Zentralinstitut f i b Ern!Wung in Potsdam-Rehbrlicke (Direktor: Prof. Dr. H. Haenel), Fmschungseentrum fib Molekularbiologie und Medizin, Akademie der Wissenschaften der DDR

CHARAKTERISIERUNG DES SPALTUNGSMFiCHANISMUS DER PEgTINESTERASE AUS ASPERGILLUS NIGER (Wissenschaftlicher Kurzbericht)

G. Dongowski und W. Bock

Bei der Spaltung der Methylesterbindungen im Pektin durch Pektinesterase (PE; EC 3.1.1.11) entstehen bekanntlich im Substratmolektil Bl6cicbe aus unveresterten Galaktu- ronsilure-Einheiten (1-3). Der von bestimmten freien Carboxylgruppen ausgehende Ein- kettenmechanismus gilt fir pflanzliche Pektinesterasen als weitgehend gesichert. Dem- gegentiber erfolgt die partielle Entesterung von hochverestertem Pektin durch Alkalien oder Stiuren nach einem statistischen Mechaniamus. Kfirzlich stellten Ishii u.a. (4) erstmalig mit einer gereinigten PE aus Aspergillus japonicus niederveresterte Rktin- prgparate her, deren funktionelles Verhalten bei der Gelbildung und warend der Chromatographie an DEAJZ-Cellulose ebenfalls auf einen statistischen Entesterungs- me chanismus hindeutet . Zur Charakterisierung des offensichtlich nicht einheitlichen Spaltungsmechanismus von PeMfnesterasen verschiedener Herkunft wird ein Aktivitgtstest mit Endo-PolygalaMuro- naee (Pa EC 3.2.1.15) vorgeschlagen. PG hydrolysiert standardisiertes Galakturonan- substrat (Citruspektins'dure) mit maximaler Geschwindigkeit nach einem Mehrketten- mechanismus (5, 6). Systematische Versuche zur Bestimmung der PG-Aktivittzt in Abhhgigkeit von molekularen Parametern des Substrats haben nimlich gezeigt, daI3 rnit niederveresterten Pektinen bei vergleichbarem Veresterungsgrad dann hahere Aktivitti- ten ermittelt werden, wenn zur Substratgewinnung hochverestertes Pektin statt mit Na- tronlauge mit einer pflanzlichen Pektinesterase partiell entestert worden ist (5). Zur Herstellung geeigneter Substrate wird Apfelpektin mit einem Veresterungsgrad von 72 % eunftchst bei 4 "C in abs. Methanol/H2S04 bis auf 95 8 verestert. Von diesem -&parat werden dann durch schonende partielle Entesterung im pH-stat-Verfahren mit Natronlauge bei pH 10,O und rnit gereinigter Rktinesterase aus Aspergillus niger bei

pH 4,5 sowie mit Pektinesterase aus reifen Orangen bei pH 7,5 bzw. pH 4,5 niederver-

K6 D angowski/Bock

esterte Pektinpraparate mit einem durchschnittlichen Veresterungsgrad von 46, l 3,O % (Serie I) bzw. von 38,8 Serie 111 mit einem durchschnittlichen Veresterungsgrad van 46,2 2 0,5 % wird das Apfelpektin unmittelbar partiell entestert. Die Aktivittitsbestimmung der verwendeten PE-freien Endo-Polygalakturonase aus Aspergillus spec. (6) erfolgt bei pH 4 , s und 30 "C auf jodometrischem Wege in Gegenwart der hergestellten Substrate, bezogen auf eine Konzentration von 1 % Galakturonan. Die im einzelnen erzielten Ergebnisse gehen aus Tab, 1 hervor. Die angegebene rela- tive FG-Aktivitat von 100 % wird mit standardisierter Pektinstiure ereielt. Innerhalb jeder der getesteten Substratserien I bis 111 ergibt sich erwartungsgemKf3 die jeweih hochste relative FG-AktivitKt an den rnit Orangen-PE erhaltenen niederveresterten Pektinpraparaten. An Substraten mit vergleichbarem Veresterungsgrad, die durch partielle Entesterung mit Aspergillus-niger -PE bzw. mit Natronlauge p r a p r b r t wurden, werden wesentlich geringere PG-Aktivitaten ermittelt. Dies kann nur dadurch erkltirt werden, daR Aspergillus-niger-PE hochverestertes Apfelpektin nach einem anderen Mechanismus partiell entestert als Orangen-PE. Der in Betracht kommende

1,5 ?&, (Serie 11) hergestellt. Fur die Substrate der

Tabelle 1 Aktivitgt der Endo-Polygalakturonase (PG) aus Aspergillus spec, (ROHAMENT P) an standardisierter Citruspektinsaure und an niederveresterten Apfelpektinen, die nach verschiedenen Entesterungsverfahren papa r i e r t wurden

Serie Entesterungsverfahren pH- Wert Substrat r e la t ive PG-Aktivitat

Vereste - ViskositKts- (%) rungsgrad zahl

(%b) (ml/@;) ~

PektinsKure

I NaOH 10,o 46; 0 153 46,7

A. niger -PE 495 49,2 196 56,l Orangen-PE 795 4 3 , l 229 84,8

II NaOH 10,o 37,7 125 49,3 A. niger -PE 4J 37,5 298 64,3 Orangen- PE 795 40, 7 394 91,6 Orangen-PE 495 39,l 313 86,5

In NaOH 10, 0 46,2 262 51,4

A. niger -PE 495 46, 7 461 69, 3 Orangen -PE 795 45, 7 51 8 81, 7

97 Pektinesterase

Spaltungsmechanismus f&t zu niederveresterten PeMhprlparaten, die hhsichtlich der Verteilung der Methylestergruppen mehr den mit Natronlauge erhaltenen Substra- ten gleichen. Eine statistische Verteilung der Methylestergruppen behindert genereU die Endo-Polygalakturose in ihrer Alctivittlt sti[rker als eine blockweise Verteilung gleichen Veresterungsgrades (5). Die festgestellten Unterschiede im Spaltungsmecha- nismus zwischen Orangen-PE und Aspergillus-niger-PE bleiben auch dam erhalten, wenn in beiden Ftlllen die partielle Entesterung zur Substratgewinnung bei pH 4,5 vor- genommen wird (Serie II). Zusammenfassend l ~ n n aus den dargelegten Ergebnissen geschluI3folgert werden, da8 der fiir die PE 8\18 Aspergillus japonicus 4 gefundene verznderte Spaltungsmechanis- mus auch fiir p% aus Aspergillus niger zutreffend ist.

Literatur

1 Her& W., H. Neukom und H. Deuel, Helv. Chim. Acta - 44, 1945 (1961).

2 Kohn, R., L Furda und Z. Kopec, Collect. Czechosluv. Chem. Commun. E,

3 Rexovh-Benkovh, f,. , und 0. Markwi?, Advances Carbohydr. Chem. Biochem. 2,

4 Ishii, S., K. Rho, S. Sugiyama und H. Sugimoto, J. Food Sci. - 44, 611 (1979).

5 Dongowski, G., W. Bock, 0. Markovi8und A. Slezarik, Nahrung - 24 (1980) Heft 7

6 Bock, W., M. Krause, H. GOb1, H. Anger, H,-J. Schawaller, Ch. Flemmingund

246 ( 1 968).

323 (1976).

(im Druck).

A. Gabert, Nahrung 3 185 (1978).

Dr. G. Dongowski und Dr. W. Bock, Zentralinstitut fCir Erniihrung, DDH - 1505 Bergholz-Rehbriicke, Arthur-Scheunert-Allee 114-116

Eingegangen 16. 5. 1980