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C A U Christian-Albrechts-Universität zu Kiel
Entwicklung stammspezifischer PCR-Systeme mittels subtraktiver
Hybridisierung anhand verschiedener Stämme von Milchsäurebakterien
Von Christian Stelter
Überblick
1. „Subtraktive Hybridisierung“
Ziel der Methode?
Welche Vorteile?
2. Prinzipieller Ablauf der Methode
3. Praktische Ergebnisse
4. Ausblick
Entwicklung
„Subtractive Hybridization“ als Basis, um
• genetische Unterschiede zu identifizieren.
Identifizierung von Genaktivität für
• Embryonalentwicklung
• Krebsentstehung
Identifizieren von Unterschieden im Genom
• verschiedener Stämme von Bakterien
• komplexer eukaryotischer Lebewesen
Biotechnologie in menschlichen Kulturen
• unkontrollierte Fermentation
• 6000 v. Chr. Alkoholische Getränke im Zweistromland
Milchwirtschaft durch Nomaden in Zentralasien
Ziel: Konservierung und Veredelung von Lebensmitteln
D a m als
H e u te
Star
terk
ultu
ren
1 . G e n e ra tio n
Notwendigkeit zur Diagnose
D a m als
H e u te
Star
terk
ultu
ren
1 . G e n e ra tio n
2 . G e n e ra tio n
3 . G e n e ra tio n
• genetische Identität
• Stabilität von Starterkulturen
• hygienische Risiken
• wirtschaftliche Effizienz
routinemäßige Verifikation
durch genetische Fingerabdrücke
Notwendigkeit zur Diagnose
D a m als
H e u te
Star
terk
ultu
ren
1 . G e n e ra tio n
2 . G e n e ra tio n
3 . G e n e ra tio n
• Fingerprinting
Notwendigkeit zur Diagnose
D a m als
H e u te
Star
terk
ultu
ren
1 . G e n e ra tio n
2 . G e n e ra tio n
3 . G e n e ra tio n
4 . G e n e ra tio n • Verständnis probiotischer Eigenschaften
Anwendbarkeit der SSH
Genomische Unterschiede identifizieren/isolieren
Um darauf aufbauend
a) Funktion der unterschiedlichen DNA zu analysieren
b) PCR-basierende Nachweissysteme zu erstellen
c) Eigenschaften in weiteren MOs zu detektieren
Subtraktive Hybridisierung
dominante Quelle der genomischen Variation: Insertionen oder Deletionen großer (10 bis 50 kb) DNA-Regionen
S ta m m A S ta m m B
=
Subtraktive Hybridisierung
gezielte Identifikation von Unterschiedenbesonders vorteilhaft
S ta m m A S ta m m B
=
Subtraktive Hybridisierung
S ta m m A S ta m m B
- =sp ez ifisch e F ra g m en tefü r S ta m m A
Subtraktive Hybridisierung
S ta m m B S ta m m A
- =sp ez ifisch e F ra g m en tefü r S ta m m B
Subtraktive Hybridisierung
Ausgangs-material
S ta m m A S ta m m B
Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung
Fragmentieren
S ta m m A S ta m m B
Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung
Mischen
S ta m m A S ta m m B+
Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung
Denaturieren
S ta m m A S ta m m B+
Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung
Hybridisieren
S ta m m A S ta m m B+
Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung
Isolieren
h o m o lo g e B ere ich e A n re ich e ru n gs tam m sp ez ifisch e r
F rag m e n te
+
wichtige Entwicklungsschritte
Entwicklungen innerhalb der „Subtraktiven
Hybridisierung“ betrafen die Isolierung der
stammspezifischen, einzelsträngigen DNA
a) Immobilisierung
b) Suppression Effekt
Isolierung durch Immobilisierung
ImmobilisierteSubtraktor-DNA
S ta m m B
Isolierung durch Immobilisierung
Zugegebene,denaturierteProben-DNA
S ta m m A
S ta m m B
Isolierung durch Immobilisierung
HomologeDNA-Fragmente
werden demÜberstandentzogen
S ta m m A
S ta m m B
Suppression Subtractive Hybridization
Verwendung von Adaptoren
Vorteile:1) Geringste Mengen2) Suppression Effekt
s tam m sp ez if isc h e
F rag m e n te
F rag m e n te , d ie in b e id enS tä m m e n v o rh a n d en s in d
Suppression Effekt
P C R -A m p lifik a tio n
U n te rd rü c k u n g
“H aa rn ad e l” -S ch le ife
Ve rv ie lfa ch u n g
Vorteile der SH/SSH
• Geringe Materialanforderungen (PCR)
• bis zu 96% der Unterschiede identifizierbar
• Verzicht auf die Sequenzierung vollständiger Genome
• Reduktion des zeitlichen und finanziellen Aufwandes
Bisherige Anwendung
Genomanalysen im medizinischen Bereich:
• Identifikation von Virulenzgenen
• neuartigen Restriktions-Modifikationssystemen
• Antibiotikaresistenzen
• Oberflächenstrukturen
• PAIs: „pathogenicity islands“
Praktische Ergebnisse
Anwendung auf Milchsäurebakterien
Lactococcus St. 1760-1526
Lactococcus St. 1526-1760
• Isolierung der unterschiedlichen Regionen:
• Funktionen der unterschiedlichen Regionen
• Stammspezifische PCR-Systeme
• Suche nach Eigenschaften in anderen MOs
Anreicherung stammspezifischer Fragmente
1526 – 1760 = ? 1760 – 1526 = ?
Gefundene Unterschiede
Lactococcus Stamm 1760
• A2: Bacteriocin-Produktion
• A5: Funktion unbekannt
Lactococcus Stamm 1526
• A22: zellwandassoziierte Proteinase
• A23: Restriktionsmodifikationssystem
[subunit (hsdS) gene]
PCR-Systeme auf die verwendeten Stämme
A2: Nisin
A5: ?
A22: Proteinase
A23: hsdSNisin
?
Proteinase
hsdS
1526 1760
PCR-Systeme auf weitere Stämme
89 bp: ?
166 bp: Proteinase
271 bp: hsdS
322 bp: Nisin
Weitergehende Anwendungen
Identifizieren von probiotischen Eigenschaften
• größere Überlebensrate
• dauerhafte Ansiedlung
• Reduktion von mutagenen Enzymen
• Stimulation von Makrophagen
Identifikation von gentechnisch veränderten Organismen
ehemalige Systementwicklung: Reaktionen auf Stress
Danke
Danisco Cultor Niebüll GmbH
Dr. Udo Friedrich
PD Dr. Winfried Hausner
Noch Fragen?
Wir haben einen Überschussan einfachen Fragenund einen Mangel
an einfachen Antworten.
Lothar Schmidt
Immer noch Fragen?
Gott weiß alles,sagt es aber nicht.
Ich weiß nichtsund sage alles.
unbekannt
Suppression Subtractive Hybridization
Ligation vonAdaptor 2
Tester DNA m it Adaptor 2Driver DNA (im Überschuss)
Erste Hybridisierungm it Denaturierung
Tester DNA m it Adaptor 1
Ligation vonAdaptor 1
Tester DNADriver DNA
EnzymatischerVerdau
Suppression Subtractive Hybridization
Zweite Hybridisierung ohne Denaturierung
Tester-Tester Hom ohybride
Tester-Tester Heterohybride
Tester-Driver Heterohybride
ds-Driver
ss-Driver
ss-Tester
Auffüllen der Enden
A A
C C
B B
D D
E
Suppression Subtractive Hybridization
Zugabe der PrimerPCR-Amplifikation
Zugabe der PrimerPCR-Amplifikation
Nested PCR
E
A
C
B
DAufschm elzen
“Haarnadel”-Schleife
Elongation
Prim er-Annealing
Self-Annealing
ern
eu
ter
PC
R-Z
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Ab
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ng
ern
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ter
PC
R-Z
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lus
Tester-TesterHom ohybride
ITRITR
