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KATJA GEIPEL, THOMAS BLEY, JULIANE STEINGROEWER

INSTITUT FÜR LEBENSMITTEL- UND BIOVERFAHRENSTECHNIK, TU DRESDEN

In advance of industrial applications of in vitro plant cell or tissue cul-tures e. g., as bioactive ingredients for pharmaceuticals, an intense characterization concerning growth and productivity has to be performed.Innovative respiration measurement techniques in shake flask scale wereapplied to investigate and compare heterotrophic, photomixotrophic andhairy root cultures of sunflower. Furthermore, the qualification of a moni-toring system for screening of plant in vitro cultures is discussed.

DOI: 10.1007/s12268-014-0460-z© Springer-Verlag 2014

ó Wirkstoffgewinnung mittels chemischerSynthese führt oft zu Stereoisomeren, welcheaufwendig getrennt werden müssen, undmanche Moleküle sind nur sehr kosteninten-siv oder gar nicht darstellbar. Landwirt-schaftliche Gewinnung bedeutet Nachteilewie Schadstoffeinsatz und großer Flächenbe-darf. Der Einsatz von pflanzlichen Zell- undGewebekulturen überwindet die genanntenHürden [1, 2]: Mithilfe von Methoden derPflanzenbiotechnologie ist es möglich, pflanz-liche Inhaltsstoffe in ihrer natürlichen, bio-aktiven Form das ganze Jahr über unabhän-gig von biotischen/abiotischen Umweltfakto-ren bei gleichbleibender Qualität und Quan-tität zu produzieren [3, 4].

Suspensionskulturen und hairy roots gel-ten momentan als die in vitro-Kulturtypen mitdem größten biotechnologischen Potenzial.Erstere sind in Flüssigmedium kultivierte Kal-

luszellen. Beim Kallus handelt es sich umundifferenzierte Pflanzenzellen, welchetumorartig wachsen und durch Zugabe vonPflanzenhormonen an der Differenzierunggehindert werden. Hairy roots entstehen durchInfektion eines Pflanzenteils mit dem Boden-bakterium Agrobacterium rhizogenes. Die soerhaltene Wurzelhaarkultur kann ohne Hor-monzusatz vermehrt werden, ihre Morpholo-gie erfordert aber häufig eine Anpassungbestehender Kultivierungsgefäße [2, 5].

Modellsystem SonnenblumeVor einer ertragreichen industriellen Anwen-dung pflanzlicher in vitro-Kulturen stehengrundlegende Untersuchungen zur Charak-terisierung ihres biotechnologischen Poten-zials. Drei Kulturtypen des ModellsystemsEinjährige Sonnenblume (Helianthus annuus)werden vorgestellt und in Bezug auf ihr Res-

pirationsverhalten bei Kultivierung im Schüt-telkolben charakterisiert und verglichen.

H. annuus gehört zur Familie der Korb-blütler und ist bekannt für einen hohen Anteilan α-Tocopherol [6]. Diese aktivste Form desVitamins E wirkt antioxidativ, verhindertLipidperoxidation [6] und findet daher z. B.zur Konservierung von Cremes, aber auch zurErhöhung des Vitamingehalts von Lebens-mitteln Anwendung.

Für die vorgestellten Versuche kamenheterotrophe und photomixotrophe Suspen-sionskulturen sowie Gewebekulturen (hairyroots) zum Einsatz (Abb. 1). Alle Kulturen wur-den aus Blättern von H. annuus induziert. Dieheterotrophe Kultur wurde in Linsmaier-Skoog-Medium unter Zugabe von 0,2 mg/l desPflanzenhormons 2,4-Dichlorphenoxyessig-säure und 30g/l Saccharose im Dunkeln kul-tiviert [7]. Zur Vermehrung der photomixo-trophen Kultur im Licht (125 μmol/(m2 s), LED)wurde Murashige-Skoog-Medium (MS) mit je0,5 mg/l der Pflanzenhormone 1-Naphthyles-sigsäure und 6-Benzylaminopurin sowie 15 g/lSaccharose eingesetzt [8]. Hairy roots wurdenin MS mit 30 g/l Saccharose im Dunkeln kul-tiviert. Alle Experimente erfolgten bei 26 °Cund 110 Umdrehungen pro Minute.

Kultivierung im Schüttelkolben mitÜberwachungDas Respiration Activity Monitoring System®(RAMOS®, HiTec Zang GmbH) bietet die Mög-lichkeit zur nicht-invasiven on-line-Wachs-tumsüberwachung von Zellkulturen ingeschüttelten Kultivierungssystemen [9]. DasSystem erlaubt über die Messung von Gesamt-und Sauerstoffpartialdruck im speziell gestal-teten Kopf des Schüttelkolbens die Berech-nung von Sauerstoff- und Kohlenstoffdioxid-transfer (OT, CT) bzw. daraus resultierenderTransferraten (OTR, CTR) sowie des Respira-tionsquotienten (RQ). Mithilfe von RAMOSsollen grundlegende Fragestellungen bezüg-lich der Charakterisierung und Etablierunginnovativer pflanzlicher Zell- bzw. Gewebe-kulturen untersucht werden – fokussiert aufGewebekulturen und Kulturen mit phototro-phem Stoffwechsel.

Pflanzenbiotechnologie

Charakterisierung pflanzlicher in vitro-Kulturen am Beispiel Sonnenblume

BIOspektrum | 04.14 | 20. Jahrgang

˚ Abb. 1: Verschiedene Kulturtypen der Sonnenblume Helianthus annuus auf festem Medium. A,heterotropher Kallus; B, photomixotropher Kallus; C, hairy roots.

A B C

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Respiratorische Charakterisierungpflanzlicher in vitro-KulturenFür die untersuchten H. annuus-Kulturtypen(Abb. 1) sind in Abbildung 2 OT, OTR, RQund das Wachstum der Biomasse (growthratio: ) dargestellt. Aus dem OTR-Verlauflässt sich schlussfolgern, dass die heterotro-phe Kultur am schnellsten wächst, gefolgt vonder Gewebe- und der photomixotrophen Kul-tur. Die Längen der lag-Phasen variieren stark:Während sich die hairy roots noch adaptie-ren (Inokulum: sehr geringe Startbiomas-senkonzentration x0 von Plattenkultur), istdie heterotrophe Suspension (Inokulum: flüs-sige Vorkultur mit ca. 20-facher x0) bereitsam Ende ihrer Wachstumsphase (t ≈ 4,5 d).Eine Einteilung in Wachstumsphasen ist beider photomixotrophen Kultur unmöglich. Zurverstärkten Anregung der Photosyntheseak-tivität wurde bei dieser Zellkultur die Sac-charosekonzentration halbiert. Es muss voneinem Stoffwechsel mit sich überlagerndemheterotrophem und phototrophem Anteil aus-gegangen werden. Bekannt ist, dass α-Tocoph-erol ausschließlich von photosynthetisch akti-ven Organismen in Abhängigkeit der Licht-intensität synthetisiert wird [8, 10]. DurchLichteinstrahlung bilden sich in den ZellenChloroplasten, welche Photosynthese ermög-lichen. Die photomixotrophe Kultur ist somitin der Lage, sowohl Zucker als auch Licht alsEnergiequelle zu nutzen [11]. Die Gründe fürdas sehr langsame Wachstum dieser Licht-induzierten Kultur gilt es zukünftig weiter zuerforschen, sowohl im Hinblick auf Anteilean respirativem bzw. phototrophem Metabo-

xmax

x0

lismus als auch im Zusammenhang mit derProduktausbeute.

Die Respirationsdaten zeigen, dass diemaximale Sauerstofftransferrate (OTRmax) beiallen Kulturtypen stark differiert. Die höchsteOTRmax zeigt die Gewebe-, gefolgt von derheterotrophen Kultur. Die photomixotrophe

Kultur zeigt nur eine sehr geringe OTRmax.Die spezifische, auf die Biotrockenmasse-konzentration (BTM) bezogene maximale Sau-erstofftransferrate (otrmax = ) weist dage-gen eine hohe Ähnlichkeit zwischen denuntersuchten Kulturtypen auf (Tab. 1). Sieliegt für alle Kulturen in einem kleinen

OTRmax

x

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¯ Abb. 2: Zeitverlaufvon Biomasse undRespiration bei ver-schiedenen Kulturender SonnenblumeHelianthus annuus.A, Wachstum der Bio-masse (growth ratio,dimensionslos). B,Respiration in derheterotrophen Kultur(n = 3). C, Respirationin der photomixotro-phen Kultur (n = 4).D, Respiration in derhairy roots-Kultur(n = 5). OT: Sauer-stofftransfer inmmol/l; OTR: Sauer-stofftransferrate inmmol/(l h); RQ: Res-pirationsquotient.

A

C

B

D

Startbiomassekonzentration 1,28 1,21 0,06

x0 in

Max. Biomassekonzentration 14,49 7,55 15,45

xmax in (12) (15) (14)

(d)

Maximum growth ratio 11,32 6,24 257,50

Max. O2-Transferrate 2,00 0,64 2,30

OTRmax in (8) (12) (12)

(d)

Max. spezifische O2-Transferrate 0,17 0,16 0,22

otrmax in

Wachstumsrate 0,26 0,12 0,48

μ in → Berechnung aus BTM/off-line (0–9) (0–15) (0–11)

(d)

Wachstumsrate 0,31 0,09 0,53

μ in → Berechnung aus OTR/on-line (0–4) (6,5–10,5) (1–14)

(d)

gl

gl

mmoll · h

1*d

mmolg · h

1*d

Tab. 1: Wachstumskenngrößen verschiedener Kulturen der Sonnenblume Helianthus annuus (Maximasind hervorgehoben, Zeitraum/Zeitspanne zur Berechnung der entsprechenden Werte in Tagen (d)in Klammern).

* Gleichung siehe [7]

Kenngröße Heterotrophe Photomixotrophe Hairy rootsSuspension Suspension

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lung von Standardparametern für die Wachs-tumscharakterisierung sowohl pflanzlicherZell- als auch Gewebekulturen dar. Besondersaufgrund der geringen Datendichte imBereich der Biomasseanalytik (off-line) sindhier die Vorteile des Systems zu sehen. Diebisherigen Untersuchungen der Autoren leis-ten einen Beitrag zur Aufklärung der Respi-ration verschiedener pflanzlicher Zellkultu-ren. Zukünftige Studien sollen weiterführen-de Erkenntnisse zum photo (mixo)trophenStoffwechsel pflanzlicher Zellkulturen liefernsowie das Verständnis vom Zusammenspielvon Respiration und Produktbildung u. a. inGewebekulturen erweitern.

DanksagungFür die finanzielle Unterstützung danken wirdem Bundesministerium für Wirtschaft undTechnologie (Zentrales InnovationsprogrammMittelstand). Für die Bereitstellung der hairy root-Kultur bedanken wir uns ganz herz-lich bei Dipl.-Biol. Joachim Püschel und Prof.Dr. Jutta Ludwig-Müller, Institut für Botanik,TU Dresden. Wir bedanken uns zudem ganzherzlich bei der Firma HiTec Zang, Herzo-genrath für die gute Zusammenarbeit! ó

Literatur[1] Marchev A, Haas C, Schulz S et al. (2014) Sage in vitro cul-tures: a promising tool for the production of bioactive terpe-nes and phenolic substances. Biotechnol Lett 36:211–221[2] Steingroewer J, Ludwig-Müller J, Bley T (2013) PflanzlicheZell- und Gewebekulturen – neue Produktionssysteme für dieBiotechnologie. BIOspektrum 19:683–686[3] Georgiev M, Pavlov A, Bley T (2007) Hairy root type plantin vitro systems as sources of bioactive substances. Appl Microbiol Biotechnol 74:1175–1185[4] Kieran PM, MacLoughlin PF, Malone DM (1997) Plant cellsuspension cultures: some engineering considerations. J Biotechnol 59:39–52

[5] Geipel K, Lenk F, Bley T et al. (2012) Die Sonnenblume imBioreaktor – Herstellung von α-Tocopherol mittels pflanz-licher Zell- und Gewebekulturen. Lebensmitteltechnik 44:55–56[6] Traber MG, Sies H (1996) Vitamin E in humans: demandand delivery. Annu Rev Nutr 16:321–347[7] Geipel K, Socher ML, Haas C et al. (2013) Growth kineticsof a Helianthus annuus and a Salvia fruticosa suspension cellline: shake flask cultivations with online monitoring system.Eng Life Sci 13:593–602[8] Geipel K, Song X, Socher ML et al. (2014) Induction of aphotomixotrophic plant cell culture of Helianthus annuus andoptimization of culture conditions for improved α-tocopherolproduction. Appl Microbiol Biotechnol 98:2029–2040[9] Anderlei T, Büchs J (2001) Device for sterile online measu-rement of the oxygen transfer rate in shaking flasks. Biochem Eng J 7:157–162[10] Fachechi C, Nisi R, Gala R et al. (2007) Tocopherol bio-synthesis is enhanced in photomixotrophic sunflower cell cul-tures. Plant Cell Rep 26:525–530[11] Madigan MT, Martinko JM, Parker J (2003) Brock Biologyof Microorganisms, 10. Aufl. Upper Saddle River, Prentice Hall

Korrespondenzadresse:Katja GeipelInstitut für Lebensmittel- und BioverfahrenstechnikTechnische Universität DresdenBergstraße 120D-01069 DresdenTel.: 0351-4633-9042katja.geipel@tu-dresden.dewww.tu-dresden.de/mw/ilb

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Bereich zwischen 0,16 und 0,22 mmol/(g h),wobei otrmax,photomixotroph <  otrmax,hetero-

troph < otrmax,hairy roots ist. Daraus lässt sichschlussfolgern, dass im Untersuchungszeit -raum bei allen drei Kulturtypen pro Biomas-se etwa die gleiche Menge Sauerstoff aufge-nommen wird. Für die photomixotrophe Kul-tur bedeutet das vermutlich, dass vorersthauptsächlich der heterotrophe Anteil desMetabolismus aktiv ist, in erster Linie wirdalso Zucker respirativ umgesetzt.

Aussagekräftigere Charakterisierungen bie-ten biotechnologische Kenngrößen wie z. B.die Wachstumsrate μ, welche sowohl aufGrundlage der BTM- (off-line) als auch derRespirationsdaten (on-line) vergleichendberechnet wurde (Tab.  1). Die Werte bei-der Berechnungsmethoden zeigen ähnli-che Ergebnisse (z. B. μ = 0,48/d bzw. 0,53/dfür hairy roots) und liegen für alle drei Kulturtypen im Bereich von 0,09 bis 0,53/d (μphotomixotroph < μheterotroph < μhairy roots).Aufgrund der höheren Datendichte (alle 1 bis3 h) ist die Berechnung auf Basis der Respi-rationsdaten exakter. Biomassedaten liegennur im Abstand von Tagen vor. Auffällig istder enorme Wachstumsschub der hairy rootsvon nur 0,06 g/l zu Beginn der Kultivierungauf über 15 g/l nach 14 Tagen. Somit ergibtsich hier eine sehr hohe maximale growthratio von über 250 bzw. eine für pflanzlichein vitro-Kulturen hohe Wachstumsrate von ca.0,5/d.

Herausforderungen und Ideen zurRespirationskontrolle pflanzlicherin vitro-KulturenDas Monitoringssystem RAMOS stellt eininnovatives und hilfreiches Tool zur Ermitt-