288 WISSENSCHAFT · SPECIAL: GENOMICS

JOCHEN SCHMID, STEVEN KOENIG, BRODER RÜHMANN, MARIUS RÜTERING,

VOLKER SIEBER

LEHRSTUHL FÜR CHEMIE BIOGENER ROHSTOFFE, TU MÜNCHEN

Microbial exopolysaccharides (EPS) are biogenic and biodegradable poly-mers. The range of their application is extending steadily and in someareas they are already competing with conventional petrochemical prod-ucts such as polyacrylates. Despite growing interest in microbial EPS,biosynthesis and production on a molecular scale are still not fully under-stood. By connecting genomic and structural data, it is possible to gainnew insights into EPS biosynthesis. Our aim is to extend the knowledgeon enzyme functions and biosynthetic pathways involved in microbial EPSproduction.

10.1007/s12268-014-0443-0© Springer-Verlag 2014

ó Polysaccharide sind vielgestaltig und kön-nen dadurch unterschiedliche Funktionenerfüllen. In Mikroorganismen dienen sie alsSpeicherstoff, Strukturelement der Zellwandoder sogar der Pathogenitätsvermittlung. Die-

se Vielseitigkeit schlägt sich auch im techni-schen und industriellen Interesse an Poly-sacchariden nieder: Ob Bau-, Lebensmittel-chemie oder die Lackindustrie, Polysacchari-de ersetzen hier zunehmend petrochemisch

basierte Polymere wie z. B. Polyacrylate [1].Gegenüber pflanzlichen Polysacchariden kön-nen mikrobielle Polysaccharide ganzjährigund umgebungsunabhängig produziert wer-den. Das regionale Klima hat keinen Einflussauf die Zusammensetzung und Qualität derProdukte. Zudem erfolgt die Aufarbeitung beiden in die Umgebung ausgeschiedenen Exo-polysacchariden (EPS) meist auf einem ein-facheren Weg als bei den pflanzlichen Poly-sacchariden. Des Weiteren lassen sich die fürdie Produktion wesentlichen Mikroorganis-men leichter auf Genomebene modifizierenals Pflanzen und besitzen höhere Produkti-vitäten. Produkttiter von bis zu 50 Grammpro Liter (Xanthan) und das Entfallen kos-tenintensiver Ernte und Produktaufarbeitungerlauben eine wirtschaftliche Produktion undwecken das Interesse der Industrie [2]. Nebenwenigen bereits kommerziell genutzten EPSexistiert auch eine Vielzahl unbeachteter odernoch unentdeckter EPS-Produzenten. DieNatur birgt hier noch ein sehr großes Poten-zial an wertvollen Polymeren mit äußerstinteressanten Eigenschaften [3, 4]. Trotz die-ser Vorteile und der bereits langjährigen Ver-wendung einzelner mikrobieller EPS mangeltes bis heute an einem tiefen Verständnis derBiosynthese auf molekularbiologischer Ebene.

Bakterielle Exopolysaccharide

Biosynthese und Genomik mikrobieller Polysaccharide

BIOspektrum | 03.14 | 20. Jahrgang

¯ Abb. 1: Wzy-abhängige Assemblierung undAusschleusung von bakteriellen Exopolysac-chariden (EPS) am Beispiel von Gellan. DieAnordnung der entsprechenden Gene findetsich im zugehörigen Cluster (Abb. 2). Im Zyto-plasma synthetisierte Nukleotidzucker (I) wer-den an der zytoplasmatischen Membran überLipidträger (Polyprenolphosphat) mittels derGlykosyltransferasen GelB, GelK, GelL undGelQ zu Wiederholungseinheiten assembliert(II). Flippasen (Wzx bzw. GelS) katalysieren denTransport durch die Membran. Dieses Zu sam -men spiel von Glykosyltransferasen, Flippasenund Polymerasen (Wzy bzw. GelG, Wzc bzw.GelC, Wzz bzw. GelE) führt zu einer Anpassungvon Kettenlänge und Zuckersequenz. Das ferti-ge Polymer wird mithilfe des Wza-Proteins(bzw. GelD) aus dem Periplasma ausgeschleust(III). Modifiziert nach [11].

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Details hierzu sind lediglich für einige kom-merzielle Polysaccharide wie z. B. Xanthan,Alginat oder einige Sphingane (Gellan, Diu-tan) bekannt. Allgemein dienen Nukleotid-zucker (z. B. UDP-Glukose, GDP-Mannose) alsVorstufen der Polysaccharide. VerschiedeneGlykosyltransferasen sind am Aufbau der EPSinklusive Substituenten beteiligt. Die Funk-tion und Eigenschaften der einzelnen Enzymesind aber nur lückenhaft verstanden, insbe-sondere die Regulationsmechanismen unter-scheiden sich stark voneinander und sindnoch nicht grundlegend aufgeklärt [5, 6].

BiosyntheseGenerell sind drei unterschiedliche Wege derbakteriellen EPS-Produktion beschrieben: derWzy-abhängige, der Synthase-abhängige undder ABC-Transporter-abhängige Weg [7]. Inden ersten beiden Fällen resultiert der Nameaus den an der Synthese beteiligten Polyme-rasen, im dritten Fall von dem am EPS-Exportbeteiligten Transporter in der Zellmembran.Die Wiederholungseinheiten von Polysac-chariden, die aus verschiedenen Zuckernbestehen (Heteropolymere), werden im Zyto-plasma synthetisiert. Anschließend erfolgtdie Polymerisierung/Assemblierung undSekretion meist über den Wzy-Weg. Der Auf-bau der Wiederholungseinheiten an der zyto-plasmatischen Membran wird dabei überLipidträger (Polyprenolphosphat) realisiert.Flippasen katalysieren den Transport der Bau-steine durch die Membran, im periplasmati-schen Raum werden sie dann kontrolliertpolymerisiert (Abb. 1). Der detaillierte Mecha-nismus der einzelnen Glykosyltransferasen,Flippasen (Wzx) und Polymerasen (Wzy, Wzz,Wzc) ermöglicht die passgenaue Einstellungvon Kettenlänge und Zuckersequenz. Die Aus-schleusung des Polymers aus dem Periplasmaerfolgt mittels des Wza-Proteins, das an deräußeren Membran verankert ist. Im Gegen-satz dazu werden Homopolymere, wie bakte-rielle Cellulose und Alginat, direkt durch dieMembran polymerisiert. Für diese Polymereentfällt auch die Notwendigkeit der Lipidträ-ger [5]. In gut charakterisierten EPS-Produ-zenten erhalten die entsprechenden GeneBenennungen mit Bezug zu dem gebildetenEPS (alg: Alginat, gel: Gellan etc.).

Die meisten Gene für die Biosynthese vonEPS sind in Clustern im Genom organisiert,die oft sämtliche Gene von der Herstellungder EPS-Vorstufen (Nukleotidzucker) bis hinzu den Membranproteinen zur Ausschleu-sung der fertigen EPS umfassen (Abb. 2).Während die Biosynthesegene örtlich nahe

zusammenliegen, befinden sich die regulato-rischen Gene oft weit von den eigentlichenGenclustern entfernt und unterliegen kom-plexen Regulationsmechanismen auf Tran -skriptebene [8]. Auch eine Regulationmittels Quorum sensing oder Biofilmbildung(externer DNA- und Protein-Gehalt) wirdbeobachtet [9].

Biosynthese und AnalytikNeben den genomischen und metabolischenGrundlagen der Biosynthese ist auch die Ana-lyse und Charakterisierung der gebildetenEPS von großer Bedeutung. Erst mit einer voll-ständig aufgeklärten chemischen Strukturkann man die physikochemischen Eigen-schaften der EPS verstehen und gezielt nut-zen. Die Aufklärung der komplexen chemi-schen Struktur von Polysacchariden ist aberaufwendig und bedarf meist mehrerer Ana-

lyseverfahren wie Hochleistungsflüssigkeits-chromatografie (HPLC), Gaschromatografiemit Massenspektrometrie-Kopplung (GC-MS),Fourier-Transformations-Infrarotspektro -skopie (FT-IR) und Kernspinresonanzspek-troskopie (NMR).

Allerdings kann die Kenntnis der Mono-merzusammensetzung und die zugrunde lie-gende Genetik bereits Aufschluss über dieFunktion der einzelnen an der Biosynthesebeteiligten Gene geben. Eine gezielte Suchenach EPS-Clustern im Genom neu identifi-zierter EPS-Produzenten in Verbindung mitder Monomerzusammensetzung ermöglichtsomit erste Aussagen zu den Polymeren. Solässt eine vorhandene Wzy-Polymerase aufein EPS mit regelmäßigen Wiederholungs-einheiten schließen. Zusätzlich vorhandeneGene für Lipidträger stellen ein Indiz für dieAssemblierung im Zytoplasma und Trans -

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˚ Abb. 2: Identifizierung der EPS-Cluster im sequenzierten Genom. A, grafische Darstellung desassemblierten Genoms von Sphingomonas spec. ATCC 31461 mit zugehörigem EPS-Cluster zurGellanproduktion (rot). Innere Kreise GC-Plot und GC-Asymmetrie zur Beurteilung der DNA-Repli-kation. B, annotierter Gellan-Cluster mit Funktion der einzelnen Gene bei der Biosynthese. WeitereGene (z. B. gelS = wzx) liegen geclustert auf entfernteren Genomabschnitten vor.

B

A

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lokation der Bausteine über die Plasmamem-bran dar.

GenomikDank Next-Generation-Sequencing-Technolo-gien ist man heutzutage in der Lage, mitgeringem Aufwand große Teile mikrobiellerGenome, auch neu isolierter Stämme, zusequenzieren. Auf Basis automatisierterAnnotation der resultierenden draft genomeserhalten wir erste Anhaltspunkte über mög-liche EPS-Cluster. Unter Umständen werdendie wichtigen Proteine wie Glykosyltrans-ferasen aufgrund geringer Homologie undfehlender Referenzsequenzen nicht automa-tisch annotiert. Vergleichende Genomik undmanuelle Analyse erlauben die Zuordnungder hypothetischen Proteine innerhalb derEPS-Cluster. Eine am Lehrstuhl für ChemieBiogener Rohstoffe, TU München, entwickel-te Analytikplattform ermöglicht es, EPS- produzierende Mikroorganismen im Hoch-durchsatz zu screenen und gleichzeitig dieMonomerzusammensetzung quantitativ zuana lysieren [10]. Diese Informationen inZusammenhang mit den Genomdaten erlau-ben eine Aussage über den Aufbau der EPS.So kann z. B. beim Fehlen von Fukose unddem Vorliegen von Galaktose davon ausge-gangen werden, dass keine Fukosyltrans-ferasen, dafür aber Galaktosyltransferasenvorliegen. Mittels Deletionsmutanten undmodifizierten Enzymvarianten charakteri-sieren wir die Biosynthese und erweiternbestehende öffentliche Datenbanken. Anhandveränderter Verhältnisse in der Monomerzu-sammensetzung können die zuständigenEnzyme für die Monomere in der Seitenkettevereinfacht identifiziert werden. Für be son -ders interessante EPS erfolgt eine kompletteAufklärung der chemischen Struktur mittelsNMR und weiteren Analysen.

AussichtenIn Bezug auf Parameter wie Temperatursta-bilität, pH-Stabilität oder den rheologischenEigenschaften sind industriell verwendeteEPS noch limitiert. Zusätzliches Wissen überbekannte und neue EPS und die an ihrer Bio-synthese beteiligten Gene soll zukünftig dieHerstellung maßgeschneiderter EPS ermög-lichen. Durch gezielte Veränderungen an denEPS können wir ein besseres Verständnis derStruktur-Wirkungsbeziehungen der einzel-nen Monomere, Seitengruppen und Substi-tuenten erlangen. Durch Identifikation, Cha-rakterisierung und heterologe Expression derEPS-Cluster-Enzyme soll eine „Toolbox“ für

die Synthese mikrobieller EPS erschaffen wer-den, die nicht den bestehenden Limitierun-gen unterliegen oder gezielt an die jeweiligeAnwendung angepasst sind. Neben Genom-daten und Enzymcharakteristika sind hierfürpassende Plasmide und Metabolic-Enginee-ring-Strategien notwendig. Die Bereitstellungmaßgeschneiderter, biogener Polymere solldie Grundlage für die nachhaltige Anwen-dung von EPS auch in bisher nicht erschlos-senen Industriezweigen schaffen.

DanksagungWir danken der DFG (SPP 1569) und dem Gra-duiertenkolleg „BayReChem2050“ für diefinanzielle Unterstützung. ó

Literatur[1] Persin Z, Stana-Kleinschek K, Foster TJ et al. (2011)Challenges and opportunities in polysaccharides research andtechnology: the EPNOE views for the next decade in the areasof materials, food and health care. Carbohydrate Polymers 84:22–32[2] Sieber V, Wittmann E, Buchholz S (2006) Polysaccharide.In: Antranikian G (Hrsg) Angewandte Mikrobiologie.Springer, Berlin, 397–408[3] Baird JK, Sandford PA, Cottrell IW (1983) Industrial appli-cations of some new microbial polysaccharides.Nat Biotechnol 1:778–783[4] Mishra A, Jha B (2013) Microbial Exopolysaccharides. In:Rosenberg E et al. (Hrsg) The Prokaryotes. Springer, Berlin,179–192

[5] Rehm BH (2010) Bacterial polymers: biosynthesis, modifi-cations and applications. Nat Rev Microbiol 8:578–592[6] Schmid J, Muller-Hagen D, Bekel T et al. (2010)Transcriptome sequencing and comparative transcriptomeanalysis of the scleroglucan producer Sclerotium rolfsii.BMC Genomics 11:329[7] Yother J (2011) Capsules of Streptococcus pneumoniae andother bacteria: paradigms for polysaccharide biosynthesis andregulation. Annu Rev Microbiol 65:563–581[8] Ruffing AM, Chen RR (2012) Transcriptome profiling of acurdlan-producing Agrobacterium reveals conserved regulato-ry mechanisms of exopolysaccharide biosynthesis.Microb Cell Fact 11:17[9] Irie Y, Borlee BR, O’Connor JR et al. (2012) Self-producedexopolysaccharide is a signal that stimulates biofilm forma-tion in Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA 109:20632–20636[10] Fialho AM, Moreira LM, Granja AT et al. (2008)Occurrence, production, and applications of gellan: currentstate and perspectives. Appl Microbiol Biotechnol 79:889–900

Korrespondenzadresse:Dr.-Ing. Jochen SchmidLehrstuhl für Chemie Biogener RohstoffeTechnische Universität MünchenSchulgasse 16D-94315 StraubingTel.: 09421-187-331Fax: 09421-187-310j.schmid@tum.dewww.rohstoffwandel.de

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AUTOREN

Volker SieberJahrgang 1970. 1990–1995 Chemie- bzw. Bioche-miestudium an der Universität Bayreuth und derUniversity of Delaware, Newark, USA. 1998 Pro-motion, 1999–2000 California Institute of Tech-nology, Pasadena, USA. 2001–2008 verschiede-ne Positionen in Forschung und Entwicklung beiDegussa und Süd-Chemie. Seit 2008 Lehrstuhlin-haber an der Technischen Universität München.

Jochen SchmidJahrgang 1974. 1998–2005 Biotechnologiestu-dium an der Technischen Universität Berlin. 2008Promotion im Bereich Mikrobiologie und Genetik.Seit 2009 wissenschaftlicher Mitarbeiter an derTechnischen Universität München, dort seit 2010Gruppenleiter Metabolic Engineering & Mikrobiel-le Polysaccharide.

Steven KoenigJahrgang 1987. 2006–2012 Biotechnologiestu-dium an der Hochschule Mannheim. Seit 2012Promotion am Lehrstuhl für Chemie BiogenerRohstoffe der Technischen Universität München.

Broder RühmannJahrgang 1977. 2000–2005 Biotechnologiestu-dium an der Fachhochschule Weihenstephan. Seit2005 Entwicklungsingenieur Biotechnologie beiEvonik Degussa GmbH. Seit 2009 Promotion amLehrstuhl für Chemie Biogener Rohstoffe derTechnischen Universität München.

Marius RüteringJahrgang 1986. 2007–2012 Water-Science-Stu-dium an der Universität Duisburg-Essen. Seit2013 Promotion am Lehrstuhl für Chemie Bioge-ner Rohstoffe der Technischen Universität Mün-chen.

Volker Sieber, JochenSchmid, Steven Koenig, Broder Rühmann und MariusRütering (v. l. n. r.)