgeführten Chemikalien wurden über die Firmen Merk (Darmstadt)

oder Riedel-de Haën (Seelze) bezogen.

Ergebnisse 37

3 Ergebnisse Die in der Einleitung vorgestellte Zielsetzung dieser Arbeit aufgreifend, wird im fol-

genden zunächst die genaue morphologische Struktur der Mitose des Mikronucleus bei

Paramecium bursaria dargestellt. Dies erscheint um so wünschenswerter, als die bisher

von zwei Autoren vorliegenden Untersuchungen – insbesondere auf ultrastruktureller

Ebene – lückenhaft sind und sich in wesentlichen Punkten widersprechen (Schwartz,

1976 und Lewis et al., 1976).

Daran anschließend werden Untersuchungen zur Stabilität der mikronucleären Mt unter

Verwendung stabilisierender und destabilisierender Agenzien erfolgen, an die sich eine

biochemische Charakterisierung der Kerne, sowohl unter Einbeziehung der indirekten

Immunfluoreszenz und des Western-Blots, als auch unter Einsatz elektronenmikrosko-

pischer Immunogoldmarkierungen anschließt.

3.1 Struktur der Kerne unter Kontrollbedingungen Die Benennung der einzelnen mitotischen Stadien erfolgt in Anlehnung an die Mitose

der Metazoen, wie bei vorangegangenen Beschreibungen der Mitose bei Einzellern

durch andere Autoren üblich (Schibler und Pickett-Heaps, 1980), wobei diese Termi-

nologie nicht in allen Fällen zutreffend erscheint.

3.1.1 Ermittlung der Zellzyklusdauer

Um eine effektive Untersuchung der Mitose ermöglichen zu können, wurde eine Er-

mittlung des relativen Anteils der verschiedenen Interphase-Abschnitte (G1, S bzw. G2)

am Gesamtzellzyklus durchgeführt.

Da ausschließlich die Mitose lichtmikroskopisch zu beobachten ist, müssen zu einer

genauen Bestimmung der Phase des Zellzyklus‘ photometrische Messungen des DNA-

Gehaltes an isolierten Kernen durchgeführt werden (Cullis, 1973).

Ergebnisse 38

Dgsga

D

G

b

a

i

k

w

D

s

t

k

b

D

s

i

iagramm 1: Der relative DNA-Gehalt von isolierten Mikronuclei und ermittelte Standardabweichun-en. Die Einteilung der Kerne erfolgte in 3 Gruppen, wobei der DNA-Gehalt von Kernen mit den niedrig-ten Werten als 2c definiert wurde, der DNA-Gehalt von Kernen mit den höchsten Werten wurde als 4c esetzt. Die Standardabweichung der Messungen in den einzelnen Gruppen wird durch senkrechte Linien uf den Balken symbolisiert.

ie Ergebnisse zeigen, daß sich 63% der isolierten und gemessenen Mikronuclei in der

1-Phase, 24 % der Kerne in der S-Phase befinden. Nur 13% der untersuchten Kerne

efinden sich in der G2-Phase und besitzen somit überhaupt die chromosomalen Vor-

ussetzungen zum Eintritt in die Mitose. Kerne, die zwar aufgrund ihres DNA-Gehaltes

n die Kategorie G2-Phase gefallen wären, aber aufgrund ihrer Struktur und guten Mar-

ierbarkeit des Primärpols mit dem Antikörper YOL/34 der Prophase zuzurechnen sind,

urden nicht berücksichtigt.

er exakte Anteil der Kerne in der Mitose (M-Phase) kann mit dem fluoreszenzmikro-

kopischen Verfahren nicht genau ermittelt werden, da bedingt durch die Art der Isola-

ion der Mikronuclei nur frühe mitotische Stadien dargestellt werden können. Lichtmi-

roskopische Untersuchungen zeigen aber, daß die Dauer des gesamten Zellzyklus 36 h

eträgt.

iese Zeit wurde von der ersten vollendeten Teilung der Ausgangstiere bis zur abge-

chlossenen Teilung der Tochtertiere gemessen, wobei es Schwankungen gab, die auf

ndividuelle Unterschiede der Zellen zurückzuführen sind.

G1-Phase

S-Phase

G2-Phase

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

Anzahl der gemessenen Kerne

rela

tiver

DN

A-G

ehal

t der

Ker

ne

148 57 30

Ergebnisse 39

Die Mitose selbst beträgt etwa 1,5 h, wobei der Beginn der Mitose mit den ersten An-

zeichen der Cytokinese und das Ende der Mitose mit der kompletten Durchschnürung

der Parentalzelle gleichgesetzt wurde. Beide Ereignisse geben, wie sich aus später ge-

wonnenen Ergebnissen der ultrastrukturellen Untersuchungen ergab, nur näherungs-

weise den tatsächlichen Beginn und das Ende der Mitose an.

Der Anteil der einzelnen Phasen an der Gesamtdauer des Zellzyklus‘ stellt sich grafisch,

wie in Diagramm 2 angegeben, dar:

Diagramm 2: Dargestellt ist der zeitliche Anteil der einzelnen Phasen am Zellzyklus. Die Zyklusdauer der Tiere liegt bei ungefähr 36 Stunden, wie sich durch lichtmikroskopische Beobachtungen ermitteln ließ. Mit der Kenntnis von 1,5 Tagen als Teilungsperiodik beträgt der zeitliche Anteil der G1-Phase 21,7 h, der S-Phase 8,3 h, der G2-Phase 4,5 h und der Mitose 1,5 h.

3.1.2 Allgemeine Strukturmerkmale

Der Mikronucleus des holotrich bewimperten Ciliaten (Abb. 1) stellt sich in der Inter-

phase als ein spindelförmiger Körper mit einer – im Gegensatz zu den meisten anderen

Ciliaten – beachtlichen Länge von ca. 12 µm und einem Durchmesser von 6 µm dar

(Abb. 2b). Die Größe des Makronucleus kann mit ca. 35 µm Länge und einem Durch-

messer von ca. 15 µm angegeben werden (Abb. 2a), was in etwa den Dimensionen von

nahe verwandten Arten wie z.B. Paramecium caudatum entspricht. Schon die lichtmi-

kroskopische Betrachtung läßt den bipolaren Bau des Mikronucleus‘ erkennen (Abbil-

dung schon bei Chen (1940): Das im intakten Tier anterior gewendete Ende läuft spitz

zu (Abb. 2a und b), wohingegen der andere Pol abgerundet erscheint.

G1-Phase61%

S-Phase23%

G2-Phase12%

M-Phase4%

Ergebnisse 40

Häufig ist der Mikronucleus auch im isolierten Zustand über den spitzzipfeligen Pol mit

dem Makronucleus verbunden (Abb. 2a). In elektronenmikroskopischen Aufnahmen

stellt sich diese Konnexion als elektronendichte Struktur dar, über deren biochemische

Natur bisher nichts bekannt ist (Abb. 3).

Bereits in der frühen Prophase lassen die Kerne schon im Lichtmikroskop eine fibrilläre

Grundsubstanz erkennen, die vom spitzzipfeligen Pol ausgeht und sich in Richtung des

abgerundeten Pols ausdehnt (z.B. Abb. 4). Aufgrund dieser Gegebenheit führte

Schwartz (1964) die Bezeichnungen „Primär“- bzw. „Sekundärpol“ ein, die im folgen-

den beibehalten werden sollen.

3.1.3 Interphase

Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen der Interphase zeigen, daß Chromatin

gleichmäßig verteilt im Kern vorliegt (Abb. 4a), wobei dieses Bild in elektronenmikro-

skopischen Aufnahmen bestätigt werden kann (Abb. 5a). Nur in unmittelbarer Nähe des

Primärpols ist kein Chromatin vorhanden, jedoch ist hier in der Immunfluoreszenz eine

intensive Tubulinmarkierung nachzuweisen (Abb. 4a). Auffällig ist, daß der Mikronu-

cleus mit einer hohen Anzahl von Kernporen besetzt ist, die mit ihrem Abstand von

knapp 100 nm dem des Makronucleus gleichkommen (Abb. 5a und b).

Die elektronenmikroskopische Untersuchung der Interphase macht weiterhin deutlich,

daß bereits jetzt feines filamentöses Material im Kern vorhanden ist (Abb. 5a). Die Län-

ge dieser Filamente bleibt in der Interphase auf wenige 100 nm beschränkt, auch ihre

Anzahl ist im Vergleich zu anderen Phasen sehr gering. Mikrotubuli sind nur vereinzelt

in der Nähe der Kernmembran nachzuweisen (Abb. 5b).

Der Einsatz spezifischer Antikörper gibt einen genaueren Überblick über das interphasi-

sche Auftreten der Mikrotubuli: Sie erstrecken sich vom Primärpol zum Sekundärpol

des Kerns (Abb. 4b). Da sich ihr Auftreten auf die unmittelbare Nähe der Kernmembran

beschränkt, zu der sie parallel orientiert sind, werden sie im folgenden als „periphere

Mikrotubuli“ bezeichnet. Häufig ist am Primärpol eine diffuse Markierung nachzuwei-

sen (Abb. 4a).

Tafel 1

Allgemeine Strukturmerkmale von Paramecium bursaria

Übersicht

Abb. 1: Der Ciliat besitzt als Vertreter der Holotrichia eine gleichmäßige Körper-bewimperung (weißer Pfeilkopf: Cilien). Zahlreiche endosymbiontische Zoochlorellen sind im Cytoplasma erkennbar (Pfeilköpfe). Maßstab: 10 µm

Struktur der Kerne

Abb. 2a: Der Mikronucleus (Mi) ist im isolierten Zustand häufig mit dem Makro-nucleus (Ma) assoziiert. Die Größenunterschiede zwischen den beiden Kernen sind deutlich zu erkennen. Der Mikronucleus weist einen polaren Bau auf (PP= Primärpol, SP= Sekundärpol). Während der Primärpol spitz zuläuft, erscheint der Sekundärpol abgerundet. Maßstab: 10 µm

Abb. 2b: Schon in der Prophase ist im Mikronucleus eine fibrilläre Grundsubstanz erkennbar, die vom Primärpol (Pfeil) ausgeht und sich in Richtung Se-kundärpol erstreckt. Maßstab: 10 µm

Abb. 3: Im Elektronenmikroskop stellt sich die Verbindung zwischen Mikronu-cleus (Mi) und Makronucleus (Ma) als elektronendichte Struktur dar, die in regelmäßigem Abstand einen Kontakt zwischen den beiden Membra-nen vermittelt (Pfeilköpfe). Maßstab: 0,5 µm

Tafel 2

Interphase

Doppelmarkierung der DNA und des Gesamt-Tubulins (YOL 1/34)

Abb. 4a: Eine gleichzeitige Markierung der DNA mit Bisbenzimid und des Tubu-lins unter Verwendung des Antikörpers YOL1/34 zeigt eine gleichmäßige Verteilung des Chromatins im Kern (blau). Nur in direkter Nähe des Pri-märpols (Pfeilkopf) kann kein Chromatin nachgewiesen werden, jedoch ist hier eine intensive Tubulin-Markierung zu dokumentieren (grün), die diffus erscheint. Durch die starke Fluoreszenz des Bisbenzimids wird die Markierung der Mt im Kern überdeckt. Maßstab: 5 µm

Darstellung des Gesamttubulins durch den mAk YOL 1/34, CLSM-Aufnahme

Abb. 4b: Auf die Peripherie des Kerns fokussiert. Periphere Mikrotubuli erstrecken sich vom Primärpol (großer Pfeilkopf) zum Sekundärpol (Pfeilkopf) und verlaufen dabei dicht unterhalb der Kernmembran. Zusätzlich zur di-stinkten Markierung der Mikrotubuli ist eine diffuse Fluoreszenz des ge-samten Kerns zu dokumentieren. Maßstab: 5 µm

Abb. 5a: Chromatin liegt in der Interphase im Kern gleichmäßig verteilt und kon-densiert vor. Feine filamentöse Strukturen mit einer Länge von wenigen hundert nm sind erkennbar (Pfeilköpfe). Maßstab: 0,5 µm

Abb. 5b: Sowohl der Mikronucleus als auch der Makronucleus weisen eine hohe Anzahl von Kernporen auf (kleine Pfeilköpfe). Der Abstand der Kernpo-ren beträgt im Mittel 100 nm. Vereinzelt sind Mt im Kern nachzuweisen (Pfeilköpfe). Maßstab: 0,5 µm

Ergebnisse 41

3.1.4 Prophase

Das Vorhandensein der peripheren Mikrotubuli kann durch eine Aufsicht auf den Pri-

märpol dokumentiert werden (Abb. 6).

In der Prophase wird der Ursprungsort der Teilungsspindel deutlich: Durch den Einsatz

von Antikörpern gegen α-Tubulin kann gezeigt werden, wie sich eine Markierung der

Mikrotubuli, vom Primärpol ausgehend, in Richtung des Sekundärpols fortsetzt (Abb.

7b, auf Primärpol fokussiert), während periphere Mikrotubuli auch im Bereich des Se-

kundärpols nachzuweisen sind (Abb. 7c, auf Sekundärpol fokussiert). Der Tubulin-

nachweis erstreckt sich mit zunehmendem Fortschreiten der Prophase immer weiter in

Richtung Sekundärpol (Abb. 8b). Zu einem späten Zeitpunkt der Prophase hat die dif-

fuse Tubulinmarkierung nahezu den Sekundärpol erreicht. Auch in diesem Stadium

kann der Nachweis für die Persistenz der peripheren Mikrotubuli erbracht werden, die

den Kern weiterhin dicht unterhalb der Kernmembran umspannen (Abb. 8d). Dieses

Bild kann durch elektronenmikroskopische Untersuchungen bestätigt werden (Abb. 11a

inset).

Der Mikronucleus ist weiterhin neben dem Makronucleus lokalisiert (Abb. 9), und die

Kerne zeigen elektronenmikroskopisch weiterhin eine Verbindung untereinander (Abb.

11a).

Das vormals dispergiert und nur leicht kondensiert im Kern vorliegende Chromatin ver-

dichtet sich zunehmend. Hierbei ist auffällig, daß die Kondensation am Primärpol be-

ginnend zum Sekundärpol hin fortschreitet (Abb. 10a, Abb. 11b zeigt ein spätes Sta-

dium der Prophase). Im weiteren Verlauf der Prophase ist nahezu der gesamte Kern mit

kondensiertem Chromatin erfüllt, nur Bereiche in der Nähe des Sekundärpols weisen

noch eine der Interphase ähnliche Struktur des Chromatins auf (Abb. 11b). Neben den

stets vorhandenen peripheren Mt beginnen nun auch Mikrotubuli des mitotischen Appa-

rates, vom Primärpol aus zu polymerisieren (Abb. 10b).

In keinem der untersuchten Prophase-Kerne konnten die bei Mitosen üblicherweise als

MTOC dienenden Centriolen bzw. Centrosomen nachgewiesen werden.

Der Gehalt an Filamenten hat im Vergleich zu interphasischen Stadien jedoch erheblich

zugenommen (Vergleiche z.B. Abb. 5a und Abb. 11b). Ihre unipolare Verteilung korre-

liert mit den immunfluoreszenzmikroskopischen Darstellungen der Tubulinmarkierung

(s. Abb. 7b-8d). Einzelne Filamente weisen einen Durchmesser von ca. 10 nm auf, lie-

gen aber auch oftmals zu Bündeln vereinigt vor und nehmen dann mit bis zu 40 nm ei-

nen Durchmesser an, der wesentlich über dem von Mikrotubuli liegt (Abb. 11b).

Tafel 3

Prophase

Immunfluoreszenz, Markierung mit dem Antikörper YOL1/34 (anti α-Tubulin).

Abb. 6: Durch Aufsicht auf den Primärpol kann dokumentiert werden, daß peri-phere Mikrotubuli in der Prophase weiterhin vorhanden sind.

Abb. 7a: Phasenkontrast

Abb. 7b: Auf den Primärpol fokussiert. Mikrotubuli der Teilungsspindel entsprin-gen am Primärpol.

Abb. 7c: Auf den Sekundärpol fokussiert. Periphere Mikrotubuli sind am Sekun-därpol vorhanden (Pfeilkopf). Mt der Teilungsspindel können in diesem Bereich nicht nachgewiesen werden, jedoch ist eine diffuse Tubulinmar-kierung zu dokumentieren.

Abb. 6-7c: Maßstab: 10 µm

Abb. 8a: Phasenkontrast

Abb. 8b: Im weiteren Verlauf der Prophase schreitet die Ausbildung der Spindel-Mikrotubuli fort. Fokussiert auf den Kernmittelpunkt.

Abb. 8c: Phasenkontrast

Abb. 8d: Zu einem späteren Zeitpunkt sind die der Spindel-Mt weiter Richtung Sekundärpol ausgewachsen. Periphere Mt können weiterhin nachgewie-sen werden (Pfeilkopf). Fokussiert auf den Kernmittelpunkt.

Abb. 8a-8d: Maßstab: 5 µm

Tafel 4

Prophase

Elektronenmikroskopie

Abb. 9: Übersicht. Wie auch in der Interphase, ist der Mikronucleus (Mi) in un-mittelbarer Nähe des Makronucleus (Ma) lokalisiert. Maßstab: 2 µm

Abb. 10a: Frühes Stadium der Prophase. Das Chromatin beginnt zu kondensieren. Die Kondensation ist am Primärpol (PP) weiter fortgeschritten als in Kernmitte, weiterhin wächst filamentöses Material am PP aus. Maßstab: 0,5 µm

Abb. 10b: Späteres Stadium der Prophase. Zahlreiche Spindel-Mikrotubuli erstrek-ken sich vom Primärpol (PP) in Richtung des Sekundärpols. Die Konden-sation des Chromatins schreitet im weiteren Verlauf der Prophase fort. Maßstab: 0,5 µm

Tafel 5

Prophase


Abb. 11a: Spätes Stadium der Prophase. Mikronucleus (Mi) und Makronucleus (Ma) sind auch in der Prophase durch die schon in der Interphase nachgewiese-nen, elektronendichten Strukturen verbunden (Pfeilkopf). Doppelkontu-rige Strukturen, die als Mikrolamellen und Mikrosepten bezeichnet wer-den, sitzen den Chromosomen kappenförmig auf (Pfeil). Die in der IIF nachgewiesenen peripheren Mikrotubuli sind auch im Elektronenmikro-skop zu erkennen (Inset, Pfeil). Maßstab: 0,5 µm

Abb . 11b: Der hohe Filamentanteil des prophasischen Kerns wird in höheren Ver-größerungen besonders deutlich. Oftmals liegen Filamente zu Bündeln vereinigt vor (Pfeilkopf), die einen Durchmesser einnehmen, der mit bis zu 40 nm weit über dem von Mikrotubuli liegt (Pfeil: Mikrotubuli). In der Nähe des Sekundärpols ist das Chromatin (Ch) weiterhin nur schwach kondensiert. Maßstab: 0,5 µm

Abb. 11c: Zu einem späten Zeitpunkt der Prophase zeigen Querschnitte im mittleren Bereich des Kerns längs zur Teilungsrichtung angeordnete Filamente (Pfeilkopf), von denen die Chromosomen ringförmig umschlossen wer-den. Der Durchmesser der Filamente beträgt hier einheitlich 10 nm, wo-hingegen periphere Mt (Pfeil) einen Durchmesser von 25 nm besitzen. Maßstab: 0,2 µm

Ergebnisse 42

Querschnitte im mittleren Bereich des Kerns zeigen zu einem späten Zeitpunkt der

Prophase Chromosomen, die in kurzem Abstand von längs zur Teilungsrichtung ange-

ordneten Filamenten separiert werden (Abb. 11c).

Neben dem Auftreten der Filamente wird bereits in diesem Stadium eine weitere Be-

sonderheit der Mitose dieses Ciliaten deutlich: Die Chromosomen weisen eine deutliche

Kammerung durch eine kappenförmig aufsitzende, gitterförmige Struktur auf (Abb.

11a).

Es handelt sich hierbei um die von Schwartz (1976) als Kinosomen bezeichneten Struk-

turen, wohingegen Lewis (1975), der eine sehr detaillierte Beschreibung gab, sie mit

„Mikrolamellen“ und „Mikrosepten“ benannte. Diese Bezeichnung soll im folgenden

beibehalten werden.

Die hohe Kernporendichte setzt sich auch in der Prophase fort, wobei die Poren gleich-

mäßig über die Kernmembran verteilt und nicht etwa gehäuft in unmittelbarer Nähe des

Makronucleus zu finden sind (z.B. Abb. 11a). Ihr Abstand beträgt weiterhin im Mittel

0,1 µm.

3.1.5 Prometaphase

Ein wichtiges Kriterium der Prometaphase ist die deutliche strukturelle Umwandlung

des Sekundärpols. Er verliert seine vormals charakteristisch runde Form und nimmt ein

spitzzipfeliges Aussehen an, womit er in seinem Erscheinungsbild dem Primärpol

gleicht. Abbildung 12a und b zeigen einen solchen Kern in einem prometaphasischen

Stadium. Er hat hier bereits eine leichte Streckung erfahren und mißt nun mindestens 19

µm in der Länge und 5 µm im Durchmesser (Abb. 12a). Die Polkappen sind im Ver-

hältnis zum übrigen Kern leicht abgewinkelt.

Der Primärpol ist nur daran zu erkennen, daß die Chromosomen hier immer noch stär-

ker kondensiert sind, als es nahe am Sekundärpol der Fall ist. Alle Chromosomen besit-

zen eine Längsorientierung in der zukünftigen Teilungsrichtung und weisen eine enge

Assoziation mit den schon in der Prophase zu erkennenden Mikrolamellen auf (Abb. 12

c und d).

Die in der Prophase vom Primärpol auswachsenden Filamente haben nun den Sekun-

därpol erreicht. Ebenso sind am Sekundärpol jetzt auch Mikrotubuli nachzuweisen

(Abb. 12d), allerdings in diesem Stadium der Prometaphase noch nicht in der Dichte des

Primärpols (Abb. 12c). Während der Durchmesser der Mikrotubuli 25 nm beträgt, wei-

sen die Filamente wie in der Prophase einen Durchmesser von 9-10 nm auf, wobei eine

Ergebnisse 43

laterale Aneinanderlagerung, die erhöhte Durchmesser zur Folge hätte, nicht mehr zu

beobachten ist.

Der Gehalt an Mikrotubuli hat sich im Vergleich zur Prophase deutlich erhöht, wohin-

gegen die Filamentanzahl gegenüber der Prophase deutlich reduziert ist.

Auch der Abstand der Kernporen beträgt immer noch ungefähr 0,1 µm (Abb. 12b) und

ist damit der Prophase gegenüber unverändert geblieben.

3.1.6 Metaphase

Eine Metaphase-„Platte“ im klassischen Sinne, wie sie sich z.B. bei dem nahen Ver-

wandten P. aurelia ausbildet (Stevenson und Lloyd, 1971a), kann bei keinem der unter-

suchten Kerne beobachtet werden.

In der Metaphase von P. bursaria kommt es zu einer parallelen Aneinanderlagerung der

Chromosomen vorwiegend in der mittleren Region des Kerns, dessen Polkappen leicht

gebogen erscheinen (s.a. Abb. 12a). Abb. 13a zeigt einen Schnitt im mittleren Bereich

des Kerns, 13b einen Schnitt in der Nähe des Pols; nahe des anderen Pols wiederholen

sich die Bilder (nicht abgebildet), so daß die gebogene Ausbildung beider Pole deutlich

wird.

In Abbildung 13d können Mikrotubuli nachgewiesen werden, die an den Mikrolamellen

inserieren.

Die Anzahl der Filamente hat gegenüber der Inter- und Prophase weiterhin abgenom-

men. Ihr Durchmesser beträgt zwischen 6 und 10 nm (Abb. 13c). In seltenen Fällen ist

es möglich, einen direkten strukturellen Übergang von Filamenten in Mikrotubuli auf-

zuzeigen (Abb. 13d).

Neben den komplett ausgebildeten Mikrotubuli sind auch solche zu erkennen, die im

Querschnitt eine C-Struktur erkennen lassen (Abb. 13c).

Die Chromosomen werden, wie in Abbildung 13b und inset ersichtlich, dicht von den

Mikrolamellen und Mikrosepten umschlossen. Diese stehen wiederum in engem Kon-

takt zu einem dichten Ring aus Mikrotubuli, welche das einzelne Chromosom flankie-

rend umgeben.

Membranmaterial kann zu diesem Zeitpunkt in nicht unerheblicher Menge im Nucleo-

plasma aufgezeigt werden (Abb. 13a inset). Daß es sich hierbei um Membranmaterial

innerhalb des Kerns und nicht um eine angeschnittene Einfaltung der Kernmembran

handelt, ist am Fehlen der Kernporen zu erkennen, die bekanntlich ein Charakteristikum

der Kernmembran darstellen. Auch besitzt das von den Membranen eingeschlossene

Tafel 6

Prometaphase

Abb. 12a: Bereits im Phasenkontrast zeigt sich die strukturelle Umwandlung des Sekundärpols. Er ist morphologisch nicht mehr vom Primärpol zu unter-scheiden und weist mit einer Länge von 19 µm eine deutliche Streckung im Vergleich zu inter- und prophasischen Stadien auf. Maßstab: 10µm

Abb.12b: Auch in der Prometaphase sind Chromosomen am Primärpol (PP) weiter-hin stärker kondensiert, als in der Nähe des Sekundärpols. Filamente erstrecken sich in dieser Phase über die gesamte Länge des Kerns (Pfeil-kopf: Filamente). Alle Chromosomen sind längs zur Teilungsrichtung angeordnet. Maßstab: 1 µm

Abb.12c: Die enge Assoziation der Mikrolamellen mit den Chromosomen wird deutlich (kleiner Pfeil: Mikrolamelle). Der Längsschnitt durch den Pri-märpol zeigt seinen dichten Besatz mit Mt, deren Durchmesser 25 nm beträgt (großer Pfeil), und Filamenten mit einem Durchmesser von 10 nm (Pfeilkopf). Maßstab: 0,2 µm

Abb.12d: Der Schnitt durch den Sekundärpol zeigt in dieser Phase eine wesentlich geringere Anzahl an Mikrotubuli (Pfeil), als es am Primärpol der Fall ist. Filamente sind zahlreich vertreten (Pfeilkopf). Maßstab: 0,2 µm

Tafel 7

Metaphase

Abb. 13a: Schnitt im mittleren Bereich des Kerns: Die parallel zueinander angeord-neten Chromosomen liegen vorwiegend im Längsschnitt vor. Membran-material kann im Kern nachgewiesen werden (Inset, Pfeil). Maßstab: 1 µm, Inset 0,5 µm

Abb. 13b: Das Bild im Bereich des Primärpols zeigt Chromosomen, die vorwiegend im Querschnitt vorliegen. Aus den Bildern 13 a und b, die denselben Kern darstellen, ergibt sich die abgewinkelte Form der Polkappen. Die Chro-mosomen sind von Mikrolamellen (Pfeil) umgeben, Mikrosepten sind erkennbar (Pfeilkopf). Mikrotubuli umgeben die Chromosomen ringför-mig (Inset). Der Gehalt an Filamenten hat im Vergleich zur Prophase deutlich abge-nommen, wohingegen Mt nun wesentlich zahlreicher auftreten. Maßstab: 0,5µm, Inset 0,2 µm

Abb. 13c: Im Querschnitt sind neben komplett ausgebildeten auch C-förmige Mi-krotubuli zu erkennen (Pfeil). Filamente besitzen einen Durchmesser von 6-10 nm (Pfeilköpfe). Maßstab: 0,2 µm

Abb. 13d: In einigen Fällen ist ein direkter struktureller Übergang von Filamenten in Mikrotubuli erkennbar (Pfeilkopf). Mikrotubuli inserieren an den mit den Chromosomen assoziierten Mikrolamellen (Pfeil). Maßstab: 0,2 µm

Ergebnisse 44

Plasma das gleiche Erscheinungsbild wie das umgebende Nucleoplasma und unter-

scheidet sich somit von dem völlig anders erscheinenden Cytoplasma.

3.1.7 Anaphase

Die Anaphase ist in zwei Teilphasen unterteilt: Während sich in der Anaphase A die

Chromosomen zu den Kernpolen bewegen, werden die Chromosomenfronten in der

Anaphase B durch eine Streckung des sich teilenden Kerns getrennt.

In der späten Anaphase A von P. bursaria sind bereits interzonale Mt zu verzeichnen,

die zu diesem Zeitpunkt der Mitose das erste Mal auftreten (Abb.14a und b). Durch die

Lage der Mikrotubuli kann eine leichte Torsion des Kerns vermutet werden. Vereinzelt

sind im Bereich der Chromosomen neben Mikrotubuli auch Filamente zu dokumentie-

ren, die einen Durchmesser von ca. 7 nm besitzen (Abb. 14c), jedoch ist in anaphasi-

schen Kernen der Mikrotubuli-Gehalt im Vergleich zu vorausgegangenen mitotischen

Phasen immer deutlich erhöht, wohingegen die Anzahl der Filamente reduziert ist (z.B.

Abb. 14a im Vergleich zu Abb. 10b). Nur in sehr

seltenen Ausnahmefällen kann in der Anaphase

noch eine erhöhte Zahl von Filamenten

nachgewiesen werden (Abb. 14d).

Die Mikrolamellen gleichen in ihrem Erschei-

nungsbild denen der Metaphase (z.B. Abb. 15a),

wobei Mikrotubuli an der äußeren Mikrolamelle

inserieren. Die innere Lamelle ist über elektronen-

dichtes Material mit dem Chromatin assoziiert

(Abb. 15b), wie es in Schema 2 dargestellt ist.

Schema 2: Schematische Darstellung der mikro-lamellaren Struktur, wie sie sich aus den Abbil-dungen 13b+inset, 15b und 17 ergibt: Die beiden Lamellnm besitzen einen Abstand von ca. 6 nm zueinander und verbunden. Mikrotubuli inserieren direkt an dem äußerenmosom aber auch ringförmig, was durch die beiden flankDie Lamellen bilden eine becherförmige Struktur, die dedichtes Material, das sich in seiner Struktur von der desfüllt den Hohlraum zwischen Chromosom und innerer Mik

Distal zur Mitte des Stemmkörpers – aber außerhalb der

phase B ein dichter Kranz aus Mikrotubuli direkt unterh

den, die parallel zur Streckungsachse des Kerns ausgerich

ihrer Lokalisation zu der Bezeichnung „Manschetten-M

und Ruthmann, 1982a ) oder „sheath“ - Mikrotubuli

en mit einer jeweiligen Stärke von 8 sind durch 20 nm lange Mikrosepten Lamellensaum, umgeben das Chro-ierenden Mt angedeutet wird (Pfeil). m Chromosom aufsitzt. Elektronen- Chromatins deutlich unterscheidet, rolamelle aus.

Halbspindel – ist in der Ana-

alb der Kernmembran zu fin-

tet sind (Abb. 16), was gemäß

ikrotubuli“ (Eichenlaub-Ritter

(Tucker et al., 1985) führte.

Tafel 8

Anaphase

Abb. 14a: In der Anaphase A sind erstmalig interzonale Mt zwischen den Halbspin-deln nachzuweisen (Pfeil). Aufgrund ihrer Ausrichtung kann eine leichte Torsion des Kerns vermutet werden. Maßstab: 2 µm

Abb. 14b: In der Detailaufnahme kann der Durchmesser der interzonalen Mikrotu-buli mit 25 nm bestimmt werden. Maßstab: 0,5 µm

Abb. 14c: Im Bereich der Halbspindeln lassen sich noch vereinzelt Filamente nach-weisen, die einen Durchmesser von 7 nm besitzen (Pfeil). Maßstab: 0,5 µm

Abb. 14d: In einigen wenigen Ausnahmefällen ist in lokal begrenzten Bereichen der Halbspindel die Anzahl der Filamente erhöht. Maßstab: 0,5 µm

Abb. 15a: Die Mikrolamellen der Anaphase gleichen in ihrem Erscheinungsbild den in der Metaphase dokumentierten Strukturen. Deutlich sind Mikrolamel-len und Mikrosepten zu erkennen (Pfeil). Maßstab: 0,5 µm

Abb. 15b: Detailaufnahmen lassen 2 Lamellen erkennen, wobei an der Äußeren (kleiner Pfeil) Mikrotubuli (großer Pfeil) inserieren. Die innere Lamelle (Pfeilkopf) steht über elektronendichtes Material mit dem Chromosom in Kontakt. Maßstab: 0,2 µm

Tafel 9

Anaphase

Abb. 16: Distal zur Mitte des Stemmkörpers, kurz unterhalb der Halbspindeln, kann ein dichter Kranz aus Mikrotubuli nachgewiesen werden, die paral-lel zur Streckungsachse des Kerns orientiert sind und als Manschetten - oder sheat-Mt bezeichnet werden (Pfeil). Maßstab: 0,2 µm

Abb. 17: In der Anaphase B ist der jeweilige Kernpol stark elongiert und weist ei-nen Durchmesser von ungefähr 0,8 µm und eine Länge von mind. 3,3 µm auf. Die Mt in diesem Bereich des Kerns sind parallel der Kernmembran ausgerichtet (Inset). In diesem Schnitt sind die beiden Mikrolamellen der dem Chromosom aufsitzenden, kappenförmigen Struktur gut zu erkennen (Pfeil). Die Ausrichtung der Mikrolamellen lassen die Wanderungsrich-tung des Chromosoms Richtung Pol deutlich werden. Maßstab: 0,5 µm

Abb. 18a: In der späten Anaphase B haben sich die zukünftigen Tochterkerne (Pfei-le) bis zu 73 µm voneinander entfernt und sind am jeweils entgegen-gesetzten Pol der Zelle lokalisiert. Ihre Länge beträgt im Mittel 9 µm. Teile des Stemmkörpers sind erkennbar (großer Pfeil). Der Makronucleus (Ma) weist eine leichte Streckung auf. Maßstab: 10 µm

Abb. 18b: Eine Detailaufnahme des Stemmkörpers zeigt im Längsschnitt, daß Mt nur in unmittelbarer Nähe der Kernmembran auftreten. Der Stemmkörper weist bei einer Breite von 5,5 µm nahezu keine Mt in seinem Inneren auf und ist somit hohl. Maßstab: 2 µm

Tafel 10

Anaphase

Abb. 19a: Innerhalb der Halbspindel weisen die Mikrotubuli einen variablen Durchmesser auf. Unmittelbar unterhalb der Kernmembran sind sowohl Mt von 25 nm (Pfeil), als auch mit einem Durchmesser von lediglich 19 nm lokalisiert (kleine Pfeile). Die Abmessungen der Halbspindel betragen 2,8 µm × 2,2 µm. Maßstab: 0,2 µm

Abb. 19b: In größerer Entfernung zum Kernpol sind innerhalb der Halbspindel Mt zu dokumentieren, die einen ungewöhnlich großen Durchmesser von 30 nm besitzen (Pfeil) und sich in der Nähe der Kernmembran befinden. Maßstab: 0,2 µm

Abb. 19c: Distal der Kernmembran weisen Mt einen Durchmesser von z.T. 32 nm auf (Pfeil). Der Größenunterschied zu direkt benachbarten Mt mit dem üblichen Durchmesser von 25 nm ist offensichtlich. Maßstab: 0,1 µm

Ergebnisse 45

Filamente sind in dieser Spindelregion nicht mehr nachzuweisen.

In der Anaphase B weisen die Kernpole nicht mehr die übliche spitzzipflige Ausprä-

gung auf, sondern sind vielmehr stark elongiert (Abb. 17). Der Durchmesser des Pols

beträgt in dieser Phase 0,8 µm bei einer Länge von mindestens 3,3 µm und weist einen

dichten Besatz von Mikrotubuli auf, die hier aufgrund der persistierenden Kernmem-

bran konvergieren und dann parallel zueinander und der Kernmembran ausgerichtet

sind (Abb.17 inset). Durch die Ausrichtung der Chromosomen in Richtung des Pols

(Abb.17) kann sicher davon ausgegangen werden, daß es sich bei dieser ungewöhnli-

chen Streckung nicht um die Ausbildung des Stemmkörpers handelt, wie sie z.B. in

Abbildung 29a zu sehen ist.

In der späten Anaphase B haben sich die beiden prospektiven Tochternuclei mit einer

jeweiligen Länge von 9 µm bis auf 73 µm voneinander entfernt und sind nun am ante-

rioren bzw. posterioren Pol des Tiers lokalisiert (Abb. 18a). Der Stemmkörper ist nun

voll ausgebildet und weist distal der beiden Halbspindeln einen Mikrotubuli-Besatz auf,

der sich auf die unmittelbare Nähe der Kernmembran beschränkt und somit bei einer

Breite von 5,5 µm nahezu hohl ist (Abb. 18b).

Die zu diesem Zeitpunkt beginnende amitotische Teilung des Makronucleus wird durch

eine leichte Streckung angezeigt, wie sie in Abbildung 18a dokumentiert ist.

Die mikronucleären Mikrotubuli weisen je nach Lokalisation einen variablen Durch-

messer auf. In der Nähe des jeweiligen Pols – und somit noch innerhalb der Halbspindel

– ist der übliche Durchmesser von 25 nm nachzuweisen, wohingegen sich unmittelbar

benachbarte Mikrotubuli mit einem Durchmesser von zum Teil nur 19 nm wesentlich

fragiler darstellen (Abb. 19a). Diese Mikrotubuli sind meist nur in unmittelbarer Nähe

der Kernmembran zu finden.

Distal des Pols – aber weiterhin im Bereich der Halbspindel – lassen sich im Bereich

der Kernmembran auch Mikrotubuli nachweisen, die mit bis zu 30 nm einen wesentlich

größeren Durchmesser besitzen, als es für Mikrotubuli normalerweise der Fall ist (Abb.

19b). In diesem Bereich des Kerns lassen sich distal der Kernmembran auch vereinzelt

Mikrotubuli dokumentieren, deren Durchmesser bis zu 32 nm beträgt (Abb. 19c).

Das vereinzelte Auftreten von Mikrotubuli mit größerem Durchmesser läßt sich im

Stemmkörper weiter verfolgen. Ein dichter Kranz Manschetten-Mikrotubuli umgibt den

Stemmkörper im interchromosomalen Bereich. Die unmittelbar unterhalb der Kern-

membran gelegenen Mikrotubuli werden auch im Stemmkörper als Manschetten- oder

Ergebnisse 46

sheath-Mt bezeichnet. Sowohl Stemmkörper- als auch sheath-Mt weisen hier in einigen

Fällen einen Durchmesser von bis zu 32 nm auf (Abb. 21a). Quervernetzungen zwi-

schen den Mikrotubuli können regelmäßig nachgewiesen werden (Abb. 21a).

Wie schon in Längsschnitten angedeutet (Abb. 18b), stellt sich der Mikrotubulibesatz

des Stemmkörpers in einiger Entfernung zu den jeweiligen Spindelpolen auch im Quer-

schnitt deutlich als Ring dar. Das Lumen des Stemmkörpers weist weder Mt auf, noch

sind Filamente zu lokalisieren. Erst in der Nähe der Stemmkörpermitte sind auch im

Lumen vereinzelt Mt zu dokumentieren, wobei die Manschetten-Mt ihre ursprüngliche

Verteilung direkt unterhalb der Kernmembran beibehalten (Abb. 22a und b), jedoch nun

nicht mehr unmittelbar von den Stemmkörper-Mt flankiert werden, wie es in Abb. 21 zu

sehen ist.

Ist die Abmessung der Halbspindel nahe des Kernpols mit 2,8 µm × 2,2 µm anzugeben

(Abb. 19a), hat der Kern in diesem Bereich die Maße 3,1 µm × 1,3 µm anstelle von 1,8

µm × 1,6 µm in Bereichen, in denen der Stemmkörper noch einen mehrreihigen, Kern-

membran-nahen und ringförmigen Besatz an Mt aufweist (Abb. 21).

Auch in der Nähe der Spindelmitte variiert der Mikrotubuli-Durchmesser erheblich.

Während ein Großteil den üblichen Durchmesser von 25 nm aufweist, treten vereinzelt

aber auch Durchmesser von 28 bis 32 nm auf (Abb. 22b). Bemerkenswert ist hierbei die

Tatsache, daß Mikrotubuli mit größerem Durchmesser in diesem Bereich des Stemm-

körpers vorwiegend weit unterhalb der Kernmembran nachzuweisen sind.

Im Stadium der Anaphase B können im Bereich des Stemmkörpers neben Mikrotubuli

niemals Filamente beobachtet werden. Die prospektiven Tochternuclei weisen ebenfalls

eine hohe Anzahl von Mikrotubuli auf, wobei nur in seltenen Fällen auch einige wenige

Filamente auszumachen sind. Niemals aber ist ihre Anzahl so hoch wie in den vorange-

gangenen Stadien der Mitose. Die Chromosomen sind auch in der Anaphase noch stark

kondensiert und weisen weiterhin eine enge Assoziation mit den Mikrolamellen und

Mikrosepten auf (Abb. 23).

Die Kernmembran der beiden zukünftigen Tochter-Mikronuclei ist auch während dieses

Stadiums mit Kernporen besetzt, wohingegen die Membran im Bereich des Stemmkör-

pers keinerlei Porenkomplexe aufweist (z.B. Vergleich der Abb. 21 und 23). Die zeit-

lich versetzte Division des Makronucleus verläuft parallel zur Teilungsrichtung des Mi-

kronucleus, wobei die beiden Kerne immer noch eine enge Nachbarschaft zueinander

aufweisen, Assoziationen untereinander jedoch – wie noch in der Prophase zu doku-

Ergebnisse 47

mentieren, sind (Abb. 11a) nicht mehr zu beobachten (Abb. 20b). Die starke Verjün-

gung des Makronucleus wird im Vergleich der Bilder 20a und b deutlich, in denen der

Durchmesser dieses Kerns von 4,8 µm – geschnitten im vorderen Drittel der Zelle – auf

1,9 µm zur Zellmitte hin abnimmt.

Zeitgleich treten im Cytoplasma Mikrotubuli in engem Kontakt zu dem sich teilenden

Mikronucleus (Abb. 24).

Die Zellteilung bei Paramecium bursaria beginnt bereits, während die Mikronucleus-

Teilung noch nicht abgeschlossen ist bzw. wie im Falle des Makronucleus erst begon-

nen hat. Im Gegensatz zur Kernteilung, die sich in Längsrichtung des Tiers vollzieht,

erfolgt die Zellteilung senkrecht dazu. Neben der schon im Lichtmikroskop deutlich zu

erkennenden Teilungsfurche läßt sich im Elektronenmikroskop nahe des Zellcortex ein

dichter fibrillärer Saum nachweisen (Abb. 25). Eine Trennung in Proter (Vordertier)

und Ophiste (Hintertier) ist bereits zu erkennen und läßt eine bevorstehende Durch-

schnürung der Zelle vermuten (Abb. 25, inset).

3.1.8 Telophase

Die extreme Elongation des Pols, wie sie noch in der Anaphase zu beobachten war,

kann in der Telophase nicht mehr dokumentiert werden, jedoch verjüngt sich der Mi-

kronucleus weiterhin zum Kernpol hin (Abb. 26).

Entgegen den Erkenntnissen der elektronenmikroskopischen Untersuchungen von

Schwartz (1976) und Lewis et al. (1976) lassen sich auch in der Telophase Mikrola-

mellen und assoziierte Mikrosepten nachweisen, wenn auch nicht mehr in der Deutlich-

keit, wie es in der Metaphase/Anaphase der Fall war (Abb. 27b).

Filamente sind in den Halbspindeln nur in sehr geringer Anzahl zu erkennen, ihr Vor-

kommen wird erst zu einem späten Zeitpunkt bzw. nach Abschluß der Telophase wieder

häufiger (Abb. 27b).

Membran-Rudimente, welche erstmals in der Metaphase dokumentiert wurden, sind in

einigen Fällen auch in der Telophase in der Halbspindel vorhanden (Abb. 28), wohin-

gegen sie in den späteren Stadien der Anaphase niemals nachgewiesen werden konnten.

Sehr auffällig stellt sich der Stemmkörper in unmittelbarer Nähe der Halbspindel dar:

der Kern mit einem maximalen Durchmesser von 7 µm verjüngt sich distal des Kern-

pols auf einen Durchmesser von 1 µm und geht dann in den Stemmkörper über. Dieser

ist über eine dokumentierte Länge von mindestens 14,5 µm dicht mit Mikrotubuli aus-

gefüllt (Abb. 29a), die parallel zueinander ausgerichtet sind (Abb. 29b).

Tafel 11

Anaphase

Abb. 20a: Schnitt distal der Zellmitte. Der Makronucleus (Ma) mißt im Querschnitt 4,8 µm × 4,8 µm. Der Mikronucleus (Mi) ist nicht mehr, wie in der Prophase, mit dem Makronucleus assoziiert. Maßstab: 1 µm

Abb. 20b: Die starke Verjüngung des Makronucleus wird im Vergleich zu Abb. 20a deutlich. Die Abmessungen des Makronucleus (Ma) betragen nun im Querschnitt 1,9 µm × 1,9 µm. Mi = Mikronucleus. Maßstab: 1 µm

Abb. 21: In Querschnitten des Stemmkörpers distal der Stemmkörpermitte kann ein mehrteiliger Ring aus Mt nachgewiesen werden, wobei der äußere Ring von den sog. Manschetten- oder sheath-Mt gebildet wird. Der Mt-Durch-messer beträgt bis zu 32 nm (Pfeilköpfe). Quervernetzungen bestehen zwischen den Mikrotubuli (Pfeil). Das Lumen des Stemmkörpers, der die Abmessungen 1,8 µm × 1,6 µm besitzt, weist keinerlei Mt auf. Maßstab: 0,2 µm

Abb. 22a: Übersicht: Querschnitte im Bereich der Stemmkörpermitte zeigen nur einen einfachen Ring aus Mt, wobei auch im Lumen vereinzelt Mt nach-gewiesen werden können. Die Maße von 3,1 µm × 1,3 µm weisen auf eine Dilatation in diesem Bereich hin. Maßstab: 0,5 µm

Abb. 22b: Mikrotubuli mit erhöhtem Durchmesser von 28-32 nm sind in diesem Bereich vorwiegend weit unterhalb der Kernmembran nachzuweisen (Pfeile). Maßstab: 0,2 µm

Tafel 12

Anaphase

Abb. 23: Auch in der späten Anaphase B weisen die Chromosomen im Bereich der Halbspindel immer noch eine enge Assoziation mit den Mikrolamellen (Pfeil) auf. Filamente sind nur selten nachzuweisen (Pfeilkopf). Kernpo-ren sind in diesem prospektiven Tochterkern vorhanden (Kp). Maßstab: 0,5 µm

Abb. 24: Dichte Mikrotubulibündel (Pfeil) flankieren im Cytoplasma den Mikronu-cleus (Mi). Maßstab: 0,5µm

Abb. 25: Bereits in der späten Anaphase wird die Cytokinese eingeleitet, erkennbar an der senkrecht zur Längsachse der Kerne verlaufenden Teilungsfurche (Inset, Pfeil). Im Bereich der Teilungsfurche ist dicht unterhalb des Zell-cortex ein dichter, fibrillärer Saum erkennbar (Pfeil). Maßstab: 0,5µm; Inset 5 µm

Tafel 13

Telophase

Abb. 26: Auch in der Telophase ist eine Verjüngung des Kerns zum Pol hin zu be-obachten, die in der Anaphase dokumentierte extreme Elongation kann jedoch nicht mehr gezeigt werden. Maßstab: 1 µm

Abb. 27a: In der Telophase sind Mikrolamellen weiterhin vorhanden (Pfeilköpfe). Maßstab: 0,5µm

Abb. 27b: In der Halbspindel sind selten Filamente nachzuweisen (Pfeil). Hohe Ver-größerungen zeigen, daß Mikrolamellen nicht mehr so distinkt ausgeprägt sind, wie es in der Anaphase der Fall ist. Maßstab: 0,2 µm

Abb. 28: In einigen Fällen sind in der Telophase Membrane im Bereich der Halb-spindel zu dokumentieren (Pfeil). Maßstab: 0,2 µm

Abb. 29a: Der zukünftige Tochterkern mit einem Durchmesser von 7 µm verjüngt sich im Stemmkörperbereich auf 1 µm. Auf einer Länge von mind. 14,5 µm weist der Stemmkörper einen konstanten Durchmesser auf. Maßstab: 2 µm

Abb. 29b: Der Stemmkörper zeigt auf einer Länge von mind. 14,5 µm einen dichten Besatz mit Mt auf, die parallel zueinander ausgerichtet sind. Maßstab: 0,2 µm

Ergebnisse 48

Im weiteren Verlauf dilatiert der Stemmkörper zunehmend und besitzt ca. 30 µm distal

der Halbspindel einen maximalen Durchmesser von 3,8 µm (Abb. 30b).

Wie bereits in der Anaphase dokumentiert werden konnte, besteht der Stemmköper in

diesem dilatierten Bereich lediglich aus einem schmalen, ringförmigen Besatz von

Manschetten-Mikrotubuli und wenigen Stemmkörper-Mt mit dem aus der Anaphase

ermittelten variablen Durchmesser (25 nm–32 nm), der sich unmittelbar unterhalb der

Kernmembran befindet. Das so umschlossene Lumen des Stemmkörpers weist in die-

sem Bereich nur vereinzelt Mikrotubuli und keinerlei Filamente mehr auf.

Zum Zeitpunkt der mikronucleären Telophase ist die Teilung des Makronucleus bereits

fortgeschritten, jedoch ist die Elongation noch nicht abgeschlossen, wohingegen die

Stomatogenese bereits vollendet erscheint (Abb. 30a).

Im Nucleoplasma des somatischen Kerns bilden sich dichte Mikrotubulibündel unter-

halb der Kernmembran (Abb. 31a), die nur während der Teilung zu beobachten sind.

Die scheinbare Insertion der Mikrotubuli an den makronucleären Chromosomen weist

ultrastrukturell im Vergleich zum Mikronucleus ein vollständig anderes Bild auf, da

hier sowohl die Mikrolamellen als auch die Mikrosepten fehlen (Abb. 31b) und somit

keine kinetochorähnliche Struktur zu erkennen ist.

Im Stemmkörper des Kerns kommt es in dem Bereich, der vollständig und nicht nur

Kernmembran-nah von Mikrotubuli erfüllt ist, zu ersten, lokal begrenzten Depolymeri-

sationserscheinungen. Abb. 33 ff. zeigen einen solchen Bezirk in einem telophasischen

Kern. Die Struktur der Mikrotubuli löst sich in einem eng begrenzten Raum in ein elek-

tronentransparentes Erscheinungsbild auf (Abb. 32), das schon bei schwacher Vergröße-

rung die bekannten filamentösen Strukturen erkennen läßt, deren Durchmesser zwi-

schen 4 und 7 nm variiert. Die Kernmembran in diesem Bereich wirkt fragil.

Um eine eindeutige Klärung der Frage zu erlangen, ob es sich in diesem Fall um ein

Nebeneinander von Mikrotubuli und Filamenten in enger räumlicher Nachbarschaft

handelt, wie es in den frühen mitotischen Phasen häufig beobachtet werden kann, oder

ob sich ein direkter struktureller Übergang von Mikrotubuli in Filamente ereignet, wie

er von Schwartz (1976) vermutet wurde, erfolgte eine Untersuchung ausgewählter Be-

reiche des Stemmkörpers mit Hilfe einer Kippserie (Abb. 34a – l).

Tafel 14

Telophase

Abb. 30a: Die Teilung des Makronucleus (Pfeilkopf) ist zum Zeitpunkt der mikro-nucleären Telophase noch nicht abgeschlossen. Die Stomatogenese hin-gegen scheint weitgehend beendet (Pfeile = Cytostom). Maßstab: 15 µm

Abb. 30b: Distal der Halbspindel weist der Stemmkörper, wie auch in der Anaphase, eine Dilatation auf bis zu 3,8 µm auf. Mikrotubuli befinden sich vorwie-gend direkt unterhalb der Kernmembran (Pfeil). Maßstab: 1 µm

Abb. 31a: Im Makronucleus sind zum Zeitpunkt der Teilung Mikrotubulibündel di-rekt unterhalb der Kernmembran vorhanden (Pfeil). Ma = Makronucleus. Maßstab: 0,5 µm

Abb. 31b: Die Mikrotubuli (Pfeile) inserieren im Makronucleus scheinbar direkt an den Chromosomen, ohne daß spezielle, vermittelnde Strukturen – wie im Falle des Mikronucleus in Form der Mikrolamellen – nachgewiesen wer-den können. Maßstab: 0,5 µm

Tafel 15

Telophase, Depolymerisation der Stemmkörper-Mikrotubuli

Abb. 32: Übersicht: In einem lokal begrenzten Bereich des Stemmkörpers kommt es in der Telophase zu ersten Abbauerscheinungen der Mikrotubuli (Pfeil). Maßstab: 1 µm

Stereobild Abb. 33a, 33b:

Durch optische Überlagerung der beiden Abbildungen, die um 6° in der Längsachse der Mt gegeneinander gedreht sind, kann ein dreidimensio-nales Bild der Filamente und Mikrotubuli erzielt werden. Es kann deutlich dargestellt werden, wie Mikrotubuli in Filamente übergehen. Der Fila-mentdurchmesser variiert zwischen 4 und 7 nm. Maßstab: 0,2 µm

Kippserie Der Ultradünnschnitt wird parallel zur Längsachse des Stemmkörpers um eine defi-nierte Gradzahl aus seiner Ursprungslage (0°) gedreht. Der direkte strukturelle Über-gang von Mikrotubuli in Filamente ist so deutlich in allen Lagen zu erkennen. Der mar-kierte Bereich kennzeichnet in allen folgenden Abbildungen denselben Mikrotubulus, der in zwei Filamente zerfällt. Abb. 34a: um - 42° gedreht Abb. 34b: um - 36° gedreht Abb. 34c: um - 30° gedreht Abb. 34d: um - 24° gedreht Abb. 34e: um - 18° gedreht Abb. 34f: um - 12° gedreht Abb. 34g: um - 6° gedreht Abb. 34h: um 0° gedreht Abb. 34i: um 6° gedreht Abb. 34j: um 12° gedreht Abb. 34k: um 18° gedreht Abb. 34l: um 24° gedreht Abb. 34a-34l: Maßstab: 0,2 µm

Ergebnisse 49

Hierbei wird der Stemmkörper im Elektronenmikroskop parallel zur Längsrichtung der

Mikrotubuli um eine definierte Gradzahl gekippt. Sollten die Filamente über oder neben

dem entsprechenden Mikrotubulus lokalisiert sein, so müßte bei einem bestimmten

Kippwinkel keine strukturelle Verbindung mehr zwischen Filamenten und Mikrotubuli

zu erkennen sein.

Dies war bei keinem Kippwinkel der Fall.

Die Untersuchung macht deutlich, daß Filamente direkt aus den depolymerisierenden

Mikrotubuli hervorgehen und eine strukturelle Verbindung zu ihnen besitzen. Eine

räumliche Vorstellung dieses Vorgangs wird durch das Stereobild verdeutlicht (Abb.

33a und b).

Schema 1 zeigt eine Zusammenfassung der einzelnen Mitosestadien des Mikronucleus‘.

3.2 Charakterisierung der Kernproteine

3.2.1 Tubulinmodifikationen und ihre Verteilung im Kern

Posttranslationale Modifikationen des Tubulins sind vermutlich an der Ausbildung und

Aufrechterhaltung bestimmter Mikrotubuli-Anordnungen beteiligt (Piperno und Fuller,

1985), aber auch die Stabilität der fertig ausgebildeten Mikrotubuli kann über enzymati-

sche Modifikationen ihrer Tubulin-Untereinheiten indirekt erfolgen (Houliston und Ma-

ro, 1989).

Da in elektronenmikroskopischen Untersuchungen des Kerns von Paramecium bursaria

zum einen Mikrotubuli gezeigt werden konnten, die während des gesamten Zellzyklus‘

bestehen bleiben, zum anderen aber Mikrotubuli nachgewiesen wurden, die offensicht-

lich erst im Verlauf der Mitose aufgebaut werden, stellt sich die interessante Frage, in-

wiefern bestimmte Tubulin-Isoformen oder posttranslationale Modifikationen von Mt

im Kern nachzuweisen sind.

3.2.1.1 Nachweis des Gesamt - Tubulins

Durch Einsatz des gegen Hefe α-Tubulin gerichteten monoklonalen Antikörpers (mAk )

YOL 1/34 gelang es, die Gesamtmasse der Mikrotubuli eines Kerns zu markieren (Abb.

4b). Je nachdem, ob sich die Kerne in der Interphase oder aber in der mitotischen

Prophase befinden, variiert auch die Markierungsdichte: In der Prophase ist eine mas-

sive Markierung des Primärpols zu erkennen (Abb. 7b ff.). Die Markierung korreliert

mit der Verteilung der Filamente zu Beginn der Prophase, wie sie im elektronenmikro-

skopischen Bild zu erkennen ist (z.B. Abb. 11a und b).

Schema 1

Auf den beiden folgenden Seiten werden schematisch die einzelnen Stadien der Mitose bei P. bursaria verdeutlicht. Die Zeichnungen beruhen auf den in den Ergebnissen dargestellten ultrastrukturellen Untersuchungen. Die Größenverhältnisse der Kerne werden aufgrund der enormen Streckung des Kerns in der Ana- und Telophase nicht exakt wiedergegeben. Interphase Der Kern besitzt eine charakteristische, spitzzipflige Ausprägung des Primärpols, wo-hingegen der Sekundärpol abgerundet erscheint. Das Chromatin ist schwach kondensiert und ungleichmäßig im Kern verteilt. Periphere Mt sind parallel der Kernmembran orientiert (periphere Mt). Im Nucleoplasma ist feines filamentöses Material nachweisbar. Prophase Periphere Mt sind weiterhin in der üblichen Orientierung vorhanden. Die Kondensation des Chromatins schreitet, am Primärpol beginnend, zum Sekundärpol fort. Zeitgleich beginnen Mikrotubuli und Filamente, vom Primärpol auszustrahlen. Zu einem späten Zeitpunkt der Prophase werden Chromosomen von Filamenten ringförmig umschlossen. Mikrolamellen und assoziierte Mikrosepten beginnen sich zu bilden. Prometaphase Die am Primärpol auswachsenden Filamente haben den Sekundärpol erreicht, ebenso die Spindel-Mikrotubuli, die am Sekundärpol aber noch nicht so zahlreich vorliegen, wie am Primärpol. Der Kern hat sich gestreckt, der Sekundärpol gleicht in seinem spitz-zipfligen Erscheinungsbild nun dem Primärpol. Metaphase Die Pole befinden sich in abgewinkelter Position zum übrigen Kern. Chromosomen richten sich parallel zueinander aus, wobei eine typische Metaphaseplatte nicht beo-bachtet werden kann. Mikrotubuli inserieren einerseits an den nun voll ausgebildeten Mikrolamellen und Mikrosepten, andererseits umgeben sie die Chromosomen ringför-mig. Die Anzahl der Filamente ist stark reduziert, wohingegen Mikrotubuli zahlreich auftreten. Anaphase A Die Kernpole sind in der Anaphase lanzettartig verlängert und dicht mit Mikrotubuli ausgefüllt. Filamente sind zu diesem Zeitpunkt nur sehr selten nachzuweisen. Die Chromosomen sind zu den Kernpolen gewandert. Bereits in der Anaphase A sind inter-zonale Mt vorhanden, so daß ein fließender Übergang zur Anaphase B besteht.

Anaphase B Die Anaphase B ist durch eine extreme Elongation des Kerns gekennzeichnet. Im Stemmkörperbereich können zu diesem Zeitpunkt nie Filamente nachgewiesen werden. Die Membran des Stemmkörpers weist keine Kernporen auf. In einigen Fällen zeigt der Kern eine leichte Torsion. Ein Ring von Mt ist im Stemmkörper nahe der Halbspindel zu finden (Manschetten- oder sheat-Mt), wohingegen der Kern im Bereich der Spin-delmitte dilatiert erscheint. In diesem Bereich liegen Mt nur als einreihiger Ring direkt unterhalb der Kernmembran vor.

Telophase Auch in dieser Phase sind Mikrolamellen und Mikrosepten vorhanden. Der Kern ist nun maximal gestreckt. Zu einem späten Zeitpunkt der Telophase können im extrem elongierten Stemmkörper-bereich erste Zerfallserscheinungen von Mikrotubuli gezeigt werden. Diese gehen in einem lokal begrenzten Bereich in Filamente über. Auch in den Halbspindeln steigt die Zahl der Filamente wieder an.

Ergebnisse 50

Diesen Gehalt an Gesamt-Tubulin im Western-Blot unter Verwendung des Ak YOL

1/34 darzustellen, gelang trotz wiederholter Versuche nicht.

Der Einsatz eines weiteren, polyklonalen anti-Tubulin Antikörpers gab ein ähnliches

Markierungsmuster in der Immunfluoreszenz (Abb. 35b). Die Verteilung der Fluores-

zenz läßt hier ebenfalls eine Kongruenz zu der Verteilung der Filamente im Kern erken-

nen, wobei Mikrotubuli allerdings nicht, wie bei einer Markierung mit dem YOL-Ak,

markiert waren.

3.2.1.2 Nachweis des tyrosinierten/detyrosinierten Tubulins Eine bekannte und bei vielen Organismen nachgewiesene posttranslationale Modifika-

tion des Tubulins besteht in der Detyrosinierung der α-Untereinheit. Es ist jedoch phy-

siologisch ebenso möglich, bereits detyrosiniertes Tubulin wieder zu tyrosinieren (Ray-

bin und Flavin, 1975).

Mittels dreier gegen tyrosiniertes Tubulin gerichteter monoklonaler Antikörper sollte

die räumliche Verteilung der tyr-Mikrotubuli im Mikronucleus überprüft werden.

Weder durch die Anwendung des Antikörper 27C2, noch durch Einsatz des Antikörpers

YL1/2 oder TUB–1A2 konnte eine Markierung des Kerns erfolgen. Ebenso war eine

Markierung von Kernextrakten im Western-Blot mit Hilfe dieser Antikörper durchweg

nicht möglich.

Bedingt durch die negativen Ergebnisse bezüglich einer Tyrosinierung des α-Tubulins,

lag die Vermutung nahe, daß ein Großteil der Mt-Population sich im überwiegend dety-

rosinierten Zustand befinden könnte. Dies wurde durch den Einsatz der Antikörper 1D5

und anti-E überprüft.

Wie bereits bei dem Einsatz der Antikörper gegen tyrosiniertes Tubulin festgestellt,

ergab auch die Inkubation der isolierten Kerne mit den o.g. Antikörpern keine nen-

nenswerte Markierung. Lediglich ein sehr geringer Prozentsatz der mit dem Ak 1D5

behandelten Kerne weist eine sehr geringe Fluoreszenz auf, wohingegen Basalkörper

und besonders Oralapparate eine deutliche Markierung zeigen (Abb. 36).

Auch beim Einsatz im Western-Blot konnte mit diesen Antikörpern an isolierten Mi-

kronuclei kein Nachweis von detyrosiniertem Tubulin erfolgen.

3.2.1.3 Nachweis des acetylierten Tubulins Alle posttranslationalen Modifikationen an Tubulin-Molekülen finden an den hochva-

riablen carboxyterminalen Enden des α- oder β-Tubulins statt. Die einzige Ausnahme

Ergebnisse 51

hiervon besteht in der Acetylierung des α-Tubulins, die an der ε-Aminogruppe des Ly-

sin 40 stattfindet (L’Hernault und Rosenbaum, 1985; Piperno und Fuller, 1985).

Wie alle posttranslationalen Modifikationen ist auch die Acetylierung des α-Tubulins in

eher stabilen Mikrotubuli-Populationen wie Neuronen (Black et al., 1989) und Basal-

körpern (LeDizet und Piperno, 1987), aber auch in Mikrotubuli der Interphase von Säu-

ger-Zellkulturen (Webster und Borisy, 1989) und Kinetochor-Mikrotubuli (Wilson und

Forer, 1997) zu finden.

Inwiefern eine Acetylierung der Mikrotubuli im Mikronucleus vorliegt, wurde mittels

der Antikörper 6-11B1 und 3A5 untersucht.

Beide Antikörper unterscheiden sich nicht in ihrem Markierungsmuster.

Die peripheren Mikrotubuli werden deutlich markiert (Abb. 37b und c), analog der

Markierung mit dem monoklonalen Antikörper gegen Hefe α-Tubulin, YOL1/34.

Besonders durch die Darstellung am konfokalen Laser-Scanning Mikroskop läßt sich

die räumliche Ausprägung der Mikrotubuli gut darstellen. Sie strahlen vom Primärpol

aus und ziehen in Bündeln Richtung Sekundärpol, wobei sie vorwiegend dicht unterhalb

der Kernmembran lokalisiert sind. Die Mt-Dichte nimmt hierbei mit steigender Entfer-

nung zum Primärpol kontinuierlich ab (Abb. 37d).

Bei einem Vergleich ist allerdings auffällig, daß Markierungen gegen acetyliertes Tu-

bulin die Mikrotubuli immer distinkter und brillanter darstellen, als es bei YOL 1/34 der

Fall ist, wobei eine diffuse Fluoreszenz des Karyoplasmas nur selten zu beobachten ist.

Eine Doppelmarkierung der Kerne mit diesen beiden Antikörpern zeigt im Bereich des

Primärpols ein identisches Markierungsmuster, wohingegen in weiter vom Primärpol

entfernten Bereichen nur eine diffuse Markierung des YOL Ak nachzuweisen ist, ohne

daß in diesem Bereich Mt distinkt markiert sind (Abb. 40).

Beide Antikörper markieren die Cilien und Basalkörper der Zellen (Abb. 38). Im We-

stern-Blot gelang der Nachweis eines Proteins mit einem errechneten Molekulargewicht

von etwa 53 kDa (Abb. 39). Die ermittelten Molekulargewichte glichen sich bei beiden

gegen acetyliertes Tubulin eingesetzten Antikörpern.

Tafel 16

Nachweis des Gesamt-Tubulins durch einen polyklonalen anti-Tubulin Ak

Abb. 35a: Phasenkontrast (Pfeil = Primärpol) 2,5 cm Abb. 35b: Die Fluoreszenz ist am Primärpol des Kerns (Pfeilkopf) stärker als am

Sekundärpol. Mikrotubuli können nicht dargestellt werden.

Nachweis des detyrosinierten Tubulins durch den mAk 1D5

Abb. 36: Isolierte Oralapparate weisen eine kräftige Fluoreszenz auf, wohingegen Kerne in nahezu keinem Fall markiert sind.

Nachweis des acetylierten Tubulins durch den mAk 6-11B1

Abb. 37a: Phasenkontrast (Pfeil = Primärpol) Abb. 37b: Die peripheren Mikrotubuli werden deutlich markiert. Fokussiert wurde

auf den Bereich des Primärpols (PP). Abb. 37c: Auf den Bereich des Sekundärpols (SP) fokussiert. Periphere Mt reichen

bis nahe an den Sekundärpol. Maßstab 35 a-37c: 10 µm

CLSM-Darstellung Abb. 37d: Die räumliche Ausprägung der peripheren Mt kann durch die digitale

Überlagerung von mehreren Bildebenen verdeutlicht werden. Sie strahlen vom Primärpol (Pfeilkopf) zum Sekundärpol, wobei die Mt-Dichte konti-nuierlich abnimmt. Maßstab: 5 µm

Abb. 38: Cilien und Basalkörper der Pellicula weisen eine distinkte Markierung auf (Pfeilkopf = Basalkörper, Pfeil = Cilien). Maßstab: 10 µm

Western-Blot Abb. 39: Western-Blot mit dem Antikörper 6-11B1 zeigt die Markierung einer

Bande im Bereich von 53 kDa. Nachweis des acetylierten Tubulins (6-11B1, rot) und Gesamt-Tubulins (YOL1/34,

grün), CLSM Aufnahme

Abb. 40: Im Bereich des Primärpols weisen beide Antikörper das gleiche Markie-rungsmuster auf. Die Überlagerung der Fluoreszenz führt zu einer orangen Farbe der Markierungen. Im Bereich des Sekundärpols ist vor-wiegend eine diffuse Markierung des Ak YOL 1/34 nachzuweisen. Maßstab: 5 µm

Ergebnisse 52

Figur 1: Molekulargewichtsbestimmung des mit dem mAk 6-11B1 markierten Tubulins

Diese Abbildung zeigt das Molekulargewicht des durch den mAk 6-11B1 markierten Antigens. Die Be-rechnung erfolgte mit dem Programm PROTMW. Die Laufweiten des eingesetzten Markers werden durch die schwarzen Quadrate symbolisiert. Die Ausgleichskurve (gestrichelt) besitzt einen hyperboli-schen Verlauf, der das rechnerische Verhältnis Mobilität/log(Molekulargewicht) besser als eine Aus-gleichsgerade wiedergibt. Die Laufstrecke des acetylierten Tubulins sowie das ermittelte Molekularge-wicht werden durch durchgezogene Linien dargestellt.

Mit Hilfe der Immunogoldtechnik sollte versucht werden, die in der Immunfluoreszenz

markierten Strukturen auch ultrastrukturell darzustellen.

Da die Aufrechterhaltung der Antigenizität unter Berücksichtigung einer adäquaten

Strukturerhaltung Variationen unterworfen war, wurde eine dichte Markierung von Ci-

lien und Basalkörpern, welche unzweifelhaft acetyliertes Tubulin enthalten (Piperno

und Fuller, 1985), als Marker für eine den oben genannten Ansprüchen genügende Ein-

bettung herangezogen.

Die dokumentierten Cilien zeigen eine spezifische Markierung ihrer axonemalen Mt

und Basalkörper (Abb. 41), wobei Basalkörper in der Regel eine dichtere Markierung

als Cilien aufweisen (Abb. 41 inset).

Abb. 42 läßt erkennen, daß die Strukturerhaltung des Kerns aufgrund der für Immuno-

goldversuche abgeänderten Fixierung und Einbettung nicht sehr wesentlich von den bei

Standardfixierungen erhaltenen Ergebnissen abweicht, wohingegen die Ätzungstechnik

mit Natriumethanolat an Epon-Einbettungen weder morphologisch noch in der Markie-

rungsdichte zufriedenstellen konnte (nicht gezeigt).

Tafel 17

Immunogoldmarkierung m.H. des mAk 6-11B1 (anti-acetyliertes Tubulin)

Abb. 41: Als Marker für eine hinsichtlich Strukturerhaltung und Antigenizität gute Einbettung diente die Markierung von Cilien und Basalkörpern der Zelle. Basalkörper (Inset) sind üblicherweise dichter markiert als Cilien. Maßstab: 0,2 µm

Abb. 42: Die Strukturerhaltung des Kerns weicht durch die für Immunogoldmar-kierungen geänderten Fixierungs- und Einbettungsmethoden nicht we-sentlich von den unter Standardbedingungen erzielten Ergebnissen ab. Maßstab: 1,5 µm

Abb. 43: Durch Verwendung des Antikörpers 6-11B1 kann eine Markierung so-wohl von mikronucleären Filamenten (Pfeilköpfe) als auch von Mikrotu-buli (Pfeile) gezeigt werden. Maßstab: 0,2 µm

Ergebnisse 53

In den Kernen kann sowohl eine Markierung der mikronucleären Mikrotubuli, als auch

der Filamente, unter Verwendung des Antikörpers 6-11B1 nachgewiesen werden (Abb.

43).

Dieses Markierungsmuster konnte auch bei Einsatz des ebenfalls gegen acetyliertes Tu-

bulin gerichteten Antikörpers 3A5 beobachtet werden (nicht gezeigt).

3.2.1.4 Nachweis des ββββ-Tubulins

Wie in Neuronen nachgewiesen werden konnte, wird β-Tubulin von einer Gen-Familie

codiert, die mindestens 5 verschiedene Polypeptid-Isotypen exprimiert (Hoffman und

Ludueña, 1996).

Posttranslationale Modifikationen, wie sie häufig an der α-Untereinheit auftreten, sind

in diesem Umfang am β-Tubulin nicht bekannt. Einzig Phosphorylierungsreaktionen

sind hier nachgewiesen, wobei daneben auch wie am α-Tubulin Polyglutamylierungen

und Polyglycylierungen auftreten können (MacRae, 1997).

Die Reaktion dreier verschiedener anti-β-Tubulin Antikörper wurde an isolierten Ker-

nen untersucht:

Während die Antikörper 2-28-33 und Nr.11 ein negatives Ergebnis zeigten, konnten

durch den Einsatz des Antikörpers WA3 die peripheren Mikrotubuli der Kerne deutlich

dargestellt werden. Hierbei ist auffällig, daß im Gegensatz zu Markierungen mit Anti-

körpern gegen acetyliertes Tubulin (Abb. 37b-d) oder Gesamt-Tubulin (Abb. 4b) immer

nur kurze Bereiche dieser Mikrotubuli dargestellt werden können (Abb. 44b – d).

Die gelelektrophoretische Auftrennung von Kernextrakten mit anschließendem We-

stern-Blot führte trotz wiederholter Versuche zu keinem positiven Ergebnis.

Der monoklonale Antikörper anti-Peptid G wurde eingesetzt, um ein Epitop zu markie-

ren, das nur bei freiem Tubulin zugänglich ist und auf der β-Untereinheit des Heterodi-

mers lokalisiert ist. Durch eine laterale Aneinanderlagerung des Tubulins ist dieses Epi-

top blockiert, wohingegen eine longitudinale Assoziation der Heterodimere den Zugang

zu diesem Epitop nicht behindert und eine Markierung ermöglichen sollte (Pérez et al.,

1997).

Die immunfluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen ergaben, daß der überwie-

gende Anteil der untersuchten Kerne eine homogene Markierung ihres Nucleoplasmas

aufweisen (Abb. 45b). In einigen Fällen variiert die Fluoreszenzintensität im Kern

Ergebnisse 54

(Abb. 45d), ohne daß hierbei eine Tendenz zur vorwiegenden Markierung des Primär-

oder Sekundärpols erkennbar war.

Eine Routineuntersuchung im Western-Blot ergab keine deutliche Markierung eines

Proteins.

3.2.2 Struktur und biochemische Zusammensetzung des Primärpols

3.2.2.1 Aktin Ausgehend von Berichten verschiedener Autoren (Hauser, 1980; Nowak et al., 1997;

Wrench und Snyder, 1997; Czaban und Forer, 1994), die eine Beteiligung von Aktin an

der Chromosomensegregation bei verschiedenen Organismen für möglich halten, wurde

das Vorhandensein dieses Proteins im Mikronucleus untersucht. Dies ist um so interes-

santer, da sich Aktin elektronenmikroskopisch als Filament mit einem Durchmesser von

7-8 nm darstellt (Steinmetz et al., 1997) und somit teilweise den Abmessungen der im

Mikronucleus nachgewiesenen Filamente entspricht.

Hierzu fand neben dem Einsatz eines monoklonalen Antikörpers auch der Versuch eines

Nachweises mit Hilfe von Rhodamin-markiertem Phalloidin statt.

Phallotoxine besitzen allgemein eine hohe Affinität zu filamentösem Aktin (F-Aktin),

wohingegen keine Bindung an globuläres (G-Aktin) nachgewiesen werden kann (Über-

sicht bei Cooper, 1987). Durch Bindung des Phalloidins werden bereits polymerisierte

Aktinfilamente an der Depolymerisation gehindert, und es kommt durch Reduzierung

der kritischen Konzentration zu einer vermehrten Neubildung von Aktinfilamenten

(Wehland et al., 1980). Durch Konjugation mit einem Fluoreszenzfarbstoff – wie z.B.

Rhodamin – kann Phalloidin zum spezifischen Nachweis von Aktinfilamenten verwen-

det werden.

Sowohl die Anwendung von Rhodamin-Phalloidin als auch die Inkubation der isolierten

Mikronuclei mit einem anti-Aktin Antikörper ergab keine Markierung der Kerne. Auch

im Bereich des Primärpols, wo zu Beginn der Mitose elektronenmikroskopisch ein ho-

her Gehalt an Filamenten nachzuweisen ist, konnte keine Fluoreszenz dokumentiert

werden.

Der Nachweis von Aktin im Western-Blot unter Verwendung des schon in der Immun-

fluoreszenz eingesetzten Antikörpers verlief ebenfalls in allen Fällen negativ.

Tafel 18

Immunfluoreszenzmikroskopischer Nachweis des ββββ-Tubulins

IIF unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers WA3

Abb. 44a: Phasenkontrast Fokusserie Abb. 44b: Der Antikörper WA3 markiert nur kurze Bereiche der peripheren Mikro-

tubuli, was durch eine Fokusserie verdeutlicht wird. Auf Primärpol fokus-siert.

Abb. 44c: Auf den mittleren Kernbereich fokussiert. Abb. 44d: Auf den Sekundärpol fokussiert. IIF unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers anti-Peptid G Abb. 45a: Phasenkontrast Abb. 45b: Mikronuclei weisen häufig eine homogene Markierung auf. Durch die

geneigte Lage des Kerns zeigt der Sekundärpol aufgrund der geringen mikroskopischen Tiefenschärfe nur scheinbar eine etwas stärkere Fluores-zenz.

Abb. 45c: Phasenkontrast Abb. 45d: In einigen Fällen variiert die Fluoreszenzintensität, ohne daß eine bevor-

zugte Markierung des Primär- bzw. Sekundärpols nachzuweisen ist. Maßstab bei allen Abbildungen: 10 µm

Ergebnisse 55

Zur Absicherung dieser Erkenntnisse wurden Postembedding-Versuche mit Aktin-Anti-

körpern durchgeführt, die aber niemals eine spezifische Markierung im Kern erkennen

ließen.

3.2.2.2 Centrin Centrin ist als ein Calcium-bindendes Protein der EF-Hand Superfamilie seit längerem

bekannt (Salisbury und Baron, 1984) und wurde mittlerweile in allen höheren eukaryo-

tischen Zellen, einschließlich der Hefen, nachgewiesen (Baum et al., 1986).

Dieses kontraktile Protein ist vorwiegend mit Centrosomen (Paoletti et al., 1996), Ba-

salkörpern (Levy et al., 1996) und mitotischen Spindeln (Lingle und Salisbury, 1997)

assoziiert, konnte jedoch auch in der Infraciliatur von einigen Paramecium-Arten nach-

gewiesen werden (Klotz et al., 1997; Allen et al., 1998).

Ausgehend von den oben erwähnten Ergebnissen anderer Autoren stellt sich die Frage,

ob im Kern von Paramecium bursaria Centrin nachgewiesen werden kann.

Eigene Ergebnisse zeigen immer Kerne, die eine brillante Fluoreszenz aufweisen. Die

Intensität ist dabei in einigen Fällen nahezu homogen über den gesamten Kern verteilt

(Abb. 46b), oftmals aber weist der Primärpol eine stärkere Fluoreszenz als der restliche

Kerninhalt auf (Abb. 46d).

Der anti-Centrin Ak detektierte in Immunoblot-Versuchen isolierter Mikronuclei ein

Protein im Bereich von 20 kDa (Abb. 47), wohingegen Postembedding-Versuche keine

spezifische Markierung des Kerns aufzeigten.

3.2.2.3 Dynein Die Beteiligung des cytoplasmatischen Motorproteins Dynein an der Separation der

Chromosomen ist sowohl in der Mitose als auch in der Meiose bei einer Vielzahl von

eukaryotischen Zellen nachgewiesen worden (z.B. Sawin und Scholey, 1991), wobei

sich das Vorkommen vorwiegend auf die Kinetochorregion beschränkt.

Neuere Untersuchungen zeigen eine weiterführende Funktion des cytoplasmatischen

Dyneins, die sich in der Formation und Stabilisierung von Spindelpolen, sowohl in Cen-

triolen-haltigen als auch in offenen Mitose-Spindeln manifestiert (Merdes et al., 1996).

Die Existenz und die räumliche Verteilung von Dynein in Mikronuclei sollte durch den

Einsatz verschiedener anti-Dynein Antikörper an isolierten Kernen überprüft werden.

Eine deutliche Markierung der Kerne konnte durch den Einsatz monoklonaler, gegen

Dynein gerichteter Antikörper nicht erzielt werden. Erst der Einsatz eines polyklonalen

Ergebnisse 56

anti-Dynein Antikörpers zeigt in der Immunfluoreszenz eine deutliche Markierung im

Bereich des Primärpols. Hierbei ist, wie auch bei einer anti-γ-Tubulin Markierung, das

Auftreten von Bereichen mit einer punktuellen, intensiven Markierung auffällig (Abb.

48b).

Die Molekulargewichte des Dyneins aus Mikronuclei wurden im Western Blot be-

stimmt, dem eine elektrophoretische Auftrennung der Proteine vorausgegangen war.

Zur Überprüfung der Auftrennung wurden die Blots mit Poinceaurot gefärbt und wieder

ausgewaschen, nachdem eine Dokumentation der nur sehr schwach angefärbten Prote-

inbanden erfolgte. Anschließend konnte eine Markierung unter Verwendung des Anti-

körpers vorgenommen werden.

Der Antikörper detektiert im Western-Blot 4 Banden, die Proteine isolierter Mikronu-

clei mit den Molekulargewichten 156, 137, 57 und 52 kDa repräsentieren (Abb. 49a).

Um eine Kontamination der Kernisolate mit ciliärem Dynein auszuschließen, wurde der

Versuch mit deciliierten Zellen wiederholt: Im Anschluß an eine Isolation der Cilien

erfolgte wie üblich ein Kernisolation. Eine Kontamination der Kerne mit ciliärem Dy-

nein kann somit nur zufällig über im Kernpellet evtl. enthaltene Pellicula- oder Cilien-

überreste erfolgen. Da ein LM-Kontrolle keine Spuren dieser Fraktionen ergab, kann

eine solche Verunreinigung ausgeschlossen werden.

Immunoblot-Versuche der aus deciliierten Zellen isolierten Kerne zeigten ein zu der

normalen Kernisolation identisches Markierungsmuster. Eine gelelektrophoretische

Auftrennung der isolierten Cilien und anschließendes Western-Blotting zeigte, daß der

Nachweis des ciliären Dyneins mit Hilfe des polyklonalen anti-Dynein Ak ein anderes

Markierungsmuster mit Banden im Bereich von 115, 103 und 17 kDa aufweist (Abb.

49b). Somit kann davon ausgegangen werden, daß die bei der Kernisolation im We-

stern-Blot durch den anti-Dynein Ak nachgewiesenen Proteine nicht durch ciliäres Dy-

nein verunreinigt waren.

3.2.2.4 Gamma-Tubulin und andere centrosomale Proteine

γ-Tubulin, als Mitglied der Tubulin-Superfamilie, ist in allen eukaryotischen Zellen in

hochkonservierter Form als ein wichtiger Bestandteil von Mikrotubuli-organisierenden

Zentren (MTOC) nachgewiesen worden (Sunkel et al., 1995).

Die Basalkörper bei Paramecium dienen als MTOC zur Nucleierung der axonemalen

Mikrotubuli und weisen, wie bei den meisten Ciliaten, eine permanente Assoziation mit

γ-Tubulin auf (Liang et al., 1996).

Tafel 19

Centrin

Abb. 46a: Phasenkontrast Abb. 46b: Häufig ist die Fluoreszenz bei Verwendung des mAk anti-Centrin homo-

gen über den Kern verteilt. Abb. 46c: Phasenkontrast Abb. 46d: In vielen Fällen weist der Primärpol eine stärkere Fluoreszenz als der üb-

rige Kerninhalt auf. Abb. 47: Im Western-Blot isolierter Kerne markiert der Antikörper eine Bande im

Bereich von 20 kDa.

Dynein

Abb. 48a: Phasenkontrast Abb. 48b: Der polyklonale anti-Dynein Ak C-18 markiert den Primärpol deutlich.

Auffällig sind punktuelle, intensivere Markierungen in diesem Bereich. Abb. 49a: Western-Blot isolierter Mikronuclei. Der verwendete polyklonale Anti-

körper markiert 4 Banden mit den Molekulargewichten 156, 137, 57 und 52 kDa.

Abb. 49b: Western-Blot isolierter Cilien. Der Antikörper C-18 detektiert 3 Banden im Bereich von 115, 103 und 17 kDa. Die Gelläufe der beiden Abbildungen wurden geblottet und mit Poinceau-rot gefärbt. Aufgrund der geringen Proteinmenge und der gegenüber den im Western-Blot verwendeten Antikörpern geringeren Empfindlichkeit ist nur eine prominente Bande im Bereich von 50 kDa sichtbar.

Maßstab bei allen Abbildungen: 10 µm

Ergebnisse 57

Darüber hinaus kann auch ein Vorkommen in den offenen mitotischen Spindeln einiger

Organismen gezeigt werden (Lajoie-Mazenc et al., 1994), aber auch in den Kernen eini-

ger Ciliaten wurde γ-Tubulin in jüngster Zeit nachgewiesen (Liang et al., 1996).

Durch die Verwendung eines polyklonalen Antikörpers sollte das Vorhandensein und

die Verteilung von γ-Tubulin in isolierten Mikronuclei untersucht werden. Dies ist von

besonderem Interesse, da dem Primärpol vermutlich eine starke MTOC-Funktion zu-

kommt.

Neben γ-Tubulin sind weitere Bestandteile in dem das Centrosom umgebenden peri-

centriolärem Material (PCM) enthalten, die ebenfalls der Strukturgebung und Erhaltung

der Mikrotubuli dienen. Zum Nachweis eines im PCM humaner Lymphoblasten-Cen-

trosomen lokalisierten Proteins, das auch bei Dinoflagellaten und Ciliaten in den Basal-

körpern vorzufinden ist (Perret et al., 1991), wurde der Antikörper CTR 210 eingesetzt.

Der gegen ein synthetisches Oligopeptid gerichtete polyklonale anti-γ-Tubulin Antikör-

per zeigt eine intensive Markierung des Primärpols (Abb. 50b). In anderen Fällen weist

die Markierung hellere Punkte intensiver Fluoreszenz im Bereich des markierten Pri-

märpols (Abb. 50d) auf.

Der monoklonale Antikörper CTR 210 ist gegen Komponenten des pericentriolären

Materials gerichtet (Bailly et al., 1988).

Sein Einsatz zeigte ein zu dem anti-γ-Tubulin Ak identisches Markierungsmuster. So-

wohl eine starke Färbung im Bereich des Primärpols (Abb. 51b) als auch häufig Stellen

intensiverer Fluoreszenz (Abb. 51d) können nachgewiesen werden.

Die Untersuchung der Pellicula zeigt bei beiden Antikörpern eine sehr differenzierte

Markierung der Basalkörper, ohne daß eine Markierung der Cilien zu verzeichnen ist

(Abb. 52). Immunoblot-Versuche isolierter Kerne ergaben bei Verwendung des Anti-

körpers CTR 210 die Detektion eines Proteins mit einem Molekulargewicht von 80 kDa

(Abb. 53).

Postembedding-Versuche zeigten eine in manchen Fällen geringfügig stärkere Markie-

rung im Bereich des Primärpols, ohne daß diese Markierungen einem bestimmten

Strukturmerkmal zuzuordnen wären (nicht dargestellt).

Ergebnisse 58

3.2.3 Parakristalline Strukturen

Tubulin besitzt als Hauptprotein der Mikrotubuli die Fähigkeit, in verschiedenen poly-

morphen Zuständen in Erscheinung zu treten. Hierzu zählt auch eine als „parakristallin“

beschriebene Ausprägung (Unger et al., 1990), wie sie regelmäßig unter der Einwirkung

von Vinblastin zu beobachten ist (Starling, 1976).

Hauser und Beinbrech (1973) berichten von einem parakristallinen Ordnungsgrad der

Filamente bei Paramecium bursaria, jedoch wurde dieser Effekt nur unter Einwirkung

von 70% D2O nachgewiesen. Die Autoren stellten die Vermutung an, daß es sich bei

diesen Parakristallen um Tubulin handelt.

Eigene Untersuchungen zeigen, daß sich in seltenen Fällen parakristalline Strukturen

auch im Mikronucleus unbehandelter Zellen nachweisen lassen.

Abbildung 54a zeigt Parakristalle in einem prophasischen Kern, die in der Nähe der

Kernmembran lokalisiert sind. Die Ausrichtung des Chromatins und der Filamente le-

gen nahe, daß es sich um die Region des Primärpols handelt, jedoch läßt der ungünstige

Anschnitt des Kerns bezüglich dieses Sachverhaltes keine zweifelsfreie Aussage zu.

Fortgeschrittene Stadien der Mitose zeigen selten parakristalline Ausprägungen, wenn

dies jedoch der Fall ist, nehmen sie niemals die Ausmaße an, wie es in der Prophase

nachzuweisen war. Abb. 54c zeigt eine frühe Anaphase, wo sich ein Parakristall im Ka-

ryoplasma – distal der Kernmembran – befindet.

In einem Fall war der Nachweis von Parakristallen in unmittelbarer Nähe zu Membran-

einschlüssen im Kern zu finden (Abb. 54b). Diese Membraneinschlüsse konnten auch

bereits in der Meta- bzw. Telophase dargestellt werden (vgl. Abb. 13a inset und Abb.

28).

Immunogoldversuche, durchgeführt nach dem Preembedding-Verfahren, machten es

möglich, Parakristalle zu dokumentieren und mit einem Antikörper gegen acetyliertes

Tubulin zu markieren (Abb. 54d).

3.3 Mikrotubuli- beeinflussende Agenzien Das Polymerisationsgleichgewicht zwischen freiem Tubulin und Mikrotubuli kann

durch den Einsatz spezifischer Agenzien sowohl in Richtung der Mikrotubuli als auch

in Richtung des freien Tubulins verschoben werden.

Da die ultrastrukturellen Untersuchungen an Paramecium bursaria einen direkten

Übergang zwischen Mikrotubuli und Filamenten (Abb. 13d, 33a ff.) aufzeigen, stellt

sich die interessante Frage, inwiefern die in das Polymerisationsgleichgewicht zwischen

Mikrotubuli und Tubulin eingreifenden Agenzien einen Einfluß auf die Ausbildung und

Tafel 20

Nachweis des γγγγ-Tubulins

Abb. 50a: Phasenkontrast Abb. 50b: Der polyklonale anti-γ-Tubulin Ak zeigt eine intensive, homogene Mar-

kierung im Bereich des Primärpols. Abb. 50c: Phasenkontrast Abb. 50d: In manchen Fällen zeigt die Markierung des Primärpols punktuelle Berei-

che besonders intensiver Fluoreszenz. Einsatz des gegen centrosomale Proteine gerichteten mAk CTR 210

Abb. 51a: Phasenkontrast Abb. 51b: Die Primärpolregion wird durch den mAk CTR 210 deutlich markiert. Abb. 51c: Phasenkontrast Abb. 51d: Wie auch in Abb. 50d weisen markierte Mikronuclei häufig Punkte inten-

siverer Fluoreszenz im Primärpolbereich auf. Maßstab bei den Abbildungen 50a-51d: 10 µm

CLSM-Aufnahme

Abb. 52: Markierung der Pellicula mit dem polyklonalen anti-γ-Tub-Ak. Die Ba-salkörper weisen eine distinkte Fluoreszenz auf. Ihre Anordnung in Diki-netiden ist erkennbar, wohingegen eine Markierung von Cilien nicht er-folgen kann. Maßstab: 5 µm

Abb. 53: Western-Blot isolierter Kerne. Der Antikörper CTR 210 detektiert eine Bande im Bereich von 80 kDa.

Tafel 21

Parakristalline Strukturen

Abb. 54a: Parakristalle (Pfeile) in einem prophasischen Mikronucleus. Vermutlich ist die Region des Primärpols dargestellt, aufgrund der Ebene des Kernan-schnitts ist aber keine zweifelsfreie Aussage möglich. Maßstab: 0,2 µm

Abb. 54b: Ein Parakristall (Pfeil) befindet sich in unmittelbarer Nähe von Membran-einschlüssen (Pfeilköpfe) im Mikronucleus. Maßstab: 0,2 µm

Abb. 54c: In seltenen Fällen sind auch in anaphasischen Kernen Parakristalle (Pfeil-kopf) – distal der Kernmembran – in kleinem Ausmaß enthalten. Maßstab: 0,5 µm

Abb. 54d: Der Einsatz des gegen acetyliertes Tubulin gerichteten Antikörpers 6-11B1 ermöglicht es, eine Markierung von Parakristallen (Pfeilkopf) zu dokumentieren. Maßstab: 0,2 µm

Ergebnisse 59

den Gehalt an Filamenten haben werden. Auch können so Erkenntnisse über die genaue

Funktion der Filamente gewonnen werden.

3.3.1 Mikrotubuli destabilisierende Agenzien

3.3.1.1 Nocodazol Nocodazol, ein Benzimidazolderivat, ist lange Zeit schon als ein Mikrotubuli-Antago-

nist bekannt, der durch spezifische Interaktion mit der Colchicin-Bindestelle des Tubu-

lin-Heterodimers die Mt-Polymerisation unterbindet und somit eine Mt-Depolymerisa-

tion bewirkt (Hoebeke et al., 1976). Neuere in vitro Studien zeigen, daß Nocodazol die

dynamische Instabilität der Mikrotubuli beeinflußt, indem es die Wachstums- und Zer-

fallsraten vermindert und somit die Zeit verlängert, in der Mikrotubuli weder wachsen

noch schrumpfen (Wilson et al., 1993; Wilson und Jordan, 1994).

Untersuchungen an Paramecium tetraurelia ergaben, daß bei Zugabe von Nocodazol zu

Teilungszellen, weder die Musterbildung der Basalkörper noch die Bildung der Tei-

lungsfurche beeinflußt werden, wohingegen die Mikronuclei allerdings in einer defek-

ten Metaphase arretiert werden (Kaczanowska et al., 1996).

Ob Zellen in der Metaphase durch Nocodazol-Einsatz arretiert werden können, sollte

sowohl durch lichtmikroskopische Kontrollen als auch mit Hilfe photometrischer Mes-

sungen der DNA analog des unter Punkt 3.1.1 beschriebenen Verfahrens ermittelt wer-

den.

Durch Zugabe von Nocodazol in einer Konzentration von bis zu 4 µg/ml zu Zellkultu-

ren konnte innerhalb eines Zeitraumes von 18 h keine erhöhte Anzahl von Tieren nach-

gewiesen werden, die sich in der Metaphase befinden bzw. hier arretiert wären. Mes-

sungen des DNA-Gehaltes zeigten keine vermehrten, auffälligen Erhöhungen, wie es

für Zellen, die in der Metaphase einen DNA-Gehalt von 4C besitzen, typisch wäre.

Immunfluoreszenzmikroskopische Untersuchungen an isolierten Mikronuclei können

jedoch unter Verwendung eines Antikörpers gegen α-Tubulin (YOL 1/34) ein im Ver-

gleich zu Kontrollzellen (z.B. Abb. 4b) diffuseres Markierungsmuster zeigen, wobei die

peripheren Mikrotubuli bei reduzierter Anzahl eine nahezu normale Verteilung aufwei-

sen (Abb. 55a). Oftmals können periphere Mikrotubuli jedoch nicht mehr lokalisiert

werden (Abb. 55b) und der Kern zeigt eine vollständig diffuse Markierung. In einigen

Fällen besitzen die peripheren Mikrotubuli eine starke Fehlorientierung (Abb. 55c).

Ergebnisse 60

Dieses Bild kann durch elektronenmikroskopische Untersuchungen bestätigt werden:

Neben desorientierten peripheren Mikrotubuli (Abb. 56a) finden sich auch solche, die

eine korrekte Orientierung parallel der Kernmembran aufweisen (Abb. 56b) und einen

normalen Durchmesser von 25 nm besitzen (Abb. 56 inset).

Als besonders auffällig stellt sich der hohe Filamentanteil im Kern dar, der schon in

interphasischen Stadien deutlich wird (Abb. 56c); frühe prophasische Stadien veran-

schaulichen dieses Ergebnis (Abb. 56d), wobei der Filamentdurchmesser eine starke

Variation zwischen 6 nm und 13 nm aufweist (Abb. 56e).

3.3.1.2 Colchicin Colchicin ist ein antimitotisch wirksames Alkaloid aus der Herbstzeitlosen Colchicum

autumnale. Durch eine feste Bindung an die β-Untereinheit der freien Tubulin-Hetero-

dimere kommt es zu einer Beeinflussung der Dynamik von Mikrotubuli dahingehend,

daß die Nucleation des Tubulins wesentlich erschwert wird (Vandecandelaere et al.,

1997). In der Regel werden so Mikrotubuli abgebaut, jedoch kommt es, je nach Asso-

ziation mit MAPs, nicht immer zu deren völliger Depolymerisation (Deery und Wei-

senberg, 1981).

Von einer 0,4%igen Konzentration ausgehend, erfolgte nach Colchicin-Inkubation eine

immunfluoreszenzmikroskopische Untersuchung der Kerne. Das Resultat gleicht den in

Tafel 22 dargestellten Ergebnissen der Nocodazol-Immunfluoreszenz (Abb. 55a-c).

Auch das elektronenmikroskopische Bild Colchicin-behandelter Kerne gleicht im we-

sentlichen den im vorigen Punkt dargestellten Befunden (Abb. 56a-e). Mikrotubuli sind

nicht vollständig abgebaut, zeigen aber im Unterschied zu Nocodazol eine z.T. „geclu-

sterte“ Verteilung im Nucleoplasma, wobei sie von elektronendichtem Material umge-

ben sind (Abb. 57a). Auch Filamente sind ebenso vielzählig vorhanden und variabel in

ihrem Durchmesser wie unter Punkt 3.3.1.1 beschrieben (Abb. 57b). Häufig sind Mikro-

tubuli in ungewöhnlicher Weise am Rande der aufgeworfen erscheinenden Kern-

membran lokalisiert (Abb. 57c).

Im Unterschied zu Nocodazol weist die Kernmembran Auffaltungen auf, wie sie auch in

Kontrollzellen bisher nicht beobachtet werden konnten. (Abb. 57d).

Tafel 22

Nocodazol-Inkubation der Zellen

Markierung des Gesamt-Tubulins (mAk YOL 1/34)

Abb. 55a: Die peripheren Mikrotubuli sind unter Nocodazoleinfluß in ihrer Anzahl reduziert, weisen aber die übliche Ausrichtung auf.

Abb. 55b: Häufig können periphere Mt nicht mehr lokalisiert werden. Abb. 55c: In einigen Fällen weisen periphere Mt eine Fehlorientierung auf (Pfeil-

kopf). Maßstab der Abbildungen 55a-c: 10 µm

Abb. 56a: Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigen z.T. desorientiert Mi-krotubulibündel im Nucleoplasma der Kerne (Pfeil). Maßstab: 1 µm

Abb. 56b: Die peripheren Mt sind oftmals normal orientiert (Pfeil) und weisen im Querschnitt einen Durchmesser von 25 nm auf (Inset). Maßstab: 0,5 µm Inset 0,1 µm

Abb. 56c: Schon in interphasischen Kernen läßt sich unter Nocodazoleinwirkung ein hoher Filamentgehalt nachweisen (Pfeilköpfe = Filamente). Maßstab: 0,5 µm

Abb. 56d: Auch in prophasischen Stadien zeigt sich unter Nocodazoleinfluß ein ho-her Filamentgehalt bei stark reduzierter Mikrotubulianzahl. Maßstab: 0,5 µm

Abb. 56e: Der Filamentdurchmesser variiert in prophasischen Stadien zwischen 9 nm (Pfeilkopf) und 13 nm (Pfeil). Km = Kernmembran. Maßstab: 0,1 µm

Tafel 23

Colchicin-Inkubation der Zellen

Abb. 57a: Mikrotubuli zeigen im Nucleoplasma eine z.T. „geclusterte“ Verteilung, wobei sie von elektronendichtem Material umgeben sind (Pfeilkopf). Ma = Makronucleus. Maßstab: 0,2 µm

Abb. 57b: Filamente sind zahlreich im interphasischen Kern enthalten und variabel in ihrem Durchmesser (Pfeilköpfe). Pfeil = Mikrotubuli. Maßstab: 0,5 µm

Abb. 57c: Die Kernmembran erscheint unter Colchicineinfluß aufgeworfen. Häufig sind Mt in ungewöhnlicher Weise am Rande der Kernmembran lokali-siert. Maßstab: 1 µm

Abb. 57d: Entgegen den Beobachtungen in Kontrollzellen, weist die mikronucleäre Kernmembran Auffaltungen auf. Ma = Makronucleus. Maßstab: 0,5 µm

Ergebnisse 61

3.3.2 Stabilisierende Agenzien

3.3.2.1 Taxol Taxol, ursprünglich aus der Eibe Taxus brevifolia isoliert (Wani et al., 1971), stellt sich

als ein komplexes, polyoxigeniertes Diterpen mit antineoplastischer Wirkung dar. Wäh-

rend alle anderen bisher bekannten pflanzlichen Wirkstoffe eine destabilisierende Wir-

kung auf Mikrotubuli besitzen, ist Taxol in der Lage, die Struktur der Mikrotubuli zu

stabilisieren (Schiff et al., 1979).

In der hier vorliegenden Arbeit sollte nun die Taxolwirkung auf die Filamente in den

mikronucleären Kernen untersucht werden.

Eine taumelnde Schwimmphase der für 16 h einer Konzentration von 300 µM Taxol

ausgesetzten Zellen weist auf eine verminderte Motilität hin, die auf den Taxoleinfluß

zurückzuführen ist. Ein Einfluß des DMSO, in dem Taxol aufgrund seiner Wasserun-

löslichkeit in der Stammlösung angesetzt wurde, konnte durch Kontrollversuche mit

entsprechenden Konzentrationen an DMSO ausgeschlossen werden.

Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen an isolierten Kernen zeigen, daß die Mt-

Markierungen bei Verwendung des YOL 1/34 Antikörpers gegen fixiertes Tubulin et-

was zahlreicher als in Kontrollen zu beobachten sind (Abb. 58b). Auch ist die Brillanz

der Mt-Markierung höher als bei Kontrollzellen, jedoch findet sich immer auch eine

diffuse Fluoreszenz des Nucleoplasmas. In ihrer Ausprägung sind die dargestellten Un-

terschiede jedoch im Vergleich zu Kontrollzellen geringfügig.

Das elektronenmikroskopische Bild der mit Taxol behandelten Zellen weist einige Un-

terschiede zu Kontrolltieren auf: Das Nucleoplasma wirkt substanzlos und das Chroma-

tin erscheint wesentlich weniger stark kondensiert (Abb. 59a). Dieser Effekt ist beson-

ders in Prophasen deutlich zu bemerken (vgl. Abb. 59a mit Abb. 11a).

Detailaufnahmen der Kerne lassen neben Filamenten, wie sie für diese Phase der Mitose

üblich sind, auch eine vermehrte Anzahl von Mikrotubuli erkennen, wobei die Fila-

mentanzahl hierbei zu Gunsten der Mikrotubuli reduziert ist (Abb. 59b).

Unter Taxoleinfluß polymerisierte Mikrotubuli weisen eine normale Ausrichtung und

einen üblichen Organisationsgrad auf. Mikrotubuli in der Kernmitte lassen im Quer-

schnitt einen Durchmesser von ca. 22 nm erkennen (Abb. 59c) und erscheinen damit

fragiler, als Mt in Kontrollzellen, die in Prophasen einen Durchmesser von 24-25 nm

besitzen.

Tafel 24

Taxol-Inkubation der Zellen

Darstellung des Gesamt-Tubulins (mAk YOL 1/34)

Abb. 58a: Phasenkontrast Maßstab: 10µm

Abb. 58b: Mikrotubuli weisen unter Taxoleinfluß eine übliche Orientierung auf und sind zahlreich vorhanden. Die Brillianz der Markierung ist geringfügig höher als bei Kontrollzellen, trotz diffuser Fluoreszenz des Nucleoplas-mas. Maßstab: 10µm


Abb. 59a: Das Chromatin erscheint in der Prophase weniger stark kondensiert als in Kontrollzellen. Maßstab: 1µm

Abb. 59b: Detailaufnahme des Primärpols. Mikrotubuli treten in der üblichen Weise ausgerichtet, jedoch für diese Phase ungewöhnlich zahlreich auf, wohin-gegen die Filamentanzahl reduziert ist. Maßstab: 0,5µm

Abb. 59c: Im Querschnitt lassen einige Mt einen Durchmesser von nur 22 nm er-kennen (Pfeil). Maßstab: 0,1µm

Ergebnisse 62

3.3.2.2 D2O Neben dem pflanzlichen Wirkstoff Taxol existiert mit Deuteriumoxid (D2O) ein weite-

rer Wirkstoff, welcher das Polymerisationsgleichgewicht des Tubulins zu Gunsten der

Mikrotubulibildung verschiebt.

Wird D2O bei sich teilenden Seeigeleiern appliziert, kommt es zu einer Vermehrung der

Anzahl und Länge der Mikrotubuli der mitotischen Spindel (Itoh und Sato, 1984).

Eine Inkubation von Paramecium bursaria in 70% D2O bewirkt hingegen, neben der

Ausbildung einiger weniger zusätzlicher Mikrotubuli im Mikronucleus, einen starken

Anstieg der Filamentanzahl, die in einigen Fällen aufgrund ihrer hohen Anzahl und ih-

rer Ausrichtung sogar einen parakristallinen Ordnungsgrad annehmen können (Hauser

und Beinbrech, 1973).

Immunfluoreszenzmikroskopische Untersuchungen an mit D2O behandelten und mit

YOL 1/34 markierten, isolierten Mikronuclei zeigen eine schwache Markierung einiger

weniger Mikrotubuli (Abb. 60b). Nach einer zwanzigstündigen Inkubation in 70% D2O

ist der Mikrotubuli-Gehalt allenfalls etwa gleich hoch wie in Kontrollzellen. Weitaus

häufiger aber können Kerne dokumentiert werden, die nahezu keine distinkte Markie-

rung der Mikrotubuli aufweisen, sondern eher eine starke Gesamtanfärbung ihres Kern-

inhalts zeigen (Abb. 60d), wie es schon unter Punkt 3.3.1.1 (Nocodazol) beschrieben

wurde.

Ungewöhnliche Streckungsphänomene, wie sie von Hauser und Beinbrech (1973) beob-

achtet worden sind, können nicht aufgezeigt werden, obwohl die Inkubationszeiten in

D2O von 2 bis 48 h variiert wurden.

Elektronenmikroskopische Untersuchungen der Mikronuclei zeigen eine zum Teil be-

trächtliche Vermehrung der Filamentanzahl. Das Vorkommen der gut ausgebildeten

Filamente erstreckt sich über den gesamten Kern, und ist nicht, wie es in frühen Stadien

der Mitose unbehandelter Kerne beobachtet werden kann, auf den Primärpol beschränkt

(Abb. 61a und b).

Das Erscheinungsbild der Filamente ist variabel, es weist neben einer diffusen Ausprä-

gung (Abb. 61a) bei gleichzeitiger Kondensation des Chromatins auch eine wesentlich

distinktere Ausprägung auf, wie sie in Abbildung 61b zu sehen ist. Bemerkenswert er-

scheint hier der im Vergleich zu Abbildung 61a geringere Kondensationsgrad des

Chromatins, der eventuell mit der Anzahl der Filamente korreliert, wie es in unbehan-

delten Zellen der Fall ist. Eine Bestimmung der mitotischen Phase, in denen sich die

Ergebnisse 63

Mikronuclei befinden, ist aber aufgrund der ungewöhnlichen Anzahl der Filamente und

der reduzierten Anzahl an Mikrotubuli nur sehr eingeschränkt möglich.

Tafel 25

Deuteriumoxid-Inkubation der Zellen

Darstellung des Gesamt-Tubulins unter Verwendung des mAk YOL 1/34

Abb. 60a: Phasenkontrast Abb. 60b: Nur eine geringe Anzahl von Mikrotubuli weisen in einigen Fällen eine

schwache Markierung auf. Abb. 60c: Phasenkontrast

Abb. 60d: Häufig kann eine starke Gesamtfärbung des Kerns dokumentiert werden.

Maßstab der Abbildungen 60a-60d: 10 µm

Elektronenmikroskopische Darstellung

Abb. 61a: Filamente treten unter D2O-Einfluß oftmals in einer diffusen Ausprägung auf. Der Kondensationsgrad des Chromatins weist auf einen prometapha-sischen Kern hin, verglichen mit Kontrollkernen der gleichen Phase ist der Gehalt an Filamenten aber wesentlich erhöht. Maßstab: 1µm

Abb. 61b: In einigen Fällen weisen Filamente unter D2O-Einwirkung eine distinkte Ausprägung auf, wobei ihre Anzahl beträchtlich erhöht ist. Maßstab: 1µm

Diskussion 64

4 Diskussion

4.1 Die Elemente des mikronucleären Spindelapparates

4.1.1 Die Funktion der Mikrolamellen

Der Mikronucleus der Ciliaten gilt als transkriptionsinaktiv bzw. transkriptionsinert

(Karrer, 1986), wohingegen der Makronucleus sowohl in der vegetativen Phase (Wich-

terman, 1986) als auch im Verlauf der Konjugation (Mikami,1992; 1996) eine hohe

RNA-Syntheseleistung aufweist.

Die scheinbare genetische Inaktivität des Mikronucleus spiegelt sich in der ultrastruktu-

rellen Beschaffenheit seines Chromatins wider. Schon in interphasischen Kernen liegt

es in kondensierter Form vor, die jedoch von Art zu Art in ihrer Ausbildung variiert.

Während das Chromatin bei Paramecium aurelia zentral und elektronendicht im Mi-

kronucleus lokalisiert und von einer granulären Zone umgeben ist (Stevenson und

Lloyd, 1971a), erscheint es bei Paramecium bursaria gleichmäßig in kondensierter

Form im Nucleoplasma verteilt, wohingegen die DNA der meisten höheren Organismen

zum überwiegenden Anteil dekondensiert und stoffwechselaktiv im Kern vorliegt. Auch

Nucleoli, wie sie bei Ciliaten als ein Zeichen von Transkriptionsaktivität im Makronu-

cleus stets vorhanden sind, können im Mikronucleus generell nicht nachgewiesen wer-

den (Allen, 1988).

Die enge Beziehung zwischen beiden Kernen wird durch die Tatsache deutlich, daß in

konjugierenden Paaren die Teilungsereignisse des Mikronucleus synchron stattfinden.

Hierfür ist ein vom Makronucleus codiertes Genprodukt verantwortlich, der micronu-

clear division inducing factor (micDIF) ( Mikami, 1992; 1996).

Der Mikronucleus von P. tetraurelia zeigt in der S-Phase geringe Transkriptionsaktivi-

tät (Pasternak, 1967), so daß zumindest in einigen Fällen die genetische Inaktivität des

Mikronucleus nicht bestätigt werden kann.

Die bei Paramecium bursaria in allen untersuchten Mikronuclei auffallend hohe Kern-

porendichte von ungefähr 0,1 µm Abstand außerhalb des Stemmkörperbereichs, läßt

eine rege Importfunktion vermuten. Um die generative Funktion des Kerns aufrecht zu

erhalten, werden vermutlich Proteine und Nucleosidtriphosphate zur DNA-Synthese aus

dem Cytoplasma in das Nucleoplasma gelangen. Die im Vergleich zu anderen unter-

suchten Ciliaten hohe und mit dem Makronucleus nahezu identische Frequenz – Helio-

phrya erhardi beispielsweise besitzt einen Kernporenabstand von nur ca. 0,25 µm

Diskussion 65

(Hanke-Bücker, 1992) – könnte die Vermutung nach einem ebenfalls existierenden,

zumindest zeitweiligen Export von Transkriptionsprodukten entstehen lassen.

Die vermutete vegetative Rolle des generativen Mikronucleus wurde durch neuere Un-

tersuchungen an Tetrahymena bestätigt (Haremaki et al., 1995).

Neben der auch während der Interphase bestehenden Kondensation des mikronucleären

Chromatins kann als ein weiteres Charakteristikum der Ciliaten die Ausbildung von

Kinetochoren gesehen werden, die im allgemeinen nicht dem typischen Aufbau höherer

Organismen (Luykx, 1970) entsprechen. Üblicherweise stellen sich Kinetochore höhe-

rer Eukaryoten im Elektronenmikroskop als eine trilamellare, scheibenförmig aufge-

baute Struktur dar (Pidoux und Allshire, 2000), die sich am Ende der Prophase formiert:

Eine äußere, elektronendichte Zone ist von einer fibrillären Korona umgeben, die nur

dann sichtbar ist, wenn keine Mikrotubuli inserieren (Brinkley und Stubblefield, 1966).

Abgetrennt durch eine elektronentransparente Zone ist eine innere, elektronendichte

Zone beschrieben worden, die oftmals mit dem darunter lokalisierten Chromatin des

Centromers assoziiert zu sein scheint (Van Hooser et al., 1999). Verschiedene Centro-

mer-Proteine (CENP) sind sowohl mit der inneren als auch mit der äußeren Zone asso-

ziiert. Zusätzlich sind in der fibrillären Korona und der äußeren Zone auch Motorpro-

teine wie CENP-E und Dynein/Dynactin lokalisiert (Dobie et al., 1999; Maney et al.,

2000). Alternative Methoden der Fixierung haben in jüngster Zeit weitere strukturelle

Bestandteile des Kinetochors aufgedeckt, so daß die Beschreibung einer trilaminaren

Struktur auch bei höheren Organismen nur noch eingeschränkte Gültigkeit besitzt

(McEwen et al., 1998).

Die Kinetochore der Ciliaten weisen im Gegensatz zu den Vertebraten in der Regel kei-

ne distinkte Ausprägung auf (Luykx, 1970), wobei jedoch bei dem heterotrichen Ci-

liaten Nyctotherus ovalis die Existenz trilaminarer Kinetochore nachgewiesen werden

konnte (Eichenlaub-Ritter und Ruthmann, 1982b), ebenso wie bei Paramecium aurelia

(Jurand und Selman, 1970) und Loxodes magnus (Raikov, 1973). Colpoda steinii

(Kuck, 1984) und Heliophrya erhardi (Hanke-Bücker, 1992) weisen lediglich kappen-

förmige, homogene Strukturen auf, in denen jeweils mehrere Mikrotubuli inserieren.

Bei Paramecium bursaria wurden erstmals 1940 „stiftchenähnliche Gebilde“ bei licht-

mikroskopischen Untersuchungen beschrieben, die den Anschluß der Kinetochore an

den Spindelapparat ermöglichen (Chen, 1946b).

Diskussion 66

Bei ersten elektronenmikroskopischen Untersuchungen wurden die Mikrolamellen und

Mikrosepten als Hüllmaterial der Chromosomen beschrieben, „das im Längsschnitt als

leiterförmige Struktur erscheint“ (Hauser und Beinbrech, 1973).

Schwartz (1976) unterschied jedoch bei ersten ultrastrukturellen Untersuchungen zwi-

schen „Kinosomen“, die sich im Verlauf der Mitose ausbilden und als Mittler zwischen

Kinetochor und Spindelapparat dienen, und Lamellen, zu denen sich längs im interpha-

sischen Kern verlaufende Fibrillen zusammenlagern und ihn in ein System von Kam-

mern unterteilen („interphasische Kammerlamellen“). Diese Lamellen werden als Spei-

cherstrukturen der Spindelsubstanz interpretiert.

Lewis et al. (1976) hingegen führte in elektronenmikroskopischen Untersuchungen die

Begriffe „Mikrolamellen“ und „Mikrosepten“ ein, wobei er ein erstes Auftreten dieser

Strukturen in der Prophase registrierte.

Die morphologischen Beschreibungen von Hauser und Beinbrech (1973) stützen die im

Rahmen dieser Arbeit gezeigten Ergebnisse. Sie entsprechen den von den Autoren vor-

gestellten Befunden. Demgegenüber muß den Erkenntnissen von Schwartz (1976) wi-

dersprochen werden: Aus den veröffentlichten Abbildungen ist kein prinzipieller, struk-

tureller Unterschied zwischen „Kinosomen“ und „interphasischen Lamellen“ erkennbar.

Der Unterschied besteht eher in einer zu Beginn der Prophase noch nicht sehr distinkten

Ausbildung dieser Strukturen im Vergleich zu späteren Stadien. Auch sind durch den

Autor z.T. nur periphere Anschnitte der Mikrolamellen abgebildet, die evtl. nicht als

solche erkannt worden sind und dann fälschlicherweise als „Kinosomen“ bezeichnet

wurden.

Schwartz (1976) beschreibt das massive Auftreten von interphasischen Lamellen, die in

ihrer Struktur den in dieser Arbeit beschriebenen Mikrolamellen exakt gleichen.

Die hier vorgestellten Ergebnisse können die Aussage des Autors nicht bestätigen: ob-

gleich frühe prophasische Stadien schon über Mikrolamellen verfügen, sind doch in

interphasischen Kernen diese Strukturen nicht aufzufinden. Diese Ergebnisse befinden

sich im Einklang mit Erkenntnissen von Lewis et al. (1976), der ebenfalls von einem

ersten Auftreten der Mikrolamellen in der Prophase berichtet. Allerdings ist eine

prophasische, enge Assoziation dieser Strukturen mit der Kernmembran, wie sie Lewis

beschreibt, nicht zu bestätigen. Auch kann im Gegensatz zu Lewis noch in der Te-

lophase die Existenz von Mikrolamellen nachgewiesen werden, wohingegen dieser Au-

tor schon beim Anaphase-Telophase-Übergang diese Strukturen nicht mehr feststellen

kann. Auch Abbildungen bei Schwartz (1976) zeigen „doppelschichtige Umhüllungen“

Diskussion 67

der Chromosomen, die den Mikrolamellen und Mikrosepten in telophasischen Kernen

durchaus entsprechen.

Die Funktion der Mikrolamellen ist trotz der Beschreibung auch durch andere Autoren

(Fokin, 1997; Watanabe, 1997) nur von Lewis (1975; 1976; 1989) und Schwartz (1976)

diskutiert worden. Schwartz vermutet zwei verschiedene, bereits erwähnte Strukturen,

die phasenabhängig auftreten. Bedingt durch MgSO4-Quellungsversuche und HCl-Hy-

drolyse vermutet er eine stoffliche Verwandtschaft zwischen Kinosomen, Speicher-

strukturen der Spindelsubstanz und des Spindelapparates, wobei das Auftreten der La-

mellen als Doppelschicht in der Kinetochor-nahen Region des interphasischen Chromo-

soms beschrieben wird.

Lewis (1975) vermutet die Kinetochor-äquivalente Funktion der Mikrolamellen durch

vergleichende Untersuchungen an Kinetochor-Äquivalenten von Paramecium multimi-

cronucleatum und Paramecium aurelia und beschreibt eine Assoziation dieser Struktu-

ren mit Mikrofilamenten beim Meta-Anaphase-Übergang. Demgegenüber kann bei den

im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Zellen sowohl in der Metaphase als auch in der

Anaphase eine klare Assoziation der Mikrolamellen mit Mikrotubuli dokumentiert wer-

den.

Das mit dem Beginn der Mitose korrelierte erste Auftreten der Mikrolamellen, ihre enge

Assoziation mit Chromosomen sowie die direkte Insertion von Mikrotubuli in den spä-

teren Phasen der Mitose sind ebenso auch bei typischen Kinetochoren höherer Orga-

nismen zu finden, die morphologisch allerdings anders zu charakterisieren sind (Über-

sicht in Hoyt und Geiser, 1996). Die beschriebenen Gemeinsamkeiten lassen den Schluß

zu, daß es sich bei den als Mikrolamellen bezeichneten Strukturen um Kinetochor-

Äquivalente handelt. Die genaue Funktion der Mikrosepten ist nicht bekannt, sie könn-

ten aber als ein Bestandteil des Gesamtkomplexes für die mechanische Stabilität der

lamellaren Komponenten dienen. Elemente, die eine mechanische Vermittlung zwi-

schen Mikrolamellen und Chromosom übernehmen, sind vermutlich in dem in elektro-

nenmikroskopischen Aufnahmen opak erscheinenden Material lokalisiert, welches den

Hohlraum der glockenförmig gestalteten Mikrolamellen auskleidet. Mikrotubuli umge-

ben diesen Komplex ab der Metaphase ringförmig und dienen vermutlich der zusätzli-

chen räumlichen Separierung der Chromosomen gegeneinander in einem System von

„Kammern“ (s. Schema 2, Seite 44).

Obwohl die Aufklärung der biochemischen Natur der Mikrolamellen und Mikrosepten

nicht vorrangiger Gegenstand der vorliegenden Arbeit war, wird doch vermutet, daß

Diskussion 68

zumindest die Mikrolamellen aus Material bestehen, das den Intermediärfilamenten

ähnelt. Lewis (1989) stellt ähnliche Mutmaßungen an, wobei sich diese Erkenntnisse

auf rein morphologische Vergleiche stützten, ohne daß biochemische Daten vorlagen.

Watanabe (1997) vermutet, daß sich die Mikrolamellen aus Elementen des Kernskeletts

zusammensetzen, ohne daß dieser Begriff genauer definiert wird. Auch die oben er-

wähnten Quellungsversuche (Schwartz, 1976) konnten nur eine unzureichende Be-

schreibung der biochemischen Natur der Mikrolamellen und Mikrosepten erbringen.

Die in der vorliegenden Arbeit beschriebene Charakterisierung der Mikronuclei unter

Verwendung verschiedenster Antikörper zeigte bei der elektronenmikroskopischen

Auswertung niemals eine Markierung der Mikrolamellen oder Mikrosepten, so daß de-

ren Interpretation als Cytoskelettprotein als unwahrscheinlich angesehen werden kann.

Die Ermittlung der biochemischen Struktur dieser Kinetochor-Äquivalente muß also

zukünftigen Untersuchungen vorbehalten bleiben, jedoch ist eine ähnliche Vielzahl von

Proteinen in diesen Komplexen zu vermuten, wie sie in den Kinetochoren höherer Or-

ganismen – einschließlich den Hefen – vorzufinden ist (Pidoux und Allshire, 2000).

4.1.2 Der Zyklus der Filamente im Verlauf der Mitose

Die hier durchgeführten ultrastrukturellen Untersuchungen lassen das zyklische Auf-

treten der Filamente in Abhängigkeit vom Zellzyklus erkennen (s. Kapitel 3.1.3

„Interphase“ bis 3.1.8 „Telophase“). Sowohl die Anzahl als auch das Erscheinungsbild

der Filamente variiert, je nachdem in welcher mitotischen Phase sich der Mikronucleus

befindet. In der Literatur finden sich nur zwei zum Teil recht lückenhafte Darstellungen

dieses Zyklus‘, die sich zudem noch in wesentlichen Punkten widersprechen.

4.1.2.1 Das Erscheinungsbild der Filamente und Mikrotubuli in der Interphase und Prophase

Die Interphase ist bei höheren Organismen unter anderem durch die Struktur des Chro-

matins gekennzeichnet. Es liegt überwiegend dekondensiert und somit stoffwechsel-

aktiv vor. Im Gegensatz hierzu ist in interphasischen Mikronuclei von Paramecium bur-

saria das Chromatin auch in dieser Phase, wie bei nahezu allen Ciliaten, kondensiert,

wobei in der Regel der Grad der Kondensation mit dem Eintritt in die Mitose noch zu-

nimmt (Flickinger, 1965; Jurand und Selman, 1970).

Schwartz (1976) rechnet bei Paramecium bursaria die Existenz der in Kapitel 4.1.1

erwähnten Kinetochor-äquivalenten Strukturen und Filamente der Interphase zu und

interpretiert sie als ein Aufbau von „Speichersubstanz“, die kurz vor Beginn der Mitose

Diskussion 69

durch „die Solvatation ihres Proteins (...) den Aufbau des mikrotubulären Verteilungs-

apparates bedeutet“. Mikrotubuli sind im Verlauf der Interphase von dem Autor nicht

dokumentiert worden.

Andere Untersuchungen zeigen, daß kurze Mikrotubuli mit einem Durchmesser von 20

nm in der Interphase vorwiegend in unmittelbarer Nähe und parallel zur Kernmembran

verlaufen, wobei keine interphasischen Filamente nachzuweisen sind (Lewis et al.,

1976). Die von beiden Autoren abgebildeten Kerne entsprechen in der Struktur ihres

Chromatins den in dieser Arbeit gezeigten Interphasen.

Der von Lewis et al. (1976) erwähnten Abwesenheit der Filamente in der Interphase

kann nicht zugestimmt werden: Feine Filamente mit einem Durchmesser von ca. 5-7 nm

sind im Nucleoplasma der Mikronuclei auch in dieser Phase bei elektronenmikroskopi-

schen Untersuchungen nachzuweisen. Der fehlende Nachweis durch Lewis ist vermut-

lich in einer für elektronenmikroskopische Untersuchungen nicht optimal erfolgten Fi-

xierung der Zellen zu suchen. Der Autor berichtet nämlich von unzureichender Struk-

turerhaltung der Filamente bei Verwendung von Cacodylat- anstelle von Collidinpuffer

(Lewis, 1989). Somit ist es wahrscheinlich, daß die nur in geringer Anzahl und disper-

giert in der Interphase auftretenden Filamente nicht dargestellt werden konnten. Ein

Hinweis auf die unzureichende Strukturerhaltung der Zellen könnte auch in dem durch-

gängig überraschend geringen interphasischen Mt-Durchmesser von nur 20 nm begrün-

det sein, von dem der Autor berichtet und der nicht bestätigt werden kann.

Dem Auftreten von Lamellen in der Interphase kann ebenfalls nicht zugestimmt wer-

den: Zwar rechnet Schwartz (1976) die oben erwähnte Solvatationsphase der Interphase

zu, zählt aber auch die massive Bildung der Lamellen noch zur Interphase. Dieser Irr-

tum ist in der durch den Autor erfolgten Differenzierung der Mikrolamellen in „Spei-

cherstrukturen“ (Interphase) und „Kinosomen“ (Mitose) begründet, deren biochemische

Natur als verschieden angenommen wurde. Den Übergang von Speicherstrukturen in

Mikrotubuli oder umgekehrt hielt der Autor für unwahrscheinlich, so daß zum Auf- und

Abbau der Spindel-Mikrotubuli aus Mikrolamellen zwangsläufig eine Solubilisierung

dieser Proteine erfolgen mußte, aus denen in einer Solvatationsphase dann Mt entstün-

den. Kinetochor-äquivalente Strukturen wurden als solche nicht erkannt und als in-

terphasische Speicherstrukturen angesprochen, wohingegen die in Wirklichkeit identi-

schen Kinosomen korrekt den mitotischen Stadien zugerechnet wurden. Somit verneint

der Autor auch die Existenz interphasischer Mikrotubuli, wie sie hier in elektronenmi-

kroskopischen und fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen dargestellt werden

Diskussion 70

können, nachdem frühere Berichte von ihm deren Existenz bestätigten (Schwartz,

1964). Interphasisch auftretende Mikrotubuli sind ebenfalls in den Mikronuclei der Ci-

liaten Paramecium aurelia (Jurand und Selman, 1970; Stevenson und Lloyd, 1971a)

und Ichthyophtirius multifiliis (Hauser, 1972) beschrieben worden, wohingegen sie bei

Heliophrya erhardi (Hanke-Bücker, 1992) und Paracineta limbata (Hauser, 1972) nicht

nachzuweisen waren.

Eigene Untersuchungen haben nie eine Differenzierung der Mikrolamellen in Kinoso-

men und Speicherstrukturen gezeigt, wie auch in der Literatur nur eine einzige generelle

Form von Mikrolamellen und Mikrosepten beschrieben wird (Lewis, 1976, 1989; Fokin,

1997; Watanabe, 1997).

Durch immunfluoreszenzmikroskopische Untersuchungen kann unter Verwendung ei-

nes anti-Tubulin Antikörpers (YOL 1/34) in interphasischen Zellkernen eine zum Teil

erhöhte, diffuse Fluoreszenz im Bereich des Primärpols nachgewiesen werden, so daß

auch bereits in nicht-mitotischen Zellen ein Tubulin-Gradient vermutet werden kann. In

elektronenmikroskopischen Aufnahmen kann in diesem Bereich keine erhöhte Anzahl

an Filamenten oder Mikrotubuli nachgewiesen werden, so daß eine amorphe Zustands-

form des Tubulins vorzuliegen scheint.

Der Beginn der Mitose wird – zumindest bei höheren Organismen – durch den M-phase

promoting factor (MPF) eingeleitet, dessen Aktivität unter anderem durch Assoziation

mit einem Komplex, bestehend aus p34cdc2-Kinase und Cyclin B, eingeleitet wird (Ari-

on et al., 1988). Sowohl Cyclin-Homologe, als auch cdc2-Kinasen, sind bereits in ver-

schiedenen Protozoen nachgewiesen worden (Affranchino et al., 1993; MacDonald et

al., 1994; Maerker und Lipps, 1994), so daß es sich bei dem schon früh vermuteten

„Protein der Zellteilung“ („division protein“) (Rasmussen und Zeuthen, 1962) mit groß-

er Wahrscheinlichkeit um einen dem MPF sehr ähnlichen oder gar identischen Protein-

komplex handelt. Dies wird durch Untersuchungen gestützt, die in Zellextrakten von

Tetrahymena und Paramecium eine hitzelabile MPF-Kinase Aktivität nachgewiesen

haben (Fujishima et al., 1992; Roth et al., 1991). In jüngster Zeit gelang es, zwei Cy-

clin-Homologe aus Paramecium tetraurelia zu identifizieren und zu klonieren. Ein Ver-

gleich der Aminosäuresequenz ergab 42-51% Übereinstimmung zu den Cyclinen höhe-

rer Eukaryoten (Zhang et al., 1999). Somit kann es als wahrscheinlich angesehen wer-

den, daß auch bei Ciliaten die Mitose durch Aktivität des MPF oder eines MPF-ähnli-

Diskussion 71

chen Proteins induziert wird, wobei ein Anstieg der Cyclin-Konzentration als Aktivator

angenommen werden kann (Adl und Berger, 1996).

Die Prophase ist bei einem Großteil aller Organismen durch den Beginn der Kondensa-

tion des in der Interphase noch diffus vorliegenden Chromatins gekennzeichnet. In hö-

heren Organismen wird dieser Vorgang von einem Zerfall cytoplasmatischer Mikrotu-

buli unter gleichzeitiger Ausbildung der Mitosespindel begleitet.

Die Prophase bei Paramecium bursaria ist durch die einsetzende Kondensation des

Chromatins charakterisiert, wobei diese am Primärpol beginnend zum Sekundärpol hin

fortschreitet.

Mehrere Faktoren werden – zumindest in Metazoenzellen – für die in der Mitose begin-

nende Kondensation des Chromatins verantwortlich gemacht. Diese sind phylogenetisch

verwandt und deuten auf einen konservierten Mechanismus hin. Diese Faktoren bein-

halten den Kondensin-Komplex, Topoisomerasen, Histon H3 und eine Reihe weiterer

Proteine (Ouspenski et al., 2000). Besonderes Interesse gilt in jüngster Zeit dem Kon-

densin-Komplex, der als erstes in Eiextrakten von Xenopus nachgewiesen wurde (Hi-

rano et al., 1997). Zu Beginn der Interphase löst sich der Kondensin-Komplex von den

Chromosomen und ist dann im Cytoplasma lokalisiert, wobei kleine Subpopulationen

auch in interphasischen Kernen nachgewiesen werden können (Schmiesing et al., 2000).

Homologe Bestandteile des Komplexes konnten bis jetzt in Drosophila und Schizosac-

charomyces pombe gezeigt werden (Ouspenski et al., 2000).

Es besteht die Vermutung, daß auch im Kern von Paramecium bursaria ein Faktor bzw.

Komplex lokalisiert ist, der durch eine Aktivierung die Kondensation der Chromosomen

einleitet. Unter Berücksichtigung des bei Eukaryoten sehr konservativen Mechanismus‘

der Chromosomenkondensation könnte es sich hierbei durchaus um Phosphorylierungen

handeln, wie sie zur Aktivierung des Kondensin-Komplexes nachgewiesen sind (Ki-

mura et al., 1998). Um die Chromosomenkondensation, beginnend am Primärpol, erklä-

ren zu können, muß davon ausgegangen werden, daß ein dem Kondensin analoger

Komplex hier lokalisiert ist, um dann durch räumliche Ausbreitung den dokumentierten

Gradienten der Kondensation zu erzeugen. Da auch andere Proteine am Primärpol

nachgewiesen werden können, die zumindest für die Polymerisation und Verankerung

der Mikrotubuli eine Rolle spielen, kann am Primärpol auch eine weitergehende Prote-

inausstattung vermutet werden. Erst bei einer innerhalb der Kernmembran homogenen

Verteilung des Kondensins ist eine gleichmäßige Kondensation, wie sie zuerst in der

Diskussion 72

mittleren Metaphase beobachtet werden kann, gewährleistet. Eine Charakterisierung

dieses vermuteten Komplexes bleibt späteren Untersuchungen vorbehalten.

Prophasische Kerne der untersuchten Zellen besitzen weiterhin periphere Mikrotubuli –

im Gegensatz zu verwandten Arten, die diese zu Beginn der Mitose bereits abgebaut

haben (Stevenson und Lloyd, 1971a). Darüber hinaus zeichnen sie sich durch eine im

Bereich des Primärpols gute Markierbarkeit mit anti-Tubulin Ak aus. Dieser Tubulin-

nachweis deckt sich räumlich mit der elektronenmikroskopischen Dokumentation der

vom Primärpol auswachsenden Filamente, die sich in Richtung Sekundärpol erstrecken.

Das massive Auswachsen mikronucleärer Filamente, einhergehend mit der Formation

der mikrolamellaren Strukturen (s. Punkt 4.1.1) gilt als das Kriterium prophasischer

Mikronuclei.

Auch Mikrotubuli beginnen am Primärpol zu polymerisieren, so daß die Spindelent-

wicklung vollständig von diesem ausgeht. Sie haben den Sekundärpol jedoch noch nicht

erreicht. Dies steht im Kontrast zu Untersuchungen von Stevenson und Lloyd (1971a)

an Paramecium aurelia, die hier eine erste prophasische Bildung der Mikrotubuli in der

fibrillären Matrix des Mikronucleus nachwiesen, ohne daß eine räumliche Nähe zur

Kernmembran besteht. Der Ciliat Nyctotherus ovalis bildet in der Prometaphase Kineto-

chor-Mikrotubuli aus, die erst in der Metaphase die jeweiligen Kernpole erreicht haben

(Eichenlaub-Ritter und Ruthmann, 1982b), wohingegen bei Colpoda steinii nur ein ein-

ziger Mikrotubulus vom Kinetochor zu Beginn der Prophase polwärts auswächst (Kuck,

1984; Kuck und Ruthmann, 1983).

Die vom Primärpol ausstrahlenden Mikrotubuli besitzen einen Durchmesser von 25 nm,

wie er in dieser Phase der Mitose auch bei Spindel-Mikrotubuli anderer Ciliaten nach-

zuweisen ist (Eichenlaub-Ritter und Tucker, 1984; Tucker et al., 1985). Berichte von

prophasischen Mikrotubuli, die überwiegend einen mittleren Durchmesser von 17 nm

besitzen (Lewis et al., 1976) können nicht bestätigt werden.

Das Fehlen von MTOC-Strukturen, die sonst bei der Organisation der Spindel tierischer

Zellen stets nachzuweisen sind (Uzbekov et al., 1995), kann bei Paramecium bursaria

bestätigt werden und gilt als ein generelles Charakteristikum der intranucleären Spin-

delbildung bei Ciliaten (Tucker, 1967; Heath, 1980).

4.1.2.2 Mikrotubuli und Filamente in der Prometa- und Metaphase In höheren Organismen wird die Prometaphase als diejenige Phase bezeichnet, in der

die Kinetochore der Chromosomen das erste Mal mit Spindel-Mikrotubuli in Wechsel-

Diskussion 73

wirkung treten, welche dann als Kinetochor-Mikrotubuli bezeichnet werden. Vorausset-

zung hierfür ist das Fragmentieren der Kernhülle bei gleichzeitiger Ausbildung einer

bipolaren Spindel (McIntosh und Koonce, 1989; Salmon, 1989). Mikrotubuli, die au-

ßerhalb der Spindel liegen, werden als Astral-Mikrotubuli benannt und dienen in Asso-

ziation mit Motorproteinen der genauen Ausrichtung der Spindel (Shaw et al., 1997).

Als MTOCs der Mikrotubuli dienen die schon in der S-Phase duplizierten Centrosomen,

die ihre Nucleationsfähigkeit unter anderem durch die Phosphorylierung pericentriolärer

Proteine erlangen (Centonze und Borisy, 1990).

Einen erheblichen Gegensatz zu den eben erwähnten Ereignissen stellt die Spindel vie-

ler Protisten – insbesondere der Ciliaten – dar, bei denen die Kernhülle während der

gesamten Teilung bestehen bleibt. Trotz dieser Gemeinsamkeit differiert die Art der

Mikrotubulibildung stark: Bei Paracineta limbata wachsen die Mikrotubuli aus einem

im Mikronucleus lokalisierten Parakristall aus, um in der Prometaphase dann von Pol zu

Pol zu reichen (Hauser, 1972). Auch Heliophrya erhardi (Hanke-Bücker, 1992) und

Paramecium aurelia (Stevenson und Lloyd, 1971a) zeigen nicht das charakteristische

Auswachsen der Mikrotubuli von einem Pol des Kerns, wie es bei Paramecium bursa-

ria der Fall ist; bei diesem Organismus ist in der Nähe des Primärpols ein erstes Andok-

ken von Mikrotubuli, die sich vom Primärpol aus bilden, an Mikrolamellen zu beobach-

ten. Aufgrund der Homologie der Mikrolamellen zu Kinetochoren werden diese Mikro-

tubuli im folgenden, gemäß den Bezeichnungen der klassischen Mitose, als Kinetochor-

Mt (kMt) bezeichnet.

Erst zu Beginn der Metaphase werden alle Chromosomen entweder mit Mikrotubuli des

Primärpols oder mit Mt des Sekundärpols eine Verbindung eingehen, so daß eine ord-

nungsgemäße Trennung der Chromatiden gewährleistet ist.

In der Prometaphase gleicht der nun ebenfalls spitzzipflige Sekundärpol in seinem Er-

scheinungsbild dem Primärpol. Die so morphologisch scheinbar dokumentierte Fähig-

keit, als MTOC zu dienen, kann allerdings erst in der Metaphase nachgewiesen werden,

wenn von dort ausgehende Mt die entsprechenden Mikrolamellen erreicht haben. In der

Prometaphase hingegen sind erst wenige Mt am Sekundärpol nachzuweisen.

Es stellt sich nun die Frage nach dem Mechanismus, gemäß dem sich Chromosomen

einordnen und die Metaphaseplatte ausbilden. Bei der Formation einer bipolaren Spin-

del in höheren Organismen wirken mannigfaltige Kräfte auf das Kinetochor. Von ihm

werden Mikrotubuli des einen Spindelpols eingefangen („search-capture“-Modell,

Diskussion 74

Kirschner und Mitchison, 1986), obwohl das Kinetochor scheinbar auch die Möglich-

keit zur Nucleation von Mikrotubuli besitzt (Mitchison und Kirschner, 1985). Injekti-

onsversuche mit markiertem Tubulin zeigen aber, daß die Polymerisation der Kineto-

chor-Mt in der Regel vom Centrosom initiiert wird (Geuens et al., 1989).

Werden Mikrotubuli des entgegengesetzten Spindelpols gebunden, kommt es zu einer

bipolaren Ausbildung der Spindel und zur Ansammlung der Chromosomen in der Me-

taphaseplatte. Bezüglich der hierbei auftretenden Kräfte werden zur Zeit 4 verschiedene

Modelle diskutiert: Im Modell A werden 2 polwärts gerichtete Kräfte vermutet, die auf

die zu den entgegengesetzten Polen orientierten Kinetochore der Schwesterchromatiden

wirken und sich im Äquatorialbereich der Spindel genau aufheben (Hays und Salmon,

1990). Hierzu bedarf es der kontinuierlichen Polymerisation und Depolymerisation der

kMt, die inzwischen auch nachgewiesen werden konnte (Mitchison et al., 1986). Eine

andere Hypothese (Modell B) besagt, daß die Einordnung der Chromosomen in die Me-

taphaseplatte zum einen auf der Kraft beruht, die polwärts auf die Kinetochore einwirkt,

zum anderen dieser Kraft aber eine Gegenkraft entgegensteht, die durch die Ausbildung

der freien Mikrotubuli der Halbspindel ausgeübt wird und die Chromosomen schließlich

in der Metaphaseplatte ansammelt (Mazia, 1987). Anstatt einer mechanischen Grenze

wird im Ejektionsmodell (Modell C) postuliert, daß jedes Chromosom Ejektionskräften

unterliegt, die Astral-Mikrotubuli als Gegenkraft zu den polwärts gerichteten Kräften

ausüben, die auf die Kinetochore durch Depolymerisation der kMt wirken (Ault et al.,

1991; Cassimeris et al., 1994). In einer weiteren Hypothese (Modell D) wird vermutet,

daß Chromosomen durch die Regulation der Mikrotubuli-assoziierten Motorproteine,

die an den Kinetochoren lokalisiert sind, in der Metaphaseplatte gehalten werden (Skib-

bens et al., 1993).

Bedingt durch das bis zum Ende der Prometaphase „monopolare“ Wachstum der mi-

kronucleären Spindel sind diese Modelle auf den Kern von Paramecium bursaria in

ihrer ursprünglichen Form nicht anwendbar. Die Assoziation von Primärpol-nahen

Chromosomen mit den Spindel-Mikrotubuli, bevor die Sekundärpol-nahen Chromoso-

men vollständige Mikrolamellen ausgebildet haben, läßt eine Anordnung der Chromo-

somen im Kern vermuten, die noch vor der Prometaphase vonstatten geht und auf ande-

ren Mechanismen beruht. Die Mt der Prometaphase durchziehen den Kern in paralleler

Anordnung und bewirken offensichtlich seinen elliptischen Habitus. In elektronenmi-

kroskopischen Darstellungen ist weiterhin zu beobachten, wie durch Mikrotubuli und

Filamente, die von Pol zu Pol ziehen, die Chromosomen in ein System von Kammern

Diskussion 75

„eingeschlossen“ zu werden scheinen. Diese „Kammerung“ ist bereits deutlich in späten

Prophasen zu beobachten, wobei hier hauptsächlich Filamente vorzufinden sind, die

Chromosomen gegeneinander abgrenzen.

Eine mögliche Deutung dieser morphologischen Besonderheit besteht darin, daß diese

Ausbildung ein erstes Einpassen und Ausrichten der Chromosomen ermöglicht, um eine

in der Anaphase erfolgende korrekte Trennung der Schwesterchromatiden zu gewährlei-

sten. Kubai (1987) berichtet über die Einordnung und Trennung der homologen Chro-

mosomen in der Prophase der Meiose des Dipteren Sciara coprophila, bevor es zur

Ausbildung der Teilungsspindel kommt.

Zu Paramecium bursaria nah verwandte Arten, wie Paramecium tetraurelia (Adl und

Berger, 1995) oder Heliophrya erhardi (Hanke-Bücker und Hauser, 1996) zeigen eine

Lokalisierung der Chromosomen im Bereich der Äquatorialebene des Kerns, wobei

diese Einordnung jedoch, zumindest in der Metaphase der Meiose I, nicht in einer

strengen, wie bei höheren Organismen üblichen Weise erfolgt.

Die Kongression der Chromosomen in einer für die Metaphase üblichen Art ist bei Pa-

ramecium bursaria nicht nachzuweisen. Dieses Ergebnis wird sowohl durch die sehr

ausführlichen lichtmikroskopischen Beobachtungen von Egelhaaf (1955), als auch

durch die elektronenmikroskopischen Untersuchungen von Lewis (1976, 1989) und

Schwartz (1976) an P. bursaria bestätigt, wobei der letztgenannte Autor sogar das Feh-

len der Prometa- und Metaphase vermutete. Demgegenüber kann im Mikronucleus eine

parallele Aneinanderlagerung der Chromosomen im mittleren Bereich des Kerns gezeigt

werden, wobei die Kernpole eine gebogene Kontur angenommen haben. Mikrotubuli

sind im Gegensatz zu früheren Phasen äußerst zahlreich zu finden, wohingegen der Ge-

halt an Filamenten im Vergleich zur Prophase deutlich abgenommen hat.

Eine mögliche Erklärung für eine fehlende, klassische Metaphase könnte in der „Kam-

merung“ der Chromosomen liegen, die dadurch bereits ausgerichtet werden, um eine

möglichst exakte Trennung der Schwesterchromatiden zu ermöglichen. Ein Ordnen der

Chromosomen im Äquatorialbereich des Kerns kann somit vermutlich entfallen.

Ein weiterer Grund für die fehlende Ausbildung einer Metaphase-„Platte“ könnte in

einer rein räumlichen Einschränkung bestehen. Die Anzahl der Chromosomen beträgt

bei P. bursaria mindestens 80, vermutlich liegt sie aber noch weit höher (Chen, 1940).

Eine parallele Aneinanderlagerung dieser Chromosomen in einer Ebene zur Bildung

einer Metaphaseplatte ist aufgrund der beschränkten Platzverhältnisse im Mikronucleus

– bedingt durch die persistierende Kernmembran – nicht möglich.

Diskussion 76

Die gebogene Struktur des Kerns beruht auf einer Streckung seiner spitzzipfligen Pol-

kappen, die in leicht abgewinkelter Position zum tonnenförmigen Mikronucleuskörper

liegen, wie es auch die Untersuchungen von Lewis et al. (1976) bestätigen. Es ist zu

vermuten, daß sich die in der Prometaphase begonnene, schon lichtmikroskopisch

sichtbare Umwandlung des Sekundärpols, hier fortgesetzt hat und nun bei beiden Polen

fortschreitet. Die offensichtlich für Mikrotubuli wesentlich erhöhte Nucleationsfähigkeit

der Pole äußert sich auch ultrastrukturell in einem geänderten Erscheinungsbild, das nun

eine extreme Elongation dieser MTOC-Region aufweist. Formveränderungen der pola-

ren Kappen in der Meta- und Anaphase sind auch bei anderen Ciliaten anzutreffen (Ka-

radzhan und Raikov, 1977).

Durch eine deutliche Verschiebung des Filament/Mikrotubuli – Verhältnisses zu Gun-

sten der Mt wird der Bedarf an Tubulin zum Aufbau der Spindel deutlich. Obwohl Fi-

lamente noch im Kern anzutreffen sind, hat ihre Zahl erheblich abgenommen. Bedingt

durch die starke Kondensation der Chromosomen kann in dieser Phase ein direkter

Übergang von Filamenten in Mikrotubuli dokumentiert werden, ohne daß aufgelocker-

tes Chromatin einen Nachweis verhindert. In einigen Fällen sind in dieser Phase C-för-

mige Mikrotubuli im Querschnitt zu erkennen, die auf Mt-Bildungsstadien hinweisen

(siehe Punkt 4.3.1).

Die schon in der Prophase dokumentierte Abgrenzung der Chromosomen durch Fila-

mente besteht auch in der Metaphase fort, jedoch sind nun Mikrotubuli in direkter Nähe

der Chromosomen nachzuweisen. Vermutlich kommt dem engen Ring aus Mikrotubuli

um die jeweiligen Chromosomen die Aufgabe der Separation zu, so daß die Trennung

der Schwesterchromatiden in der Anaphase entlang vorher festgelegter „Bahnen“ ver-

laufen kann, ohne daß es zu mechanischen Störungen der Chromatiden untereinander

kommt. Bemerkenswert ist die morphologische Kongruenz der Mikrotubuli und Fila-

mente in Querschnitten der Prometa- und Metaphase, die einen direkten Zusammenhang

zwischen Mikrotubuli und Filamenten nahelegt (s.u.).

In der Metaphase ist erstmals Membranmaterial im Nucleoplasma vorzufinden. Hierbei

ist es unwahrscheinlich, daß es sich um Anschnitte einer Einfaltung der äußeren Kern-

membran handelt, da intranucleäre Membrane weder über die für die Kernmembran

charakteristischen Kernporen verfügen, noch unterscheidet sich das von ihnen um-

grenzte Plasma von dem umgebenden Karyoplasma. Cytoplasma weist ultrastrukturell

ein anderes Erscheinungsbild auf. Würde es sich bei den nachgewiesenen Membranen

Diskussion 77

um Einfaltungen handeln, müßte das von ihnen umschlossene Plasma ein cytoplasmati-

sches Erscheinungsbild aufweisen.

Membranen sind recht häufig in den Spindelapparaten eukaryotischer Zellen anzutref-

fen: Die Spindeln der Spermatocyten des Lepidopteren Phragmatobia fuliginosa sind ab

der meiotischen Prophase bis einschließlich der Telophase von dichten Stapeln aus

Membranmaterial umgeben (Wolf, 1995). Der Autor zeigt Belege für einen Kontakt der

Stapel untereinander auf, so daß die Membranen ein Kontinuum bilden. Es wird die

Vermutung diskutiert, daß – ähnlich der Funktion des sarkoplasmatischen Reticulums in

der Muskelzelle – die Membranen durch Ausschüttung von Ca2+-Ionen eine Kontroll-

funktion auf die Spindel ausüben. Unzweifelhaft aber sind Membranvesikel an der

Formation der Kernmembran beteiligt (Übersicht bei Poccia und Collas, 1996).

Die oben diskutierten Funktionen von Membranvesikeln können nur bedingt auf Cilia-

ten übertragen werden, denn die Teilung des Mikronucleus zeichnet sich durch ein Per-

sistieren der Kernmembran aus, so daß im Gegensatz zu den oben erwähnten Beispielen

eine Kontinuität des Nucleoplasmas auch in der M-Phase besteht. Unzweifelhaft benö-

tigt die Zelle in den späteren Stadien der Mitose große Mengen an Membranmaterial,

um die enorme Streckung des Kerns und dessen Volumenzunahme realisieren zu kön-

nen. Es ist zu vermuten, daß in den Membranvesikeln eine Speicherform des Mem-

branmaterials vorliegt.

Die Bereitstellung bzw. Synthese von Membranen im Verlauf der Mitose bei Ciliaten ist

noch nicht hinreichend geklärt, jedoch können Membranstapel ähnlich dem Golgi-Ap-

parat, Mitochondrien sowie Ribosomen in der Nähe des sich teilenden Mikronucleus

nachgewiesen werden (Stevenson und Lloyd, 1971a). Diese Autoren vermuten eine zu-

sätzliche, noch nicht verstandene Beteiligung des von Ehret und DeHaller (1963) be-

schriebenen orthotubulären Systems an der Membransynthese.

Bei der etwa fünfzigfachen Verlängerung des Mikronucleus von Tetrahymena im Ver-

lauf der Konjugation kann die Fusion von cytoplasmatischen Membransystemen mit der

weiterhin als Doppelmembran bestehenden Kernhülle beobachtet werden (Wolfe et al.,

1976). Hier könnte ein Ansatzpunkt zum Verständnis der intranucleären Membranparti-

kel bestehen: Durch Fusion von cytoplasmatischen Membranbestandteilen auf der ei-

nen, von intranucleärer Membran auf der anderen Seite, könnte ein effizientes System

zur Oberflächenvergrößerung der doppelten Kernmembran bestehen. Hierzu muß aller-

dings in Phasen, wo kein Kernmembranwachstum erfolgt, innere Kernmembran zur

Speicherung in das Nucleoplasma abgegeben werden. Dieser diskutierte Mechanismus

Diskussion 78

der beiderseitigen Addition von Membranmaterial an die bestehende Kernmembran

setzt eine hochgeordnete Fusion auf beiden Seiten voraus, um eine auf cytoplasmati-

scher und nucleärer Seite gleichmäßige Vergrößerung zu gewährleisten.

4.1.2.3 Der Mikronucleus im Verlauf der Ana- und Telophase Die mitotische Anaphase, unterteilt in Anaphase A und Anaphase B, wird als diejenige

Phase definiert, in der die Trennung der Schwesterchromatiden erfolgt. Während in der

Anaphase A die Chromatiden zu den Polen wandern, ist die Anaphase B durch eine

exzessive Streckung der Spindel und einer damit verbundenen Elongation des Kerns

gekennzeichnet.

Es ist es anhand elektronenmikroskopischer Untersuchungen schwierig festzustellen,

inwieweit die Trennung der Chromosomen auf der Elongation des Kerns oder aber auf

der Verkürzung der Kinetochor-Mt beruht (Stevenson und Lloyd, 1971a), aber unter

Berücksichtigung der erheblichen Längenzunahme des Kerns kommt der Anaphase B

die hauptsächliche Bedeutung der räumlichen Trennung der Chromosomen zu (Hanke-

Bücker, 1992).

Der Mechanismus der Kräfte, die eine Chromosomenbewegung in der Anaphase A er-

möglichen, ist Gegenstand widersprüchlicher Diskussionen. Messungen haben eine um

10.000fach höhere Kraft am Chromosom ermittelt, als eigentlich notwendig wäre, um

eine polwärts gerichtete Bewegung mit der gemessenen Geschwindigkeit zu induzieren

(Coue et al., 1991). Sehr effiziente Bewegungsmechanismen müsssen somit zwangsläu-

fig eine Rolle spielen.

Eine allgemein favorisierte Vorstellung, als „Pac-Man“-Modell diskutiert, vermutet

eine Depolymerisation der kMt, induziert durch das Kinetochor selbst. Durch die hohe

Affinität dieser Struktur zu Mt und durch vermutete mechanische Bindungen, bewegen

sich die Chromosomen in Richtung des jeweiligen Spindelpols (Salmon, 1989). Zeit-

gleich kommt es in einigen Organismen zu einer Depolymerisation der am Centrosom

lokalisierten minus-Enden der kMt, die für sich allein genommen schon eine polwärts

gerichtete Bewegung der Chromosomen auslöst (Waters et al., 1996). Dieser Spindel-

pol-nahe Zerfall der kMt wurde bereits früh nachgewiesen und galt lange als einzige

Kraft zur polwärts gerichteten Bewegung von Chromosomen, was in dem heute nicht

mehr allgemein akzeptierten „Zugfasermodell“ seinen Niederschlag fand (Inoué, 1981).

Ein anderes Modell berücksichtigt die Existenz von am Kinetochor nachgewiesenen

Motorproteinen: Sowohl cytoplasmatisches Dynein (Pfarr et al., 1990; Steuer et al.,

1990), als auch die Kinesin-verwandten Proteine CENP-E (Grancel und Sorger, 1998)

Diskussion 79

und MCAK (Maney et al., 1998) scheinen aktiv an der Chromosomentrennung beteiligt

zu sein. Die genaue Funktion der Motorproteine an der Chromosomen-Segregation

bleibt umstritten.

Cytoplasmatisches Dynein ist als ein minus-Ende gerichtetes Motorprotein ein geeig-

neter Kandidat zur Chromosomentrennung, jedoch haben Injektionsversuche mit gegen

Dynein gerichteten Antikörpern keine Beteiligung dieses Proteins gezeigt (Vaisberg et

al., 1993). Auch Versuche mit Dynein-Mutanten der Hefe führten zu Ergebnissen, die

eine Beteiligung des am Kinetochor lokalisierten Dyneins an der Anaphase fraglich

machen (Li et al., 1993; Saunders et al., 1995). Im Kontrast zu diesen Versuchen stehen

Ergebnisse, die einigen Kinesin-verwandten Proteinen, die üblicherweise eine plus-

Ende gerichtete Kraft ausüben, eine unübliche minus-Ende gerichtete Bewegung zu-

sprechen (Hoenger und Milligan, 1997), die auch dem Protein CENP-E zugebilligt wird

(Thrower et al., 1995). Somit gilt zumindest eine Beteiligung dieses Proteins an der

Chromosomentrennung in der Anaphase als wahrscheinlich (Brown et al., 1996; Heck,

1999). Plus-Ende gerichtete Motorproteine der bimC-Familie besitzen ebenfalls eine

Verwandtschaft zu Kinesin, ihre Funktion beschränkt sich aber vermutlich auf die Cen-

trosomen-Separierung in der Prophase (Fuller und Wilson, 1992). Proteine der bimC-

Familie sind somit nur indirekt an der Chromosomenwanderung beteiligt.

Unzweifelhaft kommen dem Kinetochor wichtige Funktionen in der Trennung der

Chromosomen zu. Auch in der Anaphase von Paramecium bursaria weisen die Chro-

mosomen die erstmals in der Prophase in Erscheinung getretenen Kinetochor-Äquiva-

lente auf. Die Insertion der Mikrotubuli unterstreicht die Funktion dieser Strukturen,

wie schon unter Punkt 4.1.1 beschrieben. Die Depolymerisation der Kinetochor-Mt

kann in diesem Organismus zwar angenommnen werden, ist aber aufgrund der stati-

schen Ausschnitte schwierig an elektronenmikroskopischen Bildern zu belegen. Durch

das Fehlen einer typischen Metaphase-Platte im äquatorialen Bereich des Kerns, können

auch nur ungefähre Aussagen über das Schicksal der unterschiedlich langen kMt getrof-

fen werden. Jedoch kann vermutet werden, daß das mechanochemische Prinzip der

chromosomalen Trennung in der Anaphase A ein evolutiv konservativer Mechanismus

ist, der so auch auf die Anaphase A der Ciliaten übertragen werden kann und depolyme-

risierende kMt einschließt.

Zwei grundlegende Mechanismen der Kraftentwicklung werden für das Zustandekom-

men der Spindelstreckung in der Anaphase B vermutet. Zum einen wird eine Zugkraft

der Astral-Mikrotubuli postuliert, die auf die Centriolen wirkt und zu einer Verlänge-

Diskussion 80

rung des Spindelkörpers führt (Aist et al., 1993; Hiramoto und Nakano, 1988). Zum

anderen kann eine zweite Komponente von den Spindel-Mikrotubuli selbst ausgeübt

werden. Sie schieben aktiv die Spindelpole auseinander. Hierbei kann eine Krafteinwir-

kung durch ein Motorprotein-vermitteltes Aneinandergleiten antiparalleler Polmikrotu-

buli erfolgen, die sich in der Spindelzone überlappen (Hagan und Hyams, 1996; Leslie

und Picket-Heaps, 1983). Versuche von Hogan et al. (1992) führten zur Identifikation

eines Kinesin-verwandten Proteins in Diatomeen-Spindeln, das im interpolaren Spin-

delbereich lokalisiert ist und unter ATP-Verbrauch eine drückende Kraft auf die Pole

ausübt.

Aufgrund der geschlossenen Mitose bei Paramecium bursaria und dem damit verbun-

denen Fehlen astraler Mikrotubuli, kommt eine Zugwirkung auf die Spindelpole als

treibende Kraft in der Anaphase B sicherlich nicht in Betracht.

Ein Gleitmechanismus interpolarer Mikrotubuli allein kann ebenfalls die enorme Spin-

delstreckung, wie sie in der Anaphase auftritt, nicht erklären. Selbst bei vollständiger

Überlappung dieser Mikrotubuli könnte nur eine maximal zweifache Verlängerung der

Mikronucleusspindel erfolgen. Während des Gleitens erfolgende, fortwährende Polyme-

risationen dieser Mikrotubuli an ihren plus-Enden wäre zumindest zusätzlich erforder-

lich, um die festgestellte Elongation zu erklären.

In der Anaphase B können zur Separierung neben den interpolaren prinzipiell auch die

interzonalen Mikrotubuli beitragen. Diese Mikrotubuli entstehen im interchromosoma-

len Spindelbereich neu und treten in Kontakt mit den Kinetochor-fernen Regionen der

Chromosomen, um eine Spindelkörper-Elongation zu unterstützen. Tatsächlich können

interzonale Mikrotubuli in der anaphasischen Spindel von Paramecium bursaria beob-

achtet werden. Sie gleichen vermutlich der „separation spindle“ von Paramecium aure-

lia (Stevenson und Lloyd, 1971a), die Wenrich (1926) das erste Mal als Region zwi-

schen den Chromosomenfronten beschrieb und die auch in der Anaphase von Tetrahy-

mena auftreten (Davidson und LaFountain, 1975). Bei Nyctotherus ovalis werden diese

Mikrotubuli als Stemmkörper-Mt bezeichnet (Eichenlaub-Ritter und Ruthmann, 1982a). Die direkt unterhalb der Kernmembran lokalisierten Manschetten- oder sheath-Mikro-

tubuli sind bei einem Großteil der Mikronuclei von Ciliaten nachzuweisen (Eichenlaub-

Ritter und Ruthmann, 1982a; Eichenlaub-Ritter und Tucker, 1984; Hanke-Bücker,

1992; LaFountain und Davidson, 1980; Tucker et al., 1985). Sie treten immer als einfa-

cher Ring auf, der die Spindel umgibt (Tucker et al., 1985). Auch bei Paramecium bur-

saria sind diese Mikrotubuli zu finden. Sie unterscheiden sich aufgrund ihrer Anord-

Diskussion 81

nung – besonders in der Stemmkörpermitte – von den übrigen in der Spindel auftreten-

den Mt. Es gibt Hinweise darauf, daß diese sheath-Mt auch in biochemischer Hinsicht

einen Unterschied zu den meisten anderen anaphasischen Mikrotubuli aufweisen: In

Nyctotherus konnte eine erhöhte Stabilität sowohl der sheath- als auch der Stemmkör-

per-Mikrotubuli gegenüber Kälte und Vinblastin nachgewiesen werden (Eichenlaub-

Ritter und Ruthmann, 1982a), was für kMt nicht zutrifft. Bei dem Ciliaten besitzen die-

se Mikrotubuli neben der unüblichen Anordnung und Stabilität auch einen zum Teil von

den üblichen Maßen abweichenden Aufbau aus bis zu 15 Protofilamenten (Eichenlaub-

Ritter, 1985).

Auch in Paramecium tetraurelia sind Mikrotubuli im Spindelbereich des mitotischen

Mikronucleus nachzuweisen, deren Querschnitt bis zu 32 nm betragen kann (Tucker et

al., 1985).

Ein Antiserum, gerichtet gegen aus Paramecium tetraurelia isoliertes, axonemales Tu-

bulin, markiert neben cytoplasmatischen Mikrotubuli auch solche der Teilungsspindel

(Cohen et al., 1982). Diese Untersuchungen wurden nur auf immunfluoreszenz-mikro-

skopischer Ebene durchgeführt, somit konnte kein sicherer Nachweis erbracht werden,

daß nur Mikrotubuli, die dem üblichen Aufbau entsprechen, nachgewiesen wurden. An-

dere Ciliaten, sowohl Heliophrya erhardi (Hanke-Bücker, 1992) als auch Tetrahymena

thermophila (LaFountain und Davidson, 1980) die ebenfalls sheath- und Stemmkörper-

Mikrotubuli aufweisen, besitzen allerdings keinen erhöhten Durchmesser.

Sowohl bei Nyctotherus (Eichenlaub-Ritter, 1985) als auch bei Paramecium tetraurelia

(Tucker et al., 1985) scheint eine Korrelation zwischen der räumlichen Anordnung der

Mikrotubuli und ihrem Durchmesser zu bestehen: Mikrotubuli am Ende des Stemmkör-

pers, die sich in der Nähe der Halbspindel befinden, weisen meist 13 Protofilamente und

somit einen normalen Durchmesser auf, wohingegen zur Mitte des Stemmkörpers hin

Mikrotubuli mit einer erhöhten Protofilamentanzahl kontinuierlich zunehmen.

Die Deutung dieser Variation in der Zusammensetzung der Mikrotubuli-Population ist

nicht unproblematisch. Tucker et al. (1985) beobachteten in elektronenmikroskopischen

Serienschnitten der frühen Teilungsspindel von Paramecium tetraurelia bei der Spin-

delverlängerung einen Abbau von Mikrotubuli aus dem Stemmkörperbereich, wohinge-

gen die sheath-Mt mit ihrem zumeist erhöhten Durchmesser bestehen bleiben. Es wird

vermutet, daß evtl. Stemmkörper-Mt depolymerisieren, und das dadurch zur Verfügung

stehende Tubulin zum Aufbau der sheath-Mt verwendet wird. Die unterschiedlichen

Durchmesser der Mt könnten es zellulären Mechanismen ermöglichen, zwischen den

Diskussion 82

beiden Populationen zu differenzieren und entweder Abbau oder Elongation einzuleiten.

Der Sinn könnte in einer ökonomischeren Nutzung des Tubulins zu sehen sein (Tucker

et al., 1985).

Ein die Spindelelongation unterstützender Mechanismus kann in einer Gleitfunktion zu

suchen sein. Wie bei Nyctotherus, weist auch bei P. tetraurelia – distal von der Mit-

telachse des Stemmkörpers – der überwiegende Anteil der Mikrotubuli einen Durch-

messer von 25 nm auf. Es wird ein Teleskopmechanismus vermutet, der es den inneren,

normal gebauten Stemmkörper-Mt erlaubt, gegen die persistierenden, äußeren sheath-

Mt zu gleiten und den Stemmkörper, einem mehrgliedrigen Teleskop gleich, zu verlän-

gern (Tucker et al., 1985). Da sheath-Mikrotubuli bei den oben genannten Organismen

offenbar mit der Kernmembran in Kontakt stehen, können sie als Widerlager für die

Bewegung dienen. Dies setzt allerdings eine Population antiparalleler Mikrotubuli im

Stemmkörper voraus, um die Spindel in beide Richtungen zu verlängern. Als morpho-

logische Evidenz dieser Theorie werden Lücken im mittleren Stemmkörperbereich an-

gesehen, die erst in der frühen anaphasischen Verlängerung der Spindel auftreten. Diese

Lücken könnten durch ein Gleiten der Stemmkörper-Mikrotubuli entstanden sein.

Einige der Untersuchungsergebnisse an Nyctotherus und P. tetraurelia lassen sich bei P.

bursaria bestätigen: So sind auch in diesem Organismus sheath-Mt vorhanden, auf-

grund ihrer räumlichen Verteilung und ihrer Anzahl sind sie von den schon in der Inter-

phase nachzuweisenden peripheren Mt zu unterscheiden. Der bei anderen Ciliaten

nachgewiesene erhöhte Mikrotubuli-Durchmesser von bis zu 32 nm kann in einem Be-

reich distal zur Stemmkörpermitte in der Anaphase A noch nicht gezeigt werden. Auch

Filamente sind nur noch in sehr seltenen Fällen, im Bereich der Halbspindel, nachzu-

weisen. Wie schon in der Metaphase auffällig, entstehen Mikrotubuli bei gleichzeitiger

Dezimierung der Filamentanzahl. Phasen, die sich durch einen maximalen Bedarf an

Tubulin auszeichnen, wie es in der späten Anaphase der Fall zu sein scheint, weisen

nahezu keine Filamente mehr auf. Eine ausführliche Diskussion dieser morphologischen

Besonderheit des Kerns soll unter Punkt 4.3.1 erfolgen.

In der Anaphase B kann das gelegentliche Auftreten von besonders fragil erscheinenden

Mt mit einem Durchmesser von nur 19 nm im Bereich der Halbspindel dokumentiert

werden. Es setzt sich aber im weiteren Verlauf des Stemmkörpers nicht fort.

Distal des Spindelpols, aber noch innerhalb der Halbspindel, können jetzt Mt mit einem

Durchmesser von 30 nm gezeigt werden, zur Spindelmitte hin steigt der Durchmesser

auf bis zu 32 nm an. Im Bereich des Stemmkörpers ist wiederum eine heterogene Po-

Diskussion 83

pulation von Mt nachzuweisen, die Durchmesser von 25 nm im Normalfall und 28-32

nm im Extremfall besitzen. Eine Interpretation dieser Beobachtungen im Sinne der Te-

leskop-Hypothese (Tucker et al., 1985) kann hier nur bedingt erfolgen. Im Unterschied

zu P. tetraurelia besitzen die Manschetten-Mt nur vereinzelt einen erhöhten Durchmes-

ser. Eine mechanische Verbindung mit der Kernmembran, wie oben erwähnt, kann

ebenfalls nicht eindeutig beobachtet werden. Andererseits lassen sich Dynein-ähnliche

Querverbindungen zwischen den Stemmkörper-Mt aufzeigen, die sich durchaus im Sin-

ne der Induktion einer Gleitbewegung interpretieren lassen.

Tucker et al. (1985) vermuteten, daß auf einem niedrigen Stadium der evolutiven Spin-

delentwicklung kein Kontakt der Manschetten-Mt zur Kernmembran besteht, sondern

nur ein Gleiten zweier antiparalleler Mt-Populationen gegeneinander zur Verlängerung

der Spindel führt. Erst in Zellen eines höheren Entwicklungsstadiums ist die Spindel-

elongation dann wirksam fortentwickelt, was sich in Details wie der Konnexion der

Manschetten-Mt zur Kernmembran im Stemmkörperbereich äußert. Dies führt vermut-

lich auch dazu, daß die Kernmembran im Stemmkörperbereich mechanisch stabilisiert

wird. Ein evolutiv früheres Stadium der Spindelentwicklung könnte auch bei Parame-

cium bursaria vorliegen.

Ein durch Lewis (1975) durchgeführter direkter Vergleich der mikronucleären Mitose

bei Paramecium bursaria, P. multimicronucleatum und P. aurelia zur Aufdeckung evo-

lutiver Verwandtschaften hatte folgendes Ergebnis: Aufgrund der Spindelausbildung

und der Struktur der Kinetochore bzw. Kinetochor-Äquivalente handelt es sich bei P.

bursaria um die primitivste Spezies, gefolgt von P. multimicronucleatum. P. aurelia

wird in Bezug auf den Spindelapparat als am höchsten entwickelt angesehen. Dies deckt

sich mit der von Tucker et al. (1985) aufgestellten Hypothese (s.o.) und erklärt, daß die

Verbindung zwischen Manschetten-Mt und Kernmembran meist fehlt.

Das dispergierte Auftreten der Mikrotubuli mit erhöhtem Durchmesser könnte evtl.

ebenfalls auf einer in der Stammesentwicklung noch nicht weit fortgeschrittenen Spin-

delausbildung beruhen: Wenn, wie von Tucker et al. (1985) vermutet, der Organismus

anhand der Durchmesser zwischen Manschetten- und Stemmkörper-Mt unterscheiden

kann und so Manschetten-Mt vor dem Abbau schützt, so gewährleisten diese stabileren

Mikrotubuli zum einen eine mechanische Integrität des Stemmkörpers, zum anderen

eine „Leitbahn“ zum Gleiten der Subpopulation normal gebauter Mt. In einer weniger

effektiven Art wäre dieses Prinzip somit auch bei P. bursaria verwirklicht, wobei Man-

schetten-Mt auf jeden Fall zur Stabilisierung des Stemmkörperbereichs zwingend vor-

Diskussion 84

handen sein müssen, wenn hier auch vorwiegend in normaler Ausprägung. Allerdings

erscheint eine derartige morphologische Umstrukturierung der mitotischen Spindel sehr

aufwendig, da im allgemeinen durch die Möglichkeit der posttranslationalen Modifika-

tion der Zelle weniger komplizierte Mechanismen zur Charakterisierung von Mikrotu-

buli zur Verfügung stehen.

Einmalig ist bisher die Existenz von Mikrotubuli, die nur einen Durchmesser von 19 nm

besitzen. Die Vermutung, daß es sich hierbei um eine weitere Population von serolo-

gisch differenten Mikrotubuli handeln könnte, scheint möglich, gegenwärtig sind sie

aber eher als Polymerisationsvariante zu sehen. Nach jetzigem Kenntnisstand läßt sich

aus der Existenz der im Querschnitt 19 nm messenden Mt keine erkennbare biologische

Bedeutung ableiten.

Böhm et al. (1984) wiesen bei in vitro Versuchen eine empfindliche Beeinflussung der

Protofilamentanzahl von Mt durch Assoziation mit MAPs nach. In MAP-freiem Milieu

konnten Mikrotubuli erzeugt werden, die aus nur 8 Protofilamenten bestehen. Eventuell

könnte eine gestörte MAP-Assoziation die Existenz der Mikrotubuli mit verringertem

Durchmesser erklären.

Alle Autoren, die Makrotubuli in Ciliaten beschrieben haben, können letztendlich, wie

bereits erwähnt, zur genauen biologischen Funktion nur Vermutungen anstellen. Auf-

klärung lassen nur immunologische Untersuchungen, strukturdynamische Ermittlungen

im mitotischen Kern und die genaue Kenntnis der verantwortlichen mikrotubulären

Gensequenzen zu, um entscheiden zu können, ob es sich bei diesen Ausbildungen um

evolutive oder energetisch bedingte Strukturen handelt, oder aber um dynamisch/mor-

phologisch notwendige Polymerisationen.

Eine weitere, auffällige Ausbildung in der Anaphase besteht in der extremen Verlänge-

rung der jeweiligen Spindelpole. Mit einer Länge von ca. 3 µm und einem Durchmesser

von lediglich 0,8 µm besitzt der Kernpol nicht mehr eine wie in der Metaphase zu er-

kennende, spitzzipflige Ausprägung, sondern eine eher in dieser Form noch nicht be-

schriebene, „lanzettartige“ Verlängerung.

Dieser besondere Habitus des Kernpols kann verschiedene Ursachen haben. LaFountain

und Davidson (1980) vermuten in ultrastrukturellen Untersuchungen an der anaphasi-

schen Spindel von Tetrahymena, daß Kinetochor-Mikrotubuli nicht direkt an den Spin-

delpolen inserieren, sondern via polarer- und evtl. auch Manschetten-Mikrotubuli indi-

rekt mit den MTOCs verbunden sind. Da von den Autoren keine Verkürzung der Kine-

Diskussion 85

tochor-Mikrotubuli in der Anaphase nachgewiesen werden konnte, wird unter Beteili-

gung von Motorproteinen ein Gleiten der Kinetochor-Mikrotubuli an den mit ihnen ver-

bundenen Polar- oder Manschetten-Mikrotubuli vermutet. Diese Theorie läßt sich auf

Paramecium bursaria übertragen, jedoch kann aus Untersuchungen der Pro- und Meta-

phasen davon ausgegangen werden, daß im Gegensatz zu Tetrahymena die Kinetochor-

Mikrotubuli im Bereich der Kernpole entspringen. Wäre, wie bei dem oben genannten

Ciliaten, auch hier ein Gleitmechanismus der Kinetochor-Mikrotubuli vorhanden, müß-

ten diese zur Separierung der Schwesterchromatiden in Richtung Kernpol bewegt wer-

den, was zu einer lanzettartigen Elongation des jeweiligen Kernpols führen könnte. Ge-

gen die Existenz eines solchen Mechanismus bei P. bursaria spricht die Tatsache, daß

bei Tetrahymena Kinetochor-Mikrotubuli nicht bis in die Pole reichen, aber in der Ana-

phase die Kinetochore bis hinter den Ursprungsort der kMt transportiert werden. Bei

Paramecium bursaria hingegen inserieren die Kinetochor-Mt direkt am Spindelpol, was

das erwähnte Gleiten nicht sinnvoll erscheinen läßt – jedoch ist es auch nicht voll-

ständig auszuschließen.

Die Depolymerisation der Kinetochor-Mt bei P. bursaria, wie sie auch bei verwandten

Ciliaten dokumentiert ist (Eichenlaub-Ritter und Ruthmann, 1982b), kann als wahr-

scheinlich angesehen werden. Hingegen fehlen bei Tetrahymena depolymerisierende

kMt in der Anaphase A (LaFountain und Davidson, 1980), was die unübliche Dynamik

dieser Spindel betont.

Eine zutreffendere Hypothese für die Elongation der Kernpole wäre in einer Verlänge-

rung der interpolaren Mikrotubuli zu suchen. Die schon während der Prometaphase vom

Primär- zum Sekundärpol auswachsenden Mikrotubuli sorgen für eine spitzzipflige

Ausprägung des Sekundärpols. Durch eine zusätzliche Polymerisation wird die zu ei-

nem späteren Zeitpunkt in der Anaphase dokumentierte Ausbildung der Pole verursacht.

Diese wird vermutlich bereits durch eine während der Metaphase erfolgende Nucleation

von Mikrotubuli am Sekundärpol unterstützt, die im Überlappungsbereich mit den vom

Primärpol entspringenden Mt eine Gleitbewegung eingehen könnten. Durch die persi-

stierende Kernmembran konvergieren die Mikrotubuli am jeweiligen Pol, und eine

drückende Kraft – die sich aus dem erwähnten Gleiten der antiparallelen Mikrotubuli im

Überlappungsbereich ergibt, bewirkt eine entsprechende lanzettartige Verlängerung der

Kernpole.

In diesem Gleitmechanismus antiparalleler Mt könnte, analog der Funktion polarer Mt

in der Spindel höherer Organismen, neben der auf die Chromosomen drückenden Kraft

Diskussion 86

der Stemmkörper-Mt und der ziehenden Kraft der Kinetochor-Mt, eine dritte Kraft be-

stehen. Indem durch diesen Gleitmechanismus die Kernpole auseinanderweichen, kann

via der Kinetochor-Mt zusätzlich Zugkraft auf die Chromosomen ausgeübt werden.

Dies setzt eine Verbindung der Kinetochor-Mt mit Regionen der verlängerten Primär-

pole voraus, wie sie auch aus elektronenmikroskopischen Untersuchungen zu ersehen

ist. Ob die in den Kernpolen detektierten Mikrotubuli tatsächlich der Population von in

der Prophase bereits auswachsenden interpolaren Mt, kMt oder aber den erst in der

Anaphase polymerisierenden Stemmkörper-Mt zugehören, kann nicht mit Sicherheit

festgestellt werden.

Der Kern weist außerhalb der Halbspindeln einen Stemmkörperbereich auf, der in ma-

ximaler Entfernung von den Spindelpolen einen Durchmesser besitzt, wie er auch bei

den prospektiven Tochterkernen vorzufinden ist. Der Stemmkörper zeigt proximal zu

den Halbspindeln einen wesentlich geringeren Querschnitt. Während die Mikrotubuli in

diesem Bereich des Stemmkörpers zahlreich vertreten sind und sich mehrreihig parallel

der Kernmembran in Teilungsrichtung angeordnet haben, sind im dilatierten Bereich

des Kerns deutlich weniger Mikrotubuli nachzuweisen, die bis auf die einreihig vorhan-

denen Manschetten-Mikrotubuli auch eher dispergiert im Nucleoplasma vorliegen. Die-

se Beobachtung deckt sich mit den Ergebnissen von Tucker et al. (1985) an Para-

mecium tetraurelia, der aufgrund der „Lücken“ zwischen den Mikrotubuli einen bereits

erwähnten Gleitmechanismus der Stemmkörper-Mt entlang der persistierenden Man-

schetten-Mikrotubuli vermutete.

Das zur Mitte des Kerns hin geweitete Erscheinungsbild des Stemmkörpers korreliert

mit der Anzahl an Mikrotubuli. Scheinbar bilden die Mikrotubuli durch Quervernetzun-

gen untereinander und mit der Kernmembran ein stabiles Gerüst. Dieses veranlaßt ver-

mutlich durch seine eigene Dynamik die gerichtete Elongation der Kernmembran.

Wenn nun im medianen Bereich des Kerns, bedingt durch die Spindelelongation und

dem damit verbundenen Gleiten der Mt, nur noch relativ wenige Mt vorhanden sind,

fehlt eine entsprechende Quervernetzung und damit die Möglichkeit, die Kernmembran

wie in den Chromosomen-nahen Bereichen auszurichten. Die vorhandenen Manschet-

ten-Mikrotubuli vermitteln noch eine gewisse mechanische Stabilität. Vermutlich kann

einem „Aufblähen“ der Spindel in diesem Bereich aber nicht mehr entgegengewirkt

werden.

Diskussion 87

Spindeldilatationen in diesem Bereich treten ebenfalls bei Paramecium tetraurelia (Tu-

cker et al., 1985), Heliophrya erhardi (Hanke-Bücker, 1992) und Paracineta limbata

(Hauser, 1970) auf. Die beiden letztgenannten Autoren stellten dabei sowohl in der

Ana- als auch in der Telophase eine sich terminalisierende Torsion der Spindel fest, die

bei P. tetraurelia scheinbar fehlt (Tucker et al., 1985). Es wird entweder ein ungleiches

Wachstum der Kernmembran (Hauser, 1970) oder aber eine ungleichmäßige Ausstat-

tung der Mikrotubuli mit Brückenproteinen vermutet (Hanke-Bücker, 1992), die diese

Torsion bedingen. Auch bei Paramecium bursaria kann eine Torsion der anaphasischen

Spindel beobachtet werden, jedoch beruhen diese Erkenntnisse auf lichtmikroskopi-

schen Untersuchungen an isolierten, gequollenen Kernen (Schwartz, 1964). Eigene ul-

trastrukturelle Untersuchungen lassen nur eine leichte Torsion der Spindel vermuten,

die niemals so deutlich wie in den elektronenmikroskopischen Untersuchungen o.g.

Autoren zu zeigen ist.

Während der Mikronucleus eine Vergrößerung seiner Oberfläche im Stemmkörperbe-

reich aufweist, ist die Form des Makronucleus in diesem Stadium der Zellteilung durch

eine leichte Streckung gekennzeichnet. Hierbei zeigt der Kern eine Verjüngung im mitt-

leren Bereich. Obwohl zweifelsohne Mikrotubuli an der Teilung des Makronucleus

mitwirken (Stevenson und Lloyd, 1971b; Tucker et al., 1980), ist vermutlich nur ein

Teil der Kräfte wirksam, wie sie zur Mitose des Mikronucleus benötigt werden. Durch

das Fehlen einer geordneten Trennung des chromosomalen Materials (Wolfe, 1967),

wie es in der Mikronucleus-Mitose der Fall ist, scheint die Ausbildung eines komplexen

Spindelapparates nicht erforderlich.

Im Verlauf der Anaphase von P. bursaria können das erste Mal cytoplasmatische Mi-

krotubulibündel nachgewiesen werden, die den Mikronucleus flankieren. Es handelt

sich hierbei um die sogenannten juxtanucleären Mt, welche vermutlich ausschließlich in

sich teilenden Zellen von Ciliaten auftreten (Eichenlaub-Ritter und Tucker, 1984), und

wahrscheinlich die Ausrichtung des Kerns unterstützen (Lewis et al., 1976). Die extra-

nucleären Mikrotubuli von P. multimicronucleatum weisen ein anderes räumliches Vor-

kommen auf und verbinden Mikro- und Makronucleus in der Interphase (Inaba und Ku-

do, 1972).

Wie bei anderen Arten der Gattung Paramecium wird die Cytokinese bereits eingeleitet,

wenn die Teilung der Kerne noch nicht abgeschlossen ist, oder aber, wie im Fall des

Makronucleus, kurz vor ihrem Beginn steht (Berger, 1988; Jeffery et al., 1970;

Schwartz, 1976). In direkter Nähe der Teilungsfurche ist unterhalb der Pellicula ein fi-

Diskussion 88

brillärer Saum erkennbar, der vermutlich kontraktile Proteine enthält. In Zellen höherer

Organismen in dieser Region stets nachgewiesenes Aktomyosin als Bestandteil des kon-

traktilen Rings (Cao und Wang, 1990), ist bei Paramecium vermutlich nicht vorhanden:

Die Inkubation von Teilungszellen mit S1-Fragmenten des Myosins führt zu keiner

nachweisbaren Markierung in dieser Region. Auch durch den Einsatz von Cytochalasin,

einem Inhibitor der Aktin-Polymerisation, zu sich teilenden Zellen konnte keine Stö-

rung der Cytokinese verursacht werden (Cohen et al., 1984).

Die Telophase des Mikronucleus ist durch das Fortbestehen des mächtigen Stemmkör-

pers gekennzeichnet. Währenddessen schreitet die Elongation des Makronucleus voran,

vermutlich durch das Einwirken einer drückenden Kraft nucleoplasmatischer Mikrotu-

buli (Tucker et al., 1980), die direkt unterhalb der Kernmembran lokalisiert sind und

auch bei P. bursaria gezeigt werden können. Raikov (1962, 1966) bezeichnet diese Mi-

krotubuli gemäß ihrer vermuteten Funktion als „pushing body“. Durch eine Gleitbewe-

gung untereinander wird ein physikalischer Druck auf die Membran ausgeübt, wie es

von Bayer und Molé-Bajer (1969) bereits bei anderen Organismen beschrieben worden

ist. Neben der Induktion einer Gleitbewegung wird auch eine Stützfunktion der Kern-

membran durch diese Mikrotubuli vermutet (Schwartz, 1978).

Wie auch bei verwandten Paramecium-Arten üblich (Jones, 1976; Kaneda und Hanson,

1974), ist die komplizierte Stomatogenese zu diesem Zeitpunkt bereits vollständig abge-

schlossen.

Der Stemmkörper des Mikronucleus hat sich in dieser Phase weiter verlängert, wobei

dieser Bereich des Kerns in ultrastrukturellen Untersuchungen zerklüftet erscheint. Wie

schon in der Diskussion der Anaphase erwähnt, muß auch in der Telophase ein Gleit-

mechanismus vermutlich antiparalleler Mikrotubuli-Populationen angenommen werden,

die diese zusätzliche Elongation ermöglichen.

Die prospektiven Tochternuclei hingegen weisen erste Abbauerscheinungen der Mi-

krotubuli auf. Dies zeigt sich vor allem durch den im Vergleich zur späten Anaphase

leicht gestiegenen Gehalt an Filamenten in den Halbspindeln. Die Kinetochor-äquiva-

lenten Strukturen sind zu Beginn der Telophase noch recht deutlich ausgebildet, zeigen

aber bereits Zerfallserscheinungen.

Lewis et al. (1976) stellt bei seinen Untersuchungen der Mitose von Paramecium bursa-

ria eine fehlende Präsenz dieser Strukturen schon beim Ana-Telophase-Übergang fest.

Mikrotubuli inserieren an den Chromosomen, ohne daß spezielle Strukturen erkennbar

Diskussion 89

wären. Diese Beobachtungen können nicht bestätigt werden, wobei, wie oben erwähnt,

die Struktur der Kinetochor-Äquivalente nicht mehr in allen Fällen eine distinkte Aus-

prägung wie in der Meta- und Anaphase besitzt.

Via Kinetochor-äquivalenter Strukturen können Mikrotubuli indirekt an Chromosomen

inserieren und eine Trennung bewirken. Die Funktion dieser Strukturen geht offenbar

erst im Verlauf der Telophase verloren.

Wie bereits erläutert, ist vermutlich nur in der frühen Anaphase eine Verkürzung der

Kinetochor-Mikrotubuli anzunehmen, was zu einer polwärts gerichteten Bewegung der

Chromosomen führt. Eine jedoch in der späten Anaphase beobachtete Verlängerung des

Kernpols hätte bei einer fehlenden Insertion von Kinetochor-Mikrotubuli an den Mi-

krolamellen keinerlei zusätzliche Auswirkungen auf eine räumliche Separierung der

Chromosomen in diesem Stadium. Niemals konnte in den hier vorliegenden Untersu-

chungen der von Lewis et al. (1976) beobachtete Sachverhalt dokumentiert werden, daß

Mikrotubuli beim Ana-Telophase-Übergang bzw. in einem späteren oder früheren Sta-

dium direkt an den Chromosomen inserieren.

Dies steht im Gegensatz zu Beobachtungen in sich teilenden Makronuclei, wo eine di-

rekte Insertion der Mikrotubuli an Chromosomen vermutet werden kann. Andere Er-

gebnisse zeigen hingegen, daß Mikrotubuli im Makronucleus nur an Nucleoli inserieren

oder z.B. bei Paramecium tetraurelia, diese sogar pertubieren (Tucker et al., 1980). In

einigen Fällen kann allerdings, wie z.B. bei P. aurelia, keinerlei Assoziation von Mi-

krotubuli mit Chromatin-Körpern nachgewiesen werden (Stevenson und Lloyd, 1971b).

Die scheinbar gezielte Insertion von Mikrotubuli, wie es ultradünne Längsschnitte des

Makronucleus‘ von P. bursaria aufzeigen, lassen die Frage nach einer eventuell doch

zielgerichteten Verteilung der makronucleären Chromosomen auf die beiden Tochter-

kerne aufkommen. Dies würde der Definition einer amitotischen Teilung, wie sie für

den Makronucleus bei Ciliaten allgemein vermutet wird (Raikov, 1969), entgegenste-

hen. Die amitotische Division setzt eine nicht zielgerichtete Verteilung chromosomalen

Materials voraus, wie es auch Tucker et al. (1980) schon nicht beobachten konnten, so

daß diese Autoren eine reine Amitose in Frage stellten.

Bis in die heutige Zeit ist der exakte Mechanismus der Teilung des Makronucleus und

der damit verbundenen Separierung des genetischen Materials nicht genau verstanden.

Tochternuclei werden bei Paramecium bursaria nach dem gleichen Mechanismus abge-

schnürt, wie er von Stevenson und Lloyd (1971a) bei Paramecium aurelia beschrieben

Diskussion 90

wird: Die Durchschnürung der Spindel erfolgt ca. 1 µm unterhalb der terminalen „End-

knöpfe“ („terminal knobs“) in dem Bereich des Stemmkörpers, der keine Dilatation

aufweist, wie es im mittleren Bereich der Spindel der Fall ist. Diese direkte Art der Ab-

schnürung vom Stemmkörper wird ebenfalls bei Heliophrya erhardi (Hanke-Bücker,

1992), Didinium nasutum (Karadzhan und Raikov, 1977) und Paramecium multimicro-

nucleatum (Inaba und Kudo, 1972) beschrieben. Mikrotubuli bleiben nach der Abschnü-

rung noch einige Zeit in den Tochterkernen erhalten und bilden die sogenannte Spindel-

narbe, wie von Stevenson und Lloyd (1971a) beschrieben und von Lewis et al. (1976)

bei P. bursaria vermutet.

Bei Paramecium bursaria sind in dem Bereich der vermuteten Abschnürung Depolyme-

risationserscheinungen der Mikrotubuli zu beobachten. Lokal eng begrenzt ist ein Über-

gang der Mikrotubuli in Filamente zu beobachten, wobei in diesem Bereich auch ein

Desintegrieren der Kernmembran zu beobachten ist.

Dieser hier erstmalig beschriebene Mikrotubuli-Zerfall konnte bei bisherigen Untersu-

chungen an Paramecium bursaria noch nie dokumentiert werden.

Zwar vermuten sowohl Schwartz (1976) als auch Lewis et al. (1976) diese Depolymeri-

sationserscheinungen und nehmen ihre Existenz an, jedoch konnte ein direkter ultra-

struktureller Nachweis bislang nicht erfolgen.

Der vermutete Mechanismus dieser Strukturänderung soll zu einem späteren Zeitpunkt

diskutiert werden (Kapitel 4.3.1).

4.1.3 Tubulin-Isoformen und posttranslationale Modifikationen mikronucleärer Mikrotubuli

Eine Möglichkeit, verschiedene Klassen von Mikrotubuli zu verifizieren, besteht in ih-

rer Einteilung in Isoformen und Isotypen. Da die in der Literatur verwendete Termino-

logie keiner allgemein gültigen Regel folgt, wird in dieser Arbeit das Produkt verschie-

dener Gene als Isoform bezeichnet, wohingegen posttranslationale Vorgänge an Tubuli-

nen zur Entstehung von Isotypen führen.

Neben den 3 bis jetzt bekannten Tubulin-Isoformen, die α-, β-, und γ-Tubulin umfassen

(Oakley und Oakley, 1989), sind seit kurzem auch 2 weitere Mitglieder der Tubulin-

Familie beschrieben worden, das δ- und das ε-Tubulin (Burns, 1995). Gensequenzana-

lysen zeigen zum Teil eine nur 30-40%ige Übereinstimmung zwischen diesen Subfami-

lien (Burns, 1995), so daß ihre Unterschiede bereits auf Ebene der DNA manifestiert

sind.

Diskussion 91

Daneben lassen sich in allen eukaryotischen Zellen aber auch Tubulin-Isotypen nach-

weisen, die sich durch posttranslationale Modifikationen ihrer Isoformen auszeichnen

(Ludueña, 1993).

Die bekanntesten posttranslationalen Modifikationen umfassen die Tyrosinierung / De-

tyrosinierung (Xiang und MacRae, 1995), Phosphorylierung (Eipper, 1972; Piras und

Piras, 1974), Acetylierung (L’Hernault und Rosenbaum, 1983), Glutamylierung (Bo-

binnec et al., 1998) und Polyglycylierung (Bressac et al., 1995; Bré et al., 1998).

Hierbei ist jedoch der Zusammenhang zwischen posttranslationaler Modifikation und

Stabilität der Mikrotubuli bislang wenig verstanden (Greer und Rosenbaum, 1988), es

wird jedoch vermutet, daß erst durch die Änderungen an den Tubulin-Untereinheiten

die Anlagerung Mikrotubuli-Assoziierter-Proteine (MAPs) ermöglicht wird, die das

weitere Schicksal des jeweiligen Mikrotubulus bestimmen (Bulinski und Gundersen,

1991).

Die Frage nach der Ursache der Diversifikation von Mikrotubuli in Einzellern stellt sich

zwangsläufig: In Paramecium-Zellen sind bisher 12 verschiedene Mikrotubuli-Popula-

tionen aufgezeigt worden, die alle unterschiedliche Ausprägungen sowohl hinsichtlich

ihrer Stabilität, der Funktion, als auch der Phase ihres Auftretens besitzen (Cohen und

Beisson, 1988).

Im menschlichen Genom sind mindestens 3 verschiedene α-Tubulin-Gene und 4 ver-

schieden Gene, die für β-Tubulin-Isoformen codieren, nachgewiesen worden (Ludueña,

1993). In Tetrahymena thermophila hingegen sind bislang nur ein α-Tubulin-Gen und 2

β-Tubulin-Gene detektiert worden, die zudem eine Sequenzhomologie von bis zu 95%

zu entsprechenden menschlichen Tubulin-Genen besitzen (Gaertig et al., 1993). Die

extrem unterschiedliche Ausprägung von Mikrotubuli in diesem Ciliaten wird folglich

vorwiegend über posttranslationale Modifikationen erlangt (Adoutte et al., 1991). Der

hohe evolutive Druck, unter dem Mikrotubuli als ein zentraler Bestandteil der Teilungs-

spindel stehen, wird durch die hohe Sequenzhomologie der Tubulin-Gene völlig ver-

schiedener Tierstämme deutlich. Mutationen in diesen Genen könnten für die Entwick-

lung des Organismen fatale Konsequenzen zur Folge haben.

Im Gegensatz zu Tetrahymena zeichnet sich Paramecium tetraurelia durch den Besitz

von 4 α-Tubulin und 3 β-Tubulin-Genen aus, wobei 2 Gene, α-PT1 und α-PT2 für 2

sehr ähnliche Polypeptide codieren, die sich nur durch den carboxyterminalen Besitz

der hier ungewöhnlichen Aminosäuren, Glycin und Alanin, unterscheiden. Durch den

Einsatz von Antikörpern, gerichtet gegen die aus der Gensequenz abgeleiteten letzten

Diskussion 92

zwölf Aminosäuren dieser Tubuline konnte durch Vergleichsmarkierungen mit anderen

Antikörpern darauf geschlossen werden, daß die Mikrotubuli-Diversifikation bei Para-

mecium tetraurelia, wie auch bei anderen Ciliaten, nicht durch die Existenz von Tubu-

lin-Isoformen bedingt ist (Dupuis-Williams et al., 1996).

Grundsätzlich kann vermutet werden, daß Zellen mit nur wenigen Aufgaben, die einen

Einsatz von Mikrotubuli voraussetzen, unter einem weniger starken evolutiven Druck

bezüglich ihrer Tubulin-Gensequenzen stehen, als es bei den Ciliaten der Fall ist, deren

Mikrotubuli-System sich als hoch entwickelt darstellt. Zellen, deren Mikrotubuli gleiche

Funktionen wahrnehmen, wie es bei den Cilien der Fall ist, verfügen auch über die am

stärksten konservierten Gensequenzen (McGrath et al., 1994).

Der Einsatz diverser Antikörper an isolierten Mikronuclei von Paramecium bursaria

zeigt ein Bild der posttranslationalen Modifikationen. Der Einsatz des gegen Hefe-Tu-

bulin gerichteten Antikörpers YOL1/34, der Mikrotubuli sowohl von interphasischen

Kulturzellen, als auch von Teilungsspindeln der Hefe markiert, gewährt einen Einblick

in die Tubulin-Verteilung im Kern. Da dieser Antikörper nicht gegen spezielle

posttranslationale Modifikationen von polymerisierten Mikrotubuli gerichtet ist (Kil-

martin et al., 1982), kann vermutet werden, daß er den Gesamtgehalt an Tubulin im

Kern wiedergibt. Ein ähnliches Markierungsverhalten ist bei Verwendung eines po-

lyklonalen anti-Tubulin Ak vermutet worden. Dieser weist jedoch keinerlei Mikrotubuli

nach und zeigt lediglich eine diffuse Fluoreszenz, die zum Sekundärpol hin abnimmt.

Eine Erklärung könnte in der Maskierung von Epitopen der Mikrotubuli liegen, an die

dieser Antikörper bindet. Eventuell sind diese durch eine Polymerisation von Tubulin

zu Mikrotubuli bei Paramecium bursaria nicht mehr zugänglich.

Das Ausbleiben einer Markierung der Mikrotubuli kann ebenfalls in einer biochemi-

schen Modifikation begründet sein, die ein Erkennen des Epitops durch den polyklona-

len Antikörper unmöglich macht.

Offensichtlich ist der Tubulin-Gehalt, wie er sich bei Einsatz des mAk YOL 1/34 dar-

stellt, auch in interphasischen Kernen am Primärpol erhöht. Unter Berücksichtigung der

Tatsache, daß die räumliche Ausprägung der Mikrotubuli-Polymerisation zu Beginn der

Prophase am Primärpol beginnt, erscheint diese Lokalisation durchaus sinnvoll, da an

diesem Ort bis zu Beginn der Metaphase die höchste Mikrotubuli-Konzentration vor-

liegt. Eine Mt-Erzeugung aus diesem Tubulin-Pool erscheint unter Verzicht auf auf-

wendige Import-/Transportfunktionen durchaus zweckmäßig. Distal des Primärpols

Diskussion 93

gelegene Stellen zeigen nur eine schwache Fluoreszenz, was auf in geringerer Konzen-

tration vorhandenes Tubulin hindeutet.

Auch periphere Mikrotubuli des Kerns lassen sich durch diesen Antikörper darstellen

und zeigen den in der Interphase von Ciliaten typischen Verlauf entlang der Kernmem-

bran (Allen, 1988). Das auch ein fluoreszenzmikroskopischer Nachweis dieser Mikro-

tubuli in der Prophase erfolgen kann, stellt eine Besonderheit von Paramecium bursaria

dar. Die mikronucleären Mt von P. aurelia sind zu diesem Zeitpunkt bereits nicht mehr

nachzuweisen (Stevenson und Lloyd, 1971a).

Die Gründe für diese unterschiedliche Stabilität sind vermutlich in artspezifischen Aus-

prägungen der Zellen zu suchen. Der in seinem Erscheinungsbild zum Mikronucleus

von P. bursaria völlig verschiedene Kern bedarf vermutlich ab der Prophase keiner zu-

sätzlichen Stabilisation seiner Membran mehr. Das Auswachsen der Spindel bei P. au-

relia erfolgt im Gegensatz zu P. bursaria nicht monopolar, so daß evtl. auftretende me-

chanische Spannungen durch die einseitige Polymerisation von Mikrotubuli hier nicht

auftreten.

Bedingt durch das für die Produktion des Antikörpers YOL1/34 eingesetzte Antigen

kann das Markierungsverhalten keinen Aufschluß über die Art evtl. posttranslationaler

Modifikationen geben.

Sowohl ein Einsatz im Western-Blot, als auch Postembedding-Versuche zeigen ein ne-

gatives Ergebnis. Dieses Phänomen läßt sich häufig beobachten und rührt vermutlich

von einer Veränderung des Epitops her, bedingt durch die geänderten Fixierungsbedin-

gungen. Breuker (1997) berichtet ebenfalls von einer fehlenden Markierung im We-

stern-Blot durch den Antikörper YOL1/34, obwohl spezifische immunfluoreszenzmi-

kroskopische Markierungen vorher nachzuweisen waren.

Indem ein gegen β-Tubulin gerichteter Antikörper verwendet wird, können die periphe-

ren Mikrotubuli distinkt dargestellt werden: Der gegen β-Tubulin aus Rinderhirn ge-

richtete Antikörper WA3 markiert spezifisch die parallel zur Kernmembran verlaufen-

den peripheren Mikrotubuli. Hierbei ist auffällig, daß im Gegensatz zu der Gesamtmar-

kierung des Tubulins mit YOL 1/34, offenbar nur jeweils kurze Abschnitte der Mikro-

tubuli eine intensive Fluoreszenz aufweisen. Hingegen kann durch den Einsatz der

ebenfalls gegen β-Tubulin gerichteten Antikörper Nr.11 und 2-28-33 keine Färbung

erzielt werden. Die Ursache hierfür könnte in der Ausprägung verschiedener β-Tubulin-

Isoformen begründet sein, die durch o.g. Ak nicht erkannt werden.

Diskussion 94

Linder et al. (1996) charakterisierte bei Reticulomyxa 2 β-Tubulin-Gene, die in ihren

Gensequenzen um bis zu 53% von denen anderer Organismen abweichen. Western-Blot

Versuche ergaben eine spezifische Markierbarkeit der β1-Isoform mit dem Ak WA3,

wohingegen die β2-Isoform nur eine Reaktion mit dem Antikörper Nr. 11 zeigte (Breu-

ker, 1997). Ähnliche Abberationen sind von Entamoeba histolytica bekannt (Katiyar

und Edlind, 1996). Dies ist um so erstaunlicher, da die Gensequenz von β-Tubulin im

allgemeinen als stark konserviert gilt (Burns, 1991).

Wird die bereits erwähnte Tatsache berücksichtigt, daß P. tetraurelia über 3 β-Tubulin

Gene verfügt (Adoutte et al., 1991), ist es naheliegend, daß ein ähnlicher Sachverhalt

auch bei P. bursaria vorliegt; somit sind die genetischen Voraussetzungen zur Existenz

verschiedener Isoformen des β-Tubulins vorhanden.

Auch posttranslationale Modifikationen des β-Tubulins müssen in Betracht gezogen

werden, jedoch beschränken sich diese vorwiegend auf Phosphorylierungsreaktionen.

Aber auch polyglutamyliertes (Alexander et al., 1991) und polyglyciniertes β-Tubulin

sind bekannt (Xia et al., 2000).

Die heterogene Markierung der peripheren Mikrotubuli im Vergleich zu Markierungen

mit den Ak YOL1/34 oder den gegen acetyliertes Tubulin gerichteten Ak 6-11B1 und

3A5 ist zunächst schwieriger zu interpretieren. Hoffman und Ludueña (1996) weisen in

regenerierenden Axonen eine geänderte Genexpression zweier β-Tubulin Isoformen

nach, die sich in einer langsamen Änderung des β-Tubulin-Gehalts der Mikrotubuli im

Axon niederschlägt. Eventuell wird hierdurch die Dynamik des Axon-Wachstums be-

einflußt.

Eine heterogene Zusammensetzung der Mikrotubuli auf Ebene der posttranslationalen

Modifikationen kann in der Flagelle von Chlamydomonas nachgewiesen werden. Wäh-

rend tyrosiniertes Tubulin sowohl im A- und B-Tubulus des Axonems auftritt, ist das

Vorkommen von detyrosiniertem Tubulin vorwiegend auf den B-Tubulus beschränkt.

Auch die beiden zentralen Mikrotubuli zeigen keine Detyrosinierungen. Der B-Tubulus

besteht somit aus einer heterogenen Population von Tubulin-Dimeren. Die biologische

Bedeutung könnte in einer effektiveren Interaktion von Dynein des A-Tubulus mit dem

B-Tubulus des benachbarten Dupletts zu suchen sein (Johnson, 1998). Eine ebenfalls

heterogene Verteilung von tyrosinierten und detyrosinierten Tubulin kann auch in den

interphasischen Mikrotubuli von Säugerzellen nachgewiesen werden (Geuens et al.,

1986).

Diskussion 95

Neben einem vermuteten Einfluß auf die Dynamik von Mikrotubuli ist auch die Mor-

phologie eines Mikrotubulus über den Gehalt einer bestimmten β-Tubulin Isoform zu

beeinflussen. Durch Expression einer bestimmten β2-Tubulin-Isoform der Motte Heli-

othis virescens in gentechnisch veränderten Drosophila, konnten ansonsten nur für die

Motte spezifische 16-Protofilament-Mikrotubuli nachgewiesen werden (Raff et al.,

1997). Offenbar führt diese Isoform zu einer geänderten Interaktion der für den Zu-

sammenbau von Mikrotubuli verantwortlichen Komponenten.

Wird die Tatsache berücksichtigt, daß periphere Mikrotubuli bei P. bursaria, im Gegen-

satz zu Spindel-Mt, vermutlich während des gesamten Zellzyklus‘ vorhanden sind, kann

eine Modifikation der peripheren Mt mit Sicherheit angenommen werden. Aufgrund der

Markierungsergebnisse des β-Tubulin Antikörpers sind posttranslationale Modifikatio-

nen auch an der β-Untereinheit wahrscheinlich.

Eine der vielen möglichen posttranslationalen Modifikation des α-Tubulins stellt die

Acetylierung dar. Erstmals im flagellaren Tubulin der Grünalge Polytomella aufgezeigt

(McKeithan und Rosenbaum, 1981), erstreckte sich der Nachweis bald auf eine Vielzahl

Flagellen-tragender Organismen (Piperno und Fuller, 1985). Das für die posttranslatio-

nale Modifikation verantwortliche Enzym, eine Acetyltransferase, scheint seine Aktivi-

tät erst während des Transfers in die axonemale Matrix zu erlangen (Greer et al., 1985),

so daß an diesem Ort die höchste Konzentration an acetyliertem Tubulin nachgewiesen

werden kann, jedoch erstreckte sich der Nachweis in nachfolgenden Untersuchungen

auch auf Vertebraten-Zellen (Beltramo et al., 1992; Houliston und Maro, 1989). Koexi-

stent mit dem Auftreten der Acetyltransferase ist die in ihrer Aktivität vorwiegend auf

den Zellkörper beschränkte Deacetylase und ein weiteres Enzym, das einen Inhibitor

der Acetyltransferase darstellt (Maruta et al., 1986).

Acetylierte Mikrotubuli zeigen im allgemeinen eine hohe Resistenz gegen Mikrotubuli-

destabilisierende Agenzien, zudem sind manche von ihnen auch kältetolerant, wie

Schatten et al. (1988) es an Kinetochor-Mt von Maus-Oocyten nachweisen konnten.

Eine Vielzahl von Spindeln enthalten acetylierte Mikrotubuli (Übersicht in MacRae,

1997), hingegen scheinen sie in den Spindeln embryonaler Drosophila-Zellen zu fehlen

(Wolfe et al., 1988).

Die Markierung isolierter Mikronuclei durch die Antikörper 6-11B1 und 3A5 gegen

acetyliertes Tubulin ist sehr spezifisch, wobei sich das Markierungsmuster der beiden

Antikörper nicht unterscheidet. In elektronenmikroskopischen Untersuchungen kann

durch das Postembedding-Verfahren der Nachweis erbracht werden, daß auch die mi-

Diskussion 96

kronucleären Filamente ein Epitop besitzen, welches mit beiden monoklonalen Anti-

körpern spezifisch reagiert. Die hohe Spezifität dieser Antikörper kann durch eine di-

stinkte Markierung der Cilien und Basalkörper bestätigt werden, so wie es auch bei

Chlamydomonas der Fall ist (LeDizet und Piperno, 1986; 1987). Eine Markierung nur

der Cilienspitzen, wie sie bei P. tetraurelia neben einer Acetylierung der postoralen

Fibrillen, des Cytopharynx und der Mt der kontraktilen Vakuole in der indirekten Im-

munfluoreszenz nachgewiesen werden kann (Adoutte et al., 1991; Levilliers et al.,

1995), liegt bei P. bursaria nicht vor. Das gesamte Axonem zeigt sich bei Anwendung

des Postembedding-Verfahrens vollständig markiert, was die Ergebnisse von Adoutte et

al. (1991) vollauf bestätigt.

Doppelmarkierungen mit Antikörpern gegen fixiertes Tubulin (YOL 1/34) und acety-

liertes Tubulin zeigen bei prophasischen Kernen im Bereich des Primärpols weitgehend

das gleiche Markierungsmuster. Distal zum Primärpol ergibt sich vorwiegend eine po-

sitive Reaktion des mAk YOL 1/34. Dies deckt sich mit ultrastrukturellen Untersuchun-

gen, wo zu Beginn der Prophase Filamente und Mt gehäuft in diesem Bereich auftreten,

wohingegen im Bereich des Sekundärpols noch keine typischen Spindelelemente vor-

liegen. Die bei Doppelmarkierungen distal zum Primärpol auftretende YOL-Markierung

– bei fehlender Markierung gegen acetyliertes Tubulin gerichteter Antikörper – zeigt

das Vorhandensein eines Tubulin-Pools auf. Vermutlich liegt Tubulin in diesem Bereich

überwiegend als Dimer vor und nicht in der Form von Filamenten oder Mikrotubuli,

wie es am Primärpol bereits der Fall ist. Während Tubulin in Spindeln nahezu sofort

nach seinem Einbau in Mikrotubuli eine Acetylierung aufweisen kann (MacRae, 1997;

Wilson und Forer, 1989), sind in diesem Tubulin-Dimer Pool bislang keine Acetylie-

rungen feststellbar (Black et al., 1989; Fosket und Morejohn, 1992). L’Hernault und

Rosenbaum (1983) berichten hingegen von α-Tubulin, welches bereits unmittelbar vor

dem Einbau in die Flagelle eine Acetylierung erfährt. Auch in der mikronucleären Spin-

del des Ciliaten Heliophrya erhardi sind acetylierte Mikrotubuli nachgewiesen (Hanke-

Bücker, 1992).

Die Molekulargewichtsbestimmung des durch den mAk 6-11B1 markierten Isotyps er-

gibt eine Masse von ungefähr 53 kDa.

Eine strukturspezifische Eigenart des Tubulins ist es, in der Elektrophorese weniger

weit zu wandern, als es von seinem Molekulargewicht her zu erwarten wäre (Dustin,

1984). Die in dieser Arbeit nachgewiesene Isoform wäre schwerer, als es üblicherweise

für Tubulin der Fall ist, jedoch lassen sich absolut genaue Angaben über das MWG al-

Diskussion 97

lein aufgrund von elektrophoretischen Massenbestimmungen aus o.g. Gründen nicht

machen. Jedoch ist bekannt, daß Tubulin-Isoformen bei Protisten z.T. nicht unerhebli-

che Abweichungen ihres Molekulargewichtes aufzeigen (Breuker, 1997).

Eine weitere, neben der Acetylierung wichtige, posttranslationale Modifikation stellt der

Tyrosinierungs/Detyrosinierungs-Zyklus des C-terminalen α-Tubulin-Endes dar. Durch

die Aktivität der Tubulin-Carboxypeptidase (TCP) werden Mikrotubuli detyrosiniert.

Diese gelten dann im allgemeinen als stabiler und physiologisch älter, als die tyrosi-

nierten Mt (Wehland und Weber, 1987). Im umgekehrten Fall fügt eine Tubulin-Tyro-

sin-Ligase (TTL) in Gegenwart von ATP Tyrosin an den bereits detyrosinierten C–

Terminus an (Chang und Flavin, 1988). Beide Enzyme zeigen eine unterschiedliche

Affinität zu Tubulin bzw. Mikrotubuli. Während Tubulin-Dimere das bevorzugte Sub-

strat der TTL darstellen, beschränkt sich die Aktivität der TCP auf bereits polymeri-

sierte Mikrotubuli (MacRae, 1992).

Geuens et al. (1986) stellten durch den Einsatz immunelektronenmikroskopischer Mar-

kierungsmethoden fest, daß in allen untersuchten Mikrotubuli-Populationen Bereiche

vorliegen, die sowohl Tyrosinierungen als auch Detyrosinierungen aufweisen. Ist der

jeweilige Anteil der Modifikation aber verhältnismäßig gering, kann er wegen der ge-

ringen Auflösung und Empfindlichkeit der immunfluoreszenzmikroskopischen Unter-

suchung nicht mehr dargestellt werden.

Nicht in allen Zellen kann die Aktivität der TCP und somit eine Detyrosinierung der

Mikrotubuli nachgewiesen werden (Alfa und Hyams, 1991; Langdon et al., 1991).

Markierungsversuche mit unterschiedlichen Antikörpern gegen sowohl tyrosiniertes als

auch detyrosiniertes Tubulin zeigen bei P. bursaria keine Markierungen im Mikronu-

cleus, wohingegen Basalkörper und besonders Oralapparate im selben Organismus eine

deutliche Markierung ergeben.

Ähnliche Ergebnisse konnten von Hanke-Bücker (1992) an Heliophrya erhardi erzielt

werden: Eine Markierung der meiotischen Mikronuclei mittels der Ak gegen tyrosi-

nierte/detyrosinierte Mt findet nicht statt, hingegen können zumindest Detyrosinierun-

gen bei den Tentakeln und im Makronucleus nachgewiesen werden. Die Autorin ver-

mutete zum einen eine nur schwache TTL-Aktivität, was das völlige Ausbleiben einer

Tyr-Markierung erklären würde, zum anderen erklärte sie die beschränkte Markierung

durch den Ak gegen detyrosiniertes Tubulin mit einer Maskierung entsprechender Epi-

tope. Eine von Hanke-Bücker weniger favorisierte Erklärung bestand in der Vermutung,

Diskussion 98

daß sich die Aminosäuresequenz am carboxyterminalen Ende der Spindel-Mikrotubuli

von der Sequenz der markierten Tentakel-Mt unterscheidet.

Neuere Untersuchungen von Dupuis-Williams et al. (1996) an Paramecium tetraurelia

lassen tatsächlich eine geänderte Sequenz vermuten. Sequenzanalysen der α-Tubulin-

Gene α1 und α2 zeigen, daß am carboxyterminalen Ende Glycin (α1) bzw. Alanin (α2)

als Aminosäuren zu finden sind, und so kein tyrosiniertes Tubulin nachgewiesen wer-

den kann. Die Autoren vermuten, daß auch die verbliebenen 2 α-Tubulin Gene nicht für

ein terminales Tyrosin codieren. Diese Eigenart des Tubulins scheint sich auf eine Viel-

zahl von Ciliaten zu beziehen und erklärt, warum die Markierung bei Applikation der

gegen tyrosiniertes Tubulin gerichteten Antikörper (TUB1A, 27C2 und YL1/2) aus-

bleibt.

Beide sequenzierten α-Tubulin Gene zeigen am carboxyterminalen Ende an zweiter

Position Glutaminsäure (Glu). Diese könnte durch enzymatische Einwirkung exponiert

und somit durch den Ak 1D5, gerichtet gegen detyrosiniertes Tubulin, markiert werden.

Die nachgewiesene, beschränkte Markierung kann auf den Einbau zweier verschiedener

α-Tubulin-Isoformen hindeuten, von denen nur die in Basalkörpern und Oralapparaten

verwendete eine posttranslationale Modifikation erfährt und somit durch den mAk 1D5

erkannt wird.

Der Einsatz eines mAk, der gegen die GTP-Bindestelle des β-Tubulins gerichtet ist, soll

ausschließlich die Verteilung des Tubulins im Mikronucleus demonstrieren: Ein Tubu-

lin-Heterodimer besitzt eine GTP-Bindestelle auf der α-Untereinheit (UE), an die GTP

nicht austauschbar bindet, und eine im nicht-polymerisierten Zustand für GTP aus-

tauschbare Bindestelle auf den β-UE. Polymerisiert Tubulin zum Mikrotubulus, so kann

GTP auf der β-UE nicht mehr ablösen. Am wachsenden plus-Ende eines Mikrotubulus

kann GTP jedoch hydrolysiert werden. Dies hat eine Konformationsänderung des Tu-

bulins zur Folge, was zu einer veränderten Bindung der Dimere untereinander und zu

einer Depolymerisation des Mikrotubulus führt (Mitchison, 1993).

Der eingesetzte Antikörper anti-Peptid G bindet an die GTP-Bindestelle der β-UE und

verhindert in vivo eine laterale Assoziation des Tubulins, nicht aber eine longitudinale.

Das erkannte Epitop ist somit zwar bei Tubulin-Dimeren und Protofilamenten zugäng-

lich, nicht aber bei polymerisierten Mikrotubuli (Pérez et al., 1997).

Wird dieser oben erwähnte Ak eingesetzt, zeigt sich eine starke Fluoreszenz der Kerne

bei völligem Fehlen einer Mikrotubuli-Markierung. Aufgrund der oben erläuterten Bin-

dungseigenschaften ist eine Mikrotubuli-Markierung nicht zu erwarten. Somit scheint

Diskussion 99

der Ak trotz des vorliegenden Markierungsmusters spezifisch zu binden. Offensichtlich

liegt Tubulin nahezu homogen verteilt im Mikronucleus vor. Geringe Unterschiede in

der Intensität der Markierung variieren von Kern zu Kern und beruhen wahrscheinlich

auf fixierungsbedingten Faktoren. Vermutlich ist partiell freies Tubulin im Verlauf der

Fixierungsprozedur ausgewaschen worden, obwohl in einigen Fällen neben Formalde-

hyd auch 0,5% Glutardialdehyd, ein die Proteine quervernetzendes Agenz, in der Fi-

xierlösung enthalten war. Somit konnte ein derartiger Verlust des Tubulins auf ein Min-

destmaß beschränkt werden. Glutardialdehyd unterbindet wirkungsvoller als Formalde-

hyd die Mobilität von Proteinen (Jost et al., 1984).

Zusammenfassend ist die Verteilung der Tubulin-Isoformen folgendermaßen zu be-

schreiben: In der Prophase vom Primärpol auswachsende Filamente und Mikrotubuli

weisen eine Acetylierung auf, lassen sich aber auch mit einem gegen fixiertes Tubulin

gerichteten Antikörper darstellen.

Periphere Mt können spezifisch mit einem anti-β-Tubulin Antikörper markiert werden

und sind immunologisch verschieden zu den in der Prophase auftretenden Mt. Zusätz-

lich ist auch eine Acetylierung dieser Mt vorhanden.

Acetylierungen lassen sich auch immunelektronenmikroskopisch an den Filamenten

nachweisen, was ihren Aufbau aus Tubulin auf immunologischer Ebene nahelegt.

Doppelmarkierungen des Mikronucleus‘ mit Antikörpern, gerichtet gegen acetyliertes-

und Gesamt-α-Tubulin (YOL 1/34) zeigen, daß freies Tubulin nicht acetyliert vorliegt.

Die im Kern von Paramecium bursaria enthaltenen Mikrotubuli, bzw. Filamente und

Tubulin, lassen sich durch Verwendung der zur Verfügung stehenden Antikörper gegen

tyrosiniertes/detyrosiniertes Tubulin nicht markieren. Werden Gensequenzanalysen des

Tubulins bei P. tetraurelia berücksichtigt (Dupuis-Williams et al., 1996), kann nahezu

ausgeschlossen werden, daß diese Isoformen im Kern überhaupt existieren.

Der Ak anti-Peptid G zeigt augrund seiner Markierungseigenschaften einen hohen Ge-

halt an freiem Tubulin im interphasischen Kern an. Im Gegensatz zu YOL 1/34 markiert

dieser Ak keine Mt.

4.2 Mikrotubuli-assoziierte Proteine im Mikronucleus

4.2.1 Funktion des γγγγ-Tubulins am Primärpol

Mikrotubuli sind polare Strukturen, die ein plus- und ein minus-Ende besitzen. Während

das plus-Ende durch den Einbau von Tubulin zum Wachstum befähigt ist, findet am

Diskussion 100

minus-Ende bevorzugt ein Abbau von Tubulin und somit ein Schrumpfen des Mikrotu-

bulus statt. Um das minus-Ende vor Abbau zu schützen, steht dieses in enger Assozia-

tion mit Mikrotubuli-organisierenden Zentren (MTOCs). Die morphologische Erschei-

nungsweise der MTOCs differiert stark, bei tierischen Teilungsspindeln handelt es sich

in der Regel um Centriolen mit dem sie umgebenden pericentriolären Material (PCM)

(Übersicht in Koonce, 1996). Centriolen und PCM werden als Centrosom bezeichnet.

Ciliaten zeichnen sich durch eine Vielzahl von MTOCs wie Basalkörper oder der

Kernmembran aus (Keryer et al., 1990). Die Entdeckung von γ-Tubulin als permanenter

Bestandteil von MTOCs führte zu einem neuen Verständnis dieser Strukturen (Liang et

al., 1996). Diesem Protein wird eine wichtige Rolle sowohl bei der Nucleation der Mi-

krotubuli am MTOC, als auch bei der Determination der Protofilamentanzahl und der

räumlichen Ausrichtung von Mikrotubuli zugeschrieben (Joshi, 1993; Martin et al.,

1997). Auch bei der Duplikation von Basalkörpern im Rahmen der Zellteilung von Pa-

ramecium besitzt γ-Tubulin eine wichtige Funktion (Ruiz et al., 1999). Aus Xenopus-

Oocyten oder Drosophila-Centrosomen aufgereinigtes γ-Tubulin besitzt eine Ring-

struktur, die vermutlich als Matrize bei der Polymerisation von Tubulin dient und als γ-

TuRC (tubulin ring complex) bezeichnet wird (Zheng et al., 1995). Mindestens 6 Pro-

teine sind neben γ-Tubulin Bestandteil der aufgereinigten γ-TuRCs (Martin et al., 1998).

In neuerer Zeit bei dem Ciliaten Euplotes durchgeführte Markierungen von γ-Tubulin

zeigen das Vorkommen dieses Proteins in Basalkörpern, dem Mikro- und auch dem

Makronucleus (Curtenaz et al., 1997; Liang et al.,1996).

In eigenen Untersuchungen konnte, übereinstimmend mit o.g. Autoren, γ-Tubulin so-

wohl in den Basalkörpern, als auch im Mikronucleus nachgewiesen werden.

Alle untersuchten Makronuclei hingegen weisen eine fehlende Markierung auf, wobei

diese Kerne, soweit es eine lichtmikroskopische Deutung zuläßt, in keinem Fall Tei-

lungsaktivität zeigen. Mit großer Wahrscheinlichkeit also ist γ-Tubulin im Makronu-

cleus, zumindest in der teilungsinaktiven Phase, nicht präsent. Dies kann in der fehlen-

den Teilungsspindel begründet sein; die vermutlich amitotische Teilung des Makronu-

cleus bedarf keiner hochgeordneten räumlichen Struktur der Spindel, wie es im Mikro-

nucleus der Fall ist. Es ist zu vermuten, daß γ-Tubulin nur bei komplexen, räumlichen

Ausbildungen der Mikrotubuli eine tragende Rolle spielt, wie es neben dem generativen

Kern auch in den Basalkörpern zu dokumentieren ist.

Die Markierung der Basalkörper stimmt mit Ergebnissen von Liang et al. (1996), ge-

wonnen an Euplotes, Tetrahymena und P. tetraurelia, überein. Dies widerspricht den

Diskussion 101

Untersuchungen von Stearns und Kirschner (1994), die bei T. thermophila keine Mar-

kierung der Basalkörper nachweisen konnten und eine Rekrutierung von cytoplasmati-

schem γ-Tubulin durch diese Organellen vermuteten, bevor eine Nucleation von Mi-

krotubuli erfolgen kann.

Der Nachweis von γ-Tubulin im Mikronucleus von P. bursaria ist aufgrund der be-

kannten MTOC-Funktion der Kernmembran wenig überraschend. Wie bei Euplotes,

kann auch in P. bursaria das Auftreten heller Punkte intensiverer Fluoreszenz gezeigt

werden, die auch in der Prophase noch nachzuweisen sind. Offensichtlich ist die erhöhte

Konzentration von γ-Tubulin in einzelnen Bereichen des Kerns von Wichtigkeit für die

Mt-Nucleation.

Während bei Euplotes (Liang, 1996) das γ-Tubulin eine gleichmäßige Verteilung im

Kern aufweist, unterbrochen von den Stellen erhöhter Fluoreszenz (s.o.), beschränkt

sich die Lokalisation bei Paramecium bursaria auf den Bereich des Primärpols. Diese

Art der γ-Tubulin-Verteilung ist ebenfalls bei den Teilungsspindeln höherer Organismen

zu finden, die Centriolen besitzen (Moudjou et al., 1996). Hier geht die γ-Tubulin-

Verteilung mit der sich im Verlauf der Mitose entwickelnden Spindel einher. Diese Be-

obachtung kann durch elektronenmikroskopische Untersuchungen an Teilungsspindeln

von Drosophila und Xenopus bestätigt werden (Lajoie-Mazenc et al., 1994) und ver-

deutlicht die wichtige Funktion dieses Proteins. Über die genaue Rolle dieses Proteins

an dieser Stelle der Spindel kann nur spekuliert werden, vermutlich aber wird, wie es

bei MTOCs der Fall ist, eine Nucleation der Mt unterstützt.

Die Beschränkung der γ-Tubulin Markierung auf den Primärpol zeigt deutlich, daß auch

in Interphasen die MTOC-Funktion des Primärpols stets erhalten bleibt. Die höhere

Tubulin-Konzentration im interphasischen Primärpol-Bereich könnte auf den Einfluß

des ebenfalls dort lokalisierten γ-Tubulins zurückzuführen sein.

Die Verteilung von Proteinen, die neben γ-Tubulin in Assoziation mit dem MTOC ste-

hen, kann mittels des mAk CTR 210 gezeigt werden. Ursprünglich gegen isolierte

menschliche Centrosomen gerichtet (Bornens et al., 1987), markiert dieser Antikörper

bei P. tetraurelia auch das „filamentöse Reticulum“ (Schneider, 1964) direkt unterhalb

der Basalkörper von Cilien und des Oralapparates (Kaczanowska et al., 1996; Keryer et

al., 1990).

Eigene Versuche zeigen eine Kolokalisation von γ-Tubulin und CTR 210-Antigen im

Mikronucleus von P. bursaria. Offensichtlich ist dieses Protein ein für die Nucleation

von Mikrotubuli ebenso wichtiger Bestandteil des Primärpols, wie es das γ-Tubulin ist.

Diskussion 102

Die Bestandteile des Centrosoms scheinen stark konservativ zu sein, was dadurch deut-

lich wird, daß die oben erwähnten Proteine γ-Tubulin und CTR 210-Antigen, in den

MTOCs einer Vielzahl von Zellen, von Dinoflagellaten bis zu menschlichen Zellen,

auftreten (Perret et al., 1995). Untersuchungen deuten eine eventuelle Verwandtschaft

des CTR 210-Antigens mit einem 72 kDa Protein aus dem Dinoflagellaten Cryphtheco-

dinium cohnii an. Dieses gehört zu den HSP (heat shock protein) 70-Proteinen und ist

als Chaperon verantwortlich für Faltung, Transport und Auf-/Abbau von Polypeptid-

Komplexen (Perret et al., 1995). Die in SDS-Page detektierte Masse des Proteins bei P.

bursaria liegt hingegen bei 80 kDa und deckt sich mit der von Keryer et al. (1990) be-

stimmten Masse.

4.2.2 Funktion des Dyneins am Primärpol

Die Beteiligung von cytoplasmatischem Dynein an der Chromosomenbewegung ist

vielfach nachgewiesen worden, wobei Dynein vorwiegend als ein zum minus-Ende der

Mikrotubuli gerichtetes Motorprotein u.a. an den Kinetochoren lokalisiert ist (Alexan-

der und Rieder, 1991; Hyman und Mitchison, 1991; Inoué und Salmon, 1995). Neuere

Untersuchungen weisen auch auf eine Beteiligung von Dynein (Heald et al., 1996) oder

eines Dynein/Dynactin/NuMA-Komplexes (NuMA = nuclear mitotic apparatus pro-

tein) an der Spindelformation hin (Gaglio et al.,1996; Gaglio et al., 1997).

Zwei Mechanismen sind vermutlich an der Spindelausbildung beteiligt: Zum einen

kommt es durch die Aktivität eines zum Mikrotubuli plus-Ende gerichteten Motors,

vermutlich der bimC Kinesin-Familie zugehörig, zu einem Gleiten antiparalleler Mt-

Populationen. Dies führt zu einer axialen Ausrichtung der Spindel. Zum anderen kommt

es zu einer Bündelung und Parallelisierung der Mt am jeweiligen Pol, woran eine Be-

teiligung des zum minus-Ende gerichteten cytoplasmatischen Dyneins nachgewiesen

werden kann (Merdes und Cleveland, 1997; Steuer et al., 1990).

Ein Komplex aus NuMA, Dynein und Dynactin scheint ein Bindeglied zwischen Cen-

trosom und Mikrotubuli darzustellen. In mitotischen Spindeln von Säugerzellen ist

durch elektronenmikroskopische Untersuchungen belegt, daß eine Vielzahl von Mikro-

tubuli nicht direkt an Centrosomen enden, sondern in einer Distanz von ca. 1 µm blei-

ben. Vermutlich wird durch Dynein das Protein NuMA entlang der Mikrotubuli zum

minus-Ende transportiert, um dort eine Verbindung zwischen Spindel-Mikrotubuli und

Centrosom herzustellen. Dynactin („dynein activator“) (Gill et al., 1991) dient hierbei

der Stimulation des Dynein-vermittelten Transportes (Zeng, 2000). Die Injektion von

sowohl anti-Dynein Ak (Heald et al., 1997) als auch von anti-NuMA Ak (Gaglio et al.,

Diskussion 103

1995) führt zu einem Loslösen des Centrosoms von der Teilungsspindel. Obwohl in

Centrosomen-Spindeln nachgewiesen, sind diese Ergebnisse auf die meisten anderen

Spindeltypen, so z.B. auch Centriolen-lose und geschlossene Mitosen, übertragbar

(Merdes und Cleveland, 1997).

Der immunfluoreszenzmikroskopische Nachweis von Dynein im Mikronucleus von P.

bursaria kann durch Western-Blots mit einem polyklonalen anti-Dynein Ak bestätigt

werden. Die aus Kernisolaten stammenden Banden von 156 und 137 kDa entsprechen

den mittelschweren Ketten (IC = intermediate chains) des cytoplasmatischen Dyneins,

die Banden im Bereich von 57 und 52 kDa entsprechen den leichten ICs (LIC = light

IC).

Eine evtl. bei der Isolation der Kerne aufgetretene Verunreinigung durch ciliäres Dy-

nein kann weitgehend ausgeschlossen werden, da isoliertes Dynein aus Cilien ein cha-

rakteristisch anderes Markierungsmuster zeigt: Banden im Bereich von 115 und 103

kDa entsprechen ICs, wohingegen die Bande von 17 kDa eine der für ciliäres Dynein

charakteristischen leichten Ketten (LC = light chains) repräsentiert (Holzbaur und Val-

lee, 1994; Kimberly et al., 1995; King et al., 1995; Mitchell, 1994). Durch den einge-

setzten polyklonalen Antikörper können allerdings nicht alle Dynein-Komponenten

nachgewiesen werden.

Das Auftreten von Dynein am Primärpol der Mikronuclei läßt die Vermutung nach ei-

ner der oben genannten Funktionen aufkommen. Eine direkte Insertion von Mikrotubuli

an die Kernmembran kann auch in elektronenmikroskopischen Schnitten nicht eindeutig

beobachtet werden, so daß evtl. eine den NuMA-Komplex unterstützende Funktion vor-

liegt. Bemerkenswert erscheint die Tatsache, daß Dynein auch in der Interphase im Mi-

kronucleus vorzufinden ist. Zeng (2000) berichtet von einer interphasischen NuMA-

Lokalisation in Xenopus Kernen, so daß ein begleitendes Vorkommen von Dynein auch

bei P. bursaria nicht abwegig erscheint. Die Beschränkung auf den Primärpol geht ein-

her mit der oben beschriebenen Verteilung von γ-Tubulin und des durch den mAk CTR

210 erkannten Proteins.

In Ermangelung geeigneter anti-NuMA Ak kann ein Nachweis dieses im Mikronucleus

vermuteten Proteins nicht erfolgen.

4.2.3 Funktion des Centrins im Mikronucleus

Centrin ist als ein centrosomaler Bestandteil bekannt, der in allen eukaryotischen Lebe-

wesen aufzufinden ist (Salisbury, 1995). Als ein Calcium-bindendes Protein der EF-

Diskussion 104

Hand Superfamilie besitzt es 45-48% Aminosäuresequenz(AS)-Homologie zu Calmo-

dulin (Huang et al., 1988), einem anderen weit verbreitetem Ca2+-bindenden Protein.

Obwohl sich Centrin in der Regel als ein hochkonservatives Protein darstellt, besitzt die

aus der DNA-Sequenz von Paramecium tetraurelia abgeleitete Aminosäuresequenz des

Centrins nur ca. 50% Übereinstimmung mit der anderer Organismen. Diese Untersu-

chungen erfolgten jedoch nur an einem der drei bei diesem Organismus nachgewiesenen

Centrin-Gene (Madeddu et al., 1996).

Aus P. bursaria isolierte Mikronuclei weisen eine intensive Markierung ihres Karyo-

plasmas auf. Die unterschiedliche Intensität der Markierung korreliert nicht mit den

mitotischen Phasen der Zellen, so daß hierin vermutlich eher fixierungsbedingte Unzu-

länglichkeiten zu sehen sind.

In Western-Blot Analysen kann durch den Einsatz des anti-Centrin Ak ein 20 kDa Pro-

tein nachgewiesen werden. Dieses Molekulargewicht deckt sich mit Untersuchungen

von Paoletti et al., (1996) an aus HeLa-Zellen isoliertem Centrin.

Lingle und Salisbury (1997) dokumentieren Centrin in den mitotischen Spindeln des

Flagellaten Holomastigotoides spp.. Durch den Einsatz von anti-Centrin Ak ist es mög-

lich, neben dem Lumen der Centriolen auch das pericentrioläre Material von Centroso-

men in der Mitose von Säugerzellen zu markieren (Paoletti et al., 1996).

Über die Funktion von Centrin ist bislang wenig bekannt, aufgrund seiner Lokalisation

wird diesem Protein aber sowohl eine Funktion in der Ausrichtung der Basalkörper

während der Stomatogenese bei Ciliaten zugebilligt (Allen et al., 1998), als auch eine

Beteiligung bei der Separierung der Tochtercentriolen in der Mitose von Säugerzellen.

Bei S. cerevisiae, wo Centrin das Produkt des Gens CDC 31 ist (CDC = cell division

cycle), kann eine direkte Beteiligung an der Duplikation der Spindelpolkörper nachge-

wiesen werden (Baum et al., 1986).

Centrin wird oftmals als ein fibrilläres Protein beschrieben, neuere Untersuchungen

zeigen jedoch, daß eher eine Assoziation mit bislang noch unbekannten, fibrillären Pro-

teinen vorliegt (Hayashi et al., 1998).

Über die Funktion von Centrin in den Mikronuclei von P. bursaria kann nur spekuliert

werden, evtl. ist in diesem Protein eine kontraktile, Calcium-abhängige Komponente zu

sehen, die der Separierung der Halbspindeln in der Anaphase sekundiert. Wolf (1995)

berichtet von Membranstapeln, die mit der Spindel assoziiert vermutlich Calcium aus-

schütten, und so eine Kontrollfunktion bei der Kernteilung ausüben (s. S. 77). Im Kern

vorhandenes Centrin könnte eine der rezipierenden Komponenten dieses Signals sein.

Diskussion 105

Der Nachweis von Centrin beschränkte sich bislang auf das Vorkommen in mitotischen

Spindeln (Lingle und Salisbury, 1997). Die Dokumentation von Centrin in interphasi-

schen Kernen von P. bursaria ist vermutlich mit dem Persistieren der Kernmembran in

der Mitose zu erklären, offensichtlich ist ein Import des Proteins zu Beginn der Mitose

für die Zelle nicht sinnvoll, so daß es im Kern während der Interphase gespeichert wird.

4.2.4 Verschiebung des Mikrotubuli-Mikrofilament –Gehaltes durch Einsatz von stabilisierenden/destabilisierenden Agenzien

Das Reaktionsgleichgewicht zwischen freiem Tubulin und Mikrotubuli wird durch eine

Vielzahl von Faktoren beeinflußt. Neben Kälte (Mizuta et al., 1995) und Calcium-Ionen

(O’Brien et al., 1997) besitzen viele pflanzliche Wirkstoffe eine depolymerisierende

Wirkung auf Mikrotubuli, indem sie mit freien Tubulin-Heterodimeren oder Mikrotu-

buli interagieren. Als gebräuchliche anti-Mikrotubuli-Substanzen finden unter anderem

Nocodazol, Vinblastin oder Colchicin Verwendung (Hamel, 1996; Wilson und Jordan,

1995).

Das Polymerisationsgleichgewicht des Tubulins zu Gunsten der Mikrotubuli kann auch

durch spezifische, stabilisierende Agenzien beeinflußt werden. Neben Taxol, welches

sowohl die kritische Tubulin-Konzentration zur Bildung von Mikrotubuli erniedrigt als

auch bereits fertig polymerisierte Mikrotubuli stabilisiert und so einer Depolymerisation

entgegenwirkt (De Brabander et al., 1982; Caplow et al., 1994), ist auch D2O (Deuteri-

umoxid oder schweres Wasser) ein geeigneter Kandidat, um diese Effekte zu erzielen

(Itoh und Sato, 1984; Chakrabarti et al., 1999).

Die genaue Funktion der Filamente im Kern soll durch Mt-beeinflussende Drogen un-

tersucht werden. Dienen diese Strukturen ausschließlich dem Auf- und Abbau von Mi-

krotubuli, wie es ultrastrukturelle Untersuchungen zeigen, oder besitzen sie weiterge-

hende Funktionen, wie z.B. eine Stabilisierung der Kernmembran?

4.2.4.1 Die Mikrotubuli-destabilisierenden Agenzien Nocodazol und Colchicin Wird Nocodazol an tierischen Zellen in der mitotischen Anaphase appliziert, führt es zu

einem schnellen Abbau der Spindel-Mikrotubuli (De Brabander et al., 1986) und die

Trennung der Chromosomen wird unterbunden (Fishkind et al., 1996).

Nishihara et al. (1999) konnten durch die Applikation von Nocodazol in hohen Kon-

zentrationen das Erliegen der cytoplasmatischen Strömung und den Abbau cytoplasma-

tischer Mikrotubuli bei Paramecium bursaria nachweisen, wohingegen die Beeinflus-

sung der mikronucleären Mt keine Erwähnung findet.

Diskussion 106

Die hier eingesetzten Nocodazol-Konzentrationen besitzen unterschiedliche Wirkungen

auf die Zellen. Neben desorientierten können auch normal ausgerichtete Mt dokumen-

tiert werden. Auch erscheint der Gehalt an Mikrotubuli im Kern insgesamt geringer.

Diese unterschiedliche Wirkungsweise kann auch in der unterschiedlichen intrazellulä-

ren Konzentration des Wirkstoffes begründet sein, der vermutlich nicht in allen Fällen

gleich gut die Pellicula permeiert.

Der oftmals zu beobachtende hohe Filamentanteil im Mikronucleus spricht für einen

Zerfall von Mikrotubuli zu Filamenten, ohne daß durch Nocodazol bedingt, eine erneute

Polymerisation zu Mikrotubuli stattfindet. Daß ein Abbau von Mikrotubuli zu Filamen-

ten tatsächlich erfolgen kann, ergaben ultrastrukturelle Untersuchungen des telophasi-

schen Stemmkörpers.

Immunfluoreszenzmikroskopische Untersuchungen isolierter und mit Nocodazol be-

handelter Kerne zeigen in einigen Fällen eine diffuse Markierung mit dem gegen fi-

xiertes Tubulin gerichteten Ak YOL1/34. Hier liegt offensichtlich ein völliger Zerfall

der Mikrotubuli nicht nur in Filamente, sondern darüber hinaus zu freiem Tubulin, vor.

Ende des vorigen Jahrhunderts wurde erstmals die antimitotische Wirkung des Alka-

loids Colchicin bemerkt (Übersicht bei Hamel, 1996). In der heutigen Zeit sind Ana-

loga gebräuchlich, die die gleiche Funktion besitzen – bei zum Teil erheblich gestei-

gerter Wirksamkeit (Engelborghs, 1998).

Frühe Versuche von Halberstaedter und Back (1943) an P. caudatum hatten zum Er-

gebnis, daß 0,000125% Colchicin sogar die Teilungsaktivität stimuliert, 0,0005% hin-

gegen innerhalb von 24 h zum Tode führen. P. bursaria hingegen toleriert Lösungen bis

0,05% Colchicin ohne erkennbaren Einfluß auf die Kernteilung konjugierender Paare,

erst eine Konzentration von 0,4% hemmt die Kernteilung wirksam (Egelhaaf, 1955).

Eigene Untersuchungen zeigen bei Colchicin-Einsatz eine dem Nocodazol ähnliche

Wirkung: Sowohl eine Steigerung der Filamentanzahl, als auch eine desorientierte Aus-

richtung von Mikrotubuli kann beobachtet werden. Da Colchicin und Nocodazol die

gleiche Bindestelle am Tubulin-Heterodimer besitzen, entspricht dieses Ergebnis den

Erwartungen.

Im Unterschied zu Nocodazol sind bei Einsatz von Colchicin Auffaltungen der Kern-

membran zu dokumentieren. Aszalos et al. (1985) und Remy-Kristensen et al. (2000)

berichten von einer Erhöhung der Membranfluidität durch den Einsatz verschiedener,

Mikrotubuli-destabilisierender Agenzien. Die Autoren vermuten, daß eine Störung der

Diskussion 107

Interaktion von Mikrotubuli und Plasmamembran zu einer indirekten Wirkung dieser

Noxen auf die Membran führt. Dies kann auf die peripheren Mt des Mikronucleus über-

tragen werden, die dann durch den Einsatz destabilisierender Drogen eine Wech-

selwirkung mit der Kernmembran nicht mehr eingehen können.

Die o.g. Autoren berichten von einer gleichfalls gesteigerten Membranfluidität durch

den Einsatz von Nocodazol. Dem vermuteten Wirkmechanismus bei P. bursaria fol-

gend, müßte auch in diesem Fall eine Auffaltung der Kernmembran zu dokumentieren

sein. Das Fehlen einer solchen Beobachtung kann evtl. in einer bislang nicht bekannten

Wechselwirkung des Nocodazol-Lösemittels DMSO zu suchen sein. Kontrolleinbettun-

gen von Zellen, die ausschließlich in entsprechenden DMSO-Konzentrationen inkubiert

wurden, zeigten keinerlei Veränderungen der Kernmembran. Eine unbekannte Wech-

selwirkung des DMSO mit Nocodazol, die Auswirkungen auf die Kernmembran hat,

kann nicht ausgeschlossen werden.

Das auffällige, geclusterte Auftreten von Mikrotubuli unter Colchicin-Einwirkung kann

in einer Colchicin-induzierten Interaktion von MAPs begründet sein. Das die Mt umge-

bende, ungewöhnlich elektronendichte Material, könnte diese Proteine durchaus ent-

halten.

Durch die in den Kernen vorliegende, erhöhte Filamentkonzentration kommt es augen-

scheinlich unter Einfluß der Mt-destabilisierenden Agenzien zu einer Störung der Mt-

Polymerisation. Da sich diese, wie in Untersuchungen an metaphasischen Zellen zu

belegen ist, auch aus Filamenten generieren, könnte eine laterale Aneinanderlagerung

von Filamenten die dokumentierten wechselnden Filamentdurchmesser erklären. Bei

der Depolymerisation von Flagellen-Mt sind ähnliche Filamente zu beobachten, die

vermutlich durch laterale Aneinanderlagerung von 2 Protofilamenten entstehen (Unger

et al., 1990).

Durch den Einsatz der Mikrotubuli-destabilisierenden Agenzien Nocodazol und Colchi-

cin kann eine deutliche Verschiebung des Mt/Filament-Gehaltes zu Gunsten der Fila-

mente erzeugt werden, was tatsächlich dafür spricht, daß die im Kern beobachteten Fi-

lamente eine Speicherform des Tubulins darstellen.

4.2.4.2 Die Mikrotubuli-stabilisierenden Agenzien Taxol und D2O Die Mikrotubuli-stabilisierende Wirkung von Taxol wurde in den späten sechziger Jah-

ren bei einer umfassenden Untersuchung pflanzlicher Stoffe auf ihre krebshemmende

Wirkung hin entdeckt (Nicolaou et al., 1994).

Diskussion 108

Die Bindestelle für Taxol unterscheidet sich von den Bindungsstellen anderer Antimi-

krotubuli-Wirkstoffe (Kumar, 1981) und MAPs (Valle und Collins, 1986). Es gibt je-

doch Hinweise dafür, daß eine gewisse räumliche Überschneidung zwischen der Taxol-

Bindestelle und der Colchicin-Bindestelle vorliegt. Neben der Stabilisierung vorhande-

ner Mikrotubuli ist Taxol auch in der Lage, die kritische Tubulin-Konzentration abzu-

senken und somit eine erhöhte Polymerisationsrate zu bewirken (Howard und Timas-

heff, 1988). Die kritische Tubulin-Konzentration kann durch Taxol-Applikation soweit

abgesenkt werden, daß sogar freie Mt in der Zelle polymerisieren können, ohne daß

Centrosomen oder andere MTOCs beteiligt sind (De Brabander et al., 1981; 1982).

Eine oftmals bei Taxol-behandelten Zellen beobachtete Besonderheit ist der fehlende

Ordnungsgrad zusätzlich polymerisierter Mt. Bedingt durch die Polymerisationsförde-

rung des Diterpens wird die geordnete Mikrotubulibildung an einem MTOC außer Kraft

gesetzt (Zabolitzky et al., 1997). Diese Beobachtung kann in den Kernen von P. bursa-

ria nicht erfolgen: Offenbar besitzt der Primärpol eine so wirkungsvolle MTOC-Funk-

tion, daß sie nicht durch Taxol beeinträchtigt werden kann.

Oftmals im Kern dokumentierte Mt-Durchmesser von 22 nm sind ein bekanntes Phä-

nomen von unter Taxoleinfluß polymerisierten Mikrotubuli. Der kleinere Durchmesser

ist auf einen – durch elektronenmikroskopische Untersuchungen bestätigten – Aufbau

der Mikrotubuli aus nur 12 Protofilamenten zurückzuführen (Andreu et al., 1992).

Neuere Untersuchungen belegen durch die Bindung von Taxol an die β-Untereinheit

eines Heterodimers tatsächlich eine veränderte laterale Interaktion der Protofilamente,

so daß die strukturellen Voraussetzungen zur Bildung von Mikrotubuli kleineren

Durchmessers belegt werden können (Nogales et al., 1995).

Die Steigerung der Mt-Polymerisation durch Taxol kann in den Mikronuclei behandel-

ter Zellen bestätigt werden. In fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen können Mt prä-

gnanter dargestellt werden, was vermutlich auf ihre erhöhte Anzahl zurückzuführen ist.

Die gestiegene Mikrotubuli-Anzahl wird begleitet von einer Abnahme der mikronucleä-

ren Filamentanzahl, wie in ultrastrukturellen Untersuchungen gezeigt werden konnte.

Ebenso wie Taxol, vermag auch Deuteriumoxid (D2O), die Polymerisation von Mi-

krotubuli zu fördern (Houston et al., 1974). Untersuchungen an befruchteten Seeigel-

Eizellen zeigen, daß der Fortgang mitotischer Teilungen abhängig von der angewandten

D2O-Konzentration ist. Verzögertes Abschließen der Kernteilung bis hin zu einer Arre-

tierung sind durch Applikation dieser Substanz möglich (Takahashi und Sato, 1982).

Diskussion 109

Die von Hauser und Beinbrech (1973) durchgeführten Inkubationen von Paramecium

bursaria in 70% D2O führten sowohl zu einer massiven Induktion von Filamenten, als

auch zu extremen Streckungen der Mikronuclei.

Diese Ergebnisse können nur in Bezug auf das gehäufte Auftreten mikronucleärer Fila-

mente bestätigt werden, wohingegen ungewöhnliche Streckungsphänomene in keinem

Fall dokumentiert werden können. Das unerwartete Ausbleiben dieser Reaktion ist ver-

mutlich auf das individuelle Verhalten des damaligen, von den Autoren eingesetzten

Klons B1 von P. bursaria zurückzuführen, wohingegen eigene Untersuchungen an einer

Wildkultur durchgeführt wurden.

Die biologische Wirkung von D2O wird im allgemeinen mit der von Taxol gleichge-

setzt. Beide Wirkstoffe arretieren die Mitose und induzieren eine erhöhte Polymerisa-

tion von Mikrotubuli bei einer Vielzahl von Organismen. Um so erstaunlicher ist die

Tatsache, daß bei D2O-inkubierten P. bursaria eine erhöhte Anzahl an Filamenten im

Kern nachzuweisen ist. Diese Auswirkungen sind bei Taxol-Inkubationen nicht zu beo-

bachten.

Jedoch zeigen Untersuchungen Unterschiede im jeweiligen Wirkmechanismus auf.

Während Taxol fest an die β-Untereinheit des Tubulin-Heterodimers bindet (Nogales et

al., 1995), ist eine direkte, feste Bindung von D2O an Tubulin bzw. Mikrotubuli bislang

nicht bekannt. Vielmehr wird vermutet, daß die durch D2O verursachte Polymerisation

von Mikrotubuli durch Intensivieren der inter- und/oder intramolekularen, hydrophoben

Wechselwirkungen der Tubulin-Moleküle untereinander induziert wird (Panda et al.,

2000; Itoh und Sato, 1984).

Der augenfällige Unterschied der Taxol- und D2O-Wirkung bei Paramecium bursaria

könnte in dieser unterschiedlichen Wirkungsweise begründet sein. Die biochemische

Ausstattung der Tubulin-Moleküle von P. bursaria mit z.T. an sie bindende MAPs bie-

tet vermutlich die strukturelle Voraussetzung zur vorwiegenden Bildung von Filamen-

ten. Diese präferentielle Bildung ist abhängig von der jeweiligen Phase des Zellzyklus’,

in dem sich die Zelle befindet, z.B. kann durch zelleigene Mechanismen zu Beginn der

Prophase eine vermehrte Mt-Polymerisation aus Filamenten induziert werden. Offen-

sichtlich erstreckt sich die Wirkung von hydrophoben Interaktionen zwischen Tubulin-

Molekülen durch D2O-Gabe nur auf die Bildung von Filamenten, ohne daß eine weiter-

führende, geordnete Polymerisation zu Mikrotubuli erlangt werden kann.

Die Bindung von Taxol an Mikrotubuli ist wesentlich fester als an freie Heterodimere

(Nicolaou et al., 1994). Durch die Bindung an Mt bewirkt Taxol vermutlich eine Kon-

Diskussion 110

formationsänderung des Tubulins im Mikrotubulus, was – wie bereits erwähnt – eine

variierende laterale Interaktion der Protofilamente zur Folge hat. Dies wiederum scheint

eine verbesserte Bindung der Tubulin-Heterodimere an den bestehenden Mikrotubulus

zu bewirken (Derry et al., 1995), was die beschriebenen, polymerisationsfördernden

Eigenschaften des Taxols zur Folge hat.

Die hauptsächliche Wirkungsweise von Taxol liegt somit auf einer anderen Ebene als

die durch D2O induzierten morphologischen Veränderungen. Beiden Substanzen ge-

mein ist ein Einfluß auf das Gleichgewicht von Mikrotubuli und Filamenten im Mikro-

nucleus zugunsten polymerisierten Tubulins.

Der Filamentgehalt kann durch Mt-stabilisierende oder destabilisierende Drogen direkt

beeinflußt werden. Aus diesem Grund scheint es sicher, daß Filamente ausschließlich

eine Funktion beim Auf-/Abbau von Mt besitzen, und keine andere Funktion im Verlauf

des Zellzyklus’ einnehmen.

4.3 Mikrotubuli und Filamente Elektronenmikroskopische Untersuchungen des Mikronucleus von Paramecium bursa-

ria führten schon bald zu ersten Beschreibungen der Filamente im Kern. Vorwiegend

drei Autoren diskutieren die Natur dieser Filamente. Hauser und Beinbrech (1973) un-

terzog die Negative elektronenmikroskopischer Aufnahmen von Filamenten einer La-

serstrahl-Difraktometer-Analyse. Aus den ermittelten Beugungsmustern schließt er, daß

es sich bei den Filamenten „um Mikrotubulus-Untereinheiten von der Art der Protofi-

lamente handelt“.

Schwartz (1976) vermutet in den Filamenten eine Speicherform zum Aufbau der Mi-

krotubuli, wobei er aufgrund seiner elektronenmikroskopischen Untersuchungen eine

völlige Solubilisierung beim Übergang der Strukturformen in die jeweils andere postu-

liert.

Lewis et al. (1976) spekuliert, daß es sich bei den im Kern nachgewiesenen Filamenten

sowohl um Aktin, als auch um Intermediärfilamente oder Myosin handeln könnte. Spä-

tere Untersuchungen des Autors zeigen keinen erkennbaren Einfluß des Alkaloids Cy-

tochalasin B – einem Aktin-Inhibitor – auf die Formation der Filamente. Durch geän-

derte Fixierungsbedingungen kann ein vormals dokumentierter Durchmesser der Fila-

mente von bis zu 16 nm nicht mehr nachgewiesen werden. Aufgrund der Tatsache, daß

nun vorwiegend Filamente mit einem Durchmesser von 10 nm existieren, charakterisiert

Lewis (1989) die Filamente als Intermediärfilamente.

Diskussion 111

Allen bisher veröffentlichten Berichten über Filamente im Kern von Paramecium bur-

saria ist gemein, daß sie mit Ausnahme der erwähnten Difraktometer-Untersuchungen

weder strukturelle noch biochemische oder immunologische Beweise für die jeweilige

Theorie zur Natur der Filamente erbringen.

Filamentöse Strukturen treten nicht nur in den Mikronuclei von P. bursaria auf. Schib-

ler et al. (1980) weisen in der Grünalge Oedogonium Filamente mit einem Durchmesser

von 5-8 nm nach. Während der Pro- bis Anaphase des Organismus‘ – der ansonsten eine

geschlossene Mitose aufweist – sind diese Filamente mit den Kinetochoren der Chro-

mosomen assoziiert. In diesen Filamenten wird eine Komponente des Spindelapparates

vermutet, die evtl. in die Chromosomenbewegung involviert ist. Die Autoren erwähnen

ausdrücklich, daß die Natur dieser Filamente völlig unbekannt ist und keinesfalls zwin-

gend – wie es der elektronenmikroskopisch ermittelte Durchmesser suggerieren mag –

Aktin als strukturgebendes Protein vermutet wird.

Versuche einer Reihe von Autoren deuten nämlich auf eine Präsenz dieses Proteins in

der Spindel hin. So unterbindet Cytochalasin die Meiose von Schnaken-Spermatocyten

(Pickett-Heaps et al., 1996). In anderen Fällen zeigen Spindelfasern unter Einwirkung

ultravioletten Lichts mit einer Wellenlänge, die vorwiegend Aktin-Fasern zerstört, in

einigen Fällen eine verminderte Reaktion mit Phalloidin (Czaban und Forer, 1994).

Durch Zerstören der Spindel-Mikrotubuli kann in Versuchen von Wilson und Forer

(1988) die Wanderung von Chromosomen zu den Spindelpolen nicht unterbunden wer-

den, so daß eine weitere bewegungsinduzierende Komponente neben den Mikrotubuli

vermutet wird. In verschiedenen Zellinien kann durch den Einsatz eines anti-Myosin

Antikörpers gezeigt werden, daß dieses Protein überwiegend im Zellkern vorhanden ist

(Nowak et al., 1997).

Diese Versuche sind umstritten, da die Ergebnisse oftmals nicht reproduzierbar sind. In

den meisten Untersuchungen können weder Aktin noch Myosin in Spindeln nachgewie-

sen werden (z.B. Aubin et al., 1979). Auch fehlt eine genaue Modellvorstellung dar-

über, wie dieses Protein in der Spindel mit Mikrotubuli interagiert.

Obwohl der Durchmesser der im Kern von Paramecium bursaria nachgewiesenen Fi-

lamente durchaus das Vorhandensein von Aktin, nicht aber von Myosin suggerieren

könnte, zeigen eigene Untersuchungen niemals einen fluoreszenzmikroskopischen

Nachweis dieses Proteins. Auch Western-Blot Analysen isolierter Zellkerne sowie Post-

Diskussion 112

embedding-Versuche geben kein positives Ergebnis. Aus diesem Grund kann praktisch

ausgeschlossen werden, daß die mikronucleären Filamente aus Aktin bestehen.

Der A-Tubulus einer Flagelle ist mit einem Protein assoziiert, das in Längsrichtung an

der Wand der Dublett-Mikrotubuli verläuft. Vermutlich ist dieses Filament, mit einem

Durchmesser von 2-3 nm, an der Bildung der gemeinsamen Wand von A- und B-Tu-

bulus beteiligt. Dieses als Tektin bezeichnete Protein besitzt vermutlich eine mehr oder

weniger enge Verwandtschaft zu den Intermediärfilamenten (Linck et al., 1985).

Immunfluoreszenzmikroskopische Untersuchungen der meiotischen Spindel-Mikro-

tubuli des Echinodermen Spisula solidissima zeigen bei Einsatz von anti-Tektin Anti-

körpern eine positive Reaktion (Steffen und Linck, 1992). Darüber hinaus ist auch eine

Markierung von Basalkörpern und Centriolen möglich (Steffen et al., 1994).

Die Möglichkeit, daß es sich bei den im Kern von P. bursaria nachgewiesenen Fila-

menten möglicherweise um tektinartige Proteine handeln könnte, ist unwahrscheinlich.

Die o.g. Autoren weisen Tektin niemals als freies Filament nach, sondern zeigen immer

eine Markierung der Mikrotubuli mit anti-Tektin Ak, so daß nur indirekt auf die Exi-

stenz von Tektin geschlossen werden kann, ohne daß es im Elektronenmikroskop direkt

darstellbar wäre. Filamente bei P. bursaria sind elektronenmikroskopisch hingegen

problemlos im Kern zu detektieren. Der bei mikronucleären Filamenten ermittelte

Durchmesser von 5-10 nm ist durchschnittlich um ein Vielfaches höher, als er bei iso-

liertem Tektin mit 2-3 nm (Steffen et al., 1994) beschrieben wird.

Im Gegensatz hierzu besitzen Intermediärfilamente (IF) einen Durchmesser von 8-12

nm, wie er auch bei mikronucleären Filamenten teilweise nachgewiesen werden kann.

Vimentin als ein Typ II-IF-Protein kann in interphasischen HuVi–Zellen in der Nähe

des Centrosoms nachgewiesen werden. Teilweise ist eine Verbindung von Vimentin via

des pericentriolären Materials (PCM) mit dem Centriol nachweisbar. Eine direkte Asso-

ziation von Vimentin mit Mikrotubuli kann hingegen nicht dokumentiert werden (Tre-

vor et al., 1995).

Parallelen zu den mikronucleären Filamenten bei P. bursaria sind aufgrund des ähnli-

chen Durchmessers erkennbar. Zwar ist die Dichte an Filamenten im Kern des Ciliaten

nahe dem Primärpol am höchsten, was eine Analogie zu der hohen Dichte an Vimentin

in Centrosomen-Nähe bei HuVi-Zellen darstellt. Jedoch können Filamente auch jenseits

des Primärpols nachgewiesen werden und stellen keinesfalls einen ausschließlichen

Bestandteil des PCM dar. Auch berichten Trevor et al. (1995) von einem fehlenden Ein-

Diskussion 113

fluß des Nocodazols und Taxols auf die Verteilung des immunfluoreszenz- und elektro-

nenmikroskopisch detektierten Vimentins, wohingegen diese Drogen bei P. bursaria

das mikronucleäre Verhältnis von Mikrotubuli und Filamenten deutlich verschieben.

Darüber hinaus ist der generelle Nachweis von IF bei Ciliaten fraglich; zwar berichten

Mohr et al. (1990) von IF-ähnlichen Strukturen bei dem Ciliaten Nyctotherus, die mit

anti-Vimentin und anti-Cytokeratin Ak reagierten. Die Detektion dieser Strukturen be-

schränkte sich aber nur auf den Zellkortex. Darüber hinaus sind aber nur äußerst wenig

detaillierte Informationen zur Existenz von Intermediärfilamenten bei Ciliaten bekannt,

zudem konnte ein Nachweis von Intermediärfilamenten bei Paramecien-Arten bislang

generell nicht eindeutig erfolgen (Cohen und Beisson, 1988).

Die deutliche Markierung der Filamente in Postembedding-Versuchen unter Verwen-

dung eines Tubulin mAk, und der elektronenmikroskopische Nachweis des direkten

Überganges von Mt in Filamente zeigen deutlich den Aufbau der Filamente aus Tubu-

lin.

Der vermutete Mechanismus, der zu einer Generierung von Filamenten aus Mikrotubuli

– und umgekehrt – führt, wird im folgenden Kapitel erläutert.

4.3.1 Modellvorstellung zu Übergängen zwischen Mikrotubuli und Filamenten

Die Bildung von Mikrotubuli aus freien Tubulin-Heterodimeren erfolgt nach Untersu-

chungen verschiedener Autoren durch die Bildung einer 3-Start linksgängigen Hetero-

dimerhelix (Kikkawa et al., 1994; Song und Mandelkow, 1995). Durch sukzessives Ad-

dieren von Heterodimeren wird ein Mikrotubulus gebildet, wobei versetztes Anlagern

der lateral zugefügten Untereinheiten zur Bildung eines „Saums“ im Mikrotubulus

führt, d.h. einer im Vergleich zu den übrigen andersartigen Bindung zwischen Protofi-

lament 1 und 13.

In einigen Fällen werden Mikrotubuli, abweichend von der gängigen Modellvorstellung,

gebildet. So berichtet Hanke-Bücker (1992), daß prophasische, mikronucleäre Mikrotu-

buli bei Heliophrya direkt aus einem Parakristall auswachsen. Es wird vermutet, daß

diese Tubulin-Parakristalle aus Protofilamenten bestehen, die zum Teil eine helikale

Formation annehmen können und als Tubulin-Speicher zur Mt-Polymerisation dienen

(Rupp et al., 1986). Parakristalle können im Verlauf der in dieser Arbeit vorgestellten

Ergebnisse auch im generativen Kern von P. bursaria sowohl gezeigt als auch mit Hilfe

eines Tubulin-Antikörpers markiert werden, was diese Vermutungen bestätigt.

In anderen Organismen ist ein direkter struktureller Zusammenhang zwischen helikalen

Filamenten und Mikrotubuli beobachtet worden (Breuker, 1997; Golz und Hauser,

Diskussion 114

1986). Hierbei depolymerisieren Mt unter Zugabe von Magnesiumchlorid in helikale

Tubulin-Strukturen, um einen schnellen Abbau der Mt zu gewährleisten. Als Umkehr-

reaktion wird eine bislang nicht bewiesene Polymerisation von helikalen Filamenten in

Mt vermutet (Breuker, 1997).

Bei der De- und Polymerisation von Hirn-Tubulin können Protofilamentringe beobach-

tet werden, die sich am Rande eines wachsenden Mikrotubulus befinden. Durch „Ab-

rollen“ des Ringes integrieren sich die Protofilamente vermutlich in den Mikrotubulus.

Analog wird bei einer Depolymerisation die laterale Bindung zwischen den Protofila-

menten gelöst, so daß sich diese als nach außen vom Mikrotubulus gekehrte Ringe „ein-

rollen“ und der Mt abgebaut wird (Übersicht in Erickson und Stoffler, 1996).

In einigen Organismen ist durch spezielle Präparationsmethoden der Nachweis von γ-

Tubulin-Ringen möglich (Moritz et al., 1998), die als Keim bei der Mt-Nucleation die-

nen. Auch bei P. bursaria kann durch Einsatz der IIF die Existenz von γ-Tubulin im

Bereich des Primärpols nachgewiesen werden. Eine Theorie besagt, daß es nach Anpo-

lymerisieren eines Protofilaments an den Ring durch laterales Anlagern von Heterodi-

meren zur Bildung einer zweidimensionalen Protofilament-Fläche („microtubule-

sheet“) kommt. Die seitlichen Enden dieser Fläche werden lateral zusammengefügt;

somit könnte ein Mikrotubulus der bekannten Struktur gebildet werden (Erickson und

Stoffler, 1996). Kryo-Elektronenmikroskopische Untersuchungen bestätigen diese

Theorie und zeigen lange, nach außen gebogene Protofilamente an den Enden von in

vitro polymerisierten Mikrotubuli (Chrétien et al., 1995). Es wird vermutet, daß diese

Enden entstehen, wenn sich Mt-sheets zu einem Zylinder schließen und dabei Protofi-

lamente, die aufgrund ihrer zu großen Länge an Ende des Mikrotubulus keinen lateralen

Paarungspartner haben, überstehen. Das gekrümmte Erscheinungsbild der Protofila-

mente wird mit einer Konformationsänderung des Tubulins während der Polymerisation

erklärt.

Die laterale Aneinanderlagerung von bereits zu Protofilamenten polymerisierten Tubu-

lin-Dimeren ist bei in vitro Versuchen beschrieben worden (Doenges et al., 1983). Dies

führt u.a. zur Bildung von Filamenten mit einem Durchmesser von ca. 10 nm. Weiteres

laterales Assoziieren von fertigen Protofilamenten führt schließlich zur Bildung von im

Querschnitt C-förmigen Strukturen, die den gleichen Krümmungsradius wie fertige Mi-

krotubuli besitzen (Unger et al., 1990). Wenn sich diese C-Struktur zusammenschließt,

kann auch hier ein Mikrotubulus erzeugt werden.

Diskussion 115

Der Unterschied der Modelle von Erickson/Chrétien und Doenges/Unger liegt darin,

daß bei Ersterem die Anlagerung von Heterodimeren zur Bildung von sheets vermutet

wird, bei letzteren hingegen die Assoziation von Protofilamenten diskutiert wird.

Die Existenz von Filamenten mit variablem Durchmesser im Kern von Paramecium

bursaria fügt sich in das von Doenges/Unger beschriebene Modell der Mt-Polymerisa-

tion ein. Der in vielen Fällen von 10 nm abweichende Durchmesser der Filamente im

Ciliaten-Kern ist durch laterales Aneinanderlagern von Protofilamenten zu erklären.

Der Übergang der Filamente in Mikrotubuli kann z.B. in der Metaphase des Mikronu-

cleus gezeigt werden. Aufgrund des statischen Bildes kann eine Bildung des Mikrotu-

bulus nur vermutet werden, wegen der in dieser und besonders in den folgenden Phasen

hohen Anzahl von Mikrotubuli erscheint aber eine Depolymerisation eher unwahr-

scheinlich. Gleiches gilt für den in der Telophase nachgewiesenen Zerfall von Mt zu

Filamenten, wie es auch beim Abbau der Mikrotubuli des flagellaren Apparates nach-

gewiesen werden kann (Linck, 1982).

Die in der Telophase beobachtete Krümmung der Filamente (z.B. Abb. 32 ff.) beim

Zerfall der Mt ist vermutlich auf eine Konformationsänderung der Heterodimere zu-

rückzuführen. Wird an die β-Untereinheit des Tubulin-Dimers gebundenes GTP hy-

drolysiert, knicken die Protofilamente bei gleichzeitiger Depolymerisation des Mikrotu-

bulus seitlich ab (Downing und Nogales, 1998a).

4.3.2 Die Bedeutung der Existenz von Filamenten für den Organismus

Das Tubulin von Paramecium stellt sich schon allein aufgrund seiner fehlenden Tyrosi-

nierung (Dupuis-Williams et al., 1996) als ungewöhnlich dar.

Ein weiteres, markantes Merkmal ist die bei Ciliaten übliche, geschlossene Mitose des

Mikronucleus, die mit einer enormen Streckung des Kerns in der Anaphase einhergeht.

Die Elongation der Spindel wird in einem sehr kurzen Zeitraum vollzogen, was von

einer wesentlich gesteigerten Polymerisation der Mikrotubuli begleitet ist.

Bedingt durch die persistierende Kernmembran erscheint es wenig praktikabel, hierzu

benötigtes Tubulin erst zum Zeitpunkt des tatsächlichen Bedarfs durch aufwendige

Transportmechanismen in den Kern zu importieren. Eine Speicherung von Tubulin im

Kern in jeder Phase des Zellzyklus‘ ist somit sinnvoll. Parakristalline Strukturen, in den

Kernen vieler Einzeller nachgewiesen, stellen einen solchen Tubulin-Speicher dar

(Rupp et al., 1986). Auch im Mikronucleus von Paramecium bursaria ist in einigen

Fällen die Existenz von Parakristallen zu belegen. Der hauptsächliche Anteil an Spei-

Diskussion 116

cherformen des Tubulins kommt aber zumindest zu Beginn der Mitose den Filamenten

zu. In der Interphase ist Tubulin vermutlich noch in vorwiegend heterodimerer Form im

Kern enthalten, was in der geringen Anzahl von Filamenten zu diesem Zeitpunkt deut-

lich wird. Erst zu Beginn der Prophase kann ein massives Auftreten von Filamenten

dokumentiert werden. Zu diesem Zeitpunkt werden Mikrotubuli-Vorstufen in Form von

Filamenten bereits polymerisiert, um die kurzfristig in der Anaphase benötigte hohe

Mikrotubuli-Anzahl zu ermöglichen. Stevenson und Lloyd (1971a) vermuteten bei Un-

tersuchungen der Mitose von P. aurelia die Existenz von Vorstufen („precursor“) der

Mikrotubuli, die es dem Organismus ermöglichen sollen, die rasche anaphasische Elon-

gation des Mikronucleus durchzuführen.

Die Filamente von Paramecium bursaria können als diese von Stevenson und Lloyd

(1971a) geforderten Vorstufen angesehen werden, die es einerseits ermöglichen, Mi-

krotubuli schneller und möglicherweise auch mit geringerem Energieaufwand aufzu-

bauen, andererseits auch einen schnellen Abbau der hohen Anzahl von Mikrotubuli im

telophasischen Stemmkörperbereich und in den Halbspindeln ermöglichen.

Zusammenfassung 117

5 Zusammenfassung Der Mikronucleus des grünen Pantoffeltierchens Paramecium bursaria ist durch ein

polares Erscheinungsbild gekennzeichnet: Der sogenannte Primärpol besitzt im Gegen-

satz zum abgerundeten Sekundärpol eine spitzzipflige Ausprägung.

Schon in der Interphase sind im Mikronucleus ultrastrukturell feine, kurze Filamente

nachzuweisen. Ebenso kann die Existenz von interphasischen Mikrotubuli im Mikronu-

cleus belegt werden, die vorwiegend parallel der Kernmembran angeordnet sind (peri-

phere Mt). Die Natur dieser Filamente, ihre mikronucleäre Verteilung und das Auftreten

von Mikrotubuli im Verlauf der Mitose, sowie die Analyse des Primärpols waren Ge-

genstand der in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen.

Der zeitliche Anteil der verschiedenen Abschnitte des Zellzyklus‘ wurde durch photo-

metrische Messungen des DNA-Gehaltes isolierter Zellkerne bestimmt. Ergänzend hier-

zu sind lichtmikroskopische Untersuchungen der Cytokinese durchgeführt worden.

Die einzelnen Phasen der Mitose werden ultrastrukturell dargestellt, erstmals können

auch Quer-und Längsschnitte durch den Stemmkörper des Mikronucleus gezeigt wer-

den.

Ultrastrukturelle Untersuchungen dokumentieren einen vormals nicht beschriebenen

Übergang der Filamente in Mikrotubuli. Auch der umgekehrte Vorgang, der Zerfall von

Mikrotubuli in Filamente, kann elektronenmikroskopisch detailliert gezeigt werden.

Die Existenz von Membranvesikeln und parakristallinen Ausbildungen im Mikronu-

cleus werden belegt. Des weiteren wird die Ausbildung Kinetochor-ähnlicher Struktu-

ren im Verlauf der Mitose verfolgt.

Durch den Einsatz monoklonaler Antikörper kann unter Verwendung der IIF die Ver-

teilung der Mikrotubuli im Kern dokumentiert werden. Hierbei unterscheiden sich die

peripheren Mt – bei Einsatz eines gegen β-Tubulin gerichteten Antikörpers – in ihrer

Markierbarkeit von den späteren Mt der Spindel.

Markierungsversuche mit den Antikörpern 6-11B1 und 3A5 zeigen, daß die Mikrotubuli

des Mikronucleus in acetylierter Form vorliegen.

Der Nachweis von Mikrotubuli und Filamenten in der IIF kann auf elektronenmikro-

skopischem Niveau durch das Verfahren des Postembeddings bestätigt werden. Diese

Zusammenfassung 118

Methode ermöglicht eine indirekte Visualisierung von antigenen Determinanten auf ul-

trastruktureller Basis und zeigt neben markierten Mikrotubuli auch die eindeutige De-

tektion der Filamente. Eine Markierung von Parakristallen kann mit Hilfe dieses Ver-

fahrens ebenfalls gezeigt werden und belegt den Aufbau dieser Strukturen aus Tubulin.

Der in Immunoblot-Versuchen isolierter Zellkerne eingesetzte Antikörper 6-11B1 de-

tektiert ein Protein von 53 kDa, das im Bereich der bei Protisten nachgewiesenen Mole-

kulargewichte von Tubulin liegt.

Da entsprechende Antikörper keine Markierung des Nucleoplasmas in der IIF zeigen,

kann davon ausgegangen werden, daß ein Tyrosinierungs-/Detyrosinierungszyklus der

mikronucleären Mikrotubuli nicht vorhanden ist. Diese Ergebnisse werden durch We-

stern-Blot Versuche isolierter Mikronuclei bestätigt, die niemals eine positive Reaktion

bei Einsatz entsprechender Antikörper zeigten.

Der ausschließlich gegen Tubulin und Protofilamente gerichtete Antikörper anti-Peptid

G zeigt die nahezu homogene Verteilung dieser Strukturen im interphasischen Kern.

Indem Agenzien verwendet wurden, die spezifisch das Polymerisationsgleichgewicht

zwischen Tubulin und Mikrotubuli beeinflussen, wird nachgewiesen, daß ein direkter

Zusammenhang zwischen der Anzahl von Mikrotubuli und Filamenten besteht: Werden

experimentell Mt-destabilisierende Agenzien wie Nocodazol oder Colchicin eingesetzt,

ist die Anzahl der Filamente erhöht, während sich gleichzeitig die Anzahl der Mt ver-

ringert.

Wird das Mt-stabilisierende Agenz Taxol verwendet, können vermehrt Mt im Kern

nachgewiesen werden, wobei sich die Anzahl der Filamente reduziert. Werden die Zel-

len hingegen in D20 inkubiert, erhöht sich die Filamentanzahl drastisch, bei gleichzeiti-

ger Reduktion der Mt-Anzahl. Der verschiedenartige Einfluß der beiden Drogen wird

auf eine unterschiedliche Wirkweise zurückgeführt.

Erstmalig konnte an isolierten Mikronuclei des Ciliaten die Existenz diverser, in der

Regel mit den MTOCs höherer Zellen assoziierter, Proteine nachgewiesen werden.

Centrin kann in der indirekten Immunfluoreszenz im Kern gezeigt werden. Die elek-

trophoretische Auftrennung isolierter Mikronucleus-Proteine und der anschließende

Zusammenfassung 119

Western-Blot detektieren ein Protein mit einem Molekulargewicht im Bereich von 20

kDa, was den in der Literatur beschriebenen Werten entspricht. Vermutlich handelt es

sich bei diesem Protein, das bereits in mitotischen Spindeln anderer Organismen nach-

gewiesen wurde, um eine kontraktile Komponente, deren genaue Funktion in der Spin-

del bislang nicht bekannt ist. Im Gegensatz zu Untersuchungen an anderen Zellen ist

Centrin bei P. bursaria in der Interphase im Kern lokalisiert.

Als eine weitere Komponente des Primärpols in der Interphase konnte durch IIF-Unter-

suchungen cytoplasmatisches Dynein nachgewiesen werden. Western-Blot-Analysen

isolierter Kernproteine bestätigen diese Ergebnisse. Vermutlich besitzt Dynein eine

Funktion bei der Assoziation von Spindel-Mikrotubuli an die in der Mitose persistie-

rende Kernmembran.

In der IIF wurden sowohl diverse anti-Aktin Antikörper als auch Rhodamin-Phalloidin

eingesetzt, um die in der Literatur häufig strittige Frage nach der Existenz von Aktin in

Zellkernen zu untersuchen. Aktin konnte weder mit den Techniken der indirekten Im-

munfluoreszenz, des Western-Blot-Verfahrens noch des Postembeddings nachgewiesen

werden und kann daher im Fall der Mikronuclei von Paramecium bursaria als Kompo-

nente des Kerns ausgeschlossen werden.

Mit Hilfe eines Antikörpers gegen γ-Tubulin konnte der Primärpol isolierter Mikronu-

clei in der IIF distinkt markiert werden.

Bestandteile des pericentriolären Materials, wie sie mit den MTOCs höherer Zellen as-

soziiert sind, konnten am Primärpol durch den in der IIF eingesetzten Antikörper CTR

210 gezeigt werden. Das Markierungsmuster deckt sich mit der Verteilung von γ-Tubu-

lin. Western-Blot-Analysen, die den mAk CTR 210 verwenden, detektieren ein Protein

mit einem Molekulargewicht von 80 kDa, was mit dem in der Literatur berichteten Mo-

lekulargewicht übereinstimmt.

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Lebenslauf

Persönliche Daten:

Name: Andreas Zabolitzky

Anschrift: Am Weitkamp 12

44795 Bochum

Geboren: 04. Februar 1968

Familienstand: verheiratet

Schulausbildung:

1974-1976 Grundschule Bissendorf, Gemeinde Wedemark

1976-1977 Gower West School, Clarendon Hills / Illinois (USA)

1977-1978 Grundschule Kemnader Straße, Bochum

1978-1987 Graf-Engelbert-Gymnasium, Bochum

Mai 1987 Erwerb der allgemeinen Hochschulreife

Zivildienst:

1987-1989 Altenpflegehelfer im Altenheim an der Holtbrügge, Bochum

Studium:

1989-1995 Biologiestudium an der Ruhr-Universität Bochum

September 1991 Diplomvorprüfung

Mai 1995 Abgabe der Diplomarbeit

seit Juni 1995 Promotion am Lehrstuhl für Zellmorphologie

Tätigkeiten:

seit Juli 1995 Wissenschaftlicher Mitarbeiter oder wissenschaftliche Hilfskraft am

Lehrstuhl für Zellmorphologie

seit September 1997 Wissenschaftlicher Mitarbeiter und Netzwerkbeauftragter des Lehrstuhls

für Zellmorphologie

Danksagung

Diese Dissertation entstand am Lehrstuhl für Zellmorphologie der Ruhr-Universität

Bochum.

Herrn Prof. Dr. M. Hauser möchte ich an dieser Stelle für die Möglichkeit zur Durch-

führung dieser Arbeit herzlich danken. Seine stete Diskussionsbereitschaft, die wert-

vollen Ratschläge und Hinweise waren stets hilfreich.

Herrn Priv.-Doz. Dr. G. Schmahl gilt mein Dank für die Übernahme des Koreferates.

Herrn Priv.-Doz. Dr. R. Golz sei für sein wissenschaftliches Interesse am Fortgang die-

ser Arbeit gedankt.

Für die kritische und sorgfältige Durchsicht des Manuskriptes möchte ich an dieser Stel-

le Frau Dr. G. Hanke-Bücker danken.

Die sorgfältige und überaus engagierte Anfertigung der Zeichnungen besorgte Frau G.

Klee-Feller, der herzlich gedankt sei.

Das Bildmaterial wurde von Herrn R. Seidel angefertigt.

Herrn S. Othmann sei für die Nutzung des konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops ge-

dankt.

Allen nicht namentlich genannten Lehrstuhlmitgliedern, die mir in der Zeit der Promo-

tion freundschaftlich zur Seite standen, sei gedankt.

Großer Dank gilt meiner Frau und meiner Familie für ihr Verständnis und ihre Ermuti-

gung während der Promotionsarbeit.

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Bildung und Struktur der intranucleären Mikronucleusspindel des