Biochem - Agilent · 2015. 10. 6. · Title: Biochem.book Author: Thomas Klink Created Date: 2/10/2004 3:13:42 PM

Agilent ChemStation für UV-Vis-Spektroskopie

Bedienungshandbuch für Biochemische Analyse-Software

s1

Biochemische Analyse-Software für die Agilent ChemStation

Hinweise© Agilent Technologies, Inc. 2002-2003

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Handbuch-TeilenummerG1117-92008

Ausgabe10/2003

Gedruckt in Deutschland

Agilent Technologies Deutschland GmbHHewlett-Packard-Strasse 8 76337 Waldbronn

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Technologielizenzen Die in diesem Dokument beschriebene Hardware und/oder Software wird/werden unter einer Lizenz geliefert und dürfen nur entsprechend den Lizenzbedingungen genutzt oder kopiert werden.

NutzungsbeschränkungenWenn Software für den Gebrauch durch die US-Regierung bestimmt ist, wird sie als "kommerzielle Computer-Software" gemäß der Definition in DFAR 252.227-7014 (Juni 1955), als "kommerzielle Komponente" gemäß der Definition in FAR 2.101(a), als "nutzungsbeschränkte Computer-Software" gemäß der Definition in FAR 52.227-19 (Juni 1987) (oder einer vergleichbaren Agentur- oder Vertragsregelung) ausgeliefert und lizensiert. Nutzung, Vervielfältigung oder Weitergabe von Software unterliegt den standardmäßigen Bestimmungen für kom-merzielle Lizenzen von Agilent Technologies. US-Regierung- und Behörden

(außer Verteidigungsministerium) erhalten keine Rechte, die über die Rechte an "nutzungsbeschränkter Computer-Soft-ware" gemäß FAR 52.227-19(c)(1-2) (Juni 1987) hinausgehen. Zur US-Regierung zäh-lende Benutzer erhalten keine Rechte, die über die Rechte an "nutzungsbeschränkter Computer-Software" gemäß FAR 52.227-14 (Juni 1987) oder DFAR 252.227-7015 (b)(2) (November 1995) hinausgehen, soweit in irgendwelchen technischen Daten anwend-bar.

Sicherheitshinweise

VORSICHT

Ein VORSICHT-Hinweis macht auf Arbeitsweisen, Anwendungen o. ä. aufmerksam, die bei falscher Aus-führung zur Beschädigung des Pro-dukts oder zum Verlust wichtiger Daten führen können. Wenn eine Prozedur mit dem Hinweis VORSICHT gekennzeichnet ist, dür-fen Sie erst fortfahren, wenn Sie alle angeführten Bedingungen ver-standen haben und diese erfüllt sind.

WARNUNG

Ein WARNUNG-Hinweis macht auf Arbeitsweisen, Anwendungen o. ä. aufmerksam, die bei falscher Ausführung zu Personenschäden, u. U. mit Todesfolge, führen kön-nen. Wenn eine Prozedur mit dem Hinweis WARNUNG gekennzeich-net ist, dürfen Sie erst fortfahren, wenn Sie alle angeführten Bedin-gungen verstanden haben und diese erfüllt sind.

In diesem BuchDie biochemische Analyse-Software für Agilent ChemStation ergänzt die allgemein verwendbare Software um den Modus “Kinetics” und den Modus “Thermal Denaturation”. Mit diesen beiden Modi können am Agilent 8453 Spektrofotometer Experimente mit der Kinetik und mit der Wärmedenaturierung durchgeführt werden. Dies umfaßt die Möglichkeit, analytische Methoden zu entwickeln, Ihre laufenden Experimente in Echtzeit und online zu überwachen und Werkzeuge für die Auswertung und Verarbeitung der experimentellen Daten.

Dieses Handbuch enthält Anleitungen für die Installation der Software- und Hardware-Komponenten, die für Experimente mit der Kinetik und mit der Wärmedenaturierung benötigt werden. Weiterhin finden Sie in diesem Handbuch Informationen über die wichtigsten Software-Funktionen, die Sie bei der Behebung von Analyseproblemen unterstützen.

Dieses Handbuch ist in drei Kapitel unterteilt, wobei Sie mit der Installation der Software beginnen und mit der Auswertung und Darstellung eines Experimentes mit einer Kinetik oder mit einer Wärmedenaturierung enden.

1 Installation und Konfiguration

In Kapitel “Installation und Konfiguration” wird die Installation der Agilent ChemStation Software und die Konfiguration der Agilent 89090A Peltier-Temperatursteuerung, die für Experimente mit der Wärmedenaturierung benötigt wird, erläutert.

2 Der Modus “Kinetics”

In Kapitel “Der Modus “Kinetics”” führt den Benutzer von der Konfiguration des Spektrofotometers und dem Probennahmesystem über die Entwicklung einer kinetischen Methode zur Kinetikmessung und endet mit der Auswertung der experimentellen Daten.

3 Der Modus “Thermal Denaturation”

In Kapitel “Der Modus “Thermal Denaturation”” wird das Einrichten einer Temperaturstufe und einer Analysemethode beschrieben, um ein Experiment mit der Wärmedenaturierung durchzuführen. Der Benutzer erhält Informationen über die Online-Überwachung des Experiments und über die Möglichkeiten der Datenauswertung mit der Software.

Biochemische Analyse-Software für die Agilent ChemStation 3

4 Biochemische Analyse-Software für die Agilent ChemStation

Inhalt

1 Installation und Konfiguration 7

Installieren der biochemischen Analyse-Software 8

Konfigurieren der Agilent 89090A Peltier-Temperatursteuerung 9

2 Der Modus “Kinetics” 11

Vorbereiten einer zeitbasierten Messung 12

Starten des Modus “Kinetics” 12Einrichten Ihres Spektrofotometers 14Konfigurieren des Probennahmesystems 16Einrichten einer kinetischen Methode 18

Die kinetische Messung 24

Durchführen einer zeitbasierten Messung 24Auswerten der kinetischen Daten 26Anzeigen der Ergebnisse 27

3 Der Modus “Thermal Denaturation” 29

Vorbereiten einer Wärmedenaturierungsmessung 30

Starten des Modus “Thermal Denaturation” 31Einrichten Ihres Spektrofotometers 32Einrichten der Temperaturstufe 32Einrichten einer Wärmedenaturierungsmethode 33

Das Wärmedenaturierungsexperiment 39

Durchführen eines Wärmedenaturierungsexperimentes 39Auswerten der Wärmedenaturierungsdaten 40Anzeigen der Ergebnisse 41


Inhaltsverzeichnis

Index 43


Agilent ChemStation für UV-Vis-SpektroskopieBedienungshandbuch für Biochemische Analyse-Software

1Installation und Konfiguration

Installieren der biochemischen Analyse-Software 8

Konfigurieren der Agilent 89090A Peltier-Temperatursteuerung 9

Bevor Sie mit der biochemischen Analyse-Software arbeiten können, müssen Sie die Software installieren und das Spektrofotometer konfigurieren. In diesem Kapitel werden die Werkzeuge und Prozeduren für die Installation erläutert. Zuerst muß die biochemische Analyse-Software auf Ihrer Agilent ChemStation installiert werden.

Wenn Sie den Modus “Thermal Denaturation” der Agilent ChemStation verwenden wollen, müssen Sie außerdem die Agilent 89090A Peltier-Temperatursteuerung installieren. Diese Installation ist für den Modus “Kinetics” optional.

7Agilent Technologies


Installieren der biochemischen Analyse-Software

Die biochemische Analyse-Software (G1117A) ist ein Zusatzmodul und umfaßt die allgemein verwendbare Software (G1115A).

1 Legen Sie die Agilent ChemStation CD-ROM ein.

2 Starten Sie die Datei setup.exe.

3 Wählen Sie G1115AA “UV-VIS General Purpose ChemStation” unter “Available Products” aus, und klicken Sie auf “Add”.

4 Geben Sie die Lizenznummer für G1115AA ein, und klicken Sie auf “Add”.

5 Wählen Sie G1117AA “UV-VIS Biochemical Add-on mode” unter “Available Products” aus, und klicken Sie auf “Add”.

6 Geben Sie die Lizenznummer für G1117AA ein, und klicken Sie auf “Add”.

7 Klicken Sie auf OK.

8 Klicken Sie auf “Install”.

9 Starten Sie nach Abschluß der Installation die “Installation Qualification”. Sie finden diese im Menü von Agilent ChemStation.

10 Wenn die “Installation Qualification” erfolgreich abgeschlossen ist, wurden die biochemische Analyse-Software und auch die allgemein verwendbare Software installiert.


Installation und Konfiguration 1

Konfigurieren der Agilent 89090A Peltier-Temperatursteuerung

Wenn Sie den Modus “Thermal Denaturation” der biochemischen Analyse-Software verwenden wollen, müssen Sie die Agilent 89090A Peltier-Temperatursteuerung konfigurieren.

1 Starten Sie den “UV-Vis Configuration Editor” im Menü von Agilent ChemStation.

2 Wenn noch kein Agilent 8453 Gerät konfiguriert ist, fügen Sie ein neues Gerät (New Instrument) hinzu. Dieser Vorgang ist im Agilent 8453 System für UV-Vis-Spektroskopie Bedienungshandbuch beschrieben

3 Wählen Sie im Menü “Configure” die Option “Instruments…” aus.

4 Geben Sie “Instrument Name” ein. Wählen Sie die Option “Initial Screen Window Size” aus, und klicken Sie auf OK.

5 Wählen Sie “TemCo” aus.

6 Wählen Sie die GPIB-Adresse 20.

7 Klicken Sie auf “Add”, um die Konfiguration zu bestätigen.

8 Klicken Sie auf OK, um das Dialogfenster “Device Configuration” zu schließen.

9 Schließen Sie den “Configuration Editor”.



2Der Modus “Kinetics”

Vorbereiten einer zeitbasierten Messung 12

Die kinetische Messung 24

In diesem Kapitel werden die wichtigsten Aufgaben im Modus “Kinetics” der biochemischen Analyse-Software beschrieben. Da bei kinetischen Messungen eine gute Vorbereitung äußerst wichtig ist, enthält der erste Abschnitt “Vorbereiten einer zeitbasierten Messung" auf Seite 12 Informationen über die Schritte, die vor der kinetischen Messung durchzuführen sind. Sie erfahren, wie das Spektrofotometer, das Probennahmesystem und eine Analysemethode eingerichtet werden.

Im zweiten Abschnitt “Die kinetische Messung" auf Seite 24 wird die eigentliche zeitbasierte Messung und die Möglichkeiten der Datenverarbeitung sowie der Datenauswertung mit der Agilent ChemStation Software beschrieben.



Vorbereiten einer zeitbasierten Messung

Bevor Sie eine zeitbasierte Messung durchführen, müssen Sie Ihr System Ihrer Anwendung entsprechend einrichten. In diesem Abschnitt erfahren Sie, wie Sie Ihr Spektrofotometer einrichten, das Probennahmesystem auswählen und einrichten und eine kinetische Methode entwickeln. Hierdurch können Sie die Funktionen der biochemischen Analyse-Software verwenden, um so die beste Lösung für Ihre kinetische Messung herauszufinden.

Starten des Modus “Kinetics”

Um den Modus “Kinetics” der biochemischen Analyse-Software zu starten, wählen Sie die Option “Kinetics” im Menü “Mode” oder im Dropdown-Listenfeld “Mode” in der grafischen Benutzeroberfläche aus.

In Abbildung 1 ist die grafische Benutzeroberfläche für den Modus “Kinetics” der Agilent ChemStation Software dargestellt. Der derzeit ausgewählte Modus wird im Dropdown-Listenfeld “Mode” in der Symbolleiste angegeben. In der Symbolleiste befindet sich auch das Feld mit dem Namen der Methode. Dort wird der Name der eigentlichen Analysemethode angezeigt. Die Angabe “Mod” rechts neben dem Feld mit dem Namen der Methode zeigt an, daß diese Methode modifiziert wurde und daß diese Modifikationen noch nicht gespeichert wurden. In der Symbolleiste befinden sich außerdem Symbolschaltflächen. Diese sind im Agilent 8453 System für UV-Vis-Spektroskopie Bedienungshandbuch detailliert beschrieben.


Der Modus “Kinetics” 2

Der linke Fensterabschnitt ist in zwei Bereiche unterteilt. Die (obere) Analyseanzeige enthält die Schaltfläche “Setup…”, über die das Dialogfenster für die Methode aufgerufen wird. In diesem Dialogfenster befinden sich die wichtigsten Parameter für die Methode. In der (unteren) Geräteanzeige können Sie das Probennahmesystem auswählen und die Lampen für das Spektrofotometer ein- und ausschalten.

Die standardmäßige grafische Benutzeroberfläche im Modus “Kinetics” umfaßt die Fenster “Time Traces”, “Results” und “Method Summary”. In diesen Fenstern werden nach der Messung die kinetischen Zeitkurven, die ausgewerteten kinetischen Daten und die wichtigsten Parameter für die Methode angezeigt.

Abbildung 1 Die grafische Benutzeroberfläche im Modus “Kinetics”



Einrichten Ihres Spektrofotometers

Rufen Sie das Menü “Instrument” in der biochemischen Analyse-Software auf, um Ihr Agilent 8453 Spektrofotometer für eine zeitbasierte Messung einzurichten.

Wählen Sie die Option “Setup Spectrophotometer…” aus, um das Dialogfenster “Instrument Parameters” aufzurufen. Hier können Sie die Laufzeitparameter für das Spektrofotometer einstellen. In diesem Dialogfenster können die folgenden Parameter eingestellt werden.

• Sie können in den Feldern den unteren und oberen Grenzwert für den Bereich festlegen, der für Ihre Analyse benötigt wird. Im Feld “Wavelength range from:” wird der untere Grenzwert des Bereichs und im Feld rechts daneben der obere Grenzwert des Bereichs definiert. Die Standardwerte sind die Grenzwerte für den Wellenlängenbereich des konfigurierten Spektrofotometers.

HINWEIS Es sollte der maximale Wellenlängenbereich Ihres Spektrofotometers genutzt werden. Hierdurch können Sie alle Vorzüge des Diodenarray-Spektrofotometers nutzen, wie beispielsweise die Datenauswertung nach einer Messung mit verschiedenen Wellenlängen.



• Im Feld “Integration time” wird der Zeitraum in Sekunden angegeben, in dem das Signal erfaßt und integriert wird. Die “Integration time” muß zwischen 0,1 und 25,5 Sekunden liegen. Standardmäßig sind 0,5 Sekunden eingestellt. Bei einer längeren “Integration time” verbessert sich der Signalabstand, da das Signal akkumuliert und das Rauschen durch Mittelung eliminiert wird. Die ausgewählte “Integration time” wirkt sich direkt auf die minimale Zykluszeit bei einer kinetischen Messung aus. Die minimale Zykluszeit kann nicht kürzer als die “Integration time” sein. Folglich kann es notwendig werden, die “Integration time” bei schnellen kinetischen Messungen zu minimieren.

• Die Zahl im Feld “Interval” legt das Wellenlängen-Meßintervall fest. Der kleinste Intervallwert ist 1 nm, entsprechend mit der höchsten Auflösung.

Wählen Sie die Option “Lamp(s)…” im Dialogfenster “Lamp(s) Parameter” aus. Hier können Sie die Parameter für die Lampen des Spektrofotometers einstellen. Das Format des Dialogfensters “Lamp(s) Parameter” ist vom Spektrofotometertyp abhängig. Beim 8453 Spektrofotometer können Sie die Deuteriumlampe und die Wolframglühlampe einschalten (On) und ausschalten (Off). Die Lampen können auch durch Anklicken der Lampensymbole in der seitlichen Geräteanzeige in der grafischen Benutzeroberfläche aus- und eingeschaltet werden.

Der tatsächliche Status des Spektrofotometers wird im Fenster “Spectrophotometer Status” zusammengefaßt angegeben. In diesem Fenster werden die folgenden Werte angezeigt:

HINWEIS Um eine optimale Leistung des Spektrofotometers zu erzielen, sollte der Standardwert 1 nm nicht verändert werden.

HINWEIS Wenn Sie die Lampenparameter ändern, wird die aktuelle Methode modifiziert und der Lampenstatus verändert. Wenn ein Fehler bei einer Lampe auftritt (Glühfehler, Lampenschaden oder Gehäusetür bei den Lampen offen), kann es sein, daß bei den Lampenparametern die Lampen als eingeschaltet (On) angezeigt werden, obwohl diese tatsächlich aus sind. Überprüfen Sie den tatsächlichen Zustand der Lampen im Fenster “Spectrophotometer Status” oder in der seitlichen Geräteanzeige in der grafischen Benutzeroberfläche.



Gerätetyp, Wellenlängenbereich, Wellenlängenintervall, Integrationszeit, Einschaltzeit, Status der Lampen und Gesamtstatus des Agilent 8453 Spektrofotometers (betriebsbereit/nicht betriebsbereit).

Konfigurieren des Probennahmesystems

Das Probennahmesystem kann entweder über das Menü “Instrument” oder die seitliche Geräteanzeige in der grafischen Benutzeroberfläche ausgewählt und eingerichtet werden.

Wählen Sie die Option “Select Sampling System…” aus. Es erscheint das Dialogfenster “Sampling System”. Dort können Sie entweder den manuellen Betrieb oder das System mit Mehrfachküvettentransport (8 Küvetten) oder (7 Küvetten) auswählen. Wenn Sie die Peltier-Temperatursteuerung (Agilent 89090A #100) verwenden wollen, muß für das Probennahmesystem die Option “Manual” ausgewählt werden.

Wählen Sie die Option “Setup Sampling System…” aus. Es erscheint das Dialogfenster “Setup”. Dort können Sie die Laufzeitparameter für das ausgewählte Probennahmesystem einstellen.

Im Dialogfenster “Cells” können Sie die Laufzeitparameter für den Mehrfachküvettentransport einstellen.

VORSICHT Wenn Sie von der Einstellung “Manual” für die Probennahme auf das System mit Mehrfachküvettentransport umschalten, gehen die aktuellen Ergebnisse von einer einzelnen Küvette verloren..



Im Dialogfenster werden die verwendeten Küvetten in Tabellenform mit den folgenden Spalten angegeben:

• Cell Nummer: Gibt die Küvettenpositionen im Mehrfachküvettentransport an. Küvette 1 ist die Küvette mit dem geringsten Abstand zur Vorderseite des Spektrofotometers.

• In der mittleren Tabellenspalte wird die Probe in der Küvette beschrieben. Wählen Sie im Dropdown-Listenfeld die Option “Sample” (Probemessung), “Blank” (Blindmessung) oder “Not Used” (nicht verwendet) aus.

• Im Feld “Path Length” wird die Weglänge in Zentimeter der Proben-küvetten in den jeweiligen Positionen des Mehrfachküvettentransports angegeben. Der Standardwert für jede Küvette ist 1 cm.

Im Dialogfenster “Single Cell” können Sie die Laufzeitparameter für den manuellen Betrieb einrichten.

HINWEIS Die Position 1 sollte für die Blindmessung (Blank) verwendet werden. Zu Beginn eines Meßzyklus wird das Blindspektrum stets aktualisiert. Dies ist besonders dann wichtig, wenn Sie kinetische Langzeitexperimente durchführen..



Im Feld “Path Length” wird die Weglänge der verwendeten Probenküvette in cm angegeben. Der Standardwert ist 1 cm.

Aktivieren Sie die Option “Wait for Temperature Ready”, um sicherzustellen, daß die Agilent ChemStation erst dann mit einer Messung beginnt, wenn sie von der Agilent 89090A Peltier-Temperatursteuerung ein “Ready”-Signal empfangen hat. Standardmäßig ist diese Option deaktiviert. Dieses Kontrollkästchen ist nur dann verfügbar, wenn die Agilent 89090A Peltier-Temperatursteuerung konfiguriert ist.

Einrichten einer kinetischen Methode

Die Parameter für eine Methode werden im Dialogfenster “Time & Calculation Parameters” und im Dialogfenster “Info & Options” unter dem Menü “Method” bearbeitet. Das Dialogfenster “Time & Calculation Parameters” erscheint auch dann, wenn die Schaltfläche “Setup” angeklickt wurde. Die wichtigsten Parameter der Methode werden im Fenster “Method Summary” der grafischen Benutzeroberfläche angezeigt.

Im Dialogfenster “Time & Calculation” können Sie die Bedingungen für die zeitbasierte Messung festlegen.



• Im Feld “Use wavelength” können Sie die Wellenlänge (bei Messungen mit mehreren Küvetten) oder bis zu sechs Wellenlängen (bei Messungen mit einer einzelnen Küvette) der verarbeiteten Daten, aus welchen die Amplitudenwerte für das Wellenlängenergebnis extrahiert werden, festlegen. Die standardmäßige Wellenlänge beträgt 480 nm. Wenn Sie Wellenlängen eingeben, für die keine Meßdaten verfügbar sind (beispielsweise keine ganzzahligen Werte), werden die Amplitudenwerte durch lineare Interpolation berechnet.

• Im Feld “Background correction” können Sie eine Hintergrundkorrektur festlegen, die beim Wellenlängenergebnis für die Berechnung des Ergebnisses einer Funktion angewendet werden soll. Klicken Sie auf den nach unten zeigenden Pfeil, und wählen Sie im Dropdown-Listenfeld eine Prozedur für die Hintergrundkorrektur aus:



none — Legt fest, daß das Wellenlängenergebnis als Meßergebnis ohne Hintergrundkorrektur verwendet wird.

single reference wavelength — Legt fest, daß die Absorption einer einzelnen Wellenlänge vom Wellenlängenergebnis abgezogen wird. Sie geben im Feld die Hintergrundwellenlänge an.

subtract average over a range — Legt fest, daß die durchschnittliche Absorption über einen Wellenlängenbereich vom Wellenlängenergebnis abgezogen wird. Sie geben in den Feldern den oberen und unteren Grenzwert des Hintergrundwellenlängenbereichs an.

three-point drop-line — Legt fest, daß eine mit einer Dreipunkt-Dropline berechnete Hintergrundabsorption vom Wellenlängenergebnis abgezogen wird. Sie geben den oberen und unteren Grenzwert des Hintergrundwellenlängenbereichs, der für die Hintergrundberechnung verwendet wird, im linken Feld (für den unteren Wert) und im rechten Feld (für den oberen Wert) an.

• Der “Trace monitor” ist eine permanent aktualisierte Zeitkurve, die die Veränderung der Absorption bei der im Feld “Use wavelength” spezifizierten Wellenlänge im Verhältnis zur Zeit anzeigt. Definieren Sie die Skalierung der Absorptionsachse (y), indem Sie den unteren und oberen Grenzwert in den Feldern “Y scaling from:” und “to:” eingeben.

• Sie können wählen, ob das zuletzt erfaßte Spektrum oder die Spektren von einer spezifischen Küvette überwacht werden sollen. Klicken Sie auf den nach unten zeigenden Pfeil, und wählen Sie entweder “Last Spectrum”, “Cell n” (bei Messungen mit mehreren Küvetten) oder “All Spectra” (bei Messungen mit einer Küvette) aus. Definieren Sie die Skalierung der Absorptionsachse (y), indem Sie den unteren und oberen Grenzwert in den Feldern “Y scaling from:” und “to:” eingeben.

• Im Feld “Run Time” wird die Gesamtdauer der Analyse angegeben. Als “Run Time” kann ein Zeitraum von bis zu 999.999 Sekunden (11,5 Tage) eingegeben werden. Der Wert im Feld “Run Time” muß größer sein als die Summe der Werte in den Feldern “Cycle Time” und “Start Time”.

• Im Feld “Start Time” wird der Zeitraum zwischen dem Initiieren einer Messung und dem Starten einer Messung angegeben. Der Standardwert ist 0.0.



• Im Feld “Cycle Time” wird der Zeitraum vom Start einer Messung bis zum Start der nächsten Messung angegeben. Bei Messungen mit mehreren Küvetten beträgt der Standardwert 5,0 Sekunden (Mindestwert). Bei Messungen mit einer Küvette beträgt der Standardwert 0,5 Sekunden (Mindestwert).

• Die Mindestzyklusdauer ist von der Hardware abhängig. Der angegebene Wert ist nur ein Näherungswert. Um einen Datenverlust zu vermeiden, müssen Sie die Mindestzyklusdauer für Ihre Konfiguration experimentell ermitteln. Die Mindestzyklusdauer ist abhängig vom Probennahmesystem (Anzahl der Messungen pro Zyklus), von der Integrationszeit (wird im Dialogfenster “Setup Spectrophotometer…” definiert) und von der Streulichkorrektur (wird im Dialogfenster “Info & Options” definiert).

• Markieren Sie die Option “Increment cycle time by:”, um die Erhöhung der Zykluszeit zu aktivieren. Spezifizieren Sie die prozentuale Erhöhung im Feld “%” und ein Zeitintervall (in Sekunden) im Feld “after initial time of:”.

• Sie können eine der fünf verschiedenen kinetischen Auswertungsarten wählen. Klicken Sie auf den nach unten zeigenden Pfeil, und wählen Sie im Dropdown-Listenfeld den Berechnungstyp aus:

None — Legt fest, daß keine Berechnung der Rate erfolgt.

Initial rate — Legt fest, daß eine quadratische Anpassung gemäß der Gleichung a+bt+ct2 erfolgt, wobei b der Konstanten für die anfängliche Rate entspricht.

Zero order — Legt fest, daß eine lineare Anpassung gemäß der Gleichung a + bt erfolgt, wobei b der Ratenkonstanten in AU/s entspricht.

First order — Legt fest, daß eine exponentielle Anpassung gemäß der Gleichung a+b·exp(-kt) erfolgt, wobei k der Ratenkonstanten in 1/s entspricht.

Delta AU — Legt eine Subtraktion der Anfangsabsorption von der Endabsorption fest:Abst(Ende) - Abst(Anfang)

• Sie können festlegen, daß die Ratenberechnung über einen begrenzten Zeitraum erfolgt. Geben Sie die Startzeit für die Berechnung im Feld “Calculation time range from:” und die Endzeit im Feld “to:” ein.



• Markieren Sie die Option “Multiply Rate by”, um einen Konvertierungsfaktor für das Ratenergebnis zu aktivieren. Geben Sie den Faktor vor dem Feld “to convert to Rate unit:” und die neuen Einheiten nach dem Feld ein.

Aktivieren Sie die Option “Subtract Rate of cell”, um das Ergebnis einer Referenzküvette von den Ratenergebnissen aller anderen Küvetten abzuziehen. Klicken Sie auf den nach unten zeigenden Pfeil, und wählen Sie im Dropdown-Listenfeld die Referenzküvette aus. Diese Option ist nur dann verfügbar, wenn Sie eine Messung mit mehreren Küvetten eingerichtet haben.

Im Dialogfenster “Options and Information” können Sie die Erfassungsbedingungen für das kinetische Experiment festlegen.

• Wenn Sie die Option “Move multicell transport for stirring if possible” markiert haben und die Zyklusdauer ausreichend lang ist (ca. Mindest-zyklusdauer plus 4 Sekunden für jede konfigurierte Küvette), wird die aktuelle Küvette in Position gebracht, um die Probe während der Ruhezeit zwischen zwei Zyklen umzurühren. Dieses Kontrollkästchen ist nur dann verfügbar, wenn ein System mit Mehrfachküvettentransport ausgewählt wurde.



• Wenn Sie die Option “Adjust gains separately from blank measurement” markieren, ist der Befehl “Set Gains” zusätzlich im Menü “Measure” enthalten. Der Befehl “Set Gains” führt eine Anpassung der Verstärkung, eine Referenzmessung und eine normale Messung durch. Der Befehl “Blank” führt nur eine Referenzmessung und eine normale Messung durch. Die separate Anpassung der Verstärkung an einem Blindmedium mit hoher Transmission (beispielsweise Wasser oder Pufferlösung) reduziert die Verstärkung auf einen niedrigeren Wert, um so einen Überlauf beim A/D-Wandler und ungültige Datenpunkte aufgrund von Zeitkurven mit negativer Flanke zu verhindern.

• Wenn Sie die Option “Straylight correction on” markieren, ist die Streulichtkorrektur aktiviert. In diesem Fall wird mit dem Streulichtfilter eine zweite Messung durchgeführt und das Probenspektrum bezüglich des Streulichtes anhand dieses zweiten Spektrums korrigiert. Durch die Streulichtkorrektur erhöht sich die Mindestzyklusdauer durch die “Integration Time” (wird im Dialogfenster “Instrument Parameters” eingestellt) plus 2 Sekunden.

• Wenn Sie die Option “Autosave spectra to file” markieren, werden alle erfaßten Spektren auf Datenträger gespeichert. Geben Sie im Feld rechts daneben einen Dateinamen ein. Die Spektren werden im Standardverzeichnis (HPCHEM\n\DATA) mit der Dateierweiterung .KD gespeichert. Das Standardverzeichnis kann im Menü “Config” geändert werden.

• Wenn Sie die Option “Prompt for sample information before run” markieren, wird vor Beginn einer Messung das Dialogfenster “Sample Information” angezeigt.

• Wenn Sie die Option “Start Run on Trigger” markieren, wird die Datenerfassung durch Schließen der Kontakte 13 und 15 an der GPIO-Schnittstelle gestartet. Hierdurch wird sichergestellt, daß die Mindestdauer zwischen der Triggerung und dem Beginn der Datenerfassung (ca. 0,12 Sekunden) abgewartet wird. Dies ist bei schnellen Reaktionskinetiken zu verwenden.

• Im Feld “Method Information” können Sie eine Beschreibung der Methode eingeben. Im Feld können alphanumerische Zeichen erfaßt werden. Die Beschreibung kann beliebig lang sein. Der Text wird am Zeilenende automatisch umbrochen. Sie können eine vorhandene Beschreibung mit standardmäßigen Textbearbeitungsfunktionen bearbeiten (beispielsweise Kopieren, Ausschneiden, Einfügen).



Die kinetische Messung

Durchführen einer zeitbasierten Messung

Messungen können entweder über das Menü “Measure” in der Menüleiste oder durch Anklicken der Schaltflächen (“Blank”, “Sample”, “Time Based Measurement”) in den seitlichen Anzeigen der grafischen Benutzeroberfläche oder über bestimmte Funktionstasten gestartet werden.

Wenn Sie die Option “Adjust gains separately from blank measurement” im Dialogfenster “Options & Info…” ausgewählt haben, ist die Option “Set Gains” im Menü “Measure” vorhanden. Die separate Anpassung der Verstärkung an einem Blindmedium mit hoher Transmission (beispielsweise Wasser oder Pufferlösung) reduziert die Verstärkung auf einen niedrigeren Wert und verhindert so einen Überlauf beim A/D-Wandler. Auf diese Weise können ungültige Datenpunkte aufgrund von Zeitkurven mit negativer Flanke vermieden werden.

1 Setzen Sie die Küvette, gefüllt mit Wasser oder einem anderen gering absorbierenden Medium, im Küvettenhalter ein.

2 Positionieren Sie den Mehrfachküvettentransport an der korrekten Stelle.

3 Wählen Sie im Menü “Measure” die Option “Set Gains” aus.

Bei einem Probennahmesystem mit mehreren Küvetten sollten “Zero Cell”-Spektren gemessen werden, um geringfügig unterschiedliche optische Eigenschaften der Meßküvetten zu korrrigieren. Sie sollten den Mehrfachküvettentransport mit dem gleichen Blindmedium in allen Küvetten initialisieren. Der Befehl “Zero Cells…” mißt ein wahres Blindspektrum bei Küvette 1 und anschließend die Spektren für die anderen Küvetten. Das Differenzspektrum wird ermittelt, indem das Blindspektrum von den einzelnen Küvettenspektren abgezogen wird. Dann werden diese von allen nachfolgenden gemessenen Spektren abgezogen, um optische Unterschiede von Küvette zu Küvette zu korrigieren.

1 Füllen Sie alle Meßküvetten mit dem gleichen Blindmedium (beispielsweise Wasser).

2 Vergewissern Sie sich, daß sich in den Küvetten weder Luftblasen noch lose Partikel befinden.

3 Führen Sie eine Blindmessung durch. Wählen Sie hierfür im Menü “Measurement” die Option “Blank” aus, oder klicken Sie in den seitlichen



Anzeigen der grafischen Benutzeroberfläche auf die Schaltfläche “Blank”, oder drücken Sie die Funktionstaste F4.

4 Starten Sie die Messung “Zero Cells” im Menü “Measure”.

Die “Zero Cell”-Spektren werden im Fenster “Zero Cells Spectra” angezeigt, das wiederum im Menü “View” aktiviert werden kann. Vergewissern Sie sich, daß die Küvetten nicht nach der “Zero Cell”-Messung positioniert sind.

Um ein einzelnes Spektrum der in der Küvette vorhandenen Lösung zu messen und im Fenster “Sample Spectra” anzuzeigen, wählen Sie im Menü “Measure” die Option “Sample (Single Spectrum)” aus. Um ein einzelnes Spektrum zu messen, können Sie auch die Funktionstaste F5 drücken oder in den seitlichen Anzeigen der grafischen Benutzeroberfläche auf die Schaltfläche “Sample” klicken.

Wenn Sie die Funktionstaste F7 drücken oder die zeitbasierte Messung im Menü “Measure” bzw. in den seitlichen Anzeigen der grafischen Benutzeroberfläche auswählen, bereitet die Software den Beginn der zeitbasierten Messung vor. Jetzt erscheinen die Fenster “Time Trace” und “Sample Spectra”. Wählen Sie in der neuen Menüleiste die Option “Start”, um die Erfassung zu starten bzw. “Abort”, um eine laufende Erfassung abzubrechen.

Während der zeitbasierten Messung können Sie die Erfassung der Spektren und der Zeitkurven in Echtzeit in den Fenstern “Time Trace” und “Sample Spectra” verfolgen. Doppelklicken Sie mit der linken Maustaste auf das Fenster “Time Trace” oder auf das Fenster “Sample Spectra”, um die Y-Achse automatisch zu skalieren.

Wenn die zeitbasierte Messung abgeschlossen ist oder vom Benutzer abgebrochen wurde, werden die kinetischen Daten so gespeichert, wie dies im Dialogfenster “Options & Info…” festgelegt ist. Die Zeitkurven werden anhand des Ratentyps ausgewertet. Der Ratentyp wurde im Dialogfenster “Time & Calculation” ausgewählt. Diese Ergebnisse werden im Fenster “Results” angezeigt.



Auswerten der kinetischen Daten

Wenn die zeitbasierte Messung abgeschlossen ist, können Sie die kinetischen Daten erneut auswerten. Da während der Messung vollständige Spektren erfaßt wurden, können die Parameter in den Feldern “Wavelength” und “Rate Calculation” im Dialogfenster “Time & Calculation” geändert werden. Klicken Sie auf OK, um die Änderungen zu bestätigen. Die neuen Ergebnisse werden im Fenster “Results” angezeigt. Wenn die Parameter der Methode geändert wurden, wird dies in der Symbolleiste durch die Angaben “Mod” angezeigt.

Wenn ein manuelles Probennahmesystem konfiguriert wurde, können Sie im Fenster “Results” über die Option “Edit Sample Information” das Dialogfenster “Sample Information” aufrufen. Hier können Sie Probeninformationen in Ihre Ergebnisse aufnehmen. Das Dialogfenster “Sample Information” enthält folgende Parameter:

• Bezeichnung der Probe

• Anmerkung (beispielsweise eine Beschreibung der Probe)

• Die Konzentration eines Substrats im Feld “[S](mg/ml)”. Dieses Feld ist nur dann vorhanden, wenn Sie im Dialogfenster “Configure Substrate, Inhibitors” die Option “[S]” oder “[S][I]” ausgewählt haben.

• Die Konzentration eines Inhibitors im Feld “[I](mg/ml)”. Dieses Feld ist nur dann vorhanden, wenn Sie im Dialogfenster “Configure Substrate, Inhibitors” die Option “[S][I]” ausgewählt haben.

• Die Konzentration des ersten von zwei Substraten im Feld “[A](mg/ml)”. Dieses Feld ist nur dann vorhanden, wenn Sie im Dialogfenster “Configure Substrate, Inhibitors” die Option “[A][B]” ausgewählt haben.

• Die Konzentration des zweiten von zwei Substraten im Feld “[B](mg/ml)”. Dieses Feld ist nur dann vorhanden, wenn Sie im Dialogfenster “Configure Substrate, Inhibitors” die Option “[A][B]” ausgewählt haben.

Wenn ein Probennahmesystem mit Mehrfachküvettentransport konfiguriert wurde, können Sie im Fenster “Results” über die Option “Configure Substrate/Inhibitors” das Dialogfenster “Configure Substrate, Inhibitors” aufrufen. Hier können Sie Informationen zu Substraten und Inhibitoren in Ihre Ergebnisse aufnehmen. Sie können das Dialogfenster “Configure Substrate/Inhibitors” auch durch Anklicken der entsprechenden Schaltfläche im Dialogfenster “Edit Sample Information” aufrufen. Das Dialogfenster “Configure Substrate, Inhibitors” enthält die folgenden Parameter:



• None - Legt fest, daß keine Substrate und Inhibitoren aufgenommen werden.

• [S] - Legt fest, daß ein Substrat aufgenommen wird.

• [S][I] - Legt fest, daß ein Substrat und ein Inhibitor aufgenommen werden.

• [A][B] - Legt fest, daß zwei Substrate aufgenommen werden.

Geben Sie im Feld “Unit” die Einheiten für die Konzentration der Substrate und der Inhibitoren ein.

Anzeigen der Ergebnisse

Für die Anzeige Ihrer erfaßten und verarbeiteten Daten und für die Ergebnisse in Tabellenform stehen verschiedene Optionen zur Verfügung. Wählen Sie Menü “View” aus. Es enthält folgende Optionen:

• “All Spectra” zeigt alle erfaßten Spektren im Fenster “Sample Spectra” an.

• “Spectra of Cell” ermöglicht die Anzeige von Spektren aus einer ausgewählten Küvette im Fenster “Sample Spectra”. Sie wählen die Küvettennummer im Untermenü aus.

• “Traces and Results” zeigt das Fenster “Time Traces”, das Fenster “Results” und die Tabelle “Method Summary” an.

• “Measured Single Spectra” zeigt ein gemessenes Spektrum im Fenster “Single Spectra” an.

• “Last Blank Spectrum” zeigt das Fenster “Last Blank Spectrum” an.

• “Zero Cell Spectra” ist im Menü “View” enthalten, wenn Sie ein System mit Mehrfachküvettentransport konfiguriert haben. Es zeigt das Fenster “Zero Cell Spectra” an.

• “Math Results” zeigt das Fenster “Math Result” an.

HINWEIS TUm alte Daten, die mit der HP 89532K Software generiert wurden, zu laden und auszuwerten, wählen Sie im Menü “File” die Option “Import from *.MKD…” aus..



• “Tabulate Selected Spectrum/Trace” zeigt die Tabelle “Tabular Data of Spectra” des ausgewählten Spektrums oder die Tabelle “Tabular Data of Time Traces” der ausgewählten Zeitkurve an. Diese Tabellen werden auch automatisch angezeigt, wenn Sie in der grafischen Darstellung mit der linken Maustaste auf ein Spektrum bzw. eine Zeitkurve doppelklicken oder wenn Sie bei Verwendung des Cursors die Eingabetaste drücken. Der Titel der Tabelle weist auf den Spektrumtyp hin (beispielsweise “Sample”, “Standard”), wobei die Nummer des Spektrums bzw. der Zeitkurve im Fenster in Klammern angegeben wird (beispielsweise [1]).

• “Logbooks” ruft das Dialogfenster “Logbooks” auf, in dem Sie ein Protokoll aufrufen können, um dies anzuzeigen oder zu drucken.

• “Load Logbook” ruft das Dialogfenster “Load Logbook” auf, in dem Sie ein zuvor gespeichertes Protokoll auswählen und laden können.

• “Next Window” wechselt in das nächstfolgende Fenster. Sollte das Fenster durch andere Fenster verdeckt sein, wird es mit dem Befehl “Next Window” im Vordergrund positioniert. Wenn das Fenster auf Symbolgröße verkleinert ist, wird es mit dem Befehl “Next Window” in seiner Standardgröße und Standardposition angezeigt. Der Befehl “Next Window” kann auch durch Drücken der Funktionstaste F11 aktiviert werden.

• “Previous Window” wechselt in das vorherige Fenster. Sollte das Fenster durch andere Fenster verdeckt sein, wird es mit dem Befehl “Previous Window” im Vordergrund positioniert. Wenn das Fenster auf Symbolgröße verkleinert ist, wird es mit dem Befehl “Previous Window” in seiner Standardgröße und Standardposition angezeigt.

• “Reset Current View” setzt alle Fenster in der aktuellen Anzeige auf ihre Standardgrößen und Standardpositionen zurück.



3Der Modus “Thermal Denaturation”

Vorbereiten einer Wärmedenaturierungsmessung 30

Das Wärmedenaturierungsexperiment 39

In diesem Kapitel werden die Werkzeuge beschrieben, die für die Entwicklung einer Wärmedenaturierungsmethode und zum Erfassen und Auswerten der Daten mit dem Modus “Thermal Denaturation” der biochemischen Analyse-Software benötigt werden. Der erste Abschnitt “Vorbereiten einer Wärmedenaturierungsmessung" auf Seite 30 enthält Informationen über die Schritte, die vor der Messung durchzuführen sind. Sie erfahren, wie das Spektrofotometer und die Temperaturstufe für die Peltier-Temperatursteuerung eingerichtet und die verschiedenen Optionen für die Analyseauswertung ausgewählt werden.

Im zweiten Abschnitt “Das Wärmedenaturierungsexperiment" auf Seite 39 werden die eigentliche Wärmemessung, die Online-Überwachung in Echtzeit und die Möglichkeiten der Datenverarbeitung mit der Agilent ChemStation Software beschrieben.



Vorbereiten einer Wärmedenaturierungsmessung

Bevor Sie eine Wärmedenaturierungsmessung durchführen, müssen Sie Ihr System Ihrer Anwendung entsprechend einrichten. In diesem Abschnitt erfahren Sie, wie das Spektrofotometer und die Temperaturstufe für die Peltier-Temperatursteuerung eingerichtet werden und eine Wärmedenaturierungsmethode für die Analyse von DNA- und Proteinproben entwickelt wird.

HINWEIS Die Agilent 89090A Peltier-Temperatursteuerung muß bereits konfiguriert sein, bevor der Modus “Thermal Denaturation” gestartet wird.


Der Modus “Thermal Denaturation” 3

Starten des Modus “Thermal Denaturation”

Um den Modus “Thermal Denaturation” der biochemischen Analyse-Software zu starten, wählen Sie die Option “Thermal Denaturation” im Menü “Mode” oder im Dropdown-Listenfeld “Mode” in der grafischen Benutzeroberfläche aus.

In Abbildung 2 ist die grafische Benutzeroberfläche für den Modus “Thermal Denaturation” der Agilent ChemStation Software dargestellt. Der derzeit aus-gewählte Modus wird im Dropdown-Listenfeld “Mode” in der Symbolleiste angegeben. In der Symbolleiste befindet sich auch das Feld mit dem Namen der Methode. Dort wird der Name der eigentlichen Analysemethode angezeigt. In der Symbolleiste befinden sich außerdem Symbolschaltflächen. Diese sind im Bedienungshandbuch für das Agilent 8453 System für UV-Vis-Spektroskopie detailliert beschrieben.

In der oberen Analyseanzeige befindet sich eine Schaltfläche, über die das Dialogfenster “Calculation Parameters” aufgerufen werden kann. Die blaue Statusleiste informiert über den Fortschritt der Wärmedenaturierungs-

Abbildung 2 Die grafische Benutzeroberfläche im Modus “Thermal Denaturation”



messung. Die Probennahmeanzeige enthält eine Schaltfläche, über die das Dialogfenster “Temperature Ramp” und eine Anzeige für die aktuelle Temperatur aufgerufen werden kann.

Einrichten Ihres Spektrofotometers

Rufen Sie das Menü “Instrument” in der biochemischen Analyse-Software auf, um Ihr Agilent 8453 Spektrofotometer für eine Wärmedenaturierungs-messung einzurichten. Das Einrichten der wichtigsten Parameter des Spektrofotometers erfolgt wie beim Modus “Kinetics” Ihrer Agilent ChemStation (siehe “Einrichten Ihres Spektrofotometers" auf Seite 14).

Einrichten der Temperaturstufe

Im Modus “Thermal Denaturation” muß die Peltier-Temperatursteuerung als Probennahmesystem eingerichtet sein. Dies wird in der Geräteanzeige im Feld “Sampling” mit “Thermostattable Cell” angezeigt. Klicken Sie auf die Schaltfläche “Setup” neben dem Feld “Sampling”, um das Dialogfenster “Temperature Ramp” aufzurufen. Hier können Sie das Temperaturprogramm für das Wärmedenaturierungsexperiment einrichten.



Jede Zeile in diesem Dialogfenster definiert eine Temperaturstufe.

• Die Spalte “No.” enthält die Nummer der Temperaturstufe. Die Temperaturstufen sind aufsteigend numeriert.

• Die Spalte “Start” enthält die Starttemperatur für die Stufe. Wenn Sie eine Stufe hinzufügen, wird als Starttemperatur standardmäßig die Stopptemperatur der vorherigen Stufe vorgegeben.

• Die Spalte “Stop” enthält die Endtemperatur für die Stufe. Wenn Sie dem Programm eine Stufe hinzufügen, ist die Stopptemperatur undefiniert. Die maximale Stopptemperatur beträgt 100 °C.

• Die Spalte “Increment” enthält den Wert, um den die Temperatur schrittweise erhöht wird. Das Standardintervall beträgt 0,5 °C.

• Die Spalte “Hold Time” enthält die Zeit, wie lange jede Temperaturstufe gehalten wird. Die standardmäßige Haltezeit beträgt 1,00 Min.

Einrichten einer Wärmedenaturierungsmethode

Um die Analyseparameter Ihrer Wärmedenaturierungsmethode zu bearbeiten, wählen Sie im Menü “Method” die Option “Calculation” aus, oder klicken Sie in der Analyseanzeige Ihrer grafischen Benutzeroberfläche auf die Schaltfläche “Setup”. Jetzt erscheint das Dialogfenster “Calculation Parameters”.



Im Feld “Use wavelength at:” können Sie die Wellenlänge der verarbeiteten Daten, aus welchen die Amplitudenwerte für das Wellenlängenergebnis extrahiert werden, festlegen. Die standardmäßige Wellenlänge beträgt 260 nm. Wenn Sie Wellenlängen eingeben, für die keine Meßdaten verfügbar sind (beispielsweise keine ganzzahligen Werte), werden die Amplitudenwerte durch lineare Interpolation berechnet.

Im Feld “Background correction” können Sie eine Hintergrundkorrektur festlegen, die beim Wellenlängenergebnis für die Berechnung des Ergebnisses einer Funktion angewendet werden soll. Klicken Sie auf den nach unten zeigenden Pfeil, und wählen Sie im Dropdown-Listenfeld eine Prozedur für die Hintergrundkorrektur aus. Es stehen die gleichen Optionen wie beim Modus “Kinetics” zur Verfügung.

Im Abschnitt “Temperature” können Sie die Quelle für Ihre Temperaturmessung auswählen. Klicken Sie auf den nach unten zeigenden Pfeil, und wählen Sie im Dropdown-Listenfeld die Temperaturquelle aus.



Wenn Sie “Internal sensor” für den internen Fühler auswählen, wird die Temperatur des Thermostatküvettenhalters, die von der Peltier-Temperatursteuerung gemessen wird, für Auswertung der Daten verwendet. Wenn Sie “External sensor” für einen externen Fühler auswählen, wird die Temperatur Ihrer Probe, die vom externen Temperaturfühler gemessen wird, für die Auswertung der Daten verwendet.

Im Abschnitt “Set calculation range” können Sie die Berechnung der Ergebnisse für alle Meßkurven auf einen bestimmten Temperaturbereich beschränken. In den Feldern “From:” und “to:” werden der untere und der obere Grenzwert für den Temperaturbereich eingegeben.

Im Abschnitt “Absorbance ratio” kann eine Temperatur festgelegt werden, bei der die Absorptionen normalisiert werden. Die Temperaturkurve wird durch den Absorptionswert bei der spezifizierten Temperatur geteilt. Markieren Sie die Option “Normalize at temperature”, um die Normalisierung einzuschalten. Geben Sie im Feld daneben die Normalisierungstemperatur ein.

Im Abschnitt “TM calculation” kann das Berechnungsverfahren für die Schmelztemperatur ausgewählt werden.

• Wählen Sie die Option “Average (mean value)”, um die Schmelztemperatur als die Temperatur beim Mittelwert der Absorption zu berechnen, beim Anfang des Berechnungsbereichs und beim Ende des Berechnungsbereichs.

• Wählen Sie die Option “Derivative”, um die Schmelztemperatur anhand des ersten Derivates der Temperaturkurve zu berechnen. Geben Sie unter “Filter length” die Filterlänge für die Derivatberechnung und unter “Sensitivity” die Sensitivität für die Anzeige von Tm-Werten ein.

• Mit dem Wert im Feld “Filter length” wird die Anzahl der Datenpunkte festgelegt, die für die Berechnung der einzelnen Punkte in der Derivatkurve verwendet werden. Der Wert muß eine ungerade Zahl zwischen 5 und 749 sein. Der Standardwert ist 21. Durch eine Erhöhung der Anzahl der Punkte verbessert sich die Glättung der sich ergebenden Kurve.

• Es werden nur Maximum- und Minimumwerte angezeigt, die sich mindestens mit dem Wert im Feld “Sensitivity” von ihren benachbarten Maximum- und Minimumwerten unterscheiden. Bleibt das Feld leer, wird die Sensitivität auf 1/1000 des Unterschiedes zwischen dem Maximumwert und dem Minimumwert eingestellt.

Im Abschnitt “Equation” können Sie die Gleichung für Berechnung eines Ergebnisses definieren.



• Geben Sie im linken Feld einen Parameternamen für das Ergebnis und im rechten Feld die Gleichung ein. Verwenden Sie “Tm” (Schmelztemperatur), “M” (Stoffmengenkonzentration der Probe) und “K” (DNA-Länge).

• Im Abschnitt “Equation for thermal expansion” können Sie eine Korrektur für die Veränderung der Absorption aufgrund der Wärmeausdehnung der Lösung bei der Erwärmung vornehmen. Markieren Sie die Option “Volume correction”, um festzulegen, daß eine Korrektur für die Wärmeausdehnung vorgenommen werden soll. Geben Sie im Feld “Volume (T) =” die Gleichung für die Volumenkorrektur ein. Sie können in der Gleichung für die Volumenkorrektur die gleichen Operatoren wie im Abschnitt “Equation” verwenden. Benutzen Sie für die Probentemperatur die Variable T.

Wählen Sie die Option “Temperature & Options” im Menü “Method” aus, um das Dialogfenster “Temperature & Options” aufzurufen. In diesem Dialogfenster können Sie zwischen verschiedenen Optionen für Ihr Wärmedenaturierungsexperiment wählen.



• Im Abschnitt “Temperature unit” können Sie die Einheiten für die Temperaturmessung und -steuerung auswählen. Sie können wählen zwischen Celsius (°C), Kelvin (K) und Fahrenheit (°F).

• Markieren Sie im Abschnit “Stirrer” die Option “On”, um den Rührer einzuschalten. Wenn der Rührer eingeschaltet ist, können Sie die Geschwindigkeit in rpm im Feld “Speed” einstellen.

• Im Abschnitt “Online trace monitor” können Sie die Absorptionsskalierung (Y-Achse) der Online-Überwachung der Kurve festlegen. Markieren Sie die Option “Auto scaling”, damit die ChemStation die Absorptionsskalierung basierend auf der Signalintensität berechnen kann. Sie können auch die Option “Fixed scaling” markieren und eine feste Absorptionsskalierung definieren. Wenn Sie die Option “Fixed scaling” auswählen, können Sie den unteren und oberen Grenzwert der Absorptionsskalierung in den Feldern “From:” und “to:” festlegen.

• Im Abschnitt “Idle temperature” können Sie die Temperatur bearbeiten, die zwischen Wärmedenaturierungsexperimenten eingestellt wird.

• Im Abschnitt “Ramping speed” können Sie die Geschwindigkeit einstellen, mit der die Temperatur steigt. Markieren Sie die Option “Slow”, damit die Temperatur schrittweise auf jede Temperaturstufe steigt. Markieren Sie die Option “Fast”, damit die Temperatur ballistisch auf jede Temperaturstufe steigt.

• Markieren Sie die Option “Autosave spectra to file”, um festzulegen, ob die erfaßten Spektren zu speichern sind. Geben Sie in diesem Feld einen Namen für die Datendatei ein. Der Name muß den DOS-Konventionen entsprechen (max. 8 alphanumerische Zeichen). Wenn die Option “Autosave spectra to file” nicht markiert ist, werden die Spektren nicht gespeichert.

• Im Feld “Method information” können Sie eine Beschreibung der Methode eingeben. Im Feld können alphanumerische Zeichen erfaßt werden. Die Beschreibung kann beliebig lang sein. Der Text wird am Zeilenende automatisch umbrochen.

HINWEIS Bei großen Schritten besteht bei Auswahl der Option “Fast” die Gefahr, daß die Temperatur überschritten wird..



Wenn Sie die Option “Set Individual Calculation Range” im Menü “Method” auswählen, erscheint das Dialogfenster “Set Individual Calculation Range”. Hier können Sie einen Temperaturbereich für die Berechnung der Wärmedenaturierungsergebnisse bei der derzeit angezeigten Meßkurve definieren. Geben Sie in den Feldern “From:” und “to:” den unteren und den oberen Grenzwert für den Temperaturbereich ein.



Das Wärmedenaturierungsexperiment

Nachdem die Temperaturstufe definiert wurde und die Parameter für die Methode bearbeitet wurden, können Sie mit Ihrem Wärmedenaturierungs-experiment beginnen. Dieser Abschnitt enthält Informationen über die Online-Überwachung der Messung in Echtzeit und über die Funktionen der Agilent ChemStation für die Verarbeitung Ihrer experimentellen Daten.

Durchführen eines Wärmedenaturierungsexperimentes

Messungen können entweder über das Menü “Measure” in der Menüleiste oder durch Anklicken der Schaltflächen (“Blank”, “Sample”, “Thermal Measurement”) in den seitlichen Anzeigen der grafischen Benutzeroberfläche oder über bestimmte Funktionstasten gestartet werden.

Bevor Sie ein einzelnes Spektrum messen oder ein Wärmedenaturierungs-experiment durchführen können, müssen Sie ein Blindspektrum messen. Wählen Sie hierfür im Menü “Measure” die Option “Blank” aus, oder drücken Sie die Funktionstaste F4, oder klicken Sie auf die Schaltfläche “Blank” in den seitlichen Anzeigen der grafischen Benutzeroberfläche.

Um ein einzelnes Spektrum der Lösung in der Küvette zu messen und dieses im Fenster “Sample Spectra” anzuzeigen, wählen die Option “Sample (Single Spectrum)” im Menü “Measure” aus. Um ein einzelnes Spektrum zu messen, können Sie auch die Funktionstaste F5 drücken oder auf die Schaltfläche “Sample” in den seitlichen Anzeigen der grafischen Benutzeroberfläche klicken.

Wenn Sie die Funktionstaste F7 drücken oder die Option “Thermal Measurement” im Menü “Measure” auswählen oder die entsprechende Schaltfläche in den seitlichen Anzeigen der grafischen Benutzeroberfläche anklicken, erscheint das Dialogfenster “Sample Information”.

• Geben Sie im Feld “Sample Name” den Probennamen ein. Der Probenname wird in Tabellen und Berichten angegeben.

• Geben Sie im Feld “Solvent” einen Lösungsnamen ein. Die Detailangaben zur Lösung werden in der Tabelle “Results of Trace” und Berichten angegeben.



• Geben Sie im Feld “Molarity (M)” die Stoffmengenkonzentration der Probe in mol/l ein. Die Stoffmengenkonzentration wird in der Tabelle “Results of Trace” und in Berichten angegeben und bei der %G-C Berechnung verwendet.

• Geben Sie im Feld “DNA Length (K)” die DNA-Länge der Probe in Basispaaren (bp) ein. Die DNA-Länge wird in der Tabelle “Results of Trace” und in Berichten angegeben und bei der %G-C Berechnung verwendet.

• Sie können im Feld “Comment” Anmerkungen eingeben (beispielsweise eine Beschreibung der Probe).

Klicken Sie in der Geräteanzeige auf die Schaltfläche “Sample”, um die Erfassung zu starten und die Fenster “All Spectra”, “Trace” und “Sample Information” anzuzeigen. Zuerst stellt die Peltier-Temperatursteuerung die Starttemperatur am Küvettenhalter ein. Nachdem die im Dialogfenster “Temperature Ramp” definierte Haltezeit abgelaufen ist, wird das erste Spektrum gemessen. Dann wählt die Peltier-Temperatursteuerung die nächste Temperaturstufe aus.

Während der Wärmemessung können Sie die Erfassung der Spektren und der Temperaturkurven in Echtzeit in den Fenstern “All Spectra” und “Trace” verfolgen.

Wenn die Wärmedenaturierungsmessung abgeschlossen ist oder vom Benutzer abgebrochen wurde, werden die Daten so gespeichert, wie dies im Dialogfenster “Temperature & Options” festgelegt ist. Die Kurven werden anhand der Prozedur ausgewertet. Die Prozedur wurde im Dialogfenster “Calculation Parameters” ausgewählt. Diese Ergebnisse werden im Fenster “Results” angezeigt.

Auswerten der Wärmedenaturierungsdaten

Wenn die Wärmedenaturierungsmessung abgeschlossen ist, können Sie die experimentellen Daten erneut auswerten. Da während der Messung vollständige Spektren erfaßt wurden, können alle Parameter im Dialogfenster “Calculation Parameters” geändert werden. Klicken Sie auf OK, um die Änderungen zu bestätigen. Die neuen Ergebnisse werden im Fenster “Results of Heating Trace” angezeigt. Wenn die Parameter der Methode geändert wurden, wird dies in der Symbolleiste durch die Angaben “Mod” angezeigt.



Im Fenster “Results of Heating Trace” können Sie über die Schaltfläche “Edit Sample Information” das Dialogfenster “Sample Information” aufrufen. Hier können Sie Informationen zu Ihren Proben aufnehmen und bei der Berechnung von Ergebnissen verwenden.

Anzeigen der Ergebnisse

Für die Anzeige Ihrer erfaßten und verarbeiteten Daten und für die Ergebnisse in Tabellenform stehen verschiedene Optionen zur Verfügung. Wählen Sie das Menü “View” aus. Es enthält folgende Optionen:

• “All Spectra” zeigt alle erfaßten Spektren im Fenster “Sample Spectra” an.

• “Spectra of Current Trace” zeigt die Spektren der derzeit im Fenster “Spectra of Current Trace” ausgewählten Kurve an.

• “All Traces” zeigt alle Temperaturkurven im Fenster “Temperature Trace” an.

• “Traces and Results” zeigt das Fenster “Time Traces”, das Fenster “Results” und die Tabelle “Method Summary” an.

• “Measured Single Spectra” zeigt ein gemessenes Spektrum im Fenster “Single Spectra” an.

• “Last Blank Spectrum” zeigt das Fenster “Last Blank Spectrum” an.

• “Tabulate Selected Spectrum/Trace” zeigt die Tabelle “Tabular Data of Spectra” des ausgewählten Spektrums oder die Tabelle “Tabular Data of Time Traces” der ausgewählten Zeitkurve an. Diese Tabellen werden auch automatisch angezeigt, wenn Sie in der grafischen Darstellung mit der linken Maustaste auf ein Spektrum bzw. eine Zeitkurve doppelklicken oder wenn Sie bei Verwendung des Cursors die Eingabetaste drücken. Der Titel der Tabelle weist auf den Spektrumtyp hin (beispielsweise “Sample”, “Standard”), wobei die Nummer des Spektrums bzw. der Zeitkurve im Fenster in Klammern angegeben wird (beispielsweise [1]).

• “Logbooks” ruft das Dialogfenster “Logbooks” auf, in dem Sie ein Protokoll aufrufen können, um dies anzuzeigen oder zu drucken.

• “Load Logbook” ruft das Dialogfenster “Load Logbook” auf, in dem Sie ein zuvor gespeichertes Protokoll auswählen und laden können.



• “Next Window” wechselt in das nächstfolgende Fenster. Sollte das Fenster durch andere Fenster verdeckt sein, wird es mit dem Befehl “Next Window” im Vordergrund positioniert. Wenn das Fenster auf Symbolgröße verkleinert ist, wird es mit dem Befehl “Next Window” in seiner Standardgröße und Standardposition angezeigt. Der Befehl “Next Window” kann auch durch Drücken der Funktionstaste F11 aktiviert werden.

• “Previous Window” wechselt in das vorherige Fenster. Sollte das Fenster durch andere Fenster verdeckt sein, wird es mit dem Befehl “Previous Window” im Vordergrund positioniert. Wenn das Fenster auf Symbolgröße verkleinert ist, wird es mit dem Befehl “Previous Window” in seiner Standardgröße und Standardposition angezeigt.

• “Reset Current View” setzt alle Fenster in der aktuellen Anzeige auf ihre Standardgrößen und Standardpositionen zurück.


Index

AAutomatische Skalierung, 25Automatisches Speichern, 23, 37

BBerechnungsbereich, 21, 35Blindmessung, 24Blindspektrum, 39, 41

CCalculation Parameters, Dialogfenster, 31,

33, 40

DDelta AU, 21Deuteriumlampe, 15DNA

Länge, 36, 40Dreipunkt-Dropline, 20

EEndtemperatur, 33Externe Triggerung, 23

FFilterlänge, 35First order kinetics, 21

GGleichung

Bearbeiten, 35Grafische Benutzeroberfläche, 12

HHaltezeit, 33Hintergrundkorrektur, 19, 34

IInhibitor, 26Initial Rate, 21Installationsqualifikation, 8Installieren

Software, 8Instrument Parameters, Dialogfenster, 14Integrationszeit, 15, 23

KKonfigurationseditor, 9

LLampen, 15Last Blank Spectrum, 27Laufzeit, 20Logbook, 28, 41

MMath Results, 27Mehrfachküvettentransport, 16, 22, 26Menü

Config, 23Instrument, 14, 32Measure, 24Method, 18Mode, 12, 31View, 27

MessungWärme, 39zeitbasiert, 14, 25

MethodeInformationen, 23, 37Parameter, 18, 26Wärmedenaturierung, 33

Mindestzyklusdauer, 21

OOnline-Überwachung, 37Options & Info, Dialogfenster, 18, 22, 24

PPeltier-Temperatursteuerung, 9, 16, 18,

32, 40Probeninformationen, 23, 26Probennahmesystem, 16

RResults, Fenster, 25, 27Rührergeschwindigkeit, 37

SSchmelztemperatur, 35

Derivat, 35durchschnittliche, 35Sensitivität, 35

Seitliche Anzeigen, 13Starttemperatur, 33, 40Startzeit, 20Streulichtkorrektur, 21, 23Substrat, 26Symbolleiste, 12, 31


Index

TTemperatur

Einheiten, 37externer Fühler, 34interner Fühler, 34Ruhezustand, 37

Temperature & Options, Dialogfenster, 36, 40

Temperaturstufe, 31, 32, 40Time & Calculation, Dialogfenster, 18, 26Time Trace, Fenster, 25

UÜberwachung, 20Ungültige Datenpunkte, 23, 24

VVerstärkung, 23, 24

WWärmedehnung, 36Wärmedenaturierung, 31Weglänge, 17, 18Wellenlänge, 19, 34Wellenlängenbereich, 14Wellenlängenintervall, 15Wolframglühlampe, 15

ZZero Cell Spectra, 27Zero Cells, 24Zero order kinetics, 21Zyklusdauer, 15, 21, 23


Agilent Technologies Deutschland GmbH 2002-2003

Gedruckt in Deutschland10/2003

*G1117-92008**G1117-92008*G1117-92008

www.agilent.com

Agilent Technologies

In diesem Handbuch

Die biochemische Analyse-Software für Agilent ChemStation ergänzt die allgemein verwendbare Software um den Modus “Kinetics” und den Modus “Thermal Denaturation”. Mit diesen beiden Modi können am Agilent 8453 Spektrofotometer Experimente mit der Kinetik und mit der Wärmedenaturierung durchgeführt werden. Dies umfaßt die Möglichkeit, analytische Methoden zu entwickeln, Ihre laufenden Experimente in Echtzeit und online zu überwachen und Werkzeuge für die Auswertung und Verarbeitung der experimentellen Daten..

Dieses Handbuch enthält Anleitungen für die Installation der Software- und Hardware-Komponenten, die für Experimente mit der Kinetik und mit der Wärmedenaturierung benötigt werden. Weiterhin finden Sie in diesem Handbuch Informationen über die wichtigsten Software-Funktionen, die Sie bei der Behebung von Analyseproblemen unterstützen.

Agilent ChemStation für UV-Vis-SpektroskopieBedienungshandbuch für Biochemische Analyse-SoftwareInhaltInstallation und KonfigurationInstallieren der biochemischen Analyse-SoftwareKonfigurieren der Agilent�89090A Peltier-Temperatursteuerung

Der Modus “Kinetics”Vorbereiten einer zeitbasierten MessungStarten des Modus “Kinetics”Einrichten Ihres SpektrofotometersKonfigurieren des ProbennahmesystemsEinrichten einer kinetischen Methode

Die kinetische MessungDurchführen einer zeitbasierten MessungAuswerten der kinetischen DatenAnzeigen der Ergebnisse

Der Modus “Thermal Denaturation”Vorbereiten einer WärmedenaturierungsmessungStarten des Modus “Thermal Denaturation”Einrichten Ihres SpektrofotometersEinrichten der TemperaturstufeEinrichten einer Wärmedenaturierungsmethode

Das WärmedenaturierungsexperimentDurchführen eines WärmedenaturierungsexperimentesAuswerten der WärmedenaturierungsdatenAnzeigen der Ergebnisse

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Biochem - Agilent · 2015. 10. 6. · Title: Biochem.book Author: Thomas Klink Created Date: 2/10/2004 3:13:42 PM