Charakterisierung eines neuen putativen Tumorsuppressorgens im ProstatatakarzinomCharakterisierung eines neuen putativen Tumorsuppressorgens im ProstatatakarzinomS. Füssel, U. Fiedler, U. Schmidt, W. Ehlers, J. Stade, G. Faller*, M. P. Wirth

Klinik und Poliklinik für Urologie, TU Dresden, (*) Pathologie, Universität Erlangen; (DFG-Projekt WI 1750/2-1)

Material & Methoden: Die RNA aus

malignem und tumorfreiem Prostatagewebe wurde mit Hilfe des RNAimage-Kit (GenHunter, Nashville, USA) extrahiert und einer DD-PCR unterzogen. Die synthetisierten cDNA‘s wurden unter Einbau von 35S-dATP amplifiziert, nach elektrophoretischer Auftrennung und Autoradiographie analysiert. In malignem Gewebe unterrepräsentierte Banden wurden isoliert, reamplifiziert und sequenziert.Eine radioaktiv makierte Probe von C13, eine der im Tumor geringer exprimierten RNA‘s, wurde zum Screening einer humanen genomischen sowie einer Prostata-cDNA-Bank (Clontech, Palo Alto, USA) genutzt. In Kombination mit 5‘-RACE-PCR-Experimenten (unter Verwendung einer Prostata-Marathon-Ready-cDNA-Bank von Clontech) konnte ein entsprechendes vollständiges cDNA-Fragment assembliert und isoliert werden. Zur Untersuchung der Gewebe-spezifität der C13-Expression wurde eine davon abgeleitete und mittels PCR 32P-markierte Sonde mit den Northern-Blot-Arrays MTN I/II sowie MTE hybridisiert. Die Expressionssignale von Actin bzw. GAPDH dienten als interne Kontrolle.In-situ-Hybridisierungsexperimente wurden mit von C13 abgeleiteten, Digoxigenin-markierten Sense- und Antisense-Proben durchgeführt (MEGAscript Kit, Ambion, Wiesbaden). Die Hybridsierung mit den vorbehandelten 10 µm Prostatakryoschnitten fand über Nacht in einer mit Dimethylformamid abgesättigten Kammer bei 37°C statt. Die Detektion erfolgte über einen AP-gekoppelten Anti-Digoxigenin-Antikörper und die NBT/BCIP-Substratreaktion.Für LOH-Analysen („loss of heterozygosity“) wurde genomische DNA aus in Paraffin eingebettetem malignen bzw. tumorfreiem Prostatagewebe sowie aus Leukozyten extrahiert. Für die PCR-Versuche wurden 200-300 ng (Prostatagewebe) bzw. 50-100 ng (Blut) DNA eingesetzt sowie Texasrot-markierte Primer für verschiedene Mikrosatelittenmarker im Bereich des C13-Gens auf dem Chromosom 1313q: D13S171, D13S1293, D13S894, D13S1491, D13S1253 und D13S765. Nach elektrophoretischer Auftrennung der PCR-Produkte auf einem 6%igen PAA-Sequenziergel unter Nutzung eines VISTRA-Sequenziergerätes einschließlich entsprechender Software (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) wurden die Peakhöhen berechnet. Unterschiede von 10-30 % wurden als allelischen Imbalance definiert, Änderungen von >30 % als LOH.

Hintergrund: Die molekularen Grundlagen für die Entwicklung eines Prostatakarzinoms (PCa) sind bisher ungenügend bekannt. Allgemein anerkannt ist, daß die Tumorigenese mit der Überexpression von Onkogenen und der funktionellen Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen (TSG) einhergeht. Zur Aufklärung solcher Genalterationen haben wir Differenzen in Genexpressionsmustern zwischen PCa- und tumorfreiem Prostata-Gewebe untersucht.. Mittels „differential display“ PCR-Technik konnten wir mRNA-Expressions-veränderungen identifizieren, die kausal mit der malginen Trans-formation des Prostatgewebes assoziiert sein könnten. Unsere bisherigen Ergebnisse zur Charakterisierung eines solchen putativen TSG-Kanditaten, genannt C13, der im PCa-Gewebe in spezifiscer Weise unterrepräsaentiert vorliegt, könnten neue Einsichten in solche Transformationsprozesse erlauben.

Ergebnisse: Mittels „DD-PCR“ konnten wir ein cDNA-Fragment, bezeichnet als C13, isolieren, dessen Expression in 2/5 malignen Prostatagewebeproben (Abb. 1) deutlich reduziert war. Mittels Southern-Blot-Analysen, Radiation-Hybrid-Mapping sowie FISH-Experimenten wurde eine Lokalisierung auf Chromo-som 13q13 ermittelt (Daten nicht gezeigt). Über Northern-Blot-Experimente mit MTN II konnten zwei C13-spezifische Transkrip-te von 3.0 und 4.4 kb nachgewiesen werden. Dabei wurden die höchsten Expressionssignale in Hodengewebe gefunden. Mit Hilfe des MTE-Blots wurde ebenfalls eine hohe Expression im Hirn und in fötalen Geweben gezeigt (Abb. 2). Die hauptsächlich epitheliale C13-RNA-Expression wurde in in-situ-Experimenten deutlich gemacht (Abb. 3). Um die Bedeutung der Region um C13 auf dem Chromosom 13q13 für die Tumorentstehung und -progression einschätzen zu können, wurden Prostatagewebeproben von 21 Patienten untersucht. In 57% wurde eine allelische Inbalance oder ein „LOH“ in einem oder mehreren der untersuchten Loci gefunden (Tab. 1). Sechs der 21 getesteten Patienten zeigten „LOH“ in mindestens einem der Loci, die am häufigsten deletierte Region wurde beim Marker D13S1491 (8/14 informative Fällen, 57%) gefunden. Das mittels Bankenscreening und 5‘-RACE-Experimenten isolierte cDNA-Fragment enthält einen ORF von 2202 bp, der einem putativen Protein mit einer Länge von 733 Aminosäureresten (AS) und einem Molekular-gewicht von 81 kDa entspricht. Die vermutete kodierende Sequenz besteht aus einem N-terminalen, an basischen AS reichen Kernlokalisierungssignal sowie einer internen PEST-ähnlichen Sequenz, die für den schnellen Proteinumsatz verantwortlich sein könnte. Computer-gestützte Analysen des putativen Proteins ergaben eine Domänenstruktur mit einem -helikalen N-Terminus und einer C-terminalen Region, reich an „turns“ und -Faltblättern. Die hohe Wahrscheinlichkeit für eine Kernlokalisation, die mit Hilfe des Programms PSORT vorausgesagt wurde, sowie die zahlreichen Glutaminreste im C-Terminus weisen eine starke Ähnlichkeit zu vielen Transkriptionsfaktoren auf.

Schlussfolgerungen: Mittels DD-PCR und Screening konnte ein c-DNA-Fragment identifiziert werden, daß in 2 von 5 PCa-Tumorpatienten unterrepräsentiert vorlag. Das korrespondierende Gen liegt auf dem Chromosomen-abschnitt 13q13, zwischen den BRCA-2 und RB-Genloci. Die Kolokalisierung nahe dieser beiden TSG-Loci und unsere LOH-Befunde zu dieser Genregion sind ein Hinweis darauf, daß die C13-Genregion in die Genese und Progression des PCa involviert sein könnte. Da der histogenetische Ursprung des PCa im Epithel liegt, deutet die vorrangig epitheliale Expression von C13 im Prostatgewebe auf eine Rolle dieses Genproduktes in der Karzinogenese hin. Der längste offene Leserahmen innerhalb des C13-Gens kodiert für eine Protein aus 733 Aminosäureresten mit einem Molekulargewicht 81 kDa. Es enthält ein putatives N-terminales Kernlokalisationssignal, daß wahrscheinlich eine Translokation in den Zellkern steuert. Gemeinsam mit der Existenz eines Glutamin-Cluster am C-Terminus sowie zahlreicher potentieller Phosphorylierungsstellen weist dies auf eine große Ähnlichkeit zu vielen bekannten Transkriptionsfaktoren hin. Deshalb ist C13 als interessanter Kanditat eines neuen, als Transkriptionsfaktor innerhalb der malignen Transformation von Prostatazellen wirkenden TSG anzusehen.

Abb. 1: „Differential display“-PCR mit RNA von malignem und tumorfreiem Prostatagewebe ausgeführt in Gegenwart von 35S-dATP, Autoradiographie nach Auftrennung auf einem 6%igem Sequenziergel.N - tumorfreies Gewebe, T - malignes Gewebe. Der Pfeil zeigt die C13-Bande, die für die weiteren Analysen genutzt wurde.

PEST regionnuclear targeting sequence

glutamine cluster-helix region

733 AA

CN

MQQALELALD RAEYVIESAR QRPPKRKYLS SGRKSVFQKL YDLYIEECEK EPEVKQKLRR NVNLLEKLVM QETLSCLVVN 80LYPGNEGYSL MLRGKNGSDS ETIRLPYEEG ELLEYLDAEE LPPILVDLLE KSQVNIFHCG CVIAEIRDYR QSSNMKSPGY 160QSRHILLRPT MQTLICDVHS ITSDNHKWTQ EDKLLLESQL ILATAEPLCL DPSIAVTCTA NRLLYNKQKM NTRPMKRCFK 240RYSRSSLNRQ QDLSHCPPPP QLRLLDFLQK RKERKAGQHY DLKISKAGNC VDMWKRSPCN LAIPSEVDVE KYAKVEKSIK 320SDDSQPTVWP AHDVKDDYVF ECEAGTQYQK TKLTILQSLG DPLYYGKIQP CKADEESDSQ MSPSHSSTDD HSNWFIIGSK 400TDAERVVNQY QELVQNEAKC PVKMSHSSSG SASLSQVSPG KETDQTETVS VQSSVLGKGV KHRPPPIKLP SSSGNSSSGN 480YFTPQQTSSF LKSPTPPPSS KPSSIPRKSS VDLNQVSMLS PAALSPASSS QRTTATQVMA NSAGLNFINV VGSVCGAQAL 560MSGSNPMLGC NTGAITPAGI NLSGLLPSGG LLPNALPSAM QAASQAGVPF GLKNTSSLRP LNLLQLPGGS LIFNTLQQQQ 640QQLSQFTPQQ PQQPTTCSPQ QPGEQGSEQG STSQEQALSA QQAAVINLTG VGSFMQSQAA AVAILAASNG YGSSSSTNSS 720ATSSSAYRQP VKK

Abb. 4: Schematische Darstellung des längsten offenen Leserahmens in C13, der Sequenz und abgeleitete Proteinmuster.

Abb. 3: In situ-Hybridizatierung von Prostatagewebe mit spezifischen C13-Proben.

A) HE-Färbung,

B) Negativkontrolle,

C) C13-“Sense“-Probe,

D) C13-“Antisense“-Probe

Abb. 2: Hybridisierung des „Multiple Tissue Expression Array“ (Clontech) mit einer 32P-markierten C13-Sonde (50 h Exposition): die höchsten Signalewurden gefunden in 1A = gesamtes Hirn, 2A & 2B = Cerebellum links & rechts, 2C = Corpus callosum, 3D = Hirnanhangsdrüse, 8F = Hoden, 11 = fetale Gewebe.

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3

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4

D13S171 _ x _ * x _ _ _ _ _ * _ _ *

D13S1293 x _ x _ _ _ _ x

D13S894 x _ _ x x _ x _ x x _ * _

D13S1491 x _ _ * x _ * _ x _ _ * x _ *

D13S1253 _ * x _ x _ x x *

D13S765 x _ _ x _ * _ x x * *

marker

patientTab. 1:„Loss of heterozygosity“-Analysen der Region zwischen BRCA 2 und C13.

Als Symbole wurde genutzt:

- Homozygosität,

o Heterozygosität,

x Allelische Imbalance,

„Loss of heterozygosity“.

Medizinische Fakultät Carl Gustav CarusReformfakultät des Stifterverbandes

für die Deutsche WissenschaftHarvard Medical International Association

Institution

TECHNISCHEUNIVERSITÄTDRESDEN