Instrumentelle Bioanalytik - mab.blt.kit.edumab.blt.kit.edu/vorlesungsdaten/ScaleupTechBio/Bioanalytik_Vorlesung_07.pdf · Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen

Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen

Instrumentelle Bioanalytik

29.01.2012


7. Mikroskopie

7.1 Einführung

7.2 Lichtmikroskopie

7.3 Fluoreszenzmikroskopie

7.4 Konfokal-Mikroskopie (CLSM)

7.5 Elektronenmikroskopie

7.6 Rasterkraftmikroskopie

7.7 Optisches Rasternahfeldmikroskop

7-1



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7. Mikroskopie

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7.1 Einführung

1600 Drebbel 1. MikroskopKepler (erstes M. mit 2 Sammellinsen), Hooke, Leeuwenhoeck, Malpighi

1890 Abbe Theorie1913 Lehmann, Prowazek Fluoreszenz1941 Zernike Phasenkontrast Nobelpreis1955 Nomarski DIC1957 Minsky Konfokal1982 Binning, Rohrer STM Nobelpreis1986 Binning, Gate, Gerber AFM1990 Hell 4Pi

Historie

Antonie van Leeuwenhoeck, 1660

275 fach, 1,3 mm

historische Lichtmikroskope

verbessertes Design,John Yarwell, 1680

erste Zeichnungenvon Bakterien

Lichmikroskop von RobertHooke (mit 2 Linsen)(Zeichnung von Korkzellen)



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7.1 Einführung

Der kleinste noch auflösbare Abstandzweier Punkte ist etwa halb so groß wiedie Wellenlänge der verwendetenelektromagnetischen Strahlung.Bei einer Wellenlänge vonλ = 400 - 700nm (sichtbarer Lichtbereich) entspricht dieses einem Abstand vonca. 200 – 350 nm bzw. ca. 0.2 - 0.35 μm.

Größe von biologischen Strukturen

vs. Auflösung



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7.2 LichtmikroskopieStrahlengang (vereinfacht)

Objekt zwischen 0 und f :Virtuelles Bild seitenrichtig

Objekt zwischen f und 2f :Reelles Bild das auf dem Kopf steht



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a bezeichnet den halben Öffnungswinkel zwischen Präparat undObjektiv. Das Auflösungsvermögen des Lichtmikroskops ist imWesentlichen abhängig von der Wellenlänge des verwendetenLichtes und dem Winkel a.Eine Verringerung des Arbeitsabstandes vergrößert denÖffnungswinkel. Für eine optimale Auflösung sollte der Winkel aso groß wie möglich sein (im besten Fall ungefähr 70°).Immersionsöl erhöht den Brechungsindex n zwischen Objekt undObjektiv.

Immersionsöl

Steigerung des Öffnungswinkels ( a ) durch Verwendung vonImmersionsöl. Gezeigt sind die Strahlengänge dreier engbenachbart liegender Punkte eines Objektes (1, 2 und 3), diebei Verwendung von Immersionsöl aufgelöst werden (rechts).Ohne Immersionsöl (links) werden die Strahlen 2 und 3 an derGrenzfläche zwischen Deckglas und Luft gebrochen

Erhöhung der Auflösung durch Ölimmersion

d: Abstand zwischen zwei PunktenA: numerische Apertur (NA)n: Brechzahl des Mediums zwischen Deckglas und Objektiv .

Vergößerung Auflösung

Typische ObjektiveBillig: Apertur 0.1 Auflösung 2,75μmHochwertig: Apertur 0,65 Auflösung 0,42μmÖl: Apertur 1,4 Auflösung 0,20μm



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Kontraststeigerung (1): Hellfeld Dunkelfeld

Hellfeld:

Kreisförmige BlendeTransmission

Dunkelfeld:

Ringförmige BlendeSichtbar sind Umrisseund Beugung

Kutikulapräparation eines Embryos vonDrosophila melanogaster, etwa 22h alt

[http://de.wikipedia.org/]



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Prinzip

1) Abschattung durch Ringblendevor Eintritt in Objekt

2) Phasendrehung durch λ/2 Plättchennur des Objektlichtes

3) Mischung Objektlicht und Direktlicht

(Interferenz)

Kontraststeigerung (2): Phasenkontrast-MikroskopPhasenverschiebung beimDurchgang durch ein Objekt mitanderem Brechungsindex alsdas umgebende Medium



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Phasenkontrast-Mikroskop

Depending upon the configuration and properties of the phasering positioned in the objective rear focal plane, specimens canbe observed either in positive or negative phase contrast.

http://www.microscopyu.com/tutorials/java/phasecontrast/positivenegative/index.html

(S) surround wave(D) diffracted wave(P) resulting particle wave



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Prinzip: Methode nutzt die Unterschiede in der optischen Weglänge im betrachteten Objekt und stelltdiese als Helligkeitsunterschiede im Mikroskopiebild dar. Dadurch können transparente Objekte sichtbargemacht werden. Das Bild entspricht der lokalen Änderung (Gradient) des Brechungsindex der Probe(daher die Bezeichnung "differentieller" Bildkontrast).

Auflicht: Bildkontrast gibt die Änderungen der Oberflächenmorphologie wieder.

Durchlicht: plastische Bilder des Objekts.

Differentieller Interferenzkontrast, DIC von engl. differential interference contrast

Kontraststeigerung (3): Differenzial-Interferenzkontrast / DIC-Mikroskop

Strahlengang der DIC-Mikroskopie

[http://de.wikipedia.org/wiki/Differentialinterferenzkontrast]



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Kontraststeigerung: Differenzial-Interferenzkontrast



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7.3 Fluoreszenz-Mikroskopie

Beispiel:Triple-Fluorescence-labeledendothelial cells:

Red: Actin-Filamentslabeled with Phalloidin

Green: Membranes (DiO-C6)

Blue: Nuclei (DAPI-stainingof DNA)

4′,6-Diamidin-2-phenylindol



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Epifluoreszenzmikroskopie (Auflichtfluoreszenzmikroskopie)

fluoreszenzmikroskopisches Verfahren, bei dem die Fluoreszenz aufderselben Seite nachgewiesen wird, von der aus die Anregung erfolgt.Dieses Verfahren funktioniert analog zur Reflexionsmikroskopie, bei derebenfalls Anregung und Nachweis in derselben Halbebene bezüglich desPräparates stattfinden.Im Gegensatz dazu finden in der TransmissionsfluoreszenzmikroskopieAnregung und Nachweis in verschiedenen Halbebenen statt.




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Anregungslichtquellen

[http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/basics/fluorescence.html]




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http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/Tutorials.html

Anregung

Farbstoffe (Fluoreszenzsonden) (1)

Emission




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[http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/Research-Tools/Fluorescence-SpectraViewer.html]

Farbstoffe (Fluoreszenzsonden) (2)

interaktiv




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Epifluoreszenzmikroskopie

Filterselektion – Kombination von Filtersets zwecks Optimierung




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Chemically Modified TIRF slides andTIRF Microscopy lightguides

Principles of TIRF

TIRF Microscopy (TIRFM)

7. Mikroskopie 7.3 Fluoreszenz-Mikroskopie

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20.12.2011

7. Mikroskopie

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7.4 Konfokal-Mikroskopie

Problem der konventioneller Mikroskopie:Licht, welches von außerhalb des Fokuspunktes kommt(unterhalb bzw. darüber) gelangt ebenfalls zum Detektor verschwommener Fleck, der die Qualität des Bildesherabsetzt.

Lösung: Einsatz einer Lochblende:

Hintergrundsignal ebenfalls fluoreszierender Bestandteileaus höher oder tiefer liegenden Schichten des Präparatswird ausgeblendet.

Durch Scannen übereinander liegender Schichten undanschließende Rekonstruktion der so gewonnenenEinzelbilder können dreidimensionale Bilder erstelltwerden. Tiefenauflösung 0,8 mm, abhängig vonLochblendendurchmesser

Hohe Anforderungen

Laser mit intensiver, kohärenter und paralleler Strahlung

Ergebnis:

sehr schafes Bild ohne Unschärfe (Auswaschungen)

etwas höhere Auflösung als konventionelleEpifluoreszenz-Mikroskopie.

Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM)



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Zelle mit Teilungsapparat

7.4 Konfokal-Mikroskopie

Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM)

Epifluoreszenz

vs Konfokal

Leica Confocal Microscope TCS SP2:Monochromator in front of the detectorAOBS: Acousto-Optical Beam Splitter (instead of dicroic mirror)META System of Zeiss: 32 PMT-detectors every 10.7 nm(400 – 720 nm): simultaneous wavelength analysis.

Spectral Imaging Confocal Microscopy (with Emission Curve Analysis)

lambda-stack



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Prinzip

Abbildung eines Objektes mit Hilfe vonElektronen(strahlen).

Vorteil: schnelle Elektronen (als Materiewelle)besitzen eine sehr viel kleinere Wellenlänge alssichtbares Licht

höheres Auflösungsvermögen

derzeit realisiert: etwa 0,1 nm

Nachteile:

elektronenoptische Bauteile besitzen hoheAberrationen (Abbildungsfehler) nutzbare Auflösung fast um 2 Größen-

ordnungen kleiner als Elektronenwellenlänge(100 keV 0,0037 nm)

Elektronenmikroskopischen Daten (Bilder) werdenoftmals falsch „interpretiert“ (digitaleBildverarbeitung)

(Aufwändige) Probenpräparation kann zuArtefakten führen.



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Instrumentation

Elektronenquelle:Erzeugung von freien Elektronen (Glühkathode) und Beschleunigung dierElektronen durch eine um die Strahlachse liegenden Anode. Die Spannungzwischen Kathode und Anode bestimmt die Energie der Elektronen undliegt je nach Mikroskop zwischen wenigen Kilovolt bis zu 3 Megavolt.

Elektronenlinsen, die die Flugbahnen der Elektronen ablenken können.Meist werden magnetische Linsen verwendet, zum Teil auchelektrostatische. Elektronenlinsen haben die gleiche Funktion wieGlaslinsen im Lichtmikroskop. Während die Brennweite der Glaslinsen festliegt, ist sie bei Elektronenlinsen regelbar.Neben Linsen kommen wie beim Lichtmikroskop auch Blenden zumEinsatz.

Vakuumsystem: notwendig für effiziente Erzeugung einesElektronenstrahls; verhindert die Kollision der Elektronen mitGasmolekülen.

Objekthalterung: garantiert stabile Lage des Objekts.Darüber hinaus sind oft Manipulationsmöglichkeiten erwünscht, von denenje nach Art des Objekthalters unterschiedliche Kombinationen realisiertwerden: Verschiebung, Drehung, Kippung, Heizung, Kühlung, Dehnung.

Detektoren, die die Elektronen selbst oder sekundäre Signaleregistrieren.

Mikroskopsäule (engl. column) bildet den Rahmen für alleelektronenoptischen Bauteile, schirmt in der Regel magnetisch ab, um dieEinflüsse äußerer Magnetfelder auf die Messungen abzuschwächen, unddichtet das im Inneren aufrecht zu erhaltende Vakuum ab.


Strahlengang und Anordnung der Linsen imTransmissionselektronenmikroskop (TEM) imVergleich zum Lichtmikroskop (LM)



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Aufnahmetechniken (Bilderzeugung)

Ruhebildmikroskopie:

Objektbereich wird mit einem feststehenden, breitenElektronenstrahl bestrahlt. Das Bild wird hier erzeugt,indem ein Teil der vom Objekt ausgehenden Elektronen zurBilderzeugung mittels eines elektronenoptischen Systemsverwendet wird.Wichtig ist, dass die Elektronen im Objekt - anders als Licht – auchstark inelastisch gestreut werden und Energie verlieren.Generell kann der Ruhebildmodus nur genutzt werden, wenn nachder Wechselwirkung des Elektronenstrahls mit dem Objekt genügendElektronen mit einer hinreichend schmalen Energieverteilung zurVerfügung stehen und gleichzeitig nicht zu viele Elektronen mitabweichenden Energien auftreten. Dies ist nur für hinreichend dünneObjekte gegeben.


Rasterelektronenmikroskopie

REM bzw. SEM (scanning electron microscop)

Mit Hilfe eines elektronenoptischen Systems elektromagnetischer und elektrostatischer Linsen wird einfeiner Elektronenstrahl erzeugt, der zeilenweise über den zu untersuchenden rechteckigenObjektbereich geführt wird („gerastert“). Das Bild kommt dabei durch die synchrone Registrierungeines vom Elektronenstrahl ausgelösten oder beeinflussten Signals zustande.

Elastische Streuungeines Elektrons innerhalbeines Atoms

Wechselwirkungsvolumen inkompakten Proben in Abhängigkeit vonder Beschleunigungsspannung und derOrdnungszahl (Z)



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Aufnahmetechniken (Geometrie)

Transmission:

Die schnellen Strahlelektronen werden nach Durchgang durchdas Objekt zur Bilderzeugung verwendet werden, wobei in derRegel nur sehr kleine Streuwinkel erfasst werden.Transmissionselektronenmikroskope (TEM) arbeitenmeistens nach der Ruhebildmethode.

Gelegentlich wird auch die Rastermethode angewendet: Raster-Transmissionselektronenmikroskop (STEM, „scanningtransmission electron microscopy/microscope“).

Die untersuchten Objektbereiche müssen sehr dünn sein(man spricht von Elektronentransparenz, für heute üblicheBeschleunigungsspannungen bzw. Elektronenenergien: maximal einige100 nm Dicke für sehr grobe Auflösung, typisch unter 100 nm Dicke; fürHochauflösung maximal einige 10 nm).


„Reflexion“

Werden zur Bilderzeugung hauptsächlich andere Signale als die transmittierten Elektroneneingesetzt, so gibt es dafür keine feststehende Bezeichnung.

Die benutzten Signale sind meist Sekundärelektronen, seltener Rückstreuelektronen.Will man kompakte Objekte untersuchen, so ist dies die einzige Möglichkeit.

In der Regel kann hierfür nur mit Rasterverfahren (s. o.) gearbeitet werden.



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TEM (Transmissionselektronenmikroskopie)

Die Elektronen durchstrahlen das Objekt, das zu diesem Zweckentsprechend dünn sein muss ( Probenpräparation). Je nachOrdnungszahl der Atome, aus denen das Objekt besteht, der Höhe derBeschleunigungsspannung und der gewünschten Auflösung kann diesinnvolle Objektdicke von wenigen Nanometern bis zu einigenMikrometern reichen. (biologische Proben: meist 80 – 120 keV, ≤ 100 nm)

In der zu untersuchenden Probe werden die Elektronen gestreut, das heißt ihreBewegungsrichtung ändert sich. Teilweise verlieren sie dabei auchBewegungsenergie (inelastische Streuung). Elastisch gestreute Elektronen, die dasObjekt unter demselben Winkel verlassen, werden in der hinteren Brennebene derObjektivlinse in einem Punkt fokussiert.

Man kann nun in dieser Ebene mit einer Blende (Objektivblende beziehungsweiseKontrastblende) nur die Elektronen passieren lassen, die nicht gestreut wurden. DaAtome mit höherer Ordnungszahl sowie dickere Objektbereiche stärker streuen, wird

der entstehende Kontrast Massendickenkontrast genannt. (Hinweis: sehr starkvereinfachte Betrachtungsweise der Bildgebung/entstehung). Dieser Kontrastermöglicht bei amorphen Festkörpern eine recht einfache Interpretation dererhaltenen Abbildungen.

Der Kontrast kristalliner Materialien folgt komplizierteren Gesetzmäßigkeiten und wirdals Beugungskontrast bezeichnet. Durch eine Änderung des Projektivlinsensystemskann anstatt des Zwischenbildes auch die Fokusebene der Objektivlinse vergrößertabgebildet werden. Man erhält so ein Elektronenbeugungsbild, mit dessen Hilfe sichdie Kristallstruktur der Probe bestimmen lässt.

Die Mikroskopie im Vakuum erfordert präparative Maßnahmen für das (biologische) Objekt (Fixieren,Einbetten, Einfrieren), damit es nicht durch Trocknungsartefakte zerstört wird



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TEM – Biologische Präparate

Ganze Zellen oder Gewebeteile werden in spezielle Harze eingebettet, um sie mit dem Ultramikrotom zuUltradünnschnitten (≤ 100 nm) zu verarbeiten.

Zellwandfragmente, Membranen, Hüllen von Organellen, Proteine und andere makromolekulare Strukturensind dünn genug. Ein kleiner Tropfen der Probe (2 – 5 ul) wird auf den Objektträger (Trägernetzchen, Grid)pipettiert und nach kurzer Zeit mit Filterpapier abgesaugt. Das noch feuchte Präparat wird durch Eintauchenin ein Kryogen eingefroren oder kontrastiert.

Fixierung – um die Probe realistischer darstellen zu können. Verwendet werden Glutardialdehyd zur Vernetzungund damit Verhärtung der Proteine und Osmiumtetroxid, welches Lipide schwarz färbt und gleichzeitig fixiert.

Präparationsverfahren (1) - Übersicht

Cryo-Fixierung – die Probe wird in flüssigem Ethan bei weniger als −135 °C schockgefroren. Dabei kristallisiert das Wasser nicht, sondern bildet vitrifiziertes(glasartiges) Eis. Bei dieser Methode wird die biologische Probe mit dergeringsten Artefaktbildung fixiert. Allerdings ist der Kontrast sehr gering.

Dehydratisierung – Wasser wird entfernt und schrittweise durch Ethanol oderAceton ersetzt.

Einbettung – um Gewebe sektionieren zu können. Hierzu werden meistAcrylharze genutzt.

Sektionierung – Aufteilen der Probe in dünne Scheiben (Ultradünnschnitte).Diese können auf einem Ultra-Mikrotom mit einer Diamant- oder Glasklingegeschnitten werden.

Färbung (Negative Stain) – schwere Atome wie Blei- oder Uran-Atomestreuen Elektronen stärker als leichte Atome und erhöhen so den Kontrast.Hier werden Reagenzien wie Uranylacetat oder Bleicitrat verwendet.

A: Probenhalter für KryoelektronenmikroskopieB: Trägernetzchen (3 mm )C: Kohlefilm mit Löchern



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Negativkontrastierung mit Schwermetallsalzen:

- einfache und schnelle Methode zur Darstellung von Proteinen, Proteinaggregaten und Membranen.- maximal nutzbare Auflösung von 1,0 bis 1,5 nm (entspricht Proteindomänen mit etwa 5 bis 15 AS)

Präparationsverfahren (2) - Negativkontrastierung

Schematische Darstellung der verschiedenen Kontrastierungsarten für die Abbildung von Makromolekülen im TEM.Die Kontrastierungen mit Schwermetall führen zu sehr unterschiedlichen Dichteverteilungen im EM-Bild und liefernjeweils andere Strukturinformationen. Nur bei der Einbettung der Proteine in (amorphes) Eis stammt der Kontrast vomObjekt selbst, sonst wird das die Moleküle umgebende oder eingelagerte Metall abgebildet.



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Gefrierbruch/Gefrierätzung (freeze etching)Intakte Gewebe oder Zellen werden eingefroren und im Vakuum geschnitten oder gebrochen; die Oberfläche wirddurch Sublimation des Eises freigelegt und mit einer dünnen Metallschicht (meist 1 - 2 nm Pt/C) unidirektionell odereinem Winkel von 20 – 60° bedampft und anschließend mit senkrechter Bedampfung mit 10 – 20 nm Kohlestabilisiert. Die anhaftenden biologischen Teile werden mit oxidierenden/ätzenden Flüssigkeit entfernt und derverbleibende Abdruck im Mikroskop betrachtet (Replikattechnik) ( 3D-Information von Oberflächen undaufgebrochenen Zellen)

Präparationsverfahren (3) – Bedampfung mit Schwermetallen

Direkte BedampfungVariante, zur Mikroskopie von isolierten Proteinen oder Membranen. Wie bei der Negativkontrasttechnik werden dieObjekte auf den Objektträgernetzchen adsorbiert und in der Kälte bedampft. Als kontrastierende Metalle werdenentweder Pt/C (1 – 1,5 nm) oder auch Ta/W (etwa 0,5 nm) verwendet

EM-Aufnahmen eines zweidimensionalenProteinkristalls (Oberflächenprotein des Bakteriums

Deinnococcus radiodurans) mit verschiedenenKontrastierung . Die Vergrößerungen stellenMittelungen über viele Einheitszellen dar.A: Bei Einbettung in amorphes Material (Eis) liefert dasProtein selbst den Kontrast und erscheint dunkel.B: Bei Negativkontrastierung erscheint das Protein hell,das Schwermetallsalz (Phosphorwolframat) hingegendunkel.C: Unidirektionelle direkte Bedampfung mit Metall(Ta/W) liefert zwei Ansichten, von der physiologischenInnen- bzw. Außenseite des Kristalls, die damit leichtunterschieden werden können.



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Das Rasterkraftmikroskop (AFM atomic force microscope) wurde1986 entwickelt/vorgestellt(durch Gerd Binnig, Calvin Quate und Christoph Gerber).

Wichtiges Werkzeug in der Oberflächenchemie, dient zur mechanischen Abtastung vonOberflächen und der Messung atomarer Kräfte auf der Nanometerskala.

Gehört zur Familie der Rastersondenmikroskopie (SPM, scanning probe microscopes), welcheOberflächen mit spitzen Sonden abtasten: Art der spezifischen Wechselwirkung der Sonde mit demObjekt bestimmt die Zugehörigkeit, z.B.

Optische Signale Rasternahfeldmikroskop (scanning near-field microscope, SNOM)Tunnelströme Rastertunnelmikroskop (scanning tunneling microscope, STM)

Mittlerweise sind über zwanzig verschiedene Messanwendungen für die Rastersondenmikroskopieanorganischer und organischer Proben entwickelt worden.

Oberfläche von Natriumchlorid (Kochsalz) mit demRasterkraftmikroskop im Nicht-Kontakt-Modus im Ultrahochvakuumaufgenommen. Man sieht die einzelnen Atome als Erhebungen bzw.Vertiefungen in dieser 3-dimensionalen Darstellung.(Messung: Center for Nanotechnology (CeNTech), Universität Münster,Deutschland)



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Kraft Kraftrichtung Reichweite

Kraft bei Kontakt derElektronenhüllen

abstoßend extrem kurz(≤ 0,1 nm)

Van-der-Waals-Wechselwirkungen

anziehend sehr kurz(wenige Nanometer)

elektrostatische WW anziehend/abstoßend kurz (nm bis um)

Kapillarkräfte(Sonde im Wasser)

anziehend weit (um bis mm)

Tab.Kräfte zwischenAFM-Sonde und Objekt

Wechselwirkungskräfte

Vorteile der AFM (bei biologischen Proben):

- Oberflächen können in Flüssigkeiten (unter physiologischen Bedingungen) abgebildet werden

- Signal-zu-Rausch-Verhältnis besser als bei Licht- und Elektronenmikroskopie

- Auflösung im Subnanometerbereich

- Probe wird bei Untersuchung nicht beschädigt bzw. Funktionsfähigkeit bleibt erhalten



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7.6 RasterkraftmikroskopieFunktionsprinzip

Abb. Schematische Darstellung des

Rasterkraftmikroskops.

Die auf einer Unterlage immobilisierte Probe wird

mit einem dreiachsigen piezoelektrischen Element

unter der Messspitze bewegt. Während dieser

Rasterbewegung wird die Verbiegung der

Blattfeder mithilfe eines Laserstrahles und eines

Photodetektors gemessen. Die

Spannungsdifferenz zwischen den oberen und

unteren Segmenten des Photodetektors

(V = (A + B) - (C + D)) ist dabei ein direktes Maß

für die Verbiegung der Feder.

Eine scharfe Messspitze (tip), die sich auf einem elastisch biegsamen Hebelarm (cantilever) befindet, wirdals Messsonde (probe) in geringem Abstand in einer Rasterbewegung über die Probenoberfläche geführt.Ein piezoelektrischer Scanner bewegt hierfür entweder die Spitze über die Probe oder die Probe unter derfeststehenden Spitze. Die Verbiegungen des Hebelarms, hervorgerufen durch Kräfte zwischen Probe(sample) und Spitze, werden hochaufgelöst gemessen, meist indem ein Laserstrahl auf die Spitzegerichtet und der reflektierte Strahl mit einem Photodetektor aufgefangen wird (Lichtzeigerprinzip). DieWW-Kräfte liegen typischerweise in der Größenordnung von 0,01 bis 100 nN und setzen sich ausrepulsiven und attraktiven Beiträgen unterschiedlicher Reichweite zusammen (siehe Tabelle).Ein wichtiges Element eines Rasterkraftmikroskops ist der Controller, der die Bewegung des Scanners undder Probe bzw. Spitze steuert sowie die Signale auswertet. Die Bedienung des Geräts wird erleichtert,wenn die Positionierung des Lasers und der Spitze durch ein lichtoptisches Mikroskop unterstützt werden.



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Abb. Die drei Modi der AFM:(a) Kontakt-, (b) Nicht-Kontakt- und (c) Intermittent-Modus

Das Rasterkraftmikroskop kann in verschiedenen Betriebsmodi betrieben werden. Die Betriebsmodi könnennach drei Systematiken geordnet werden, je nachdem

- ob eine Bildgebung erfolgt:bildgebendspektroskopisch

- welche Wechselwirkungen für die Messungen genutzt werden:Kontakt-ModusNicht-Kontakt-ModusIntermittierender Modus

- wie die Bewegung der Nadel geregelt wird:Constant-height-ModusConstant-force/amplitude-Modus

Funktionsprinzip - Betriebsmodi

Kontakt-ModusIn allen Kontakt-Messmethoden steht die Messspitze in direktem mechanischem Kontakt mit der zuvermessenden Oberfläche. Zwischen den Elektronenhüllen der Atome an der Oberfläche und der sie berührendenMessspitze entsteht dabei eine starke elektrostatische Abstoßung.

- ungeregelt: constant height mode (älteste Messmethode: Topographie aus Auslenksignal der Blattfeder)

- geregelt: constant force mode (in z-Richtung wird so nachgeregelt, dass die Kraft zwischen Probe und Spitzekonstant bleibt (langsamer, dafür schonender für die Probe)



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Funktionsprinzip – Betriebsmodi (2)

Nicht-Kontakt-Modus (NC-AFM) (non-contact, dynamic mode)Dynamischer Anregungsmodus. Federbalken wird durch ein zusätzliches Piezoelement resonant zur Schwingungangeregt (Schwingkreis). Wenn Kräfte zwischen Spitze und Probe auftreten, ändert sich die Frequenz des Schwingkreises Frequenzverschiebung ist Maß für Kraftwechselwirkung

Im (Ultra)Hochvakuum höchste Auflösung im Vergleich zu anderen Betriebsarten

Intermittierender Modus (intermittent mode, tapping mode)Ebenfalls dynamischer Anregungsmodus. Externe Anregung des Federbalken bei einer festen Frequenz nahe derResonanzfrequenz. WW-Kräfte zwischen Spitze und Probe verändern die Resonanzfrequenz des Systems, wodurch sich dieSchwingungsamplitude und die Phase (zwischen Schwingung und Anregung) ändern. Als Regelsignal wird meistens die

Amplitude genutzt, die über einen Regelkreis konstant gehalten wird, indem der Abstand angepasst wird.Bester Modus unter Umgebungsbedingungen und in Flüssigkeiten.



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Funktionsprinzip – Betriebsmodi (3)

Abb. Abbildungsverfahren

der Rasterkraftmikroskopie.

A Im Kontaktmodus ist die Spitze in ständigemKontakt mit der biologischen Probe und folgtdaher bei Hindernissen der Oberflächenstrukturder Probe, was zu Verbiegungen der Blattfederführt. Deshalb wird mithilfe einer Regelschlaufedie Kontaktkraft (Verbiegung der Feder) durchVerändern der Z-Position der Probe konstantgehalten. Aus dem Korrektursignal kann dannauf die Topographie der Probenoberflächegeschlossen werden.

B In dynamischen Abbildungsverfahren oszilliert die Blattfeder nahe ihrer natürlichen Resonanzfrequenz mit einerAmplitude von wenigen Nanometern. Somit wird das Objekt nur kurzzeitig berührt, wodurch seitliche Wechselwirkungenreduziert werden. Die Regelschlaufe wird in dynamischen Abbildungsverfahren dazu verwendet, die Amplitude der Oszillationkonstant zu halten.C Die seitliche Abtastrichtung der AFM-Spitze kann das biologische Objekt verformen. Dies kann durch die präziseEinstellung der Kontaktkraft, der Rastergeschwindigkeit und der Rückkopplungsparameter verhindert werden.D Zur Elastizitätsbestimmung wird die Spitze gegen ein weiches Objekt (z. B. Zellen) bewegt. Durch das Verhältnis vongefahrener Distanz und der tatsächlichen Federverbiegung lässt sich die Elastizität der des Objektes berechnen.



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Abb. Überlagerungseffekte zwischen Spitze und Probe können die AFM-Topographie verfälschen.

A Die Spitze kann aufgrund ihres endlichen Durchmessers sehr scharfen Kanten nicht folgen. Daher stellt die erhalteneTopographie (rote Linie) eine Überlagerung zwischen Spitze und Probe dar.

B In vielen Fällen kann die Periodizität von Strukturen unabhängig vom Spitzendurchmesser korrekt aufgelöst werden.

Wechselwirkung zwischen Spitze und Probe

Auflösungen bis in atomare Dimensionen erfordernbesondere Maßnahmen.

Wesentlicher Faktor ist die Dimension der Spitze; dieerreichbare Auflösung hängt von der Schärfe der Spitze undden Oberflächeneigenschaften des Objektes ab (diegemessene Topograhpie ist eine nichtlineare Überlagerung desuntersuchten Objektes mit der Spitze)

Biologische Objekte sind relativ weich

(Proteine können z.B. bei größeren Kontaktkräften denaturieren)

Abbildungsverfahren, Blattfedern undAbbildungsparameter (Rastergeschwindigkeit,

Rückkopplungsschleifen, Bildgröße) müssen optimiert werden.

Ionenkonzentration des Puffers ist so zu wählen, dassrepulsive (ca. 0,05 nN) und langreichweitige (mehrere nm)WW zustande kommen.

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Präparationsverfahren

Abbildung von biologischen Makromolekülen und Zellen erfordert keine Beschichtung oderMarkierung!

Probenvorbereitung erfordert lediglich die Immobilisierung auf dem Probenträger.

Kompromiss: gut verankertes Objekt (da nur in diesem Fall die genaue Position der Spitze über dem

Objekt bekannt ist) bei gleichzeitiger Minmierung der WW zwischen biologischen Objekt undObjektträger (um Denaturierung zu verhindern).

Probenträger: Glas, Glimmer, Graphit, metallisierte (z.B. Au-beschichtete) Oberflächen

Für hohe Auflösung: atomar flache Oberflächen notwendig

Proteine und Nucleinsäuren: Glimmer (Schichtsilikat) ist besonders geeignet (Kristallschichtenkönnen leicht gespalten werden, um chemisch relativ inerte und negativ geladene atomar glatteOberflächen zu erhalten).

Immobilisierungsstrategien:

Physikalische Kopplung: meist durch Abschirmung abstoßender elektrostatischer WW

( Makromoleküle in geeigneter Pufferlösung hoher Ionenkonzentration aufnehmen und auf frischgespaltene Glimmeroberfläche aufgeben)

Kovalente Verknüpfung: chemische Kopplung der Makromoleküle auf funktionalisiertenSubstratoberflächen (modifiziert mit reaktiven chemischen Gruppen)



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AFM biologischer Makromoleküle (1)

Oberflächenstrukturen und auch dynamische Prozesse verschiedenster biologischer Proben unternativen Bedingungen beobachtbar.

Objekte: Proteine, DNA, RNA, supramolekulare Komplexe, Bakterien, Zellverbände, Gewebehöherer Organismen.

Höchste Auflösung nur an isolierten Makromolekülen, die immobilisiert wurden; Zellen/Zellverbändemaximal nur bis 50 nm.

Hochaufgelöste Topographien zeigen nicht nureinzelne Membranproteine in ihrer nativen Umgebung,sondern auch Untereinheiten und Substrukturen

Abb. Cytoplasmatische Oberfläche der nativenPurpurmembran des Halobacteriums salinarum.A In der AFM Topographie ist ersichtlich, wie sicheinzelne Bakteriorhodopsinmoleküle zu Trimerenanordnen. Die Trimere wiederum ordnen sich zueinem hexagonalen Gitter an. Die Topographie derMembran wurde in physiologischer Pufferlösung beiRaumtemperatur aufgenommen.B Das Diffraktionsbild der gezeigten Topographiebeugt bis zur elften Ordnung (eingezeichneteKreise), was eine laterale Auflösung von 0,49 nmandeutet.C Die gemittelte Topographie (oben) und diedazugehörige Standardabweichung (unten) desBakteriorhodopsintrimers ermöglicht die strukturelleKorrelation zu Daten, welche mittels Elektronen-kristallographie erhalten wurden. Überlagert wurdender Umriss der Bakteriorhododopsinmoleküle sowiedie Positionen der sieben transmembranena-Helices (A–F).





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7. Mikroskopie

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Abb. AFM zur Bestimmung der Proteinanordnung und -funktion.

A Na+-getriebene Rotoren der F0F1-ATP-Synthase von Ilyobacter tartaricus. Die hohe Auflösung der Topographie ermöglicht es, dieStöchiometrie und Anordnung der Proteine eines funktionellen Rotors zu charakterisieren.

B Extrazelluläre Oberfläche der Kommunikationskanäle (gap junctions) aus Epithelzellen der Rattenleber. Die hexameren Proteine zeigeneinen offenen, zentralen Kanal. Das Mittel und die Standardabweichung (SA) lassen Einblicke in die Struktur und Flexibilität zu. Während dasProfil des Mittels den Kanaleingang erkennen lässt, ordnet die SA-Karte dem zentralen Kanal eine erhöhte strukturelle Flexibilität zu.

C In Anwesenheit von 0,5 mM Ca2+ (bei neutralem pH-Wert) schließen die Hexamere ihren zentralen Kanal. Dieser Vorgang wird imgemittelten Hexamer deutlich und die dazugehörige SA-Karte zeigt, dass der Kanaleingang im geschlossenen Zustand seine Flexibilitätverloren hat. Alle Topographien wurden in physiologischer Pufferlösung bei Raumtemperatur aufgenommen.

Struktur der FoF1 ATPase

Untereinheiten a, b, 3 a, 3 b und d bildenden Stator

Untereinheiten c, g, und e bilden den Rotator

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Dynamische Prozesse

Entscheidender Faktor: Aufnahmezeit für eine einzelne Topographie:

Konventionelles AFM: ein bis fünfzehn MinutenForschungsprototypen (ultraschnelle AFMs): Aufnahmezeit im Sekundenbereich (und kleiner)

Anwendungen für biologische Objekte/Fragestellungen

- DNS-Transkription- Proteindiffusion- Konformationsänderungen von Proteinen

Untersuchungen zur Elastizität

Mehrere Verfahren, z.B.

- Objekt wird gegen die AFM-Spitze gedrückt, wobei die Auslenkung der Blattfeder mit dem vomPiezoelement gefahrenen Weg in Beziehung gesetzt wird.- Dynamisches Abbildungsverfahren: Elastizität lässt sich aus der Phasenänderung derBlattfederoszillation ableiten.Problem bei biologischen Objekten (Zellen): Korrelation der Elastizitätsbilder mit strukturellenKomponenten, die mechanische Stabilität verleihen (z.B. Cytoskelett).





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7. Mikroskopie

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AFM einzelner Moleküle (1)

Sensitivität von AFMs liegt in der Größenordnung von wenigen Pikonewton

Messung der Stärke von biologischen und chemischen Bindungen möglich

Untersuchung des Verhaltens einzelner Moleküle unter mechanischer Belastung

Spezifische Sonden: (z.B.) Fixierung von Proteinen oder niedermolekularen Liganden an der Spitze.

KraftspektroskopieOrtsaufgelöste Detektion von spezifischen Bindungen und Bestimmung der zwischenmolekularenKräfte:

Proteine – Liganden

Proteine – Nucleinsäure

Antikörper – Antigene

zwischen Zellen

Abb. Kraftmessungen an einzelnen Molekülen: Dabei wird die Spitze zum Beispiel mit Liganden beschichtet und mitRezeptoren, welche an einen Probenträger gebunden sind, in Kontakt gebracht. Zur Bestimmung der molekularenBindungskräfte werden beide Oberflächen voneinander getrennt. Die Abrisskraft zwischen den Molekülen istgeschwindigkeitsabhängig und nimmt mit steigender Trennungsgeschwindigkeit zu. Die Trennung einzelner Moleküle lässtsich mit einer Zwei-Zustands-Energielandschaft beschreiben. Durch Trennen der Moleküle überschreitet man dieEnergiebarriere, welche den gebundenen (G) vom ungebundenen (U) Zustand trennt. Hierbei entspricht ΔG† derAktivierungsenergie, um die beiden Moleküle voneinander zu trennen, k0 der natürlichen Übergangsrate und Δx der Breitedes Potenzials. Aus der Geschwindigkeitsabhängigkeit der Abrisskraft können k0 und Δx ermittelt werden.



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7. Mikroskopie

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AFM einzelner Moleküle (2)

Bindungstyp Abrisskraft

Kovalente Bindung 1 nN

WW zwischen zwei Zellen 500 pN

Biotin-Avidin-Bindung 200 pN

Antikörper-Antigen-Bindung < 200 pN

Protein-Zucker-Bindung 100 pN

Protein/Protein- oder Protein-DNA-WW 10-50 pN

Wasserstoffbrücke wenige pN

Tab.Ungefähre Abrisskräftechemischer und biologischerBindungen(bei einer Ziehgeschwindigkeitvon etwa 500 nm/s)

Weitere Anwendungen der Kraftspektroskopie:

Messung der Elastizität von einzelnen Polysaccharid- oder Nucleinsäuresträngen

Kontrollierte Entfaltung von einzelnen Proteinen

Abb. Ein Proteinkonstrukt, welches aus mehreren(hier Immunoglobulin-27-)Domänen besteht, kannmit dem Rasterkraftmikroskop gestreckt werden.Dabei entfaltet jede Domäne in einem einzelnenSchritt und die Abrisskraft kann gemessen werden.Das charakteristische Sägezahnmuster in derKraftabstandskurve kommt dabei durch diesequenzielle Entfaltung der Domänen zustande.



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Adhäsion von Zellen / Wechselwirkung von Zellen (BioAFM)

[http://www.jpk.com/]



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Die chemische Kraftmikroskopie (chemical force microscopy, CFM )ermöglicht die nanometergenaue topographische und spezifischechemische Abbildung beliebiger Oberflächen. Dabei verwendetsie chemisch einheitlich modifizierte Sondenspitzen undverschiedene liquide Abbildungsmedien, so dass immer nur eineganz spezifische Wechselwirkung mit der Oberfläche auftritt.

Eine speziell aufbereitete Messsonde (Sondenradius kleiner 3 nm)der Rasterkraftmikroskopie wird mit einer einzigen chemischenEndgruppe, wie zum Beispiel –OH, –CH3, –CF3, –NH2 oder –COOHdicht belegt. Durch die nun chemisch einheitliche Oberfläche derSonde und durch die Verwendung von Wasser, gepuffertenLösungen oder Lösungsmitteln wie Hexadekan alsAbbildungsmedium wird erreicht, dass – im Gegensatz zurnormalen Rasterkraftmikroskopie – nur ganz spezifischeWechselwirkungen zwischen CFM-Sonde und der abzubildendenOberfläche auftreten. Damit wird eine chemische Selektivität derCFM-Sonde erzielt.

Chemische Kraftmikroskopie (CFM )

Die Stärke der an einem Ort der Oberfläche gemessenen spezifischen Wechselwirkung erlaubtRückschlüsse über die Dichte der spezifisch detektierten chemischen Endgruppen der Oberfläche. Beimzeilenweisen Abtasten der Oberfläche wird die chemische Sonde an jedem Messpunkt mit der Oberflächein Kontakt gebracht und wieder getrennt (Digitaler Pulsed Force Mode). Bei diesem physikalischenVorgang werden simultan die Stärke der Wechselwirkung, die Steifigkeit der Oberfläche sowie weiterechemische bzw. physikalische Größen bestimmt und jedem Bildpunkt zugeordnet.

Supplement



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7.7 Optisches Rasternahfeldmikroskop / SNOMEin optisches Rasternahfeldmikroskop (scanning nearfield optical microscope, SNOM, auch NSOM)umgeht die Auflösungsgrenze des optischen Mikroskops, indem es nur Licht auswertet, das zwischen einersehr kleinen (100 nm oder weniger) Nahfeldsonde und der untersuchten Probe ausgetauscht wird. Mit demoptischen Rasternahfeldmikroskop kann eine räumliche Auflösung von etwa 20 nm erreicht werden.

Rastersondenmethode, die Spitze wird ins Nahfeld der Probe gebracht und mittels eines Regelkreisesauf konstantem Abstand gehalten. Für Abstandsreglung gibt es mehrere Methoden:

- Prinzip des Rasterkraftmikroskopes- Scherkraft (engl. shear force, Resonanzänderung eines Schwingers, der die Spitze trägt)- Messen und Regeln des Tunnelstroms (Rastertunnelmikroskop, nur bei leitfähigen Proben)

Vorteilegegenüber den nichtoptischen Rastersondenverfahren: bekannte Kontrastmechanismen der konventionellenoptischen Mikroskopie genutzt können werden,Probe wird zerstörungsfrei untersucht.Nachteile des SNOM sind- die hohen Kosten, da zusätzlich das Rastersonden-Prinzip angewendet werden muss- Schwierigkeiten bei der Auswertung der erhaltenen Daten (Auftreten von Artefakten)- noch bestehende theoretische Probleme der Beschreibung der Kontrastentstehung

Übliche Abstände zwischen Spitze und Probe liegen bei 1–10 nm. DieNachführung der Spitze liefert ein topografisches Bild der Oberfläche,zusätzlich gewinnt man im Rasternahfeldmikroskop jedoch auch eineoptische Information der Oberflächenstruktur. Die optische Auflösunghängt von der Feinheit der Spitze ab und übertrifft diejenigeabbildender Lichtmikroskope um ein Vielfaches. „Kombi“ aus Raster(kraft)mikroskop und optischem Mikroskop

Supplement



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Auf beiden Bildern sind Kohlenstoff-Nanoröhren abgebildet.(A) Aufnahme mit einem klassischen Mikroskop(B) Aufnahme mit einem NahfeldmikroskopQuelle: http://www.schilbe.de/archiv/elektrik.htm

Vergleich klassisches Mikroskopund Nahfeldmikroskop

Betriebsarten (Modi)

Beleuchtungsmodus

Sammelmodus

7.7 Optisches Rasternahfeldmikroskop / SNOM

Supplement

http://www.schilbe.de/archiv/elektrik.htm



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7.7 Optisches Rasternahfeldmikroskop / SNOM

Abstandabhängigkeit (Nahfeldeinfluss)

Spitzentypen

aperturlose Spitzemit Aperturleitfähige Spitze

Supplement



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7. Mikroskopie

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7.7 SNOM

A 40 nm optical resolution near-field ‘zoom-in’ on the indicatedarea (3.2 × 3.2 μm2) in the bright-field image of a fibroblastexpressing LFA-1-GFP. GFP excitation is accomplished using488 nm light (Ar-Kr laser line) linearly polarized along 90°.Fluorescence is collected by a 1.3 numerical aperture oil-immersion objective in combination with standard optical filters. Apolarizing beam-splitter cube (Newport, Fountain Valley, CA) isused to split the fluorescence signal into two perpendicularpolarized components. Both signals are then detected by photon-counting avalanche photodiode detectors. The red/green color-coding of the signals reflects the orientation of the GFPmolecules in the plane of the sample. Examples of clusteredmolecules (arrows) as well as examples showing clear single-molecule detection sensitivity are indicated (circles and squares).The squares show the fast-blinking behavior typical of singlemolecule GFP fluorescence. The circles present demonstrationsof discrete photodissociation phenomena.

B Estimation of the resolution in the near-field image. This figureshows a line trace through the feature marked with the hexagonin the near-field image. The full width at half maximum (FWHM;arrows) of such traces can be used to obtain an estimate for themaximal resolution (half the FWHM) in the near-field image. Onthis basis, we estimate the resolution in the near-field image tobe ∼40 nm.

Single molecule detection by NSOM

[C.G. Figdor et.al., Journal of Cell Science 114, 4153-4160 (2001)]

Supplement

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Instrumentelle Bioanalytik - mab.blt.kit.edumab.blt.kit.edu/vorlesungsdaten/ScaleupTechBio/Bioanalytik_Vorlesung_07.pdf · Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen