Entwicklung einer auf subtraktiver Hybridisierung ...elib.suub.uni-bremen.de/diss/docs/E-Diss1043_li.pdf · DNA wurde hierbei in einem Phenol-haltigen Puffer durchgeführt. Das Phenol

Entwicklung einer auf subtraktiver Hybridisierung basierenden Nachweismethode

zur Identifizierung differentieller Genexpression in Eukaryonten

Dissertationzur Erlangung des akademischen Grades

Doktor der Naturwissenschaft-Dr. rer. nat.-

Dem Fachbereich Biologie/Chemieder Universität Bremen

Li Li Bremen, 2003

1. Gutachter: Prof. Dr. Hildebrandt

2. Gutachter: Prof. Dr. Beyersmann

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung....................................................................................................................................1-19

1.1 Differentielle Genexpression..........................................................................................................1

1.2 Methoden zur Analyse differentieller Genexpression....................................................................2

1.3 Probleme, die bei der Genom-Subtraktion zu bewältigen sind....................................................13

1.4 Auswahl eines Testsystems zur Überprüfung eines Genom-Subtraktionssystems......................16

1.5 Transgene Solanum als Modellsystem zur Genom-Subtraktion bei hochkomplexen

Eukaryonten.................................................................................................................................17

1.6 Das Ziel der Arbeit ......................................................................................................................19

2 Material und Methoden...........................................................................................................20-52

2.1 Vorbereitung der cDNA ..............................................................................................................20

2.2 Genom-Subtraktion mittels SSH .................................................................................................28

2.3 Überprüfung der DSC.................................................................................................................. 33

2.4 Suche nach der Ursache des Versagens der DSC ........................................................................39

2.5 Entwicklung der NSC.................................................................................................................. 41

2.6 Subtraktion mittels SSH/NSC .....................................................................................................42

2.7 Die Logik der Methodenentwickelung.........................................................................................52

Inhaltsverzeichnis

3 Ergebnisse.................................................................................................................................53-84

3.1 Vorbereitung des Tester/Drivers zur Genom-Subtraktion...........................................................53

3.2 Analyse differentieller Genexpression in Kartoffeln mit SSH.....................................................58

3.3 Experiment zur Etablierung der DSC...........................................................................................62

3.4 Suche nach der Schwachstelle der DSC.......................................................................................65

3.5 Entwicklung der NSC...................................................................................................................68

3.6 Kombination SSH/NSC...............................................................................................................72

3.7 SN am Beispiel von Kartoffel-cDNA..........................................................................................78

4 Diskussion.................................................................................................................................85-92

4.1 SN ist ein innovatives, elegantes Genom-Subtraktionssystem ...................................................85

4.2 Bei höheren Eukaryonten ist SNH zur Analyse differenzieller Genexpression gegenüber den

bekannten Methoden zu bevorzugen; sie stellt auch eine gute Alternative zur Identifizierung

genomischer Unterschiede dar...........................................................................................................87

4.3 Ausblick........................................................................................................................................90

Zusammenfassung............................................................................................................................91

Literaturverzeichnis.........................................................................................................................92

Anhang...............................................................................................................................................97

Danksagung.....................................................................................................................................107

1

1 Einleitung

1.1 Differentielle Genexpression

Organismen lassen sich anhand ihrer Gene unterscheiden. Ein vielzelliger Organismus wiederum

exprimiert seine Gene je nach Zell- oder Gewebetyp unterschiedlich. Diese Unterschiede können

dabei sowohl qualitativ als auch quantitativ sein.

Das menschliche Genom codiert für bis zu 30,000-100,000 Gene (Bishop, 1974; Zhang, 1997;

Venter, 2001; the genome international sequencing consortium, 2001). Zu einem gegebenen

Zeitpunkt in einer bestimmten Zelle werden jedoch nur 15-20,000 Gene exprimiert. Ihren

Konzentrationen nach können die eukaryontischen mRNAs in drei relativ homogenen Unterklassen

eingeteilt werden: Nur wenige Sequenzen gehören der am höchsten konzentrierten Klasse an. In

Hela Zellen haben 10-20 Gene in dieser Klasse in der Größenordnung von etwa 8,000 Kopien pro

Zelle; 1 % (350 Sequenzen) sind in der mittel konzentrierten Klasse vorhanden, mit etwa 440

Kopien pro Zelle; die meisten Gene gehören dagegen der am niedrigsten konzentrierten Klasse an

und besitzen durchschnittlich nur 8 Kopien pro Zelle. Den beiden höher konzentrierten mRNA-

Klassen wird eine große Bedeutung bei der Zelldifferenzierung zugesprochen. Die mRNAs in der

höchsten Konzentrationsklasse scheinen gewebespezifisch zu sein, während sich die „house-

keeping“ Gene in der am niedrigsten konzentrierten Klasse befinden (Hastie, 1976).

Die Analyse differentieller Genexpression dient dazu, die biologischen Vorgänge zu verstehen, was

wiederum ermöglichen könnte, ein bestimmtes Geschehen zu lenken. Die Identifizierung eines

Gens oder Genprodukts, das tendenziell bei einem bestimmten Krankheitsbild auftritt, könnte

eventuell zu einer früheren Erkennung und/oder neuen Therapien hinführen. Nahezu 60 % aller

menschlichen Tumore exprimieren z. B. kein funktionsfähiges p53, ein Gen, das in der normalen

Zelle verhindert, dass ein DNA-Schaden bei der Zellteilung an die Nachkommen weitergegeben

wird; während Gene, die für ein robustes Wachstum charakteristisch sind, z. B. die für ribosomale

Proteine codierenden Gene, im Vergleich zum umgebenden Gewebe überexprimiert werden

(Levine, 1991; Zhang, 1997).

Für Fragestellungen, bei denen der Zusammenhang eines Expressionsmusters und z. B. einer

Erkrankung bereits bekannt ist, existiert ein breites Spektrum an Untersuchungstechniken. Wenn

jedoch die Fragestellung darin liegt, ob sich zwei Proben überhaupt in ihren Expressionsprofilen

2

voneinander unterscheiden, kann nur auf wenige und teilweise aufwendige Methoden

zurückgegriffen werden. Neben der Auffindung von entwicklungs- und differenzierungsrelevanten

Genen gilt dies u. a. auch für die Detektion von Transgenen.

1.2 Methoden zur Analyse differentieller Genexpression

Da der Analyse differentieller Genexpression große Bedeutung beigemessen wird, ist in letzter Zeit

eine dynamische Entwicklung der dazu dienenden Techniken zu beobachten, der sich viele

Arbeitsgruppen widmen. Schematisiert lässt sich das Spektrum der Analysetechniken wie folgt in

Abb. 1-1 darstellen.

Die Bevorzugung einer bestimmten Methode bei einer bestimmten Fragestellung hängt von

mehreren Faktoren ab, u. a. der Komplexität der Genome, der Expressionsstärke des Target Gens,

dem Bekanntsein der cDNA Sequenzen, der technischen Ausstattung sowie der

„Forschungstradition“ der jeweiligen Arbeitsgruppe.

Abb. 1-1: Übersicht der gängigen Methoden zur Analyse differenzieller Genexpression

1.2.1 mRNA Differential Display

Die direkteste Methode zum Vergleichen von zwei mRNAs ist das Differential Display (Liang,

1994). Dabei werden die mRNAs systematisch in cDNAs umgeschrieben und die cDNAs dann

parallel auf einem Sequenzierungsgel aufgetrennt und deren Bandenmuster verglichen.

Um die Teilpopulation der zu vergleichenden cDNA-Fragmente zu verkleinern und die Auflösung

der Banden zu erhöhen, werden Ankerprimer für die cDNA-Synthese an den polyA-Enden der

Methoden zur Analyse differenzieller Genexpression

Genom-Subtraktion

SAGE

Mikroarray

Differential Display

3

mRNAs gebunden und die folgende Amplifikation durch PCR mit einem zusätzlichen willkürlichen

Primer durchgeführt. Schematisch lässt sich diese Methode folgendermaßen in Abb. 1-2

veranschaulichen.

Differential Display eignet sich gut für wenig komplexe mRNA-Populationen. Bei höher

komplexen mRNA-Gemischen ist der optische Vergleich der cDNA Bandemuster erheblich

erschwert, da die Auflösung der Banden auf Grund deren hohen Anzahl niedrig wird. Komplette

Repräsentation einer komplexen mRNA Population mit angemessener Auflösung der Banden

dagegen verlangt extrem hohen Arbeitsaufwand.

Abb. 1-2: Schema des mRNA Differential Display mit einem einbasigen Oligo-dT

Ankerprimer, nach Liang (1994)

G (U oder C) AAAAAAAAAAAAAAAAAA

5́ -TTTTTTTTTTTTTTTTTTC(A oder G)

dNTPs

Reverse Transkriptase

G (U oder C) AAAAAAAAAAAAAAAAAAC (A oder G) TTTTTTTTTTTTTTTTT

5́ -AAGCTTTTTTTTTTTC(A oder G)

Abitrary Primer

dNTPs

Taq Polymerase

C (A oder G) TTTTTTTTTTTTTTTTTAbitraryPrimer

C (A oder G) TTTTTTTTTTTTTTTTTAbitraryPrimer

RNA A B

Differentielle Genexpression

mRNA

Reverse Transkription

PCR

Gelanalyse

C

4

1.2.2 Mikroarray

Die Expression von bis zu 50,000 Genen kann mit der Mikroarray-Technik (Heller, 2002) parallel

untersucht werden. Somit eignet sich diese Methode gut zur Herstellung gesamtgenomischer

Genexpressionsprofile. Bei der Mikroarray-Technik werden bis zu 108 Oligos, die verschiedene

cDNAs repräsentieren, auf Trägern (Chips) immobilisiert und mit den markierten cDNAs

hybridisiert. Die Hybridisierungssignale reportieren dann das Vorhandensein sowie die

Expressionsstärke jeder Sequenz (Abb. 1-3).

Abb. 1-3: Mikroarray zur Analyse differentieller Genexpressionsprofile

Die Anwendung der Mikroarray-Technologie setzt allerdings voraus, dass die

Zelle A

Zelle B

H ybridizierung auf M ikroarray

R ohe D aten Q uantifizierung E xpressionstärke

m R N A cD N A

Laser Scanning

R ohdaten

5

Sequenzinformationen der zu untersuchenden Fragmente vorhanden sind. Jedoch sind nur wenige

Organismen durchsequenziert, daher ist die Herstellung eines passenden Chips zu jedem beliebigen

Organismus und jeder beliebigen Fragestellung zurzeit unmöglich. Auch die hohen Kosten und die

hohen technischen Ansprüche bei der Chip-Herstellung, die wenig standardisierte

Versuchsdurchführung und Dateninterprätation verhindern zurzeit in den meisten Fällen die

Etablierung dieser Technik in Routinelabors.

1.2.3 SAGE

Die SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) ist wie das Mikroarray-Verfahren eine Computer

gestützte Technologie (Velculescu, 1995). Durch ein kompliziertes Verfahren werden die cDNAs

durch die Summe ihrer SAGE-Tags repräsentiert. Jeder Repräsentant wird dann sequenziert. Die

Ergebnisse der darauffolgenden, vom Computer unterstützten Vergleich der beiden Pools von

SAGE-Tags weist auf eine mögliche differentielle Genexpression hin (Abb. 1-4).

Abb. 1-4: Schema der SAGE

AAAAATTTTT

AAAAATTTTTGTAC

AAAAATTTTTGTAC

AAAAATTTTTGTAC

CATG CATGA B

CCTACGTACXXXXXXXXXGGATGCATGXXXXXXXXXPrimer A GGATGCATGOOOOOOOOOPrimer B CCTACGTACOOOOOOOOO

CCTACGTACXXXXXXXXXOOOOOOOOOGTACGTAGGGGATGCATGXXXXXXXXXOOOOOOOOOCATGCATCCPrimer A Primer B

GTACXXXXXXXXXOOOOOOOOOGTACGXXXXXXXXXXOOOOOOOOOGTACGCATGXXXXXXXXXOOOOOOOOOCATGXXXXXXXXXXOOOOOOOOOCATG

Ditag

Streptavidin

BiotincDNASchnitte mit 4-Base Endonukease , binden an Streptavidin

In 2-Pools verteilen, Ligation mit Adapteren

Schnitte mit Typ-2 Enzyme

Ligation, PCR

Schnitte mit 4-Base Endonuklease,

Isolierung der Ditags, CloningSchnitte mit 4-Basen Endonuklease, Isolierung der Ditags, Klonierung

Ligation mit Adaptoren

Schnitte mit 4-Basen Endonuklease, binden an Streptavidin

6

Die mRNAs werden dabei zuerst mit biotinylierten Oligo-dT-Primern in cDNAs umgeschrieben.

Die cDNAs werden dann mit einer 4-Basen Endonuklease geschnitten und die Fragmente, an die

Biotin gebunden ist, mit Streptavidin isoliert. Die biotinylierten cDNAs werden dann in zwei Pools

verteilt, und anschließend mit zwei Adaptoren versehen, die die Erkennungssequenz eines Typ-2

Enzyms tragen. Die Typ-2 Enzyme schneiden DNA-Sequenzen an den Stellen, die in einer

bestimmten Distanz (8-15 Basen) zu ihrer Erkennungssequenz liegen (Szybalski, 1985). Nach der

Restriktion mit dem Typ-2 Enzym ergeben sich dann Fragmente, die die Adaptorsequenz und einen

kurzen Teil einer cDNA (5-10 Basen) enthalten. Dieser mit Adaptor verbundene cDNA-Teil ist für

jede cDNA spezifisch und wird als deren SAGE-Tag bezeichnet. Die SAGE-Tags aus beiden Pools

werden dann zusammenligiert und die dabei entstandenen Ditags durch PCR amplifiziert. Als

Primer dafür dienen die Sequenzen der beiden Adaptoren. Die amplifizierten Ditags werden dann

mit der gleichen Endonuklease geschnitten, danach gereinigt und kloniert.

Es dauert durchschnittlich 2-3 Monate, um mit SAGE das Expressionsprofil eines eukaryontischen

Organismus, herzustellen. Auch die technischen Ansprüche sind nicht niedrig und die Kosten der

Laborausstattung hoch.

1.2. 4 Genom Subtraktion

Die Analyse differentieller Genexpression wird in Forschungslabors oft mittels Genom-Subtraktion

betrieben, wozu u. a. auch die damit verbundenen relativ niedrigen Kosten und die hohen

technischen Ansprüche beigetragen haben. Es sind dabei keine teuren Geräte wie z. B. eine

Sequenzierungsapparatur wie bei SAGE nötig.

„Genom-Subtraktion“ bezeichnet den Vorgang, die gemeinsamen Sequenzen zwischen zwei

Genomen durch Hybridisierung zu subtrahieren, und die einzigartigen Sequenzen, die nur in einer

der zwei (c)DNA-Präparationen, oder in wesentlich höheren Konzentrationen in einer der (c)DNA-

Präparationen vorhanden sind, anzureichern.

In diesem Zusammenhang nennt man die gesuchten einzigartigen Sequenzen das „Target“. Der

„Tester“ ist dabei das Genom, welches das Target enthält, oder dessen Repräsentant als PCR-

Amplikon. Der „Driver“ ist dagegen das Referenz-Genom, das das Target nicht enthält, oder dessen

Repräsentant als PCR-Amplikon. Alle anderen Sequenzen außer der des Targets bezeichnet man als

„Hintergrundsequenzen“. Dieser Hintergrund ist desto höher, je komplexer die zu vergleichenden

7

Genome sind.

Der Einsatz dieser Genom-Subtraktion geht auf Versuche von Lamar et al. am Y-Chromosom von

Mäusen zurück. In seiner Arbeit wurden DNA-Regionen untersucht, die in männlichen Mäusen

vorhanden waren und in weiblichen jedoch fehlten (Lamar, 1984).

Bei der Untersuchung wurde gescherte DNA weiblicher Mäuse im Überschuss gegen die mit Mbo1

verdaute DNA männlicher Mäuse hybridisiert. Bei der Hybridisierung entstanden drei Arten von

Hybriden: Männlich/männlich, männlich/weiblich und weiblich/weiblich. Nur die

männlich/männlichen Hybride besaßen an beiden Enden die Erkennungssequenz von MBO I,

sodass diese kloniert werden könnten.

Eine Weiterentwicklung dieser Technik stellte die von Kunkel et al. 1985 verwendete Methode bei

der Untersuchung der Duchenne Muskeldystrophie dar (Kunkel, 1985). Die Hybridisierung der

DNA wurde hierbei in einem Phenol-haltigen Puffer durchgeführt. Das Phenol bewirkt eine

Verkürzung der Reassoziationszeit während der Hybridisierung bei Raumtemperatur.

1990 ligierten Strauß et al. vor der Hybridisierung kurze Adaptoren an die mit Endonuklease

verdauten Tester-Fragmente, sodass die Tester/Tester Hybride nach der Hybridisierung mit Hilfe

einer PCR vermehrt werden können (Strauß 1990).

1993 stellten Lisitsyn et al. RDA („representional difference analysis“) vor (Lisitsyn, 1993). Bei

dieser Methode werden vor der Hybridisierung Tester und Driver mit Endonuklease geschnitten,

mit verschiedenen Adaptoren versehen und durch PCR vereinfachend repräsentiert. Diese

Repräsentation durch PCR-Amplikons vereinfacht die Komplexität von eukaryontischen Genomen

80-100 fach, was die Hybridisierung erheblich beschleunigt. Dieser Repräsentationsschritt wurde

von vielen späteren Subtraktionstechniken übernommen.

Für den Tester werden dann die Adaptoren-Sequenzen des PCR-Amplikons wieder entfernt und

nach Reinigung der DNA mit einen anderem Adaptor erneut ligiert. Als Driver dient das PCR-

Amplikon mit oder ohne dessen Adaptor-Sequenz.

Die schrittweise Anreicherung des Targets erfolgt durch mehrere Runden Hybridisierung und die

darauf folgende Anreicherung der Tester/Tester-Hybride durch PCR. Die Tester/Tester-Hybride

sind dabei die Einzigen, die an beiden Enden die Tester-Adaptor-Sequenzen besetzen und so durch

die PCR mit dem Tester-Primer exponentiell reamplifiziert werden. Das Subtraktionsprodukt aus

der vorherigen Runde wird durch Restriktion und Ligation erneut mit einem anderem Adaptor

versetzt und dient als Tester für die nächste Hybridisierungsrunde. Das Austausch des Tester-

8

Adaptors zwischen den Subtraktionsrunden sollte die ungewollte überdurchschnittliche

Anreicherung mancher Hintergrundsequenzen durch PCR mindern, die eventuell im

Subtraktionsprodukt das tatsächliche Target überdecken könnten (Abb. 1-5).

Abb. 1-5: Schema der RDA

Im Jahr 2000 gelangt es A. Nekrutenko mit der RDA spezifische Gensonden für die Feldmausarten

zu entwickeln (Nekrutenko, 2000). Jedoch werden mehrere PCRs und der Austausch des Adaptors

zwischen den Subtraktionsrunden für die RDA benötigt. Daher ist diese Methode relativ

arbeitsintensiv und kontaminationsanfällig.

Tester Driver

Representation durch PCR-Amplikons

Restriktion

Ligationmit neuem Adapter

Adapterumtausch

Hybridisierung

PCR

a

b

c

expontionelle Amplifikationa:

c: keine Amplifikation

lineale Amplifikationb:

Adaptor-AustauschLigation mit einem neuen Adaptor

lineare Amplifikation

9

Die 1996 von Diatchenko et al. entwickelte SSH (Supression Subtractive Hybridisation) ist ein

zurzeit oft benutztes Genom Subtraktionssystem, was sich an der Vielzahl von Publikationen und

auch der großen Resonanz und dem wirtschaftlichen Erfolg der teuren-Kits der Firma „Clontech“

zeigt, die auf diesem Prinzip basieren (Diatchenko, 1996). SSH beruht auf dem Suppressions PCR

Effekt (Siebert, 1995), wobei nach der Hybridisierung nur das Target exponentiell durch PCR

vervielfacht wird, während die Reamplifikation der anderen Sequenzen unterdrückt wird. Dies führt

zu einer starken Anreicherung des Targets.

Suppression der PCR entsteht bei ssDNAs, die an ihren beiden Enden lange, zueinander

komplementäre Sequenzen besitzen. Die Kinetik der Hybridisierung bevorzugt die Formation einer

Pfannen-ähnlichen Sekundärstruktur, was das Annealing der PCR-Primer erheblich erschwert und

eine effiziente Amplifikation solcher Sequenzen stark unterdrückt.

Abb. 1-6: Suppression PCR (Lukyanov, 1994; Siebert, 1995)

Die Anwendung der Suppressions-PCR bei SSH beruht auf der eleganten Konstruktion von

Denaturierung

Annealing

PCR Primer

Keine Primer-Annealing,

Pfanne-ähnliche Struktur, Suppression PCR

Amplifikationkein Primer-Annealing durch Pfannen-ähnliche Struktur, Suppressions PCR

10

Adaptoren/Primern und der besonderen Strategie der Hybridisierung: Für den Tester werden zwei

nicht phosphorylierte Adaptoren konstruiert, die aus je einem längeren (42-44 Basen) und einem

kürzeren (12 Basen) Strang bestehen. Die Teilsequenzen an den Ligationsenden (22 sowie 24

Basen) sind spezifisch für jeden Adaptor und die anderen Teilsequenzen (20 Basen) sind

gemeinsam zwischen den Adaptoren. Der Tester (geschnittene DNA oder cDNA) wird zuerst auf

zwei Pools verteilt, mit je einem der beiden Adaptoren ligiert, dann in getrennten Ansätzen mit

überschüssigem Driver ohne Adaptor solange hybridisiert, bis die Molaritäten der einzelsträngigen

Fragmente von unterschiedlichen Sequenzen sich gerade ausgleichen. Von der Firma Clontech

wird als Erfahrungswert für die Subtraktion eukaryontischer cDNA bei einer Tester Menge von 10

ng und einer Driver Menge von 300 ng eine Zeitspanne von 6-12h angegeben. Für die zweite

Hybridisierung werden die beiden Ansätze dann unter erneuter Zugabe denaturierten Drivers

zusammengeführt und der zweite Hybridisierungsschritt nahezu zur Völlständigkeit geführt.

Clontech empfiehlt dazu eine übernacht-Hybridisierung. Dieser Hybridisierungsansatz wird dann

verdünnt und ein Teil davon dient als Template für die PCR.

Vor der Reamplifizierung werden die PCR-Ansätze ohne Polymerase für einige Minuten bei 75oC

gehalten, um die kürzeren, nicht ligierten Stränge der Adaptoren vom Tester abzulösen. Dann

werden die ligierten längeren Stränge der Tester-Adaptoren durch die Zugabe von Polymerase

verdoppelt. Die erste PCR erfolgt mit einem Primer, der die gemeinsame Sequenz von beiden

Adaptoren besitzt. Alle Tester/Tester-Hybride aus dem ersten Hybridisierungsschritt besitzen die

gleiche Adaptor-Sequenz an deren beiden Enden. Dadurch wird ihre Amplifizierung während dieser

PCR unterdrückt; exponentiell reamplifizierbar sind dabei nur die Tester/Tester-Hybride aus dem

zweiten Hybridisierungsschritt, wobei das Target erheblich angereichert wird, weil es keine

komplementären Sequenzen im Driver findet. Die Tester/Driver-Hybride vermehren sich dagegen

nur linear, die einzelsträngigen Tester-Sequenzen und die nur Driver-haltigen Sequenzen gar nicht.

Das Produkt der ersten PCR wird dann verdünnt und als Template für die zweite PCR verwendet,

mit den speziellen Sequenzen der beiden Adaptoren als Primer. Die zweite PCR reichert das Target

nochmals an (Abb. 1-7).

Gegenüber der RDA ist die Handhabung der SSH mit nur relativ wenigen Hybridizierungsschritten

ohne Adaptoraustausch eine Vereinfachung. Der Zeitaufwand des Verfahrens ist stark verkürzt und

die Quellen der falsch-positiven Ergebnisse sind erheblich vermindert. Nach Clontech gelingt es

mit SSH die Unterschiede nah verwandter prokaryontischer Genome zu detektieren.

Bei der Applikation dieser Methoden bei eukaryontischen cDNAs werden die Targets ebenfalls

11

stark angereichert, dennoch wird zur Identifizierung des Subtraktionsprodukts ein radioaktives,

kostenintensives Screening-Verfahren empfohlen.

Abb. 1-7: Schema der SSH

1999 veröffentlichten J.H. Luo et al. die Methode DSC (Differential Subtraction Chain, Luo, 1999).

Wie bei der RDA werden auch bei der DSC die Genome von dem Tester und dem Driver vor der

Tester mit Adapter 1 Tester mit Adapter 2Driver im Überschuss

1. Hybridisierung

a

b

c

d

a, b, c, d + e

2. Hybridisierung mit denatuiertem Driver

Filling-in

a

b

c

d

e

PCR mit

a: keine Amplifikationb: keine Amplifikation

d: keine Amplifikation

c: lineale Amplifikation

e: expontionelle Amplifikation

2. Hybridisierung mit denaturiertem Driver

Tester mit Adaptor 1 Driver im Überschuss Tester mit Adaptor 2

12

Subtraktion durch PCR vereinfacht repräsentiert. Nach der Hybridisierung bleibt der Tester-

Adaptor in den Heterohybriden einzelsträngig und kann von Mungo Bohnen Nuklease (MBN)

degradiert werden. Die Subtraktion wäre, wie bei der RDA, durch mehrere Hybridisierungsrunden

zu bewältigen, aber ohne die lästigen Schritte des Adaptoraustausches und der PCR zwischen den

Runden (Abb. 1-8), was die Handhabung erheblich vereinfacht und die Kosten niedrig hält. Die

DSC schien elegant und effizient. Luo berichtete, dass es mit DSC möglich wäre, ein singuläres

Target in hoch komplexen humanen Genomen zu detektieren. Aber bisher wird die DSC von

keinem unabhängigen Forscher bestätigt.

Abb. 1-8: Schema der DSC

Tester Driver

Representation durch PCR-Amplikons

Hybridisierung

Mung Bean Nuklease

PCR

13

1.3 Probleme, die bei der Genom-Subtraktion zu bewältigen sind

Wenn ein Tester mit einem Driver bis zur Vollständigkeit hybridisiert wird, entstehen dabei 3

Varianten doppelsträngiger Hybride: Tester/Tester, Tester/Driver und Driver/Driver. Wenn dabei

der Driver noch in absolutem Überschuss vorliegt, bedeutet dies, dass alle Hintergrundsequenzen

im Tester mit ihren Gegenstücken im Driver Heterohybride bilden. Die Tester/Tester-Hybride

stellen dann das Target dar. Um das Target durch Genom-Subtraktion zu isolieren, sind somit

theoretisch vier (miteinander zusammenhängende) Teilprobleme (markiert mit Stern) zu

bewältigen:

Abb. 1-9: Probleme bei der Genom-Subtraktion

Tester Driver

Hybridisierung

Trennung der Hintergrund und Target

Identifizierung des Targets

1* überschüssiger Driver

2* Vollständige Hybridisierung

3* Trennung der Tester-Tester-Hybride von anderen

4* Identifizierung des Targetes

Hintergrund

Target

Hintergrund

Target

14

Driver in absolutem Überschuss

Obwohl ein großer Überschuss an Driver die Subtraktionseffizienz erhöht, und

theoretisch durch Poolen einer großen Menge von (c)DNA, oder Driver-Amplikons, die aus vielen

parallelen PCR-Ansätzen stammen, ein sehr hoher Überschuss an Driver erreicht werden könnte,

ist jedoch die Löslichkeit der DNA in Hybridisierungspuffer begrenzt. Eine größere Menge an

Driver erfordert ein größeres Volumen zur Hybridisierung und bewirkt eine Verdünnung des

Targets, was wiederum zu einer Verlangsamung der Hybridisierung führt.

Daher kann ein zu großer Überschuss an Driver negativ auf die Kinetik der Hybridisierung wirken.

Aus diesem Gründe wurde der Driver lediglich in „verträglichem“ Überschuss eingesetzt. Bei

eukaryontischen cDNAs erwies sich ein Driver/Tester-Verhältnis zwischen 10-100:1, mit einer

Tester-Menge in der Größenordnung von 100 ng in einem Hybridisierungsvolumen von einigen

Mikrolitern als optimal.

Wenn für die Hybridisierung kein absoluter Überschuss an Driver benutzt wird, wird auch ein

geringer Anteil an Tester-Hintergrundsequenzen Tester/Tester-Hybride bilden, was das Target im

Subtraktionsprodukt verunreinigen würde. Zur weiteren Verminderung dieser

Hintergrundsequenzen wird die Subtraktion oft in mehreren Runden durchgeführt, z. B im Falle

RDA (Birkenmeyer, 2002) und DSC (Luo, 1999).

Hybridisierung bis zur Vollständigkeit

Die eukaryontischen Genome sind hochkomplex, und der größte Anteil der Fragmente ist nur in

sehr niedrigen Konzentrationen vorhanden. Um die Hybridisierung in absehbarer Zeit nahezu zur

Vollständigkeit zu führen, werden diese bei hoch komplexen eukaryontischen Genomen in Form

ihrer PCR-Amplikons vereinfacht repräsentiert. Dies ist z. B. bei RDA und DSC der Fall.

Weil praktisch keine Hybridisierung zur absoluten Vollständigkeit geführt werden kann, sind

theoretisch nach der Hybridisierung immer noch einzelsträngige Tester und Driver vorhanden, von

denen das Target unterschieden werden muss.

Trennung der Tester/Tester-Hybride von allen anderen Sequenzen

Um das Target zu isolieren, ist das Hauptproblem oft die Unterscheidung der Tester/Tester-Hybride

von allen anderen Sequenzen nach der Hybridisierung. Wenn die Tester/Tester-Hybride durch PCR

15

angereichert werden sollen, muss man dafür sorgen, dass eine exponentielle Amplifikation aller

anderen Sequenzen durch PCR unmöglich wird. Dazu werden außer den besprochenen Strategie

wie bei RDA, SSH und DSC noch verschiedene anderen Strategien entwickelt, durch die sich

einige (meist in den USA patentierten) Methoden voneinander unterscheiden.

Patent 5871927 (Lin, 1999)

Beim Patent 5871927 werden Nukleotid-Analoga vor der Hybridisierung in den Driver eingebaut.

Ein Enzym greift dann nach der Hybridisierung die Analoga in den Tester/Driver- und den

Driver/Driver-Hybriden an und erzeugt Lücken in diesen Sequenzen. Die darauf folgende S1-

Nuklease-Behandlung greift die lückenhaften Hybride an, wodurch diese Hybride nicht mehr durch

PCR amplifizierbar sind. Bei jeder Subtraktionsrunde wird der Driver von Enzymen angegriffen

und abgebaut, sodass vor jeder Hybridisierung neuer Driver zugegeben muss.

Patent 5804382 (Sytkowski, 2002)

Ein Teil des Tester-Adaptors in Tester/Driver-Hybriden ist beim Patent 5804382 wie bei DSC

beschrieben einzelsträngig. Dieser Teil soll dann von Mung Bean Nuklease degradiert werden.

Diese einzelsträngige Form wird bei NSC allein durch die innovative Konstruktion der

Adaptors/Primers gewährleistet, während beim Patent 5804382 die Erkennungssequenzen einer

Endonukleoase in den Driver-Adaptor eingebaut werden, und vor der Hybridisierung an dieser

Stelle ein Teil des Driver-Adaptors von den Driver-PCR-Amplikons gespalten wird.

Patent 5958738 (Lindemann, 1999)

Der Primer zur Synthese der Driver-Amplikons wird bei dem Patent 5985738 so markiert

(Phosphor), dass alle Hybride, die diese markierte Primer-Sequenz enthalten, die Tester/Driver- und

Driver/Driver-Hybride sowie die einzelstängigen Driver und Tester von Nukleasen (Lambda

Exonuklease und Mung Bean Nuklease) angegriffen werden können. Nach der Degradation mit den

Enzymen bleiben nur noch die Tester/Tester-Hybride intakt und werden durch PCR amplifiziert.

Identifizierung des isolierten Targets

Solange die Tester/Tester-Hybride von allen anderen Sequenzen getrennt werden, erfolgt die

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eventuelle Verifizierung des isolierten Targets bei allen bekannten Techniken auf ähnlichem Weg:

Es wird zunächst durch PCR amplifiziert, dann kloniert und sequenziert. Die Unterscheidung des

„echten“ Targets von den Hintergrundsequenzen im Subtraktionsprodukt erfolgt über Screening-

Verfahren mittels Northern- oder Southern-Blot.

1.4 Auswahl eines Testsystems zur Überprüfung eines Genom-Subtraktionssystems

Nicht jedes Individuenpaar, welches sich im Phänotyp unterscheidet, ist auch als Tester und Driver

geeignet. Genexpression bei Eukaryonten ist ein extrem komplexes Netzwerksystem, dessen

Regulation bisher nur in Teilen verstanden wird. Es gibt in der Natur selten „durchschnittliche

Gesunde“ und „durchschnittliche Kranke“, bei denen die Unterschiede ihrer Genexpression sich

lediglich auf die des untersuchten Gens beziehen. Wenn die Unterschiede zwischen zwei Genomen

aus vielen Sequenzen bestehen, von denen nur wenige niedrig konzentrierte Sequenzen jedoch auch

tatsächlich mit dem untersuchten Phänotyp zusammenhängen, könnten diese „echten“

Targetsequenzen während der Genom-Subtraktion verloren gehen, wenn manche höher

konzentrierte Hintergrundsequenzen durch PCR bevorzugt angereichert werden.

Vor der Subtraktion ist somit immer darauf zu achten, dass der Hintergrund von beiden zu

vergleichenden Genomen möglichst ähnlich sein sollte, wie dies z. B durch das Poolen der (c)DNA

von vielen Individuen eines Phänotyps weitgehend ermöglicht werden könnte.

Bei der Entwicklung einer Subtraktionsmethode, wobei deren Prinzip der Subtraktion noch zu

überprüfen ist, kann man als einfaches Modell künstliche Tester und Driver benutzen, womit man

eine effiziente Subtraktion von einer nicht effizienten leicht unterscheiden kann. Dies ist bei DSC

der Fall. Tester und Driver sind dabei nur ein einziges Lambda-Fragment, das entweder mit dem

Tester-Adaptor oder dem Driver-Adaptor versehen wird. Eine effiziente Subtraktion ist anhand der

nicht Amplifizierbarkeit mittels PCR nach der Hybridisierung zu zeigen.

Weil die Wahrscheinlichkeit der Isolierung einer Targetsequenz von ihrer Konzentration und der

Art und Vielfalt des Hintergrunds abhängt, ist der Erfolg jeder Genom-Subtraktionsmethode nur an

deren Praktizierbarkeit an einem Tester/Driver-Paar, das aus natürlichen Genomen stammt oder

denen weitergehend ähnelt, zu beurteilen. Wenn ein künstliches Tester/Driver-Paar benutzt wird, ist

dabei stets zu beachten, dass das Target nur in Konzentrationen zugegeben wird, wie es der

relativen Expressionsstärke von natürlich vorkommenen mRNAs entspricht.

17

Eine phänotypische Eigenschaft könnte mit dem Vorhandensein oder dem Fehlen eines bestimmten

Fragments in Zusammenhang stehen. Daher sind beide Genome wechselweise als Tester oder

Driver in Betracht zu ziehen.

1.5 Solanum als Modellsystem zur Genom-Subtraktion bei hochkomplexen Eukaryonten

Die Kartoffel, (solanum tubersorum, L., 2n = 4x = 48 Chromosomen, Genomgröße 1012 Bp) ist eine

alte Kulturpflanze der Indianer Südamerikas (Hawkes, 1990; Arumuganathan, 1991). Sie kam um

1570 nach Europa, erlangte gegen Ende des 18. Jahrhunderts sehr große wirtschaftliche Bedeutung.

Die Kulturkartoffeln stammen von tetraploiden Formen ab, die wahrscheinlich aus diploiden

Wildkartoffeln entstanden sind. Solanum findet auch in der Forschung vielfach Verwendung. Die

Kartoffel lässt sich leicht und schnell kultivieren. Frische Kartoffel-Blätter bieten ein gutes

Ausgangsmaterial für die RNA- und mRNA-Isolierung.

Das Kartoffeln Paar Gus und Desiree, stellt ein ideales Testsystem für Eukaryonten zur Beurteilung

einer Genome-Subtraktion-Methode dar, daher dienen sie als Modellsystem zur Überprüfung der in

dieser Arbeit zu entwickelnden Genom-Subtraktionsmethode. Morphologisch sind die beiden

Stämme voneinander nicht zu unterscheiden. Der transgene Stamm Gus ist Desiree, mit dem Gen

Gus aus E.coli mit Hilfe des Ti-Plasmides von Agrobakterium tumefaciens (Horsch R. B., 1985;

Klee H. J., 1987) transformiert. Desiree ist dabei der Referenz-Stamm. Das Transgen, wenn es

experimiert wird, kann als ein Reporter-Target zur Überprüfung eines Genom-Subtraktionssystems

dienen.

Zur Herstellung des transgenen Stamms durch Transformation wird der T-DNA-Komplex

„35S Promoter-gus Gen-ocs Terminator-nos Promotor-npt2 Gen-nos Terminator“

mit Hilfe eines „entwaffneten“ Ti-Plasmides (Ti-Plasmid ohne ocs-Gen für die Octopine-

Synthethase) in das Zellinnere der Solanum eingeschleust.

Das Gus Gen aus E. coli codiert für ß-Glukuronidase, eines der am häufigsten benutzten Reporter-

Gene in transgenen Pflanzen (Gallagher, S. R. 1992). Anfänglich als ein Gen-Fusionsreporter für E.

coli und C. elegans, wird das Gus Gen zurzeit am häufigsten zum Monitoring der Expression der

chimeren Gene in transgenen Pflanzen benutzt. Es gibt keine oder nur geringe Enzym-Aktivität von

ß-Glukuronidase in Pilzen, Drosophila, C. elegans und den meisten Pflanzen (es gibt keine Gus-

Gen in Solanum). Die ß-Glukuronidase hat eine Molekulargewicht von 68,200 kDa und ist stabil

auch in Anwesenheit von Detergenzien und unter unterschiedlichen ionischen Bedingungen (Nester

18

E. W., 1984). Außerdem lässt sich die Aktivität des Gus Gens leicht colorimetrisch oder durch

einen sichtbaren blauen Farbkomplex nachweisen.

Die Detektierung der Expression des Gus Gens erfolgt traditionell durch einen histochemikalischen

Assay (Abb. 1-9), wobei das Substrat 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide (X-Gluc) am Ort der

Enzym-Aktivität blaue Präzipitate erzeugt, oder durch einen fluorimetrischen Assay (Abb. 1-10)

mit dem Substrat 4-methylumbelliferyl-b-D-glucuronide (MUG) oder 4-trifluoromethylumbelliferyl

b-D-glucuronic acid (4-TFMUG) (Jefferson, R. A. 1987; Janssen, B. J., 1989).

Abb. 1-9: Histochemikalischer Assay zur Detektion von Gus-Aktivität. Gus-Tabak. Linke

Seite, unter Licht gewachsen; rechte Seite, im Dunkel gewachsen.

Abb. 1-10: Fluorimetrischer Assay zur Detektion von Gus-Aktivität. 1.3, 5, Kontrolle. 2, 4, 6,

Gewebe mit Gus-Aktivität.

Die Effizienz fast aller damaliger Transformationsmethoden ist so niedrig, dass man gezwungen ist,

möglichst frühzeitig die transformierten von den nicht transformierten Zellen zu trennen. Dazu

wird das selektierbare Markierungsgen npt2 (Walden, 1990), welches für das Toxin-abbauende

Enzym Neomycin-Phosphotranferase codiert, mit in die Zellen transformiert. Beim Einsetzen der

selektiv wirkenden Antibiotika Kanamycin, Neomycin oder Geneticin während der Gewerbekultur-

Phase zur Herstellung der transgenen Pflanzen, werden alle nicht transformierten Zellen entweder

abgetötet oder ihr Wachstum erheblich eingeschränkt, weil der Translationsprozess in den Plastiden

blockiert wird.

Der 35 S-Promotor ist dem Blumenkohlmosaikvirus entnommen. Der nos-Promotor steuert in dem

Ti-Plasmid das Gen für die Nopalinsynthase. Beide sind fast uneingeschränkt in höheren Pflanzen

aktiv, wobei der 35S-Promotor deutlich wirksamer ist (Sander, 1987).

1 2 3 4 5 6

19

Wenn die Einschleusung eines Transgens durch Agrobakterien erfolgt ist, ist die Anzahl der

gewünschten Konstruktionen, das heißt pro Zelle eine vollständige Einzelkopie von dem T-DNA-

Komplex, höher als bei den anderen bekannten Methoden (u.A Mikroinjektion, Elekroporation und

Partikelbeschusstechnik). Der Ort der Integration des Transgens in den pflanzlichen Chromosomen

ist rein zufällig.

Die Expression eines Transgens schwankt erheblich. Es gibt heute viele Beispiele dafür, dass die

Expression des fremden Gens in transgenen Pflanzen ganz ausbleibt oder unerwartet schwach

ausfällt. Der genaue Mechanismus der trangenen Expression wird noch nicht vollständig

verstanden. Es wird in manchem Falle beobachtet, dass sich das stark methylierte fremde Gen in

einer Umgebung mit deutlich geringerem Methylierungsgrad befindet (Meyer, 1992). Pflanzen

können durch Methylierung des Cytosins im Dinukleotid CG oder im Trinukleotid CNG (N kann

jede beliebige Base sein) die Aktivität von Genen abschalten, indem das Methylcytosin nachteilig

in die Protein-DNA-Interaktionen eingreift.

1.6 Das Ziel der Arbeit

Es handelt sich bei dieser Arbeit um eine Methodenentwicklung. Das Ziel der Arbeit ist es, eine

relativ einfache, nicht-radioaktive, routinetaugliche und auf dem Prinzip der Genom-Subtraktion

basierende Methode zur Analyse differentieller Genexpression für Eukaryonten zu entwickeln.

Zunächst wird diese Methodenentwicklung von SSH und 2D-Gelelektrophorese ausgehen. Falls

dieser Ansatz nicht erfolgversprechend sein sollte, ist dann die DSC zu überprüfen und darüber

hinaus eine Subtraktionsmethode, basierend auf dem Prinzip der „negativen Subtraktion“ zu

entwickeln und zu etablieren. Ferner soll geprüft werden, ob sich die Vorteile von SSH und der

„negativen Subtraktion“ zu einer Methode kombinieren lassen.

Als Testmodell für hoch komplexe Eukaryonten werden die cDNAs der beiden Solanum-Stämme

als Tester und Driver der Genom-Subtraktion dienen. Für die Überprüfung der DSC wird dagegen

zur Überschaubarkeit das viel einfachere Lambda Fragment verwendet. Zur Untersuchung der

Sensitivität der Detektion differentieller Genexpression in Eukaryonten durch ein zu entwickelndes

Genom-Subtraktionssystem wird dann ein künstliches Target konstruiert.

20

2 Material und Methoden

2.1 Vorbereitung der cDNA

Als Driver/Tester zur Genom-Subtraktion dienen die mit Endonukleasen geschnittenen cDNAs oder

deren PCR-Amplikons. Die Gesamt-RNA wird aus jungen Blättern der Kartoffeln isoliert und

daraus die mRNA angereichert. Die Intaktheit der mRNA sowie die Expression eines Reporter-

Targets werden mittels Northern-Blot überprüft. Die cDNA wird nach ihrer Synthese mit

Endonuklease geschnitten.

2.1.1 Kultivierung der Kartoffeln

Kartoffel-Knollen werden in Blumenerde gekeimt und die Jünglinge bei 25 oC für einen Monat

wachsen lassen. Junge Blätter werden entweder zur sofortigen RNA-Isolation bearbeitet, oder in

flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 oC für den weiteren Gebrauch gelagert.

2.1.2 Isolierung der Gesamt-RNA

Die Isolierung der Gesamt-RNA wird mit der Guanidinium/Phenol-Methode (Chomczynski, 1987)

durchgeführt. Alle mit RNA in Berührung kommenden Glaswaren werden silikonisiert.

5g junge Blätter werden in flüssigem Stickstoff zu Pulver gemörsert und das gefrorene Pulver in 10

ml Denaturierungslösung überführt, dann 0,1 Vol. NaOAc, pH4, 2M und 1Vol. Wasser-gesättigtes

Phenol, sowie 0,2 Vol. Chloroform/Isoamylalkohol werden addiert, mit sanftem Schütteln nach

jeder Zugabe. Nach einer 15-minütigen Inkubation auf Eis werden die Proben bei 4 oC , mit

10,000g für 20 Min. zentrifugiert und die RNA-haltige obere Phase in 0,8 Vol. Isopropanol

überführt. Die RNA wird dann für 30 Min. bei -20 oC gefällt und anschließend für 20 Min. bei 4 oC,

10,000g zentrifugiert. Das Pellet wird in 75% Ethanol zwei Mal gewaschen und in 2-3 ml H2O

aufgenommen.

Zur Kontrolle ihrer Qualität wird die RNA auf einem 1% MOPS-Gel aufgetrennt. Dabei löst man

in der Mikrowelle 0.25g Agarose in 24 ml MOPS Puffer, lässt die Lösung auf 60-65 oC abkühlen

und mischt dann 0,75 ml Formaldehyd dazu, gießt sofort das Gel und lässt es bis zum Beladen für

0,5 bis 1 Stunde fest werden.

21

3µl (1,5 µg) RNA wird mit 9 µl RNA-Puffer vermischt, bei 55 oC für 10 Min denaturiert und dann

das Gel geladen. Die Auftrennung der RNA erfolgt bei 10 Volt/cm für 40 Min.

Die Absorption der RNA wird mittels Photometer gemessen und ihre Konzentration nach folgenem

Schema berechnet:

µg/µl RNA = OD260 x 0,04 µg/µl x Verdünnungsfaktor

Die Konzentration der gesamten RNA wird auf 2 µg/µl nachjustiert und die RNA in Aliquots von

0,75 ml (1,5 mg) aufgeteilt und bei -80 oC gelagert.

Denaturierungslösung

4 M Guanidinium Thiocyanat; 25 mM Na-Citrat, pH 4,0; 0,5% Na-Laurylsarcosinat; 0,1 M beta-

Mercaptoethanol

MOPS-Puffer

0,02 M MOPS; 8 mM Na-Acetat; 1mM EDTA, pH 7,0

RNA-Puffer

250 µl Formamid, deionisiert mit AG 501-X8; 50 µl Färbelösung (50% Glycerol; 1 mM EDTA; 0,4

% Bromphenolblau; 0,4% Xylencyanol); 10 µg Ethidiumbromid

Phenol, Wasser gesättigt

Phenol zusammen mit gleicher Menge H2O sowie etwas Isoamylalkohol kräftig schütteln und die

Phasen sich trennen lassen. Das Phenol befindet sich in der unteren Phase.

Chloroform/Isoamylalkohol

24:1 (Vol.)

2M Natrium Acetat, pH4

2M Natrium Acetat ansetzen. PH mit Acetat justieren.

2.1.3 Anreicherung der mRNA

0,2g OligodT-Zellulose Pulver (Invitrogen) wird wiederholt in L-Puffer gewaschen (suspendieren

und sanft zentrifugieren, den Überstand vorsichtig verwerfen und die Zellulose erneut

22

suspendieren) bis der PH-Wert unter 8 liegt. 1,5mg RNA (750 µl) wird mit gleichem Volumen 2X

L-Puffer versetzt und bei 65 oC für 5 Min. denaturiert. Nach Abkühlung auf RT wird die RNA-

Lösung auf die Zellulose gegeben, unter sanftem Schütteln für 1 Stunde bei RT inkubiert. Die

Zellulose wird dann bei 2000g, 4 oC für 2 Min. zentrifugiert und der Überstand vorsichtig

verworfen. Das Pellet wird mit den Wasch Puffern I und II je 2 mal gewaschen. Anschließend wird

die mRNA mit 1ml H2O eluiert. Die Anreicherung wird zweimal wiederholt.

Die mRNA wird dann bei -20 oC, übernacht in der Anwesenheit von 0,1 Vol. 2M Natriumacetat,

pH4 und 0,8 Vol. Isopropanol gefällt und durch Zentrifugation für 45 Min bei 10, 000g und 4 oC

pelletiert. Das Pellet wird 2 mal mit 75% Ethanol gewaschen und anschließend in 30µl Aqua bidest.

aufgenommen.

Kontrollen der mRNA auf einem Gel und mit dem Photometer erfolgen wie unter 3.1.2

beschrieben. Die Konzentration der mRNA wird auf 0,5 µg/µl eingestellt, bevor sie in Volumina

von 8µl aufgeteilt und bei -80 oC gelagert wird.

2x L-Puffer

40 mM Tris-Cl, pH7,6; 1M NaCl; 2 mM EDTA; 0,2% N-Laurylsarkosinat

Wasch Puffer I

10 mM Tris-Cl, pH7,6; 0,3 M NaCl; 1 mM EDTA

Wasch Puffer II

10 mM Tris-Cl, pH7,6; 0,15 M NaCl; 1 mM EDTA

2.1.4 Überprüfung der Intaktheit der mRNA

Die Intaktheit der mRNA wird durch Northern-Blot überprüft. Dazu werden je 0,5 µg mRNA von

beiden Stämmen auf einem 1,0% MOPS-Gel aufgetrennt. Die Vakuum-Übertragung der mRNA

von dem Gel auf eine positiv geladene Nylonmembran (Amersham Hybond N+) erfolgt bei 60 Bar

und 2 Stunden mit 20X SSC. Die mRNA wird dann unter UV-Licht bei 325 µm für 30 Sek. fixiert.

Die Prä-Hybridisierung erfolgt bei 42 oC für 2 Stunden, in 5 ml Prä-Hybridisierungspuffer. Die

Hybridisierung erfolgt bei 42 oC über Nacht in 5 ml prä-Hybridisierungspuffer, der 50 ng

denaturierte Sonde enthältet. Als Sonde dient ein mit Digoxigenin markiertes Actin-Fragment.

Gewaschen wird die Membran dann je zweimal in 100 ml 0,5 x SSC bei RT und in 100 ml 0,1x

23

SSC bei 63 oC. Nach einem kurzen Pufferausgleich in Puffer 1 wird die Membran in Puffer 2 für 30

Min. bei RT inkubiert. Die Bindung der Antikörper erfolgt durch eine 30 minütige Inkubation in

Puffer2 plus 0,02% Antikörper bei RT. Die Membran wird dann 2 mal für je 15 Min. bei RT in

Puffer 1 gewaschen. Nach kurzer Äquilibrierung in Puffer 3 erfolgt die Farbentwicklung in 1 ml

Puffer 3, die 3,5 µl X-Phosphat und 4,5 µl NBT enthält, für mehrere Stunden bei RT.

Prä-Hybridisierung-Puffer

Böhringer Standard-Lösung plus 50% deionisiertes Formamid

TAE-Puffer

Tris-Acetat, 0,04 M; EDTA, 1 mM; pH 7,5

Das mit Digoxigenin markierte Aktin-Fragment wird durch PCR synthetisiert.

Dazu wird ein wenig Blattmaterial von dem Stamm Gus in 0,5 ml H2O gegeben, für eine Minute

stark gevortext und anschießend zentrifugiert. Der DNA-haltige Überstand dient dann als Template

der PCR. Für die PCR werden folgende Komponenten zusammengeführt:

H2O auf 25 µl auffüllenPCR-Puffer 1xMg2+ 1,5 mMNukleotide je 2 mM A, G, C, T und 0,3 mM Digoxigenin-U Primer Aktin-1 1 mMPrimer Aktin-2 1 mMTaq Polymerase 1UTemplate 1µl

Aktin-1: 5´-AGT TGT ATG TAG TCT CGT GGA TTC-3´

Aktin-2: 5´-ATG TAT GTT GCT ATT CAG GCT G-3´

Nach einer 2-minütigen initialen Inkubation bei 94oC erfolgt die Amplifikation durch 35 Zyklen:

Denaturierung bei 94 oC für 30 Sek.

Annealing bei 68 oC für 30 Sek.

Elongation bei 72 oC für 60 Sek.

24

Die PCR-Produkte werden auf einem 1% TAE-Agarrose-Gel kontrolliert.

Die Überprüfung der Digoxigenin-Markierung erfolgt durch Dot-Blot. Dazu werden die PCR-

Produkte in fünffachen Zentnerverdünnungen parallel zu denen der Kontrolle auf eine Membran

aufgetragen. Die Menge der Digoxigenin-markierten DNA in der Kontrolle ist bekannt. Nach dem

Trocknen der Membran erfolgt die Detektierung des Digoxigenins wie oben beschrieben. Die

relative Stärke der Signale der Proben im Verhältnis zu denen bei der Kontrolle ist ein Maß für die

Effizienz der Markierung.

2.1.5 Überprüfung der Expression des Gus-Gens

Die Expression des Gus-Gens wird durch Northern-Blot überprüft.

Je 1µg mRNA von beiden Stämmen wird auf einem MOPS-Gel aufgetrennt und geblottet. Als

Sonde dient dabei ein mit Digoxigenin markiertes Gus-Fragment (Dig-Gus). Zur Quantifizierung

der Stärke der Expression, werden auf dem Gel 0,3, 3 und 30pg Gus-Fragment in nicht markierter

Form parallel zu den mRNAs aufgetragen. Blot und Hybridisierung erfolgen wie beschrieben.

Die Probe Dig-Gus und das Gus-Fragment in nicht markierter Form werden durch RT-PCR erzeugt

(TitanTM One Tube RT-PCR-System, Firma Roche).

Als Template der RT-PCR dient die gesamte RNA von Stamm Gus. Die Zusammensetzung der

RT-PCR-Komponenten ist:

Dig-Gus Gus, nicht markiertesH2O auf 50 µl auffüllen auf 50 µl auffüllenRT-PCR-Puffer 1x 1xNukeotide 2 mM dNTPs und 0,3 mM Digoxigenin-U 2 mM dNTPs Primer Gus-1 1 mM 1 mMPrimer Gus-2 1 mM 1 mMDTT 2,5 µl 2,5 µlRNA Inhibitor 0,2 µl 0,2 µlReverse Transkriptase 1µl 1µlTaq Polymerase 1µl 1µlGesamte RNA von Gus 1,8 µl 1,8 µl

Gus-1: CGACGCTCACACCGATACCATC (Nt1347-1368)

25

Gus-2: CCATACCTGTTCACCGACGACG (Nt1647-1626)

Nach einer 2-minütigen initialen Denaturierung bei 94oC erfolgt die Amplifikation durch 35

Zyklen:




Die PCR-Produkte werden auf einem Gel kontrolliert. Die Überprüfung der Markierungseffizienz

erfolgt wie beschrieben durch Dot-Blot. Die Konzentration des nicht markierten Gus-Fragments

wird mittels Photometer bestimmt.

2.1.6 Synthese der cDNA

cDNA wird nach dem Prinzip des „SmartTM PCR cDNA Synthesis Kit“ von der Firma Clontech

synthetisiert.

2.1.6.1 Prinzip des „SmartTM PCR cDNA Synthesis Kit“

Das Prinzip des Kits wird im Abb. 2-1 schematisiert. Zur Synthese des ersten cDNA-Stranges

bindet man an den PolyA-Schwanz der mRNA einen Oligo(dT)-Anker-Primer. Die terminale

Transferase-Aktivität der reversen Transkriptase addiert eine zusätzliche Sequenz, vorzugsweise

Oligo(dC), an den neu hergestellten ersten Strang. Ein zweites Oligonukleotid, welches am 3´-

Ende Oligo(dG) trägt, bindet an das Oligo(dC). Die reverse Transkriptase verwendet dann dieses

Oligo(dG)-haltige Oligonukleotid als Template und füllt es zu doppelstrangiger DNA auf, daher

wird es auch „template-switch-oligonucleotide“ genannt. Dieses „template-switch-oligonucleotide“

und der Oligo(dT)-Primer enthalten außerdem die Primer-Sequenz für die PCR, durch die die

cDNA amplifiziert wird. Die Oligo(dC) wird am effizientesten an den Enden der vollständigen

ersten Stränge angehängt, daher ist der überwiegende Teil der synthetisierten cDNAs vollständig.

26

Abb. 2-1: Prinzip des SmartTM PCR cDNA Synthesis Kits

2.1.6.2 Synthese des ersten cDNA-Strangs

Folgende Komponenten werden zusammenpipettiert:

mRNA 1µl (500ng)OligodT-Anker-Adaptor 1µl (10pmol)Templat-Switch-Adaptor 1µl (10pmol)H2O 2µl

Die Komponenten werden kurz vermischt und zentrifugiert. Nach einer Inkubation bei 72 oC für 2

Min. werden die Reaktionsgefäße für 2 Min. auf Eis gestellt, bevor folgende Zutaten hinzugefügt

werden und die Ansätze für 1 Stunde bei 42 oC inkubiert werden:

Poly A RNAPoly A 3´5´

2. PCR- Primer

1. Oligo dT-Anker- Adaptor

12

Poly A 3´CCC

Poly A 3´CCCGGG3

3. Template-Switch-Adaptor

Ds cDNA

27

DTT 1µl (20µM)dNTPs 1µl (10µM)5x Puffer für die Erststrang-Synthese 2µl Power Script Reverse-Transkriptase 1µl

Die Adaptoren und Primer enthalten dabei die Erkennungssequenzen für Mbo1 (GATC) anstelle

der von Ras1 wie bei Clontech.

OligodT-Anker-Adaptor:

5´-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGATCT(30)N-1N-3´

N-1 = A, G oder C; N= A, G, C oder T

Template-Switch-Adaptor:

5´-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGATCGCGGG-3´

2.1.6.3 Amplifikation der cDNA durch PCR

Folgende Komponenten werden zusammengemischt:

H2O 80 µl 10x PCR-Puffer 10 µldNTPs 2µl (100

mM)PCR Primer 4µl (100µM)Polymerase Mix 2µlErststrang-cDNA 2µl

PCR Primer: 5´-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGA-3´

Die Amplifikation erfolgt nach folgendem Schema:

Initiate Denaturiering bei 94oC für 2 min.

dann 16 Zyklen bei:

28

Denaturiering bei 94 oC für 30 Sek.


und Elongation bei 68 oC für 6 Min.

Die synthetisierten cDNAs werden auf einem TAE-Gel kontrolliert.

2.1.7 Reinigung der cDNA

Man gibt gleiche Volumen von Chloroform/Isoamylalkohol zu den cDNAs, vermischt die Proben

durch Vortexen und zentrifugiert sie für 10 Min bei 13, 000g. Der Überstand wird erneut mit

Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert und die cDNA dann in 2,5 Vol. Ethanol und 0,1 Vol. NaOAc

gefällt. Das cDNA-Pellet wird zweimal mit 75% Ethanol gewaschen und dann in H2O

aufgenommen.

2.1.8 Restriktion der cDNA

Folgende Bestandteile werden zusammengeführt:

cDNA 5µgMbo1 10 U10X Puffer 5 µlH2O auf 50 µl auffüllen

Die Restriktion erfolgt übernacht bei 37 oC. Die geschnittene cDNA wird dann auf einem Gel

kontrolliert, gereinigt und nach der Photometer-Messung auf 400 ng/ul eingestellt.

2.2 Genom-Subtraktion mittels SSH

Die Eignung der SSH zur Analyse differenzieller Genexpression in hoch komplexen Eukaryonten

wird am Beispiel von Kartoffeln verifiziert. Dazu wird zuerst SSH an Kartoffel-cDNA

durchgeführt, dann der Effekt dieser SSH-Subtraktion mittels Southern-Blot verifiziert, und

anschließend das SSH-Produkt durch 2D-Gel, Core-PCR und Sequenzierung analysiert.

2.2.1 SSH

29

SSH an Kartoffel-cDNA wird nach dem Prinzip des „PCR select cDNA Subtraction Kit“ der Firma

Clontech durchgeführt, mit geringfügiger Modifikation bezüglich der Adaptoren. Für SSHG/D dient

die mit Mbo1 geschnittene cDNA von Desiree als Driver, die geschnittene cDNA von Gus als

Tester. Für SSHD/D fungieren die cDNAs von Desiree als Tester und Driver zugleich.

2.2.1.1 Adaptoren/Primer

Die modifizierten Adaptor/Primer enthalten die Erkennungssequenzen von Mbo1, anstelle die von

Rsa1 wie bei Clontech (Abb. 2-2):

Abb. 2-2: Adaptoren/Primer der SSH naach Clontech

2.2.1.2 Ligation der Adaptoren an den Tester

Die Tester werden in zwei getrennten Ansätzen nach folgendem Schema mit den Adaptoren ligiert:

Ligation LT1 (Ligation Tester/Adaptor 1) LT2 (Ligation Tester-Adaptor 2)Adaptor 10 pmol Adaptor 1 10 pmol Adaptor 2 Tester-cDNA, geschnitten 100 ng 100 ng Ligase Puffer 1 x 1xLigase 200 U 200 UH2O auf 10µl auffüllen auf 10µl auffüllen

5´-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C TCG AGC GGC CGC CCG GGC AG-3´3´-GGC CCG TCC TAG-5´

5´-TCG AGC GGC CGC CCG GGC AGG A-3´

5´-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG-3´

5´-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C AGC GTG GTC GCG GCC GAG-3´

5´-AGC GTG GTC GCG GCC GAG GA-3´

3´-GC CGG CTC CTA G-5´

Adaptor 1

Adaptor 2

Primer 1

Nested Primer 2

Nested Primer 1

Mbo1

Mbo1

30

Je 2 µl von LT1 und LT2 ergeben zusammen den Ligationsansatz LT. Die Ligation erfolgt

übernacht bei 17oC. Der Erfolg der Ligation und der Effekt der Suppressions-PCR werden durch

PCR überprüft. Als Template dazu werden die Ligationsansätze 1:1000 verdünnt.

PCR P1LT1 P1LT2 P1LT Negative KontrollPCR-Puffer 1x 1x 1x 1xPrimer 1 10 pmol 10 pmol 10 pmol 10 pmolMg2+ 1,5 mM 1,5 mM 1,5 mM 1,5 mM dNTPs 2 mM 2 mM 2 mM 2 mMTemplate LT1, 1µl LT1, 1µl LT, 1µl H2O auf 25 µl auffüllen auf 25 µl auffüllen auf 25 µl auffüllen auf 25 µl auffüllen

Die anfängliche 5-minütige Inkubation bei 75oC in Abwesenheit von Polymerase dient zur

Abkoppelung der nicht ligierten, kürzeren Stränge der Adaptoren. 1 U Taq Polymerase wird dann

dazugegeben, um die längeren Adaptor-Stränge durch eine 10-minütigen Inkubation bei 72 oC zu

verdoppeln. Nach einer anfänglichen 3-minütigen Inkubation bei 94oC folgt die Amplifikation mit

27 Zyklen:




Die PCR-Produkte werden auf einem 1,5%igen TAE-Gel kontrolliert.

2.2.1.3 Subtraktive Hybridisierung

Die Subtraktion erfolgt durch zwei Hybridisierungsschritte. In der ersten Hybridisierung werden die

mit unterschiedlichen Adaptoren versehenen Tester in getrennten Ansätzen mit Überschuss an

Driver subtrahiert und die molare Konzentration verschiedener Tester-Fragmente ausgeglichen. Das

geschieht in folgendem Ansatz:

H1 H2Tester 1,5µl LT1 1,5µl LT2 Driver (geschnittene Desiree-cDNA) 1,5µl x 400 ng/µl 1,5µl x 400 ng/µl4X Hybridisierungspuffer 1 µl 1 µl

31

4X Hybridisierungspuffer

30mM Tris-HCl , pH8; 3mM EDTA, pH8; 2M NaCl

Nach einer 2-minütigen Denaturierung bei 98 oC werden die Proben für 7 Stunden bei 63 oC

inkubiert.

Kurz vom Ende der ersten Hybridisierung werden 100ng Driver in 1x Hybridisierungspuffer durch

eine 2-minütige Inkubation bei 98 oC denaturiert. Die beiden Ansätze der ersten Hybridisierung

werden dann ohne erneute Denaturierung in Anwesenheit des frisch denaturierten Drivers

zusammengeführt und bei 63 oC übernacht inkubiert. Um die unspezifischen Bindungen zu

vermindern, wird wenige Minuten vor Ende der zweiten Hybridisierung zu dem

Hybridisierungsansatz 90µl H2O zugegeben.

2.2.1.4 Amplifikation der SSH-Produkt mittels „Nested-PCR“

Die erste PCR erfolgt wie im 2.2.1.2 beschrieben, außer dass der zweite Hybridisierungsansatz

unverdünnt als Template fungiert.

Das Produkt der ersten PCR wird 1:10 verdünnt und als Template für die Nested-PCR verwendet.

Als Positive-Kontrolle wird verdünnte LT als Template verwendet.

Template 1µlPCR-Puffer 1xMg2+ 1,5 mMdNTPs 2 mMNested-Primer 1 und 2 10 pmol Taq Polymerase 1 UH2O auf 25 µl auffüllen

Nach einer anfänglichen 2-minütigen Denaturierung bei 94 oC folgen 12 Zyklen Amplifikation bei:

Denaturing bei 94 oC für 30 Sek.



32

2.2.2 Überprüfung der SSH-Produkte durch Southern-Blot

Mittels Southern-Blot wird überprüft, ob durch SSH die differentiell erprimierten Gene angereichert

wurden. Als Sonde dienen dabei die mit Digoxigenin markierten SSH-Produkte, die auf die cDNA

vom Tester und Driver hybridisiert werden.

Je 1µg geschnittene cDNA von beiden Stämme wird auf einem 1,2%igen TAE-Gel aufgetrennt.

Der Vakuum-Blot der cDNA auf die positiv geladenen Nylonmembranen erfolgt bei 60 Bar und 2

Stunden mit 0,4 M NaOH. Die Hybridisierung erfolgt wie oben beschrieben.

Die Markierung der SSH-Produkte wird mit einem „Random Primed DNA Labeling Kit“ der Firma

Roche durchgeführt.

Man mischt dabei 10µl (1µg) gereinigte SSHG/D-Produkte mit 2 µl Hexanukleotiden (10 µM), kocht

die Probe für10 Min und stellt sie sofort auf Eis. Anschließend gibt man folgende Komponenten

dazu und inkubiert die Proben für 15 Stunden bei 37 oC:

10X Dig-Labeling-Mix, 2µl

10X Random-Priming-Puffer, 2µl und

Klenow Enzym, 1µl

2.2.3 Analyse der SSHG/D-Produkte

Das SSHG/D-Produkt wird auf den 2D-Gelen aufgetrennt und das Fragment mit höchster DNA-

Konzentration dann mittels „Core-PCR“ erneut amplifiziert. Sequenzierung und das anschließende

Alignment der Sequenz mittels Blastn dient zur Klärung der Identität des SSH-Produktes.

2.2.3.1 2D-Gel Auftrennung

Zuerst werden 10 µl von dem durch PCR amplifizierten SSHG/D-Produkt wie herkömmlich nach

ihrer Größe auf einem 1,5%igen TAE-Agarose-Gel aufgetrennt. Der Gel-Streifen, auf dem sich das

SSH-Produkt befindet, wird ausgeschnitten und quer zur Laufrichtung an die Obererkante eines

zweiten 2%igen Agarrose-Gels angelegt und bei 1,5 V/cm übernacht aufgetrennt. Dieses 2. Gel

enthält einen Farbstoff (Bisbenzimid) von 1µg/ml, der vorzugsweise in AT-Clustern der DNA-

Helix interkaliert. Dieser Farbstoff wird durch eine kovalent gebundene Polyethylenglycol-Kette

(PEG) modifiziert. DNA-Fragmente gleicher Länge werden im zweiten Gellauf je nach AT-Gehalt

33

und damit je nach Menge des gebundenen Farbstoff-PEG-Konstruktes verschieden stark bei der

Wanderung im elektrischen Feld des Gels behindert. Der Farbstoff ist kommerziell erhältlich

(ehem. Hansa Analytik).

2.2.3.2 Core-PCR

Aus der Mitte des stärksten DNA-Signals wird ein kleines Stück aus dem 2D-Gel ausgestanzt und

in ein PCR-Reaktionsgefäß überführt. Die PCR wird anschließend wie in 2.2.1.4 (nur die zweite

PCR) beschrieben zwecks Reamplifikation durchgeführt.

2.2.3.3 Direkte Sequenzierung

Das Produkt der Core-PCR wird sequenziert (Auftragssequenzierung). Als Sequenzierungsprimer

dient einer der beiden Nested-Primer. Das Sequenzen-Alignment erfolgt mit der Software „Blastn“.

2.3 Überprüfung der DSC

DSC wird als eine sehr elegante Methode zur Genom-Subtraktion beschrieben. Jedoch wird diese

Methode bisher von keinem unabhängigen Forscher bestätigt, oder gar benutzt. Um das Prinzip von

DSC zu überprüfen, wird einerseits ein Modellversuch aus der DSC-Literatur wiederholt, und

anderseits das Prinzip der DSC an eukaryontischer cDNA getestet.

2.3.1 DSC am Beispiel eines Lambda-Fragments

In der Literatur wird effiziente Subtraktion durch DSC am Beispiel eines sehr einfachen

Modellsystems beschrieben. Sowohl der Tester als auch der Driver stammen dabei von dem selben

Lambda-Fragment. Der Tester würde durch den Driver subtrahiert, wodurch im DSC-Produkt

kein intakter Tester mehr vorhanden wäre, der durch PCR mit den Tester-Primer erneut amplifiziert

werden kann. Dieser Versuch wird wiederholt.

2.3.1.1 Vorbereitung des Tester/Driver

34

Zuerst wird 1 µg von der mit HindIII/EcoRI geschnittene Lambda-DNA auf einem 1%-igen TAE-

Agarose-Gel aufgetrennt und das 564 Bp-Fragment aus dem Gel eluiert, gereinigt, quantifiziert und

für die Ligation verwendet:

Ligation LT (Ligation-Tester) LD (Ligation-Driver)

Adaptor 10 pmol Tester-Adaptor 10 pmol Driver-Adaptor Lambda Fragment 1ng 1 ng Ligase Puffer 1 x 1xLigase 100 U 100 UH2O auf 10µl auffüllen auf 10µl auffüllen

Tester-Adaptor:

5´-AGCACTCTCCAGCCTCTCACCGCA-3´

3´-AGTGGCGTTCGA-5´

Driver-Adaptor:

5´-ACCGACGTCGACTATCCATGAACA-3´

3´-GTACTTGTTCGA-5´

Zur Herstellung eines Adaptors werden gleiche Mengen zweier Primer-Stränge zusammengeführt,

für 5 Min. bei 65 oC denaturiert, dann langsam auf 16 oC (in 4 Stunden) abgekühlt. Die Ligation

erfolgt für 2 Stunden bei 17 oC. Die längeren Stränge der Adaptoren fungieren auch als Primer zur

Synthese der Tester/Driver-Amplikons durch PCR:

T (Tester-Amplikon) D (Driver-Amplikon)Template 1µl LT 1µl LDPCR-Puffer 1x 1xMg2+ 1,5 mM 1,5 mMdNTPs 2 mM 2 mMPrimer 10 pmol Tester-Primer 10 pmol Driver-PrimerTaq Polymerase 1 U 1 UH2O auf 25 µl auffüllen auf 25 µl auffüllen

Nach der anfänglichen Denaturierung für 2 Min. bei 94 oC erfolgt die Amplifikation für 35 Zyklen

bei:

35

Denaturierung bei 94 oC für 1Min.,

Annealing bei 68 oC für 1 Min., und

Elongation bei 72 oC für 1 Min.

Nach der finalen Elongation bei 72 oC für 3 Min. werden die PCR-Produkte auf einem Gel

kontrolliert, die Tester- und Driver-Amplikons aus dem Gel eluiert und quantifiziert.

2.3.1.2 Subtraktive Hybridisierung

Die subtraktive Hybridisierung erfolgt bei 67 oC, in einem 0,5 M NaCl-haltigen Puffer für drei

Stunden, mit einem Tester/Driver-Verhältnis von 1:100 und einer Tester-Menge von 1 ng.

1 ng Tester und 100 ng Driver werden zusammen gereinigt, in 32 µl 3x EE Puffer ( 30 mM EPPS,

pH8; 3 mM EDTA) aufgenommen und mit Öl überschichtet. Nach einer 5-minütigen Denaturierung

bei 99 oC werden 8 µl 5M NaCl dazugegeben. Darauf folgt eine 3-stündige Inkubation bei 67 oC,

bevor die DNA erneut gereinigt und in 20 µl H2O aufgenommen wird. Die anschließende MBN-

Behandlung erfolgt für 30 Min bei 37 oC in:

DNA 20 µl MBN 10 U 10x Puffer 3µl H2O auf 30 µl auffüllen

Die MBN-Reaktion wird dann zweimal mit Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert und 1µl der

DNA in 40 µl H2O überführt. Diese verdünnte DNA dient als Template für die PCR zur

Überprüfung der Subtraktion. Die restliche DNA wird erneut gereinigt und für die zweite

Subtraktion in 32 µl 3x EE Puffer aufgenommen. Insgesamt werden 3 Runden Subtraktion

durchgeführt.

2.3.1.3 Amplifikation der DSC-Produkte durch PCR

Die Amplifikation der DSC-Produkte durch PCR erfolgt mit dem gleichen PCR-Profil wie in

2.3.1.1 beschrieben (wie bei der Synthese der Tester-Amplikons).

36

2.3.2 DSC am Beispiel von Kartoffel-cDNA

Am Beispiel von Kartoffel-cDNA wird überprüft, ob differenzielle Genexpression in Eukaryonten

mit DSC analysiert werden kann.

2.3.2.1 Anwendung der DSC auf Kartoffel-cDNA

Die mit Mbo1 verdaute Desiree- cDNA dient dabei als Driver, die verdaute Gus-cDNA als Tester.

Zur Synthese der Tester/Driver-Amplikons wird folgende Ligation angesetzt:

Ligation LT (Ligation-Tester) LD (Ligation-Driver)

Adaptor 100 pmol Tester-Adaptor * 100 pmol Driver-Adaptor *DNA 100 ng geschnittene Gus-cDNA 100 ng geschnittene Desiree-cDNALigase Puffer 1 x 1xLigase 200 U 200 UH2O auf 10µl auffüllen auf 10µl auffüllen

* Die Adaptoren beinhalten die Erkennungssequenzen von Mbo1.

Tester-Adaptor:

5´-AGCACTCTCCAGCCTCTCACCGCA-3´

3´-AGTGGCGTCTAG-5´

Driver-Adaptor:

5´-ACCGACGTCGACTATCCATGAACA-3´

3´-GTACTTGTCTAG-5´

Die Ligation erfolgt übernacht bei 17 oC. Die PCR zur Synthese der Tester/Driver-Amplikons

erfolgt in 20 Zyklen, mit gleichen PCR-Profilen wie in 2.3.1 beschrieben.

Die Subtraktion erfolgt mit 100 ng Tester und 10 µg Driver. Die Zeit der Hybridisierung wird auf

12 Stunden verlängert. Insgesamt werden 4 Runden Subtraktion durchgeführt. Alle anderen

37

ungenannten Schritte erfolgen wie in 2.3.1 beschrieben.

2.3.2.2 Überprüfung der DSC-Produkte mittels Southern-Blot

Zwei Fragen sollen durch die Southern-Blots beantwortet werden: 1) ist das DSC-Produkt

spezifisch für den Tester? 2) Ist das Reporter-Target (Gus) noch in dem DSC-Produkt aufzufinden?

Die Ergebnisse dieser Untersuchungen werden Informationen über die Effektivität der Subtraktion

sowie die Sensitivität der Detektion differenzieller Genexpression durch DSC liefern.

Zur Beantwortung der Frage 1 wird das durch Random-Priming mit Digoxigenin markierte DSC-

Produkt auf je 200 ng Tester- und Driver-cDNA hybridisiert.

Zur Beantwortung der Frage 2 wird das Dig-Gus ( 2.1) mit dem DSC-Produkt hybridisiert. Als

Positive Kontrolle werden 3 pg nicht markiertes Gus-Fragment parallel zu dem DSC-Produkt auf

das Gel aufgetragen.

2.3.2.3 Identifizierung des DSC-Produktes

Zur Identifizierung des DSC-Produktes wird dieses kloniert, einige positive Klone willkürlich

ausgewählt, deren Plasmide isoliert und die Inserts sequenziert.

Klonierung

Die DSC-Produkte werden mit dem „TOPO TA Cloning Kit for Sequencing“ Kit von der Firma

Invitrogen kloniert.

Die Ligation des DSC-Produktes und der Plasmide erfolgt in folgender Zusammensetzung:

Frische DSC-Produkte aus der PCR 1µlSalz (1,2 M NaCl, 0,06 M MgCl2) 1µl

Plasmide 1µlH2O 3µl

38

Die Probe wird für 30 Min bei RT inkubiert und dann sofort für die Transformation verwendet. 2µl

des Ligations-Ansatzes werden zu 50 µl frisch aufgetauten, kompetenten E.coli gegeben und für 10

Min. auf Eis gestellt. Dann wird 500 µl SOC-Puffer zu den Zellen gegeben und die Zellen bei 37 oC

für 50 Min inkubiert.

Die E. coli werden anschließend auf LB-Agarose-Platten, die 5mg/L Kanamycin enthalten,

ausplattiert und über Nacht bei 37 oC inkubiert.

Isolierung der Plasmide

Die meisten in Anwesenheit des Antibiotikums entstandenen Klone beinhalten auch Plasmide.

Einige Klone werden zufällig ausgewählt und in je 1,5 ml LB-Medium mit 5 mg/L Kanamycyn bis

zum Ende der Log-Phase kultiviert.

Die Bakteriensuspension werden kurz zentrifugiert, mit PBS-Puffer gewaschen, in 100 µl RNase H-

haltigem GTE Puffer erneut suspendiert und für 5 min. bei RT inkubiert. Nach Zugabe von 200 µl

NaOH/SDS werden die Proben durch leichtes Schütteln vermischt und für 5 min. auf Eis gestellt,

dann 150 µl PAS-Puffer zugegeben, durch kurzes Vortexen vermischt und erneut für 5 min. auf Eis

gelagert.

Nach der Zentrifugation bei 13,000 g für 20 min. wird der Plasmid-haltige Überstand zweimal mit

Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (50:48:2) extrahiert und dann mit Ethanol gefällt. Nach

zweimal Waschen mit 75% Ethanol werden die Plasmide-Pellets in je 10 µl H2O aufgenommen.

RNAase H haltiger GTE-Puffer

50 mM Glucose; 25 mM TrisHCl, pH8; 10 mM EDTA; 0,1 µg/µl RNase H

NaOH/SDS

0,18 N NaOH; 1% SDS

PAS-Puffer

29,5 ml Essigsäure, mit KOH-Plättchen auf pH4,8 einstellen, mit H2O auf 100 ml auffüllen.

Sequenzierung

39

Die Sequenzierung der Inserts wird als Auftragsarbeit vergeben. Als Sequenzierungsprimer dienen

die T7- oder SP6-Sequenzen im Plasmide. Das Sequenz-Alignment erfolgt mit der Software Blastn.

2.4 Suche nach der Ursache des Versagens der DSC

Die Wiederholung des DSC-Modellversuches ist misslungen. Auch DSC am Beispiel von

Kartoffel-cDNA zeigt keinerlei Effekt der Subtraktion. Verschiedene Faktoren, darunter die MBN-

Aktivität und die Adaptoren, werden überprüft, um herauszufinden, was für das Nichtfunktionieren

der DSC ursächlich ist.

2.4.1 Überprüfung der MBN-Aktivität

Um festzustellen, ob die fehlende MBN-Aktivität für das Versagen der DSC verantwortlich ist,

wird die MBN-Aktivität überprüft:

Zwei Ansätze, je 8 µl (100 ng) gereinigte DNA (die überschüssigen DSC-Tester aus 2.3.1) werden

in Gefäße gegeben: Die Probe 1 bleibt unbehandelt; die Probe 2 wird für 2 Min denaturiert und

sofort auf Eis gestellt, dann 1µl 10x MBN-Puffer und 1µl (0,1 U) MBN zugegeben. Die MBN-

Behandlung erfolgt für 10 Min. bei 37 oC.

Der Effekt der MBN-Behandlung wird auf einem Gel kontrolliert.

2.4.2 Überprüfung des Zusammenhanges zwischen dem Aufbau der Adaptoren und der

Funktionalität der DSC

Es wird die Hypothese aufgestellt, dass die fehlende Funktionalität der DSC mit dem Design der

Adaptoren zusammenhängt. Zur Überprüfung dieser Hypothese wird ein Modellsystem entwickelt,

wobei zugleich zwei Tester, die sich nur durch ihre Adaptoren voneinander unterscheiden, von

einem Driver zu subtrahieren versucht werden.

Das DSC-Driver-Amplikon von 2.3.1 dient erneut als Driver. Das DSC-Tester-Amplikon von 2.3.1

und ein zweiter Tester werden zusammen im gleichen Reaktionsgefäß zu subtrahieren versucht.

Der neue Tester besteht aus dem 564 Bp Lambda-Fragment sowie je 11 Bp Überhang an seinen

beiden Enden. Der Tester-Überhang in den Heterohybriden beträgt bei der DSC 24 Bp, bei der

Subtraktion mit dem neuen Tester ist er jedoch mit 11 Bp viel kürzer.

40

Der zweite Tester, der wegen seiner im Vergleich zum DSC-Tester kürzeren Sequenz als Tk

bezeichnet wird, wird durch „Nested-PCR“ hergestellt. Dazu werden folgende Primer verwendet:

Tk1L

5´- CAGAGAGTCGAAGCTTTAGAGCGATTTATCTTCTG -3´

Tk2L

5´- CAGAGAGTCGA AGC TTT CCT GAC GGA ATG TTA ATT -3´

Tk1

5´- CAGAGAGTCGAAGCTTTAGAGC -3´

Tk2

5´- CAGAGAGTCGAAGC TTT CCT GAC -3´

Wobei die unterstrichenen Teile der Primer den 11 Bp Tester-Überhängen in den Heterohybriden

entsprechen. Die nicht unterstrichenen Teile der Primer stammen von den Sequenzen des Lambda-

Fragmentes.

Die erste PCR erfolgt in folgendem Ansatz:

Template 1 ng Lambda-FragmentPCR-Puffer 1xMg2+ 1,5 mMdNTPs 2 mMPrimer Tk1L, Tk2L, je 10 pmolTaq Polymerase 1 UH2O auf 25 µl auffüllen


bei:


41


Elongation bei 72 oC für 1 Min..

Das Produkt der ersten PCR dient als Template für die zweite PCR:

Template 0,5 µl PCR-Produkt aus erster PCRPCR-Puffer 1xMg2+ 1,5 mMdNTPs 2 mMPrimer Tk1, Tk2, je 10 pmolTaq Polymerase 1 UH2O auf 25 µl auffüllen


bei:



Elongation bei 72 oC für 1 Min..

Das PCR-Produkt Tk wird auf einem Gel kontrolliert, aus dem Gel eluiert und mittels Photometer

quantifiziert. Je 1ng von Tk und DSC-Tester-Amplikon sowie 100 ng DSC-Driver-Amplikon

werden zusammengeführt, mit Ethanol gefällt und in 32 µl 3x EE Puffer aufgenommen. Die

weiteren Schritte der Subtraktion sind wie bei der DSC beschrieben.

Die erneute Amplifikation des Produktes der Tk-Subtraktion erfolgt wie oben beschrieben mittels

einer PCR.

2.5 Entwicklung der NSC

Nachdem gezeigt wurde, dass die fatale Schwäche der DSC auf deren Adaptoren/Primer

zurückgeht, werden entsprechende neue Adaptoren/Primer für eine effiziente Subtraktion

konstruiert. Das daraus resultierende neue Subtaktionssystem mit innovativen Adaptoren/Primern

wird später als NSC (Negative Subtraktion Chain) bezeichnet.

NSC und DSC unterscheiden sich lediglich durch deren Adaptoren/Primer. Für NSC werden die

42

folgenden Adaptoren/Primer konstruiert:

NSC-Tester-Adaptor (BamH1):

A-Ta: 5´-CAGTCAGAGAGCTCTCACA-3´

A-b: 3´-GAGAGTGTTCGA-5´

NSC-Tester-Primer (BamH1):

P-T: 5´-CAGTCAGAGAGCTCTCACAAGCT-3´

NSC-Driver-Adaptor (BamH1):

A-Da: 5´-GACACTCTCACCTCTCACA-3´

A-b: 3´-GAGAGTGTTCGA-5´

NSC-Driver-Primer (BamH1):

P-D: 5´-GACACTCTCACCTCTCACAAGCT-3´

NSC und DSC werden in parallelen Ansätzen am Beispiel des 564 Bp Lambda-Fragments

überprüft. Abgesehen von den unterschiedlichen Sequenzen der Adaptoren/Primer erfolgen alle

Schritte der Subtraktion in gleicher Weise und wie in 2.3.1 beschrieben.

2.6 Subtraktion mittels SSH/NSC (SNH)

Die beiden Techniken, SSH und NSC, werden zur Analyse differenzieller Genexpression in

Eukaryonten kombiniert. Die Idee, auf der diese Kombination beruht, ist, zuerst mittels SSH das

Target anzureichern, dann mittels NSC den restlichen Hintergrund zu eliminieren. Das Prinzip der

SNH (subtraktive, negative Hybridisierung), wird am Beispiel von Kartoffel-cDNA überprüft.

Ferner wird die Sensitivität der Detektion differenzieller Genexpression in Eukaryonten durch SNH

festgestellt, und diese Methode bezüglich der Effektivität der Subtraktion sowie der Sensitivität der

Detektion optimiert.

2.6.1 Subtraktion mittels SNH am Beispiel Kartoffel-cDNA

Am Beispiel von Kartoffel-cDNA wird das Prinzip der SNH überprüft. Als Driver dient dabei die

Desiree-cDNA, als Tester die Gus-cDNA. Die Identität des SNG/D-Produktes wird durch Southern-

Blot, Klonierung und Sequenzierung festgestellt.

43

2.6.1.1 SNH am Beispiel von Kartoffel-cDNA

SNG/D und SNH D/D werden parallel durchgeführt. SNG/D verwendet die Gus-cDNA als Tester, die

Desiree-cDNA als Driver. SND/D benutzt die Desiree-cDNA als Tester und Driver zugleich. Zur

besseren Übersicht wird lediglich SNG/D ausführlich beschrieben. SND/D erfolgt auf analoge Weise.

Die SNH beinhaltet drei Schritte:

1) SSH;

SSHG/D und SSH D/D werden zuerst parallel durchgeführt und die SSH-Produkte durch die erste

PCR amplifiziert.

2) Adapter-Austausch

Von den SSH-Produkten werden die SSH-Adaptor-Sequenzen mittels Endonuklease abgetrennt und

durch Ligation und PCR auf deren Stelle mit den NSC-Adaptoren erneut versehen.

und 3) NSC

Als Tester der NSC dienen die Produkte von SSHG/D, die mit dem Tester-Adaptor der NSC versehen

werden. Als Driver dienen die Produkte von SSHD/D, die mit dem Driver-Adaptor der NSC versehen

werden.

SSH

Zwei SSH-Ansätze werden zuerst parallel durchgeführt. Die Gus-cDNA fungiert bei SSHG/D als

Tester, die Desiree-cDNA als Driver. Die Desiree-cDNA fungiert bei SSH D/D als Tester und Driver

zugleich. Die SSH-Produkte werden durch die erste PCR amplifiziert.

Alle Adaptoren/Primer beinhalten die Erkennungssequenzen von Mbo1.

Zur Herstellung der Tester wird folgende Ligationsreaktion angesetzt:

Ligation LG1 LG2 LD1 LD2Adaptor 10 pmol Adaptor 1 10 pmol Adaptor 2 10 pmol Adaptor 1 10 pmol Adaptor 2Gus-cDNA,

geschnitten

100 ng 100 ng

Desiree-cDNA,

geschnitten

100 ng 100 ng

44

Ligation LG1 LG2 LD1 LD2Ligase Puffer 1 x 1 x 1 x 1 x Ligase 200 U 200 U 200 U 200 UH2O auf 10µl auffüllen auf 10µl auffüllen auf 10µl auffüllen auf 10µl auffüllen

Je 2 µl von LG1 und LG2 zusammen ergeben das LG. Je 2 µl von LD1 und LD2 zusammen

ergeben das LD. Die Ligation erfolgt über Nacht bei 17oC. Der Erfolg der Ligation wird wie in 2.2

beschrieben durch PCR kontrolliert.

Das Tester/Driver-Verhältnis bei der ersten Hybridisierung beträgt 1:80, mit einer Tester-Menge

von 10 ng:

erste Hybridisierung LG1/D LG2/D LD1/D LD2/DTester LG1, 1µl LG2, 1µl LD1, 1µl LD2, 1µlDriver (geschnittene

Desiree-cDNA)

2µl x 400 ng/µl 2µl x 400 ng/µl 2µl x 400 ng/µl 2µl x 400 ng/µl

4X Hybridisierungspuffer 1 µl 1 µl 1µl 1 µl

Nach einer Denaturierung bei 98 oC für 2 Min. werden die Proben bei 63 oC für 1,5 Stunden

inkubiert.

Kurz vor Ende der ersten Hybridisierung werden 2 parallele Ansätze von 300ng Driver in 1µl

Hybridisierungspuffer bei 98 oC für 2 Min. denaturiert. Die beiden Ansätze der ersten

Hybridisierung (LG1/D und LG2/D für SSHG/D; LD1/D und LD2/D für SSHD/D) werden dann ohne

erneute Denaturierung in Anwesenheit des frisch denaturierten Drivers zusammengeführt und bei

63oC über Nacht inkubiert. 90µl H2O werden wenige Minuten vor dem Ende der Inkubation zu den

Ansätzen hinzugegeben.

Die Amplifikation der SSH-Produkte erfolgt durch die erste PCR:

Erste PCR SSHG/D SSHD/D Negative KontrolleTemplate 1µl der zweiten

Hybridisierung SSHG/D

1µl der zweiten

Hybridisierung SSHD/D

PCR-Puffer 1x 1x 1x

45

Erste PCR SSHG/D SSHD/D Negative KontrolleMg2+ 1,5 mM 1,5 mM 1,5 mMdNTPs 2 mM 2 mM 2 mMPrimer1 20pmol 20pmol 20pmol Taq

Polymerase

1 U 1 U 1 U

H2O auf 50 µl auffüllen auf 50 µl auffüllen auf 50 µl auffüllen

Das angewendete PCR-Profil ist wie in 2.2 beschrieben.

Adaptor-Austausch

In diesem Schritt werden die SSH-Adaptoren der SSH-Produkte durch die NSC-Adaptoren

ausgetauscht. Zuerst werden je 40 µl SSH-Produkt mit Chloroform/Isoamyalkohol extrahiert, mit

Ethanol gefällt und erneut in je 40 µl H2O aufgenommen. Die Restriktion der SSH-Adaptoren

erfolgt übernacht bei 37 oC in folgenden Ansätzen:

gereinigte SSH-Produkte SSHG/D, 40 µl SSHD/D, 40 µlMbo1 10 U 10 U10X Puffer 5 µl 5 µlH2O auf 50 µl auffüllen auf 50 µl auffüllen

Die geschnittenen SSH-Produkte werden erneut mit Chloroform/Isoamyalkohol extrahiert, mit

Ethanol gefällt und in je 15 µl H2O aufgenommen. Die Ligation der NSC-Adaptoren erfolgt

übernacht bei 17 oC in folgenden Ansätzen:

Ligation LT LDNSC-Adapter 10 pmol Tester-Adaptor 20 pmol Driver-AdaptorSSH-Produkt, geschnitten 2 µl SSHG/D 4 µl SSHD/D

Ligation Puffer 1 x 1xLigase 200 U 400 UH2O auf 10µl auffüllen auf 20µl auffüllen

Die Tester/Driver-Amplikons für NSC werden durch PCR synthetisiert:

46

Amplikon NSC-Tester NSC-Driver Negative Kontrolle der PCRTemplate 1µl LT 5µl LDPCR-Puffer 1x 1x 1xMg2+ 1,5 mM 1,5 mM 1,5 mMdNTPs 2 mM 2 mM 2 mMPrimer NSC-Tester-Primer NSC-Driver-Primer NSC-Tester/Driver-PrimerTaq Polymerase 1 U 5U 1 UH2O auf 25 µl auffüllen auf 125 µl auffüllen auf 25 µl auffüllen

Nach der anfänglichen Denaturierung bei 94 oC für 2 Min. erfolgt die Amplifikation für 15 Zyklen

bei

94 oC, 1Min.

68 oC, 30 Sek. und

72 oC , 90 Sek.

Die PCR-Produkte werden auf einem Gel kontrolliert.

NSC

1µl Tester- und 100 µl Driver-Amplikons werden zusammengeführt, mit

Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert, mit Ethanol gefällt und dann in 4 µl NSC -Puffer

aufgenommen. Die Probe wird mit Öl überschichtet und für 5 Min. bei 100 oC denaturiert. Das

Reannealing erfolgt in 12 Stunden bei 63 oC. Einige Minuten vom Ende der Inkubation werden 36

µl H2O zugegeben.

NSC -Puffer

10 mM EPPS, pH8; 1 mM EDTA; 0,5 M NaCl

Der Hybridisierungsansatz wird dann zweimal mit Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert und mit

Ethanol gefällt. Das DNA-Pellet wird in 20 µl H2O aufgenommen. Die MBN-Behandlung bei 37oC

für 30 Min erfolgt in folgendem Ansatz:

Gereinigte DNA 20 µlMBN 5 U

47

Gereinigte DNA 20 µl10X Puffer 3µlH2O auf 30 µl auffüllen

Nach der MBN-Behandlung wird die DNA erneut zweimal mit Chloroform/Isoamylalkohol

extrahiert. 1 µl dieser behandelten DNA wird in 20 µl H2O überführt und dient als Template für die

PCR zur Überprüfung der Subtraktion. Die restliche DNA wird mit Ethanol gefällt und für die

weitere Subtraktion in 4 µl NSC-Puffer aufgenommen. Es werden insgesamt drei Runden

Subtraktion durchgeführt.

Die Amplifikation der NSC-Produkte erfolgt in folgenden Ansätzen:

NSC1 NSC2 NSC3 Negative Kontrolle

Verdünntes NSC-

Produkt als Template

1µl nach der ersten

Subtraktionsrunde

1µl nach der zweiten

Subtraktionsrunde

1µl nach der dritten

Subtraktionsrunde

PCR-Puffer 1x 1x 1x 1xMg2+ 1,5 mM 1,5 mM 1,5 mM 1,5 mMdNTPs 2 mM 2 mM 2 mM 2 mMTester-Primer 10 pmol 10 pmol 10 pmol 10 pmolTaq Polymerase 1 U 1 U 1 U 1 UH2O auf 25 µl

auffüllen

auf 25 µl

auffüllen

auf 25 µl

auffüllen

auf 25 µl auffüllen

Nach einer anfänglichen Denaturierung bei 95 oC für 2 Min. erfolgt die Amplifikation in 30 Zyklen

bei

94 oC, 30 Sek.

68 oC, 30 Sek.

72 oC, 90 Sek.

2.6.1.2 Verifizierung der SNG/D-Produkte mittels Southern-Blot

Zwei Fragen sollen durch die Southern-Blots beantwortet werden: 1) Ist das SNG/D-Produkt

spezifisch für den Tester? und 2) Ist das Reporter-Target (Gus) noch unter den SNG/D-Produkten

aufzufinden? Die Ergebnisse dieser Untersuchungen werden Informationen über die Effektivität der

Subtraktion sowie die Sensitivität der Detektion differenzieller Genexpression durch SNH liefern.

48

Zur Frage 1 wird das durch Random-Priming mit Digoxigenin markierte SNH-Produkt auf je 200

ng Tester- und Driver-cDNA hybridisiert.

Zur Frage 2 wird das Gus- Gen durch PCR mit Digoxigenin markiert und auf das SNG/D-Produkt

hybridisiert, um die Sensitivität der SNH-Technik zu ermitteln.

Das Gus-Gen von E.coli ist insgesamt 1812 Bp lang. Ein 1632 Bp langes markiertes Gus-Fragment

wird durch PCR erzeugt (Dig-Gus-voll). Alle Mbo1-Fragmente des Gus-Genes sind in dem Dig-

Gus-voll repräsentiert.

PCR Dig-Gus-voll

Template 10 ng Gus-cDNA, unverdaut

PCR-Puffer 1xMg2+ 1,5 mMNTPs 2 mM dNTPs + 0,5mM Dig-UPrimer Je 10 pmol von GusvV und GusvRTaq Polymerase 1 UH2O auf 25 µl auffüllen

GusvV: 5´-TGT GGG CAT TCA GTC TGG ATC-3´ Nt53-73

GusvR: 5´-TCA CCG AAG TTC ATG CCA GTC-3´ Nt1784-1764

Nach einer anfänglichen Denaturierung bei 95 oC für 2 Min. erfolgt die Amplifikation in 35

Zyklen:

94 oC, 30 Sek.

64 oC , 30 Sek.

72 oC , 3 Min.,

sowie eine finale Elongation für 5 Min. bei 72 oC.

2.6.1.3 Identifizierung des SNG/D-Produktes durch Klonierung und Sequenzierung

Zur Identifizierung des SNG/D-Produktes wird dieses kloniert, dann 15 positive Klone zufällig

49

ausgewählt, daraus die Plasmide isoliert und Sequenziert. Die Durchführung ist wie in 2.3.2.3

beschrieben.

2.6.2 Untersuchung der Sensitivität der Detektion differenzieller Genexpression in Kartoffeln

durch SNH

Um die Sensitivität der SNH zu bestimmen, wird diese an dem Modell-Tester getestet, der ein

künstliches Target in verschiedenen bekannten Konzentrationen beinhaltet.

2.6.2.1 Vorbereitung des künstlichen Targets

Das 301 Bp Gus-Fragment (ein PCR-Produkt wie in 2.1), das zwei Mbo1-Erkennungssequenzen

beinhaltet, wird mit Mbo1 geschnitten:

Gus (301 Bp) Ca 500 ngMbo1 10 U10x Puffer 1µlH2O auf 10 µl auffüllen

Die Mbo1-Verdauung erfolgt übernacht bei 37 oC. Es entsteht dabei ein 244 Bp Fragment (Gm),

das an seinen beiden Enden die Mbo1-Erkennungssequenzen besitzt.

Die geschnittenen Gus-Fragmente werden auf einem Gel kontrolliert und das 244 Bp Gm aus dem

Gel eluiert, gereinigt und quantifiziert.

2.6.2.2 SNH

Als künstliches Target dient Gm in unterschiedlichen bekannten Mengen. Als Driver dient die

cDNA von Desiree. Die SSH-Tester, die den Driver sowie 0, 20, 100 oder 500 ppm von Gm

enthalten, werden durch Ligation hergestellt:

künstliche Tester Desiree-cDNA

mit 0 ppm Gm

Desiree-cDNA

mit 20 ppm Gm

Desiree-cDNA

mit 100 ppm Gm

Desiree-cDNA

mit 500 ppm GmDesiree-cDNA,

geschnitten

100 ng 100 ng 100 ng 100 ng

Gm - 2 pg 10 pg 50 pgSSH-Adaptor1/2 10 pmol 10 pmol 10 pmol 10 pmol

50

künstliche Tester Desiree-cDNA

mit 0 ppm Gm

Desiree-cDNA

mit 20 ppm Gm

Desiree-cDNA

mit 100 ppm Gm

Desiree-cDNA

mit 500 ppm Gm Ligase Puffer 1 x 1 x 1 x 1 x Ligase 200 U 200 U 200 U 200 UH2O auf 10µl

auffüllen

auf 10µl auffüllen auf 10µl

auffüllen

auf 10µl auffüllen

Die Subtraktion sowie die Identifizierung der SNH-Produkte erfolgen wie in 2.6.1 beschrieben.

2.6.3 Optimierung der SNH

Es werden Experimente durchgeführt, um SNH bezüglich der Art der angewendeten Exonuklease,

der optimalen MBN-Konzentration sowie der geeignetsten Adaptoren zu optimieren.

2.6.3.1 Exonuklease 7 anstelle von MBN für NSC

Überprüft wird es, ob Exonuklease VII anstelle von MBN für NSC verwendet werden kann. Dies

wird einerseits am Beispiel des Lambda-Fragments, andererseits am Beispiel der Kartoffel-cDNA

überprüft. NSCs werden entweder mit 5 U/Reaktion MBN oder gleicher Menge Exonuklease 7

parallel durchgeführt. Die meisten Schritte sind wie in 2.5 und in 2.6.2 beschrieben, außer dass bei

der NSC mit Exonuklease7 die DNA-Reinigungsschritte vor den Exonuklease-Behandlungen

übergangen werden.

2.6.3.2 Optimierung der MBN-Menge

Eine ausreichende MBN-Konzentration ist unentbehrlich zur effizienten Subtraktion durch SNH,

zugleich jedoch deradiert hoch konzentrierte MBN dsDNA. Dadurch wird die Sensitivität der

Detektion differenzieller Genexpression negativ beeinflusst. Gesucht wird deshalb die optimale

MBN-Konzentration für SNH.

SNH mit unterschiedlichen MBN-Konzentrationen

Überprüft werden 0,05, 0,5 und 5 U MBN pro Reaktion. NSC erfolgt wie in 2.5.2 beschrieben mit

unterschiedlichen Mengen von MBN. Das Ausgangesmaterial für NSC sind die mit den NSC-

Adaptoren versehenen SSH-Produkte.

51

Die Sensitivität der SNH-Detektion und die angewendeten MBN-Konzentrationen

Der Zusammenhang zwischen der Sensitivität der SNH-Detektion und der dabei angewendeten

MBN-Konzentrationen wird durch Southern Blot überprüft. Als Sonde dient das Reporter-Target,

das mit Digoxigenin markierte Gus-Gen (2.6.2.2). Hybridisiert wird die Sonde auf die gleichen

Mengen von SNH-Produkten, bei denen unterschiedliche Mengen von MBN eingesetzt werden.

Die Effektivität der Subtraktion und die angewendeten MBN-Mengen

Die SNH-Produkte bei 5 U MBN sind spezifisch für den Tester. Durch Dot-Blot wird dann

überprüft, welcher Anteil der SNH-Produkte bei 0,5 U MBN für den Tester spezifisch ist.

Zwei Dot-Blots werden parallel durchgeführt. Als Sonde dienen dabei die cDNAs von Gus oder

Desiree, die durch Random-Priming mit Digoxigenin markiert werden. Hybridisiert wird auf 30

denaturierte Plasmid-DNA-Proben, die zufällig aus den klonierten SNH-Produkten bei 0,5 U

MBN/Reaktion ausgewählt werden. Je 1,5 µl Plasmid-DNA und 0,2 M NaOH werden dabei

vermischt, und je 1µl parallel auf zwei Membranen gedottet.

2.6.3.3 neue Adaptoren für SNH

Es wird ein Versuch durchgeführt, um neue Adaptoren zu konstruieren, die zugleich die Adaptor-

Sequenzen für SSH und NSC beinhalten, was den umständlichen Adaptor-Austausch überflüssig

macht. Dazu werden folgende Primer eingesetzt:P1T: 5´-CTAATACGACTCACTATAGGGCCAGTCAGAGAGCTCTCACA -3´

P2T: 5´-GAGTAGTCATAGTCAGTGCTGACAGTCAGAGAGCTCTCACA -3´

P1D: 5´-CTAATACGACTCACTATAGGGCGACACTCTCACCTCTCACA -3´

P2D: 5´-GAGTAGTCATAGTCAGTGCTGAGACACTCTCACCTCTCACA -3´

p1: 5´-CTAATACGACTCACTATAGGGCCAG -3´

p2: 5´-GAGTAGTCATAGTCAGTGCTGACAG -3´

Die SSH-Adaptoren werden durch Annealing komplementärer Primer-Sequenzen hergestellt:

SSH-Tester-Adaptor 1 SSH-Tester-Adaptor 2 SSH-Driver-Adaptor 1 SSH-Driver-Adaptor 2P1T/A-b P2T/A-b P1D/A-b P2D/A-b

Die Kontrolle des Suppressions-PCR-Effekts und der Erfolg der Ligation erfolgt wie in 2.2.1.2

beschrieben, mit P1 und P2 anstelle von nur P1 als Primer für PCR. Die Annealing-Temperatur der

Primer liegt bei 69 oC. Sequenzen der Primer A-b siehe 2.5.

52

2.7 Die Logik der Methodenentwickelung

Abb. 2-3: Die Entwickelung der SNH

Zusammenfassend lässt sich die Logik der Methodenentwickelung so darstellen: Beim Fehlschlag

der SSH/2D zur Identifizierung differenzieller Genexpression in Solanum wurde beabsichtigt, die

SSH und DSC zu kombinieren. Beim Misserfolg zur Etablierung der DSC wurde dann die genaue

Ursache dieser Fehlfunktion gesucht, gefunden und entsprechend korrigiert, daraus wurde ein

effizientes Subtraktionssystem namens NSC entwickelt. SSH und NSC wurden dann zu dem

Lösungsweg SNH kombiniert. Die Eignung und Sensitivität der SNH zum Detektieren

differenzieller Genexpression wurde anhand der Solanum-cDNA bestimmt. Ferner wurden

Optimierungsversuche betrieben, die die Sensitivität der SNH steigeren, oder ihre Durchführung

vereinfachen sollten.

SSH/2D-Gel an cDNA aus Solanum

Überprüfung des Prinzips der DSC

Suche nach der Schwachstelle der DSC

Überprüfung des Prinzips der NSC

SSH DSC

Entwicklung der NSC

Bestimmung der Sensitivität zum Detektieren differenzieller Genexpression mittels SNH

Anwendung verschiedener MBN-Mengen zur Optimierung der Sensitivitität der Detektion und der Effektivität der Subtraktion

MBN durch Exonuklease VII ersetzen: Optimierung der Sensitivität und des Arbeitsaufwandes

Konstruktion neuer Adaptoren und Primer

Überprüfung des Prinzips der SNH an cDNA aus Solanum

Kombination der SSH/NSC

53

3. Ergebnisse

3.1 Vorbereitung des Tester/Drivers zur Genom-Subtraktion

Dieser Teil der Arbeit dient zur Vorbereitung und Charakterisierung der Solanum-cDNA als Tester

und Driver der Genom-Subtraktion.

3.1.1 Isolierung der Gesamt-RNA

Die Gesamt-RNA wird mit der Guanidinium/Phenol-Methode aus jungen Blättern der Kartoffeln

von beiden Stämmen isoliert.

Abb.3-1: Gesamt-RNA aus jungen Blättern der Kartoffeln.

Aufgetrennt auf einem 1% MPOS-Gel ist die gesamt-RNA von beiden Stämme rein optisch nicht

voneinander zu unterscheiden. Die Gesamt-RNA zeigt sich dabei als ein Schmier mit mehreren

starken Banden. Der Schmier enthält bis zu 20-30,000 verschiedene mRNA-Sequenzen, meist in

niedrigen Konzentrationen. Die starken Banden sind dagegen den rRNA-Sequenzen zuzurechnen.

In den Blättern der Kartoffeln haben die rRNAs sowohl eukaryontische als auch prokaryontische

(aus den Chloroplasten) Ursprünge. Dass die Menge von 28S rRNA mehr als die doppelte von 18S

rRNA beträgt, deutet auf die gute Qualität der Gesamt-RNA hin. Aus je 5 g jungen Blättern werden

dabei 8-10 mg gesamt-RNA gewonnen.

28S rRNA, 4800 Basen

18S rRNA, 1800 Basen

54

3.1.2 Anreicherung der mRNA

mRNA wird mit Oligo(dT)-Zellulose angereichert. Der letzte Wasch-Puffer enthält 0,15 M NaCl .

Aus 1,5 mg gesamt-RNA gehen dabei ca. 25-30 µg mRNA hervor.

Abb.3-2: mRNA aus Blättern der Kartoffeln.

Aufgetrennt auf einem MPOS-Gel sind die mRNAs von beiden Stämmen rein optisch voneinander

nicht zu unterscheiden. Die mRNA zeigt sich als ein Schmier ohne ausgeprägte starke Banden, wie

es bei der gesamt-RNA der Fall ist. Die rRNA-Sequenzen sind sichtbar vermindert worden.

3.1.3 Überprüfung der Intaktheit der mRNA

Die Intaktheit der mRNA wird mittels Northern-Blot überprüft.

Abb.3-3: Überprüfung der Intaktheit der mRNA.

Dig-Aktin wird hybridisiert auf: 1. Gus-mRNA; 2. Desiree-mRNA.

Je 0,5µg mRNA von beiden Stämmen werden auf einem MOPS-Gel aufgetrennt, geblottet und mit

dem mit Digoxigenin markierten Aktin-Fragment hybridisiert. Die klaren und starken Signale bei

beiden mRNAs weisen auf die Intaktheit der mRNA hin (Abb.3-3).

Als Sonde dient dabei ein mit Digoxigenin markiertes Aktin-Fragment.

1 2

55

Abb.3-4: PCR-markiertes Dig-Aktin. 1. Größenstandards; 2.Dig-Actin.

Die Markierung der Dig-Aktin erfolgt während der PCR-Anreicherung des 650 Bp langen Aktin-

Fragments aus Kartoffel-DNA (Abb.3-4).

Die Markierungseffizienz des Dig-Aktins wird durch Dot-Blot ermittelt.

Abb.3-5: Dot-Blot zur Ermittelung der Markierungseffizienz bei Dig-Aktin. 1. Dig-Aktin; 2.

Kontrolle. a-e, unverdünnt, sowie 1: 10, 1:100, 1:1000, 1:1000 Verdünnungen. Die am höchsten

konzentrierte Kontrolle a beinhaltet 1ng mit Digoxigenin markierte DNA.

Die Konzentration der Sonde Dig-Aktin wird dabei auf das 10-fache der Kontrolle, rechnerisch auf

10 ng/µl geschätzt (Abb.3-5).

3.1.4 Expression des Reporter-Targets

Die Expression des Reporter-Targets, die des Transgens „Gus“, wird mittels Northern Blot

überprüft. Je 1µg mRNA von beiden Stämmen werden auf einem MOPS-Gel aufgetrennt, geblottet

und mit einem mit Digoxigenin markierten Gus-Fragment hybridisiert. Zur Schätzung der

Expressionsstärke des Transgens wurden auch verschiedene Mengen von dem nicht markierten

Gus-Fragment als quantitative Kontrollen parallel zu den mRNAs aufgetragen.

1

2

a b c d e

1 2

56

Abb.3-6. Die Expression des Gus-Gens. Dig-Gus wird hybridisiert mit: 1. 1µg mRNA von Stamm

Gus; 2. 1µg mRNA von Stamm Desiree; 3-5. 0,3, 3 und 30 pg von dem 301 Bp langen Gus-

Fragment.

Die Expression des Gus-Gens von rechnerisch 1,5-15 Kopien pro Zelle ist lediglich bei dem

transgenen Stamm festzustellen.

Signale sind nur bei der Gus-mRNA und bei den quantitativen Kontrollen (Gus-Fragmenten) zu

sehen, aber nicht bei der Desiree-mRNA. Die Signale bei den Gus-Fragments sind doppelt, weil das

dsDNA-Fragment auf dem MOPS Gel denaturiert wird.

Die Stärke des Signals von 1µg mRNA aus dem Stamm Gus ist ähnlich wie das bei 0,3-3 pg reinem

Gus-Fragment (Abb.3-6). Das Gus-Fragment ist 301-Bp lang. Wenn man davon ausgeht, dass die

mRNA von Kartoffeln eine durchschnittliche Länge von 3000 Bp besitzt, kann man schätzen, dass

die mRNA des Gus-Gens 3-30 ppm der gesamten mRNA ausmacht. Angenommen, dass in einer

Zelle zu einem bestimmten Zeitpunkt insgesamt ca. 500, 000 Kopien mRNAs exprimiert werden,

entspricht die Expressionsstärke des Gus-Gens 1,5-15 Kopien pro Zelle. Daher gehört das Gus-Gen

zu der am niedrigsten exprimierten mRNA-Klasse.

Das 301 Bp lange Gus-Fragment sowie das Fragment in markierter Form als Sonde werden durch

PCR erzeugt (Abb.3-7).

1 2 3 4 5

57

Abb.3-7: Die durch PCR hergestellten Gus-Fragmente.1. Größenstandards; 2. GUS-Fragment,

nicht markiertes; 3. Dig-GUS.

Das Gus-Fragment ist ein PCR Fragment von 382 Bp. Wegen den eingebauten Digoxigenin-

Molekülen läuft das Dig-Gus im Gel langsamer als das unmarkierte Gus.

Die Markierungseffizienz bei Dig-Gus wird durch Dot-Blot kontrolliert.

Abb.3-8: Dot-Blot zur Ermittelung der Markierungseffizienz bei Dig-GUS. 1. Dig-GUS; 2.

Kontrolle. a-e, unverdünnt, sowie 1: 10, 1:100, 1:1000, 1:1000 Verdünnungen.

Die am höchsten konzentrierte Kontrolle a beinhaltet 1ng/µl Digoxigenin markierte DNA.

Die Konzentration der Sonde Dig-Gus wird hierbei auf das 10-fache der Kontrolle, rechnerisch auf

10 ng/µl geschätzt (Abb.3-5).

3.1.5 Synthese und Restriktion der cDNA

cDNA wird nach dem Prinzip des „SmartTM PCR cDNA Synthesis Kit“ synthetisiert. Für Genome-

Subtraktion werden die cDNA anschließend mit Mbo1 geschnitten.

1

2

a b c d e

1 2 3

58

Abb.3-9: cDNA aus Blättern der Kartoffeln. 1. DNA-Größenstandards; 2. durch Mbo1 verdaute

cDNA von Gus; 3. durch Mbo1 verdaute cDNA von Desiree; 4. cDNA von Gus, ungeschnitten; 5.

cDNA von Desiree, ungeschnitten.

Auf einem Gel aufgetrennt zeigt sich die cDNA von jungen Blättern der Kartoffeln als Signale

zwischen 100 Bp und 3 KB. Die mit Mbo1 verdaute cDNA liegt zwischen 100 Bp und 1 KB. Rein

optisch sind die cDNAs von unterschiedlichen Stämmen nicht voneinander zu unterscheiden

(Abb.3-9). Aus einem 100 µl PCR-Ansatz werden ca. 8 µg cDNA gewonnen.

Die Gesamt-RNA wird mit der Guanidinium/Phenol Methode aus Blättern der Kartoffeln isoliert

und im Anschluss mRNA mit Oligo(dT)-Zellulose daraus angereichert. Die Synthese der cDNA

erfolgt nach Clontech mit geringfügigen Modifikationen. Die Qualität der mRNA sowie die

Expressionsstärke eines Reporter-Targets von 1,5-15 ppm werden durch Northern-Blot überprüft.

Die mit Mbo1 verdaute cDNA wird als Tester und Driver der Genom-Subtraktion dienen.

3.2 Analyse differentieller Genexpression in Kartoffeln mit SSH

Mit SSH und 2D-Gelauftrennung kann man ohne Klonierung die unterschiedlichen Fragmente

zweier nah verwandter Pilzstämme identifizieren (Harms, 2002). Überprüft wird hierbei die Frage,

ob mit dieser Technik auch die Analyse differentieller Genexpression in viel komplexeren

Eukaryonten gelingen kann.

1 2 3 4 5

59

3.2.1 SSH am Beispiel von Kartoffel-cDNA

SSH wird bezüglich der Adaptor/Primer-Sequenzen geringfügig modifiziert. Sie werden mit den die

Erkennungssequenzen von Mbo1 anstelle die von Rsa1 versehen. Diese Modifikation macht die

Ligation effektiver.

Abb.3-10. SSH am Beispiel von Kartoffel-cDNA. 1. DNA-Größenstandards; 2. SSHD/D -Produkt;

3. SSHG/D -Produkt.

Zwei SSH-Ansätze werden parallel durchgeführt. Wenn die mit Mbo1 geschnittene cDNA von Gus

als Tester, die geschnittene cDNA von Desiree als Driver fungieren, zeigt sich das SSHG/D-Produkt

auf dem Gel als ein Schmier mit mehreren Banden. Im Gegensatz dazu ist das Produkt der

negativen Subtraktionskontrolle SSHD/D, worin die geschnittene cDNA von Desiree zugleich als

Tester und Driver fungiert, als ein schwächerer Schmier ohne distinkte Banden sichtbar (Abb.3-

10).

3.2.2 Anreicherung des Targets durch SSH

Die Anreicherung des Targets durch SSH wird durch Southern Blot evaluiert.

Abb.3-11. Anreicherung differentiell exprimierter Gene durch SSH. Das mit Digoxigenin

1 2 3

1 2

60

markierte SSHG/D-Produkt wird hybridisiert auf: 1) Mbo1 verdaute cDNA von Gus (Tester); 2)

Mbo1 verdaute cDNA von Desiree (Driver)

Wenn das mit Digoxigenin markierte SSHG/D-Produkt als Sonde auf gleiche Mengen

immobilisierter Tester- und Driver-cDNA hybridisiert wird, erweist sich das Signal bei dem Driver

als ein leichter Schmier mit kaum wahrnehmbaren Banden, bei dem Tester dagegen als ein stärkerer

Schmier mit mehreren starken Banden (Abb.3-11). Dies deutet darauf hin, dass die durch SSH

angereicherten Fragmente in dem Tester höher konzentriert sind. Dies wiederum bedeutet, dass die

differentiell exprimierten Gene durch SSH angereichert werden.

3.2.3 Identifizierung eines im SSHG/D-Produkt am höchsten konzentrierten Fragment mittels

2D-Gelen „Core PCR“ und Sequenzierung

Anders als bei Bakterien Genomen, bei denen die durch SSH angereicherten Fragmente dem Target

entsprechen, stammt dagegen das am höchsten konzentrierte Fragment in dem SSH-Produkt bei

Kartoffel cDNA nicht immer aus den differentiell exprimierten Genen, sondern oft aus den hoch

konzentrierten Hintergrund-Sequenzen.

Abb.3-12. 2D-Auftrennung des SSHG/D-Produkts

Nach der 2D-Gelelektrophorese erscheinen die konzentrierten Fragmente im Produkt der SSHG/D als

leuchtende DNA-Punkte, die sich von dem wolkigen Hintergund abheben (Abb.3-12). Für die

„Core-PCR“ dient die in einem Gel-Stück, das manuell aus dem starken DNA-Signalpunkt auf dem

2D-Gel (Pfeil) ausgestanzt wird, enthaltete DNA als Template.

(2 . D im en sio n )

C o re-P C R

61

Abb.3-13. Core-PCR eines mit SSH angereicherten Fragmentes.

1. DNA-Größenstandards; 2. Produkt der Core-PCR.

Es werden dabei immer auch ungewollte Hintergrund-Sequenzen mit übertragen, die für den

Schmier in dem Produkt der „Core-PCR“ verantwortlich sind (Abb.3-13). Das Haupt-Produkt der

Core-PCR im Form einer distinkten Bande wird aus dem Gel eluiert, gereinigt und sequenziert.

Durch Sequenz-Alignment wird dieses Fragment als Teil des rRNA-Gens identifiziert,welches in

beiden Stämmen vorhanden ist:

TCGCGGGGNNAGAAGACCCTGTGTGGNCCNTNNCTCTAGCTCCCNANTTTGNGGAANTGCACTNNTAAAGGNNTNGTATANGTAGGG

CANCCNCAAGGCNAAAGTGAAACNCCNNTANTTTTAACNNTATTNTACTNATTCCGTGAATNGTNAAGCGGGGCACTGCCCCTATNTT

TGGACCCAAGGCTCGCTNTGCGGNCCGATCNGGNCNGNANACATTGTNANGTGGGGAGTATGGCTGGGGCGGCACATCTAGTGAAAA

GATNACCCATGCGTCNCTAAGATGAGCTCAACCTAGAACAGAATTGTCGTGNGNNACATAAGGGTAAAAGCTCGTTTCGTTTCTNATT

TACAGTNCGAATGCCAACCCGTAAAAGNCNCGGCCTAACAATTCTTTTNACCCTNNGAATTCNAANTTNGAGGGGTNAAAAAGTTNC

AAGGGGATATTTGCTTGGGGATCCAACCGTNATACNAACNANCTTTTTAANCTTTNTGGCCCCCTNCNTTTTTGGAACCNAANTNCCTT

NGGAGGTGGNNCCNCAAAGGAC

Nicotiana tabacum 26S ribosomal RNA gene, complete sequence:

Query: 95 aaggcnaaagtgaaacnccnntanttttaacnntattntactnattccgtgaatngtnaa 154 ||||| ||||||||| || || ||||||| |||| |||| ||||||||||| | ||Sbjct: 2455 aaggcgaaagtgaaataccactacttttaacgttattttacttattccgtgaatcg-gaa 2513 Query: 155 gcggggcactgcccctatntttggacccaaggctcgctntgcggnccgatcnggncngna 214 |||||||||||||||| | ||||||||||||||| ||| ||| | |||||| || | | |Sbjct: 2514 gcggggcactgcccctctttttggacccaaggcttgct-tgcaggccgatccgggcggaa 2572 Query: 215 nacattgtnangtggggagtatggctggggcggcacatctagtgaaaagatnacccatgc 274 ||||||| | ||||||||| ||||||||||||||||||| || ||||||| || || | Sbjct: 2573 gacattgtcaggtggggagtttggctggggcggcacatct-gttaaaagataacgcaggt 2631 Query: 275 gtcnctaagatgagctcaacctagaacagaattgtcgtgngnnacataagggtaaaagct 334 ||| ||||||||||||||| | ||||||||| | ||||| | ||| |||||||||||||Sbjct: 2632 gtc-ctaagatgagctcaa-cgagaacagaaatctcgtgtggaacagaagggtaaaagct 2689 Query: 335 cgtttcgtttctnatttacagtncgaat 362 ||||| | |||| |||| |||| |||||Sbjct: 2690 cgttt-gattctgatttccagtacgaat 2716

1 2

62

Die hier gewonnenen Ergebnisse zeigen, dass die differentiell exprimierten Gene in Kartoffeln

durch SSH angereichert werden. Dennoch ist die Identifizierung differentieller Genexpression in

hoch komplexen eukaryontischen cDNAs mit SSH/2D-Gelen ohne Klonierung nicht immer möglich.

Das in dem SSHG/D-Produkt am stärksten konzentrierte Fragment wird sich als von der hoch

konzentrierten rRNA stammend erweisen.

3.3 Experiment zur Etablierung der DSC

An zwei Systemen, an einem Lambda-Fragment und an den cDNAs der Solanum, wird das Prinzip

der DSC überprüft.

3.3.1 DSC am Beispiel eines Lambda-Fragments

Die Autoren der DSC berichteten, dass am Beispiel eines Lambda-Fragmentes eine effiziente

Subtraktion durch DSC erzielt worden sei (Luo, 1999). Dabei sollte ein mit dem Tester-Adaptor

versehenes Lambda Fragment durch das gleiche Fragment, das mit dem Driver-Adaptor versehen

wurde, mittels DSC so effizient subtrahiert worden sein, dass im DSC-Produkt kein intakter Tester

mehr vorhanden und die Kontroll-Amplifikation des DSC-Produktes mit dem Tester-Primer

entsprechend negativ verlaufen sei.

Dieser einfache Modellversuch wird originalgetreu wiederholt. Dazu wird zuerst das 564 Bp lange

Lambda Fragment aus einem Gel eluiert, gereinigt und in getrennten Ansätzen durch Ligation und

PCR mit den Driver- und Tester-Adaptoren versehen. 1ng Tester- und 100 ng Driver-Amplikon

werden zusammengeführt und die DSC durchgeführt.

Abb.3-14. DSC am Beispiel eines Lambda-Fragments. 1. DNA-Größenstandards; 2. Tester-

Amplikon; 3. Driver-Amplikon; 4-6. durch PCR amplifizierte Produkte, nach 1-3 Runden DSC.

Im Gegensatz zu der Beschreibung in der Literatur ist dabei jedoch keine effiziente Subtraktion

1 2 3 4 5 6

63

durch DSC festzustellen. Die PCR-Amplifikation des DSC-Produktes mit dem Tester-Primer

verläuft nach der dritten DSC-Runde nach wie vor positiv (Abb.3-14 ).

3.3.2 DSC am Beispiel von Kartoffel-cDNA

Am Beispiel zweier Kartoffel-cDNAs wird das Prinzip der DSC getestet. Ähnlich wie bei dem

Lambda-Fragment ist hierbei keine effiziente Subtraktion durch DSC festzustellen. Das DSC-

Produkt besteht hauptsächlich aus den hoch konzentrierten Hintergrund-Sequenzen.

Abb.3-15. DSC am Beispiel von Kartoffel-cDNA. 1. DNA-Größenstandards; 2. Tester-Amplikon;

3. Driver-Amplikon; 4. DSCG/D-Produkt.

100 ng Gus-cDNA-Amplikon fungiert dabei als Tester, und 10µg Desiree-cDNA-Amplikon als

Driver. Im Gegensatz zu den Tester- und Driver-Amplikons enthält das DSC-Produkt nur wenige

Fragmente (Abb.3-15).

Die Spezifität des DSC-Produkts wird durch Sonthern-Blot kontrolliert:

Abb.3-16. (Un)Spezifität des DSC-Produktes. Das mit Digoxigenin markierte DSCG/D-Produkt

wird hybridisiert mit der: 1. Tester cDNA; 2. Driver cDNA

1 2 3 4

1 2

64

Dieses DSC-Produkt ist jedoch nicht spezifisch für den Tester. Wenn das DSC-Produkt mit

Digoxigenin markiert wird und auf die Driver/Tester cDNA hybridisiert wird, bindet es

gleichermaßen an beiden cDNAs (Abb.3-16).

Aber das Reporter-Target, das Gus-Gen, ist in dem DSC-Produkt nicht mehr aufzufinden, wie die

Hybridisierung des Targets auf dem DSC-Produkt beweist (Abb.3-17).

Abb.3-17. (Un)Sensitivität der Detektion differenzieller Genexpression durch DSC. Dig-Gus

wird hybridisiert mitdem 1. Gus-Fragment; 2. DSCG/D-Produkt.

Das Dig-Gus bindet dabei lediglich auf dem als Kontrolle fungierenden Gus-Fragment, jedoch nicht

auf dem DSCG/D-Produkt. Dies bedeutet, dass das Reporter-Target nicht mehr im DSC-Produkt

vorhanden ist und dass DSC keine sensitive Methode zur Identifizierung differentieller

Genexpression in hoch komplexen Eukaryonten wie Solanum ist.

Dieses DSC-Produkt wird kloniert und einige Klone werden zufällig ausgewählt und sequenziert.

Durch das anschließende Sequenz-Alignment mittels Blastn werden sie als rRNA-Sequenzen

identifiziert.

An einem Lambda-Fragment wird einer der DSC-Versuche aus der Literatur originalgetreu

durchgeführt, dennoch mit anderem Ergebnis. Am Beispiel von cDNAs der Solanum werden nicht

die differentiell exprimierten Gene, sonderen die in den cDNA hoch konzentrierten Sequenzen wie

rRNAs, durch DSC angereichert. Es wird daher bei keinem der beiden getesteten Systeme eine

effiziente Subtraktion durch DSC erzielt.

1 2

65

3.4 Suche nach der Schwachstelle der DSC

Verschiedene Faktoren, darunter die MBN-Aktivität und die Eigenschaften der Adaptoren, werden

überprüft, um herauszufinden, was für den Misserfolg der DSC verantwortlich ist.

3.4.1 Funktionalität der MBN

Es wird ein Experiment durchgeführt, um sicherzustellen, dass die für die DSC angewendete MBN

überhaupt aktiv ist, da sonst keine ssDNA-spezifische Verdauung gewährleistet wäre und somit

keine Subtraktion durch DSC möglich ist.

Abb.3-18. Überprüfung der MBN-Aktivität. 1. DNA-Größenstandards; 2. das denaturierte

Lambda Fragment nach MBN-Behandlung; und 3. das unbehandelte Lambda Fragment .

Der Versuch zeigt, dass das Versagen der DSC nicht auf die fehlende MBN-Aktivität

zurückzuführen ist. Die für die DSC verwendete MBN ist aktiv. Das Enzym ist in der Lage, durch

eine kurzzeitige Einwirkung ein denaturiertes DNA-Fragment vollständig zu degradieren (Abb.3-

18).

3.4.2 Adaptoren der DSC

Die Hypothese, dass die fehlende Fähigkeit zur Subtraktion durch DSC von den 24 Bp-Überhängen

des Testers in den Heterohybriden verursacht wird, wird an einem Modellsystem überprüft. Die

Adaptoren werden dabei als die Ursache für das Versagen der DSC identifiziert.

3.4.2.1 Die Hypothese über die Länge des Tester-Überhanges im Heterohybrid und die

Funktionalität der DSC

1 2 3

66

Auch bei wiederholten Versuchen zeigt sich keine effektive Subtraktion durch DSC. Es wird daher

zur Erklärung des Versagens eine Hypothese aufgestellt:

Schema 3-1: Hypothese über den Zusammenhang der Fähigkeit zur Subtraktion und die

Länge des Tester-Überhanges in Heterohybriden.

Schematisch wird diese Hypothese in Schema 3-1 erklärt: dass der Tester-Überhang in den

Heterohybriden (gleicht hierbei dem Tester-Adaptor) bei der DSC mit 24Bp zu lang für eine

Subtraktion ist. Bei 37oC und 0,05M NaCl können die komplementären Stränge des Tester-

Überhänges aneinander binden, einen Doppelstrang ausbilden, und somit nicht mehr von MBN

ssDNA-spezifisch verdaut werden. Dagegen sollte eine Adaptor-Konstruktion, bei der der Tester-

Überhang in den Heterohybriden so verkürzt ist, dass die komplementären Stränge der Tester-

24 Bp Tester-Überhang in Heterohybriden (DSC) 12 Bp Tester-Überhang in Heterohybriden

Der Tester-Überhang bildet dsDNA Der Tester-Überhang bildet keine dsDNA

Kein Zugang für MBN zugänglich für MBN

PCR mit dem Tester-Primer verläuft positiv

PCR mit dem Tester-Primer verläuft negativ

(Tester)

Keine Subtraktion Effektive Subtraktion

11

67

Überhänge bei 37oC und 0,05M NaCl nicht mehr aneinander binden können, eine effiziente

Subtraktion ermöglichen.

Bei der Einwirkung hoch konzentrierter MBN wird dsDNA, darunter auch das Target, unspezifisch

verdaut. Nur noch der besonders hoch konzentrierte Tester verbleibt mit PCR amplifizierbar.

Dieser verbleibende Rest an DNA entspricht nicht unbedingt dem Target, sondern den am höchsten

konzentrierten Sequenzen im Tester, wie z B den rRNA-Sequenzen in den cDNAs der Kartoffeln.

3.4.2.2 Überprüfung der Hypothese

Am Beispiel des Lambda-Fragmentes wird die oben genannte Hypothese überprüft. Das DSC-

Driver-Amplikon dient erneut als Driver, das DSC-Tester-Amplikon sowie ein neu konstruierter

Tester dienen als Tester. Der neue Tester besteht aus dem 564 Bp Lambda-Fragment sowie je

einem 11 Bp Überhang an seinen beiden Enden. Der Tester-Überhang in den Heterohybriden

beträgt bei dem DSC-Tester 24 Bp, bei dem neuen Tester ist er mit 11 Bp deutlich kürzer.

Abb.3-19. Nur ein verkürzter Tester-Überhang in den Heterohybriden gewährleistet eine

effiziente Subtraktion (Modelversuch zur Überprüfung der Hypothese). 1. und 8. DNA-

Größenstandards; 2-4. durch PCR amplifizierte DSC-Produkte nach 1-3 Runden DSC (Tester-

Überhang in den Heterohybriden 24 Bp); 5-7. durch PCR amplifizierte Subtraktionsprodukte mit

dem neuen Tester, nach 1-3 Runden Substraktion (Tester-Überhang in den Heterohybriden 11 Bp).

Die Ergebnisse des Versuches bestätigen die oben genannte Hypothese. Nach 3-Runden

Hybridisierung und MBN-Behandlung sind alle Sequenzen des neuen Testers subtrahiert, dagegen

bleibt der DSC-Tester nach wie vor durch PCR amplifizierbar (Abb.3-19). Dies, obwohl beide

Tester sich lediglich durch die Länge der Tester-Überhänge in den Heterohybriden unterscheiden,

und ansonsten die gleiche Menge von beiden Testern in gleichen Reaktionsgefäßen in Anwesenheit

1 2 3 4 5 6 7 8

68

des gleichen Drivers zur Subtraktion benutzt werden.

Die Adaptoren erwiesen sich dabei als die fatale Schwäche der DSC. Der Tester-Überhang in den

Heterohybriden (gleicht hierbei dem Tester-Adaptor) bei der DSC ist mit 24Bp zu lang für eine

Subtraktion. Bei 37oC und 0,05M NaCl können die komplementären Stränge des Tester-

Überhänges aneinander binden, einen Doppelstrang ausbilden, und somit nicht mehr von MBN

ssDNA-spezifisch verdaut werden.

3.5 Entwicklung der NSC

Ziel ist es, die DSC so zu korrigieren, dass daraus eine Methode der effizienten Genom-Subtraktion

entsteht.

3.5.1 Neuartige Adaptoren/Primer

Zur Konstruktion der NSC-Adaptoren/Primer werden folgende Kriterien aufgestellt:

1. der Tester-Überhang in den Heterohybriden muss so kurz sein, dass er bei 37oC und 0,05M NaCl,

jene Bedingungen, unter denen die MBN funktioniert, einzelsträngig bleibt und von MBN ssDNA-

spezifisch verdaut werden kann;

2. zugleich müssen die Tester/Driver-Adaptor/Primer lang genug sein, dass die spezifischen PCRs,

u. a. zur Synthese der Amplikons und zur Amplifikation des DSC-Produktes, möglich sind;

3. Die gemeinsamen Sequenzen zwischen den Tester- und Driver-Adaptoren müssen so kurz sein,

dass keine unspezifische PCR, durch Bindung des Tester-Primers an den Driver-Adaptor möglich

ist.

69

Schema 3-2: Adaptoren/Primer der NSC

Schema 3-2 zeigt eine Möglichkeit, wie ein solches System aussehen könnte. Der Tester/Driver-

Adapter/Primer besetzt dabei je einen spezifischen und einen gemeinsamen Teil. Der spezifische

Teil des Tester-Adaptor/Primers gleicht dem Tester-Überhang in den Heterohybriden und ist 11Bp

lang, bleibt bei 37oC und 0,05M NaCl einzelsträngig und kann somit von MBN verdaut werden.

Die gesamte Länge der Adaptoren ist 23bp. Bei dieser Länge ist auch eine spezifische

Amplifikation durch PCR möglich.

Dieses Modell wird in folgenden Adaptoren/Primern realisiert (der unterstrichene Teil ist je nach

der angewendeten Endonuklease variabel:

Tester-Adaptor: 5´-CAGTCAGAGAGCTCTCACA-3´

3´-GAGAGTGTTCGA-5´

Tester-Primer: 5´-CAGTCAGAGAGCTCTCACAAGCT-3´

Tester-Adaptor/Primer Driver-Adaptor/Primer

Adaptor in Heterohybriden

11 Bp 12 Bp 11 Bp 12 Bp

MBN-Behandlung

PCR mit dem Tester-Primer

PCR verläuft negativ;

(Effiziente Subtraktion)

70

Driver-Adaptor: 5´-GACACTCTCACCTCTCACA-3´

3´-GAGAGTGTTCGA-5´

Driver-Primer: 5´-GACACTCTCACCTCTCACAAGCT-3´

3.5.2 Schema der NSC

NSC und DSC unterscheiden sich lediglich durch ihr Adaptoren/Primer.

Schema 3-3: Schema der NSC

Schematisch lässt sich eine Subtraktion durch NSC wie in Schema 3-3 veranschaulichen. Die NSC-

Tester und -Driver werden mit unterschiedlichen Adaptoren versehen. Die Tester- und Driver-

Adaptoren/Primer besetzen je einen spezifischen (11Bp) und einen gemeinsamen Teil (12 Bp). Der

Tester Driver

Hybridisierung

MBN

Erneute Hybridisierung

PCR mit dem Tester-Primer

Target

71

spezifische Teil des Tester-Adaptors in den Heterohybriden bleibt einzelsträngig und wird

anschließend von MBN degradiert. So verwandelt sich Tester in Driver und die Subtraktion erfolgt

mit doppelter exponenzieller Rate. Die Subtraktion erfolgt durch mehrere Hybridisierungsrunden,

ohne erneute Zugabe von Driver zwischen den Runden.

3.5.3 NSC und DSC am Beispiel eines Lambda-Fragments

NSC und DSC werden in parallelen Ansätzen am Beispiel des Lambda-Fragments überprüft.

Abb.3-20. NSC und DSC am Beispiel eines Lambda-Fragments. 1. DNA Größenstandards; 2-4.

die durch PCR amplifizierten DSC-Produkte, nach 1-3 Runden DSC ; 5-7. die durch PCR

amplifizierten NSC-Produkte, nach 1-3 Runden NSC.

Obwohl beide Methoden sich lediglich durch ihre Adaptoren/Primer unterscheiden, wird eine

effiziente Subtraktion lediglich durch NSC erzielt, nicht aber durch DSC (Abb.3-20). Nach 3

Runden NSC wird das Lambda-Tester vollständig subtrahiert, währen es nach 3 Runden DSC noch

durch PCR amplifizierbar ist.

Ein wirksames Subtraktionsverfahren, genannt NSC („negative subtraction chain“, analog zu DSC,

„differential subtraction chain“), wird entwickelt. NSC und DSC unterscheiden sich lediglich

durch ihre Adaptoren/Primer. Der Tester/Driver-Adapter/Primer der NSC is 23bp lang und besetzt

einen spezifischen und einen gemeinsamen Teil. Der spezifische Teil des Tester-Adaptor/Primers

gleicht dem Tester-Überhang in den Heterohybriden und ist 11Bp lang, bleibt bei 37oC und 0,05M

NaCl einzelsträngig und kann von MBN verdaut werden.

1 2 3 4 5 6 7

72

3.6 Kombination von SSH und NSC

Ziel ist es, SSH und NSC so zu kombinieren, dass daraus eine effiziente und sensitive Methode zur

Genom-Subtraktion entsteht.

3.6.1 Das Prinzip der SNH

Durch SSH könnte eine Targetsequenz bis zu 1000-fach angereichert werden, jedoch sind bei hoch

komplexen eukaryontischen cDNAs nach nur einer einzigen Subtraktion immer noch so viele

störende Hintergrundsequenzen im Subtraktionsprodukt zu erwarten, dass die eventuelle Isolierung

des tatsächlichen Targetes schwierig ist und oft auch radioaktives Screening verlangt.

Die NSC erschien als ein sehr elegantes System, aber ihre Sensitivität würde nicht sehr hoch sein,

da die Mung Bean Nuklease, die zur Degradierung der einzelsträngigen Tester-Adapter in

Tester/Driver-Heterohybriden zugegeben wird, auch eine unspezifische Verdauung der dsDNA

verursachen kann. Niedrig konzentriertes Target könnte somit während der Subtraktion „verloren

gehen“.

So entstand die Idee, die beiden Methoden zu kombinieren, zuerst das Target durch SSH

anzureichern, dann den restlichen Hintergrund durch NSC zu eliminieren. Diese Strategie lässt

sich wie folgt mit Hilfe eines Schemas kurz schildern:

Schema 3-4. Genom-Subtraktion durch SNH

T ester D river D riverD river

SSH T /D SSH D /D

D as SSH T /D -Produkt w ird m it dem T ester-A daptor der N SC versehen

D as SSH D /D-Produkt w ird m it dem D river-A daptor der N SC versehen

N SC

T arget

SSH

A daptor-A ustausch

N SC

SN H

73

Der Ablauf der SNH sieht wie folgt aus:

Das Ziel ist es, ein Target, das nur in DNA1 vorhanden ist, aber in DNA2 fehlt, durch Subtraktion

zu identifizieren.

Dazu werden zuerst werden zwei parallele SSH-Reaktion durchgeführt. SSH1/2 benutzt DNA1 als

Tester, DNA2 als Driver. SSH 2/2 verwendet DNA2 als Tester und Driver zugleich. Durch SSH1/2

sollte das Target angereichert und die Anzahl verschiedener Hintergrund-Sequenzen in cDNA1 auf

niedrigem Niveau ausgeglichen werden. Dementsprechend sollte die Anzahl verschiedener

Hintergrund-Sequenzen in DNA2 durch SSH2/2 auf niedrigem Niveau ausgeglichen werden. Wenn

DNA1 und DNA2 nahe verwandt sind, ähneln sich die Hintergrund-Sequenzen in DNA1 und

DNA2. Im Anschluss wird NSC durchgeführt, mit dem SSH1/2-Produkt als Tester und dem SSH2/2-

Produkt als Driver.

Weil SSH und NSC mit unterschiedlichen Adaptor/Primer-Sequenzen arbeiten, erfolgt zwischen

der SSH und der NSC ein Adaptoren-Austausch. Dieser Austausch realisiert sich durch das

Entfernen der SSH-Adaptoren/Primer mittels einer Endonuklease und die erneute Ligation der

NSC-Adaptoren auf die geschnittenen SSH-Produkte.

Normalerweise wird zur Amplifikation der SSH-Produkt eine genestete PCR durchgeführt, jedoch

trägt hauptsächlich die erste PCR mit dem Suppressions-PCR-Effekt zur Anreicherung des Targets

durch SSH bei. Die zweite PCR der SSH dient lediglich dazu, das SSH-Produkt für die weitere

Analyse in ausreichender Menge herzustellen. Auch zur Synthese der Tester/Driver-Amplikons für

NSC muss eine PCR durchgeführt werden. Eine Über-Amplifikation durch PCR führt oft zur

Selektion verschiedener Sequenzen. Aus diesem Grund wird hierbei auf die zweite PCR der SSH

verzichtet.

3.6.2 Strategie I zur Optimierung der SNH: Exonuklease VII anstelle von MBN

Degradation der einzelsträngigen Tester-Überhänge in Heterohybriden, z. B durch MBN, ist

essentiell für eine erfolgreiche SNH. MBN in hoher Konzentration verdaut jedoch auch dsDNA,

darunter natürlich auch das Target. Daher kann die Sensitivität der SNH bei der Detektion

differenzieller Genexpression durch die Anwendung der MBN negativ beeinträchtigt werden.

Um diesen Widerspruch aufzulösen wird versucht, anstelle von MBN Exonuklease 7 für die NSC

zu benutzen. Ähnlich wie die MBN baut Exonuklease 7 ssDNA von beiden Enden her ab. Die

74

Exonuklease VII ist jedochstreng ssDNA-spezifisch und ist auch aktiv in Anwesenheit von EDTA.

Diese Beschaffenheit verspricht eine höhere Sensitivität beim Detektieren differenzieller Gene und

eine Vereinfachung der Handhabung der NSC, indem der Reinigungsschritt zum Entfernen des

EDTAs vor jeder Exonuklease-Behandlung entbehrlich wird.

Die NSC mit Exonuklease VII wird zuerst an einem Lambda-Fragment durchgeführt.

Abb.3-21. NSC mit Exonuklease VII (anstelle von MBN) an einem Lambda-Fragment. 1.

DNA Größenstandards; 2-4. 1.-3. NSC-Produkte, mit Exonuklease VII.

Dabei zeigt sich, dass bei dem Lambda-Fragment eine effiziente Subtraktion auch mit Exonuklease

VII anstellen von MBN erreicht wird(Abb.3-21). Nach 3 Runden NSC mit Exonuklease VII wird

das Lamba-Tester vollständig subtrahiert und daher nicht mehr durch PCR amplifizierbar. Dies

spricht für eine Optimierung der SNH durch Anwendung der Exonuklease VII.

Im weiteren wird überprüft, ob sich durch die Verwendung von ExoVII anstelle von MBN auch bei

den Kartoffel-cDNA erreichen läßt. Dazu wird der gleiche SNH-Versuch, mit dem die Sensitivität

der SNH getestet wird (siehe 3.7.3), durchgeführt, wobei Exonuklease VII anstelle von MBN

verwendet wird (Abb.3-22).

1 2 3 4

75

Abb.3-22. SNH an Kartoffel-cDNAs, mit Exonuklease VII. 1. DNA Größenstandards; 2-5.

Ligationskontrollen der Tester mit 0, 20, 100 oder 500 ppm künstlichem Target; 6-9. Die SSH-

Produkte der Tester mit 20, 100, 500 oder 0 ppm künstlichem Target; 10-12. SNH-Produkt der

Tester mit 20, 100 oder 500 ppm künstlichem Target.

Die SNH mit Exonuklease VII anstelle von MBN wird jedoch bei der Identifizierung differentieller

Genexpression in Kartoffeln als nicht zufriedenstellend erwiesen und daher spricht gegen einer

Optimierung der SNH durch Anwendung der Exonuklease VII. Bei der Kartoffel-cDNA mit dem

100 ppm konzentrierten künstlichen Target ist durch NSC mit Exonuklease VII zwar eine

Subtraktion festzustellen, jedoch enthält das NSC-Produkt außer dem Target noch Fragmente, die

größer als das Target sind und auf dem Gel als ein Schmier über dem Target sichtbar sind. Bei der

Subtraktion mit dem 500 ppm Target ist dies noch deutlicher der Fall, sodass durch NSC aus einem

„sauberen“ SSH-Produkt ein „unsauberes“ NSC-Produkt wird. Über dem Target liegt bei dem

NSC-Produkt ein deutlicher Schmier, obwohl allein durch SSH das Target so stark angereichert

wird und die Hintergrund-Sequenzen so effektiv subtrahiert werden, dass das SSH-Produkt dadurch

ein sauberes, gut definiertes Target-Fragment wird. Daher ist bei 500 ppm Target durch die NSC

mit Exonuklease VII keine Subtraktion festzustellen, stattdessen sogar ein störender Faktor.

Bei dem Lambda-Fragment wird eine effiziente Subtraktion sowohl mit MBN als auch mit

Exonuklease VII erreicht, während bei den Kartoffel-cDNAs eine effiziente Subtraktion lediglich

mit MBN erreicht wird. Eine Erklärung dazu wäre, dass bei der Ligation der NSC-Adaptoren auch

die Bildung des Artefaktes „Adaptor-Hintergrundsequenz-Target-Adaptor“ als Nebenprodrukt

unvermeidbar ist. In diesen Beiprodukten finden sich viele unterschiedliche Sequenzen in relativ

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

76

niedriger Konzentrationen, die zwar während der NSC mit MBN durch MBN verdaut werden und

daher die Subtraktion nicht stören, aber während der NSC mit Exonuklease VII nicht effizient

subtrahiert werden können und damit erhebliche Hintergrundprobleme im SNH-Produkt

verursachen. Bei der NSC mit dem Lambda-Fragment ist kein entsprechender Hintergrund

aufgetaucht, da der NSC-Tester als DNA-Bande aus einem Gel eluiert wird und daher kein oder

sehr wenig von jenen ungewollten Beiprodukten in die Hybridisierung übergeführt wird.

3.6.3 Strategie II zur Optimierung der SNH: SNH ohne Adaptor-Austausch

Es werden Versuche durchgeführt, um neue Adaptoren zu konstruieren, die zugleich für SSH und

NSC verwendet werden können,und mit denen der umständliche Adaptoren-Austausch überflüssig

gemacht werden kann. Schmatisch lässt die Idee hinter den Versuchen so darstellen:

Schema 3-5: Skizze zur SNH ohne Adaptor-Austausch

Theoretisch gibt es dazu folgende Konstruktion: die Adaptoren P1T und P2T für den SNH-Tester,

sowie die Adaptoren P1D und P2D für den SNH-Driver. P1 und P2 stehen dabei für Primer1 und

Primer2, die Primer für die erste PCR der SSH. T und D stehen für die Tester- und Driver-Primer

der NSC. Die Tm von P1 und P2 sind höher als die von T und D, aber viel nieriger als die der

DNA1P1T DNA1P2T DNA2P1D DNA2P1DAdaptor-Ligation

1. Hybridisierung + DNA2 + DNA2 + DNA2 + DNA2

+ DNA2 + DNA22. Hybridisierung

1. PCR der SSH SSH1/2P1P2 SSH2/2P1P2

PCR zur Synthese der NSC-Amplikons

SSH1/2TSSH2/2D

NSC (SSH1/2T) / (SSH2/2D)NSC-Subtraktion

SNH

77

Adaptoren.

Die Idee ist es, zuerst den Tester der SNH mit den beiden SSH-Tester-Adaptoren und den Driver

mit den beiden SSH-Driver-Adaptoren zu versehen. Angenommen, dass die erste PCR der SSH mit

P1 und P2 dem Suppressions-PCR-Effekt unterliegt, woraufhin die Struktur der Adaptoren deutet,

kann dabei das Target angereichert werden und die Anzahl der Hintergrund-Sequenzen

ausgeglichen werden. Das SSHT/D-Produkt enthält die Sequenz des Primers T, und das SSHD/D-

Produkt die Sequenz des Primers D. Die Synthese der Tester- und Driver-Amplikons für NSC

können wie gewöhnlich durch PCR mit den Primer T und D erfolgen. Dadurch wird der Adaptor-

Austausch übersprungen, wobei die Handhabung der SNH erheblich vereinfacht und die Quelle für

Fehler verringert würde.

Zu obengenanntem Zwerk werden Adaptoren und Primers bestellt und der erwartete Suppressions-

PCR-Effekt wird durch PCR überprüft:

Abb.3-23. die in 2.6.3 konstruierten Adaptoren/primer erzeugen keinen Suppressions-PCR-

Effekt. 1. DNA-Größenstandards; 2-8. PCR-Produkte, die mit folgenden Template und Primern

erzeugt werden:

PCR-Produkt Primer Template2 P1, P2 H2O3 P1 Gus-cDNA, mit P1T versehen4 P2 Gus-cDNA, mit P2T versehen5 P1, P2 Gus-cDNA, mit P1T und P2T versehen6 P1 Desiree-cDNA, mit P1D versehen7 P2 Desiree-cDNA, mit P2D versehen8 P1, P2 Desiree-cDNA, mit P1D und P2D versehen

Leider erzeugen die im Laufe der Arbeit konstruierten Adaptoren/Primer nicht wie gewünscht den

Suppressions-PCR-Effekt. Die PCR mit P1 oder P2 als Primer, und den cDNAs als Template, die

1 2 3 4 5 6 7 8

78

mit nur einem der Adaptoren versehen werden, verlaufen positiv. Die in dieser Arbeit entwickelte

Methode bleibt also auf den Austausch der Adaptoren angewiesen.

Auch wenn die in dieser Arbeit getesteten Adaptoren, die die Sequenzen für SSH- und NSC-

Adaptoren zugleich tragen und mit denen der umständliche Adaptor-Austausch überflüssig gemacht

werden sollte, nicht zufriedenstellend sind, erscheint es doch möglich, die SNH basierend auf

diesem Prinzip zu optimieren. Theoretisch kann man dazu folgende Adaptoren konstruieren:

für den Tester: P1M1T und P2M2T

für den Driver: P1M1D und P2M2D

M1 und M2 stehen dabei für kurze, GC-reiche Sequenzen, die zu einem starken Suppressionseffekt

beitragen sollten. Die Kriterien zur Konstruktion der anderen (Teil-) Sequenzen und das Prinzip

einer SNH ohne Adaptor-Austausch sind wie beschrieben.

Weil die herkömmlichen Verfahren nur Primer/Adaptor-Sequenzen bis zu 50 Basen zuverlässig

herstellen können, ist die Länge der M1 und M2 nicht unbegrenzt, daher die Herausforderung dabei

ist: M1 und M2 so kurz wie möglich zu gestalten, damit es keine Schwierigkeiten bei der

Adaptoren-Synthethese gibt, und zugleich die Tm der Sequenzen so hoch wie möglich halten, damit

der Suppressions-PCR-Effekt gewährleistet wird. Dazu sind umfangreiche experimentelle Arbeiten

nötig.

SSH und NSC werden zu einem effizienten und sensitiven Genom-Subtraktionssystem, genannt SNH

(subtraktive, negative Hybridisierung), kombiniert. Die Analyse differenzieller Genexpression für

hoch komplexe Eukaryonten durch SNH erfolgt zuerst durch die Anreicherung des Targets durch

SSH, dann die Eliminierung des restlichen Hintergrunds durch NSC zu eliminieren.

3.7 SNH am Beispiel von Kartoffel-cDNA

Am Beispiel von Kartoffel-cDNA wird das Prinzip und die Sensitivität und Effektivität der SNH

überprüft.

3.7.1 SNH am Beispiel von Kartoffel-cDNA

79

SNH mit 5 U MBN pro Reaktion wird am Beispiel von Kartoffeln-cDNA durchgeführt.

Abb.3-24. SNH am Beispiel von Kartoffel-cDNA. 1. DNA-Größenstandards; 2. Tester; 3. Driver;

4. SSHG/D -Produkt ; 5. SSHD/D-Produkt; 6-8. NSCG/D-Produkt nach 1-3 Runden Subtraktion.

Es werden sowohl in dem SSHG/D-Produkt als auch in dem SSHD/D-Produkt einige Fragment

gegenüber dem Hintergrund stärker angereichert. Die SNG/D-Produkte erscheinen als einige klar

definierte DNA-Fragmente auf dem Gel, die nicht ganz den stärksten Banden in den SNG/D-

Produkte entsprechen(Abb.3-24). Dies beweist eine selektive Subtraktion durch NSC.

Die Spezifität der SNH-Produkt wird durch Southern Blot kontrolliert:

Abb.3-25. Das SNHG/D-Produkt ist spezifisch für das Tester. Das mit Digoxigenin markierte

SNG/D -Produkt wird hybridisiert mit: 1. dem Tester, Gus-cDNA; 2. dem Driver, Desiree-cDNA.

Wenn diese SNH-Produkte mit Digoxigenin markiert und auf die cDNA von Tester und Driver

hybridisiert werden, binden sie nur an die Tester-cDNA (Abb.3-25). Dies besagt, dass das SNH-

Produkt spezifisch für den Tester ist. SNH erweist sich daher als ein effizientes Genom-

Subtraktion-System für hoch komplexe eukaryontische cDNA.

1 2 3 4 5 6 7 8

1 2

80

Dieses SNHG/D-Produkt wird mit Hilfe des „Topo4-TA cloning Kit for sequencing“ kloniert, daraus

15 Plasmid-Präperationen angefertigt und diese sequenziert.

A Arabidopsis thaliana xyloglucan endo-

transglycosylase-like protein

4 Sequenzen

B Arabidopsis thaliana, serine/threonine

kinase

2 Sequenzen

C Arabidopsis thaliana unknown protein

(At5g13260) mRNA

4 Sequenzen

D1 Andere unbekannten Proteine 2 SequenzenD2 pflanzliche DNA 3 Sequenzen

Tabelle 3-1. Die Identität der SNHG/D-Produkte

Nach anschließendem Sequenzenalignment mit Blastn werden 12 Sequenzen von SNHG/D-Produkte

als für (hauptsächlich pflanzliche) Proteine codierend identifiziert (siehe Anhang). Auch dies

spricht dafür, dass die SNH eine effiziente Genom-Subtraktionsmethode ist, weil sonst viel mehr

Hintergrundsequenzen wie rRNA-Sequenzen in den Produkten bei einer erfolglosen Subtraktion zu

erwarten sind.

Die Sensitivität der SNH zur Identifizierung differentieller Genexpression wird auch durch

Southern Blot kontrolliert:

Abb.3-26. SNH (mit 5 U MBN pro Reaktion) zeigt niedrige Sensitivität bei der Detektion

differenzieller Genexpression. Das mit Digoxigenin markierte Reporter-Target (Dig-Gus-v) wird

hybridisiert mit: 1. geschnittene Gus-cDNA; 2. SSHG/D-Produkt; 3-5. NSCG/D-Produkte nach 1-3

Runden Subtraktion.

Das Reporter-Target Gus-Gen, das mit einer Stärke von 1-15 Kopien pro Zelle exprimiert wird, ist

jedoch schon nach der 1. NSC vollständig von MBN degradiert und wird daher nicht mehr durch

1 2 3 4 5

81

Southern-Blot detektiert (Abb.3-26). Dies besagt, dass die SNH mit 5 U MBN nicht sensitive genug

ist, um die differentiell exprimierten Gene der niedrigsten Konzentrationsklasse wie Gus zu

identifizieren, was auch bei der Anwendung hoch konzentrierter MBN zu erwarten ist.

3.7.2 Die Optimale MBN-Menge für SNH

Die effiziente Verdauung der ssDNA durch MBN ist essentiell für die Funktionalität der NSC,

jedoch verdaut MBN in großen Mengen dsDNA auch unspezifisch. Zu geringe MBN-

Konzentrationen könnten daher zu uneffizienter Subtraktion führen, zu hohe Konzentrationen

dagegen zur unspezifischen Verdauung der niedrig konzentrierten Target-Sequenzen. Dies würde

eine Verminderung der Sensitivität dieser Methode bei der Detektion differenzieller DNA-

Fragmente bedeuten.

Gesucht wird daher die optimale MBN-Konzentration, bei der eine effiziente Subtraktion möglich

ist, zugleich jedoch wenig dsDNA durch MBN unspezifisch verdaut wird, und somit die Sensitivität

der Detektion und die Effektivität der Subtraktion bei der NSC optimal sind.

Dazu wird SNH mit unterschiedlichen MBN-Konzentrationen durchgeführt und anschließend die

Sensitivität der Detektion und die Effektivität der Subtraktion der NSC in Abhängigkeit von den

angewendeten MBN-Mengen überprüft.

Die Sensitivität der Detektion differentiell exprimierter Gene und die Effektivität der Subtraktion

allgemeiner Sequenzen durch SNH ist optimierbar bezüglich der Menge der angewendeten MBN.

Die optimale Menge der MBN hängt von der Natur der jeweiligen Fragstellung ab, z. B. ob dabei

hoch oder eher niedrig konzentrierte Sequenzen gesucht werden: bei den Kartoffel-cDNAs stammt

das SNH-Produkt bei 5 Enzymeinheiten pro Reaktion vollständig aus den differentiell exprimierten

Genen; bei 0,5 Enzymeinheiten pro Reaktion entsprechen hingegen nur 70-80% der SNH-Produkte

der differentiellen Expression; bei noch niedrigerer MBN-Einwirkung (0,05 Enzymeinheiten pro

Reaktion) wird die Subtraktion kaum wahrnehmbar; bei deutlich mehr als 5 Enzymeinheiten pro

Reaktion werden dagegen alle Tester-Sequenzen während der NSC degradiert.

SNH mit unterschiedlichen MBN-Konzentration

SNG/D wird mit 0,05, 0,5 und 5U MBN pro NSC-Runde an Kartoffel-cDNA durchgeführt.

82

Abb.3-27. SNH-Produkt mit unterschiedlichen MBN-Mengen. 1. DNA Größenstandards; 2-4.

SNHG/D-Produkte, nach 1-3 Runden NSC.

Bei niedriger MBN Einwirkung verstärkt sich der Hintergrund des SNH-Produktes (Abb.3-27).

Dies könnte darauf hinweisen, dass die angewendete MBN-Menge Einfluss auf die Sensitivität und

Spezifität der Subtraktion hat.

Effektivität der Subtraktion und die angewendete MBN-Konzentration

Der Zusammenhang zwischen der Effektivität der Subtraktion und der angewendete MBN-

Konzentration wird durch Southern Blot kontrolliert:

Abb.3-28. 80% der SNHG/D-Produkte bei 0,5 U MBN pro NSC-Runde erweisen sich als

differentiell exprimierte Sequenzen. A. Die mit Digoxigenin markierte Driver-cDNA wird mit

den klonierten SNH-Produkten hybridisiert. B. Die mit Digoxigenin markierte Tester-cDNA wird

mit den klonierten SNH-Produkten hybridisiert.

Wie erwartet verringert sich die Effektivität der Subtraktion mit abnehmender MBN-Konzentration.

Wenn die mit Digoxigenin markierte SNH-Produkte mit dem Tester/Driver hybridisiert werden,

zeigen sie sich bei 5U MBN als differentiell exprimierte Fragemente (Abb. 3-25). Bei weniger

MBN bindet dagegen ein Teil des SNH-Produkts auch an den Driver. Wenn die mit Digoxigenin

1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

A 5 U B 0,5 U C 0,05 U

A

B

83

markierten Tester/Driver-cDNAs mit dem klonierten SNH-Produkt bei 0,5 U MBN hybridisiert

werden, erweisen sich nur 80% (24/30) der Klone als differentiell exprimierte Sequenzen (binden

nur an dem Tester). Die übrigen 20% (6/30) sind Sequenzen, die sowohl im Tester und als auch im

Driver vorhanden sind (binden auch an dem Driver) (Abb.3-28).

Sensitivität der Detektion und die angewendete MBN-Konzentration

Der Zusammenhang zwischen der Sensitivität der Detektion und der angewendete MBN-

Konzentration wird durch Southern Blot kontrolliert:

Abb.3-29. Die Sensitivität der Detektion durch SNH nimmt mit der Einwirkung von weniger

MBN zu. Das mit Digoxigenin markierte Reporter-Target (Dig-Gus-v) wird hybridisiert mit: 1.

Gus-cDNA, mit Mbo1 geschnitten; 2. SSHG/D-Produkten; 3-5. Die SNH-Produkte nach 1-3 Runden

NSC, mit 5U MBN pro Reaktion; 6-8. Die SNH-Produkte nach 1-3 Runden NSC, mit 0,5 U MBN

pro NSC-Runde; 9-11. Die SNH-Produkte nach 1-3 Runden NSC, mit 0,05 U MBN pro NSC-

Runde.

Wie erwartet nimmt die Sensitivität der Detektion durch SNH mit geringerer MBN-Einwirkung zu.

Bei 5U MBN pro NSC-Runde ist das Reporter-Target (Gus-Gen) schon nach der ersten NSC nicht

mehr auffindbar. Bei 0,5 U MBN findet es sich noch nach der 2. NSC-Runden. Bei nur 0,05 U

MBN gelangt es noch in das endgültige SNH-Produkt.

3.7.3 Die Sensitivität der SNH zur Detektion differenzieller Genexpression

Die Sensitivität der SNH zur Detektion differenzieller Genexpression wird an einem Modelsystem

getestet. Als Driver dient dabei die cDNA von Desiree. Die Tester enthalten die Desiree-cDNA

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

84

sowie 0, 20, 100 oder 500 ppm von dem künstlichen Target. Die dabei angewendete MBN beträgt 5

U pro Behandlung.

Abb.3-30. Die Sensitivität der SNH zur Detektion differenzieller Genexpression (5U MBN).

1.DNA Größenstandards; 2-5. Ligationskontrollen der Tester mit 0, 20, 100 oder 500 ppm

künstlichem Target; 6-9. Die SSH-Produkte des Testers mit 0, 20, 100 oder 500 ppm Target; 10-12.

SNH-Produkt des Testers mit 20, 100 oder 500 ppm Target. cDNA von Kartoffeln dient dabei als

Hintergrund der Subtraktion.

Die SNH zeigt sich dabei als 5-fach sensitiver als SSH, mit einer Sensitivität zur Detektion fremder

Gene von 100 ppm in Solanum. Das SSH-Produkt bei 500 ppm Target sowie die SNH-Produkte

bei 100 und 500 ppm Target werden durch Klonierung und Sequenzierung als identisch mit dem

zugefügten Target identifiziert.Durch SSH allein ist es möglich, das Target in der höchsten

Konzentration (500 ppm) zu identifizieren, bei niedrigeren Mengen (100 ppm, 20 ppm) wird das

Target im SSH-Produkt von den Hintergrund-Sequenzen überdeckt. SNH ist dagegen fähig, das

Target in einer Konzentration von 100 ppm zu detektieren. Auch das Target von 20 ppm wird durch

SNH stark angereichert.

SNH erweist sich dabei als ein effizientes Genom-Subtraktionssystem für hoch komplexe

Eukaryonten. Das SNH-Produkt (mit 5 U MBN ) ist spezifisch im Tester vorhanden und kodiert

verschiedene pflanzliche Proteine. Wie erwartet verringert sich die Effektivität der Subtraktion mit

abnehmender MBN-Konzentration, und zugleich nimmt die Sensitivität der Detektion zu. Die SNH (

mit 5 U MBN) zeigt sich dabei als 5-fach sensitiver als SSH, mit einer Sensitivität zur Detektion

fremder Gene von 100 ppm in Solanum. Diese Steigerung von Sensitivität bezeichnet eine

qualitative Optimierung zur Detektion differenziell exprimierter Gene.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

85

4 Diskussion

4.1 SNH ist ein innovatives, elegantes Genom-Subtraktionssystem

Ein für die Routine geeignetes Genom-Subtraktionssystem (SNH) zur Analyse differenzieller

Genexpression in hoch komplexen Eukaryonten wird im Rahmen dieser Arbeit aufgebaut. Diese

Methode basiert auf der Kombination von SSH, einem bewährtes System zur Genom-Subtraktion

bei Prokaryonten, und NSC, einer aus der patentierten aber nicht praktizierbaren DSC

weiterentwickelten Methode. Dieses Verfahren ist robust, relativ sensitiv, schnell und einfach

durchführbar, kostengünstig und nicht radioaktiv.

Die wichtigsten Neuerungen bei der SNH beziehen sich auf zwei Aspekte: 1. die Entwicklung der

NSC und, 2. die Kombination von SSH und NSC.

Die Entwicklung der NSC

Bei der patentierten DSC scheint es sich um eine elegante Methode zu handeln. Jedoch wird sie

bisher von keinem unabhängigen Forscher bestätigt (Jaccoud , 2001). Auch unsere Versuche, einen

der originalen DSC-Versuche aus der Literatur (mit dem Lambda-Fragment) zu wiederholen, und

mit der DSC die differenziell exprimierten Gene in Eukaryonten zu identifizieren, schlugen fehl

(Absatz 3.3, Abb. 3-14, 15, 16, 17). Es wurde dann eine Hypothese (Schema 3-1) aufgestellt, dass

es sich um ein systemimmanentes Problem handelt und die DSC in der publizierten Form nicht

praktikabel sein könnte. Diese Hypothese, dass der Tester-Überhang in den Heterohybriden bei der

DSC (gleicht hierbei dem Tester-Adaptor)mit 24Bp zu lang für eine Subtraktion ist, wird dann

durch ein einfaches Experiment am Beispiel eines Lambda-Fragments überprüft und bestätigt.

Dazu werden neue Adaptoren/Primer konstruiert, wobei der Tester-Überhang in den

Heterohybriden auf 11Bp verkürzt und so eine effiziente Subtraktion ermöglicht wird (Abb. 3-19).

Nachdem bewiesen wurde, dass die Konstruktion der DSC schon theoretisch nicht funktionsfähig

ist und zu keiner effizienten Subtraktion führen kann und ihre Schwachstelle die Adaptoren/Primer

sind, wird sie entsprechend korrigiert und daraus ein effizientes Subtraktionssystem namens NSC

(Negative Subtraktion Chain) mit innovativen Adaptoren/Primern entwickelt ( Schema 3-2, 3-3).

Der Tester/Driver-Adapter/Primer der NSC ist 23bp lang und besetzt einen spezifischen und einen

86

gemeinsamen Teil. Der spezifische Teil des Tester-Adaptor/Primers gleicht dem Tester-Überhang

in den Heterohybriden und ist 11Bp lang, bleibt bei 37oC und 0,05M NaCl einzelsträngig und kann

von MBN verdaut werden. In parallelen Versuchen am Beispiel eines Lambda-Fragments wird

bewiesen, dass eine effiziente Subtraktion nur mit NSC, aber nicht mit DSC zu erreichen ist

(Abb.3-20).

Bei NSC bleibt der Driver während der Hybridisierung intakt, auch bei jeder Subtraktionsrunde

wird Tester in Driver umgewandelt, daher ist keine erneute Zugabe von Driver zwischen den

Runden nötig, was bei den bekannten Methoden jedoch meistens notwendig ist.

Kombination der SSH und NSC

Durch SSH könnte eine Targetsequenz theoretisch bis zu 1000-fach angereichert werden

(Diatchenko, L., 1993), jedoch sind bei hoch komplexen cDNAs aus Solanum nach nur einer

einzigen Subtraktion immer noch so viele störende Hintergrundsequenzen im Subtraktionsprodukt

vorhanden, dass die eventuelle Isolierung des tatsächlichen Targets schwierig ist. Wie am Beispiel

zweier Kartoffeln gezeigt wird, machen die hoch konzentrierten Hintergrund-Sequenzen, darunter

rRNA Sequenzen, einen großen Teil des SSH-Produktes aus (Absatz 3-2, Abb. 3-10, 11, 12, 13).

Wegen dieses hohen Hintergrundes ist radioaktives Screening zur eventuellen Verifizierung der

„echten“ differentiell exprimierten Sequenzen unentbehrlich. Mit SNH ist es aber möglich, einige

der differenziell exprimierten Gene direkt zu identifizieren.

Die Sensitivität der Subtraktion mittels NSC allein ist begrenzt, da die Mung Bean Nuklease, die

zur Degradierung der einzelsträngigen Tester-Adaptoren in Tester/Driver-Heterohybriden

zugegeben wird, auch eine unspezifische Verdauung der dsDNA verursachen kann. Niedrig

konzentriertes Target könnte somit während der Subtraktion „verloren gehen“.

Aus der Kombination von SSH und NSC geht eine sensitive und effiziente Methode zur Analyse

differenzieller Genexpression in hoch komplexen Eukaryonten hervor. Durch die Kombination von

SSH und NSC wird die Effektivität der Subtraktion im Vergleich zu der SSH gesteigert, und

zugleich die Sensitivität der Detektion im Vergleich zur NSC erhöht. Die Eignung dieser

Kombination zur Subtraktion natürlich vorkommener eukaryontischer cDNAs wird schließlich am

Beispiel von zwei Kartoffel-cDNAs überprüft und bestätigt.

Die Sensitivität der Detektion differenzieller Genexpression mittels SNH und SSH wird anhand der

87

Solanum-cDNA mit einem künstlichen Target in definierten Konzentrationen bestimmt. Die

Sensitivität der Detektion ist dabei mit SNH um das fünffache höher als mit SSH allein (Abb. 3-

30). Mit SSH ist es möglich, ein 500 ppm Target in Kartoffel-cDNA ohne Screening-Verfahren zu

identifizieren, mit SNH hingegen ist das Detektieren eines Targets von 100 ppm erfolgreich. Die

hierbei bestimmte SSH-Sensitivität ist übereinstimmend mit dem Angaben von der Firma Clontech,

die 200 ppm Fremdgene als positive Kontrolle zu ihren SSH-Assays bei Eukaryonten dazu gibt.

Die Genom-Größe der Kartoffel ist größer als die der Menschen, insofern sind die Ergebnisse bei

Kartoffel im Prinzip auf das menschlichen Genom, woran größtes Interesse besteht, übertragbar.

4.2 Bei höheren Eukaryonten ist SNH zur Analyse differenzieller Genexpression gegenüber

den bekannten Methoden zu bevorzugen; sie stellt auch eine gute Alternative zur

Identifizierung genomischer Unterschiede dar

Die wichtigsten Auswahlkriterien einer passenden Methode zur Genom-Subtraktion sind: Die

Komplexität der zu untersuchenden Genome, die Konzentrationen der Zielsequenzen und die

Handhabbarkeit der Analysemethode.

Die Komplexität eines Genoms wird traditionell durch Hybridisierungs-Versuche anhand seines

Verhaltens und der Kinetik während der Hybridisierung bestimmt (Bishop, 1974; Hastie, 1976 ).

Generell wird angenommen, dass die Komplexität eines Genoms proportional zu seiner Größe ist.

Die Genome verschiedener Organismen sind ihrer Größe (siehe Anhang) nach grob in drei Klassen

einzuteilen: Die Genome der Bakterien und die der einfachen Pilze sowie die cDNAs der

komplexeren Pilze mit einer Genom-Größe von 105-6 Bp in der untersten Komplexitätsklasse; die

Genome der komplexeren Pilze und die cDNAs der höheren Organismen in der mittleren Klasse,

wo eine Komplexität von 107-8 Bp herrscht; und die genomischen DNAs von höheren Organismen,

die aus bis zu 109-11 Bp bestehen, wobei die Genome von Tieren nahe der unteren Grenze von 109

Bp liegen.

Die unterschiedlichen Phänotypen von Stämmen gleicher Art sind oft auf ein „single copy“ Gen

zurückzuführen. Eine 4-Basen-Endonuklease verdaut DNA zu Fragmenten mit einer

durchschnittlichen Größe von 256bp. Wenn ein solches Restriktionsfragment aus einem „single

copy“ Gen stammt, besitzt es rein rechnerisch eine Konzentration von ca. 10 ppm bei Bakterien (E.

88

coli), und 0,001 bis 0,1 ppm bei höheren Organismen. Der Anteil eines Fragments in der cDNA

hängt von der Stärke seiner Expression ab, daher können die Konzentrationen verschiedener

cDNA-Sequenzen in höheren Organismen zwischen weniger als 1 und mehr als 1000 ppm

variieren. Die Komplexität der Hintergrundsequenzen bei der Genom-Subtraktion ist im Falle der

cDNAs höherer Organismen jedoch viel höher als die der Bakterien. Daher wird generell

angenommen, dass die Schwierigkeit, eine Genom-Subtraktion zur Völlständigkeit zu führen, in der

Reihefolge von Bakterien-DNA, eukaryontischer cDNA und genomischer eukaryontischer DNA

zunimmt.

Zur Unterscheidung zweier Bakterien-Stämme sind alle die in der Einleitung besprochen Methoden

erfolgsversprechend. Dazu werden oft SSH/2D-Gel, die Finger-Printing Technik mit paralleler

Homo- und Heterohybridisierung, oder RFLP benutzt, denn diese Techniken sind relativ schnell

und einfach durchzuführen.

RFLP enthält einen PCR-Schritt, welcher die Genomkomplexität vereinfacht, aber zugleich das

Spektrum der Fragmente vermindert. Durch eine solche PCR werden auch genomische

Unterschiede erfasst, die lediglich auf eine Punkt-Mutation zurückzuführen sind (Smith, 1997).

Mit der Einführung der Suppressions-PCR ist die SSH/2D-Gel die zurzeit schnellste und

zuverlässigste Methode, mit der ein Target ohne Vorinformation bezüglich seiner Sequenz aus

einem Hintergrund in Bakteriengenomen identifiziert wird. Ein weiterer Subtraktionsschritt durch

NSC ist dazu nicht nötig.

In der mittleren Komplexitätsklasse wurden in dieser Arbeit alle jene Methoden, bei denen eine

manuelle Trennung der mRNA verlangt wird, wegen der hohen Labilität der mRNA nicht

berücksichtigt. Die mRNA wird hier immer zuerst in cDNA umgeschrieben und das dabei

unvermeidliche Verlorengehen bestimmter rarer mRNAs als System-Schwäche akzeptiert, weil es

bisher keine Methode gibt, mit Hilfe derer man alle Unterschiede zwischen zwei mRNAs mit

absoluter Sicherheit erfassen kann.

Die SNH ist zur Identifizierung differenzieller Gene der mittleren Komplexitätsklasse zu

bevorzugen, weil sie den robuststen, schnellsten und kostengünstigsten Weg darstellt, der zu einem

erfolgreichen Detektieren führt. Die Sensitivität der SNH zur direkten Detektion differentieller

Genexpression ist 5-fach höher als die der SSH (Abb. 3-30). Diese 5-fache Steigerung der

Sensitivität durch SNH gegenüber SSH bezeichnet jedoch einen Qualitätssprung: 100 ppm, die

Sensitivität der SNH zur Identifizierung differentieller Genexpression, ist gerade die Konzentration,

89

mit der eine eukaryontische mRNA in der mittleren Konzentrationsklasse zu erwarten ist. Dies

bedeutet, dass mit SSH allein es lediglich möglich ist, die Sequenzen in der höchsten

Konzentrationsklasse zu detektieren, deren Anzahl in eukaryontischen cDNAs jedoch sehr begrenzt

ist. Mit SNH dagegen ist es möglich, auch die Sequenzen der mittleren Klasse zu erfassen, die

einen weitaus größeren Anteil der differentiell exprimierten Gene ausmacht.

2D-Gelauftrennung im Anschluss auf SSH führt zur direkten (ohne Klonierung) Identifizierung

differentieller Fragmente bei den Genomen der Bakterien oder denen der niedrigen Pilze (Harms,

2002), aber SSH/2D-Gel reicht nicht aus, differentielle Genexpression in Solanum sicher zu

identifizieren (Abb. 3-10, 11, 12, 13). Außerdem wird dazu großes manuelles Geschick benötigt,

damit nur die Zielbande aus dem Gel entnommen wird, und trotz des starken Hintergrunds wenig

von den kontaminierenden Nebenbanden in die nachfolgenden Arbeitsschritte eingetragen wird, da

dies später erhebliche Schwierigkeiten bei der Verifizierung des Targets verursachen könnte.

Zur Identifizierung eines differentiell exprimierten Gens der mittleren Komplexitätsklasse halten

sich alle anderen bisher bekannten Techniken in ihrer Brauchbarkeit die Waage. Der Zeitverbrauch

ist bei der SSH mit radioaktiven Screening und bei der SNH ähnlich, zwischen 2 bis 3 Wochen. Mit

der RDA werden drei bis vier Wochen benötigt, und mit der SAGE sogar zwei bis drei Monate. Bei

Chips ist die Vorkenntnis der Sequenzinformation eine Voraussetzung, und bei der SAGE das

Vorhandensein einer Apparatur zur „high-throughput“ Sequenzierung. Bei der RDA bringt der

Adaptor-Austausch intensivere Handhabung mit sich, wodurch sich die Kontaminationsanfälligkeit

stark erhöht.

Zum Detektieren eines niedrig konzentrierten Targets in Organismen der höchsten

Komplexitätsklasse halten sich SSH, SNH und RDA hinsichtlich ihrer Brauchbarkeit in etwa die

Waage. Jedoch gibt es dazu bisher noch keine robuste Methode.

Das Screening mit radioaktiven Proben bei SSH und die anschließende Subtraktion mit NSC bei

SNH bereiten vergleichbare Schwierigkeiten. Bei der SSH müsste die zum Screening nötige

Genbank sehr groß sein, um mit relativ hoher Sicherheit zu dem gesuchten „single copy“ Gen in

einem sehr komplexen Genom zu gelangen. Auch wenn durch die SSH das Target 1000-fach

angereichert wird, macht ein Restriktionsfragment von einem Gen, das im Genom (109 Bp) in

einer einzigen Kopie vorliegt, nur einen Anteil von 100 ppm in dem SSH-Produkt aus. Daher

würden mindestens 46050 [n=ln(1-p)/ln(1-1000*0,1ppm); p=0,99] Klone gebraucht werden, um mit

einer Sicherheit vom 99% das Fragment zumindest einmal in der Genbank zu erhalten. Wenn

90

außerdem beim Screening das ganze Genom als Sonde markiert wird, um auch bei den „single

copy“ Genen spezifische Signale zu bekommen, ist radioaktive Arbeit nötig, was mit höheren

Ansprüchen an die Ausstattung des Arbeitsplatzes einher geht. Zur Unterscheidung von zwei hoch

komplexen genomischen DNAs ist eine Optimierung der SNH für jede Genom-Größe nötig. Eine

Analyse mit der RDA ist auch mit intensiver Handhabung verbunden und außerdem sehr

kontaminationsanfallig.

Die SAGE mit einem Zeitverbrauch von bis zu drei Monaten wird als zu langsam für die Routine

empfunden. Außerdem können dabei die Proben nur nacheinander untersucht werden, nicht aber in

parallelen Versuchen, wie dies bei den auf der Hybridisierung basierenden Methoden der Fall ist.

4.3 Ausblick:

Auch wenn sich die SNH bei Solanum gut bewährt hat, und theoretisch die Ergebnisse aus dieser

Arbeit mit Solanum prinzipiell als übertragbar auf das menschliche Genomen angesehen werden

können, weil das Genom der Kartoffeln eher komplexer als das der Menschen ist, wird erst eine

erfolgreiche Anwendung dieser Methode bei menschlichen (oder menschenähnlichen) Genomen,

denen unser Haupt-Interesse gilt, zu ihrer besseren Akzeptanz bei den auf diesem Gebiet tätigen

Arbeitsgruppen führen.

91

Zusammenfassung

Ein für die Routine geeignetes Genom-Subtraktionssystem zur Analyse differenzieller

Genexpression in hoch komplexen Eukaryonten wird aufgebaut. Dieses Verfahren ist robust, relativ

sensitiv, kostengünstig und nicht radioaktiv. Es stellt eine gute Alternative zu anderen bekannten

Methoden dar. Die Basis für die Methoden-Entwicklung ist SSH und DSC.

Zuerst wird festgestellt, dass die SSH mit 2D-Gel-Auftrennung nicht fähig ist, die differenziell

exprimierten Gene in Kartoffeln zu isolieren. Zwar wird das Reporter-Target durch SSH

angereichert, das in dem SSHG/D-Produkt am stärksten konzentrierte Fragment stammt jedoch nicht

aus einem Target, sondern aus einer hoch konzentrierten Hintergrund-Sequenz.

Es wird dann bewiesen, dass eine Subtraktion durch DSC gar nicht möglich ist. Ferner wird eine

Hypothese über das Nichtfunktionieren der DSC aufgestellt und anschließend wird diese durch ein

Experiment bestätigt: die Tester-Überhänge in den Heterohybriden sind mit 24Bp so lang, dass sie

bei 37 oC und 0,05M NaCl dsDNA bilden, die nicht von MBN ssDNA-spezifisch verdaut werden

kann. Eine effiziente Subtraktion ist aus diesem Grunde unmöglich.

Auf Grund dieser Befunde wird ein effizientes Genom-Subtraktionssystem namens NSC entwickelt,

welches sich durch seine innovativen Adaptoren/Primer von der DSC unterscheidet. Eine effiziente

Subtraktion durch NSC wird am Beispiel eines Lambda-Fragmentes demonstriert.

Anschließend wird dann die Kombination der SSH mit der NSC etabliert, genannt SNH

(subtraktive, negative Hybridisierung), die die Sensitivität der SSH-Detektion und die Effektivität

der NSC-Subtraktion miteinander verbindet. An den Kartoffel-cDNAs wird gezeigt, dass diese

SNH fähig ist, die differenzielle Genexpression in hoch komplexen Eukaryonten erfolgreich zu

untersuchen.

Die Sensitivität der Detektion durch SSH allein wird auf 500 ppm für ein Fremd-Fragment in den

Kartoffel-cDNA-Präparationen beziffert; die der SNH (5 U MBN) hingegen auf 100 ppm. Diese

Steigerung der Sensitivität bedeutet eine Qualitätssteigerung bei der Detektion differenzieller

Genexpression in Eukaryonten, weil die SNH in der Lage ist, die cDNA in der mittleren

Konzentrationsklasse, der die meisten für die Differenzierung verantwortlichen Sequenzen

angehören, direkt (ohne Screening) zu identifizieren.

92

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96

Zitierte Manuals

BD Clontech PCR-Select™ cDNA Subtraction Kit

BD Clontech PCR-Select™ Bacterial Genome Subtraction Kit

BD Clontech PCR-Select™ Differential Screening Kit

BD Clontech Smart PCR cDNA Synthesis Kit

Invitrogen TOPO TA Cloning Kit for Sequencing

97

Anhang 1: Abkürzungsverzeichnis

DTT dithiothreitot

DSC differential subtraction chain

EDTA ethylenediaminetetraaceticacid

EPPS N-[2-hydroxyethyl]piperazine-N'-3-ethanesulfonic-acid

MBN mung bean nuclease

MOPS 3-[N-morpholino]propane-sulfonic acid); (4-morpholinepropanesulfonic acid)

NSC negative subtraction chain

PBS phosphate buffered saline

RDA representation differential analysis

RT Raumtemperatur

SAGE serial analysis of gene expression

SNH subtractive, negative Hybridisierung

SSH suppression subtractive hybridisation

G/D (für Subtraktion) Gus-cDNA als Tester, Desiree-cDNA als Driver

D/D (für Subtraktion) Desiree-cDNA als Tester und Driver zugleich

U Unit

KDa Kilodalton

98

Anhang 2: SNG/D-Produkte

A(Arabidopsis thaliana xyloglucan endo-transglycosylase-likeprotein, MPA24.8 mRNA, 4 Sequenzen)

Sequenz 8ATCACGGGGATAGAGAGACAATATCTGCAATGGAGGGTAATATAGGTTTTCTCAATGCCGAGCTTGCTGTTGTAGCCGACATAGAGAAGAAGAGAGAAGAAAGAGAGAGGAGGAGATTGCGACAACAAAGGAGATAGAGAACAAAAGGTAAGCAGCGCTTCAGGCCCAACTAACTTTTCTTTTTGAATCAGGAAAAAATCTTCCTCCATGTCCGGGGAGTAACGGTGAAGAGAATGATAAGTCTGATAAGGAGAGTGAGGGTGATGAGGAGACTAAGGGTGATGAGGAGTAGTTGTATCT

Arabidopsis thaliana xyloglucan endo-transglycosylase-like protein (MPA24.8) mRNA, Query: 126 caaaggagatagagaacaaa 145 ||||||||||||||||||||Sbjct: 333 caaaggagatagagaacaaa 352

Sequenz 13CAAGCTCAGAATTAACCTCACTAAAGGGACTAGTCCTGCAGGTTTAAACGAATTCGCCCTTCASTCAGAGAGCTCTCACAGATCAAACAATTCSAAAAATATAGAAGTCTAARATGTCAAATAGATACAACTACTCCTCATCACCCTTAGTCTCCTCATCACCCTCACTCTCCTTATCAGACTTATCATTCTCTTCACCGTTACTCCCCGGACATGGAGGAAGATTTTTTCCTGATTCAAAAAGAAAAGTTAGATTGGGCCTGAAGCGCTGCTTACCTTTTGTTCTCTATCTCCTTTGTTGTCGCAATCTCCTCCTCTCTCTTTCTTCTCTCTTCTTCTCTATGTCGGCTACAACAGCAAGCTCGGCATTGMGAAMACCTATATTACCCTCCATTGCAGATATTGTCTCTCTATCCCCGTGATCTGTGAGAGCTCTCT

homology to the Arabidopsis thaliana xyloglucan endo-transglycosylase-likeprotein(MPA24.8) mRNA, complete cds.

Sequenz 14ATCACGGGGATAGAGAGACAATATCTGCAATGGAGGGTAATATAGGTTTTCTCAATGCCGAGCTTGCTGTTGTAGCCGACATAGAGAAGAAGAGAGAAGAAAGAGAGAGGAGGAGATTGCGACAACAAAGGAGATAGAGAACAAAAGGTAAGCAGCGCTTCAGGCCCAACTAACTTTTCTTTTTGAATCAGGAAAAAATCTTCCTCCATGTCCGGGGAGTAACGGTGAAGAGAATGATAAGTCTGATAAGGAGAGTGAGGGTGATGAGGAGACTAAGGGTGATGAGGAGTAGTTGTATCTATTTGACATTTTAGACTTCTATATTTTTGGAATTGTTTG

Arabidopsis thaliana AT5g65730/MPA24_8 mRNA,

Query: 126 caaaggagatagagaacaaa 145 ||||||||||||||||||||Sbjct: 402 caaaggagatagagaacaaa 421

Sequenz 11GGGATAGAGAGACAATATCTGCAATGGAGGGTAATATAGGTTTTCTCAATGCCGAGCTTGCTGTTGTAGCCGACATAGAGAAGAAGAGAGAAGAHAGAGAGAGGAGGAGATTGCGACAACAAAGGAGATAGAGAACAAAAGGTAAGCAGCGCTTCAGGCCCAACTAACTTTTCTTTTTGAATCAGGAAAAAATCTTCCTCCATGTCCGGGGGAGTAACGGGTGAAGAGAATtGATTAAGGYtTGACTAGGAGAKGTGWGGGTGATGAGGAGACTMAGGGTGATGAGGAGTAGTTGTATCTATTTGACATTTTAGACTTCTATATTTTTGGGAATTGTTTGATCTGTGAGAGCTCTCTGACTGAAGGGCGAATTCG

Arabidopsis thaliana xyloglucan endo-transglycosylase-like protein (MPA24.8) mRNA, Query: 120 caaaggagatagagaacaaa 139 ||||||||||||||||||||Sbjct: 333 caaaggagatagagaacaaa 352

99

B(Arabidopsis thaliana, serine/threonine kinase (At1g01540) mRNA,2 Sequenzen.)

Sequenz 9TATGGTATTMMaGTGTTSATTTGGGTTGTAAATTTCMATGDAGAGAGGAGTTATGTGAAATCGCYGTAATGGGAATATTTGGTTATGTTGgACCMCCAATATGcTTGTAaYGCGDATGSTTAATGAGAAGAGTGATATTTATAGGTTTGGAATAATTATbAYGGAGATAATTATTSGGAGAATTCYCCTGATTATGGTAGATMC

Arabidopsis thaliana clone C00102 (h) putative protein serine/threonine kinase (At1g01540) mRNA, Query: 125 gagaagagtgatatttataggtttggaataattatbayggagataat 171 |||||||||||||| ||||| || |||||| | || | |||||||||Sbjct: 1003 gagaagagtgatatctatagcttcggaatactaatcatggagataat 1049

Sequenz 10YGCCAGTGGCATCCAAAGCTGTCCGACTTTGGGCTTGCTAAACTCCTCAATGCAGAGAGGAGTTATGTGACAACTCGTGTAATGGGAACATTTGGTTATGTTGCACCAGAATATGCTTGTACCGGCATGCTTAATGAGAAGAGTGACATTTATAGCTTTGGAATACTTATCATGGAGATAATTACTGGGAGAACTCCTGTTGATTATGGTAGACCAAAAGGCGAGACTAATTTGGTGGAGTGGTTAARAaTGAWGGGTKGGgAATCTkAAA

Arabidopsis thaliana clone C00102 (h) putative protein serine/threonine kinase (At1g01540) mRNA, Query: 55 gagaggagttatgtgacaactcgtgtaatgggaacatttggttatgttgcaccagaatat 114 ||||| ||||||||||| |||||||| |||||||| || |||||||| ||||||||||| Sbjct: 922 gagagcagttatgtgactactcgtgtgatgggaactttcggttatgtagcaccagaatac 981Query: 115 gcttgtaccggcatgcttaatgagaagagtgacatttatagctttggaatacttatcatg 174 ||||| ||||| ||| | || ||||||||||| || |||||||| |||||||| ||||||Sbjct: 982 gcttgcaccggaatgttaaacgagaagagtgatatctatagcttcggaatactaatcatg 1041Query: 175 gagataattactgggagaactcctgttgattat 207 |||||||| ||||| |||| || |||||||||Sbjct: 1042 gagataatcactggaagaaacccggttgattat 1074

C(Arabidopsis thaliana unknown protein (At5g13260) mRNA, 4Sequenzen)

Sequenz 1AAGCTCAGCAATTAACCCTCACTAAAGGGCACTAGTCCTGtCAGGTTTAARCGAATTCGTCCCTTCAGCTCAGAGBAGTCTCTCACAGTACTCAKTGGGAGKAGTGTCCTTCCGSAATTCAGCTATCTCATTTGTTCCATTATKTAGGGTGGSTCAATCTCTTTACGTAGgATGCCTTCCCACAGCCTGTCTGCTTCTATCCCCAGACTTCCTCAGATTCTATCAAACTTCTTTCAACATCAACTGCATCATGCAGTGGTTGGTGACTGTtCCGCTRACGGCCAATCCAGACCTGGAAGCCTCTCTTCTGCAATATCCTCTTCTtMMMAATGCGMTTTGGCTCTCCTCCSAAAAGTATGTAAGCCAAGCCTCCTTGAAAAGAACATCTTCCGATTCCTCTTGCCCCAACTCATATGCATCCATCAACTTGGGGTCAGCAGATGATTTAGGATCTGTGAGAGCTCTCTGACT

Arabidopsis thaliana unknown protein (At5g13260) mRNA, Query: 353 aagtatgtaagccaagcctccttgaaaagaacatc 387 ||||| || ||||||||||||||||| ||||||||Sbjct: 1558 aagtacgtgagccaagcctccttgaagagaacatc 1524

Sequenz 2ATCCTAAATCATCTGCTGACCCCAAGTTGATGGATGCATATGAGTTGGGGCAAGAGGAATCGGAAGATGTTCTTTTCAAGGAGGCTTGGCTTACATACTTTTGGAGGAGAGCCAAAGTGCATTGTGTAGAAGAGGATATTGCAGAAGAGAGGCTTCAGGTCTGGATTGGCCGTAGCGGACAGTCACCAACCACTCATGATGCAGTTGATGTTGAAAGAAGTTTGATAGAACTGAGGAAGC

100

TGGGGAWTGAACAGCAGCTGTGGGAAGCATCTCGTAAAGAGATTGACCAACCTAATAATGGAAAAaTGAGTACTGATTCGGAGGCATCTCCATGATCTGTGAGAGCTCTCTGACTGAAGGGCGAATtCGTTTAAACCTGCAGGACTAGT

Arabidopsis thaliana unknown protein (At5g13260) mRNA, Query: 66 gatgttcttttcaaggaggcttggcttacatacttttggaggagagc 112 |||||||| ||||||||||||||||| || ||||| ||||| |||||Sbjct: 1524 gatgttctcttcaaggaggcttggctcacgtacttctggagaagagc 1570

Sequenz 15AAGCTCAGCAATTAACCCTCACTAAAGGGCACTAGTCCTGtCAGGTTTAARCGAATTCGTCCCTTCAGCTCAGAGBAGTCTCTCACAGTACTCAKTGGGAGKAGTGTCCTTCCGSAATTCAGCTATCTCATTTGTTCCATTATKTAGGGTGGSTCAATCTCTTTACGTAGgATGCCTTCCCACAGCCTGTCTGCTTCTATCCCCAGACTTCCTCAGATTCTATCAAACTTCTTTCAACATCAACTGCATCATGCAGTGGTTGGTGACTGTtCCGCTRACGGCCAATCCAGACCTGGAAGCCTCTCTTCTGCAATATCCTCTTCTtMmMaATGCGMTTTGGCTCTCCTCCSAAAAGTATGTAAGCCAAGCCTCCTTGAAAAGAACATCTTCCGATTCCTCTTGCCCCAACTCATATGCATCCATCAACTTGGGGTCAGCAGATGATTTAGGATCTGTGAGAGCTCTCTGACT

Arabidopsis thaliana unknown protein (At5g13260) mRNA,

Query: 66 gatgttcttttcaaggaggcttggcttacatacttttggaggagagc 112 |||||||| ||||||||||||||||| || ||||| ||||| |||||Sbjct: 1393 gatgttctcttcaaggaggcttggctcacgtacttctggagaagagc 1439

Sequenz 12ATCCTAAATCATCTGCTGACCCCAAGTTGATGGATGCATATGAGTTGGGGCAAGAGGAATCGGAAGATGTTCTTTTCAAGGAGGCTTGGCTTACATACTTTTGGAGGAGAGCCAAAGTGCATTGTGTAGAAGAGGATATTGCAGAAGAGAGGCTTCAGGTCTGGATTGGCCGTAGCGGACAGTCACCAACCACTCATGATGCAGTTGATGTTGAAAGAAGTTTGATAGAACTGAGGAAGCTGGGGAWTGAACAGCAGCTGTGGGAAGCATCTCGTAAAGAGATTGACCAACCTAATAATGGAAAAaTGAGTACTGATTCGGAGGCATCTCCATGATCTGTGAGAGCTCTCTGACTGAAGGGCGAATtCGTTTAAACCTGCAGGACTAGT

Arabidopsis thaliana unknown protein (At5g13260) mRNA, complete cds

Query: 66 gatgttcttttcaaggaggcttggcttacatacttttggaggagagc 112 |||||||| ||||||||||||||||| || ||||| ||||| |||||Sbjct: 1393 gatgttctcttcaaggaggcttggctcacgtacttctggagaagagc 1439

D1 (unbekannte Protein, 2 Sequenzen)

Sequenz 7CAAGCTCAGAATTAACCTCACTAAAGGGACTAGTCCTGCAGGTTTAAACGAATTCGCCCTTCASTCAGAGAGCTCTCACAGATCAAACAATTCSAAAAATATAGAAGTCTAARATGTCAAATAGATACAACTACTCCTCATCACCCTTAGTCTCCTCATCACCCTCACTCTCCTTATCAGACTTATCATTCTCTTCACCGTTACTCCCCGGACATGGAGGAAGATTTTTTCCTGATTCAAAAAGAAAAGTTAGATTGGGCCTGAAGCGCTGCTTACCTTTTGTTCTCTATCTCCTTTGTTGTCGCAATCTCCTCCTCTCTCTTTCTTCTCTCTTCTTCTCTATGTCGGCTACAACAGCAAGCTCGGCATTGMGAAMACCTATATTACCCTCCATTGCAGATATTGTCTCTCTATCCCCGTGATCTGTGAGAGCTCTCT

Atropa belladonna partial mRNA, 3'UTR, clone nh13.4 Query: 1 caagctcagaattaacc-tcactaaagggactagtcctgcaggtttaaacgaattcgccc 59 ||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct: 513 caagctcagaattaaccctcactaaagggactagtcctgcaggtttaaacgaattcgccc 454Query: 60 ttc 62 |||Sbjct: 453 ttc 451

101

Sequenz 3ATCGGAGAGGAATATTGAGAGTATGCTGTCAGTTGAAATGGCTCTAAGAGGATAGCTCCTCAAGGTAGAGGATGCTGTTATTCTTGCATTGGCACAGCATCGGCGCTCAAATGTAGTCCCGCAGTTCTCTGmTCTGTGAGaGGTCTCTGACTGA

Arabidopsis thaliana genomic DNA, chromosome 5, P1 clone:MQM1, Unidentifizierte Protein Query: 63 aggtagaggatgctgttattcttgcattggcacag 97 |||| |||||||||||||| |||||||| ||||||Sbjct: 74644 aggttgaggatgctgttatgcttgcattcgcacag 74678

D2 (pflanzliche DNA, 3 Sequenzen)

Sequenz 4TTCGCCTTCAGTCAGAKAGCTCTKCAGATCAAAACGAATAAATTTATATCKKAGATGCATCTTTTCATAATAATACACCATCCTTCTGAAATTGTGAATACGTCTCTGAATGTGATGCATTTGAAACATTATAATACGAAGTYATTGTAAGTTGAGTAAAYCTGGGAAGTCGCATATBGTAAAATTACCCAGGAATATGGTTATTCACCCAWTGAAAATTACTTTGATAAATAAGATACAAGgTAWTGKCAAACACATC

Arabidopsis thaliana chromosome 1 BAC F6D5 genomic sequence, Query: 29 tcaaaacgaataaatttat 47 |||||||||||||||||||Sbjct: 1643 tcaaaacgaataaatttat 1661

Sequenz 5AAACGAATAAATTTATATCTTAGATGCACCTTTTCATAATAATACACCAKCCTTCTGAAATTGTGAATACGCCTCTGAATGTGATGCATTTGAAACATTATAATACGAAGTCATTGTTAGTTGAGTAAACCTGGGAAGTGCATATGTAARATTACCCAGGACTATGGTCATTCACCCATTAARAATTACTTTTATAAATRAGATATAAGTATGTCAAACACAYTAAACGAAAAATTGAAAGgARAAAATGG

Genomic sequence for Arabidopsis thaliana BAC F27F5 from chromosome I, Query: 7 ataaatttatatcttagatg 26 ||||||||||||||||||||Sbjct: 134258 ataaatttatatcttagatg 134277

Sequenz 6NTCAAACAATTCCAAAAATATAGAAGTCTAAAATGgTCAAATAGATACAACTACTCCTCATCACCCTTAGTCTCCTCATCACCCTYCACTCTCCTTATCAGACTTATCATTCTCTTCACCGTCACTCTYCGGATCATGGAGGAAGATTTTTTtCCTGATTCAAAAAGAAAAGTTAGTTGGGGCTGAAGCGCGCTTACCTTTGgTCYCCATCYCCTTGGTTGGCGCAWYTTCCTCC

Caenorhabditis elegans cosmid C34B7, Query: 158 ttcaaaaagaaaagttagtt 177 ||||||||||||||||||||Sbjct: 3460 ttcaaaaagaaaagttagtt 3479

102

Anhang3: DOGS abbreviated genome size table (Sat Jan 13 16:42:49MET 2001)

-----------------------------------------------------------Organism Genome size-----------------------------------------------------------Amoeba dubia 670,000,000,000Amoeba proteus 290,000,000,000Ophioglossum petiolatum 160,000,000,000Protopterus aethiopicus 139,000,000,000Fritillaria assyriaca 124,900,000,000Lilium longiflorum 90,000,000,000Amphiuma means 84,000,000,000Necturus maculosus 81,300,000,000Pinus resinosa 68,000,000,000Lilium formosanum 36,000,000,000Coscinodiscus asteromphalus 25,000,000,000Triturus cristatus 20,600,000,000Allium cepa 18,000,000,000Schistocerca gregaria 9,300,000,000Paramecium caudatum 8,600,000,000Bufo bufo 6,900,000,000Scyliorhinus stellatus 6,000,000,000Orycteropus afer 5,763,500,000Leuascus cephalus 5,400,000,000Peromyscus eremiticus 5,294,700,000Tarsius syrichta 5,151,600,000Cercopithecus cephus 5,141,700,000Cercopithecus nigroviridis 5,117,100,000Zea mays 5,000,000,000Hordeum vulgare 5,000,000,000Thomomys townsendii 4,934,500,000Cercopithecus neglectus 4,796,300,000Dypodomys ordii monoensis 4,658,200,000Isodon macrourus 4,589,100,000Isodon obesulus 4,554,500,000Cercopithecus aethiops griseoviridis 4,490,400,000Thomomys bottae 4,485,500,000Parameles nasuta 4,426,200,000Macropus robustus 4,396,600,000Parameles gunni 4,357,200,000Cercopithecus nictitans 4,342,400,000Thomomys umbrinus 4,317,700,000Octodon degus 4,263,400,000Nasalis larvatus 4,258,500,000Didelphis azarae azarae 4,238,700,000Dypodomys spectabilis spectabilis 4,214,100,000Tylacomys lagotis 4,209,100,000Dypodomys ordii compactus 4,174,600,000Macropus giganteus 4,154,800,000Lasiorhinus latifrons 4,145,000,000Lutreolina crassicaudata paranasalis 4,140,000,000Galago senegalensis 4,130,200,000Cercopithecus cynosurus 4,130,200,000Monodelphis dimidiata 4,115,400,000Sciurus carolinensis 4,105,500,000Dypodomys spectabilis baileyi 4,105,500,000Cercopithecus aethiops aethiops 4,075,900,000Phascolomis mitchelli 4,071,000,000Dypodomys agilis perplexus 4,066,000,000Pongo pygmaeus 4,046,300,000Potorous tridactilys 4,026,600,000

103

Marmosa pusilla 4,026,600,000Peromyscus maniculatus 4,006,800,000Terrapene carolina 4,000,000,000Marmosa agilis chacoensis 3,977,200,000Cercopithecus sabaeus 3,962,400,000Cebus albifrons 3,927,900,000Peromyscus crinitus 3,922,900,000Galago crass.crassicaudatu 3,922,900,000Gerbillus pyramidum 3,913,100,000Cercopithecus aethiops tantalus 3,898,300,000Galago alleni 3,878,500,000Didelphis marsupialis aurita 3,848,900,000Ctenomys conoveri 3,848,900,000Cebus capucinus 3,829,200,000Ctenomys leucodon 3,824,200,000Nicotiana tabaccum 3,800,000,000Pan troglodytes 3,799,600,000Dypodomys deserti deserti 3,770,000,000Phascolarctus cinereus 3,765,000,000Ornitorhynchus anatinus 3,725,500,000Ctenomys freter 3,715,700,000Ctenomys boliviensis 3,715,700,000Symphalangus syndactylus 3,705,800,000Cercocebus aterrimus 3,705,800,000Cercocebus atys 3,691,000,000Ctenomys steinbachi 3,681,100,000Alouatta caraja 3,676,200,000Lemur mongoz coronatus 3,656,500,000Dypodomys heermani californicus 3,656,500,000Bos taurus 3,651,500,000Cebus apella 3,631,800,000Mesocricetus auratus 3,621,900,000Gerbillus campestris 3,621,900,000Cercopithecus talapoin 3,617,000,000Erinaceus europaeus 3,612,100,000Pongo pygmaeus 3,607,100,000Macaca silenus 3,582,400,000Ellobius fuscocapillus 3,582,400,000Pan troglodytes 3,577,500,000Ateles belzebuth 3,577,500,000Alouatta villosa 3,577,500,000Colobus polykomos 3,562,700,000Sminthopsis crassicaudata 3,557,800,000Dasyurops maculatus 3,557,800,000Cercatetus nanus 3,557,800,000Cercatetus concinnus 3,557,800,000Cricetulus griseus 3,547,900,000Macaca mulatta 3,543,000,000Nycticebus coucang 3,533,100,000Gorilla gorilla 3,523,200,000Ctenomys lewisi 3,513,400,000Macaca nemestrina 3,508,400,000Macaca fuscata 3,508,400,000Tachyglossus aculeatus 3,498,600,000Sarcophilus arrisi 3,498,600,000Lagothrix lagothricha 3,493,600,000Papio hamadryas 3,478,800,000Dypodomys merriami merriami 3,473,900,000Oryctolagus cuniculus 3,469,000,000Erythrocebus patas 3,469,000,000Cercocebus galeritus 3,464,000,000Mus musculus 3,454,200,000Macaca sylvana 3,454,200,000Papio sphinx 3,449,200,000Dypodomys microps 3,439,300,000

104

Cebuella pygmaea 3,439,300,000Hylobates agilis 3,429,500,000Chalomys laucha 3,424,500,000Ateles paniscus 3,424,500,000Macaca arctoides 3,409,700,000Macaca fascicularis 3,404,800,000Homo sapiens 3,400,000,000Macaca nigra 3,399,900,000Dypodomys panamintinus leucogenys 3,399,900,000Cavia porcellus 3,399,900,000Callithrix jacchus 3,385,100,000Macaca maura 3,380,100,000Apodemus sylvaticus 3,360,400,000Canis familiaris 3,355,500,000Cebus nigrivittatus 3,350,500,000Microtus agrestis 3,330,800,000Tupaia glis 3,325,900,000Equus caballus 3,311,000,000Raja montagui 3,300,000,000Hylobates muelleri muelleri 3,296,200,000Muntiacus muntjak muntjak 3,281,400,000Saimiri sciureus 3,251,800,000Perodicticus potto potto 3,251,800,000Ovis aries 3,251,800,000Perodicticus potto edwardsi 3,246,900,000Hapalemur griseus griseus 3,242,000,000Hylobates klossi 3,222,200,000Holochilus vulpinus 3,217,300,000Ateles geoffroy 3,207,400,000Lepilemur mustelinus 3,202,500,000Lama glama 3,202,500,000Hapalemur simus 3,202,500,000Hapalemur gr.occidentalis 3,202,500,000Galago crass.argentatus 3,202,500,000Lama vicugna 3,197,600,000Capra hircus 3,197,600,000Hylobates moloch 3,192,600,000Hylobates lar 3,192,600,000Apodemus flavicollis 3,177,800,000Lama huanacus 3,163,000,000Hapalemur gr.olivaceus 3,138,300,000Clethrionomys rufocans 3,138,300,000Hapalemur gr.alaotrensis 3,133,400,000Ctenomys opimus 3,118,600,000Akodon xantorhinus 3,118,600,000Sus scrofa 3,108,700,000Xenopus laevis 3,100,000,000Rattus rattus 3,093,900,000Lemur macaco rufus 3,084,100,000Muntiacus reevesi 3,074,200,000Microcebus murinus 3,074,200,000Lemur catta 3,069,300,000Apodemus agrari 3,069,300,000Chalomys musculinus 3,059,400,000Lemur mongoz mongoz 3,049,500,000Lemur macaco fulvus 3,049,500,000Chincilla laniger 3,029,800,000Akodon olivaceus 3,010,000,000Ellobius lutescens 2,990,300,000Neotoma floridana 2,955,800,000Microtus montanus 2,955,800,000Ellobius talpinus 2,955,800,000Dypodomys heermani tularensis 2,955,800,000Bolomys obscurus 2,945,900,000Camelus dromedarius 2,926,200,000

105

Rattus norvegicus 2,900,000,000Tadarida brasiliensis 2,896,600,000Akodon molinae 2,876,800,000Chalomys laucha laucha 2,862,000,000Cabreramys sp. 2,847,200,000Clethrionomys rutilus 2,842,300,000Microtus arvalis 2,837,300,000Arvicola terrestris 2,837,300,000Camelus bactrianus 2,817,600,000Meriones unguiculatus 2,807,700,000Phyllotis griseoflavus 2,797,900,000Eligmontia sp. 2,792,900,000Scapteromys aquaticus 2,768,300,000Peromyscus floridanus 2,768,300,000Clethrionomys glereolus 2,768,300,000Oryzomys nigripes flavescens 2,763,300,000Chalomys callosus callosus 2,763,300,000Akodon mollis 2,728,800,000Loligo loligo 2,700,000,000Limulus polyphemus 2,700,000,000Carcarias obscurus 2,700,000,000Microtus ochragaster 2,699,200,000Akodon dolores 2,694,200,000Microtus longicaudatus 2,659,700,000Oxymycteris rufus platensis 2,630,100,000Caiman crocodylus 2,600,000,000Acomys cahirinus 2,585,700,000Microtus subterraneus 2,546,200,000Thomomys talpoides 2,536,300,000Eumops perotis perotis 2,536,300,000Muntiacus muntjak vaginalis 2,521,500,000Microtus oregoni 2,511,700,000Parascaris equorum 2,500,000,000Natrix natrix 2,500,000,000Microtus pennsylvanicus 2,477,100,000Microtus duodecimcostatus 2,477,100,000Microtus oeconomus 2,437,600,000Microtus californicus 2,432,700,000Akodon azarae 2,393,200,000Callicebus cupreus 2,264,900,000Pipistrellus kuhli 2,260,000,000Callicebus torquatus 2,225,500,000Eptesicus fuscus 2,220,500,000Pteropus giganteus 2,186,000,000Barbastella barbastellus 2,171,200,000Thomomys monticola 2,136,600,000Myotis myotis 2,116,900,000Boa constrictor 2,100,000,000Pipistrellus savii 1,973,800,000Rhinolophus ferrumequinum 1,929,400,000Lampreta planeri 1,900,000,000Danio rerio 1,900,000,000Myotis mistacinus 1,899,800,000Rhinolophus hipposideros 1,894,800,000Rhinolophus euryale 1,840,600,000Myotis capaccinii 1,820,800,000Aplysia californica 1,800,000,000Miniopterus schreibensi 1,707,300,000Python reticulatus 1,700,000,000Cyprinus carpio 1,700,000,000Erysiphe cichoracearum 1,500,000,000Cerebratulus 1,400,000,000Spisula solidissima 1,200,000,000Gallus gallus 1,200,000,000Glycine max 1,115,000,000

106

Strongylocentrotus purpuratus 900,000,000Musca domestica 900,000,000Crassostrea virginica 700,000,000Aurelia aurita 700,000,000Lycopersicon esculentum 655,000,000Oryza sativa 400,000,000Medicago truncatula 400,000,000Fugu rubripes 400,000,000Tetraodon nigroviridis 350,000,000Schistosoma mansoni 270,000,000Sarcocystis cruzi 201,000,000Tetrahymena pyriformis 200,000,000Prosimulium multidentatum 200,000,000Ciona intestinalis 200,000,000Chironomus tentans 200,000,000Paramecium aurelia 190,000,000Drosophila melanogaster 180,000,000Chlamydomonas reinhardtii 100,000,000Caenorhabditis elegans 100,000,000Brugia malayi 100,000,000Arabidopsis thaliana 100,000,000Toxoplasma gondii 89,000,000Eimeria tenella 70,000,000Eimeria acervulina 70,000,000Trypanosoma brucei 35,000,000Navicola pelliculosa 35,000,000Dictyostelium discoideum 34,000,000Emericella nidulans 31,000,000Aspergillus nidulans 31,000,000Plasmodium falciparum 25,000,000Plasmodium berghei 25,000,000Entamoeba histolytica 20,000,000Schizosaccharomyces pombe 14,000,000Saccharomyces cerevisiae 12,067,280Giardia lamblia 12,000,000Giardia intestinalis 12,000,000Escherichia coli 4,639,221Mycobacterium tuberculosis 4,397,000Bacillus subtilis 4,170,000Synechocystis sp. strain PCC6803 3,573,470Mycobacterium leprae 2,800,000Haemophilus influenzae 1,830,137Helicobacter pylori 1,667,867Methanococcus jannaschii 1,664,974Borrelia garinii 953,000Borrelia afzelii 948,000Borrelia burgdorferi 946,000Mycoplasma pneumoniae 816,394Mycoplasma genitalium 580,000Human immunodeficiency virus type 1 9,750-----------------------------------------------------------

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Danksagung

Meiner erste Dank gilt Prof. Hildebrandt, für die Überlassung des interessanten Themas, für seinefürsorgliche Leitung und Unterstützung in Form wöchentlicher Gruppensitzungen, produktiverDiskussionen, und für seine teils nächtigen oder an Wochenenden bezüglich meiner Promotiongeleisteten Arbeiten.

Ein von Dr. Techel beantragtes BMBF-Stipendium machte meinen wissenschaftlichen Aufenthalt inDeutschland finanziell überhaupt erst möglich. Ich danke ihm auch für die meisten produktivenwissenschaftlichen Diskussionen und für die sprachliche Unterstützung, durch die dieseDoktorarbeit besser lesbar wird.

Ich danke Prof. Beyersmann für die sehr schnelle Fertigstellung eines Gutachtens zu dieser Arbeit.

Dr. Heyer vom Max-Plank-Institut für molekulare Pflanzenphysiologie in Golm danke ich für dieÜberlassung der transgenen Solanum als Testmodell.

Allen Kollegen in der AG Hildebrandt danke ich für die lockere Atmosphäre, für allewissenschaftlichen, technischen oder sprachlichen Unterstützungen.

Documents

Entwicklung einer auf subtraktiver Hybridisierung ...elib.suub.uni-bremen.de/diss/docs/E-Diss1043_li.pdf · DNA wurde hierbei in einem Phenol-haltigen Puffer durchgeführt. Das Phenol