Diplomarbeit

Charakterisierung der Rolle des Enzyms

Dimethylglycindehydrogenase im Sarkosinmetabolismus

von humanen Prostatakarzinomzellen

eingereicht von

Michael Haider

zur Erlangung des akademischen Grades

Doktor der gesamten Heilkunde

(Dr. med. univ.)

an der

Medizinischen Universität Graz

ausgeführt am

Institut für Pathophysiologie und Immunologie

unter der Anleitung von

Univ.-Ass. Mag. Dr.scient.med. Robert Fuchs Univ.-Prof.Dr.phil. Anton Sadjak

Graz, am 02.11.2017

i

Eidesstattliche Erklärung

Ich erkläre ehrenwörtlich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und ohne fremde

Hilfe verfasst habe, andere als die angegebenen Quellen nicht verwendet habe und die den

benutzten Quellen wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen als solche kenntlich

gemacht habe.

Graz, am 02.11.2017 Michael Haider, eh

ii

Danksagungen

Ich möchte mich bei meinen beiden Betreuern Prof. Anton Sadjak und Dr. Robert Fuchs

recht herzlich bedanken. Besonders Dr. Robert Fuchs stand mir immer mit guten Tipps zur

Seite und zeigte außerordentliche Geduld mit mir. Außerdem ist er während des Verfassens

dieser Arbeit Vater geworden, weshalb ich Ihm und seiner Familie auch auf diesem Wege

alles Gute für die Zukunft wünschen möchte!

Auch bei Peter Augustin möchte ich mich für seine außerordentliche Hilfe bedanken.

Weiters möchte ich mich herzlich bei all jenen, die mich bei dieser Arbeit unterstützt haben,

für die Geduld und die Hilfestellung bedanken. Dazu zählen Anika Stracke, Nathalie Allard

und Andreas Meinitzer. Außerdem gebührt mein Dank auch Peter Macheroux und Beate

Rinner.

Meinen Eltern danke ich dafür, dass sie mir dieses Studium ermöglicht, und mich bei allen

Unternehmungen unterstützt haben.

Auch meinen Großeltern möchte ich auf diesem Weg meinen Dank aussprechen, da sie mich

stets unterstützt und gefördert haben.

Bei meiner Freundin Stephanie möchte ich mich ebenfalls für die aufgebrachte Geduld

bedanken.

Zuletzt sei noch meinen Studienkollegen und Freunden gedankt, die mir während des

Studiums viele unvergessliche Momente schenkten.

Diese Diplomarbeit wurde durch eine Forschungssubvention der Stadt Graz unterstützt.

iii

Zusammenfassung

Hintergrund: Im Jahr 2009 wurde Sarkosin als potenziell neuer Tumormarker für

Prostatakrebs entdeckt. Sarkosin wurde mit der Aggressivität von Prostatakarzinomen (PCa)

in Verbindung gebracht. Weiters scheint Sarkosin im Tumormetabolismus bzw. in der

Kanzerogenese involviert zu sein. Das Enzym Dimethylglycindehydrogenase (DMGDH)

spielt eine entscheidende Rolle im Cholin-Metabolismus durch die Demethylierung von

Dimethylglycin zu Sarkosin. Dennoch ist bislang nur sehr wenig über eine Rolle des Enzyms

im Zusammenhang mit dem PCa bekannt. Ziel dieser in vitro Studie ist es deshalb, den

Einfluss der DMGDH auf die Sarkosinsynthese, Zellmigration und Zellproliferation der

PCa-Zelllinien DU-145, PC-3 und LNCaP zu evaluieren.

Methoden: Die Expression der DMGDH in humanen PCa Zelllinien mit und ohne

Androgenstimulation wurde auf mRNA und Proteinebene mittels qPCR (Taqman® qPCR)

bzw. mit Immunfluoreszenz und Western Blotting analysiert. Um den Einfluss der DMGDH

auf Sarkosinsynthese, Zellmigration und Zellproliferation analysieren zu können, wurde ein

Silencing des Enzyms mittels ShRNA System mit lentiviralem Vektor durchgeführt. Die

Messung der intrazellulären Sarkosinkonzentration wurde mittels HPLC realisiert. Um das

Proliferations- bzw. Migrationsverhalten beurteilen zu können wurden WST-1®

Proliferationsassays bzw. Wound healing Assays verwendet.

Ergebnisse: Auf mRNA-Ebene konnte sehr schwache Expression der DMGDH in allen drei

getesteten PCa-Zelllinien nachgewiesen werden ohne Sensitivität auf Androgenstimulation.

Die mRNA-Expression der DMGDH konnte durch das sHRNA-Silencing erfolgreich

verringert werden. Der Proteinnachweis des Enzyms in den PCa-Zelllinien lieferte jedoch

ein inkonklusives Ergebnis, da die Immunfluoreszenz-Assays zwar Expression der DMGDH

suggerierten, jedoch die Western Blotting Experimente keine spezifischen DMGDH-Signale

erbrachten. Weiters konnte kein Effekt durch das Silencing der DMGDH hinsichtlich

Zellproliferation, Zellmigration und intrazellulärer Sarkosinkonzentration in DU-145 Zellen

beobachtet werden.

Schlußfolgerung: Unsere Daten legen nahe, dass das Enzym DMGDH nur eine

untergeordnete Rolle im Sarkosinmetabolismus in humanen PCa-Zellen zu spielen scheint.

iv

Abstract

Background: In 2009 sarcosine was identified as a new potential biomarker for prostate

cancer (PCa) and found to be associated with its aggressiveness. Since then the metabolism

of sarcosine was investigated in the light of cancerogenesis of PCa. Even though the enzyme

dimethylglycine dehydrogenase (DMGDH) plays a major role in the choline degradation

pathway its possible role in the genesis of PCa which is sparsely defined as yet. Therefore,

the aim of our study is to assess the impact of DMGDH on sarcosine synthesis and in-vitro

growth and migration behavior of human PCa-cell lines DU-145, PC-3 and LNCaP.

Methods: First of all, the expression of DMGDH was assessed at mRNA and protein level

by means of qPCR, respectively immunofluorescence assays and western blotting. In order

to assess the role of DMGDH on sarcosine metabolism in human PCa-cell lines, expression

of the enzyme was silenced using a ShRNA approach by means of a lentiviral system.

Measurement of intracellular sarcosine concentration was done by means of HPLC.

Proliferation of DMGDHSh-clones was analyzed by means of the proliferation dye WST-

1®. The migration behavior of DMGDHSh-clones was tested in wound healing assays.

Results: qPCR experiments showed weak expression of DMGDH at mRNA level in all three

tested cell linesthat was not influenced by androgens. Immunofluorescence assays further

suggested expression of the enzyme. However, in western blotting assays we were not able

to confirm expression of the enzyme at protein level. Furthermore, we successfully

established stable DMGDH knockdown-clones. Silencing of DMGDH did not affect

intracellular sarcosine concentration, cell proliferation and cell migration in DU-145 cells.

Conclusion: Our results suggest that the enzyme DMGDH only plays a minor role in

sarcosine metabolism of human PCa-cell lines.

v

Inhaltsverzeichnis

Danksagungen ----------------------------------------------------------------------------------------------- ii

Zusammenfassung ----------------------------------------------------------------------------------------- iii

Abstract ------------------------------------------------------------------------------------------------------ iv

Inhaltsverzeichnis ------------------------------------------------------------------------------------------- v

Abbildungsverzeichnis------------------------------------------------------------------------------------- vii

Tabellenverzeichnis --------------------------------------------------------------------------------------- viii

1 Einleitung ---------------------------------------------------------------------------------------------- 1 1.1 Prostatakarzinom --------------------------------------------------------------------------------------------- 1

1.1.1 Epidemiologie ---------------------------------------------------------------------------------------------- 1 1.1.2 Molekularpathologie ------------------------------------------------------------------------------------- 1 1.1.3 Klinik --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 2 1.1.4 Diagnostik -------------------------------------------------------------------------------------------------- 3 1.1.5 Therapie ----------------------------------------------------------------------------------------------------- 4 1.1.6 Sarkosin – ein neuer Marker für die Diagnose von Prostatakrebs? ---------------------------- 6

1.2 Dimethylglycindehydrogenase und andere Enzyme im Sarkosinmetabolismus --------------- 8 1.3 Hypothese ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 10 1.4 Ziele ------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 10

1.4.1 PC-3 -------------------------------------------------------------------------------------------------------- 11 1.4.2 DU-145 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 11 1.4.3 LNCaP ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 11

2 Material und Methoden --------------------------------------------------------------------------- 12 2.1 Kultivierung der humanen Prostatakrebszellen ----------------------------------------------------- 12 2.2 Transfektion der PCa-Zellen mittels lentiviralem Vektor ------------------------------------------ 12 2.3 Immunfluoreszenznachweis von DMGDH ------------------------------------------------------------ 13

2.3.1 Herstellung der Slides und Färbung ----------------------------------------------------------------- 13 2.4 Western Blot ------------------------------------------------------------------------------------------------- 14

2.4.1 Probenvorbereitung ------------------------------------------------------------------------------------ 14 2.4.2 SDS-PAGE und Blotting-Prozedur -------------------------------------------------------------------- 15

2.5 qPCR ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 16 2.5.1 RNA – Isolierung ----------------------------------------------------------------------------------------- 16 2.5.2 Umschreiben der mRNA in cDNA -------------------------------------------------------------------- 17 2.5.3 Quantifizierung der Expression Sarkosin-metabolisierender Enzyme mittels qPCR. ----- 18

2.6 Analyse der Expression Sarkosin metabolisierender Enzyme in Abhängigkeit von Androgenstimulation ------------------------------------------------------------------------------------------------- 19 2.7 Mitochondrienfärbung mittels MitoRed® ------------------------------------------------------------ 20 2.8 Messung der Zellproliferation mit WST-1-Assay ---------------------------------------------------- 20 2.9 Messung der Zellmigration mit Wound-healing Assay --------------------------------------------- 21 2.10 Messung der intrazellulären Sarkosinkonzentration mit HPLC ---------------------------------- 23 2.11 Statistische Verfahren ------------------------------------------------------------------------------------- 23

3 Ergebnisse ------------------------------------------------------------------------------------------- 24 3.1 DMGDH wird in den Zelllinien LNCaP, PC-3 und DU-145 exprimiert --------------------------- 24 3.2 Erfolgreiches Silencing der DMGDH-Expression in PCa-Zellen ----------------------------------- 26 3.3 Ergebnisse der Messung der Expression von SARDH und GNMT nach Silencing der DMGDH------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 29 3.4 Ergebnisse der Messung der Expression Sarkosin metabolisierender Enzyme nach Androgenstimulation ------------------------------------------------------------------------------------------------- 30

vi

3.5 Visualisierung der Mitochondrien mittels MitoRed® in DU-145 DMGDHsH-Klonen -------- 31 3.6 Das Silencing der DMGDH hat keinen Einfluss auf die Zellproliferation ----------------------- 32 3.7 Das Silencing der DMGDH beeinflusst das Migrationsverhalten der PCa-Zellen nicht ----- 33 3.8 Messung der Sarkosinkonzentration nach DMGDH Knockdown -------------------------------- 35

4 Diskussion -------------------------------------------------------------------------------------------- 37

5 Literaturverzeichnis -------------------------------------------------------------------------------- 42

Anhang - Lösungen --------------------------------------------------------------------------------------- 48

Anhang – ISC Poster -------------------------------------------------------------------------------------- 50

vii

Abbildungsverzeichnis ABBILDUNG 1: ENZYME IM CHOLINSTOFFWECHSEL ...................................................................................... 8 ABBILDUNG 2: SCHEMATISCHE DARSTELLUNG DES IBIDI®-SYSTEMS ........................................................... 22 ABBILDUNG 3: QUANTIFIZIERUNG DER DMGDH-EXPRESSION IN PCA-ZELLLINIEN ....................................... 24 ABBILDUNG 4: NACHWEIS DER DMGDH-EXPRESSION IN HUMANEN PCA-ZELLLINIEN MITTELS INDIREKTER

IMMUNFLUORESZENZ ........................................................................................................................ 25 ABBILDUNG 5: VERSUCH DES NACHWEISES DER DMGDH IN DU-145 UND LNCAP WILDTYPZELLEN MITTELS

WESTERN-BLOTTING ASSAY ............................................................................................................... 26 ABBILDUNG 6: NACHWEIS DES SILENCINGS DER DMGDH IN HUMANEN PCA-ZELLLINIEN AUF PROTEINEBENE

........................................................................................................................................................... 28 ABBILDUNG 7: QUANTIFIZIERUNG DER DMGDH-EXPRESSION IN DU-145 ZELLEN MITTELS QPCR NACH

SILENCING MIT SHRNA ....................................................................................................................... 29 ABBILDUNG 8: RELATIVE EXPRESSION VON GNMT UND SARDH NACH SILENCING DER DMGDH.................. 30 ABBILDUNG 9: ANDROGENABHÄNGIGKEIT DER EXPRESSION SARKOSIN-METABOLISIERENDER ENZYME IN

HUMANEN PCA-ZELLEN ...................................................................................................................... 31 ABBILDUNG 10: VERGLEICH DER MITOCHONDRIENLOKALISATION ZWISCHEN DU-145 WILDTYPZELLEN UND

DMGDHSH-KLONEN ........................................................................................................................... 32 ABBILDUNG 11: ERGEBNISSE DES WST-1-PROLIFERATIONS-ASSAYS VON DU-145 ZELLEN MIT SILENCING DER

DMGDH .............................................................................................................................................. 33 ABBILDUNG 12: WOUND-HEALING ASSAY MIT DU-145 ZELLEN ................................................................... 34 ABBILDUNG 13: ERGEBNISSE DES WOUND-HEALING ASSAYS MIT DU-145 ZELLEN VERSUS DU-145 DMGDH-

SH-KLONE ........................................................................................................................................... 34 ABBILDUNG 14: MESSUNG DER INTRAZELLULÄREN SARKOSINKONZENTRATION IN DU-145 DMGDHSH-

KLONEN .............................................................................................................................................. 36

viii

Tabellenverzeichnis TABELLE 1: ZUSAMMENSETZUNG DER REAKTIONSLÖSUNG FÜR DIE CDNA SYNTHESE................................. 17 TABELLE 2: TEMPERATURPROGRAMM VERWENDET IN DER CDNA-SYNTHESE............................................. 18 TABELLE 3: ZUSAMMENSETZUNG DER PCR-REAKTIONSLÖSUNG ................................................................. 18 TABELLE 4: TEMPERATURPROGRAMM QPCR............................................................................................... 19 TABELLE 5: BERECHNUNG VON ∆CQ, RELATIVER EXPRESSION, ∆∆CQ UND DES RELATIVEN

EXPRESSIONSUNTERSCHIEDS.............................................................................................................. 19

1

1 Einleitung

1.1 Prostatakarzinom

1.1.1 Epidemiologie

Laut WHO Cancer Report machten Tumoren der Prostata beim Mann 2012 15% aller

bösartigen Tumoren aus, das sind in Krankheitsfällen gerechnet weltweit 1.111.689 Fälle,

wovon 307.471 Patienten an Prostatakrebs verstarben [1]. Im Alter über 70 ist das

Prostatakarzinom (PCa) sogar der häufigste bösartige Tumor beim Mann [2].

Altersstandardisierte Statistiken zeigen eine Inzidenz von 31,1 Fällen pro 100 000

Einwohner. Somit befinden sich bösartige Neoplasien der Prostata auf Platz 2 der

Krebsinzidenzen bei Männern hinter bösartigen Lungentumoren mit einer Inzidenz von 34,2

[1]. Geographisch zeigen sich höhere Inzidenzen in den Vereinigten Staaten und im

nördlichen Europa, niedrigere Inzidenzen hingegen in Süd-Ost-Asien [3]. 2012 betrug die

Mortalität bei Prostatakrebs 6,8%, was 307 471 Todesfällen weltweit entspricht [1]. Als

anerkannte Risikofaktoren gelten hohes Lebensalter, familiäre Vorbelastung sowie

ethnische Zugehörigkeit, jedoch scheinen auch Umwelteinflüsse eine Rolle zu spielen, da

Auswanderer aus dem asiatischen Raum in Amerika gleiche Inzidenzen wie die

einheimische Bevölkerung aufweisen [3]. Aufgrund der immer höher werdenden

Lebenserwartung bei Männern, wird Prostatakrebs auch sozioökonomisch eine immer

wichtiger werdende Erkrankung. So werden in Zukunft durch den Umstand der steigenden

Lebenserwartung und Inzidenz die verursachten Kosten dieser Erkrankung in Europa auf

über 8,43 Mrd. € geschätzt [3, 4].

1.1.2 Molekularpathologie

Generell scheint der Androgenrezeptor (AR) eine Schlüsselrolle bei der Entstehung von

Prostatakarzinomen einzunehmen. Etwa 60% der Patienten mit Prostatakarzinom zeigen

eine Alteration des AR [5, 6]. So können die Eigenschaften des AR durch den Austausch

von nur einer Aminosäure gravierend verändert sein. Eine Aktivierung des AR durch

Androgene, Östrogene und sogar Antiandrogene wird möglich [7-13]. Durch den Austausch

von Threonin durch Alanin an Position 878 lässt sich ein solcher AR (in diesem Fall der AR-

Mutant „AR T878A“) durch Androgene, Östrogene und Antiandrogene aktivieren [10]. Eine

solche Mutation spricht somit wenig bis gar nicht auf eine Hormontherapie an.

2

Neben dem AR ist auch eine Rolle von weiteren Proteinen in der Pathogenese des

Prostatakarzinoms dokumentiert. So zeigen neben diesem vor allem das Tumor Protein 53

(Tp53), der E-twenty-six Transkriptionsfaktor (ETS) und das Tumorsuppressorgen PTEN

Mutationen in PCa-Zellen [5, 6].

Der Verlust des Tumorsuppressors PTEN führt zur Stimulation der Proliferation der PCa-

Zellen durch den PI3K-AKT Signalweg und genomischer Instabilität. Es wurde spekuliert,

dass dieser Umstand eine Fusion des ETS-related-gene (ERG) und des androgenabhängigen

Transmembrane-protease-serine (TMPRSS) Promoters begünstigt. Daraus ergibt sich eine

durch Androgen gesteuerte Expression von ERG, welche Proliferation, Invasion und

Aggressivität des PCa beeinflusst [14, 15]. Wie ERG kann auch ETS mit TMPRSS

fusionieren und die Expression dadurch über Androgene gesteuert werden, was ebenfalls ein

wichtiger Mechanismus in PCa ist [16].

Auch der Verlust von Tumorsuppressorgenen ist relativ häufig in PCa-Zellen. Besonders

hervorzuheben sind neben PTEN und p53 das Retinoblastoma Tumor-Suppressor-Gen und

das NKX3-1 Gen [17-19].

Interessanterweise zeigten Prostatakarzinome nach längerer Behandlung mit

Androgenantagonisten eine Verminderung der AR Expression. Als Kompensation wird

jedoch der Epidermal-Growth-Factor Receptor (EGFR) hinaufreguliert und ermöglicht dem

Tumor auf diesem Weg wieder Proliferation [20]. Festuccia et al. schlossen aus dieser

Erkenntnis, dass eine kombinierte Therapie mit Antiandrogenen und EGFR Inhibitoren

sinnvoll wäre und der bisher verwendeten Monotherapie überlegen sein könnte [20].

Weiters konnten Varambally et al. zeigen, dass das Protein Histon – Lysin N –

Methyltransferase EZH2 bei PCa hinaufreguliert ist [21]. Diese Überexpression führt zu

erhöhter Invasivität und Progression. Außerdem zeigte sich, dass Überexpression von EZH2

zu erhöhter Sarkosinproduktion führte [21]. Sarkosin wiederum scheint die Expression des

EGF – Rezeptors HER2 zu induzieren was Proliferation und Androgenunabhängigkeit der

PCa Zellen zur Folge hat [22].

1.1.3 Klinik

Prostatakarzinome breiten sich zunächst lokal entlang der Nerven aus und infiltrieren im

späteren Verlauf das umliegende Gewebe und Organe. Die Metastasierung erfolgt

hämatogen und lymphogen. Von der Metastasierung ist bevorzugt das Skelett betroffen,

wobei sich häufig Metastasen in Wirbelsäule, Femur und Beckenknochen finden [2].

3

Neben der allgemeinen B-Symptomatik von Tumoren wie Gewichtsverlust und

Nachtschweiß ergeben sich aufgrund der anatomischen Lage auch viele andere Symptome

des PCa. Trotzdem bleiben gerade am Anfang Patienten oft symptomlos. Mit zunehmender

Tumorgröße kann es dann aber zum Beispiel zu Störungen beim Wasserlassen bis hin zur

Stauungsniere durch Obstruktion der Harnröhre kommen. Auch Schmerzen im

Bewegungsapparat bis hin zu pathologischen Frakturen sind je nach Lokalisation und

Ausdehnung der Knochenmetastasen möglich.

1.1.4 Diagnostik

1.1.4.1 Etablierte Verfahren

Ein Durchbruch in der Labordiagnostik des PCa gelang 1970 mit dem Nachweis des

Prostataspezifischen Antigens (PSA) [23].

Bei PSA handelt es sich um ein Glykoprotein welches prinzipiell von Männern und Frauen

synthetisiert wird. PSA konnte bei Männern im Prostataepithel, aber auch bei Frauen im

Brustgewebe nachgewiesen werden. PSA zählt zur Proteinfamilie der Kallikreine und

fungiert als Serinprotease [24]. Man unterscheidet freies und gebundenes PSA wobei beim

gebundenen Protein je nach Carrier-Protein 5 Subtypen unterschieden werden können [25-

27].

Beim Mann wird PSA vom Epithel der Prostata produziert und der Samenflüssigkeit

beigemengt. Dort bewirkt es durch Aufspaltung von Semenogelin eine Verflüssigung des

Ejakulates [28]. Eine Erhöhung von PSA im Serum lässt auf einen möglichen pathologischen

Prozess in der Prostata schließen, da durch Zelluntergang, Biopsie oder Malignom PSA ins

Blut diffundieren kann. So kommen erhöhte PSA-Werte zum Beispiel bei Entzündung in

Form einer Prostatitis, bei Zunahme der Zellmasse der Prostata in Form einer benignen

Prostatahyperplasie (BPH) oder aber auch bei neoplastischen Geschehnissen – einem

Prostatakarzinom – vor. Neben der PSA-Analytik hat sich auch die digital rektale

Untersuchung (DRU) etabliert. Dabei wird die Prostata über das Rektum ertastet um

Größenzunahme und/oder Formveränderungen zu erkennen.

Ein Screening sollte allen Männern mit erhöhtem Risikoprofil bezüglich PCa angeboten

werden. Das betrifft über 50 Jahre alte Männer, 45jährige Männer mit positiver PCa-

Familienanamnese, Afroamerikaner, 40 Jahre alte Männer mit einem PSA-Wert von

>1ng/ml und 60jährige Männer mit einem PSA-Wert von >2ng/ml. PSA und DRU Befund

bestimmen auch ob biospiert werden soll oder nicht. Jedoch sollte immer das individuelle

4

Risikoprofil evaluiert werden und nicht nur aufgrund einer reinen PSA-Erhöhung eine

Biospie durchgeführt werden, da diese auch mit Komplikationen verbunden sein kann. Die

Biopsie selbst erfolgt unter Zuhilfenahme von Ultraschall. Als die drei häufigsten

Komplikationen der Biopsie kommen Hämatospermie (37,4% der Patienten betroffen),

Hämaturie > 24h (14,5% der Patienten betroffen) und rektale Blutungen < 48h (2,2% der

Patienten betroffen) vor [3].

Zur Abschätzung der Prognose des PCa hat sich das System nach Gleason durchgesetzt.

Dieses nach Donald F. Gleason benannte und 1966 publizierte Gradingsystem berücksichtigt

die Drüsenarchitektur des Tumorgewebes [29]. Je nach histologischem Erscheinungsbild des

Tumorgewebes wird von Gleason 1 bis Gleason 5 unterschieden, wobei Gleason 1

hochdifferenzierte und Gleason 5 keine ersichtliche Differenzierung bedeutet. Der Gleason

Score errechnet sich durch Summation des häufigsten und zweithäufigsten Gleason –

Musters, bei Vorliegen nur eines Musters durch Verdoppelung von diesem [2].

Für die weiterführende Diagnostik und Staging stehen Magnetresonanztomographie (MRT),

Computertomographie, Szintigraphie und Ultraschall zur Verfügung [3].

1.1.5 Therapie

Es stehen verschiedene Therapieprotokolle zur Verfügung. Entscheidend sind der Wunsch

des Patienten und eine Nutzen-Risiko Abwägung. So macht es wenig Sinn bei Patienten mit

Komorbiditäten und einer eingeschränkten Lebenserwartung eine aggressive PCa-Therapie

durchzuführen, mit der Gefahr die Lebensqualität des Patienten zu vermindern.

Für ein konservatives Vorgehen stehen zwei Strategien zur Verfügung, nämlich watchful

waiting und active surveillance. Bei beiden Strategien wird eine sofortige und unnötige

Therapie vermieden, stattdessen wird beobachtet um bei Voranschreiten der Erkrankung

rechtzeitig intervenieren zu können. Besteht ein kurativer Ansatz, und wird eine

Lebenserwartung >10 Jahren erwartet entscheidet man sich für active surveillance. Zur

Verlaufskontrolle stehen dabei PSA-Bluttests, DRUs und regelmäßige Biopsien nach

definierten Protokollen zur Verfügung. Handelt es sich hingegen um einen palliativen

Therapieansatz, ist watchful waiting die Strategie der Wahl. Bei watchful waiting richtet sich

die Verlaufskontrolle nach dem Patienten und der Fokus liegt eher auf den Symptomen und

deren zeitlicher Veränderung [3]. Ziel beider Strategien (watchful waiting und active

surveillance) ist die Minimierung der toxischen Nebenwirkungen der Therapie [30-32].

Als operativen Therapieansatz steht die radikale Prostatektomie zur Verfügung. Dabei wird

die gesamte Prostata zwischen Blase und Harnröhre entfernt. Zusätzlich werden auch beide

5

Samenbläschen und umgebendes Gewebe reserziert. Ziel ist eine komplette Entfernung von

Tumorgewebe. Dies kann auch die Resektion der pelvinen Lymphknoten beinhalten. Da

auch diese Operation ein gewisses Risiko birgt, sollte vor allem bei Patienten mit

Komorbiditäten abgewogen werden ob eine Prostatektomie sinnvoll ist. Patienten mit einer

geschätzten Lebenserwartung von >10 Jahren profitieren eher von dieser Methode.

Operationstechnisch stehen neben radikaler retropubischer und perinealer Prostatektomie

auch minimal invasive Techniken wie laparoskopische und Roboter-assisitierte-

laparoskopische Operationsmethoden zur Verfügung, wobei Roboter-assistierte minimal

invasive Techniken in den USA bereits als Goldstandard gelten [3].

Neben konservativen und operativen Methoden gibt es auch noch die Möglichkeit mit

Strahlung auf den Tumor zu wirken. Mehrere Techniken stehen zur Verfügung. Als

Goldstandard gilt dabei die Intensity Modulated Radiation Therapy (IMRT). Die Intensität

der Strahlung kann während der Behandlung verändert werden und erlaubt somit höhere

Intensitäten als bei konventionellen Methoden. Durch Bildgebung vermessen, kann der

Tumor im dreidimensionalen Raum gezielt bestrahlt und umliegendes Gewebe geschont

werden [33].

Eine weitere Säule der Therapie von PCa ist die Hormon-Therapie (Androgen Deprivation

Therapy) die einer chemischen Kastration entspricht. Es handelt sich um eine Anti-

Hormontherapie. Ziel ist es die Wirkung der Androgene auf den Tumor zu hemmen. Eine

Verminderung der Androgenwirkung kann über verschieden Mechanismen erreicht werden.

So kann zum Beispiel die Sekretion von Androgen durch operative Entfernung des

Syntheseortes (operative Kastration) vermindert, oder durch die Gabe von Antiandrogenen

die Wirkung direkt am Rezeptor gehemmt werden. Goldstandard ist nach wie vor die

operative Kastration [3].

Für die medikamentöse Kastration stehen Luteinisierendes-Hormon-releasing-Hormon

(LHRH) Agonisten und Antagonisten, Östrogene und Antiandrogene zur Verfügung.

Beim Einsatz von LHRH Agonisten wird die Synthese des Luteinisiernden Hormons (LH)

und des Follikel stimulierenden Hormons (FSH) hinaufreguliert, was zu einer Down-

Regulation des LHRH Rezeptors führt und letztendlich eine Verminderung von LH und FSH

bewirkt. Es kann jedoch durch die anfangs überschießende FSH und LH Stimulation zu

einem sogenannten flare-up Phänomen kommen, welches bei den LHRH Antagonisten nicht

vorkommt [3]. LHRH Antagonisten binden kompetitiv an den LHRH Rezeptor und

bewirken eine sofortige Verminderung von FSH, LH und Testosteron. Nachteil bei diesen

Substanzen ist die Formulierung der Medikamente. Im Gegensatz zu LHRH Agonisten gibt

6

es für LHRH Antagonisten keine langwirkenden Depot-Formulierungen. Eingesetzte

Pharmaka sind Abarelix (LHRH Agonist) und Degarelix (LHRH Antagonist) [3].

Neben Östrogenen und LHRH Antagonisten/Agonisten, kommen wie schon erwähnt auch

Antiandrogene zum Einsatz. Unterschieden werden steroidale und nicht-steroidale

Antiandrogene. Bei ersteren handelt es sich um synthetische Derivate von

Hydroxyprogesteron. Als steroidale Antiandrogene kommen Cyproteronacetat,

Megestrolacetat und Medroxyprogesteronacetat zum Einsatz. Nilutamid, Flutamid und

Bicaltumid werden als nicht-steroidale Antiandrogene eingesetzt. Als neue Substanzen

stehen Abirateron und Enzalutamid zur Verfügung. Abirateron vermindert über Hemmung

von CYP17 die intrazelluläre Testosteronkonzentration, Enzalutamid wirkt als nicht-

steroidales Antiandrogen und blockiert zusätzlich noch den Transport des AR zum Zellkern,

was eine agonistische Wirkung ebenfalls unterbindet [3].

1.1.6 Sarkosin – ein neuer Marker für die Diagnose von Prostatakrebs?

Ein großes Problem bei den bisherigen PCa Screeningmethoden ist, dass keine

Unterscheidung zwischen harmlosen und aggressiven Tumoren möglich ist. Dieser Umstand

führt zu Überdiagnosen, was Patienten einer Therapie zuführt (mit möglichen

Nebenwirkungen), obwohl die Behandlung gar nicht oder noch nicht nötig gewesen wäre.

Es zeigte sich, dass der Einfluss der Behandlung auf das Überleben nur minimal ist, da

Übertherapie und Überdiagnose die Fälle überdecken, welche von einer Behandlung

wirklich profitieren würden [34].

2009 untersuchten Sreekumar et al. [35] 262 klinische Proben auf Tumormetabolite und

konnten das Glycinderivat Sarkosin (N-Methylglycin) als möglichen PCa Marker

identifizieren [36].

Es wurden in dieser Studie 42 Gewebeproben (16 benigne, 12 klinisch lokale PCas und 14

metastatische PCas) und jeweils 110 Urin- und Plasmaproben untersucht. Insgesamt wurden

in der Analyse 1126 Metabolite gefunden wovon allerdings nur 176 in allen drei getesteten

Tumortypen vorkamen. Die gemessenen Metabolit-Konzentrationen zeigten eine sehr gute

Korrelation mit der Aggressivität der Tumoren. Es stellte sich heraus, dass Gewebeproben

den Urin- bzw. Plasmaproben überlegen waren, da hier eine bessere Differenzierung der

Probenkategorien möglich war. So wurden Metabolite in Gewebeproben von benignen,

klinisch lokalen, und metastasierenden PCas untersucht. Von 547 in den Gewebeproben

gefundenen Substanzen wurden 37 identifiziert, die eine Unterscheidung zwischen benignen

und lokalen PCa zulassen. 91 von insgesamt 533 erlaubten die Unterscheidung zwischen

7

lokalen und bereits metastasierenden PCa. Nur sechs Metabolite, darunter Sarkosin,

erlaubten eine Unterscheidung zwischen benignem Geschehen, lokalem PCa und

metastatischem PCa. Sarkosin wurde daher als Tumormarker diskutiert, da es in benignen

Gewebeproben nicht nachweisbar war und somit eine mögliche Früherkennung zulassen

würde [36].

Außerdem konnte gezeigt werden, dass Sarkosin verglichen zu Biopsie-negativen Proben in

Biopsie-positiven signifikant erhöht im Urinsediment nachweisbar war. Somit könnte eine

invasive Biopsie durch eine einfache Sarkosin-Urinuntersuchung umgangen werden.

Weitere Stärken von Sarkosin als diagnostischer Marker zeigten sich bei Fällen bei denen

ein Ergebnis von 2-10ng/ml PSA vorlag. In diesem Bereich ist der PSA-Test inkonklusiv in

Bezug auf die Diagnose PCa. Bei Untersuchung von Patienten mit PSA-Werten in diesem

Konzentrationsbereich zeigte sich eine erhöhte Sakosinkonzentration als verlässlicher

Indikator eines PCas [36].

Varambally et al. [21] konnten zeigen, dass Überexpression von EZH2 in benignen Zellen

zu Zellinvasion und neoplastischer Progression führt. Da die Sarkosinkonzentration in

malignen Zellen mit hohem Invasionspotential ebenfalls erhöht waren, untersuchten

Sreekumar et al. [35] den Zusammenhang zwischen Sarkosin und EZH2. Es zeigte sich, dass

Überexpression von EZH2 in benignen Zellen zu einer Erhöhung, Knockdown von EZH2

zu einer Verminderung der Sarkosinkonzentration führte. Weiters führte die Zugabe von

Sarkosin zu benignen Epithelzellen der Prostata zur Ausprägung eines invasiven Phänotyps.

Die Autoren schlossen daraus, dass Sarkosin direkt mit der Invasionsfähigkeit in PCa

assoziiert verbunden sein könnte.

Enzyme, welche im Sarkosinmetabolismus involviert sind, könnten somit potentielle

therapeutische Targets von PCa darstellen so die Autoren weiter.

Die Autoren eines Reviews aus dem Jahr 2013 sahen in Sarkosin und dem Schlüsselenzym

im Sarkosinmetabolismus - Glycin N-Methyltransferase (GNMT) - vielversprechende

Kandidaten als nicht-invasive Marker für PCa [37].

Generell geht der Trend in der PCa Diagnostik Richtung Multiplextestung von mehreren

zuverlässigen Tumormarkern wie zum Beispiel EZH2, Glutathion-S-Transferase P-1

(GSTP-1) und des TMPRSS-ETS Fusions-Gen. Genauere Untersuchungen und gezielte

Therapien könnten so ermöglicht und Überdiagnose und Übertherapie verhindert werden.

Weiters spielt die Probengewinnung eine wichtige Rolle, da so Biopsien vermieden und ein

Screening erleichtert werden könnte [23].

8

1.2 Dimethylglycindehydrogenase und andere Enzyme im

Sarkosinmetabolismus

Das Enzym Dimethylglycindehydrogenase (DMGDH) ist ein mitochondriales Flavoprotein,

welches die Reaktion von Dimethylglycin unter Abspaltung einer Methylgruppe zu Sarkosin

katalysiert (Abb.1) [38, 39]. Im Körper wird DMGDH hauptsächlich in Hepatozyten und

Tubuluszellen der Niere gebildet [40-42]. DMGDH ist als Enzym des Cholinstoffwechsels

für einen Demethylierungsschritt hin zu Glycin verantwortlich [39, 43]. Chemisch gesehen

spielt Cholin als Baustein für Biomoleküle eine wichtige Rolle. Gebunden an Acetat

ermöglicht Cholin in Form des Neurotransmitters Acetylcholin im Zentralnervensystem die

Übertragung von Nervenimpulsen an der Synapse. In Kombination mit Phospholipiden trägt

Cholin als Phosphatidylcholin maßgeblich zur Zellintegrität bei [44].

DMGDH katalysiert die Umwandlung von Dimethylglycin zu N-Methylglycin (=Sarkosin).

Sarkosin wiederum kann als Substrat für weitere Enzyme dienen und weiter zu Glycin weiter

abgebaut werden [39, 43].

Abbildung 1: Enzyme im Cholinstoffwechsel. Dargestellt ist der stufenweise Abbau von Cholin bis hin zu Glycin. Cholin wird durch die Enzyme Cholindehydrogenase (CHD), Betainaldehyd-Dehydrogenase (BAD) und Betain-Homocystein-S-Methyltransferase (BHMT) zu Dimethylglycin umgewandet. Dimethylglycin wiederum kann durch das Enzym Dimethylglycindehydrogenase (DMGDH) zu Sarkosin umgewandelt werden. Dabei wird die Methylgruppe auf den Kofaktor Tetrahydrofolsäure (THF) übertragen. Dabei reagiert THF zu N-5,10-methyl-THF. Die so übertragene Methylgruppe kann wiederum für andere Synthesen verwendet werden. Die freiwerdenden Elektronen werden auf Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD+) übertragen und FAD+ wird zu Dihydro-Flavin-Adenin-Dinukleotid (FADH2) reduziert. Diese in Form von FADH2 gespeicherten Elektronen können über Umwege in die Atmungskette eingeschleust und zur Energieumwandlung verwendet werden. Das Produkt der von der DMGDH katalysierten Reaktion – Sarkosin – kann durch die Enzyme Sarkosindehydrogenase (SARDH) und Pipecolinsäure- und Sarkosinoxidase (PIPOX) weiter zu Glycin demethyliert werden. Auch DMGDH kann die Demethylierung von Sakosin katalysieren. Umgekehrt kann Sarkosin durch Mehtylierung auch aus Glycin synthetisiert werden. Diese Reaktion katalysiert das Enzym Glycin-N-methyltransferase (GNMT). Abbildung mit freundlicher Genehmigung von Peter Augustin aus [39] entnommen.

Wie in Abb. 1 ersichtlich, sind viele Enzyme an der Metabolisierung von Cholin hin zu

Glycin beteiligt. Cholin wird zuerst durch das Enzym Cholindehydrogenase zu

Betainaldehyd umgewandelt, welches dann erneut durch Cholindehydrogenase mit dem

Kofaktor Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD) zu Betain und Dihydro-Flavin-Adenin-

9

Dinukleotid (FADH2) metabolisiert wird. In Folge katalysiert das Enzym Betain-

Homocystein-S-Methyltransferase die Umwandlung von Betain zu Dimethylglycin. Als

Methylgruppenakzeptor dient L-Homocystein welches zu L-Methionin methyliert wird.

Dimethylglycin dient wie schon erwähnt nun als Substrat für DMGDH. Mit den Kofaktoren

Tetrahydrofolsäure (THF) und FAD+ katalysiert die DMGDH die Demethylierung von

Dimethylglycin zu Sarkosin [39, 43]. THF nimmt dabei die freiwerdende Methylgruppe auf

und reagiert zu N-5,10-Methyl-THF; FAD wird zu FADH2 reduziert. FADH2 kann die

aufgenommenen Elektronen über Umwege dann in die Atmungskette einschleusen, Methyl-

THF hingegen kann die Methylgruppe als Methyldonator auf andere Biomoleküle

übertragen [39].

Für die weitere Umwandlung von Sarkosin zu Glycin steht dem Körper das Enzym

Sarkosindehydrogenase (SARDH) zur Verfügung. Unter anaeroben Bedingungen und

Abwesenheit von THF entsteht bei der Demethylierung von Dimethylglycin oder Sarkosin

aus dem Methylrest Formaldehyd, bei aeroben Verhältnissen und Anwesenheit von THF

wird die Methylgruppe auf THF übertragen; N-5,10-methyl-THF entsteht und kann wie

schon oben beschrieben weiter reagieren [45].

Glycin kann jedoch auch methyliert und dadurch zu Sarkosin umgewandelt werden. Dabei

erfolgt die von der SARDH-katalysierte Reaktion in umgekehrter Richtung. Verantwortlich

als Katalysator für diese Reaktion ist die Glycin-N-Methyltransferase (GNMT). GNMT

methyliert mit Hilfe von S-Adenosylmethionin (SAM) Glycin am Stickstoffatom zu

Sarkosin, wobei S-Adenosylmethionin seine Methylgruppe abgibt und zu S-

Adenosylhomocystein reagiert [46]. GNMT gilt als der wichtigste Regulator der SAM-

Konzentration in den Mitochondrien [39].

GNMT und SARDH sind wichtige Enzyme des Sarkosinmetabolismus in PCa-Zellen.

Interessanterweise konnte beim PCa eine Hochregulation von GNMT beobachtet werden

[47-49]. Zudem führte ein Silencing der Expression vonSARDH zum gleichen Effekt wie

eine Überexpression von GNMT. Resultat waren erhöhte Sarkosinkonzentrationen und

verstärktes Tumorwachstum. Ausknocken von GNMT führte zu einer Verminderung der

GNMT-Expression um 70% was letztendlich zu einer Verminderung der Zellproliferation

und der Induktion von Zelltod führte [47]. Wie erwartet führte auch die Überexpression von

SARDH zu vergleichbaren Effekten. In einem Mausmodell führte eine Überexpression von

SARDH und gleichzeitiges Knockdown von GNMT zu einer Verminderung des

Tumorwachstums um 75% [47]. Ottaviani et al. konnten weiters zeigen, dass das GNMT-

10

Gen eine androgenabhängige Promoterregion besitzt [49]. Dies wurde zwar auch schon von

Sreekumar et al. vermutet jedoch fehlten genauere Untersuchungen. Im Gegensatz zu

GNMT und SARDH wurde die DMGDH im Lichte des PCas noch kaum untersucht.

Binzak et al. konnten 2001 zeigen wie sich ein Fehlen von DMGDH auf den menschlichen

Phänotyp auswirkt. In der Studie wird der Fall eines 38-jährigen Afroamerikaners mit

homozygoter DMGDH Mutation resultierend in einer Inaktivität von DMGDH beschrieben.

Auffällig war ein starker Körpergeruch des Patienten nach Fisch, Muskelschwund und

erhöhte Dimethylglycin Konzentrationen in Serum und Urin [50].

In Anbetracht der potentiellen Konsequenzen durch das Fehlen von DMGDH sind die

Symptome allerdings überraschend mild [50].

1.3 Hypothese

Bisherige Studien haben eine eindeutige Assoziation der Enzyme GNMT und SARDH mit

dem Sarkosin-Metabolismus und der Aggressivität von PCas festgestellt. Eine mögliche

Rolle der DMGDH in der Progression des PCas wurde bislang jedoch nur spärlich

untersucht. Die vorliegende Arbeit soll in Form einer Pilotstudie den Nachweis der

Expression der DMGDH in drei klassischen PCa-Zelllinien (LNCaP, DU-145, PC-3)

erbringen und die Rolle der DMGDH in zellulären Prozessen wie Survival, Proliferation und

Migrationsverhalten erörtern.

1.4 Ziele

Es konnte bisher gezeigt werden, dass Sarkosin eine Rolle im PCa-Tumormetabolismus

spielt und als potentieller Marker für PCa in Betracht kommt. Da Sarkosin durch mehrere

Enzyme synthetisiert bzw. wieder degradiert, wird liegt der Fokus auf genau diesen

Enzymen. Eines davon ist DMGDH und wurde im Gegensatz zu GNMT und SARDH noch

nicht so intensiv untersucht. Daher liegt das Ziel dieser Arbeit darin zu untersuchen, wie

wichtig DMGDH für die Sarkosinsynthese in PCa-Zellinien ist. Dies geschieht auf

Proteinebene mittels Immunfluoreszenz und Western Blotting und auf mRNA Ebene mittels

qPCR. Anschließend erfolgt ein Silencing der DMGDH-Expression mit Hilfe eines sHRNA-

Konstrukts unter Verwendung eines lentiviralen Vektors. In generierten stabilen Klonen mit

Silencing der DMGDH sollen die intrazelluläre Sarkosinkonzentration sowie etwaige

Alterationen in der Genexpression von SARDH und GNMT bestimmt werden. Zusätzlich

werden mit den Zellen noch funktionelle Versuche durchgeführt um die Auswirkungen des

11

DMGDH-Silencings auf die Proliferation und Zellmigration zu untersuchen. Dazu werden

der WST-1 Assay und der Wound-healing Assay verwendet. Außerdem wird untersucht, ob

die Expression von DMGDH durch Androgene (Testosteron, Dihydrotestosteron)

beeinflusst wird, was für die GNMT bereits demonstriert werden konnte. Die drei gut

etablierten PCa-Zelllinien PC-3, DU-145 und LNCaP wurden in dieser Studie als in vitro

Modelle für PCa herangezogen.

1.4.1 PC-3

Die PC-3 Zelllinie wurde aus einer Knochenmetastase eines 62 Jahre alten Kaukasiers mit

einem niedrig differenzierten Adenokarzinom (G4) generiert. Die PC-3 Zelllinie erwies sich

als Androgen-unabhängig. Bei den Zellen handelt es sich um epithelähnliche adhärent

wachsende Zellen, welche als Mono- oder Multilayer wachsen können. Die

Verdoppelungszeit der PC-3 Zellen beträgt ca 50h [51].

1.4.2 DU-145

Die DU-145 Zellen wurden aus der Tumormasse einer metastatischen Läsion im zentralen

Nervensystem eines 69 Jahre alten Patienten im Jahr 1975 gewonnen. Zellen dieses Typs

wachsen adhärent als Monolayer und sind epithelähnlich. Die Verdoppelungszeit von DU-

145 Zellen beträgt in etwa 30-40h. Neben PC-3 Zellen sind auch Zellen der DU-145 Linie

Androgen unabhängig [52, 53].

1.4.3 LNCaP

LNCaP Zellen wurden 1977 aus einer metastatischen Läsion im linken supraklavikulären

Lymphknoten eines 50 Jahre alten Mannes mit PCa gewonnen. Die Zellen sind adhärent und

wachsen einzeln oder in Form von Zellaggregaten [54]. Außerdem sind LNCaP Zellen im

Gegensatz zu den beiden anderen verwendeten Linien androgensensitiv [55]. Die

Verdoppelungszeit beträgt um die 60h [54].

12

2 Material und Methoden

2.1 Kultivierung der humanen Prostatakrebszellen

Für die Studie wurden die drei Zelllinien PC-3, DU-145 und LNCaP verwendet. Die

Zelllinien wurden vom Zentrum für Biomedizinische Forschung der Medizinischen

Universität Graz (Ass.Prof.in Priv.Doz.in Mag.a Dr.in Beate Rinner) bezogen. Als

Kulturgefäße dienten 25ml Zellkultur-Flasks (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland). Die

Zellen (LNCaP und DU-145) wurden in RPMI-1640-Medium (Sigma-Aldrich, Darmstadt,

Deutschland) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS-Superior, Biochrom, Berlin,

Deutschland) und mit Zusatz von 2mM Glutamin (Sigma Aldrich) und Penicillin-

Streptomycin Lösung (Penstrep®, Sigma Aldrich) mit einer Endkonzentration von 100 U/L

Penicillin und 100µg/ml Streptomycin im fertigen Medium kultiviert. Die Kultivierung der

PC-3 Zellen erfolgte in einem Misch-Medium bestehend aus 45% Ham´s F12 + 45% RPMI

1640 + 10% FBS mit Zugabe von Penstrep® und Glutamin (2mM). Die Kultivierung der

Zellen erfolgte im Brutschrank bei 37°C, 5% CO2 und einer relativen Luftfeuchtigkeit von

90%. Bei allen Zellen handelt es sich um adhärent wachsende Zellen. Zur Passagierung der

Zellen wurde das RPMI Medium abgehoben, die Zellen einmal mit Calcium/Magnesium

freiem Phosphatpuffer (CMF-PBS) gewaschen und anschließend mit 1ml Trypsin/EDTA-

Lösung (Sigma-Aldrich) gespült, wobei final 0,3ml der Trypsinlösung im Flask

zurückgelassen wurde. Danach wurden die Zellen im Brutschrank inkubiert (typischerweise

rund fünf Minuten) bis sich die Zellen abgerundet und vollständig von der Oberfläche der

Kulturflasche abgelöst haben. Nach diesem Schritt wurden 4,7ml Zellkulturmedium

zugesetzt und die Zellen darin resuspendiert. Abhängig von der Konfluenz der Zellen wurde

im Flask ein Aliquot der Zellsuspension zur weiteren Kultivierung zurückgelassen und mit

Zellkulturmedium auf 5ml aufgefüllt. Die restliche Zellsuspension wurde für Experimente

verwendet bzw. verworfen.

2.2 Transfektion der PCa-Zellen mittels lentiviralem Vektor

Für das Silencing der DMGDH in den PCa-Zelllinien wurde ein lentivirales Small hairpin

RNA (ShRNA) System von Santa Cruz Biotechnologies (Dallas, Texas, USA.) verwendet.

24h vor Transfektion der Zellen mit den Lentivirus-Partikeln wurden pro Well einer 24-Well

Platte 1ml Medium vorgelegt mit 1x105 Zellen ausgelegt und bis zur Transfektion über

Nacht im Brutschrank inkubiert um für den Zeitpunkt der Transfektion 50% Konfluenz zu

erreichen. Die Inkubation erfolgte in RPMI Medium mit Penstrep.

13

Für die Transfektion wurde eine Lösung bestehend aus Zellkulturmedium und Polybrene®

(Santa Cruz Biotechnologies) hergestellt (finale Konzentration 5µg/µl). Das vorhandene

Medium wurde abgehoben und durch 1ml des mit Polybrene® versetzten Mediums ersetzt

(dazu wurden pro Well 0,5µl Polybrene®-Lösung zum Medium gegeben). Die zuvor bei

Raumtemperatur aufgetauten und vorsichtig resuspendierten Viruspartikel wurden nun zu

den Zellen hinzugegeben (pro Well 20µl Virussuspension) und die Zellen über Nacht

inkubiert. Am nächsten Tag wurde das Polybrene® hältige Medium entfernt, durch

Polybrene® freies ersetzt und die Zellen wieder über Nacht in diesem Medium inkubiert.

Für die anschließende Selektion von stabilen Klonen mit Silencing der DMGDH wurden die

Zellen entsprechend der Herstellerangaben gesplittet und weiter in Polybrene® freiem

Medium 24h inkubiert und für die Selektion vorbereitet. Die Selektion der erfolgreich

transfizierten Zellen erfolgte durch Zugabe von Puromycin Dihydrochlorid (sc – 108071,

Santa Cruz Biotechnologies) in der vom Hersteller empfohlenen Konzentration (10µg/ml).

Das Puromycin-hältige Medium wurde alle 4 Tage durch frisches Medium ersetzt.

Zur Kontrolle wurde ebenfalls eine Transfektion mit Kontroll ShRNA Virus Partikeln

(Control shRNA lentiviral Particles, sc – 108080, Santa Cruz Biotechnologies) durchgeführt.

2.3 Immunfluoreszenznachweis von DMGDH

Um das DMGDH Protein in den Zellen nachweisen und lokalisieren zu können wurde ein

monoklonaler IgG Maus-Antikörper (Klon E-6, Santa Cruz Biotechnologies) in einer

Verdünnung von 1/50 in CMF-PBS Puffer (mit 0,3% Igepal CA-630 /Sigma-Aldrich und

5% Goat-Serum/PAA, Pasching, Österreich) gegen DMGDH eingesetzt. Die eigentliche

Visualisierung erfolgte durch Bindung eines fluoreszierenden Sekundärantikörpers an den

primären Maus-Antikörper. Als Sekundärantikörper wurde ein polyklonaler IgG Ziegen

Anti-Maus Antikörper (Alexa Fluor® 555 Goat anti-mouse IgG Antibody, Biolegend®, San

Diego, CA, USA) in einer Verdünnung von 1/200 in CMF-PBS mit 0,3% Igepal verwendet.

2.3.1 Herstellung der Slides und Färbung

Für die Analyse der DMGDH-Expression wurden die Zellen geerntet und direkt auf sterilen

Objektträgern kultiviert. Die Fixation der Zellen erfolgte mit 4% Paraformaldehyd für

15min. Danach wurden die Zellen dreimal mit CMF-PBS gewaschen, luftgetrocknet und bis

zur Immunfluoreszenzfärbung bei -20°C gelagert.

Die vollständig mit Zellen bewachsenen Slides wurden aus dem Gefrierschrank (-20°C)

entnommen, aufgetaut und 30min im Abzug getrocknet. Auf den Slides wurden durch

14

einfaches Wegwischen des Zellrasens jeweils zwei Zellfelder geschaffen und mit einem

Fettstift umrandet. Eines der Felder wurde mit Primärantikörper-Lösung beschickt

(=Testansatz), das zweite nur mit dem Färbepuffer ohne Antikörper (=Negativkontrolle).

Die Permeabilisierung der Zellmembranen erfolgte durch Tris-Buffered-Saline-Tween 20®

Puffer (TBST) für 5min. Beide Felder wurden mit den jeweiligen Lösungen bedeckt. Dazu

wurden ca. 300µl pro Feld veranschlagt um die Zellen gut zu bedecken. In einer feuchten

Kammer und gekühlt bei 4°C wurden die Slides über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag

wurde die Flüssigkeit auf den Slides abgegossen, die Slides in CMF-Puffer getaucht und

anschließend dreimal mit TBST Puffer für jeweils 5min gewaschen. Nach diesem Schritt

wurden pro Feld ca. 300µl Sekundärantikörper-Lösung aufgetragen. Da der

fluoreszenzmarkierte Sekundärantikörper lichtsensitiv ist, musste ab diesem Schritt unter

Lichtschutz gearbeitet werden. Die Proben wurden unter Lichtschutz bei Raumtemperatur

30min in der feuchten Kammer inkubiert. Nach diesen 30min wurden die Slides wieder in

CMF-Puffer getaucht und zwei Mal in TBST-Puffer für jeweils 5min gewaschen. Neben der

DMGDH-Färbung wurde noch eine Kernfärbung mit 4´,6-Diamidino-2-Phenylindol-

dihydrochlorid (DAPI, Sigma, 1µg/ml in CMF-Puffer) durchgeführt. Hier wurde ebenfalls

unter Lichtschutz gearbeitet. Die Slides wurden nach dem zweimaligen Waschen mit TBST-

Puffer mit DAPI-Lösung überschichtet. Nach 20 min wurden die Slides aus der DAPI-

Lösung entnommen, einmal gespült mit CMF-PBS und erneut einmal mit TBST-Puffer 5

min gewaschen und final wieder in CMF-Puffer getaucht um Reste von TBST zu entfernen.

Anschließend wurden die gefärbten Zellen mit Roti®Mount FluorCare Mounting-Medium

(Roth, Karlsruhe, Deutschland) überschichtet und mit einem Deckglas bedeckt. Die

Versiegelung der Slides erfolgte mit farblosem Nagellack.

Die anschließende mikroskopische Auswertung erfolgte mit einem Leica DM 4000 B

Mikroskop (Leica, Wetzlar, Deutschland), ausgestattet mit einer PC gekoppelten Leica DFC

300 FX Kamera und dazugehöriger Software vom Hersteller.

2.4 Western Blot

2.4.1 Probenvorbereitung

Die Zellen wurden durch Trypsinierung geerntet und je zweimal in CMF-PBS-Puffer

gewaschen. Bis zur Proteinisolierung wurden die Zellpellets bei -20°C gelagert.

Zu den Zellpellets (2x106 Zellen) wurden jeweils 150µl Lysis-Puffer (siehe Anhang)

zugegeben. Der Aufschluss der Zellen erfolgte am Vortex-Mischer und im Anschluss durch

Ultraschall in einem mit Eis gekühlten Ultraschallbad (6min). Dann wurde 10min unter

15

Kühlung bei 12000rpm und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde abgehoben und in ein

neues Eppendorf-Gefäß gegeben. Die Messung der Proteinkonzentration erfolgte mittels

PierceTM BCA Protein Kit Assay (Thermo Fisher Scientific). Dafür wurden die Reagenzien

und die einzelnen Proteinlösungen in eine 96 Well Platte entsprechend den

Herstellerangaben vorgelegt und 30min bei 37°C inkubiert. Daneben wurden noch Protein-

Standards (Bovines Serum Albumin) mit den Konzentrationen von 0,5mg/ml, 1mg/ml,

1,5mg/ml und 2mg/ml und als Leerwert ohne Proteinzugabe hergestellt. Die

Proteinbestimmung erfolgte mittels Photometer (Tecan Sunrise absorbance reader, Tecan,

Männedorf, Schweiz) bei 562nm. In Microsoft Excel wurde mit Hilfe der Proteinstandards

eine Standardgerade generiert und anhand dieser Gerade die Konzentration der einzelnen

Proteinlösung auf Basis der jeweiligen gemessenen Absorption berechnet.

2.4.2 SDS-PAGE und Blotting-Prozedur

Für die Auftrennung der Proteine mittels Natriumdodecylsulfat Polyacrylamid-

Gelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde ein Biorad® Mini-Protean II System verwendet. Als

Gel wurde ein selbst gegossenes 10%iges SDS Polyacrylamidgel verwendet. Über dem

10%igen Trenngel wurde ein 5%iges Stacking-Gel (inklusive Kamm zur Bildung von

Probentaschen) aufgetragen. In jede Kammer wurden jeweils 25µg Probe versetzt mit

Loading Dye pipettiert. Als Molekulargewichtsstandard wurde eine Prestained

Proteinstandard (Thermo Scientific) aufgetragen. Als Positivprobe wurde aufgereinigte

heterolog in Komagataella phaffi exprimierte humane DMGDH verwendet [39]. Das Gel

wurde in die Bio-Rad® Apparatur eingespannt und in Tris-Glycin Puffer getaucht. Weiters

wurde das Gel mit den Proben beladen und anschließend wurde für die Auftrennung der

Proteine die Spannung für 10min auf 120V, dann für 60min auf 160V eingestellt. Danach

wurde das Gel entnommen und es wurde der Transfer der Proteine (=Blotting) auf eine

Nitrocellulosefolie vorbereitet. Dazu wurden Nitrocellulose und Gel

übereinandergeschichtet und in den Transferpuffer bestehend aus Tris-Glycin Puffer,

versetzt mit Ethanol und Methanol, getaucht. Während des Blottingvorganges (200mA für

2h) wurde mit Eis gekühlt. Um die Blotting-Effizienz zu überprüfen wurde die Membran

mit Ponceau S-Lösung gefärbt. Die Nitrocellulose wurde so lange mit TBST gewaschen bis

die Anfärbung der Banden nicht mehr sichtbar war. Anschließend wurde die Membran mit

2%igem Milchpulver (Roth®) gelöst in TBST-Puffer geblockt (1h bei 4°C). Danach erfolgte

die Inkubation mit dem DMGDH-Primärantikörper (Santa Cruz Maus Anti-DMGDH, Klon

E-6, IgG 1/200 Verdünnung in 0,5%iger Milchpulver-TBST-Lösung). Die Membran wurde

16

1h bei 4°C gekühlt mit dem Primärantikörper inkubiert. Nach der Inkubation wurde die

Nitrocellulosemembran 3x jeweils 5min mit TBST-Puffer gewaschen. Danach erfolgte die

Zugabe des Sekundärantikörpers (Goat Anti-Mouse IgG konjugiert mit Horseradish

Peroxidase, 1/5000 Verdünnung in 0,5%iger Milchpulver-TBST-Lösung). Die Inkubation

erfolgte wieder gekühlt bei 4°C für 2h. Die Visualisierung der Banden erfolgte mittels

Chemiluminiszenz in der G Box (Syngene, Cambridge, UK) unter Verwendung von

Luminol (Super Signal West Pico chemiluminescent substrate, Thermo Scientific).

2.5 qPCR

2.5.1 RNA – Isolierung

Die Zellen wurden durch Trypsinierung geerntet, durch Zentrifugation pelletiert, der

Überstand abgehoben und die Zellpellets bis zur weiteren Verwendung bei -20°C

tiefgefroren.

Um eine Beschädigung der RNAs zu vermeiden, wurde bei den Isolationsschritten auf Eis

gearbeitet. Die Proben wurden aus dem Gefrierschrank entnommen und sofort wurde

TriReagent RT (Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA) in die Gefäße

zugegeben. Die mit TriReagent RT versetzten Proben wurden anschließend in 1,5ml

Probengefäße überführt und mit 50µl 4 - Bromanisol (BAN, Sigma-Aldrich) versetzt. Nach

diesem Schritt wurden die Gefäße 20x durch Kippen gut gemischt, 5min bei

Raumtemperatur inkubiert und um eine beschleunigte Phasentrennung zu erreichen bei

12000x g und bei einer Temperatur von 4°C 15min lang zentrifugiert.

Anschließend wurden 500µl des Überstandes abgehoben und in ein neues Eppendorf-Gefäß

pipettiert. Das Ausfällen der RNA erfolgte durch Zugabe von 500µl 2 – Propanol. Wieder

wurde 20x durch Kippen gemischt, 10min bei Raumtemperatur inkubiert und bei 12000x g

8min bei 4°C zentrifugiert. War ein RNA Pellet vorhanden, wurde der Überstand abgehoben

und zum RNA Pellet 1ml Ethanol 96% zugegeben. Anschließend wurde zentrifugiert (bei

7500x g, 4°C, 5min) und der Überstand möglichst gründlich entfernt. Die RNA wurde dann

bei Raumtemperatur getrocknet und je nach Pelletgröße mit 50 – 100µl Aqua bidest im

Thermoschüttler (300rpm, 10min) gelöst. Es folgte die Lagerung der Proben auf Eis und die

anschließende Messung der RNA Konzentration am NanoDrop® - Photometer (Thermo-

Fisher).

Für die Qualitätskontrolle der isolierten RNAs wurden je Probe 300ng RNA mit Aqua bidest

auf ein Volumen von 10µl aufgefüllt und mit 2µl 6x Loading Dye versetzt. Die Auftrennung

der Proben erfolgte durch in einem Ethidiumbromid-haltigem Argarosegel (1x TAE Puffer,

17

1% Argarose, 0,4µg/ml Ethidiumbromid) bei 70 Volt für 40min. Die Visualisierung der

RNA-Banden erfolgte mittels einem CHEMI-DOC XRS® System (Bio-Rad, Hercules, CA,

USA)

2.5.2 Umschreiben der mRNA in cDNA

Für das Umschreiben der zellulären RNAs in cDNA wurde der High Capacity cDNA Kit

von Thermo Fisher verwendet. Es wurden insgesamt 2000ng RNA pro Probe eingesetzt.

Dazu wurden entsprechend der gemessenen RNA Konzentration nach der Isolierung das

entsprechende Aliquot entnommen und mit RNAse freiem Aqua bidest auf ein

Gesamtvolumen von 10µl aufgefüllt. Somit ergibt sich eine RNA Konzentration von

200ng/µl. Zu diesen 10µl Probe wurden anschließend noch 10µl Reaktionslösung

zugegeben. Die genaue Zusammensetzung der Reaktionslösung ist in Tabelle 1 angeführt.

Daraus ergibt sich eine neue Konzentration von 100ng RNA/µl. Als Kontrolle wurde noch

ein Ansatz mit Wasser anstatt RNA angesetzt. Anschließend erfolgte das Umschreiben der

RNA Fragmente in cDNA in einem C 1000 Thermal Cycler der Firma Bio-Rad®. In Tabelle

2 ist das verwendete Temperaturprogramm angeführt. Die gewonnene cDNA wurde bis zur

weiteren Verwendung bei -20°C im Gefrierschrank gelagert.

Tabelle 1: Zusammensetzung der Reaktionslösung für die cDNA Synthese

Bezeichnung Volumen pro Ansatz in µl

10x RT Buffer 2,0

25x dNTP Mix (100mM) 0,8

10x RT Random Primers 2,0

MultiscribeTM Reverse Transcriptase 1,0

Nucleasefreies Wasser 4,2

Gesamtvolumen 10

18

Tabelle 2: Temperaturprogramm verwendet in der cDNA-Synthese

Zeit Temperatur [°C]

10min 25

120min 37

5sec 85

Bis zur Entnahme 4

2.5.3 Quantifizierung der Expression Sarkosin-metabolisierender

Enzyme mittels qPCR.

Die Quantifizierung von DMGDH, SARDH und GNMT erfolgte mittels qRT-PCR durch

Verwendung von predesigned Taqman Assays (DMGDH: Assay ID Hs00919744_m1,

SARDH: Assay ID Hs00990344_m1, GNMT: Assay ID Hs00219089_m1, Applied

Biosystems/Thermo Fisher). Dabei wurde die zuvor in cDNA umgeschriebene mRNA als

Probe verwendet. Diese wurde dazu 1/20 verdünnt und das entsprechende Aliquot (20ng) in

einer PCR-Platte vorgelegt. Zu dieser Menge cDNA wurden die in Tabelle 3 angeführten

Komponenten hinzugegeben um die Reaktion starten zu können. Als Bezugsgröße und

Vergleich diente die parallele Analyse von 18S-RNA. Nach Zugabe aller Komponenten

wurde die PCR-Platte mit PCR Plate Seal versiegelt und 1 min bei 1000x g zentrifugiert.

Anschließend erfolgte die Amplifikation mittels PCR in einem C 1000 Thermal Cycler mit

CFX 96 Real Time System der Firma Bio-Rad®. Bei der Kontrolle wurden alle Substanzen

bis auf das Enzym zugegeben. Das Temperaturprogramm der PCR ist Tabelle 4 zu

entnehmen.

Tabelle 3: Zusammensetzung der PCR-Reaktionslösung

Bezeichnung Volumen pro Ansatz in µl

20x Gene Expression Assay 0,5

2x TaqMan Mastermix 5

cDNA 20ng 4

Wasser 0,5

19

Tabelle 4: Temperaturprogramm qPCR

Zeit Temperatur [°C]

1. 10min 95

2. 15sec 95

3. 1min 60

Zyklen (2. – 3.) 45x

Die Darstellung der Ergebnisse erfolgte als Cq-, Cq und Cq Werte (Tabelle 5). Beim

Cq Wert wird vom Cq Wert des Zielgens der Cq Wert des Housekeeping Gens (in diesem

Fall 18S RNA) abgezogen (Formel 1). Je größer der erhaltene Cq Wert eines untersuchten

Gens ist, umso geringer ist die Expression dieses Gens. Die relative Expression lässt sich

nach Einsetzen in Formel 2 berechnen. Neben Cq und Cq lässt sich auch noch der relative

Expressionsunterschied mittels Cq berechnen (Formel 3). Durch Einsetzen in Formel 4

ergibt sich dann der relative Expressionsunterschied zwischen den Proben mit einer Probe

als Bezugsgröße.

Tabelle 5: Berechnung von ∆Cq, relativer Expression, ∆∆Cq und des relativen

Expressionsunterschieds

Nummer Formel

1 ∆𝑪𝒒 = 𝑪𝒒(𝒁𝒊𝒆𝒍𝒈𝒆𝒏) − 𝑪𝒒(𝟏𝟖𝑺)

2 𝒓𝒆𝒍𝒂𝒕𝒊𝒗𝒆 𝑬𝒙𝒑𝒓𝒆𝒔𝒔𝒊𝒐𝒏 = 𝟐−∆𝑪𝒒

3 ∆∆𝑪𝒒 = ∆𝑪𝒒(𝑷𝒓𝒐𝒃𝒆) − ∆𝑪𝒒(𝑩𝒆𝒛𝒖𝒈𝒔𝒑𝒓𝒐𝒃𝒆)

4 𝒓𝒆𝒍𝒂𝒕𝒊𝒗𝒆𝒓 𝑬𝒙𝒑𝒓𝒆𝒔𝒔𝒊𝒐𝒏𝒔𝒖𝒏𝒕𝒆𝒓𝒔𝒄𝒉𝒊𝒆𝒅 = 𝟐−∆∆𝑪𝒒

2.6 Analyse der Expression Sarkosin metabolisierender Enzyme

in Abhängigkeit von Androgenstimulation

Für diesen Versuch wurden Zellen des Typs DU-145 (Androgenrezeptor negativ) und

LNCaP (Androgenrezeptor positiv) verwendet. Dazu wurden 106 Zellen in 25cm2

Kulturflaschen ausgesät und über Nacht inkubiert um ein Anhaften der Zellen zu

gewährleisten. Am nächsten Tag erfolgte der Austausch des Mediums und die Stimulation

der Zellen mit Androgenen (100µM Testosteron bzw. 100µM Dihydrotestosteron/Sigma-

Aldrich) oder mit Epidermal Growth Factor (2µg/ml rekombinantes EGF, Biolegend). Da

20

die Androgene in Dimethylsulfoxid (DMSO, Sigma-Aldrich) gelöst wurden, wurde als

Vektorkontrolle jeweils ein Flask nur mit DMSO behandelt. Als weitere Kontrolle dienten

Zellen ohne Zusatz von weiteren Substanzen. Die Androgen-Lösungen wurden vor dem

Zusatz zur Zellkultur sterilfiltriert (0,2µm Porengröße). Die Inkubation der Zellen nach

Zugabe der Androgene bzw. EGF erfolgte für 48h im Brutschrank. Nach 48h wurde das

Zellkulturmedium abgesaugt und die Zellen in den Flasks bei -20°C bis zur weiteren Analyse

gelagert. Die Analyse der mRNA-Expression von DMGDH, SARDH und GNMT nach

Androgen bzw. EGF Stimulation erfolgte auf Ebene der mRNA mittels qPCR.

2.7 Mitochondrienfärbung mittels MitoRed®

Es wurden die Mitochondrien der Zelllinie DU-145 analysiert. Diese wurden dazu in

schwarzen 24 Well Klarbodenplatten (Biozym, Wien, Österreich), optimiert für

Fluoreszenzfärbungen kultiviert. Die Färbung der Mitochondrien erfolgte mit MitoRed von

Sigma-Aldrich®, die Kernfärbung wurde mittels Höchstfärbung realisiert. Es wurden pro

Well 5x104 Zellen (DU-145 Wildtyp versus DU-145 DMGDHsH-Klone) in einem Volumen

von jeweils 500µl Medium ausgelegt. Als Verdampfungsfalle wurden jeweils 500µl Wasser

in die übrigen leeren Wells gegeben.

Entsprechend der Herstellerangaben wurde eine 1mM MitoRed Lösung in DMSO

hergestellt. Die Zielkonzentration im Medium betrug 100nM. Weiters wurden noch

0,5µl/Well Höchst 33342-Reagenz (Molecular Probes/Thermo Fisher) für die Anfärbung der

Zellkerne zugesetzt. Anschließend erfolgte die Inkubation der Zellen laut Herstellerangaben

und eine Auswertung der Fluoreszenz mit einem ZOE Fluoreszenzmikroskop von Bio-

Rad®.

2.8 Messung der Zellproliferation mit WST-1-Assay

Die aus der Zellernte gewonnene Zellsuspension wurde am CASY Zellzähler vermessen und

so verdünnt, dass eine Suspension mit 3x104 Zellen/ml erhalten wurde. Daraus wurden in

jedes Well einer 96 Well-Platte jeweils 100µl dieser Lösung pipettiert was einer

Konzentration von 3x103 Zellen/Well entspricht. In den Wells an den Rändern der Platte

wurde keine Zellsuspension, sondern jeweils 100µl Wasser als Verdampfungsfalle

eingefüllt. Die Auswertung erfolgte nach 24h, 48h und 72h. Nach Inkubation der Zellen

entsprechend den angegebenen Zeitspannen wurden pro Well 10µl WST-1-Reagens (Roche,

Mannheim, Deutschland) zugegeben und die jeweilige Platte für 60min im Brutschrank

inkubiert. Die Messung erfolgte danach photometrisch bei 450nm mit dem Tecan Sunrise

21

Photometer. Die Messungen pro Versuch erfolgten in Triplikaten. Um die Ergebnisse der

einzelnen Experimente besser vergleichen zu können, wurden die erzielten Messwerte auf

den Zeitpunkt 24h (=100%) bezogen.

2.9 Messung der Zellmigration mit Wound-healing Assay

Um die Zellmigration der DU-145 DMGDHsH-Klone beurteilen zu können, wurde auf die

Methode Wound-Healing Assay zurückgegriffen. Im klassischen Wound-Healing Assay

wird in einem Zellrasen mit einer Pipettenspitze eine „Wunde“ (wound) erzeugt. Über einen

gewissen Zeitraum wird nun das Schließen der Wunde beobachtet, was in erster Linie vom

Migrationsverhalten der Zellen abhängt. In unserem Setting wurde jedoch keine „Wunde“

erzeugt, sondern ein System von IBIDI® (Martinsried, Deutschland) verwendet. Es handelt

sich dabei um eine Zweikammer-Silikon Form welche in ein Well eingesetzt wird und

danach mit Zellsuspension befüllt wird. Die Zellen haften sich an den Boden der Platte,

jedoch trennt eine Wand die beiden Kammern voneinander und verhindert so die

Ansiedelung der Zellen in diesem Bereich. Es entsteht ein zellfreier Streifen der nach

Entfernung des Inserts von Zellen besiedelt werden kann. Wie schnell die Zellen diese

Fläche bedecken hängt von der Zellmigration ab. Je mehr Fläche pro Zeiteinheit abgedeckt

wird, desto höher die Zellmigration.

22

Abbildung 2: Schematische Darstellung des IBIDI®-Systems. Zunächst wird die IBIDI® Silikonform mit einer Pinzette in ein Well eingesetzt (1). Anschließend erfolgt die Befüllung der beiden Kammern mit jeweils 70µl Zellsuspension (2). Nach Inkubation über Nacht haften sich die Zellen am Boden der Zellkulturplatte an und die IBIDI®-Form kann entfernt werden (3). Nach Auffüllen des Wells mit Medium können die Zellen den freien Raum zwischen den beiden Feldern besiedeln (4). Wie schnell diese Besiedelung erfolgt hängt in erster Linie von der Zellmigration ab.

Die IBIDI® Silikonkammern wurden in einer 24 Wellplatte platziert. Dabei war darauf zu

achten, dass guter Kontakt zwischen dem Boden der Silikonform und dem Boden der Platte

gewährleistet war um ein Auslaufen der Zellsuspension in den zellfreien Bereich zu

verhindern. Die durch Trypsinierung gewonnene Zellsupension wurde am CASY gemessen

und derart verdünnt, dass eine Suspension mit einer Konzentration von 4,71x105 Zellen/ml

erhalten wurde. Jeweils 70µl dieser Zellsuspension wurden in die beiden Kammern der

Inserts pipettiert. Anschließend wurde die Platte über Nacht im Brutschrank inkubiert um

die Adhäsion der Zellen zu ermöglichen. Danach wurden die Inserts entfernt und die Wells

mit 1ml Medium gespült. Anschließend wurde pro Well 1ml Medium mit 1% FBS zugesetzt.

Bei manchen Proben wurde als Kontrolle 10ng/ml EGF zugesetzt um die Migration der

Zellen zu stimulieren. Die Auswertung der Migration erfolgte mittels ZOE

Fluoreszenzmikroskop zum Zeitpunkt t=0 (Wegnahme der Inserts), t=6h, t=12h und t=18h.

Um zu gewährleisten, dass immer dieselbe Stelle fotografiert wurde, erfolgte eine

Markierung an der Unterseite der 24 Well Platte. Die Auswertung der Bilder und die

Quantifizierung der Migration der Flächen erfolgte mit Paint und ImageJ. Dazu wurde der

Prozentsatz der zellfreien Oberfläche gegen die Zeit aufgetragen. Pro DMGDHSh-Klon

wurden jeweils drei unabhängige Versuche durchgeführt.

23

2.10 Messung der intrazellulären Sarkosinkonzentration mit

HPLC

Die Messung von Sarkosin in der Zellsuspension erfolgte mit einem stable-isotope-dilution-

assay und high performance liquid chromatography (HPLC) in Kombination mit einem

Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometer auf einem Voyager TSQ Quantum triple

Quadrupol, ausgerüstet mit einem Ultimate 3000 chromatography System (Thermo

Instruments, San Jose, Californien). Sarkosin wurde nach der Derivatisierung mit

Phenylisothiocyanat (PITC) mit einer Phenomenex Zorbax Eclipse XDB-C18 (100 x 3mm,

3,5µm) Säule mit einem linearen Gradienten (mobile Phase A: 0,2% Ameisensäure, v/v und

B: 0,2% Ameisensäure in Acetonitril, v/v) bei einem flow von 0,5ml/min bei einer

Temperatur von 30°C getrennt. Sarkosin und der interne Standard (Sarkosin-d3

hydrochlorid, Toronto Research Chemicals, Canada) wurden durch ein multiple reaction

monitoring (MRM) quantifiziert. Das Sarkosin-Isomer Alanin konnte chromatographisch

gut abgetrennt werden.

2.11 Statistische Verfahren

Die Daten wurden als Mittelwerte plus/minus Standardabweichung dargestellt.

Signifikanztestung erfolgte mittels ANOVA. Ein p-Wert von p<0,05 wurde dabei als

signifikant eingestuft. Für graphische Darstellungen von Kurven und Diagrammen wurde

Microsoft Excel 2016, für Signifikanztestung das Programm SigmaPlot 11.0 verwendet.

24

3 Ergebnisse

3.1 DMGDH wird in den Zelllinien LNCaP, PC-3 und DU-145

exprimiert

Zunächst galt es zu bestimmen ob und wie viel DMGDH in den PCa Zellen exprimiert wird.

Der Nachweis der DMGDH-Expression wurde mittels qPCR, indirekter Immunfluoreszenz

und Western-Blotting realisiert. Es konnte gezeigt werden, dass DMGDH in den

verwendeten PCa-Zelllinien zumindest schwach exprimiert wird. Die qPCR-Experimente

zeigten in den PCa-Zellen Cq-Werte für die DMGDH von ≥35 und daraus sehr hohe

resultierende ∆Cq-Werte bezogen auf die Expression der 18sRNA (Abb. 3).

Die Immunfluoreszfärbung (Abb. 4) wies auf Expression der DMGDH in allen drei

getesteten Zelllinien hin, da in allen Zelllinien ein Fluoreszenzsignal detektiert werden

konnte. Der versuchte Nachweis der Expression der DMGDH mittels Western-Blotting

zeigte jedoch kein spezifisches Ergebnis (Abb. 5). Nach Inkubation mit dem Anti-DMGDH

Primärantikörper und anschließender Visualisierung mit Peroxidase-markiertem

Sekundärantikörper und Chemilimineszenz konnte kein Signal auf der Laufhöhe von

100kDa (Molekulargewicht der DMGDH: 97kDa) beobachtet werden. Als Positivkontrolle

wurde im Western-Blotting Assay aufgereinigte humane DMGDH mitgeführt, die ein

spezifisches Signal auf der Höhe von 100kDa zeigte.

Abbildung 3: Quantifizierung der DMGDH-Expression in PCa-Zelllinien. Dargestellt sind die ∆Cq-Werte inklusive Standardabweichung (resultierend aus jeweils drei technischen Replikaten) aller drei analysierten Zelllinien. Als Referenz diente 18sRNA. Je höher die ∆Cq-Werte, desto geringer die Enzymexpression. In diesem Fall sind die ∆Cq-Werte alle >24 (PC-3: ∆Cq= 26,31±0,30, LNCaP: ∆Cq= 25,58±0,51, DU-145: ∆Cq= 24,05±0,77), was für eine geringe Expression der DMGDH in den analysierten Zelllinien spricht.

25

Abbildung 4: Nachweis der DMGDH-Expression in humanen PCa-Zelllinien mittels indirekter Immunfluoreszenz. Blau: DAPI Kernfärbung, Orange: indirekte DMGDH Färbung. Originale Vergrößerung 630x. Links ist der jeweilige Testansatz, rechts die jeweilige dazugehörige Negativkontrolle (Ansatz ohne Primärantikörper) dargestellt. Da die Zellen eine unterschiedliche Zellmorphologie (DU-145: flach ausgebreitet versus LNCaP: spindelförmig, PC-3: teils spindelförmig teils ausgebreitet) aufweisen und die Belichtungszeit bei der mikroskopischen Analyse unterschiedlich eingestellt wurde, ist eine Aussage zur etwaigen Expressionsunterschieden nicht

26

möglich. Wie in der Negativkontrolle erkennbar, konnte kein unspezifisches Signal des Sekundärantikörpers beobachtet werden.

Abbildung 5: Versuch des Nachweises der DMGDH in DU-145 und LNCaP Wildtypzellen mittels Western-Blotting Assay. A: Als Proben wurden LNCaP Wildtypzellen (Position 1) und DU-145 Wildtypzellen (Position 2) analysiert. Weiters wurden Klone mit stabilem Silencing der DMGDH (DMGDHsH) DU-145 Klon 3 (Position 3), DU-145 Klon 5 (Position 4), DU-145 Klon 6 (Position 5) und DU-145 Klon 10 (Position 6) aufgetragen. Die Probe DU-145 ShControl ist auf Position 8 aufgetragen. Als Referenz diente reine DMGDH (Position 10) und ein Lysat der Leberzelllinie HepG2 (Position 9). Der Nachweis von reiner DMGDH zeigt eine Bande bei 100kDa. Die Zellproben hingegen zeigen ein Signal bei etwa 40kDa. B: Als Loading-Kontrolle wurde α/β-Tubulin verwendet. Die Reihenfolge der Proben ist ident mit jener von A. Es zeigen sich Banden bei 55kDa, was dem Molekulargewicht von α-Tubulin entspricht. Der Molekulargewichtsstandard mit dessen Hilfe das Molekulargewicht der Banden bestimmt wurde, wurde auf Position 7 aufgetragen, ist jedoch am Blot nicht sichtbar.

3.2 Erfolgreiches Silencing der DMGDH-Expression in PCa-Zellen

Insgesamt konnten in der DU-145-Zelllinie 12 Klone, in der PC-3-Zelllinie 14 Klone und in

der LNCaP-Zelllinie 6 Klone mit Resistenz gegenüber dem Selektionsantibiotikum

Puromycin gewonnen werden. Um zu verifizieren, ob in diesen stabilen Klonen auch ein

Silencing der DMGDH vorlag, wurde die DMGDH-Immunfluoreszenzfärbung als

Screeningmethode (Abb. 6) gewählt. DMGDH-qPCR wurde als Bestätigungs-Assay

eingesetzt. In der Immunfluoreszenzfärbung wurde eine Intensitätsminderung des DMGDH-

Signals als Verminderung der Expression gedeutet. Alle generierten Zellklone wurden dabei

jeweils einer Doppeluntersuchung unterzogen. Bei zweimaliger beobachteter

Intensitätsminderung wurden die Klone für eine PCR Untersuchung selektioniert. In den

Zelllinien DU-145 und PC-3 konnten jeweils 5 Klone mit offensichtlicher Downregulation

der DMGDH-Expression identifiziert werden (Abb. 6). In der LNCaP-Zelllinie konnte

jedoch kein einziger Klon mit verminderter DMGDH-Expression gefunden werden (Abb.

6). Schon das Anzüchten von LNCaP-Zellklonen gestaltete sich nach Transfektion bzw.

27

Selektion schwierig, da sich LNCaP-Einzelzellen in Zellkulturplatten nur sehr schlecht

vermehren lassen.

Der Nachweis des Silencings der DMGDH in der DU-145-Zelllinie mittels Western-Blotting

zeigte dieselben Ergebnisse wie schon beim Nachweis von DMGDH in den Wildtyp-Zellen.

Bei den Wildtyp-Zellen trat wiederum eine Bande bei etwa 40kDa auf, bei den getesteten

DMGDHsH-Klonen – jedoch auch bei der sH-Kontrollzelllinie-nicht (Abb. 6)

Die qPCR-Untersuchung der DU-145 Klone mit dem offensichtlich effektivsten Silencing

(Abb. 7) zeigte eine teils sehr starke Verminderung der DMGDH-Expression (obwohl

ohnehin schon sehr schwach exprimiert) im Vergleich zum Wildtyp. Interessanterweise

zeigte der DU-145 DMGDHSh-Klon 2 keine Verminderung der DMGDH mRNA-

Expression. Es muss jedoch erwähnt werden, dass jeweils nur eine PCR-Untersuchung

durchgeführt wurde.

28

Abbildung 6: Nachweis des Silencings der DMGDH in humanen PCa-Zelllinien auf Proteinebene. A: DMGDH-Immunfluoreszenzfärbung von PCa Zellen nach DMGDH-Silencing mittels sHRNA. Als repräsentative Beispiele sind einzelne DMGDHsH Zellklone der Zelllinien PC-3, DU-145 und LNCaP im direkten Vergleich zu den jeweiligen Wildtyp-Zellen gezeigt. Im Gegensatz zu den DU-145 und PC-3-Zellen konnten keine LNCaP-Klone mit verminderter Fluoreszenzintensität in der DMGDH-Färbung identifiziert werden. Alle mikroskopischen Fotos wurden jeweils mit derselben Belichtungszeit aufgenommen. Blau: DAPI Kernfärbung, Orange: indirekte DMGDH-Färbung. DU-145/PC-3: Originale Vergrößerung: 400x, LNCaP: 200x. B: Western-Blotting nach Silencing der DMGDH mit DU-145-Zelllysaten. I: Aufgetragen sind Lysate von DMGDHsH Klon 3 (Pos. 1), Klon 5 (Pos. 2), Klon 6 (Pos. 3) und Klon 10 (Pos. 4) im Vergleich zu den Wildtyp Zellen (Pos. 5) und der ShControl (Pos. 7). Weiters wurde ein Proteinstandard zur Größenbestimmung (Pos. 6) und reine

29

DMGDH (Pos. 8) als Positivkontrolle verwendet. Da der Größenstandard durch keine Immunfärbung sichtbar gemacht wurde, wurden die Standardbanden aus der Ponceau S Färbung nachträglich in die Abb. eingefügt. DMGDH besitzt ein Molekulargewicht von 97kDa. Bei den Klonen ist auf der Höhe von 100kDa keine Bande erkennbar, beim Wildtyp hingegen zeigt sich eine Bande bei etwa 40kDa. II: Nachweis von α/β-Tubulin als Loading Control. Die Reihenfolge der Proben entspricht jener in A. Zu erkennen sind Banden bei 55kDa, was dem Molekulargewicht von α/β-Tubulin entspricht. III: Färbung der Membran mit Ponceau S. Zu erkennen ist auf Position 6 der Größenstandard.

Abbildung 7: Quantifizierung der DMGDH-Expression in DU-145 Zellen mittels qPCR nach Silencing mit sHRNA. Dargestellt ist die relative Expression der DMGDH bezogen auf 18sRNA der DU-145 DMGDHsH-Klone. Die DMGDH-Expression der Klone wurde in Verhältnis zum Wildtyp gesetzt. Es zeigt sich eine deutliche Verminderung der DMGDH-Expression nach Knockdown bei den DMGDHsH-Klonen 3, 5, 6 und 10 (DMGDHsH-Klon 3: 0,056±0,042, DMGDHsH-Klon 5: 0,0019±0,00074, DMGDHsH-Klon 6: 0,057±0,030, DMGDHsH-Klon 10: 0,022±0,0087). Beim DMGDHsH-Klon 2 konnte keine Verminderung der DMGDH-Expression gemessen werden (DMGDHsH-Klon 2: 1,1±0,41,). Die eingezeichnete Standardabweichung resultiert aus jeweils drei technischen Replikaten eines Versuchsansatzes.

3.3 Ergebnisse der Messung der Expression von SARDH und

GNMT nach Silencing der DMGDH

Ziel dieses Versuches war es zu beobachten, ob sich durch das Silencing der DMGDH auch

die Expression der GNMT und SARDH verändert, was auf ein eventuelles

Kompensationsverhalten in Bezug auf den Sarkosin-Metabolismus von PCa-Zellen

schließen lassen würde. Abb. 8 zeigt die SARDH und GNMT-Expression nach Silencing

der DMGDH. Entsprechend den Erwartungen führt eine Verminderung der DMGDH-

Expression zu einer Downregulation der SARDH-Expression. Interessanterweise führt das

Silencing der DMGDH jedoch auch zu einer Verminderung der GNMT Expression.

30

Abbildung 8: Relative Expression von GNMT und SARDH nach Silencing der DMGDH. Dargestellt ist die relative Expression von GNMT und SARDH nach Silencing der DMGDH in DU-145 DMGDHsH-Zellen. Als Bezugsgröße diente der Wildtyp. Die eingezeichnete Standardabweichung resultiert aus jeweils drei technischen Replikaten eines Versuchsansatzes.

3.4 Ergebnisse der Messung der Expression Sarkosin

metabolisierender Enzyme nach Androgenstimulation

Wie aus der Literatur bekannt [49], kann die Expression der GNMT durch Androgene

induziert werden. Da jedoch bezüglich Androgenstimulation von PCa-Zellen und DMGDH

noch keinerlei Informationen vorhanden waren, wurde ein Versuch durchgeführt um den

Einfluss von Androgenen auf die DMGDH-Expression in LNCaP-Zellen die den

Androgenrezeptor exprimieren zu erörtern. Um einen möglichen Link von EGF-Signaling

mit dem Sarkosin-Haushalt der PCa-Zellen zu überprüfen, wurden die PCa-Zellen auch mit

EGF stimuliert. Um unspezifische Reaktionen ausschließen zu können, wurde als Referenz

eine Androgen-unabhängige Zelllinie (in diesem Fall DU-145) verwendet. Es zeigte sich,

dass durch Stimulation der LNCaP-Zellen mit Testosteron bzw. Dihydrotestosteron die

Expression der GNMT um das Zehnfache anstieg, während es bei den DU-145-Zellen zu

keiner Änderung der GNMT-Expression kam (Abb. 9). EGF hatte in beiden Zelllinien

keinen offensichtlichen Einfluss auf die Expression der GNMT.

Im Gegensatz zur GNMT konnte bei der DMGDH keine spezifische Regulation der mRNA-

Expression durch Androgene (und EGF) nachgewiesen werden. Es kam zwar zu einer

scheinbaren Up-Regulation der Expression der DMGDH durch Androgene; jedoch sowohl

in Anwesenheit (LNCaP), als auch in Abwesenheit (DU-145) des Androgenrezeptors, was

einer Androgenrezeptor-abhängigen Regulation der DMGDH-Expression widerspricht.

Eine Induktion/Repression der SARDH-Expression durch Androgene oder EGF konnte

ebenfalls nicht nachgewiesen werden.

31

Abbildung 9: Androgenabhängigkeit der Expression Sarkosin-metabolisierender Enzyme in humanen PCa-Zellen. LNCaP (A, Androgenrezeptor positiv) und DU-145 (B, Androgenrezeptor negativ) wurden 24h mit Testosteron (T, 100µM), Dihydrotestosteron (DT, 100µM) oder Epidermal Growth Factor (EGF, 2µg/ml) behandelt. Die mRNA-Expression der Sarkosin-metabolisierenden Enzyme Glycin-N-methyltransferase (GNMT), Dimethylglycindehydrogenase (DMGDH) und Sarkosindehydrogenase (SARDH) wurde mittels qPCR bestimmt. Der Balken der DMGDH-Expression in LNCaP-Zellen (A) nach Dihydrotestosteron-Behandlung wurde abgeschnitten, da der gemessene Wert mehr als 10mal so hoch ist (240,5±137,2).

3.5 Visualisierung der Mitochondrien mittels MitoRed® in DU-145

DMGDHsH-Klonen

Da es sich bei der DMGDH um ein mitochondriales Enzym handelt, wurde analysiert, ob

sich durch das Silencing der DMGDH die Morphologie der Mitochondrien, die

mitochondriale Masse bzw. die Distribution der Mitochondrien in den DU-145-Zellen

ändert. Für diesen Zweck wurden die Zellen mit MitoRed® gefärbt und mit dem ZOE-

Fluoreszenzmikroskop analysiert (Abb. 10). Es zeigte sich hier das typische Bild der

Mitochondrien – teils vesikuläre und vorwiegend tubuläre Strukturen im Cytosol der Zellen.

Im Vergleich zwischen den Wildtyp-Zellen und einzelnen DMGDHsH-Klonen sah man im

32

Fluoreszenzmuster keine erkennbaren Unterschiede, die auf Alterationen in Bezug auf

Morphologie bzw. Distribution der Mitochondrien in Folge des Silencings der DMGDH

hinweisen würden.

Abbildung 10: Vergleich der Mitochondrienlokalisation zwischen DU-145 Wildtypzellen und DMGDHsH-Klonen. Blau: Höchst Kernfärbung, Rot: Mitochondrienfärbung mittels MitoRed®. Gezeigt sind Zellen des DU-145 Wildtyps und des DMGDHsH-Zellklons 5. Dieser Zellklon wies im in der qPCR-Analyse den höchsten Silencingeffekt der DMGDH auf. Zu erkennen sind die teils vesikulären, vorwiegend jedoch tubulären Strukturen der Mitochondrien – sowohl beim Wildtyp als auch beim DMGDHsH-Zellklon. Es konnten keine Alterationen der Zellmorphologie oder der Mitochondrienverteilung beobachtet werden.

3.6 Das Silencing der DMGDH hat keinen Einfluss auf die

Zellproliferation

Ziel dieses Versuchs war es zu evaluieren, ob das Silencing der DMGDH Einfluss auf die

Proliferation der DU-145-Zellen hat.

Abb 11 zeigt das Ergebnis dieser Versuchsserie. Die Proliferationsrate der DMGDHsH-

Klone – indirekt gemessen durch Analyse der Stoffwechselaktivität über einen Zeitraum von

72 Stunden – unterschied sich nicht signifikant von jener des Wildtyps. Es konnte daher

weder eine Proliferationssteigerung noch eine Inhibition des Wachstums durch das

DMGDH-Silencing beobachtet werden.

33

Abbildung 11: Ergebnisse des WST-1-Proliferations-Assays von DU-145 Zellen mit Silencing der DMGDH. Dargestellt ist die relative Signalzunahme (Absorption bei 450nm) der einzelnen Zellproben. Neben dem Wildtyp (WT) wurde zum Vergleich auch die DU-145 sHControl (Sh) analysiert. Gemessen wurde jeweils nach 24h (blau), 48h (orange) und 72h (grau). Es zeigten sich keine signifikanten Unterschiede bezogen auf die Referenzen (Wildtyp bzw. sHControl). n=3

3.7 Das Silencing der DMGDH beeinflusst das

Migrationsverhalten der PCa-Zellen nicht

Neben dem Einfluss auf die Zellproliferation wurde ebenfalls ein Einfluss auf die

Zellmigration der PCa-Zellen durch das Silencing der DMGDH erwartet. Deshalb wurde das

Migrationsverhalten der DU-145 DMGDHsH-Klone mittels Scratch/Wound-Healing Assay

getestet (Abb. 12). Als Kontrolle wurden Wildtyp-Zellen bzw. Wildtyp-Zellen behandelt mit

EGF eingesetzt.

Abb. 13 zeigt das Migrationsverhalten der verschiedenen DU-145 Zellklone. Die Klone

zeigen keine Alterationen bezüglich des Migrationsverhaltens durch das Silencing der

DMGDH. Interessanterweise konnte eine (jedoch nicht signifikante) Steigerung der

Zellmigration nach EGF-Behandlung beobachtet werden.

34

Abbildung 12: Wound-Healing Assay mit DU-145 Zellen. Gezeigt sind Bilder der DU-145 sHControl beim Start des Experimentes (0h), 6h und 12h. Durch die Migration der Zellen wird die zellfreie Fläche (als Wound oder Scratch bezeichnet) immer kleiner und kann gegen die Zeit aufgetragen werden. In der oberen Reihe sind die unbearbeiteten Bilder ersichtlich, darunter werden jeweils dieselben Bilder mit den markierten Grenzen des Zelllayers gezeigt. Die markierte zellfreie Fläche wurde mittels ImageJ ausgewertet.

Abbildung 13: Ergebnisse des Wound-healing Assays mit DU-145 Zellen versus DU-145 DMGDH-sH-Klone. Dargestellt ist die zeitabhängige prozentuale Flächenabnahme der „Wunde“. Dazu wurde die Fläche zum Zeitpunkt 0 (blauer Balken), nach 6h (oranger Balken), nach 12h (grauer Balken) und nach 18h (gelber Balken) gemessen. Bei diesem Versuch wurde zur Kultur der Wildtyp-Zellen (WT) auch noch Epidermal Growth Factor (EGF) zugesetzt. Außerdem diente als zusätzliche Referenz noch die DU-145 sHControl-Zelllinie (Sh). Es zeigten sich keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich des Migrationsverhaltens der getesteten DMGDHsH-Klone (Klone 2, 3, 5, 6, 10) bezogen auf den WT. Jedoch ist der Trend erkennbar, dass mit EGF behandelte Zellen die freie Oberfläche schneller bedecken und somit eine beschleunigte Zellmigration aufweisen könnten. n=3

35

3.8 Messung der Sarkosinkonzentration nach DMGDH

Knockdown

Sreekumar et al. konnten zeigen, dass Veränderungen der GNMT-, bzw. der SARDH-

Expression Einfluss auf die Sarkosinkonzentration in PCa-Zellen haben [47]. Inwieweit die

DMGDH in PCa-Zellen an der Sarkosinsynthese beteiligt ist, wurde hingegen noch nicht

gezeigt. Bei diesem Versuch wurde daher der Sarkosin-Gehalt von DU-145 Wildtyp-Zellen

mit jenen der Puromycin-resistenten Zellklone verglichen und in Korrelation gesetzt mit der

Effizienz des Silencings der DMGDH. Außerdem wurden Wildtyp-Zellen aller drei

eingesetzten Zelllinien analysiert und die jeweiligen intrazellulären

Sarkosinkonzentrationen mit den anderen verwendeten Zelllinien verglichen.

In Abb. 14 sind die Ergebnisse der Messung der intrazellulären Sarkosinkonzentration der

einzelnen DMGDHsH-Klone dargestellt. Es zeigen sich keine Unterschiede bezüglich der

intrazellulären Sarkosinkonzentration in den Klonen im Vergleich zum Wildtyp in

Abhängigkeit von der Effizienz des Silencings. Die DU-145 Klone 1 und 3-12 zeigen eine

ähnliche intrazelluläre Sarkosinkonzentration im Vergleich zum Wildtyp. Nur der DU-145

DMGDHsH-Klon 2 zeigt eine deutlich erhöhte Sarkosinkonzentration im Vergleich zum

Wildtyp. Am wahrscheinlichsten lässt sich dieses Resultat dadurch erklären, da die Zellen

des DU-145 DMGDHsH-Klons 2 im Vergleich zum Wildtyp (WT) und anderen Zellklonen

ein deutlich größeres Zellvolumen bzw. Zelldurchmesser aufweisen (Durchmesser WT-

Zellen: etwa 30µm, Klon 2: etwa 50µm) und daher in Folge pro Zelle mehr Sarkosin

speichern können als kleinere Zellen.

36

Abbildung 14: Messung der intrazellulären Sarkosinkonzentration in DU-145 DMGDHsH-Klonen. Als Referenz dienten der Wildtyp (WT) und die ShControl (Sh). K1-K12 sind die jeweiligen DMGDHsH-Zellklone nach Selektion (Klon 1-Klon 12). Bei K3, K5, K6 und K10 konnte eine Verminderung der DMGDH-Expression mittels qPCR und Immuncytochemie bestätigt werden.

37

4 Diskussion

Ziel dieser Pilotstudie war es, die Rolle des Enzyms Dimethylglycindehydrogenase im

Sarkosinmetabolismus von Prostatakrebszellen zu charakterisieren, da rezente Studien

gezeigt hatten, dass das Metabolit Sarkosin mit der Aggressivität von Prostatakrebs

korreliert [47]. Wir konnten zeigen, dass in den humanen Prostatakrebszelllinien PC-3, DU-

145 und LNCaP DMGDH-Expression auf mRNA-Ebene vorhanden ist. Die Expression des

Enzyms war jedoch äußerst schwach ausgeprägt. Für den Nachweis der DMGDH auf

mRNA-Ebene wurde jedoch ein TaqMan®-basierendes Detektionssystem verwendet,

welches (im Gegensatz zu SYBR Green basierenden Systemen) eine sehr hohe Sensitivität

und Spezifität aufweist [56].

Der Nachweis der DMGDH in PCa-Zellen auf Proteinebene war jedoch inkonklusiv, da die

Immunfluoreszenz-Assays Expression der DMGDH in allen drei getesteten Zelllinien

suggerierten, jedoch ebenfalls durchgeführte Western Blotting-Experimente keinen

spezifischen Nachweis der DMGDH in den PCa-Zellen erbrachte. Es wurden in den PCa-

Proteinlysaten Banden bei 40kDa beobachtet, obwohl das DMGDH-Signal bei 100kDa zu

erwarten wäre. Als Positivkontrolle für den DMGDH Western-Blotting-Assay wurde

aufgereinigte humane DMGDH verwendet, die wie erwartet ein Signal bei 100kDa zeigte.

Dies legt nahe, dass die Western-Blotting-Methodik per se funktioniert hat. Eine

unspezifische Bindung des Antikörpers im Western Blotting Assay und wahrscheinlich auch

im Immunfluoreszenz-Assaykann daher nicht ausgeschlossen werden. Der verwendete

DMGDH-Antikörper kann laut Herstellerangaben sowohl für Immunfluoreszenz als auch

für Western-Blotting verwendet werden, was eine applikationsabhängige Limitation des

Antikörpers in Abhängigkeit der Konformation des Epitops ausschließt [57].

Interessanterweise konnte durch die Anwendung eines lentiviralen Systems zum Silencing

der DMGDH eine weitere Verringerung der Expression des Enzyms (obwohl schon in den

Wildtyp-Zellen sehr niedrig) - nachgewiesen werden. Bei 4 von 5 getesteten DU-145

DMGDHsH Klonen konnte bestätigt werden, dass die Expression der DMGDH sowohl auf

Protein- (Immunfluoreszenz) als auch auf mRNA-Ebene (qPCR) im Vergleich zum

jeweiligen Wildtyp erniedrigt war. Trotz des negativen gebliebenen Western-Blotting

Nachweises des Enzyms in den PCa-Zellen erhärtet dies die Spezifität des Versuchsansatzes.

Ottaviani et al. hatten bereits 2013 gezeigt, dass die Expression des Enzyms GNMT durch

Androgene reguliert wird [49]. Eine Regulation der Expression der DMGDH in PCa-Zellen

durch Androgene ist bislang in der Literatur noch nicht dokumentiert. Um die mögliche

38

Induzierbarkeit der DMGDH-Expression durch Androgene zu überprüfen wurden PCa-

Zellen (LNCaP und DU145-Zellen) mit Testosteron oder mit Dihydrotestosteron behandelt.

Es zeigte sich wie erwartet, dass die LNCaP-Zellen die den Androgenrezeptor exprimieren

mit einer Upregulation der DMGDH-Expression (mRNA-Level) reagieren, die

Androgenrezeptor-negativen DU145-Zellen jedoch nicht. Bei der DMGDH fand man keine

Androgen/Androgenrezeptor-abhängige Regulation, was nicht darauf schließen lässt, dass

die DMGDH-Expression abhängig von Androgenen ist.

Das Silencing der DMGDH führte weder zu einer Verminderung noch zu einer Erhöhung

der intrazellulären Sarkosinmenge. Nach Khan et al. führte die Überexpression des Sarkosin-

degradierenden Enzyms SARDH in PCa-Zellen in Bezug auf die intrazelluläre

Sarkosinkonzentration zum gleichen Effekt wie das Silencing des Sarkosin-produzierenden

Enzyms GNMT, nämlich zu einer Verringerung der Sarkosinkonzentration. Die

Überexpression von GNMT hingegen führt zu einer Erhöhung des intrazellulären

Sarkosinlevels [47]. Die DMGDH scheint demnach nur eine untergeordnete Rolle in Bezug

auf die Sarkosinsynthese in PCa-Zellen, zumindest in den analysierten PCa-Zellinien zu

spielen. Um zu testen, ob es durch das Silencing der DMGDH zu einer Änderung der

Expression der GNMT bzw. SARDH in den PCa-Zellen kommt, wurde die Expression

dieser Enzyme in den DMGDHsH-PCa-Klonen überprüft. Interessanterweise wurde durch

das Silencing der DMGDH in mehreren DMGDHsH-Klonen auch die Expression von

GNMT und SARDH vermindert. Damit konnte auch die Hypothese eines

Kompensationsmechanismus nach Silencing der DMGDH über eine mögliche Upregulation

der Sarkosin-produzierenden GNMT nicht bestätigt werden.

Weiters führte das Silencing der DMGDH hinsichtlich des Proliferations- und

Migrationsverhaltens der PCa-Zellen zu keinen Alterationen. Nach Khan et al. beeinflussen

GNMT und SARDH diese Parameter indirekt durch Erhöhung bzw. Verminderung der

intrazellulären Sarkosinkonzentration [47]. Aufgrund der Beobachtungen in unserer Studie,

dass die DMGDH keinen Einfluss auf die intrazelluläre Sarkosinkonzentration hat, erscheint

eine fehlende Alteration von Proliferation bzw. Migration als sehr wahrscheinlich, da diese

Parameter laut Khan et al. maßgeblich von der Sarkosinkonzentration abhängen.

Eine beschleunigte Zellmigration nach EGF-Stimulation konnte bislang nur bei Zellen der

PC-3 Zelllinie beobachtet werden [58]. Wie auch PC-3 Zellen exprimieren jedoch auch

39

Zellen der DU-145 Linie keinen Androgenrezeptor [53]. Auch wenn bei unseren Messungen

kein signifikantes Ergebnis vorlag, konnte dennoch ein Trend hinsichtlich beschleunigter

Zellmigration nach EGF Zugabe in DU-145 Zellen beobachtet werden. Mehr Experimente

müssen in Zukunft noch durchgeführt werden um die stimulierende Rolle von EGF auf das

Migrationsverhalten der DU145-Zellen weiter zu überprüfen, jedoch erscheinen die bis jetzt

gewonnen Resultate diesbezüglich durchaus plausibel. Bei PCas konnte nach antiandrogener

Therapie eine Überexpression des EGF-Rezeptors HER-2/neu in PCa-Zellen beobachtet

werden [20, 59]. Außerdem konnte gezeigt werden, dass ein direkt proportionaler

Zusammenhang zwischen Sarkosinkonzentration und EGFR-Expression besteht [22]. So

kann durch Erhöhen der intrazellulären Sarkosinmenge eine Expressionssteigerung von Her-

2/neu erreicht werden [22]. Die von uns gemessenen sehr hohen Sarkosinkonzentrationen in

Zellen der DU-145 Linie im Vergleich zu LNCaP Zellen wären demnach mit diesem

Umstand vereinbar. Die Frage ob die Androgen-Unabhängigkeit (inklusive Steigerung der

EGFR-Expression) als Folge der hohen Sarkosinkonzentration anzusehen ist oder ob die

hohe Sarkosinkonzentration die Folge der Androgen-Unabhängigkeit ist konnte diese Studie

nicht beantworten.

Um einen eventuellen Zusammenhang zwischen dem EGF-Signalling und dem Sarkosin-

Metabolismus zu finden, wurde überprüft, ob sich die Expression Sarkosin-

metabolisierender Enzyme in Antwort auf EGF in DU-145 Zellen ändert. Dies war nicht der

Fall, was auf keine transkriptionelle Kontrolle durch EGF auf Sarkosin-metabolisierende

Enzyme hindeutet. Zukünftige Versuche müssen noch klären ob EGF einen Einfluss auf den

intrazellulären Sarkosingehalt hat.

Weiters gilt es zu klären, welche Auswirkungen der Entzug von Nährstoffen auf den

Sarkosinmetabolismus im Allgemeinen und speziell auf die Enzymexpression der DMGDH,

SARDH und GNMT hat, da bei den in dieser Studie verwendeten Nährmedien ein

Nährstoffüberangebot vorhanden war. PCa-Zellen könnten Sarkosin in Zeiten mit

vermindertem Nährstoffangebot als Methylquelle bzw. Aminosäurequelle verstoffwechseln.

Dazu könnte die Expression der im Sarkosinmetabolismus beteiligten Enzyme beeinflusst

werden. Zukünftige Versuche könnten diesen Aspekt genauer untersuchen.

Aufgrund der Forschungsergebnisse von Khan et al. und Sreekumar et al. wurde Sarkosin

bereits als neuer PCa-Tumormarker vorgeschlagen. Allerdings lieferten weiterführende

Studien widersprüchliche Ergbnisse [35, 37, 47, 60, 61] und Sarkosin ist nach wie vor kein

klinisch genutzer Parameter für die Diagnosestellung eines PCa. Obwohl die bisherigen

Ergebnisse einen Zusammenhang zwischen Sarkosin und PCa nahelegen, konnten die

40

Details der Rolle von Sarkosin im Tumormetabolismus noch nicht endgültig geklärt werden.

Außerdem konnte, wie schon bei einer früheren Studie gezeigt wurde [36], durch die

Analyse der Sarkosinkonzentration in Urin und/oder Serum nur unter bestimmten

Voraussetzungen ein Vorteil in der Diagnostik gegenüber der bisherigen PSA Bestimmung

erreicht werden. Ankerst et al. untersuchten die Datenlage erneut und kamen zu

widersprüchlichen Ergebnissen. In ihrer Studie aus dem Jahr 2015 kamen sie

zusammenfassend zum Schluss, dass die Serumbestimmung von Sarkosin nicht als

Screeningmethode zur PCa-Früherkennung verwendet werden sollte. Zusätzlich raten die

Autoren Sarkosin trotz der Datenlage aus früheren Studien nicht weiter als Tumormarker zu

verfolgen [60]. Lima et al. verwiesen in ihrer Studie auf die Schwierigkeiten der Auswertung

der gewonnenen Daten beiMetabolomics-Studien. Problematisch wären die enormen

Datenmengen und die statistische Aufbereitung bzw. Auswertung dieser. Weitere

Fehlerquellen würden Probenvorbereitung und analytische Methoden betreffen. In Summe

betrachtet würden diese Umstände die Inhomogenität der erzielten Studienergebnisse

unterschiedlicher Arbeitsgruppen erklären so die Autoren [62].

Letztlich stellt sich die Frage wie wichtig die DMGDH für den Sarkosinmetabolsimus von

PCa Zellen wirklich ist. Aufgrund der von uns gewonnenen Daten scheint die DMGDH eine

eher untergeordnete bis gar keine Rolle im Sarkosinmetabolismus in den von uns

verwendeten PCa-Zelllinien zu spielen. Trotzdem muss auf den Umstand hingewiesen

werden, dass es sich bei dem von uns verwendeten Modell um ein in vitro Modell handelt.

Die Daten können demnach nicht einfach auf solide Tumoren im menschlichen Organismus

übertragen werden. Die DMGDH ist zwar in den von uns verwendeten PCa-Zellen

vorhanden jedoch hat ein Wegfall dieses Enzyms keine Auswirkungen auf Survival,

Migration, Proliferation, intrazelluläre Sarkosinkonzentration und Zellmorphologie. Ob ein

solches Verhalten auch im in vivo Modell beobachtet werden kann müssen künftige Studien

klären.

41

42

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47

48

Anhang - Lösungen

Calcium- und Magnesiumfreier Phosphatpuffer

(CMF-PBS)

8g NaCl

0,3g KCl

2g Glukose-Monohydrat

91,4g Dinatriumdihydrogenphosphat Dihydrat

0,02g Kaliumdihydrogenphosphat

Ad H2O auf 1L

pH-Wert 7,4

Tris-buffered saline Konzentrat (TBS 10x)

24g Tris-HCl

5,6g Tris-Base

88g NaCl

Ad H2O auf 1L

pH-Wert 7,6

Tris-buffered saline, Tween 20 (TBST-Puffer)

100ml TBS 10x

900ml H2O

500µl Tween 20

RIPA Puffer

50mM Tris-HCl, pH 8

150mM NaCl

1% NP-40

0,5% Natriumdeoxycholat

0,1% SDS

NP-40 Puffer

20mM Tris-HCl, pH 8

137mM NaCl

10% Glycerol

1% NP-40

2mM EDTA

Western Blotting Running buffer (5x)

15g Tris

71g Glycin

2g Glukose-Monohydrat

1,68g EDTA Dihydrat

6,25ml SDS

Ad H2O auf 1L

49

Western Blotting Transfer buffer (10x)

30g Tris

140g Glycin

Ad H2O auf 1L

Western Blotting Transfer buffer (1x)

100ml 10x Transfer buffer

100ml Ethanol 96%

100ml Methanol

Ad H2O auf 1L

Ponceau S Lösung

0,2% Ponceau S

3% TCA

50

Anhang – ISC Poster

Ergebnisse der Studie wurden am Internationalen Student Congress (ISC) 2016 in Graz in

Form eines Posters präsentiert. Das Poster wurde außerdem als beste Posterpräsentation

ausgezeichnet.