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Bioanalytik Zusammenfassung P. Sebregondi und F. Hobi

Inhaltsverzeichnis

1 Allgemeines ...................................................................................................................................... 3

2 Nachweismethoden .......................................................................................................................... 3

3 Probenaufbereitung für die Bioanalytik ............................................................................................ 3

3.1 Proteine ................................................................................................................................... 3

3.1.1 Proteineigenschaften ........................................................................................................... 3

3.1.2 Grobtrennung ....................................................................................................................... 4

3.1.3 Feintrennung ........................................................................................................................ 4

3.1.3.1 Chromatographie ......................................................................................................... 4

3.1.3.2 Elektrophorese ............................................................................................................. 5

3.2 Nukleinsäuren .......................................................................................................................... 5

3.2.1 Klassische Methoden........................................................................................................... 5

3.2.2 Verfahren für verschiedene Zelltypen .................................................................................. 5

3.2.3 Anionenaustauscher ............................................................................................................ 6

3.2.4 Silica + chaotrope Salze ...................................................................................................... 6

4 Photometrie ...................................................................................................................................... 7

4.1 Einführung ............................................................................................................................... 7

4.2 Unspezifische Photometrie (Bsp.: Proteinmessung) ............................................................... 7

4.2.1 Kolorimetrie .......................................................................................................................... 7

4.2.2 Absorption / Fluoreszenz ohne Reagenz ............................................................................ 7

4.2.3 Spezifische Photometrie (Bsp.: Enzymbasierter Glukosenachweis) ................................... 7

4.2.3.1 Bestimmen der Enzymaktivität .................................................................................... 8

4.2.3.2 Bestimmung von Metabolit-Konzentration ................................................................... 8

4.3 Spezifischer Protein-Nachweis ................................................................................................ 8

4.3.1 Allgemeines ......................................................................................................................... 8

4.3.2 Immunaglutination ............................................................................................................... 9

4.3.3 Immunchromatographische (Durchfluss-) Tests ................................................................. 9

4.3.4 Bindungsassay (ELISA) ..................................................................................................... 10

4.3.4.1 Allgemeines ............................................................................................................... 10

4.3.4.2 Häufig benutztes Bindungssystem ............................................................................ 11

4.3.4.3 Häufiges Nachweissystem für ELISA ........................................................................ 11

4.3.5 Immunpräzipitation in Lösung ............................................................................................ 11

4.3.6 Western Blot ...................................................................................................................... 11

4.3.6.1 Allgemeines ............................................................................................................... 11

4.3.6.2 Auswahl der Blot-Membran ....................................................................................... 11

4.3.6.3 Nachweisverfahren für Western Blot ......................................................................... 12

4.3.7 Zusammenfassung ............................................................................................................ 12

4.4 Spezifität und Sensitivität ...................................................................................................... 12

4.5 Signal-zu-Rausch-Betrachtungen.......................................................................................... 13

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4.6 Surface plasmon resonance (SPR) ....................................................................................... 13

4.7 Durchflusszytometrie ............................................................................................................. 14

4.8 Proteinsequenzanalyse ......................................................................................................... 14

4.8.1 Allgemeines ....................................................................................................................... 14

4.8.2 Aminosäurenanalyse ......................................................................................................... 14

4.8.3 Edman-Abbau .................................................................................................................... 15

4.9 Photometrischer DNA-Nachweis ........................................................................................... 15

4.9.1 Unspezifischer DNA-Nachweis .......................................................................................... 15

4.9.2 Spezifischer Nachweis: Real-time PCR ............................................................................ 15

4.9.2.1 Detektion .................................................................................................................... 16

4.9.2.2 Eichkurven und Standards ........................................................................................ 16

4.9.3 Schmelzpunktanalyse ........................................................................................................ 17

4.9.4 Warum PCR statt nur Immunoassays ............................................................................... 17

4.10 Microarrays ............................................................................................................................ 17

4.10.1 Anwendung .................................................................................................................... 17

4.10.2 Detektionsmethoden ...................................................................................................... 17

4.11 Fluoreszenz IN-situ Hybridisierung ........................................................................................ 18

4.12 DNA-Sequenzierung .............................................................................................................. 18

4.12.1 Begriffe .......................................................................................................................... 18

4.12.2 Vorbereitende Schritte ................................................................................................... 18

4.12.3 Sequenzierungsreaktion: Didesoxymethode nach Sanger ........................................... 18

4.12.4 Pyrosequenzierung ........................................................................................................ 18

5 Massenspektroskopie ..................................................................................................................... 19

5.1 Allgemeines ........................................................................................................................... 19

5.2 MALDI .................................................................................................................................... 19

5.2.1 TOF .................................................................................................................................... 19

5.2.2 Molekülmassen-Bestimmung ............................................................................................ 19

5.2.3 Peptid-Sequenzierung mit MALDI ..................................................................................... 20

5.2.4 PAGE + Scanning-IR-MALDI ............................................................................................. 20

5.3 Elektronenspray-Ionisation (ESI) ........................................................................................... 20

5.3.1 Molekülmassen-Bestimmung ............................................................................................ 20

5.3.2 Sequenzierung von Peptiden mit ESI-MS ......................................................................... 20

6 Laborautomation ............................................................................................................................ 21

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1 Allgemeines

Gehört medizinische Diagnostik zur Bioanalytik? - in-vitro-Diagnostik (Chemie basierend): JA z.B.: Klinische Chemie, Immunochemie - in-vivo-Diagnostik (Physik basierend): NEIN z.B.: Röntgen, Ultraschall, Tomographie

2 Nachweismethoden

Methode Messprinzip Messgrösse Bemerkungen

Photometrie - Farbänderung - Absorbtion - Fluoreszenz

Strom/Spannung Beurteilung: Schwellenwert

ca. 70% aller Analysen sind photometrisch

Massenspektroskopie - unterschiedliche Ionenmassen - unterschiedliche Flugzeiten/bahnen

Strom Beurteilung: zeitlicher Verlauf

wird immer wichtiger

Imaging (Mikroskopie) spezifisches Anfärben von Zellstrukturen

visuelle oder automatische Bildanalyse

- sehr aufwändig - schlecht reproduzierbar - schwer automatsierbar

NMR - Kernspinausrichtung im Magnetfeld - unterschiedliche Frequenzen

Strom Beurteilung: Intensitätsmuster

- 3D-Strukturen von Proteinen - in-vivo: MRI

Röntgenstrukturanalyse Beugung von Rönten-, Elektronen- oder Synchrotronstrahlung an Kristallen

Intensitätsverteilung des Beugungsmusters

3 Probenaufbereitung für die Bioanalytik

3.1 Proteine

3.1.1 Proteineigenschaften

Grösse: - 50 – 13000 Aminosäuren � 5 kDa – 1.3 MDa - je grösser desto schwerer die Isolierung - Trennmethode der Wahl: - ca. 1kDa: Chromatographie - ca. 10kDa: Elektrophorese - > MDa: Pulsfeld-Elektrophorese oder Zentrifugation Löslichkeit: - intrazelluräre Proteine: gut - Cytoskelett-Proteine: schlecht - Membranproteine: sehr schlecht (sehr hydrophob) Verfügbare Mengen: - je kleiner die Menge desto grösser der Reinigungsaufwand Säure/Basen-Eigenschaften: - pI-Wert ist abhängig von Asp, Glu, Lys, Arg, His Biologische Aktivität/Stabilität: - Proteinaktivität muss während jedem Reinigungsschritt aufrecht erhalten werden! - Denaturierung (Hitze, Säure, Base, Salze, Schwermetalle) und Spaltung/Aggregation (Proteasen) vermeiden.

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3.1.2 Grobtrennung

Reinigungsstrategien: - Extrazelluläre Proteine: Zentrifugation, Protein fällen (aufkonzentrieren) - Intrazelluläre Proteine: Zellaufschluss, Zentrifugation - Inclusion Bodies: Zellaufschluss, Zentrifugation, Renaturierung - Membranproteine/unlösliche Proteine: Detergenzien und chaotrope Reagenzien � nächster Schritt: hochselektive Methode (z.B.: Chromatographie) Zellaufschluss: - Lysozym/EDTA, Zellmühle, Einfrieren/Auftauen, Ultraschall, french press, zermahlen in N2(l) - Wichtig: Erwärmung, Proteasen und osmotisches Platzen vermeiden Fällung: - Kohn-Fraktionierung: Blutplasma mit steigenden Mengen Ethanol versetzen - Aussalzung: antichaotrope Salze ((NH4)2SO4) verdrängen Wasser � hydrophobe WeWi zwischen den Proteinen � Aggregation Zentrifugation: - Abtrennen von Feststoffen Salzabtrennung und Konzentrierung: - Dialyse: Poröser (definierte Grösse) Zelluloseschlauch in Lösung (Dialysepuffer) mit niedriger Konzentration, Puffer mehrmals wechseln. Cutoff-Wert: Molekulargewicht eines Proteins welches zu 90% drin bleibt. - Ultrafiltration: Filtration durch Membran � Aufkonzentration bei gleichem Salzgehalt - Diafiltration: wie Ultrafiltration plus kontinuierlich frischer Puffer hinzugeben � Salzabreicherung Detergenzien-Entfernung: - Verwendung oberhalb kritischer Micell-Konzentration (CMC) - Ionische (SDS) wirken denaturierend, nicht-ionische (Triton, Tween) nicht - Entfernung: Verdünnung, Extraktion oder Ausschlusschromatographie 3.1.3 Feintrennung

3.1.3.1 Chromatographie

Methode Moleküleigenschaften

Ionenaustausch Ladung Reversed-Phase, Hydrophobe Interaktion (HIC)

Hydrophobizität

Affinität Biospezifität Ausschluss Grösse, Form Ionenaustausch-Chromtographie - geladene Proteine werden an Säulenmaterial gebunden - mit Hochsalzkonzentrationen werden die Proteine wieder verdrängt (Gradient oder Stufe)

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Reversed-Phase-Chromatographie (RPC): - apolares Säulenmaterial (Kieselgel mit langen Alklresten) - polares Lösungsmittel - eluieren: apolares Lösungsmittel (oft: Acetonitril (transparent bis 200nm), bei sehr apolaren Proteinen: z.B.: Propanol (absorbiert bis 230nm!)) - für kleine Proteine (grosse denaturieren) - empfindliche Detektion: gekoppelt mit MS Hydrophobe-Interaktions-Chromatographie (HIC): - wie RPC aber Bindung/Elution durch Salze erzeugen - native Form des Proteins bleibt erhalten Affinitätschromatographie: - spezifische reversible Adsorbtion an einen matrixgebundenen Bindungspartner (Schlüssel-Schloss-Prinzip) - nicht zu starke oder schwache Bindung - gruppenspezifischer oder monospezifischer Ligand Ausschluss-Chromatographie, Gelchromatographie (SEC): - Trennung nach Grösse (Analytbewegung durch poröses Trägermaterial) - Ausschlussvolumen: Teilchen welche grösser als die Poren sind (kommen zuerst) - hydrophobe und ionische Wechselwirkungen vermeiden - grosse Auftragsvolumen und Flussraten verschlechtern die Auflösung 3.1.3.2 Elektrophorese - Trennung aufgrund von Ladung und Grösse - Durch Anlegen von Ladung wandern die Proteine und werden durch das Gel aufgrund ihrer Grösse getrennt - Trägermaterialien: Agarose-Gel, Polyacrylamid-Gel - SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese: SDS bildet Micellen und überdeckt so die Eigenladung der Proteine � Mobilität hängt nur noch von der Ladung ab (Nachteil: Denaturierung) - isoelektrische Fokusierung: Elektrophorese mit pH-Gradient im Gel � Proteine wandern bis zum pH-Wert wo die Gesamtladung 0 ist - Kapillar-Elektrophorese (CE): kein Gel mehr nötig

3.2 Nukleinsäuren

- standardisiert - optimiert - Man muss in Katalogen das richtige Kit suchen nach den folgenden Kriterien: Typ, Ursprung, Probenart, Menge, Anzahl der Proben 3.2.1 Klassische Methoden

- Phenol-Extraktion: NA lösen sich in wässriger Phase, Proteine denaturieren und befinden sich in der Phenol/H2O Interphase - Ethanol-Präzipitation: NA ist unlöslich in Ethanol � Ionen und Puffer entfernen durch waschen mit EtOH - Gelfiltration (SEC): hochmolekulare NA wird von niedermolekularen Verbindungen getrennt 3.2.2 Verfahren für verschiedene Zelltypen

- Bakterien: Inkubation mit Lysozym, alkalische Lyse (Zellwände auflösen) - Eukaryonten: alkalische Lyse, Inkubation mit Proteinase K (Histone spalten) - Phagen-DNA (aus Phagen in Bakterien): E.coli Phagen-Verhältnis beachten bei der Vermehrung, bakterielle DNA/RNA zerstören, Pelletierung, Aufschluss mit Proteinase K, Präzipitation - RNA: Gefahr: RNasen!, RNasen-Inhibitoren einsetzen, mRNA mit Affinitätschrom. isolieren.

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3.2.3 Anionenaustauscher

- negativ geladene NA (-P-O-) binden unter sauren Bedingungen und tiefer Ionenstärke an Säule. Eluieren mit zunehmender Ionenstärke � am wenigsten negativ geladene (kleine) Moleküle kommen zuerst. 3.2.4 Silica + chaotrope Salze

- Chaotrope Salze: Zerstören H-Brücken und WeWi zwischen und innerhalb der Moleküle - NA binden in Gegenwart von chaotropen Salzen an Silica - Eluieren: bei tiefer Ionensärke - Magnetpartikel-Technologie: Probe, Zelllyse, cahotrope Salze und Magnetpartikel, DNA Separation, waschen, Elution - Filter-Technologie: Probe in Tube mit Silica Filter, Lyse, binden, waschen, eluieren

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4 Photometrie

4.1 Einführung

Probe mit Analyt + Test-spezifisches Reagenz � chem. Reaktion Inkubation in Messküvette � Änderung der optischen Eigenschaften � photometrische Messung Absorbierende Moleküle: freie EP’s oder konjugierte Doppelbindungen Intensität: Art des elektronischen Übergangs bestimmt die Intenstität, je grösser die Ladungsverschiebung (Übergangsdipolmoment) desto intensiver die Absorption. Absorptionsphotometrie: - Einheit: Extinktion ( A=log(I0/I) ) oder auch Absorbanz genannt (Abs, mAbs, OD) - Absorptionskoeffizient: Einheit: L/(mol*cm), bei einer bestimmten Wellenlänge - Quantifizierung: Eichgerade aufnehmen und linearer Bereich bestimmen! - Blindwert: Die Extinktion setzt sich zusammen aus: Absorption des Analyten und des Lösungsmittel, Reflektion (an Cüvetten-Wände), Streuung, Beugung. � Messen von Blindwert eliminiert die unterstrichenen Einflüsse � nur noch Absorption des Analyten wird gemessen! Fluoreszenz: - keine Referenz (Aufwändig in zwei Apparaturen den gleichen Wert zu erhalten!) � immer Eichkurve! - Aufbau: Lichtquelle � Probe � Detektor im 90° Winkel Lambert-Beer-Gesetz: A = ε * d * c - gilt nur für verdünnte klare Lösungen und bei einstrahlen einer Wellenlänge

4.2 Unspezifische Photometrie (Bsp.: Proteinmessung)

4.2.1 Kolorimetrie

- immer Beigabe von Reagenzien (1-4) � reagieren auf Peptidbindungen - immer sind Kupfer-Ionen involviert welche durch Reduktion (2+ � +) oder Komplexierung Farbreaktionen machen - alle Methoden sind störanfällig - Quantifizierungen: ε*d wird oft vom Lieferanten gegeben, aber wenn es genau sein sollte � eigene Eichgerade machen! - alle Methoden (Biuret, Lowry, Bicinchoninsäure, Bradford (am sensitivsten)) zerstören die Proteine 4.2.2 Absorption / Fluoreszenz ohne Reagenz

- Vorteil: zerstört Proteine nicht! - Nachteil: weniger empfindlich Absorption 280nm Trp, Tyr - stark abhängig von Proteinzusammensetzung

- wenig störungsanfällig - nur für reine Lösungen - Hauptstörung: Nukleinsäuren-Abs. bei 260nm

Absorption 205nm Peptidbindung - wenig abhängig von der Zusammensetzung - sehr störungsanfällig

Fluoreszenz 230nm � 340 Trp - stark abhängig von Proetinzusammensetzung - wenig störungsanfällig

4.2.3 Spezifische Photometrie (Bsp.: Enzymbasierter Glukosenachweis)

- Enzymbasierte Reaktionen für zwei Arten von Analytik: Enzymaktivität oder Metabolit-Konz. bestimmen - Bsp.-Reaktion: Pyruvat + NADH + H+ � Lactat + NAD+ Enzym: LDH NADH ist Coenzym und deren Absorption bei 340nm ist ein Mass für die Enzymaktivität

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4.2.3.1 Bestimmen der Enzymaktivität - Reaktionsgeschwindigkeit messen (Aktivität = ∆c/∆t) - für das obige Beispiel: ∆c(Lactat)=∆c(NAD+) � ∆c=∆A/(ε*d) - nach Michaelis-Menten: V=(Vmax[S])/(KM+[S]) - Bestimmung bei Substrat- oder Hilfsenzym-Sättigung (oder grossem Überschuss) - bevor die Messung startet: Äquilibrierungszeit abwarten (bis System im Gleichgewicht ist) - nach starten der Reaktion (Substratzugabe): messen von ∆A/∆t im linearen Bereich 4.2.3.2 Bestimmung von Metabolit-Konzentration - Enzym nur als Hilfsmittel um Metaboliten rasch und quantitativ umzusetzen � Enzyme und Co-Faktoren im Überschuss - es interessiert die Endkonzentration und nicht die Kinetik!

4.3 Spezifischer Protein-Nachweis

4.3.1 Allgemeines

- Immunoassays: Test durch Antigen-Antikörper-Reaktionen - Antikörper: Glykoproteine für die Abwehr von Mikroogranismen und Viren (durch Ak-Ag-Reaktion) - Ak das beste Nachweis-Reagenz weil: Nachweis vieler Proteine, hohe Spezifität, leicht handbar, verlässlich und gut automatisierbar - IgG ist der wichtigste analytische Antikörper! (klein, gut löslich, in pH 4 – 9.5 aktiv, gut haltbar, bivalent) - Molekulare Struktur des IgG-Ak:

- Paratop: Ag-Bindungsstelle - H: heavy-chain - L: light-chain - die Bindungsstellen sind hochaffin (komplementär) � starke Bindung - H und L Ketten sind miteinander über Disulfid-Brücken gebunden - Fab: antigenbindende oberen zwei Teile - Fc: Stamm (unterer Teil) - lösen der Ak-Ag-Bindung: stark sauer oder mit chaotropen Ionen - Handhabung: bovines Serumalbumin hinzusetzen (verhindert Aggregation), NaN3 hinzusetzen (Bakterienwachstum verhindern) - gewisse Antikörper sind Monomere (IgD, IgE, IgG), Dimere (IgA), Pentamere (IgM) - Befunde aufgrund von Elektrophorese:

Bsp.: - α erhöht: akute Entzündung - β und γ erhöht: Leberzirrhose

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- Antigene: jede Art von chemischer Spezies zu welcher ein Antikörper exisitiert welcher daran bindet - Immunogene: Ag welche eine Immunantwort erzeugen - Haptene: Ag an welche Ak binden, aber keine Immunantwort auslösen 4.3.2 Immunaglutination

Bsp.: Blutgruppentest - je nach Antigen (am Erythrozyten gebunden) und Antikörper kommt es zu einer Agglutination (verklumpen und ausfallen) - Blutgruppe 0 (Ag: keine, Ak: Anti-A, Anti-B): Universalspender für Erythrozytenkonzentrat und Universalempfänger für Plasma - Blutgruppe: Buchstabe gibt an welche Antigene es hat � hat die dazu komplementären Antikörper (Bsp.: Blutgruppe A: Ag � A, Ak � Anti-B) Zwei Arten von Blutgruppentest: - Erythrozytentest: Patient-Vollblut mit Anti-A-Ak und eine zweite Probe mit Anti-B-Ak � Nachwei der Verklumpung - Antikörper-Suchtest: Patienten-Serum mit Test-Erythrozyten der Blutgruppen A, B, 0 - Auswertung mit CCD-Kamera 4.3.3 Immunchromatographische (Durchfluss-) Tests

Bsp.: Schwangerschafts-Schnelltest - beruht auf Nachweis von Peptidhormons hCG (verantwortlich für die Erhaltung der Schwangerschaft) - starker Anstieg der hCG-Konzentration in der ersten Wochen - Urintest - Verlauf der Analyse: - hCG-Ag aus Urin reagiert mit dem farbstoffmarkierten Antikörper

- Ag-Ak-Farbstoff-Komplex wandern zur Testzone und binden an zweiten fixierten hCG-Ak � Verfärbung in der Testzone - überschüssiger farbstoffmarkierter hCG-Ak wandert zur Kontrollzone und verfärbt sich dort mit fixiertem anti-Fc-Ak

- Nachweisgrenze: wegen starkem hCG-Anstieg hat der Nachweis 15 Tage nach der Befruchtung eine Zuverlässigkeit >95% - Analysen anhand Urinverfärbungen: breite Spektren der Komponenten welche zur Verfärbung bei einer Erkrankung beitragen, viele Störfaktoren � schlechte Methode! (v.a. für Schwangerschaft!) - Frösche: Nachweis einer Schwangerschaft durch Injektion von Urin in Frösche � erhöhte Eierproduktion!

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4.3.4 Bindungsassay (ELISA)

4.3.4.1 Allgemeines - ELISA: Enzym linked immuno sorbent assay - Ag oder Ak an Oberfläche gebunden - besteht immer aus drei Schritten: 1. Binden (Zugabe von Ak bzw. Ag � Bindung) 2. Waschen (Entfernung nicht gebundener Ak bzw. Ag)

3. Detektieren (Ak-Ag-Komplex mit Absorption, Chemolumieszenz oder Radioaktivität)

- Problem; Antikörper setzen sich gerne an die Oberfläche (unspezifisches Signal (von anderen Ak’s bzw. Ag‘s) � unspez. Adsorption blocken durch BAS, Casein oder Milchpulver, Probe verdünnen, besser waschen, evtl. Detergenzien

Indirektes ELISA (Ak-Suchtest): 1. Ag beschichtetes Gefäss 2. Zugabe der Probe mit gesuchtem Ak (spezifische Bindung) 3. Zugabe von enzymkonjugierten Sekundär-Ak (musst nicht sehr spezifisch sein, bindet an Stamm) 4. Zugabe von Substrat (S + E � Verfärbung) � Signal Sandwich ELISA (Ag-Suchtest): 1. Ak beschichtetes Gefäss 2. Zugabe der Probe mit gesuchtem Ag 3. Zugabe von enzymkonjugierten Sekundär-Ak 4. Zugabe von Substrat � Signal Kompetitiver ELISA (Ag-Suchtest): 1. Ak mit gesuchtem Ag inkubieren (Ak-Ag-Bindung + überschüssige Ak) 2. Zugabe der inkubierten Lösung in Ag beschichtetes Gefäss (überschüssige Ak binden) 3. Zugabe von enzymkonjugierten Sekundär Ak 4. Zugabe von Substrat � Signal

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4.3.4.2 Häufig benutztes Bindungssystem ||-gebundener (Captrue Ak)---Antigen---Detektions-Ak—Biotin---Avidin--HRP---Substrat |spez. Bindungssystem | |Detektionssystem | - Biotin: hochspezifische Bindung mit Streptavidin - Avidin: eher unspezifisch - Streptavidin: spezifischere Bindungen als Biotin-Avidin-System 4.3.4.3 Häufiges Nachweissystem für ELISA - Alkalische Phosphatase mit pNNP als Substrat (farblos � gelblich) - Meerrettichperoxidas mit Wasserstoffperoxid und Luminol als Substrat ( � Lumineszenz) 4.3.5 Immunpräzipitation in Lösung

- Agglutination: betrifft Zellen � verklumpen � ausfallen � fallen herunter - Präzipitation: betrifft Moleküle � fallen aus � Trübung - messen der Trübung durch Ak-Ag-Präzipitation - Turbidimetrie: Abnahme des in Anregungsrichtung transmittiertes Licht - Nephelometrie: Zunahme des gestreuten Lichts, rechtwinklig zur Anregung - Trübungs-Kinetik: quantitative Bestimmung der Ag-Konzentration (je höher die Ag-Konz. desto schneller die Trübung) Prozonen-Phänomen: - Ausbleiben einer Agglutination - Gründe: starker Ak-Überschuss � alle Ag schnell mit Ak gesättigt � keine

Kreuzverknüpfungen starker Ag-Überschuss � wenige Ak reichen nicht aus um Ag zu glutinieren - nur im (nicht zu starken) Ak-Überschuss-Bereich kann Antigen quantifiziert werden - ideal: Ak : Ag = 2 : 1 - Direkte Agglutination: Kreuzvernetzung nur durch eine Art von Ak verursacht (Ag-Ak-Ag) - Indirekte Agglutination: Kreuzvernetzung durch zwei Ak-Arten, mit sekundär Ak welcher an prim. Ak bindet (Ag-Ak1-Ak2-Ak1-Ag), Nachteil: sek. Ak kann auch direkt binden � falsches Resultat, Vorteil: sek. Ak muss nicht sehr spezifisch sein. Immunpräzipitation auf Gel: - Platte mit zwei Löchern auf einer Seite (mit zwei Ag) und ein Loch auf der anderen Seite (Ak), bei Reaktion wird eine Linie sichtbar (je nachdem zwischen beiden Löchern, einem oder gar keinem) 4.3.6 Western Blot

4.3.6.1 Allgemeines - Übertragung von Proteinen vom Elektrophorese-Gel auf eine Membran und anschliessendem Proteinnachweis. Auf der Zellulose können die Proteine spezifisch nachgewiesen werden (auf dem Gel nicht spez.). 1. Auftrennung der Proteine einer Probe durch 1D oder 2D-Elektrophorese 2. Übertragung der Proteine vom Polyacrylamid-Gel auf die Membran (z.B. Nitrocellulose), meist mit Elektrophorese 3. Zugabe von spez. Ak, Waschen, Detektieren (analog ELISA) 4.3.6.2 Auswahl der Blot-Membran Kriterien: 1. geforderte Transfer-Effizienz 2. Abtrennung der Pufferkomponente (z.B.: SDS) 3. Erhaltung der Proteinstruktur und Zugänglichkeit von spez. Bindungsstellen abhängig von der Anwendung Häufige Anwendungen: Direktnachweis auf der Membran (Western Blot, v.a. Kriterium 3), Protein-Sequenzierung (v.a. Kriterium 2), MS (hohe Proteindichte an der Oberfläche notwendig)

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4.3.6.3 Nachweisverfahren für Western Blot unspezifisch: - Kolloidales Gold (hohe Sensitivität, einfach Durchführung, Immundetektion nach der Färbung nicht möglich, harsch Bedingungen) - Ponceau S (Diazoverbindung, färbt Proteine auf Nitrocellulose und PVDF reversibel an (mit Wasser auswaschbar) � Proteinübertragung kontrollierbar und spez. Nachweis möglich) - Coomassie-Blau = Bradford-Assay (empfindlic aber irreversibel) spezifisch: - gleiche Verfahren wie bei ELISA 4.3.7 Zusammenfassung

Methode Sensitivität Spezifität

AS-Absorption 280nm steigt von oben nach unten

unspez. AS-Absorption 205nm unspez. Trp-Fluoreszenz 280/330 unspez. Kolorimetrie unspez. Nephelometrie eher spez. ELISA spez. Radioimmunassay (RIA) spez.

4.4 Spezifität und Sensitivität

Instrumentelle Sensitivität: welche kleinste Menge ist noch detektierbar, variert je nach Ausführung Instrumentelle Spezifität: spez. Methoden weissen nur bestimmte Proteine nach unspez. alle Diagnostische Sensitivität (analytische Sensitivität, Empfindlichkeit): Richtig-Positiv-Rate

Anzahl Richtig-Positive TPdiag. Sens.

Anzahl Richtig-Positive + Anzahl Falsch-Negative TP + FN= =

Diagnostische Spezifität: Richtig-Negativ-Rate

Anzahl Richtig-Negative TNdiag. Spez.

Anzahl Richtig-Negative + Anzahl Falsch-Positive TN + FP= =

linke Glockenkurve: Verteilung des Wertes bei gesunden Leute rechte Glockenkurve: Verteilung des Wertes bei kranken Leute links vom senkrechten Strich (Grenzwert): werden als gesund diagnostiziert rechts vom senkrechten Strich (Grenzwert): werden als krank diagnostiziert Krenzwert nach links verschieben: Sensitivität steigt, Spezifität nimmt ab ROC-Kurve: beschreibt wie sich die Verschiebung des Trennkriteriums auswirkt - Sensitivität (TP, y) gegen 1 - Spezifität (FP, x) aufgetragen - Ideal: Verlauf entlang der Y-Achse - Real: Bereich Suchen bei dem eine Sensitivitätserhöhung fast keine FP-Erhöhung zur Folge hat

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4.5 Signal-zu-Rausch-Betrachtungen

- Güte eines Messsignals wird durch Signal-zu-Rausch-Verhältnis (S/R) charakterisiert - Rauschen: Standardabweichungen der Schwankungen um den mittleren Signalwert - Optische (Instrumentelle) Sensitivität: kleinste messbare Analyt-Konzentration, bei welcher das Signal noch mit genügender Sicherheit vom Rauschen unterschieden werden kann (S/R=3) Rauschquellen: - fundamentales Rauschen - thermisches Rauschen (ungeordnete therm. Bewegungen der Elektronen) - Auslese Rauschen (CCD-Kamera)

- Shot Noise (photon noise): Anzahl der auftreffenden Elektronen ist statistisch, steigt mit der Wurzel an Photonen

- Zusatzrauschen: - Drifts, Fluktationen der Komponenten/Umgebung, Interferenzen: linear zum Signal - Digitalisierungsfehler: begrenzte Auflösung des AD-Wandlers Absorption und Fluoreszenz Signal Rauschen S/R

Limitierung der Sensitivität: - durch chemische sowie Geräte-technische Ursachen - Untergrund-Signale sollten immer eliminiert werden, da auch diese Rausch-behaftet sind - Fluoreszenztechnik ist empfindlicher als Absorption da sie eine hintergrundfreie Methode ist (kein Analyt � kein Signal) - bei einer CCD-Kamer ist vor allem das Ausleserauschen wichtig (möglichst tief)

4.6 Surface plasmon resonance (SPR)

- Nachweis von Adsorption von Molekülen auf Metalloberflächen (Au oder Ag) - an der Grenzfläche von Metall und Flüssigkeit breitet sich eine elektromagnetische Oberflächenwelle (Plasmon) aus welche empfindlich auf Adsorption von Moleküle auf der Oberfläche reagiert - Bestimmung von Bindungskonstanten: durch zwei dynamische Messungen., 1. von (Assoziationsrate bei der Zugabe der Spezies),, 2. voff (Desorptionsrate bei Zugabe von reinem Puffer) � KD=voff/von

unteres Bild, Phasen: 1. Basislinie (ohne Protein) 2-3. Antigenadsorption bis zur Sättigung und auswaschen von Überschuss 4-5. Bindung von Antikörpern bis zur Sättigung Steigung am Anfang: von 6. Puffer ohne Ak � Desorption Steigung am Anfang: voff 7. Desporption höher affiner Ak

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4.7 Durchflusszytometrie

- Zellpopulationen identifizieren und isolieren - es werden feinste Tröpfchen generiert (höchstens 1 Zelle) - diese wandern durch verschiedene Detektoren - je nach Messwert werden die Zellen unterschiedliche geladen - durch Ablenkplatten werden sie in die entsprechenden Gefässe gelenkt Mögliche Detektoren: - Streulicht-Detektoren (Grösse, kleine Zellen streuen mehr seitwärts als vorwärts!) - 1 – 6 Fluoreszenzlicht-Detektoren B- und T-Lymphozyten: je ein spezifischer Ak mit bestimmter Fluoreszenz anlagern � Durchflusszytometrie

4.8 Proteinsequenzanalyse

4.8.1 Allgemeines

- Bestimmung der Proteinsequenz über die Nukleinsäuresequenz ist einfacher - Gründe für die direkte Proteinsequenzanalyse: - posttranslationale Modifikationen nachweisen

- gesamte Primärstruktur muss bekannt sein damit die Raumstruktur und die Funktion des Proteins bestimmt werden kann

- Wichtigste Methoden: Edman-Abbau und MS (HPLC + Elektrospray-Ionisation) - Hilfstechniken welche die Bestimmung der Sequenz erleichtern: Aminosäurenzusammensetzung und Bestimmung der N- und C-terminalen Aminosäuren - Prokaryoten: keine Introns, kein posttransl. Modifikationen 1. Edman-Abbau oder MS für eine kurze Sequenz von ca. 15 AS 2. mRNA komplementäre Sonde benutzen und mRNA isolieren 3. mRNA mittels PCR amplifizieren und sequenzieren 4.8.2 Aminosäurenanalyse

- Bestimmung der prozentualen AS-Zusammensetzung - daraus lässt sich auf das Protein schliessen - dient als Entscheidung für Proteasenwahl für die Fragmentierung

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4.8.3 Edman-Abbau

Ablauf: - Disulfidbrücken brechen - verschiedene Ketten des Proteins trennen und aufreinigen - AS-Zusammensetzung bestimmen - Kette in Fragmente aufbrechen, trennen und aufreinigen - Sequenz jedes Fragmentes bestimmen - Nochmals spalten mit anderen Fragmentierungsmuster, aufreinigen und Sequenz bestimmen - Gesamtsequenz des Proteins konstruieren - Spaltung: spezifisch spaltende Enzyme Edman-Abbau: - Prinzip: Protein an Oberfläche adsorbieren, N-Ende des Proteins derivatisieren, abtrennen und mittels Chromatographie oder Elektrophorese analysieren, - Derivatisierungsreagenz: Phenylisothiocyanat (reagiert mit der Aminogruppe) - Probleme: nur 30-40 AS (Ausbeute eines Abbaus: 95%), wenn N-Ende chemisch blockiert oder im Innern des Proteins ist, Protein muss rein sein, gewisse AS werden durch die Reaktionsbedingungen degradiert, Positionen der Disulfidbrücken kann nicht bestimmt werden.

4.9 Photometrischer DNA-Nachweis

4.9.1 Unspezifischer DNA-Nachweis

Absorptionsmessung bei 260nm: nicht sehr empfindlich, reicht aber für Konzentrationsbestimmung Fluoreszenzmessung: - Ethidiumbromid: interkaliert die doppelsträngige DNA, lagert sich zwischen die DNA - SybrGreen: sensitiver und weniger mutagen als Ethidiumbromid 4.9.2 Spezifischer Nachweis: Real-time PCR

- auch quantitative PCR oder qPCR - sehr hohe Sensitivität - normale PCR: Endpunktmethode (Sichtbarmachung mit unspezifischem Reagenz nach der Amplifikation - qPCR: nach jedem Zyklus die Menge bestimmen - vom Kurvenverlauf kann auf die Anfangskonzentration zurückgeschlossen werden - Idealfall: Verdoppelung der DNA nach jedem Zyklus (N = N0 * 2

n) - Praxis: N = N0 (1+E)n, E = Effizienz, bei gut optimierter PCR: E = 0.9, E nimmt gegen Ende der PCR ab

- Quantifizierung: in der exponentiellen Phase - Ablauf: Probenentnahme (interner Standard hier rein), RNA-Extraktion, Reverse Transkriptase, qPCR

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4.9.2.1 Detektion - qPCR enthält die selben Komponente wie eine normale PCR (Taq-Polymerase, Nukleotide, MgCl2, 2 Primer, Tempalte (Analyt-Lösung mit gesuchter NA)) - zusätzlich bei der qPCR: Fluoreszenzsonde („Probe“) ! (erlaubt das Monitoring der NA) Taqman Probes: - bestehend aus Reporter-Farbstoff, sequenzspezifisches Oligonucleotid und Fluoreszenzquencher - Taqman-Probe lagert sich an die Sequenz - Quencher blockiert die Fluoreszenz des Reporter-Farbstoffes (solange der Quencher da ist) - während der Elongation (DNA-Synthese an den Einzelstrang) wird der Quencher durch die Taq-Polymerase abgespalten - ist der Quencher nicht mehr da leuchtet das Ding (Fluoreszenz) - Anzahl der ungequenchten (leuchtenden) Reporter ist gleich der Anzahl Amplikons Interkalationsfarbstoffe: - Sybr-Green - Fluoreszenzsignal ist proportional zur Gesamtmenge doppelsträngiger DNA FRET Probes: - Donor-Farbstoff absorbiert das Licht und fluoresziert bei einer Wellenlänge - Akzeptor in der Nähe: Akzeptor fängt Anregungsenergie vom Donor auf und fluoresziert bei seiner spez. Wellenlänge! - bei der Anlagerung der Primer kommt der Donor und Akzeptor zusammen und es kommt zum vorher beschriebenen Phänomen � Messen vor der Elongation 4.9.2.2 Eichkurven und Standards Externe Eichkurve: - Verdünnungsreihe bekannter Konzentration machen und messen (amplifizieren) - Threshold Cycle (ct) festlegen, bestimmtes Grenzsignal - ct gegen log(c) auftragen

Interne Standards: - bekannte Menge einer zweiten NA-Sequenz in die Probe geben (bereits am Anfang!) - IS wird ebenfalls amplifiziert und mit anderem Farbstoff detektiert - IS vor allem wenn eine Reverse Transkriptase (Ausbeute: 10-30%) beteiligt ist - Auswertung mit der ∆c-Methode kompetitive Standards: - ähnliche Sequenzen wie das Target (gleiche Primer, gleiche Länge, unterschiedliche Probes) � bilden das Target sehr gut nach - Nachteil: Konkurrenz um dieselben Primer � bei stark unterschiedlichen Ausgangsmengen kann das Resultat verfälscht werden nicht-kompetitive Standards: - separate Primer � keine Konkurrenz - Verlauf der Target-Amplifikation wird weniger gut nachgebildet Multiplex-PCR: - mehrere Zielsequenzen gleichzeitig suchen - jede Sequenz hat ein individuelles Primer-Paar und Probes mit verschiedenen Farbstoffen - ab drei Fluoreszenzfarben: Spektren überlappen � Farbkompensation nötig

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4.9.3 Schmelzpunktanalyse

- Smp.: Doppelsträngige DNA � DNA-Einzelstränge - Smp. ist abhängig von dem Basenanteil A/T : G/C � spezifisch für bestimmte Sequenzen - Fluoreszenz von FRET-Komplex oder SybrGreen nimmt beim Schmelzen drastisch ab

Mutationssuche: - Ankersonde: Hybridisierungssonde welche sich an den nicht mutierten Teil setzt - Mutationssonde: setzt sich auf den evtl. mutierten Teil - löst sich die Mutationssonde bei tiefer Temperatur � Mutation vorhanden! 4.9.4 Warum PCR statt nur Immunoassays

- der Virus ist zuerst im Plasma (Nachweis mittels PCR) - die Antikörper nehmen erst später zu (Nachweis mittels Immunoassay) - Zellmessungen sind noch später möglich! - am Schluss befinden sich wieder mehr Viren im Plasma (PCR)

4.10 Microarrays

- viele Einzelnachweise mit geringer Probenmenge - Prinzip: - verschiedene Spots mit unterschiedlichen Oligonukleotiden auf dem Array - Zugabe der fluoreszenzmarkierten Probe - bei 100% Übereinstimmung (komplementär) erfolgt eine Bindung - Ungebunde mit Puffer weg waschen - Detektion der Fluoreszenz (dort wo sie gebunden haben!) 4.10.1 Anwendung

Funktionsanalyse - Genomsequenz mit den Auswirkungen auf den Organismus zusammenbringen - Microarrays welche mRNA detektieren Diagnostik - Erkennen von Anzeichen für verschiedenen Krankheiten welche auf den Genen enthalten sind - Drug Response (nicht alle Menschen reagieren gleich), Ursache suchen - spez. Krankheitsdiagnose 4.10.2 Detektionsmethoden

- Konfokales Scanning: - Anregungsstrahl scannt die Array-Oberfläche via Scan-Spiegel - Fluoreszenz-Signal läuft durch das Spiegelsystem zurück und wird zum Detektor umgelenkt - Lochblende: verbessert Tiefenschärfe - Planare Wellenleiter (totale interne Reflexion des Anregungslichts im Wellenleiter) - Fluoreszenz-Imaging - Oberflächen-Plasmonresonanz

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4.11 Fluoreszenz IN-situ Hybridisierung

- FISH - Wo befindet sich ein bestimmtes Gen? - Prinzip: Paarung von Fluoreszenz markierter Sonden-NA und gesuchte NA - Sonden-NA: meist DANN (leichter handhabbar als RNA) - Echtzeitverfolgung nicht möglich, da Zelle zuvor fixiert werden muss (Formaldehyd) - Vorgehen: Denaturieren (Fixierung), Hybridisierung, Auswaschen von überschüssigem Farbstoff, mikroskopieren - Bsp. Mensch: Gendefekte mit Mehrfarben-Karyogramm finden

4.12 DNA-Sequenzierung

4.12.1 Begriffe

- de novo sequencing: Entschlüsselung neuer DNA - resequencing: Unterschiede zu einer „Referenz“-Sequenz der gleichen Spezies sind entscheidend - consensus sequence: „Referenzsequenz“, Sequenzen die bei der Sequenzierung mehrerer Proben am meisten vorkommt - contig: überlappende „Reads“ aus welchen beim Shotgun Sequencing die Original-DNA-Sequenz bestimmt werden kann - offener Leserahmen (ORF): Teil der DNA-Sequenz zwischen Start und Stopp-Codon 4.12.2 Vorbereitende Schritte

1. DNA-Isolierung und Aufarbeitung 2. Fragmentierung der DNA (Restriktionsverdau, Ultraschall, Nebulisierung) 3. Klonierung in Vektoren 4. Vervielfältigung (Bakterienwachstum oder PCR) und neue Aufreinigung 4.12.3 Sequenzierungsreaktion: Didesoxymethode nach Sanger

Reagenzien: - einsträngige DNA - vier Desoxy-Nucleotide (dNTP) - vier farbstoffmarkierte Didesoxy-Nucleotide (ddNTP) (geringere Menge als dNTP) - DNA-Polymerase - Primer (startet die Reaktion) Grundschritte: - denaturieren - Aufbau eines Gegenstrangs (und Einbau der ddNTP’s (kein OH am 3‘-C � Abbruch des Aufbaus) - Elektrophorese (Kapillar-Elektrophorese) Radioaktiv markierte ddNTP’s: es müssen vier separate Reaktionen, mit jeweils einem ddNTP, durchgeführt werden 4.12.4 Pyrosequenzierung

- Sanger-Methode: bis ca. 500 Nucleotide (begrenzt durch Auflösung der Kapillar-Elektrophorese) - Pyrosequenzierung: besser! - Prinzip: die Polymerase wird direkt bei dem Aufbau des Gegenstrangs beobachtet. Jedesmal wenn ein Nucleotid eingebaut wird sieht man einen Lichtblitz (durch Luziferase). Durch kontrollierte Zugabe von jeweils nur einem dNTP kann bestimmt werden welches eingebaut wurde. Durch Waschen dazwischen kommt es zu keiner Vermischung. Beim Einbau des gleichen dNTP’s nacheinander wird das Signal intensiver.

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5 Massenspektroskopie

5.1 Allgemeines

Aufbau: - Ionenquelle - Massenanalysator - Detektor Ionenquellen: - EI: Elektronenstoss-Ionisation (viele Fragmentierungen) - FAB: Fast atom bombardement (viele Fragmentierungen) - ESI: Elektronenspray-Ionisation - MALDI Massenanalysator: - Quadrupol - Magnetfeld - Flugzeitanalysator (TOF) - Ion Trap Detektor: - SEV: Sekundärelektronenvervielfacher - MCP: Vielkanalplatte Hauptprobleme in der Proteinanlytik: - Protein in Gasphase überführen und ionisieren ohne viele, unkontrollierte Fragmentierungsreaktionen - daher: schonende Methoden wie MALD und ESI - es braucht eine hohe Auflösung (R=m/∆m), wobei ∆m = Halbwertsbreite eines Peaks (MALDI) oder Abstand zweier Peaks welche durch ein 50%-Tal getrennt sind (Quadrupol-MS)

5.2 MALDI

- Probe wird in das Kristallgitter einer Matrix eingebaut - Bestrahlung mit Laserpulsen: Energie wird in von den Matrix-Molekülen absorbiert und rasch an das Festkörpergitter weitergegeben � Verdunstung an der Oberfläche � intakte Überführung der Analytmoleküle in die Gasphase, Protonentransfer von angeregten Matrixmolekülen � positive Ladung - Matrixmoleküle: kleine aromatische Moleküle mit einer Carboxy-Gruppe oder IR-Absorber mit Carboxy-Gruppe - Wichtig: Analyt frei von Salzen (Puffer), da diese die Kristallisation stören � Entsalzung mit RP-Chromatographie 5.2.1 TOF

- Time of Flight - t=(m/(2zeU)1/2 L (alles kontant ausser m und z) - einfachste Methode: lineares Flugrohr - Reflotron-TOF: kann unterschiedliche Startenergie der Teilchen korrigieren 5.2.2 Molekülmassen-Bestimmung

- bei Peptiden erscheint fast nur (M+H)+ - bei grösseren Proteinen auch (M+2H)2+, (M+3H)3+ und (2M+H)+ - Durchschnittsmasse: Summe aller gemittelten Atommassen (oft angegeben bei grösseren Proteinen) - Monoisotopische Masse: Masse des häufigsten Isotops

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5.2.3 Peptid-Sequenzierung mit MALDI

- nur für kleine Peptide (15-20AS), da sonst zu komplex - schnelle Methode - modifizierte Edman-Reaktion bei welchem der Abbau unvollständig stattfindet � Gemisch aller Peptid-Reste � Analyse mit MALDI 5.2.4 PAGE + Scanning-IR-MALDI

- Polyacrylamid-Gelelektrophorese machen - Übertragung der aufgetrennten Proteine auf PVDF-Membran und Inkubation mit Matrixlösung - Scannen von der Oberfläche � Zuordnung der Masse zu den Banden

5.3 Elektronenspray-Ionisation (ESI)

- kontinuierlicher Ionoisierungsprozess - bei der Methode trennen sich geladene Tröpfchen am Ende der Elektrophorese-Kapillare - beim verdunsten des Lösungsmittels erhöht sich die Ladungsdichte � Zerfall der Tröpfchen - der Prozess wiederholt sich bis LM-freie, geladene Analyt-Monomere übrigbleiben - kein TOF als Analysator da kontinuierlich gearbeitet wird, oft Quadrupol und ion trap 5.3.1 Molekülmassen-Bestimmung

- charakteristisch für das Sepktrum: eine Serie von geladenen Ionen die sich durch eine Ladung (ein Proton) unterscheiden ((M+H)+, (M+2H)2+, (M+3H)3+,…) - Intensität: abhängig vom Puffer und pH-Wert, bei kleinen Molekülen ist der (M+H)+ am intensivsten, bei grösseren sind höher geladene viel intensiver - mit Quadrupol nur bis 4000 Da � die Proteinmasse kann nicht direkt bestimmt werden � rechnerische Rekonstruktion der Hypermass aus den Abständen der Ionenpeaks 5.3.2 Sequenzierung von Peptiden mit ESI-MS

- Triple-Quadrupol-MS - 1. Quadrupol: m/z-konstant - 2. Quadrupol: Fragmentierung - 3. Quadrupol: m/z-scanning

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6 Laborautomation

Entscheidungsfaktoren: - Probendurchsatz - Gerätefehler - Strategische Ausrichtung des Labors - Kundenfreundlichkeit und erhältliche Laborautomaten Die Kosten für eine Analyse setzen sich zusammen aus: - Lohnkosten - Consumable-Kosten - Geräte-Abschreibung - Service-Kosten