Charakterisierung zweier Rattenmutanten mit spontanem ... · Aus dem Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover Charakterisierung

Aus dem Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der

Tierärztlichen Hochschule Hannover

Charakterisierung zweier Rattenmutanten mit spontanem Drehverhalten

These

zur Erlangung des Grades eines

PHILOSOPHICAL DOCTOR

-Ph.D.-

im Fachgebiet Pharmakologie

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

vorgelegt von Alina Lessenich aus Westerholt

Hannover 2002

Supervisor: Prof. Dr. W. Löscher Betreuungsgruppe: Univ.-Prof. Dr. W. Löscher Univ.-Prof. Dr. H.-J. Hedrich Univ.-Prof. Dr. E. Zimmermann 1.Gutachten: Prof. Dr. W. Löscher, Institut für Pharmakologie,

Toxikologie und Pharmazie, Tierärztliche Hochschule Hannover

Prof. Dr. H.-J. Hedrich, Institut für Versuchstierkunde und

Zentrales Tierlaboratorium, Medizinische Hochschule Hannover

Prof. Dr. E. Zimmermann, Institut für Zoologie,

Tierärztliche Hochschule Hannover 2. Gutachten: Univ.-Prof. Dr. C. Grothe Datum der mündlichen Prüfung: 03.06.2002 Gefördert durch eine Sachbeihilfe der Deutschen Forschungsgemeinschaft und ein Promotionsstipendium der H. Wilhelm Schaumann Stiftung

Teile der These wurden bereits in folgenden Originalarbeiten veröffentlicht: LESSENICH, A., LINDEMANN, S., RICHTER, A., HEDRICH, H.-J., WEDEKIND, D., KAISER, A., LÖSCHER, W. (2001) A novel black-hooded mutant rat (ci3) with spontaneous circling behavior but normal auditory and vestibular functions. Neuroscience 107, 615 – 628 LINDEMANN, S., LESSENICH, A., EBERT, U., LÖSCHER, W. (2001) Spontaneous paroxysmal circling behavior in the ci2 rat mutant: epilepsy with rotational seizures or hyperkinetic movement disorder ? Exp. Neurol. 172, 437 – 445

Für meine Eltern in Liebe

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung 13

2. Literaturübersicht 16

2.1. Cerebrale Lateralität bei Mensch und Tier 16

2.1.1. Physiologie 16

2.1.2. Pathologie 18

2.2. Zentrale Regulation der Motorik 20

2.3. Die Basalganglien 21

2.3.1. Anatomie 21


2.3.3. Bewegungsstörungen mit Ursprung in den Basalganglien 24

2.4. Dopamin (DA) 27

2.4.1. Anatomie 27


2.4.3. Metabolismus 29

2.4.4. Pharmakologie 31

2.4.5. Besondere Neuroanatomie der dopaminergen 33

SNC und ihre Bedeutung für die Motorik

2.5. Cochleäres und vestibuläres System 34

2.5.1. Cochleäres System 34

2.5.1.1. Anatomie und Physiologie 34

2.5.1.2. Pathologie 35

2.5.2. Vestibuläres System 38

2.5.2.1. Anatomie und Physiologie 38

2.5.2.2. Pathologie 39

2.6. Lateralität und Bewegungsstörungen bei normalen Tieren 40

2.7. Lateralität und Bewegungsstörungen bei Stimulation und 43

Läsion von Hirnregionen

2.7.1. Zentrale Bereiche 43

2.7.2. Innenohr 47

2.8. Lateralität und Bewegungsstörungen bei murinen Mutanten 49

2.8.1. Mausmutanten 49

2.8.2. Rattenmutanten 51

2.9. Die ci2- und ci3-Mutante 53

2.9.1. Die LEW/Ztm-ci2-Rattenmutante 53

2.9.2. Die BH.7A/Ztm-ci3-Rattenmutante 58

2.10. Aufgabenstellung 59

3. Material und Methoden 60

3. Versuchstiere 60

3.1.1. Herkunft 60

3.1.2. Haltung und Fütterung 61

3.1.3. Narkose 61

3.1.4. Generierung von Ratten mit einem Innenohrschaden 62

durch Streptomycin

3.2. Verhaltensbeobachtungen 62

3.2.1. Charakterisierung des Rotationsverhaltens 62

3.2.2. Beurteilung weiterer motorischer Anomalien 64

3.2.3. Untersuchungen zur Funktion des vestibulären Systems 64

3.2.3.1. Schwimmtest 64

3.2.3.2. „Air-Righting Test“ 65

3.2.3.3. “Tail-Hanging Test” 66

3.2.4. Pharmakologische Untersuchungen 66

3.2.4.1. Verwendete Substanzen und Dosierungen 66

3.2.4.2. Beurteilung der Wirkungen 67

3.3. EEGs 71

3.3.1. Elektrodenimplantation 71

3.3.2. EEG-Ableitung 73

3.4. Neuropathologische Untersuchungen 73

3.4.1. Perfusion für neuropathologische Untersuchungen 73

3.4.2. TH-Immunhistochemie 74

3.4.3. Thioninfärbung 75

3.4.4. Bestimmung der Dichte TH-positiver Neurone 76

in SNC und VTA

3.4.5. Untersuchung der cochleären und vestibulären Nuclei 79

im Hirnstamm

3.4.5.1. Kerngrößen 79

3.4.5.2. Morphologie der Neurone des anteroventralen 81

cochleären Nucleus

3.5. Neurochemische Untersuchungen 82

3.5.1. Gewinnung und Aufarbeitung 82

3.5.2. Analytik der Monoamine 83

3.6. Untersuchungen zur Funktion des auditorischen Systems 86

3.6.1. Auditorisch evozierte Potentiale 86

3.7. Histologische Untersuchung des Innenohres 88

3.8. Statistische Auswertung 88

4. Ergebnisse 90

4.1. Verhaltensbeobachtungen 90

4.1.1. Charakterisierung des Rotationsverhaltens 90

4.1.1.1. Rotationsverhalten der ci2-Mutante 90

4.1.1.2. Rotationsverhalten der ci3-Mutante 93

4.1.1.3. Rotationsverhalten der Streptomycin-behandelten 95

Tiere

4.1.2. Vergleich weiterer motorischer Anomalien zwischen 98

ci2-, ci3-Mutante und Streptomycin-behandelten Ratten

4.1.3. Untersuchungen zur Funktion des vestibulären Systems 100

4.1.3.1. Schwimmtest 100

4.1.3.2. “Air-Righting Test“ 104

4.1.3.3. ”Tail-Hanging Test” 104

4.1.4. Pharmakologische Untersuchungen 105

4.1.4.1. Wirkungen von DA-Rezeptor-Antagonisten 105

bei der ci2-Mutante und der ci3-Mutante

4.1.4.2. D-Amphetamin-Effekte 111

4.1.4.3. MK-801-Wirkungen 115

4.2. EEGs 118

4.3. Neuropathologische Befunde 121

4.3.1. Bestimmung der Dichte TH-positiver Neurone 121

in SNC und VTA

4.3.2. Untersuchung der cochleären und vestibulären Nuclei 127

im Hirnstamm

4.3.2.1. Kerngrößen 127

4.3.2.1.1. ci3-Mutante und BH.7A-Tiere 127

4.3.2.1.2. Streptomycin-behandelte Tiere, 130

ci2/+-Kontrollen und ci2/ci2-Tiere

4.3.2.2. Morphologie der Neurone des anteroventralen 132

cochleären Nucleus

4.3.2.2.1. ci3-Mutante und BH.7A-Tiere 132

4.3.2.2.2. Streptomycin-behandelte Tiere, 133

ci2/+-Kontrollen und ci2/ci2-Tiere

4.4. Neurochemische Untersuchungen 134

4.5. Untersuchungen zur Funktion des auditorischen Systems 136


4.6. Histologische Untersuchung des Innenohres 137

5. Diskussion 138

5.1. Betrachtungen zur Methodik 138

5.1.1. Verhaltensbeobachtungen 138

5.1.1.1. Rotationsverhalten und weitere motorische 138

Anomalien

5.1.1.2. Untersuchungen zur Funktion des vestibulären 139

Systems

5.1.1.3. Pharmakologische Untersuchungen 140

5.1.2. EEGs 141

5.1.3. Neuropathologische Befunde 142

5.1.3.1. TH-Immunhistochemie 142

5.1.3.2. Histologie der cochleären und vestibulären Nuclei 143

5.1.4. Neurochemische Untersuchungen 143


5.1.6. Histologische Untersuchung des Innenohres 144

5.2. Betrachtung der Versuchsergebnisse 145

5.2.1. Verhaltensbeobachtungen 145

5.2.1.1. Rotationsverhalten und weitere motorische 145

Anomalien

5.2.1.2. Pharmakologische Untersuchungen 146

5.2.1.2.1. Wirkungen von DA-Rezeptor-Antagonisten 146

bei der ci2-Mutante und der ci3-Mutante

5.2.1.2.2. D-Amphetamin-Effekte 147

5.2.1.2.3. MK-801-Wirkungen 150

5.2.2. EEGs 150

5.2.3. TH-Immunhistochemie 152

5.2.4. Neurochemische Untersuchungen 153

5.2.5. Untersuchungen zum cochleären und vestibulären 155

System

5.2.5.1. ci3-Mutante und BH.7A-Ratten 155

5.2.5.2. ci2-Mutante und Streptomycin-behandelte Tiere 156

5.3. Vergleichende Übersicht über die ci2-, ci3- und Streptomycin- 162

behandelten Tiere

5.4. Schlussbetrachtungen zur Bedeutung der ci2- und ci3-Mutante 163

5.5. Ausblick 164

6. Zusammenfassung - Summary 166

7. Literatur 171

8. Tabellarischer Anhang

Abkürzungsverzeichnis Abkürzung Bedeutung Abb. Abbildung BH Ratten des “Black-Hooded”-Inzuchtstammes ca. circa cm Centimeter ci2/ci2 homozygote, drehende ci2-Mutante; Gensymbol: ci2 ci2/+ heterozygote, nicht drehende Geschwistertiere der ci2- Mutante ci3/ci3 homozygote, drehende ci3-Mutante; Gensymbol: ci3 DA Dopamin dB Dezibel d.h. das heißt EEG Elektroencephalogramm GABA Gamma-Aminobuttersäure HPLC High Performance (Pressure) Liquid Chromatography Hz Hertz i.p. intraperitoneal kg Kilogramm KGW Körpergewicht l Liter LEW Ratten des Lewis-Inzuchtstammes M molar mg Milligramm µm Mikrometer µl Mikroliter Min. Minute ml Milliliter µm Mikrometer mm Millimeter ms Millisekunde pg Picogramm s. siehe s.c. subcutan Sek. Sekunde SEM Standardfehler SNC Substantia nigra pars compacta SNL Substantia nigra pars lateralis sog. sogenannt Std. Stunde Tab. Tabelle TH Tyrosinhydroxylase VTA ventrale tegmentale Region z.B. zum Beispiel Ztm Zentrales Tierlabor der Medizinischen Hochschule Hannover

13

1. Einleitung

Als Rotationsverhalten, synonym auch Drehverhalten oder Circling, bezeichnet man

eine aktive, stereotype Bewegung um die eigene Körperachse (PYCOCK, 1980). Die

Drehungen können hierbei als enge Rotationen oder als Rotationen auf weiten

Kreisen gezeigt werden (KOSHIKAWA, 1994).

Rotationsverhalten wird bei vielen Spezies beobachtet und weist auf eine laterale

Präferenz für die Ausführung bestimmter Verhaltensfunktionen hin (CARLSON und

GLICK, 1996). In dieser Hinsicht ist Circling der Händigkeit ähnlich, dem bekanntesten

Index für laterale Präferenz beim Menschen. Als Ursache für diese Präferenz wird

eine funktionelle Lateralisierung von Hirnsystemen angesehen, wobei mit

Lateralisierung gemeint ist, dass die beiden Hemisphären in verschiedenem Ausmaß

unterschiedliche Verhaltensaktivitäten kontrollieren (CARLSON und GLICK, 1996).

Beim Menschen kommt Rotationsverhalten in stereotyper Ausprägung nur selten vor.

So zeigen z.B. Patienten mit einer Rotationsepilepsie in einem Anfall enge

Drehungen von mindestens 180° um die eigene Achse (VERCUEIL et al., 1999;

RAMMELLI et al., 1999). Für dieses Verhalten werden asymmetrische Entladungen im

Bereich der Basalganglien verantwortlich gemacht (VERCUEIL et al., 1999).

Des weiteren werden Drehungen bei nicht-medikierten, schizophrenen Patienten

gesehen und hier auf dopaminerge Asymmetrien zurückgeführt (BRACHA, 1987).

Eine weitere Form asymmetrischen Verhaltens kann beim Morbus Parkinson

auftreten. Diese Erkrankung beginnt zunächst unilateral und die Patienten wenden

sich hier spontan der Hirnseite zu, von welcher die niedrigere dopaminerge Aktivität

angenommen wird (BRACHA et al., 1987).

Eine Präferenz für das Hinwenden zu einer bestimmten Seite ist aber auch von

gesunden Testpersonen bekannt und wird einer Lateralisierung im nigro-striatalen

dopaminergen System (das zu den Basalganglien zählt) zugeschrieben (YAZGAN et

al., 1996; MEAD und HAMPSON, 1996).

Eine Lateralisierung von Hirnfunktionen wurde lange Zeit nur für den Menschen

angenommen (LEVY, 1977). Mittlerweile wird sie jedoch als evolutionäres Prinzip

angesehen (CARLSON und GLICK, 1996). Dazu beigetragen haben zahlreiche Studien

über funktionelle und morphologische Hirnasymmetrien verschiedenster Spezies

(Primaten, Nager, Vögel etc.) (LEMAY, 1985; GALABURDA et al., 1985; ARNOLD und

BOTTJER, 1985). Diese Lateralisierungen der Gehirne von Tieren können als Modelle

14

für humane Verhaltensfunktionen verwendet werden, die eine präzisere Bestimmung

der Beziehung zwischen chemischen und morphologischen Asymmetrien und

Verhaltensprozessen ermöglichen (CARLSON und GLICK, 1996).

Als wichtige Manifestierung der funktionellen Lateralisierung wird Rotationsverhalten

angesehen. Bei gesunden Labornagern bestimmter Stämme, wie z.B. bei Sprague-

Dawley Ratten, kann Circling-Verhalten in Form ganzer (360°) Drehungen vor allem

nachts, in der aktiven Phase der Tiere, spontan auftreten (GLICK und COX, 1978). Bei

solchen Tieren kann Rotationsverhalten auch durch die systemische Applikation

pharmakologisch wirksamer Substanzen, wie dem Amphetamin, ausgelöst oder

verstärkt werden (JERUSSI und GLICK, 1974).

Künstlich hervorrufen lässt sich Drehverhalten durch unilaterale elektrische oder

chemische Läsionen in zahlreichen Hirnregionen, wie der Substantia nigra

(UNGERSTEDT und ARBUTHNOTT, 1970), dem Striatum (UNGERSTEDT, 1971) oder dem

frontalen Cortex (GLICK und GREENSTEIN, 1973). Besondere Bedeutung kommt hierbei

Ratten mit unilateralen Läsionen des nigro-striatalen dopaminergen Systems zu, die

zu einem wichtigen Tiermodell für die Erkrankung Morbus Parkinson geworden sind

(KAAKKOLA und TERAVAINEN, 1990).

Ein massiv verstärktes, spontanes Rotationsverhalten findet sich bei zahlreichen

Maus- und Rattenmutanten (z.B.: RATTY et al., 1990; TRUETT et al., 1994; BLOOM und

HULTCRANTZ, 1994; GIBSON et al., 1995; YONEZAWA et al., 1999; PROBST et al., 1998;

ALAGRAMAM et al., 1999; RABBATH et al., 2001).

Es gibt verschiedene Theorien darüber, welche Strukturen hier für das Drehverhalten

entscheidend sind. Zum einen werden die Rotationen auf Schäden des Innenohres

zurückgeführt. Viele der drehenden Nagermutanten sind zusätzlich taub und zeigen

Defekte im vestibulären System, welche als Ursache für das Drehverhalten

angesehen werden (BLOOM und HULTCRANTZ, 1994; GIBSON et al., 1995; YONEZAWA et

al., 1999; PROBST et al., 1998; ALAGRAMAM et al., 1999; RABBATH et al., 2001). Diese

Mutanten haben sich als gutes Taubheitsmodell erwiesen, da in vielen Fällen der für

die Taubheit verantwortliche Gendefekt bei Mensch und Maus homolog ist. Vielfach

wird das Defektgen beim Menschen erst durch eine Identifizierung des mutierten

Genes bei der Maus ausfindig gemacht (WEIL et al., 1997; PROBST et al, 1998). Andere

Gruppen sehen in Asymmetrien im Bereich der Basalganglien, vor allem im nigro-

striatalen dopaminergen System, den Auslöser für Drehverhalten (RATTY et al., 1990).

15

Über eine Untersuchung der Pathophysiologie des Phänomens „Circling“ und über

eine Lokalisierung der Gendefekte erhofft man sich nähere Informationen zur

Physiologie und Pathophysiologie der beteiligten Strukturen.

In unserer Arbeitsgruppe wird seit einiger Zeit mit zwei Rattenmutanten gearbeitet,

der LEW/Ztm-ci2-Mutante und der BH.7A/Ztm-ci3-Mutante, die beide aus dem

Zentralen Tierlabor der Medizinischen Hochschule Hannover (Ztm) stammen. Beide

Mutanten zeigen Bewegungsstörungen, die sich als spontanes Drehverhalten

äußern. Die Rotationen treten zumeist paroxysmal als Salven ganzer (360°)

Rotationen auf.

Die LEW/Ztm-ci2-Mutante zeigt zusätzlich zum Rotationsverhalten weitere

motorische Anomalien (Hyperlokomotion, Opisthotonus und Ataxie) sowie Taubheit

(LÖSCHER et al., 1996; KAISER et al., 2001). Die BH.7A/Ztm-ci3-Mutante zeigt zwar

ebenfalls Drehverhalten und eine leichte Hyperlokomotion, aber keine Anzeichen für

eine vorliegende Taubheit.

Diese beiden Mutanten erlauben eine nähere Untersuchung der Pathophysiologie

des Circling-Phänomens. In den durchgeführten Studien sollte eine

Charakterisierung der Mutanten vorgenommen werden und die Tiere sollten auf ihren

Modellcharakter für die Taubheitsforschung und für Bewegungsstörungen sowie

Hirnasymmetrien hin überprüft werden.

16

2. Literaturübersicht

2.1. Cerebrale Lateralität bei Mensch und Tier

2.1.1. Physiologie

Das menschliche Gehirn ist auf unterschiedlichen Ebenen lateralisiert mit der

Konsequenz einer großen Reihe von links-rechts Asymmetrien von Hirnfunktionen

(KANDEL, 1995).

1861 entdeckte der französische Neurologe Broca, dass Aphasien (zentrale

Sprachstörungen) durch Läsionen der linken cerebralen Hemisphäre ausgelöst

werden (KANDEL, 1995).

1870 fanden der deutsche Physiologe Gustav Fritsch und der Psychiater Eduard

Hitzig, dass Extremitätenbewegungen einer Seite durch Stimulation bestimmter

Cortexbereiche derckontralateralen Seite hervorgerufen werden können. Die rechte

Hand wird von der linken Hemisphäre gesteuert, welche auch die Sprache

kontrolliert, die linke Hand von der rechten. Bei den meisten Menschen (90 %

Rechtshänder) ist die linke Hemisphäre dominant (KANDEL, 1995).

Der Neurochirurg Wilder Penfield stellte bei Patienten mit einer einseitigen

Schädigung des Temporallappens Gedächtnisverluste fest. Patienten mit

linksseitigen Schädigungen im Temporallappen hatten Schwierigkeiten, sich an

Sprachmaterial, wie zum Beispiel eine Liste mit Substantiven, zu erinnern. Patienten

mit rechtsseitigen Schädigungen hingegen behielten zwar ihr normales verbales

Gedächtnis, konnten sich jedoch Muster von sensorischen Informationen schlechter

merken. Die linke Hemisphäre ist also für die Verarbeitung verbaler, die rechte für die

Verarbeitung nicht-verbaler Informationen zuständig (KUPFERMANN, 1995).

Die Unterschiedlichkeit der Hirnhälften lässt sich auch morphologisch

nachvollziehen. So zeigten Geschwind und Levitsky 1968, dass das linke Planum

temporale, eine Region auf der oberen Fläche des Temporallappens, in welcher das

Wernicke-Sprachfeld lokalisiert ist, in 65% der Fälle größer ist als das Planum der

rechten Seite (KUPFERMANN, 1995).

Es gibt heute zahlreiche Beweise dafür, dass die beiden Hemisphären

unterschiedliche kognitive Fähigkeiten vermitteln und unterschiedlich spezialisiert

17

sind (LEVY, 1977; KANDEL, 1995). Solche Asymmetrien zwischen den beiden

Hemisphären kommen aber nicht nur beim Menschen vor (LEMAY, 1985; GALABURDA

et al., 1985; ARNOLD und BOTTJER, 1985). Vor allem bei Labornagern wurden hierzu

ausführliche Untersuchungen durchgeführt. So ergaben sich erste Hinweise auf

funktionelle Asymmetrien im Rattengehirn aus Untersuchungen, die zeigten, dass

systemisch appliziertes Amphetamin bei normalen, gesunden Sprague-Dawley

Ratten zu lateralisiertem Drehverhalten führt (JERUSSI und GLICK, 1974), welches auf

eine intrinsische, bilaterale Imbalanz im Dopamin-Gehalt des nigro-striatalen

Systems zurückgeführt wurde. Weiterführende Untersuchungen zeigten, dass z.B.

normale Sprague-Dawley Ratten, vor allem während ihrer nächtlichen

Aktivitätsphasen, spontan mit Seitenpräferenz drehen (GLICK und COX, 1978) und

dass die Applikation dopaminerger Substanzen (Amphetamin, Apomorphin,

Levodopa), aber auch von Scopolamin oder Morphin, bei normalen Ratten und

Mäusen Rotationsverhalten auslöst (GLICK et al., 1976). Bei diesen Tieren konnte

eine Differenz im Dopamin-Gehalt zwischen rechtem und linkem Striatum von 10 –

15% festgestellt werden, welche sich nach Amphetamin-Applikation auf ca. 25%

verstärkte (GLICK et al., 1976).

Zahlreiche folgende Studien zeigten weitere biochemische Asymmetrien in normalen

Rattengehirnen, darunter für den Noradrenalin-Gehalt in Thalamus und Striatum, für

Gamma-Aminobuttersäure-Gehalte in Substantia nigra, Nucleus accumbens,

Thalamus und Striatum, für Serotonin in Striatum, Nucleus accumbens und

Hippocampus (CARLSON und GLICK, 1992, 1996).

Durch verschiedene Effekte unilateraler Läsionen wurden des weiteren funktionelle

Asymmetrien von Striatum, Cortex und Hippocampus nachgewiesen (CARLSON und

GLICK, 1992). Morphologische Asymmetrien konnten ebenfalls z.B. für den Cortex

und den Hippocampus gezeigt werden (CARLSON und GLICK, 1992).

Geschlechts- und Stammesunterschiede in der Ausprägung dieser Asymmetrien

wiesen auf die Beteiligung von Geschlechtshormonen und genetischen Faktoren bei

der Manifestierung von Imbalanzen hin (CARLSON und GLICK, 1992).

Auch eine Händigkeit wurde bei Ratten durch Funktionstests nachgewiesen

(CARLSON und GLICK, 1992).

18

2.1.2. Pathologie

Die im physiologischen Zustand vorliegende funktionelle Asymmetrie von

Hirnregionen spiegelt sich in der asymmetrischen Ausprägung zahlreicher

Hirnerkrankungen wider. Einige dieser Erkrankungen mit lateralisierter Symptomatik

sollen nachfolgend beschrieben werden.

Der Apoplex („Schlaganfall“, Hirninfarkt), der sowohl ischämische Insulte als auch

Hirnblutungen umfasst, führt in den meisten Fällen zu einer lateralisierten

Symptomatik. Infarkte im linken Territorium der Arteria cerebri media mit

Cortexbeteiligung gehen in der Regel mit motorischen, sensiblen oder

sensomotorischen Hemiparesen (Halbseitenlähmungen) und verschiedenen Typen

und Schweregraden einer Aphasie einher. Ausgedehnte Infarkte in der rechten

Hemisphäre mit Cortexbeteiligung führen in der Initialphase zu einem mehr oder

weniger ausgeprägten Hemineglect nach links (RINGELSTEIN, 1992). Klinisch

manifestiert sich ein Hemineglect z.B. darin, dass die Patienten links liegende Dinge

übersehen, die linke Körper- bzw. Gesichtshälfte nicht waschen oder die linke Hälfte

der Kleider nicht korrekt anziehen. Im Extremfall werden die linken, meist gelähmten

Gliedmaßen nicht bemerkt oder nicht als zum eigenen Körper gehörend akzeptiert

(Alien Hand/Limb-Phänomen) (HARTJE, 1992).

Interessant ist die Annahme, dass psychotische Störungen, wie Schizophrenie oder

bipolare Störungen, Folge von Anomalien der Entwicklung cerebraler Asymmetrie

sind (KLAR, 1999).

Erkrankungen mit lateralisierter Ausprägung, die mit Bewegungsstörungen

einhergehen, entstehen oftmals in den Basalganglien, einer Gruppe subkortikaler

Kerngebiete, die die Bewegung modulieren (s. Kap. 2.3.). Zu den hyperkinetischen

Bewegungsstörungen (Erkrankungen, die sich durch unwillkürliche Bewegungen

auszeichnen, s. Kap. 2.3.3.) mit Ursprung in den Basalganglien zählt der

Hemiballismus. Dieser ist charakterisiert durch heftige und schleudernde

Bewegungen proximal betonter Muskelgruppen (insbesondere Schulter und Hüfte)

einer Körperseite. Diese Basalganglienerkrankung wird mit einer Läsion des Nucleus

subthalamicus oder seiner afferenten oder efferenten Bahnen in Zusammenhang

gebracht (CONRAD, 1996).

19

Eine weitere hyperkinetische Erkrankung ist die Chorea Huntington. Als Chorea oder

choreatische Bewegungen werden unwillkürliche, unregelmäßige, abrupt

auftretende, kurzzeitige, nicht repetitive und zufällig verteilte Muskelkontraktionen mit

Bewegungseffekt bezeichnet, die alle Körperregionen (einschließlich Nacken, Rumpf

und Gesicht) betreffen können. Auch die Chorea kann halbseitig als Hemichorea

auftreten, wenn unilaterale Schädigungen, vor allem im Bereich der Basalganglien,

vorliegen (WEINDL, 1996).

Die wohl wichtigste hypokinetische Bewegungsstörung (Erkrankungen, die sich

durch verminderte Motorik auszeichnen, s. Kap. 2.3.3.), die den Basalganglien

entspringt, ist der Morbus Parkinson (s. auch Kap. 2.4.5.). Die Kardinalsymptome

dieser Erkrankung sind Hypokinesie (Verminderung von Spontanbewegungen),

Bradykinesie (charakteristische Bewegungsverlangsamung) und Akinesie (Hemmung

des Bewegungsstarts), sowie Rigor (erhöhter Muskeltonus) und Tremor

(Muskelzittern) (POEWE, 1996). Die Symptomatik beginnt asymmetrisch und bleibt

auch im weiteren Verlauf teils lateralisiert (HORNYKIEWICZ, 1989). Der Symptom-

Komplex beruht auf einer massiven Degeneration dopaminerger Neurone in der

Substantia nigra pars compacta (s. Kap. 2.4.5.), wiederum eine zu den

Basalganglien zählende Struktur (LUDIN, 1988).

Eine weitere Erkrankung mit Ursprung in den Basalganglien, die Rotationsepilepsie,

zeichnet sich durch Anfälle aus, während derer die Patienten wiederholt auf engen

Kreisen laufen oder plötzliche Rotationen (mindestens um 180°) des gesamten

Körpers, bis hin zu mehreren Drehungen, zeigen. Oft sind diese Phänomene mit

typischen epileptischen Anfällen, d.h. mit myoklonischen, klonischen oder tonischen

Anfällen, assoziiert (DONALDSON, 1986). Die Rotationsepilepsie kann im

Zusammenhang mit idiopathischen generalisierten Epilepsien (SAKA et al., 1996;

TRINKA et al., 1997; AGUGLIA et al., 1999), aber auch bei fokalen Formen der

Epilepsie vorkommen (DONALDSON et al., 1986; SAKA et al., 1996; VERCUEIL et al.,

1999). Während einer Rotationsepilepsie werden paroxysmale Veränderungen im

EEG sichtbar (SAKA et al., 1996; TRINKA et al., 1997; AGUGLIA et al., 1999). Eine

Ursache für die gezeigten Rotationen wird in asymmetrischen Entladungen der

Basalganglien gesehen (VERCUEIL et al., 1999; RAMMELLI et al., 1999).

20

Neben den Basalganglien sind weitere wichtige Regionen an Physiologie und

Pathologie der Motorik beteiligt. Deren Aufgaben sollen im Folgenden beschrieben

werden.

2.2. Zentrale Regulation der Motorik

Kenntnisse über die an der Kontrolle der Motorik beteiligten Gehirnregionen sind zum

Verständnis der Pathophysiologie von Bewegungsstörungen wichtig.

Der Antrieb, eine Bewegung auszuführen, entsteht im limbischen System. Dieses

gibt die entsprechenden Impulse an den Assoziationscortex weiter, von wo aus die

Bewegungsimpulse dann drei getrennte Wege nehmen (TREPEL, 1995), um

schließlich im Thalamus und dem motorischen Cortex wieder zu konvergieren. Von

dort aus laufen die motorischen Impulse dann in der Pyramidenbahn (Tractus

corticospinalis) zu den α-Motoneuronen des Rückenmarks, welche letztendlich die

Ausführung der Bewegung veranlassen (TREPEL, 1995).

Der erste Weg führt als cortico-thalamo-corticale Neuronenschleife vom Cortex über

den Thalamus wieder auf die bewegungsvorbereitenden Zentren im prämotorischen

und motorischen Cortex des Frontallappens zurück. Vor der Weiterleitung der

Impulse zum Rückenmark bedarf es aber der „Rückmeldung“ aus den beiden

anderen Wegen.

Der zweite Weg führt über den cortico-pontinen Trakt zum Cerebellum, welches für

die Bewegungskoordination zuständig ist. Störungen in diesem Bereich können sich

z.B. in einer Ataxie äußern.

Der dritte Weg läuft über die Basalganglien, eine Ansammlung von Kerngebieten, die

für die Bewegungsmodulation zuständig sind. Sie können das Bewegungsausmaß

verändern – Störungen in diesem Bereich können somit zu Hypo- oder

Hyperkinesien führen.

Die Bewegungsimpulse aus diesen beiden letzten Wegen konvergieren im Thalamus

und greifen dort rückkoppelnd in die cortico-thalamo-corticale Neuronenschleife ein.

Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die motorischen Impulse im Kleinhirn

eine Feinabstimmung erfahren und von den Basalganglien bahnend oder

unterdrückend verarbeitet werden, wobei beide Anteile zentralnervös-motorischer

21

Integration im Thalamus konvergieren. Dort wird ein „Fazit“ gezogen: Fein

abgestimmte Bewegung wird zugelassen / nicht zugelassen / partiell bzw. in

bestimmter Form zugelassen. Dieses Fazit wird dann dem Motorcortex vermittelt, der

via Pyramidenbahn die Bewegungsimpulse ins Rückenmark weiterleitet (TREPEL,

1995).

2.3. Die Basalganglien 2.3.1. Anatomie

Die Basalganglien sind subkortikale Kerngebiete, welche, wie bereits geschildert, an

höherrangigen, kognitiven Aspekten der Bewegungskontrolle teilhaben.

Zu den Basalganglien werden das Corpus striatum (Striatum), der Globus pallidus,

der Nucleus subthalamicus sowie die Substantia nigra gezählt (s. Abb. 1). Bei

Primaten setzt sich das Striatum aus dem Nucleus caudatus, dem Putamen

(zusammen auch als Neostriatum oder dorsales Striatum bezeichnet), dem Nucleus

accumbens und Teilen des Tuberculum olfactorium (zusammen mit ventralen

Anteilen von Caudatus und Putamen auch als ventrales Striatum bezeichnet)

zusammen (AFIFI, 1994). Bei Nagern wird hingegen das dorsale Striatum nicht

unterteilt (FLAHERTY und GRAYBIEL, 1994). Der Globus pallidus ist in ein externes

(entspricht dem Globus pallidus bei Nagern) und ein internes (entspricht dem

Nucleus entopeduncularis der Nager) Segment, sowie einen ventralen Anteil

(Ventrales Pallidum) unterteilt. Die Substantia nigra wird in eine dopaminreiche Pars

compacta und eine dopaminarme Pars reticulata unterteilt (AFIFI, 1994; FLAHERTY und

GRAYBIEL, 1994).

Verschiedene Untersuchungen der Projektionsbahnen der Basalganglien lassen

vermuten, dass die Informationen über mehrere Schleifensysteme laufen, welche

parallel organisiert sind und vom Cortex über die Basalganglien und den Thalamus

wieder zu bestimmten Regionen des frontalen Cortex laufen. Man geht derzeit von 3

großen „Familien“ von Schleifen mit getrennter Repräsentation sowohl in der

Hirnrinde als auch im Striatum und den Frontalhirnregionen aus: Schleifen mit primär

motorischen Funktionen (Zwischenglied im Striatum ist das Putamen), Schleifen mit

höher integrativen oder assoziativen Funktionen (Zwischenglied im Striatum ist der

22

Nucleus caudatus) und Schleifen mit „limbischen“ Funktionen (Zwischenglied im

Striatum ist das ventrale Striatum mit Nucleus accumbens und Tuberculum

olfactorium) (ALEXANDER und CRUTCHER, 1990).

2.3.2. Physiologie

Das Striatum ist, wie in Abb. 1 ersichtlich, die Eingangsstruktur der Basalganglien.

Die wichtigsten exzitatorischen (glutamatergen und aspartatergen) Eingänge auf das

Striatum kommen vom Cortex. Zusätzlich gibt es weitere Projektionen vom

Thalamus, den dorsalen Raphekernen, der Amygdala, dem Locus coeruleus und der

Substantia nigra (PARENT und HAZRATI, 1995). Für die Verarbeitung und Weiterleitung

der erhaltenen Informationen enthält das Striatum Projektionsneurone, die Gamma-

Aminobuttersäure (GABA) als Neurotransmitter verwenden. Die striatalen Neurone

sind mittelgroß und besitzen Ansatzstellen für die Synapsen anderer

Neurotransmitter und Modulatoren, die sog. „spines“. Neben GABA enthalten sie

auch bestimmte Neuropeptide wie z.B. das Enkephalin bzw. Substanz P/ Dynorphin

(PARENT und HAZRATI, 1995). Die GABAergen Projektionsneurone des Striatums

stehen mit den Ausgangsstrukturen der Basalganglien, dem Globus pallidus internus

und der Substantia nigra pars reticulata, über zwei unterschiedliche

Projektionsbahnen in Verbindung (DELONG, 1990). Der sog. direkte striato-nigrale

Weg inhibiert monosynaptisch GABAerge Neurone im Globus pallidus internus und

der Substantia nigra pars reticulata und bewirkt nachfolgend eine Enthemmung des

Thalamus. Beim sog. indirekten striato-pallidalen Weg existiert eine polysynaptische

Verschaltung. Die striatalen Neurone projizieren inhibitorisch auf den Globus pallidus

externus. Somit ist die GABAerge Hemmung des Nucleus subthalamicus durch den

Globus pallidus externus abgeschwächt und der Nucleus subthalamicus kann über

glutamaterge Projektionen eine exzitatorische Wirkung auf die Ausgangsstrukturen

der Basalganglien ausüben. Dieser Projektionsweg sorgt also, anders als der direkte

Weg, für eine zusätzliche Hemmung des Thalamus.

Es resultiert also aus dem direkten Weg eine vermehrte und aus dem indirekten Weg

eine verminderte exzitatorische Wirkung des Thalamus auf verschiedene, an der

Motorik beteiligte, corticale Areale (ALEXANDER und CRUTCHER, 1990; WICHMANN und

23

DELONG, 1996). Man geht davon aus, dass ein Gleichgewicht zwischen den beiden

beschriebenen Wegen für die Bewegungskoordination eine wichtige Rolle spielt. So

wird dem direkten striato-nigralen Weg eine Initiierung gewollter und dem indirekten

striato-pallidalen Weg eine Hemmung ungewollter Bewegungen zugeschrieben (MINK

und THATCH, 1993).

Abb. 1: Schematische Darstellung wichtiger Verbindungen innerhalb der Basalganglien unter physiologischen Bedingungen. Inhibitorische Verbindungen (Neurotransmitter: GABA) sind durch schwarze Pfeile dargestellt, exzitatorische Verbindungen (Neurotransmitter: Glutamat/Aspartat) durch weiße Pfeile. Dargestellt ist die sog. cortico-striato-thalamo-corticale Feedback-Schleife. Die GABAergen striato-nigralen Projektionsneurone (direktes System), die Substanz P und Dynorphin als Cotransmitter enthalten, wirken inhibitorisch direkt auf die GABAergen Neurone des Ausgangskomplexes der Basalganglien (Globus pallidus internus und Substantia nigra pars reticulata). Die GABAergen striato-pallidalen Projektionsneurone (indirektes System), die als Cotransmitter Enkephalin (Enk.) enthalten, projizieren zu den GABAergen Neuronen des Gobus pallidus externus, die wiederum inhibitorische Projektionen zum Nucleus subthalamicus haben. Das indirekte System wirkt über den Nucleus subthalamicus exzitatorisch auf den Ausgangskomplex der Basalganglien. Die GABAergen Neurone des Ausgangskomplexes projizieren nun inhibitorisch zu den ventralen Thalamuskernen, die wiederum exzitatorisch auf den frontalen Cortex zurückwirken. Nach DELONG, 1990, sowie WICHMANN und DELONG, 1996.

Striatum

Cortex

Hirnstamm/Rückenmark

Globus pallidus externus

Nucleussubthalamicus

Globus pallidus Internus/Substantia nigra pars reticulata

ThalamusG

luta

ma

t

Glu

tam

at

Glu

tam

at

GABA

GA

BA

/Su

bs

tan

z P

GA

BA

GA

BA

/

En

k.

24

Auf der Annahme, dass unter physiologischen Bedingungen ein Gleichgewicht

zwischen den beiden Wegen besteht, beruhen Hypothesen zur Entstehung

Basalganglien-bedingter Bewegungsstörungen (WICHMANN und DELONG, 1996).

2.3.3. Bewegungsstörungen mit Ursprung in den Basalganglien

Hypokinesien (s. Abb. 2), die sich durch eine Verminderung oder Dämpfung

motorischer Aktivität auszeichnen, wären demnach Folge einer verstärkten

Transmission durch das indirekte System. Eine Überinhibition im Globus pallidus

externus verursacht eine Enthemmung des Nucleus subthalamicus, welcher nun

stark exzitatorisch auf Globus pallidus internus und Substantia nigra pars reticulata

einwirken kann. Es kommt somit zu einer erhöhten Aktivität der GABAergen Neurone

der Ausgangsstrukturen, wodurch die Thalamusneurone inhibiert werden. Resultat ist

eine verminderte exzitatorische Projektion des Thalamus auf den frontalen Cortex

und damit eine verminderte Bewegung (DELONG, 1990).

Hyperkinesien (s. Abb. 3) sind Bewegungsstörungen, bei denen es zu einem

Bewegungsüberschuß mit schnellen, unkontrollierbaren Bewegungen kommt (ILLERT,

1994). Für die Pathogenese dieses Typs von Bewegungsstörungen besteht die

Hypothese, dass der direkte striato-nigrale Projektionsweg überwiegt und es so zu

einer Überinhibition der Ausgangsstrukturen kommt. Somit wird der Thalamus

disinhibiert, und es kommt zu einer verstärkten Aktivität thalamo-corticaler Neurone

(DELONG, 1990; WICHMANN und DELONG, 1996).

25

Abb. 2: Schematische Darstellung der Hypothese zur Entstehung hypokinetischer Bewegungsstörungen (Parkinson`sche Krankheit). Ein Verlust des striatalen Dopamins führt zu einer Steigerung der Transmission über das indirekte Projektionssystem mit resultierender Überinhibition des Globus pallidus externus, mit Disinhibition des Nucleus subthalamicus und damit zu einer erhöhten exzitatorischen Stimulation des Ausgangskomplexes der Basalganglien (Globus pallidus internus und Substantia nigra pars reticulata). Daraus resultiert eine Überinhibition thalamischer Kerne mit verminderter Aktivität thalamo-corticaler Neurone. Nach DELONG 1990, sowie WICHMANN und DELONG, 1996. Weitere Erläuterungen s. Abb. 1.

Striatum

Cortex


Globus pallidus externus

Nucleussubthalamicus


Thalamus

Glu

tamat

Glu

tamat

Glu

tamat

GABA

GA

BA

/Su

bstan

z P

GA

BA

GA

BA

/

En

k.

26

Abb. 3: Schematische Darstellung der Hypothese zur Entstehung hyperkinetischer Bewegungsstörungen. Durch ein Überwiegen des direkten striato-nigralen Projektionssystems kommt es zur Überinhibition des Ausgangskomplexes der Basalganglien und resultierender verminderter Disinhibition thalamischer Kerne. Dadurch kommt es zu einer verstärkten Aktivität thalamo-corticaler Neurone. Nach DELONG, 1990, sowie WICHMANN und DELONG, 1996). Weitere Erläuterungen s. Abb. 1.

Striatum

Cortex


Globus pallidusexternus

Nucleus subthalamicus


ThalamusG

lutamat

Glutam

at

Glutam

at

GABA

GABA/Substanz P

GABA

GABA/

Enk.

27

2.4. Dopamin (DA)

2.4.1. Anatomie

Seit das Monoamin DA 1957 in charakteristischer Verteilung im Gehirn

nachgewiesen wurde, weiß man, dass DA ein wichtiger Neurotransmitter ist. Die

dopaminergen Neurone wurden vor allem im Mesencephalon und Diencephalon

nachgewiesen (STARKE, 1996).

Das mesencephalische DA-System ist das größte dopaminerge System. Bei der

Ratte unterteilt man dieses System in drei Zellgruppen: A8, A9 und A10. Die Zellen

der Gruppe A10 befinden sich in der ventralen tegmentalen Region (VTA), welches

die ventromedialste Region des Mittelhirns ist. Lateral an die VTA schließt sich die

Substantia nigra an, in welcher die Neurone der A9 liegen. Die meisten Neurone

dieser Gruppe liegen hierbei in der Pars compacta der Substantia nigra (SNC). Als

A8 Zellgruppe werden die DA-Zellkörper in der retrorubralen Region bezeichnet, die

caudal und dorsal der Substantia nigra zu finden ist (DAHLSTROM und FUXE, 1964).

Diese drei Zellgruppen finden sich auch bei humanen und nicht-humanen Primaten.

Die anatomische Unterteilung der DA-Zellen reflektiert Unterschiede in ihren

efferenten Projektionen. Die Neurone der A10 projizieren zum Nucleus accumbens

und anderen limbischen Regionen und werden als das mesolimbische DA-System

bezeichnet. Die Projektionen von der A9 Zellgruppe führen zum Striatum und

enthalten das nigro-striatale DA-System (JOEL und WEINER, 2000). Des weiteren gibt

es verschiedenste Projektionen von SNC und VTA zu corticalen Regionen, wie dem

präfrontalen, cingulaten, perirhinalen oder rhinalen Cortex. Diese werden als das

mesocorticale DA-System bezeichnet (FALLON und LOUGHLIN, 1995). Weitere

Zellkörper, als tubero-infundibuläres System benannt, liegen im Nucleus

infundibularis. Die zugehörigen Axone ziehen zur Eminentia mediana. Peripher

kommt DA in einigen postganglionär-sympathischen Neuronen, so z.B. in der Niere,

vor (STARKE, 1996).

28

2.4.2. Physiologie

Die Wirkungen des DAs sind vielfältig. So greift vor allem das DA des nigro-striatalen

Systems modulierend in Bewegungsabläufe ein (ALEXANDER und CRUTCHER, 1990;

FLAHERTY und GRAYBIEL, 1994). Beim mesolimbischen DA-System spricht man von

einer „dopaminergen Belohnungsbahn“, denn diese Neurone sind bei der

Empfindung von Lust oder Freude vermehrt aktiv. Eine erhöhte Aktivität wird hier z.B.

im Zusammenhang mit Freß- (RICHARDSON und GRATTON, 1996) und Sexualverhalten

(FIORINO et al., 1997) beobachtet. Auch abhängigkeiterzeugende Substanzen, wie

Opiate, Amphetamin, Ethanol oder Cocain, erhöhen bei Ratten die synaptischen DA-

Konzentrationen in diesem Bereich (DI CHIARA und IMPERATO, 1988) und die

antipsychotische Wirkung von DA-Rezeptor-Antagonisten wird der Blockade von

Rezeptoren in diesen Arealen zugeschrieben (STARKE, 1996). Den mesocorticalen

DA-Projektionen wird vor allem eine Beteiligung an kognitiven Prozessen

zugeschrieben (LE MOAL und SIMON, 1991). Das DA des tubero-infundibulären

Systems erreicht über die Portalgefäße die Adenohypophyse und hemmt dort die

Prolaktinsekretion, das periphere DA übt vor allem lokale Wirkungen auf das

Gefäßsystem aus (STARKE, 1996).

Die Zielstrukturen des freigesetzten DAs sind die G-Protein gekoppelten DA-

Rezeptoren, von welchen es 5 Typen gibt (D1 – D5). Die zuerst gefundenen D1- und

D2-Rezeptoren übertreffen zahlenmäßig die später gefundenen D3- bis D5-

Rezeptoren weit, und so werden die Rezeptoren heute in zwei Unterfamilien

gegliedert (STRANGE, 1996): D1 und D5 als D1-ähnliche und D2, D3 und D4 als D2-

ähnliche. Zwischen den Rezeptoren bestehen Unterschiede hinsichtlich Lokalisation,

physiologischer Funktion und biochemischer Reaktion. Im Striatum findet man

hauptsächlich D1- und D2-Rezeptoren, im Cortex und im limbischen System

kommen alle Subtypen vor, in der Hypophyse gibt es fast ausschließlich D2-

Rezeptoren und im Gefäßsystem herrschen D1-, D2- und D4-Rezeptoren vor.

Die D1-Rezeptoren sind somit für die Bewegungsmodulation, für kognitive und

kardiovaskuläre Funktionen wichtig. D2-Rezeptoren vermitteln

Bewegungsmodulation und Verhalten, sowie die Prolaktinsekretion in der

Hypophyse. D3- und D4-Rezeptoren sind wahrscheinlich an kognitiven und

29

emotionalen Vorgängen und Verhalten beteiligt, während die Bedeutung der D5-

Rezeptoren noch weitgehend unklar ist (JABER et al., 1996).

Die Freisetzung des DAs, und zwar sowohl die basale als auch die induzierte, wird

über präsynaptische Autorezeptoren vom D2-Typus gesteuert (DUGAST et al., 1997;

TORSTENSON et al., 1998).

2.4.3. Metabolismus

Das Monoamin DA wird aus Tyrosin synthetisiert, indem dieses zunächst durch das

Enzym Tyrosinhydroxylase (TH) in 3,4-Dihydroxyphenylalanin umgewandelt wird.

Dieses carboxyliert die aromatische L-Aminosäure-Decarboxylase in einem nächsten

Schritt zu DA. Die Geschwindigkeit der Synthese wird durch die TH bestimmt,

welche nur in Catecholamin-Neuronen vorkommt. Über eine immunhistologische

Anfärbung dieses Enzyms lassen sich in den entsprechenden Kerngebieten die

dopaminergen Neurone identifizieren (NICHOLLS et al., 1995). Das fertige DA wird aus

dem Axoplasma in Vesikel aufgenommen und dort gespeichert, wobei hier Kurzzeit-

und Langzeitspeicher unterschieden werden können (ARBUTHNOTT et al., 1991; Abb.

4). Aus den Kurzzeitspeichern wird das DA Calcium-abhängig durch Exozytose in

den synaptischen Spalt freigesetzt. Zytoplasmatisches DA aus dem Langzeitspeicher

wird Carrier-vermittelt (DA-Transporter) in den Extrazellularraum abgegeben. Bei

dem Carrier handelt es sich um ein Membranprotein, welches zu den Na+, Cl- -

abhängigen Transportproteinen gehört. Der DA-Transporter stellt einen wichtigen

Angriffspunkt für bestimmte Pharmaka, wie z.B. Psychostimulantien, dar, und über

dieses Protein gelangen auch Neurotoxine in die Zelle (REITH et al., 1997).

Die DA-Inaktivierung (s. Abb. 4) kann intrazellulär über das Enzym

Monoaminoxidase erfolgen. Es entsteht Dihydroxyphenylessigsäure, welche

extrazellulär zu Homovanillinsäure umgewandelt wird. Des weiteren kann DA auch

extrazellulär mittels Catechol-O-Methyl-Transferase über das Zwischenprodukt 3-

Methoxytyramin zu Homovanillinsäure abgebaut werden.

Die Monoaminoxidase kommt in zwei Isoformen vor: Typ A und Typ B, welche beide

DA, Serotonin und Noradrenalin als Substrate haben. Die Monoaminoxidase-B ist bei

der Ratte im Vergleich zur Monoaminoxidase-A zu geringeren Anteilen (10 – 20%)

30

an der Desaminierung dieser Transmitter in und außerhalb der Synaptosomen

beteiligt (FAGERVALL und ROSS, 1986). Neu synthetisiertes DA wird vorwiegend von

der Monoaminoxidase-A abgebaut (DEMAREST et al., 1980). Im Rahmen des

„normalen“ Katabolismus wird DA durch die Monoaminoxidase-A intrazellulär zu

Dihydroxyphenylessigsäure umgewandelt, so dass man aus der Konzentration der

Dihydroxyphenylessigsäure Informationen über die DA-Syntheserate und den DA-

Umsatz erhält.

Abb. 4: DA-Speicherung und Freisetzung (nach JUSTICE et al., 1988; modifiziert von ARBUTHNOTT et al., 1991). Abkürzungen: DOPA: Dihydroxyphenylalanin; DOPAC: Dihydroxyphenylessigsäure; HVA: Homovanillinsäure; MAO: Monoaminoxidase.

DA: vesikulärer Langzeit-speicher

DA: Zytoplasma-tisches Kompartiment

DA: vesikulärer Kurzzeit-speicher

Tyrosin

DOPA

MAO

DOPAC

Exozytose

Dopamin-transporter

DOPACHVA

synaptischer Spalt

DA

DA

31

2.4.4. Pharmakologie

Zahlreiche Substanzen sind in der Lage, modulierend in das DA-System

einzugreifen. Dieser Umstand wird therapeutisch (z.B. bei Morbus Parkinson), aber

auch experimentell genutzt.

Das Psychostimulans Amphetamin ist ein Substrat der Monoamintransporter in der

Plasmamembran catecholaminerger Neurone und der Membran der Speichervesikel,

wodurch es mit den Monoaminen um die Aufnahme in die Nervenendigung und

Vesikel konkurriert. So wirkt Amphetamin als indirektes Sympathomimetikum durch

eine nicht-exocytotische, transportervermittelte Freisetzung von DA (GÖTHERT et al.,

1996). Zusätzlich hemmt es die Wiederaufnahme und, durch eine Inhibition der

Monoaminoxidase, den Katabolismus von DA (ZETTERSTRÖM et al., 1986). Bei

Versuchstieren zeigt sich nach systemischer Applikation einer niedrigen

Amphetamin-Dosis eine erhöhte lokomotorische Aktivität, welche in Bezug zur

Freisetzung von Noradrenalin gebracht wird. Bei Applikation höherer Dosen weicht

die Hyperlokomotion einer Reihe von Stereotypien, wie Schnüffeln, Lecken,

Zwangsnagen etc., welche dem DA-System zugeschrieben werden (FOG, 1972;

RANDRUP und MUNKVAD, 1975). Wiederholte Amphetamingaben bei Ratten führen zu

einer Sensibilisierung, welche nach intermittierender Anwendung für Monate

anhalten kann. Beim Menschen endet chronischer Gebrauch oftmals in paranoidem

Verhalten bis hin zur Psychose (KALIVAS und STEWART, 1991).

Ähnliche Effekte wie das Amphetamin hat die Verabreichung nicht-kompetitiver N-

Methyl-D-Aspartat-Rezeptorantagonisten, zu welchen das MK-801 (Dizocilpin) und

das Phencyclidin zählen. Es kommt hier ebenfalls zu erhöhter Lokomotion und

Stereotypien (ALI et al., 1994). Ein verstärkter DA-Metabolismus wird für diese

Verhaltenseffekte verantwortlich gemacht (SCHMIDT und KRETSCHMER, 1997). Ein

erhöhter DA-Umsatz wird nach systemischer MK-801-Gabe z.B. in corticalen

Regionen und im Nucleus accumbens gesehen (LÖSCHER et al., 1993). Zusätzlich

findet man jedoch auch einen erhöhten DA-Umsatz im Striatum nach systemischer

Applikation und eine erhöhte striatale DA-Freisetzung nach lokaler MK-801

Applikation (IMPERATO et al., 1990; LÖSCHER et al., 1991).

DA-Rezeptoragonisten vermitteln ihre dopaminerge Wirkung durch die direkte

Aktivierung der entsprechenden Rezeptoren. Es können selektive Agonisten, die

32

unterschiedlich stark auf die verschiedenen Rezeptortypen wirken, von nicht-

selektiven Agonisten unterschieden werden. Die nicht-selektiven Agonisten besitzen

starke Affinität zu beiden Rezeptorunterfamilien (D1 und D2). Zu den selektiven

Agonisten zählen das SKF 38393 als D1-Agonist und das Quinpirol als D2-Agonist

(DUGAST et al., 1997). Ein oft verwendeter, nicht-selektiver Agonist ist das

Apomorphin (JERUSSI und GLICK, 1975). DA-Agonisten finden therapeutische

Anwendung zur Behandlung des Morbus Parkinson (FEUERSTEIN und JURNA, 1996).

Das heute wirksamste und wichtigste Parkinsonmedikament ist das Levodopa, die

Vorläufersubstanz des DA. Durch die Applikation von Levodopa wird die DA-

Synthese verstärkt (FEUERSTEIN und JURNA, 1996; SARRE et al., 1998).

DA-Rezeptorantagonisten binden an die Rezeptoren und blockieren sie so, dass DA

die Rezeptoren nicht mehr aktivieren kann. Zu diesen Substanzen gehören die

Neuroleptika, welche über eine hauptsächliche D2-Blockade gegen die produktiven

Symptome einer Schizophrenie wirksam sind (FEUERSTEIN und JURNA, 1996). Als

selektiver D1-Antagonist soll hier das SCH 23390, als selektiver D2-Antagonist das

Racloprid genannt werden (SARRE et al., 1998). Ein nicht-selektiver Antagonist mit

stärkerer Wirkung auf D2-Rezeptoren ist das Haloperidol. Antagonisten an DA-

Rezeptoren sind in der Lage, eine Katalepsie auszulösen, welche definiert wird als

die Unfähigkeit des Tieres, eine ihm auferlegte Haltung zu korrigieren (SANBERG et

al., 1996). Katalepsie wird von Neurowissenschaftlern oft verwendet, um

Verhaltensmechanismen neurochemischer Systeme zu studieren, und die Katalepsie

ist von besonderem Wert aufgrund der Ähnlichkeit der Symptomatik zu humanen

Störungen wie dem Morbus Parkinson und abnormem Verhalten nach

Basalganglienschäden (DUVOISIN, 1976; GARVER, 1984). Das Vorhandensein von

Katalepsie kann mit Hilfe des „Standard Bar-Test“ überprüft werden (KUSCHINSKY und

HORNYKIEWICZ, 1972). Bei diesem Test werden die Tiere mit den Vorderpfoten auf

einen Aluminiumblock gesetzt und verharren bei vollständig ausgeprägter Katalepsie

dort.

33

2.4.5. Besondere Neuroanatomie der dopaminergen SNC und ihre

Bedeutung für die Motorik

Die SNC liegt im ventralen Tegmentum des Mittelhirnes. Ihr Volumen beträgt bei der

Ratte ca. 0,3 mm³ und sie enthält ca. 10 000 bis 12 000 dopaminerge Neurone pro

Seite (HALLIDAY und TORK, 1986). Als Substantia nigra pars lateralis (SNL) wird die

lateral gelegene Ausziehung der SNC bezeichnet. Die dopaminergen Neurone (A9

Zellgruppe) projizieren als nigro-striatales DA-System auf das Striatum (JOEL und

WEINER, 2000). Der Nettoeffekt der DA-Ausschüttung im Striatum besteht in einer

positiven Beeinflussung der Bewegung. Bei DA-Mangel kommt es somit auch zu

einem Mangel an Bewegung. Ein solcher DA-Mangel entsteht beim Morbus

Parkinson, einer hypokinetischen Bewegungsstörung, die bei 1% aller über 60 Jahre

alten Menschen und 3% aller über 80 Jahre alten Menschen auftritt. Diese

Erkrankung lenkte das Augenmerk vieler Forschergruppen auf die Funktion und

Bedeutung der SNC. Ursache ist eine massive Degeneration der dopaminergen

Neurone in der SNC (LUDIN, 1988), die klinisch zu Hypokinesie, Rigor und Tremor

führt. Die Degeneration, und folglich auch die Symptomatik, beginnen unilateral und

bleiben auch im Verlauf zumeist lateralisiert ausgeprägt (HORNYKIEWICZ, 1989). Ein

Überwiegen des DAs in der SNC einer Hemisphäre führt also zu Funktionsstörungen

dieses Systems.

Es scheint aber auch innerhalb der SNC einer Hemisphäre unterschiedliche

funktionelle Anteile zu geben. So drehen Ratten nach Läsionen des medialen

Anteiles der SNC ipsilateral (zur läsionierten Seite hin), nach Läsionen des lateralen

Anteils der SNC hingegen contralateral (von der läsionierten Seite weg) (VACCARINO

et al., 1985; FRANKLIN und WOLFE, 1987). Weiterhin wurde das Vorhandensein

funktioneller Unterabteilungen über die rostro-caudale Ausdehnung der SNC

diskutiert. Unilaterale Injektionen des cholinergen Agonisten Carbachol in die

caudalen Anteile der SNC induzieren contralaterales Circling-Verhalten mit einer

erhöhten DA-Ausschüttung im Striatum. Unilaterale Injektionen von Carbachol in die

rostralen SNC-Anteile bewirken das Gegenteil: ipsilaterale Rotationen zusammen mit

einer verminderten striatalen DA-Freisetzung (HERNANDEZ-LOPEZ et al., 1994).

Bestätigt wurden diese Ergebnisse durch elektrophysiologische Studien, die auf die

Existenz von Subpopulationen nigro-striataler DA-Neurone hinwiesen, so dass

34

HERNANDEZ-LOPEZ et al. (1994) eine funktionelle Kompartimentalisierung der SNC

postulierten.

2.5. Cochleäres und vestibuläres System

Es sollen hier kurz das cochleäre System, welches für die akustische Wahrnehmung

zuständig ist, und das vestibuläre System, zuständig für Lage- und

Bewegungswahrnehmung, beschrieben werden.

2.5.1. Cochleäres System

2.5.1.1. Anatomie und Physiologie

Die Cochlea (Schnecke) bildet zusammen mit dem Vestibularapparat und dem

Perilymphraum das Innenohr (ZILLES und REHKÄMPER, 1998).

In der Schnecke sind drei voneinander getrennte Räume erkennbar: die Scala

vestibuli, die Scala media mit dem Ductus cochlearis, sowie die Scala tympani. Scala

vestibuli und Scala tympani sind perilymphatische Räume, die an der Spitze der

Schnecke ineinander übergehen. Der Ductus cochlearis enthält Endolymphe.

Zwischen Ductus cochlearis und Scala vestibuli liegt die Reissner-Membran. Zur

Scala tympani hin ist der Ductus cochlearis durch die Basilarmembran abgegrenzt.

Ihr liegt das Corti-Organ auf. Dessen Sinneszellen bilden als innere und äußere

Haarzellen zwei Gruppen, die jeweils von inneren und äußeren Stützzellen

(Phalangenzellen) getragen werden (ZILLES und REHKÄMPER, 1998).

Bei Erregung dieser Haarzellen werden Impulse über den Nervus vestibulocochlearis

an zentrale Bereiche weitergeleitet. Die Perikaryen der Radix cochlearis dieses

Nerven liegen im Ganglion spirale, welches sich entlang des spiraligen Verlaufes der

Cochlea befindet (TREPEL, 1995).

Die zentralen Fasern enden im Pons in den cochleären Kernen. Zu diesen gehören

der anteroventrale cochleäre Nucleus, der posteroventrale cochleäre Nucleus, sowie

der dorsale cochleäre Nucleus.

35

Die Efferenzen aus diesen Kernen bilden die zentrale Hörbahn (Lemniscus lateralis)

und kreuzen teilweise auf die Gegenseite. Sie enden im cerebralen Cortex im

Bereich der Hörrinde (TREPEL, 1995).

2.5.1.2. Pathologie

Beim Menschen werden Störungen im Bereich des cochleären Systems, die sich als

Hörverluste äußern, bei 1 von 1000 Kindern manifest. Mehr als die Hälfte der Fälle

sind genetisch bedingt, aber auch bei den umweltbedingten Fällen ist eine zugrunde

liegende genetische Prädisposition wahrscheinlich relevant (KEATS und BERLIN, 1999).

Hörverluste sind klinisch und genetisch sehr heterogen. Es gibt über 400 Störungen,

in denen ein Hörverlust Charakteristikum eines Syndroms ist. Für nicht-syndromische

Hörverluste haben Familienstudien gezeigt, dass hier mindestens 30 autosomale

Loci eine Rolle spielen. Es werden autosomal-dominante, nicht-syndromische

sensorineurale Taubheiten von autosomal-rezessiven, nicht-syndromischen

sensorineuralen Taubheiten unterschieden (KEATS und BERLIN, 1999). Darüber hinaus

kann Taubheit auch X-chromsomal und mitochondrial vererbt werden (SKVORAK

GIERSCH und MORTON, 1999).

In den letzten Jahren ergab die Suche nach Genen, die an der Pathologie der

humanen, genetisch bedingten Taubheit beteiligt sind, Hinweise auf die Beteiligung

von unkonventionellen Myosinen des Innenohres (REDOWICZ, 1999). Zweiköpfige,

Filament-formende Myosine, die die Basis der Muskelkontraktion darstellen, werden

als konventionelle Myosine bezeichnet. Zur Myosin-Superfamilie gehören neben

diesen aber auch die unkonventionellen Myosine, deren Funktionen bisher weniger

verstanden werden. Man nimmt an, dass sie intrazelluläre Transportereignisse

vermitteln (WANG et al., 1998). Unkonventionelle Myosine finden sich in vielen

spezialisierten Zellen, wie den Melanozyten, in Nierenzellen, in Nervenzelltubuli und

in den Haarzellen des Innenohres. Im Innenohr spielen vor allem das Myosin 6, das

Myosin 7A und das Myosin 15 eine wichtige Rolle. Studien zur Bedeutung des

Myosin 7A zeigten, dass dieses nicht nur eine Rolle bei der Haarzellfunktion spielt

(so wird es z.B. für die normale Transduktion benötigt), sondern auch essentiell für

die Organisation der sich entwickelnden Stereozilienbündel ist (SELF et al., 1998).

36

Myosin 15 scheint für die Aktinorganisation der Haarzellen entscheidend zu sein

(PROBST et al., 1998).

Mutationen im Myosin 7A zeichnen sowohl verantwortlich für das humane Usher-

Syndrom 1B, als auch für autosomal-rezessive, nicht-syndromische Taubheit Typ 2

(WEIL et al., 1997). Aufgrund seiner Verbindung zur „Shaker-2“-Mutante, einer tauben

Mausmutante mit Rotationsverhalten (s. Kap. 2.8.1.), soll das Usher-Syndrom hier

näher beschrieben werden. Ca. 5% aller Fälle mit schwerwiegender Taubheit bei

Kindern und die Hälfte aller Fälle von Taub-Blindheit sind dem Usher-Syndrom

zuzuordnen. Es handelt sich um eine autosomal-rezessive Erkrankung, die in

verschiedenen Ausprägungen auftritt. Die schwerste Form, der Typ 1, zeichnet sich

durch Taubheit, sowie vestibuläre Dysfunktionen (mit beidseitig fehlenden

vestibulären Reflexen) und Retinitis pigmentosa mit progressiver Blindheit aus. Beim

Typ 2 liegt eine Retinitis pigmentosa zusammen mit moderater bis schwerer

Taubheit bei normalen Vestibularfunktionen vor. Beim seltenen Typ 3 kommt es zu

Retinitis pigmentosa und progressivem Gehörverlust. Usher 1B wird in

Zusammenhang mit einer Mutation im Myosin 7A-Gen gebracht. Es ist bisher nicht

bekannt, ob die vestibulären Funktionen peripher oder zentral gestört sind (VERNON,

1969; KEATS und COREY, 1999; OTTERSTEDDE et al., 2001).

Mutationen im Myosin 15 können beim Menschen zu autosomal-rezessiver, nicht-

syndromischer Taubheit Typ 3 führen (PROBST et al., 1998; WANG et al., 1998).

Vergleichende Genanalysen haben viel zur Identifikation solcher Taubheitsgene

beigetragen (KEATS und BERLIN, 1999). Bei tauben Mausmutanten werden die

mutierten Gene ausfindig gemacht (s. 2.8.1.) und durch eine vergleichende

Kartierung können dann Hinweise auf krankheits-vermittelnde Gene beim Menschen

erhalten werden. Diese Mutanten sind sowohl gute Modelle für humane hereditäre

Taubheit, als auch geeignet, die molekulare Basis cochleärer Defekte zu verstehen

(STEEL et al., 1997).

Eine weitere syndromische Taubheit, die aufgrund des gleichzeitigen Vorliegens von

Taubheit und Bewegungsstörung in diesem Rahmen vorgestellt werden soll, ist das

rezessive, X-chromosomal vererbte Taubheits-Dystonie-Syndrom des Menschen. Bei

dieser Erkrankung handelt es sich um eine neue Art eines rezessiven,

neurodegenerativen Syndroms, welches durch progressive sensorineurale Taubheit

(welche als erstes Symptom in der frühen Kindheit auftritt), und darauf folgend durch

37

progressive Dystonie, Spastik, Dysphagie, mentale Retardierung, Paranoia, sowie

corticale Blindheit charakterisiert ist (JIN et al., 1996). Dieses Syndrom resultiert aus

der Mutation eines Gens, welches ein mitochondriales Protein codiert.

Wahrscheinlich führt diese Mutation zur Defizienz eines mitochondrialen Protein-

Import-Systems, welche dann für die Symptomatik verantwortlich zeichnet (KOEHLER

et al., 1999).

Neben den genetischen Ursachen für Taubheit gibt es erworbene Hörverluste. Seit

langem ist der toxische Effekt der Antibiotika-Klasse der Aminoglykoside auf die

sensorischen Haarzellen des Innenohres bekannt (HAWKINS, 1976). Der primäre

Grund für diese selektive Toxizität in vivo scheint eine rapide Ansammlung hoher

Konzentrationen dieser Medikamente in den Haarzellen zu sein (HIEL et al., 1992), an

welcher wiederum die unkonventionellen Myosine des Innenohres beteiligt sind

(RICHARDSON et al., 1997). Vor allem Myosin 7A wird für die Aminoglykosid-

Akkumulation in den Haarzellen benötigt. Die Degeneration der Haarzellen wird

letztendlich wahrscheinlich durch einen exzitotoxischen Prozess ausgelöst, der eine

Aktivierung von N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptoren durch die Aminoglykoside

beinhaltet (RICHARDSON et al., 1997).

Die Ototoxizität der Aminoglykoside zeigt eine Altersabhängigkeit (HENLEY et al.,

1996; MOORE et al., 1998). Bei neonatalen Ratten, bei denen sich die Cochlea noch

in ihrer strukturellen und funktionellen Entwicklung befindet, zeigt sich z.B. schon

nach wenigen Tagen der Behandlung mit Aminoglykosiden ein ototoxischer Effekt.

Bei adulten Tieren wird dieser erst nach zwei- bis dreimal so langen

Behandlungszeiten und höheren Substanzdosen sichtbar (HENLEY et al., 1996).

Über die Exzitotoxizität der Aminoglykoside wird auch ihr neurotoxischer Effekt bei

Neonaten erklärt. Nach intrastriataler Injektion von Neomycin (10 – 250 nmol)

wurden Dosis-abhängige striatale Schäden sichtbar, die sich als gesteigerte Gliose

manifestierten. Es wurde geschlossen, dass Aminoglykoside bei geschädigter Blut-

Hirn-Schranke das zentrale Nervensystem angreifen können (SEGAL et al., 1999).

Zusätzlich wird davon ausgegangen, dass eine Passage von Aminoglykosiden durch

die Blut-Hirn-Schranke bei Neonaten möglich ist, und diese Substanzen somit

neurotoxische Effekte haben können (SETH et al., 1982).

38

2.5.2. Vestibuläres System

2.5.2.1. Anatomie und Physiologie

Der Vestibularapparat (oder das Labyrinthorgan) besteht aus den drei

Bogengängen, dem Utriculus und dem Sacculus (ZILLES und REHKÄMPER, 1998). Im

Inneren von Utriculus und Sacculus liegen an scharf umschriebenen Stellen die

flachen Maculae utriculi und sacculi. Maculae sind Sinnesepithelien mit zwei

verschiedenen Haarzelltypen, deren apikale Kinozilien und Stereovilli in eine

Statolithenmembran hineinreichen. Sie sind für die Wahrnehmung von horizontalen

und vertikalen Linearbeschleunigungen zuständig. Die Anfänge der Bogengänge

sind an ihren Basen gegen den Utriculus als Ampullen erweitert. Im Inneren dieser

Ampullen liegen ebenfalls Sinnesepithelien, die aus Haarzellen vom Typ I und II

bestehen und als Cristae ampullares in den Endolymphraum vorgewölbt sind. Hier

sind die Zellfortsätze in eine gallertige Cupula eingebettet. In diesen Bereichen

werden Drehbeschleunigungen wahrgenommen (ZILLES und REHKÄMPER, 1998). Die

Radix vestibularis des Nervus vestibulocochlearis zieht zum Ganglion vestibulare,

welches am Ende des Meatus acusticus internus liegt. Von dort führen zentrale

Afferenzen zu den vier Vestibularkernen, dem superioren vestibulären Nucleus, dem

inferioren (spinalen) vestibulären Nucleus, dem medialen vestibulären Nucleus (mit

parvizellulärem und magnozellulärem Anteil), sowie dem lateralen vestibulären

Nucleus (mit anteriorem und posteriorem Teil) (TREPEL, 1995).

Die „Gleichgewichtskerne“ unterhalten Verbindungen zum striato-pallidalen System

und können somit in Basalganglienschaltkreise eingreifen (SHIMA, 1984). Der

superiore vestibuläre Nucleus spielt eine wichtige Rolle für den vestibulo-oculären

Reflex. Der mediale vestibuläre Nucleus ist für die Integration von Augen- und

Kopfbewegungen zuständig. Vom lateralen vestibulären Nucleus werden

Informationen an spinale, motorische Neurone weitergegeben und vom inferioren

vestibulären Nucleus ziehen Projektionen zum Cerebellum, zum Rückenmark, zu

den oculomotorischen Kernen und zum Thalamus (RUBERTONE et al., 1995). Bei der

Ratte findet man vestibulo-thalamische Projektionen zwischen dem medialen und

spinalen vestibulären Anteil und contralateralen Kerngebieten des Thalamus, sowie

39

zwischen dem superioren vestibulären Nucleus und ipsilateralen thalamischen

Kernen (RUBERTONE et al., 1995).

2.5.2.2. Pathologie

Läsionen des vestibulären Systems verursachen häufig Gleichgewichtsstörungen

(Ataxie, unsicherer Stand). Eine andere, sehr häufige Störung des Labyrinthorgans

ist der Schwindel (DAVID GERTZ, 2001). Von den Haarzellen des vestibulären Systems

ist mittlerweile bekannt, dass sie, im Gegensatz zu den Haarzellen des cochleären

Systems, zu einer Regeneration fähig sind. Für das Meerschweinchen und den

Menschen konnte 1993 von WARCHOL et al. in vitro nachgewiesen werden, dass es

nach einer Behandlung mit Aminoglykosiden zu einer regenerativen Proliferation des

vestibulären sensorischen Epithels kommt. 1995 dokumentierten TANYERI et al. eine

solche Regeneration in der Crista ampullaris von Chinchillas in vivo. Als

Mechanismen der Entstehung neuer Haarzellen nach ototoxischen und akustischen

Schädigungen wurden eine Proliferations-vermittelte Generation neuer Haarzellen,

eine direkte Konversion einer Subpopulation von unterstützenden Zellen zu

Haarzellen, sowie eine Reparatur nicht-letal geschädigter Haarzellen beschrieben

(SOBKOWICZ, 1992; ADLER and RAPHAEL, 1996; BAIRD et al., 1996).

Die physiologische und pathologische Funktion des vestibulären Systems wird

anhand diverser Einzeltests untersucht, von denen hier nur einige erwähnt werden

sollen. In einem Schwimmtest wird die Schwimmfähigkeit der Tiere getestet (GRAY et

al., 1988; RABBATH et al., 2001). Ratten mit intaktem vestibulärem System gehen im

Wasserbecken nicht unter. Sie können sich orientieren und schwimmen am Rand

des Beckens entlang. Von Ratten mit Defiziten des vestibulären Systems ist

hingegen bekannt, dass sie unfähig sind zu schwimmen (GRAY et al., 1988). Sie

tauchen korkenzieher- oder schraubenförmig ab und müssen vor dem Ertrinken

gerettet werden.

Weitere Hinweise auf die vestibulären Funktionen können im „Air-Righting Test“

erlangt werden (OSSENKOPP et al., 1990; RABBATH et al., 2001). In diesem Test

werden die Tiere auf den Rücken gedreht und aus einer Höhe von 30 cm auf eine

Schaumstoffunterlage (um Verletzungen der Tiere zu vermeiden) fallengelassen.

40

Tiere ohne Defekte des vestibulären Systems sind in der Lage, sich auf dieser

kurzen Strecke so zu drehen, dass sie auf den Gliedmaßen landen.

Im „Tail-Hanging Test“ ( HUNT et al., 1987; RABBATH et al., 2001) werden die Ratten

an der Schwanzwurzel in die Höhe genommen und einige Zentimeter über den

Boden gehalten. Es wird nun beurteilt, ob die Tiere eine normale Landungsantwort

zeigen, d.h., ob sie die Gliedmaßen zum Boden hin ausstrecken, um dort zu landen.

Ein Hochdrehen zur Seite oder zum Bauch hin, welches auch bei

bilabyrinthektomierten Ratten auftritt, wird hingegen als Ausdruck vestibulärer

Dysfunktion gewertet. Des weiteren wird dieser Test aber auch angewandt, um

Seitenpräferenzen der Tiere (WILLAR und CROWNE, 1989) und Asymmetrien im DA-

System zu überprüfen (ABROUS et al., 1998; bei BORLONGAN and SANBERG, 1995, als

„Elevated Body Swing Test“ bezeichnet [s. Kap. 2.6.]).

2.6. Lateralität und Bewegungsstörungen bei normalen Tieren

Auch bei Tieren sind chemische, funktionelle und morphologische Indices für

Hirnasymmetrien vorhanden (Kap. 2.1.1.). Individuelle Unterschiede in cerebraler

Lateralität covariieren mit individuellen Unterschieden in der Reaktion auf

Substanzapplikation, im räumlichen Verhalten und bei Stressreaktionen (CARLSON

und GLICK, 1992).

Bei Nagern tritt die Asymmetrie vor allem als Rotationspräferenz in Erscheinung.

Hierbei geben Richtung und Intensität Auskunft über chemische und morphologische

Indices von Asymmetrien (CARLSON und GLICK, 1992).

Bereits 1974 fanden JERUSSI und GLICK, dass normale Sprague-Dawley Ratten nach

systemischer Gabe von Amphetamin auf engen Kreisen rotieren. CLAUSING et al.

zählten 1996 duchschnittlich 80 Rotationen in 20 Min. nach Verabreichung von

Amphetamin (2,5 mg/kg Körpergewicht [KGW] s.c.) an solche Ratten. Die Rotationen

wurden hier mit Hilfe einer automatischen Meßmethode im sog. Rotometer (HUDSON

et al., 1993) dokumentiert. Das Tier wird hierzu in ein zylindrisches Behältnis

verbracht und an eine Messapparatur (einen beweglichen Arm, der mit einem

elektronischen Zählsystem verbunden ist) angeschlossen. Die Daten können vom

Zählsystem direkt in einen Computer transferiert und dort ausgewertet werden.

41

JERUSSI und GLICK (1974) führten die gezeigten Drehungen auf eine intrinsische,

bilaterale Imbalanz im DA-Gehalt des nigro-striatalen Systems von normalen Ratten

zurück. Amphetamin könnte eine neurochemische Imbalanz in diesem System

verstärken, indem es auf einer Seite mehr DA freisetzt. Als Konsequenz der durch

Amphetamin verstärkten funktionellen Asymmetrie würde die Ratte nun vermehrt in

die, bereits basal vorhandene, dominante Richtung gesteuert. 1976 gab es eine erste

Bestätigung für diese Hypothese. Es konnte eine Differenz im DA-Gehalt zwischen

rechtem und linkem Striatum von 10 – 15% bei normalen Ratten festgestellt werden,

welche sich nach Amphetamin-Applikation auf ca. 25% verstärkte (GLICK et al., 1976).

1978 machten GLICK und COX die Beobachtung, dass normale Sprague-Dawley

Ratten während ihrer nächtlichen Aktivitätsphase drehen, und dass die dabei

bevorzugte Drehrichtung zu 91,7% auch bei Beobachtungen an verschiedenen

Tagen konstant bleibt und mit der Amphetamin-induzierten Rotationsrichtung

übereinstimmt.

SHAPIRO et al. fanden 1986, dass das Rotationsverhalten bei weiblichen Sprague-

Dawley Tieren stärker ausgeprägt ist als bei männlichen. Mit Hilfe eines Rotometers

wurden nachts in 6 Std. durchschnittlich 74 Drehungen bei Weibchen und 27

Drehungen bei Männchen gezählt. Östrogene scheinen das Rotationsverhalten zu

beeinflussen, denn während des Östrus lassen sich mehr Rotationen feststellen

(BECKER et al., 1982). Es gibt Untersuchungen, die einen Einfluß der weiblichen

Steroide auf die Aktivität nigro-striataler DA-Neurone bestätigen (MCDERMOTT, 1993).

Applikation von Apomorphin löst in gesunden Ratten ebenfalls Rotationen aus,

jedoch normalerweise in die entgegengesetzte Richtung wie Amphetamin im selben

Tier (JERUSSI und GLICK, 1975).

In folgenden biochemischen Analysen konnte bestätigt werden, dass die

Amphetamin-induzierten Rotationen auf einer Asymmetrie in der striatalen DA-

Konzentration beruhen (GLICK et al., 1974) und die Apomorphin-induzierten

Rotationen Folge einer postsynaptischen Rezeptor-Asymmetrie im Striatum von

normalen Ratten sind (JERUSSI et al., 1977). Auch daraufhin getestete weitere

dopaminerge Substanzen, wie das Levodopa, führten in bestimmten Dosierungen zu

Rotationsverhalten (JERUSSI und GLICK, 1976). Neben den dopaminergen Substanzen

wurden eine Reihe weiterer pharmakologisch wirksamer Substanzen auf ihre

Fähigkeit hin, Drehungen auszulösen, getestet. Sowohl Ketamin (MYSLOBODOSKY et

42

al., 1979), als auch Tetrahydrocannabinol (WATERS und GLICK, 1973) und Morphin

(KORCZYN und ESHEL, 1979) waren in der Lage, Drehungen zu evozieren. Ebenso

führte die Applikation der Halluzinogene LSD, Mescalin und 5-Methoxy-N,N-

Dimethyltryptamin zu dosis-abhängigem Drehverhalten (FLEISHER und GLICK, 1979).

Die Substanzen Scopolamin und Atropin induzierten Rotationen in dieselbe Richtung

wie Amphetamin und potenzierten den Amphetamin-Effekt. Das cholinerge Pilocarpin

hingegen antagonisiert den Amphetamin-Effekt (JERUSSI und GLICK, 1976). Diese

Ergebnisse stimmen mit einer angenommenen cholinergen/dopaminergen Balance

im Striatum, d.h. einer wechselseitigen Beeinflussung der beiden Systeme, überein

(FOG, 1972; RANDRUP und MUNKVAD, 1975).

Es wurde nach Substanzversuchen, aber auch nach Versuchen mit unilateralen

Läsionen des DA-Systems (s. Kap. 2.7.1.) postuliert, dass die Tiere von der Seite mit

der höheren striatalen DA-Aktivität, der contralateralen Seite, weg und zur Seite mit

dem geringeren DA-Gehalt, der ipsilateralen Seite, hin drehen.

1986 konnte jedoch von SHAPIRO et al. gezeigt werden, dass es 2 Arten von

Populationen beider Geschlecher gibt: solche mit einer Drehrichtung weg von

(„Contra > Ipsi-Ratten“) und solche mit einer Drehrichtung hin zur („Ipsi > Contra-

Ratten“) Seite des Striatums mit der höheren DA-Konzentration. Dieses wurde

dahingehend interpretiert, dass der Grad der striatalen DA-Asymmetrie nur die

Stärke der Drehpräferenz bestimmt, nicht jedoch die Drehrichtung, die von weiteren

Faktoren beeinflusst wird.

Eine starke Verbindung zwischen einer Asymmetrie der Hemisphären und

Rotationsverhalten zeigten WILLAR und CROWNE (1989). Sie untersuchten Sprague-

Dawley Ratten zunächst auf das Vorliegen einer funktionellen Hirnasymmetrie: das

Circling-Verhalten nach Amphetamin-Gabe wurde beurteilt; es wurde beobachtet, zu

welcher Seite sich die Tiere wenden, wenn sie in ein Open field gesetzt werden; und

es wurde untersucht, zu welcher Seite sie sich hochdrehen, wenn sie am Schwanz in

die Höhe genommen werden („Tail-Hanging Test“, s. Kap. 2.5.2.2.). Danach konnte

eine gute Aussage über die Seitenpräferenz des jeweiligen Tieres getroffen werden.

Im Folgenden wurde die Fähigkeit getestet, eine links-rechts Unterscheidung zu

lernen und zu behalten (wiederholte Testung 24 Std. später). Es zeigte sich, dass die

Tiere mit Seitenpräferenz im Gegensatz zu denen ohne Seitenpräferenz sowohl

schneller lernten, als auch besser behielten. Diese räumliche Fähigkeit wurde allein

43

auf das Vorhandensein einer intrinsischen DA-Asymmetrie zurückgeführt, die sich in

Amphetamin-induziertem Circling-Verhalten widerspiegelt.

Einen wichtigen Einfluß auf Drehverhalten scheint der Cortex zu nehmen. Es gibt

zahlreiche Berichte darüber, dass die Aktivität des frontalen Cortex die

mesolimbischen und nigro-striatalen DA-Funktionen moduliert (GLICK und

GREENSTEIN, 1973; ROSS und GLICK, 1981a; CARTER und PYCOCK, 1980). So konnte

beispielsweise die Aktivierung des mesocorticalen DA-Systems durch Stressoren

einen Wechsel in der Rotationsrichtung induzieren (CARLSON et al., 1987). Die

Aufnahme von radioaktiv markierter Deoxyglukose in Hirnregionen zeigte einen

Unterschied im Energiemetabolismus des Frontalhirns, der so interpretiert wurde,

dass eine links-rechts Asymmetrie im frontalen Cortex die nigro-striatale Asymmetrie

moduliert: Die Seitenpräferenzen der Ratten waren stärker ausgeprägt, wenn die

Deoxyglukose-Aufnahme im contralateralen Cortex stärker war als im ipsilateralen

(GLICK et al., 1979). Da der linke frontale Cortex normalerweise eine höhere

Deoxyglukose-Aufnahme zeigte, wurde postuliert, dass in großen Populationen mehr

Ratten eine Rechtspräferenz haben als eine Linkspräferenz. Diese Annahme fand

durch Untersuchung eines Rattenkollektivs von 602 Tieren Bestätigung (GLICK et al.,

1979).

2.7. Lateralität und Bewegungsstörungen bei Stimulation und Läsion von

Hirnregionen

2.7.1. Zentrale Bereiche

Um näheres über die Ausprägung und Funktion von Hirnasymmetrien zu erfahren

und um Tiermodelle zu erzeugen, die als Krankheitsmodelle geeignet sind, wurden

zahlreiche Hirnregionen unilateral stimuliert oder aber chemisch oder elektrisch

läsioniert. So wurde zunächst für verschiedenste Tierarten (Ratte, Katze, Hund,

Frosch, Affe, Kaninchen) gezeigt, dass einseitige Stimulationen unterschiedlicher

Hirnbereiche (z.B. SNC, Nucleus caudatus, VTA, Hippocampus, Amygdala,

thalamische Kerne etc.) zu Rotationsverhalten führen (PYCOCK, 1980). Die elektrische

44

Läsion oder Ablation verschiedener Bereiche innerhalb der Basalganglien (Nucleus

caudatus, Globus pallidus, Nucleus subthalamicus, Substantia nigra) evozierte den

(in Bezug auf die Rotationsrichtung) zur Stimulation gegensätzlichen Effekt. Die

Erklärung hierfür ist, dass bei der Schädigung einer Region auf der einen Hirnseite

die analoge anatomische Region auf der anderen Hirnseite dominant wird und sich

dadurch die Haltungsasymmetrie und die Drehungen contralateral zur dominanten

Seite entwickeln (PYCOCK, 1980). Die gleichen Beobachtungen wurden nach

Verwendung unterschiedlicher Neurotoxine zur Erstellung einer Läsion gemacht

(PYCOCK, 1980).

Genauer beschrieben werden soll hier nur die chemische Läsion der SNC, die zu

einem heute wichtigen Tiermodell für die Erkrankung Morbus Parkinson geführt hat,

dem sogenannten „Ungerstedt-Modell“ der Ratte (s. auch SCHWARTING und HUSTON,

1996 a,b). 1968 beschrieb UNGERSTEDT zum ersten Mal, dass unilaterale Injektionen

des Neurotoxins 6-Hydroxydopamin in die SNC zu einer Degeneration des

ipsilateralen nigro-striatalen Projektionsweges und einem Verlust des DAs im

ipsilateralen Striatum führt. Die Tiere zeigen nach der Degeneration ein

Rotationsverhalten, eine Körperasymmetrie zur läsionierten Seite hin (UNGERSTEDT

und ARBUTHNOTT, 1970; UNGERSTEDT, 1971b) und Bewegungsstörungen (vor allem

beim Gebrauch der Gliedmaßen contralateral zur Läsion) (MIKLYAEVA et al., 1995).

Was das Rotationsverhalten anbelangt, so zeigen die Tiere ohne pharmakologische

Manipulation im Durchschnitt 2 spontane Rotationen pro Minute (PYCOCK und

MARSDEN, 1978). Bei Applikation von Substanzen, die das zentrale DA-System

manipulieren, zeigen die Tiere stärkeres Circling-Verhalten. Nach Gabe von

Amphetamin (3 mg/kg KGW i.p.) konnten PYCOCK und MARSDEN (1978) 7 Rotationen

pro Min. zur läsionierten Seite hin beobachten, HASHITANI et al. (1998) sahen bei

Applikation von Methamphetamin (3 mg/kg KGW i.p.) sogar 13 ipsilaterale

Rotationen in einer Min..

Auch nach Apomorphin-Injektion (1 mg/kg KGW i.p.) wird verstärktes Drehverhalten

gezeigt, hier erfolgen die Drehungen jedoch zur contralateralen, nicht-läsionierten

Seite hin (HUDSON et al., 1993). Diese unterschiedliche Reaktion auf die beiden

Substanzen lässt sich folgendermaßen erklären (s. Abb. 5):

Amphetamin sorgt in der intakten Gehirnhälfte für eine vermehrte DA-Freisetzung

und somit für eine Verstärkung der bilateralen Imbalanz, was zu Drehverhalten von

45

der Seite mit der höheren DA-Konzentration weg, also auf die läsionierte, DA-

verarmte Seite zu, führt.

Nach Apomorphin-Applikation erfolgt contralaterales Drehen, da es als

Kompensation des DA-Mangels auf der läsionierten Seite zu einer Hypersensibilität

und Vermehrung der DA-Rezeptoren kommt. DA-Rezeptoragonisten sind somit auf

der läsionierten Seite stärker wirksam als auf der intakten, wo die Rezeptoranzahl

nicht erhöht ist (CAREY 1986; HUDSON et al., 1993).

Abb. 5: Schema für die Drehrichtung von Nagern nach Läsionierung der dopaminergen Zellen in der linken Substantia nigra nach UNGERSTEDT (1971b) bei Applikation von Amphetamin oder Apomorphin. Weitere Erläuterungen s. Text.

Neben der Substanzapplikation gibt es weitere Möglichkeiten, die stattgefundene

Lateralisierung zu überprüfen. So werden Imbalanzen im nigro-striatalen System

auch im „Elevated Body Swing Test“ deutlich (BORLONGAN et al., 1995; von ABROUS et

al., 1998 als „Tail-Hanging Test“ bezeichnet). Dieser Test wird als Maß für das

46

asymmetrische motorische Verhalten von Hemiparkinson-Tieren in einem Substanz-

freien Status vorgeschlagen. Das Tier wird hier am Schwanz in die Höhe genommen

und die Frequenz und die Richtung des Schwingverhaltens werden aufgezeichnet.

Ratten mit unilateralen 6-Hydroxydopamin-Läsionen zeigen contralateral zur Läsion

gerichtete Schwingaktivität.

Ein weiteres Testverfahren, welches motorische Asymmetrien ausfindig machen

kann, ist der „Paw-Reaching Test“ (MONTOYA et al., 1990). Hier wird die Kontrolle der

Bewegung durch das Greifen nach Futterpellets gemessen und für die beiden

Körperseiten getrennt ausgewertet. Ungerstedt-Tiere sind in der Geschicklichkeit der

contralateralen Gliedmaße eingeschränkt. Es werden hier die Geschwindigkeit, die

Motivation und die maximale Greifkapazität überprüft. Dieser Test wird auch

verwendet, um die Tiere auf eine Händigkeit hin zu testen.

Obwohl Rotationsverhalten nicht zu den klassischen Symptomen bei Parkinson zählt,

so finden sich doch gelegentlich Patienten, die spontan zu der Hirnseite hin drehen,

von welcher die niedrigere DA-Aktivität angenommen wird, drehen (BRACHA et al.,

1987). Außerdem wird eine eindeutige Seitenasymmetrie als ein wesentliches

Kriterium für das Vorliegen der klinischen Entität Parkinson-Krankheit gewertet

(POEWE et al., 1996). Der Grund für den Neuronenuntergang bei Parkinson ist mit

Hilfe des Ungerstedt-Modells zwar nicht zu ermitteln, es kann jedoch genutzt werden,

um den therapeutischen Erfolg von Stammzelltransplantaten zu prüfen oder um neue

Antiparkinson-Medikamente zu entwickeln. Anhand dieses Modells konnte die

Vorstellung, dass Circling-Verhalten direkt aus einer Imbalanz der striatalen DA-

Aktivität resultiert, weiter bestätigt werden. Es wurde eine positive Korrelation

zwischen der Rotationsrate nach Applikation von DA-Agonisten und der Reduktion

der DA-Konzentration im läsionierten Striatum gefunden (THORNBURG und MOORE,

1975; COSTALL et al., 1976a). Aus folgenden Studien ergab sich jedoch der Hinweis,

dass andere DA-enthaltende Regionen zusätzlich zum nigro-striatalen System eine

Rolle beim Rotationsverhalten spielen. Obwohl die Manipulation des mesolimbischen

Systems per se kein Drehverhalten erzeugt, scheint es doch eine Rolle bei der

Vermittlung von Circling-Verhalten nach nigro-striatalen Läsionen zu spielen (KELLY

und MOORE, 1976; PYCOCK und MARSDEN, 1978). Circling-Verhalten tritt nur auf, wenn

eine Imbalanz im striatalen DA-Gehalt zusammen mit einer Stimulation limbischer

DA-Regionen vorliegt (PYCOCK und MARSDEN, 1978). So löst die unilaterale Injektion

47

von DA oder seiner Agonisten in das Striatum nur eine Haltungsasymmetrie mit

Drehen des Kopfes, aber keine Rotationen aus (COSTALL et al., 1974). Die bilaterale

Injektion von DA in den Nucleus accumbens resultiert in motorischer Hyperaktivität

(PIJNENBURG und VAN ROSSUM, 1973; KELLY und IVERSEN, 1976).

Es wurde die Schlussfolgerung gezogen, dass die rotierende Ratte zwei funktionelle

DA-Komponenten benötigt:

1. Eine striatale DA-Imbalanz, die eine Haltungsasymmetrie und Drehung des Kopfes

hervorruft.

2. Eine Stimulation des mesolimbischen DA-Systems, insbesondere des Nucleus

accumbens, die für die lokomotorische Komponente sorgt, welche die

Haltungsasymmetrie in aktives Circling-Verhalten umwandelt.

2.7.2. Innenohr

Auch vestibuläre Dysfunktionen können Rotationsverhalten auslösen, da die

vestibulären Kerngebiete Projektionen zum striato-pallidalen System ausbilden und

somit in die Schaltkreise der Basalganglien eingreifen können (SHIMA 1984) (s. Kap.

2.5.2.1.). So führten Läsionen des inferioren und des medialen Nucleus vestibularis

zu ipsilateralen Drehungen, Läsionen des superioren und des lateralen Nucleus

vestibularis hingegen zu contralateralen Drehungen (SHIMA, 1984).

Amphetamininjektion nahm hier keinen Einfluß auf das Drehverhalten, nach

Apomorphinapplikation zeigten die Tiere jedoch die gleichen Richtungspräferenzen.

Nach einer unilateralen Läsion der Projektionsbahnen der Vestibularkerne auf das

Striatum (Fasciculus tegmenti dorsolateralis) wurden keine Unterschiede in den

striatalen Gehalten von DA, Noradrenalin oder Serotonin zwischen den beiden

Hemisphären gesehen. Dies wurde dahingehend interpretiert, dass die vestibulären

Regionen die striato-pallidalen Funktionen über eine Modulation der DA-

Rezeptoraktivität beeinflussen (SHIMA, 1984).

Rotationsverhalten lässt sich bei Ratten auch durch eine pharmakologische

Zerstörung der Haarzellen des Innenohres durch Aminoglykoside auslösen (s. Kap.

2.5.1.2.). 1978 zeigten ALLEVA und BALAZS, dass Ratten, denen vom 2. bis zum 22.

Postnataltag das Aminoglykosid Streptomycin in einer Dosierung von 300 mg/kg

48

KGW s.c. verabreicht wurde, Circling-Verhalten sowie abnorme Kopfbewegungen,

Hyperlokomotion und Taubheit zeigten. Des weiteren war der „Air-Righting Reflex“

bei den Tieren gestört. Das Circling-Verhalten und die Hyperlokomotion nahmen bis

zum Ende der Beobachtungsperiode (8 Monate) stark ab. Die weiteren

phänotypischen Veränderungen, einschließlich der Taubheit, persistierten.

Die Kopfbewegungen und der gestörte Ausrichtungsreflex wurden hier zunächst dem

vestibulären System zugeschrieben. Die Hyperlokomotion und das Circling-Verhalten

wurden von dieser Arbeitsgruppe jedoch nicht auf das Innenohr bezogen, sondern es

wurde eine Beteiligung zentraler Regionen angenommen.

In einer Folgeuntersuchung konnte gezeigt werden, dass es bei den Tieren zu einer

Zerstörung der inneren und äußeren Haarzellen der Cochlea, zu einer Reduktion der

Zellen im Spiralganglion, sowie zu starken Schäden des Nervus cochlearis kommt

(ALLEVA und BALAZS, 1980). Die histologische Untersuchung des vestibulären

Systems (von Cristae ampullares, Maculae utriculi und sacculi, sowie des Nervus

vestibularis) zeigte jedoch keine Veränderungen innerhalb dieses Systems. Es wurde

hieraus geschlossen, dass die Dyskinesien, die in Abwesenheit von

morphologischen Schäden im Vestibularapparat auftreten, entweder aus

funktionellen vestibulären Veränderungen resultieren, oder aber auf Alterationen

zentraler Regionen zurückzuführen sind (ALLEVA und BALAZS, 1980). Ein Hinweis auf

eine Veränderung zentraler Regionen war die Tatsache, dass die Dyskinesien durch

die Behandlung mit DA-Agonisten reversibel waren (ALLEVA et al., 1979). Des

weiteren unterstützte die festgestellte Erhöhung der DA-Rezeptorzahl im Striatum

und der Serotonin-Rezeptorzahl im frontalen Cortex die Idee von der Beteiligung

zentraler Bereiche an der Entstehung von Dyskinesien nach Streptomycin-

Behandlung (SETH et al., 1982). Interessant ist die Beobachtung, dass Streptomycin

nur bei Neonaten Dyskinesien auslösen kann. Bei adulten Tieren kommt es zwar

auch zu Hörverlusten, es kann jedoch auch mit hohen Dosen von Streptomycin kein

Circling-Verhalten ausgelöst werden (ALLEVA und BALASZ, 1980). Dieses wird mit

einer erhöhten Vulnerabilität der dopaminergen (COYLE, 1973; KELLOGG und

LUNDBORG, 1973) und serotonergen (BENNETT und SNYDER, 1976) Projektionsbahnen

während der neonatalen Entwicklung erklärt. Zusätzlich ist das Gehirn bei der

adulten Ratte durch die Blut-Hirn-Schranke geschützt, welche eine Passage von

Streptomycin wahrscheinlich nur bei Neonaten zulässt (SETH et al., 1982).

49

2.8. Lateralität und Bewegungsstörungen bei murinen Mutanten

Es sind mittlerweile zahlreiche Maus- und Rattenmutanten beschrieben, die als

Tiermodelle für die Taubheitsforschung und für die Untersuchung der Lateralisierung

von Hirnfunktionen eine wesentliche Bedeutung erlangt haben. Einige Mutanten mit

abnormem, massivem Drehverhalten oder mit Schädigungen der Basalganglien oder

des Innenohres sollen hier näher beschrieben werden.

2.8.1. Mausmutanten

Bei den Mausmutanten zählt die „Chakragati-Maus“ zu den Mutanten, die zwar

Circling-Verhalten zeigen, bei denen aber keine Dysfunktionen von cochleärem oder

vestibulärem System vorliegen (RATTY et al., 1990; FITZGERALD et al., 1992;

FITZGERALD et al., 1993). Es handelt sich hier um eine autosomal-rezessiv vererbte

Mutation, die in einer transgenen Mauslinie (TgX15; chakragati) als Folge einer

Insertionsmutagenese entstanden ist, und die zu Rotationsverhalten mit

Seitenpräferenz (90,3 ± 6,1%) und Hyperlokomotion führt. Das Rotationsverhalten

tritt spontan auf und kann jederzeit durch Stress (z.B. in die Hände klatschen)

ausgelöst werden. Die in der Neurochemie bestimmten Gehalte an DA, 3,4-

Dihydroxyphenylessigsäure, Homovanillinsäure, 5-Hydroxytryptamin, 5-

Hydroxyindollessigsäure und Noradrenalin in Striatum, Nucleus accumbens und

Cortex waren normal. Bei der Untersuchung der DA-Rezeptordichte in striatalen und

mesolimbischen Regionen wurde eine signifikante, unilaterale Erhöhung in der D2-

Rezeptor-Dichte in der zum Drehverhalten contralateralen, dorso- und

ventrolateralen Subregion des Striatums gefunden (FITZGERALD et al., 1992).

Bei der autosomal-rezessiven „Weaver“-Mutante zeichnen sich die für das „Weaver“-

Gen (wv) homozygoten Tiere zwar nicht durch Drehverhalten, aber durch einen

instabilen Gang mit gestörter Koordination der Gliedmaßen, sowie einen feinen

frequenten Tremor aus. Eine Untersuchung der Anzahl dopaminerger Neurone in

den drei Regionen des mesencephalischen DA-Zellsystem zeigte eine signifikante

bilaterale Abnahme der TH-positiven Neurone in der SNC der Mutanten im Vergleich

mit nicht-betroffenen Geschwistertieren. Die Mutante hat beidseitig erniedrigte DA-

50

Gehalte im Neostriatum (ca. 75%), im olfaktorischen Tuberkel (ca. 27%) und im

frontalen Cortex (ca. 77%) (SCHMIDT et al., 1982; GUPTA et al., 1987; TRIARHOU et al.,

1988).

Die meisten drehenden Mausmutanten weisen Defekte des Innenohres auf und

finden daher Verwendung in der Taubheitsforschung. Es sind bisher über 70

verschiedene Gene bekannt, die Innenohrfunktionen bei Mäusen stören. Wie beim

Menschen (s. 2.5.1.2.) liegen Mutationen vielfach in Genen für die unkonventionellen

Myosine.

Ein defektes Myosin 6-Gen führt zum „Snell`s Waltzer“-Phänotyp, ein defektes

Myosin 7A-Gen zum „Shaker-1“-Phänotyp und ein Defekt im Myosin 15 kann den

„Shaker-2“-Phänotyp erzeugen (YONEZAWA et al., 1999). Das „Shaker-1“-Gen führt

homozygot zu Taubheit, Circling-Verhalten, Hyperlokomotion und stereotypen

Kopfbewegungen. Histopathologisch zeigen sich typische cochleäre Defekte vom

neuroepithelialen Typ (Dysfunktionen und progressive Degeneration des Corti-

Organs). Zusätzlich läßt sich lichtmikroskopisch eine progressive Degeneration der

Haarzellen im Sacculus darstellen (GIBSON et al., 1995; SELF et al., 1998). 1997

beschrieben WEIL et al., dass der murine „Shaker-1“- und der humane Usher 1B-

Phänotyp durch Mutationen im Myosin 7A-Gen entstehen. Die Ähnlichkeiten im

Phänotyp von Patienten mit autosomal-rezessiver, nicht-syndromischer Taubheit Typ

2 und der „Shaker-1“-Mutante ließen vermuten, dass ein defektes Myosin 7A auch

für die autosomal-rezessive, nicht-syndromische Taubheit Typ 2 verantwortlich

zeichnet. Auch dieses konnte bestätigt werden (WEIL et al., 1997).

Die autosomal-rezessive „Shaker-2“-Mutation löst ebenfalls Taubheit und Circling

aus. Das unkonventionelle Myosin 15-Gen scheint hier verändert. Die auditorischen

Haarzellen haben sehr kurze Stereozilien und eine lange, Aktin-enthaltende

Protrusion an ihrem basalen Ende. In den Cristae ampullares scheint die Anzahl der

Haarzellen verringert. In einigen Haarzellen liegen Fragmentationen der

Mitochondrien vor, einige Haarzellen befinden sich in Degeneration (ANNIKO et al.,

1980; PROBST et al., 1998). Für die „Shaker-2“-Mutation wurde eine Homologie zur

humanen autosomal-rezessiven, nicht-syndromischen Taubheit Typ 3 festgestellt

(PROBST et al., 1998; WANG et al., 1998).

Homozygote Mäuse der Mutantenlinie BUS/Idr zeigen phänotypisch Taubheit, sowie

Drehverhalten, Hyperlokomotion und stereotype Kopfbewegungen. Das

51

verantwortliche Gen wurde auf Chromosom 10 lokalisiert. Es könnte sich um ein Allel

des bereits bekannten „Albany Waltzer“-Gens (BRYDA et al., 1997) handeln. Das zum

„Waltzer“-Locus homologe Gen des Menschen ist ein möglicher Kandidat für die

humane autosomal-rezessive, nicht-syndromische Taubheit Typ 12. Bei adulten

Tieren wurden Degenerationen des Corti-Organs und des Spiralganglions, sowie

vestibuläre Dysfunktionen gefunden (YONEZAWA et al., 1999).

Tiere des DBA/2-Mäusestamms haben genetisch induzierte vestibuläre

Dysfunktionen (BLOOM und HULTCRANTZ, 1994). Einige dieser Tiere zeigen ein

Rotationsverhalten, sowie Deformationen und Degenerationen im vestibulären

System, wie vergrößerte Haarzellen, Zelltrümmer und ungeordnete Stereozilien

(BLOOM und HULTCRANTZ, 1994). Die nicht-drehenden Geschwistertiere zeigen eine

ähnliche, aber nicht so schwer ausgeprägte, Pathologie des vestibulären

sensorischen Epithels (BLOOM und HULTCRANTZ, 1994).

Auch bei einer spontan aufgetretenen Mutante im C3H/He-Stamm wurden

Dysfunktionen des vestibulären Systems für den Phänotyp mit Drehverhalten,

Hyperlokomotion und stereotypen Kopfbewegungen verantwortlich gemacht. Bei

Abwesenheit morphologischer Abnormitäten im zentralen Nervensystem wurden

starke morphologische Veränderungen der Stereozilien von Macula utriculi und

Macula sacculi (reduzierte Anzahl, disorganisierte Verteilung und Riesen-

Stereozilien) beobachtet. Bei 18 Monate alten Tieren lag eine massive Degeneration

der Haarzellen in Macula utriculi und Macula sacculi vor (KITAMURA et al., 1991 a,b).

Eine autosomal-rezessive Mausmutante mit Bewegungsstörungen, aber ohne

Drehverhalten, ist die im A/J-Inzuchtstamm des Jackson Laboratoriums aufgetretene

„Stargazer“ (stg)-Mutante. Sie zeigt charakteristische Kopfbewegungen und Ataxie.

Darüber hinaus führt die auf Mauschromosom (MMU) 15 gelegene Mutation zu einer

Epilepsie, die sich im Elektroencephalogramm (EEG) in „Spike-Wave“-Entladungen

äußert (NOEBELS et al., 1990).

2.8.2. Rattenmutanten

Bereits im Jahr 1973 wurden zwei Rattenmutanten mit Drehverhalten beschrieben.

Die „Spinner-1“ (spn-1)-Mutante trat im B/1N-Stamm spontan auf. Der Erbgang ist

52

hier autosomal-rezessiv. Die heterozygoten Tiere verhalten sich normal, aber die

spn-1/spn-1-Tiere haben den Hang, in Uhrzeigerrichtung zu drehen, und zeigen

zusätzlich einen leichten Hydrocephalus (HEDRICH, 1990).

Auch die „Spinner-2“ (spn-2)-Mutante trat spontan auf, und zwar im N:SDN

Auszuchtstamm. Phänotypisch ist die Mutante der spn-1 ähnlich, aber ein

Komplementationstest wies auf zwei unabhängige Mutationen hin (HEDRICH, 1990).

Eine Rattenmutante mit Bewegungsstörungen, die AS/Agu-Mutante, trat spontan in

einer Kolonie von Albino-Swiss (AS) Ratten in Glasgow auf (CLARKE und PAYNE,

1994). Diese Mutante ist von Interesse, weil hier zwar Verluste dopaminerger

Neurone vorliegen, im Gegensatz zur ci2- und ci3-Mutante aber dennoch kein

Rotationsverhalten gezeigt wird. Die möglichen Ursachen werden bei der

Betrachtung der Versuchsergebnisse diskutiert. Die autosomal-rezessiv vererbte

Mutation führt ab dem 10. Lebenstag zu progressiven lokomotorischen Störungen.

Es kommt zu einem steifen Gang und einer Rigidität der Hintergliedmaßen. Die

Applikation von Levodopa über einen Zeitraum von 4 Wochen verbesserte die

Leistung der Mutanten in Balancetests, änderte jedoch nichts an dem steifen Gang

der Mutanten (RUSSELL et al., 1998). In der SNC fielen bei lichtmikroskopischer

Untersuchung leichte Abweichungen von Form und Größe der dopaminergen

Neurone auf (CLARKE und PAYNE, 1994). Mittels immunhistochemischer

Untersuchungen wurde ein bilateraler Verlust dieser Neurone in den zentralen

Bereichen der SNC nachgewiesen, welcher bei -58% im Vergleich mit Kontrolltieren

des Ursprungsstammes lag. Auch im Striatum fanden sich Zellverluste. In der VTA

ergaben sich Zellverluste von 20 – 30%. Des weiteren wies die SNC um 45%

erniedrigte DA-Gehalte auf und im Striatum zeigte sich eine subregional

unterschiedlich ausgeprägte DA-Reduktion (CLARKE und PAYNE, 1994).

Bei der „Stargazer“ (stg)-Rattenmutante, die 1994 von TRUETT et al. zum ersten Mal

beschrieben wurde, handelt es sich um eine Rattenmutante im Zucker- (Crl:ZUC-

lepfa) Stamm, die sowohl eine Dysfunktion im DA-System, als auch Defekte des

cochleären und vestibulären Systems aufweist (TRUETT et al., 1994; BROCK et al.,

1995; BROCK und ASHBY, 1996). Die Mutation wird in einem autosomal-rezessiven

Erbgang weitergegeben und führt phänotypisch zu Circling-Verhalten,

Hyperlokomotion und Opisthotonus, die alle ab der 3. Lebenswoche auftreten. Eine

vorliegende Taubheit wurde mittels der Ableitung auditorisch evozierter Potentiale

53

nachgewiesen. Histologische Untersuchungen des Innenohres zeigten

fortgeschrittene Degenerationen der Haarzellen und von Zellen des akustischen

Ganglions. Des weiteren gingen die Ratten im Schwimmtest korkenzieherförmig

unter, was auf Dysfunktionen des vestibulären Systems zurückgeführt wurde. Die

Untersuchung der Reaktion der Mutante, sowie gesunder Kontrollen auf die

Applikation von Quinpirol und Haloperidol wies auf eine verringerte Sensitivität der

D2-/D3-Rezeptoren hin, so dass auf eine Dysfunktion des zentralen DA-Systems

geschlossen wurde.

Im Jahr 2001 wurde von RABBATH et al. in einem Stamm von Long-Evans Ratten eine

neue „Waltzing“-Mutante beschrieben, die sich durch Circling-Verhalten, sowie

Dysfunktionen in der vestibulären Kontrolle von Haltung (Kopfhaltung nach abwärts)

und Blick (Defizit des horizontalen vestibulo-oculären Reflexes während konstanter

Beschleunigungen) auszeichnet. Licht- und elektronenmikroskopische

Untersuchungen zeigten keine Abnormitäten des vestibulären Neuroepithels. Es

wurde hier angenommen, dass das Rotationsverhalten in Verbindung zu

Abnormitäten in der Transduktion oder der Prozessierung von Signalen im

vestibulären System stehen könnte.

2.9. Die ci2- und ci3-Mutante

2.9.1. Die LEW/Ztm-ci2-Rattenmutante

1991 trat in einem Lewis (LEW)-Inzuchtstamm am damaligen Zentralinstitut für

Versuchstierzucht der DFG in Hannover eine Spontanmutante auf, welche

Bewegungsstörungen in Form von Rotationsverhalten zeigte. Die Mutante wurde mit

dem Namen „ci2“ belegt: „ci“ als Gensymbol für Circling, und „2“, weil bereits 1986 in

diesem Stamm eine drehende Rattenmutante aufgetreten war (DEERBERG et al.,

1989), die als „ci1“ benannt, aber nicht näher charakterisiert wurde, und die auch

nicht mehr existiert.

Die ci2-Mutante wurde dann im Zentralen Tierlabor der Medizinischen Hochschule

Hannover (Ztm) weitergezüchtet und näher untersucht. Durch klassische

54

Zuchtversuche konnte die Vermutung, dass es sich hier um einen autosomal-

rezessiven Erbgang handelt, bestätigt werden (LÖSCHER et al., 1996).

Bei den homozygoten Tieren (ci2/ci2) sind schon in einem Alter von 18 – 20 Tagen

erste Anzeichen für motorische Anomalien erkennbar, die sich als ein Überstrecken

des Kopfes nach caudo-dorsal, als Opisthotonus oder „Stargazing“, äußern. Ab der

3. – 4. Lebenswoche tritt dann ein intensives, spontanes Drehverhalten auf. Diese

Drehungen werden als enge „nose-to-tail“ Rotationen ausgeführt und treten zumeist

salvenartig auf, wobei Stress (z.B. durch Verbringen der Tiere in eine neue

Umgebung) die Salven noch verstärkt. Das Rotationsverhalten der ci2 ist lateralisiert,

d.h. ein Großteil der Mutanten hat eine eindeutige Richtungspräferenz im

Drehverhalten (LÖSCHER et al., 1996). Neben dem Circling-Verhalten und dem

Opisthotonus zeigen die Tiere noch weitere motorische Anomalien, die sich in

Hyperlokomotion und Ataxie äußern (LÖSCHER et al, 1996).

Die heterozygoten Geschwistertiere zeigen kein Rotationsverhalten, sie sind

phänotypisch normal und konnten somit, neben Tieren des LEW-

Hintergrundstammes, als Kontrolltiere eingesetzt werden.

Die Tiere werden im Ztm gezüchtet, indem ein drehendes mit einem nicht-drehenden

Tier verpaart wird. Das starke Rotationsverhalten der Tiere verschlechtert die

Zuchtergebnisse. Des weiteren kommt es durch die starke Bewegungsaktivität zu

geringeren Gewichtszunahmen, die Vitalität der Tiere ist jedoch nicht beeinträchtigt

(LÖSCHER et al., 1996; FEDROWITZ, 1999).

Aufgrund der Ähnlichkeit der Mutante zum Phänotyp 6-Hydroxydopamin-läsionierter

Ratten im Ungerstedt-Modell wurde zunächst der Frage nachgegangen, ob es sich

bei der ci2-Mutante um ein hereditäres Modell für den Morbus Parkinson handeln

könnte (LÖSCHER et al., 1996; RICHTER et al., 1999).

Das Rotationsverhalten der Tiere wurde charakterisiert, indem über 5 Min. die

Rotationen gezählt wurden. Im Open Field zeigten die weiblichen Tiere im Mittel 22

Drehungen, die männlichen im Mittel 14 Drehungen in dieser Zeit. Die

Rotationszahlen der nicht-drehenden Kontrolltiere lagen wie erwartet für beide

Geschlechter bei 0 Drehungen im Beobachtungszeitraum (LÖSCHER et al., 1996).

Der “Paw-Reaching Test” (nach MONTOYA et al., 1990), der das Greifverhalten und

die Motorik der Vorderextremitäten überprüft, zeigte eine ausgeprägte einseitige

55

Defizienz der Vorderextremität contralateral zur spontanen Drehpräferenz (LÖSCHER

et al., 1996).

In pharmakologischen Testreihen wurden den ci2-Ratten die Substanzen

Amphetamin, MK-801, sowie Apomorphin in verschiedenen Dosen appliziert. Die

Injektion von Amphetamin bewirkte neben verstärkter Hyperlokomotion und

verstärkter Ataxie eine signifikante Erhöhung der Rotationsrate bei den ci2-Tieren,

wohingegen sie bei den nicht-drehenden Wurfgeschwistern kein Drehverhalten

auslöste. Dieses Ergebnis wurde auf eine Imbalanz des nigro-striatalen DA-Systems

zurückgeführt (LÖSCHER et al., 1996), da durch die Wirkung des Amphetamins eine

bestehende Ungleichheit im DA-Gehalt verstärkt würde. Auch MK-801 führte nur bei

den Mutanten zu einer Intensivierung des Rotationsverhaltens, vermutlich durch

Erhöhung des DA-Umsatzes im Striatum (LÖSCHER et al., 1996). Bei Verwendung von

Apomorphin in einer Dosierung, welche nur die präsynaptischen D2-Rezeptoren

erregt, kam es zu einer Abnahme spontaner Rotationen bei den ci2-Ratten. Dasselbe

Ergebnis brachte die Injektion einer höheren Dosis, die sowohl auf prä- als auch auf

postsynaptische Rezeptoren stimulierend wirkt. Dieses wurde dahingehend

interpretiert, dass bei reiner Erregung der präsynaptischen D2-Rezeptoren, welche

einen Überschuß an freiem DA im synaptischen Spalt signalisiert, die DA-

Freisetzung reduziert wurde und somit auch die Rotationszahl abnahm. Durch eine

vermutete Simulierung gleicher DA-Gehalte rechts und links bei Erregung auch der

postsynaptischen DA-Rezeptoren durch die höhere Apomorphindosis wurde die

Circling-Rate ebenfalls vermindert, was darauf schließen läßt, daß keine einseitige

Hypersensitivität von DA-Rezeptoren vorliegt (LÖSCHER et al.,1996). Neurochemische

Untersuchungen lieferten weitere Hinweise auf eine bilaterale Imbalanz im nigro-

striatalen DA-System. Es wurden Homogenate von Striatum, Nucleus accumbens

und frontalem Cortex hergestellt und verschiedene Monoamine und Metaboliten

mittels „High Pressure Liquid Chromatography“ (HPLC) bestimmt. Die ci2-Ratten mit

klar ausgeprägter Seitenpräferenz im Circling-Verhalten wiesen im Striatum auf der

Seite ipsilateral zur Rotationspräferenz signifikant geringere Konzentrationen an DA

und seinen Metaboliten Homovanillinsäure und 3,4-Dihydroxyphenylessigsäure auf

(LÖSCHER et al., 1996). In den anderen untersuchten Bereichen konnten keine

Seitenunterschiede bezüglich dieser Monoamine festgestellt werden, auch nicht für

Serotonin und dessen Metabolit 5-Hydroxyindolessigsäure, sowie Noradrenalin

56

(RICHTER et al., 1999). Diese pharmakologischen und neurochemischen Befunde,

welche Gemeinsamkeiten mit dem Ungerstedt-Modell zeigten, gaben zunächst Anlaß

zu der Annahme, dass die Circling-Ratte das erste genetische Tiermodell für

idiopathischen Morbus Parkinson darstellen könnte, was sich im Weiteren jedoch

nicht bestätigte. Denn immunhistochemische Studien zeigten, dass die Anzahl

dopaminerger Neurone der SNC und die Dichte der dopaminergen Terminalen im

Striatum keine bilaterale Asymmetrie aufwiesen. Lediglich in der rostralen VTA fand

sich ipsilateral eine signifikant höhere Neuronendichte als contralateral. Zu den LEW-

Kontrollratten ergaben sich keine signifikanten Unterschiede (RICHTER et al., 1999).

Autoradiographische Untersuchungen zur Dichte von D1- und D2-Rezeptoren und

des DA-Transporters in Striatum und Substantia nigra liessen keine Unterschiede

zwischen den beiden Hemisphären der ci2-Mutante erkennen. Im Vergleich mit LEW-

Kontrollratten zeigten sich bei ci2-Ratten jedoch erhöhte Bindungsdichten für den

DA-Transporter und den D1-Rezeptor im Striatum und für den D1- und den D2-

Rezeptor in der Substantia nigra. Aufgrund der bisher erhobenen Daten wurde

geschlossen, dass die gefundene geringe bilaterale Asymmetrie der DA-

Konzentration im Striatum aufgrund einer Erhöhung der striatalen Rezeptordichte

zum Rotationsverhalten führen könnte (RICHTER et al., 1999). Um herauszufinden, ob

die salvenartigen Rotationen auf einer temporär stärker ausgeprägten bilateralen

Asymmetrie in der striatalen DA-Freisetzung beruhen könnte, wurden nun in vivo-

Untersuchungen die extrazellulären DA-Konzentrationen im Striatum mittels

Mikrodialyse am frei beweglichen Tier bestimmt (FEDROWITZ et al., 2000). Es wurden

wiederum ci2-Tiere mit Kontrolltieren verglichen und Messungen während einer

Ruhe- und einer Stressphase (in welcher die Tiere durch Handling gestört wurden)

vorgenommen. Während der Ruhephase gab es keine signifikanten Imbalanzen in

der DA-Freisetzung, wohingegen unter Einfluß von Stress bei den ci2-Tieren eine

signifikante Erhöhung der DA-Freisetzung contralateral zur Seite der Drehpräferenz

manifest wurde, bei den Kontrolltieren aber im linken und rechten Striatum keine

Veränderungen der DA-Ausschüttung auftraten. Nach Zugabe von Amphetamin zum

Perfusionsmedium zeigten die weiblichen ci2-Ratten contralateral im Striatum eine

signifikant höhere Ausschüttung von DA als ipsilateral, bei den männlichen ci2-

Ratten und den Kontrollen gab es hingegen keinen Unterschied. Die Ergebnisse der

Mikrodialyse sprachen erneut für eine genetisch vermittelte Dysfunktion des

57

zentralen DA-Systems. Trotz vieler Ähnlichkeiten der ci2 zum Ungerstedt-Modell für

den Morbus Parkinson deutete das Fehlen einer signifikanten Degeneration

dopaminerger Neurone in der SNC zusammen mit der Hyperlokomotion und den

stereotypen Kopfbewegungen der Mutante darauf hin, dass diese Mutante nicht als

Modell für den Morbus Parkinson, eine hypokinetische Bewegungsstörung, sondern

als Modell für hyperkinetische Bewegungsstörungen geeignet sein könnte (RICHTER

et al., 1999; FEDROWITZ et al., 2000).

Aufgrund der Ähnlichkeit des motorischen Syndroms zum Phänotyp von

Mausmutanten mit Taubheit wurde bei ci2/ci2-Tieren und ci2/+-Kontrollen auch die

Funktion des cochleären Systems mittels auditorisch evozierter Potentiale getestet.

Bei denselben Tieren erfolgten anschließend histologische Untersuchungen der

Haarzellen des Innenohres. Die Funktion des vestibulären Systems wurde anhand

des Schwimmtests, des „Air-Righting Tests“ und des „Tail-Hanging Tests“ untersucht.

Die cochleären und vestibulären Kerngebiete von ci2/ci2-Tieren und ci2/+-Tieren

wurden auf das Kernvolumen, die Neuronendichte und die Neuronenmorphologie

(Größe, Umfang, Kreisfaktor) hin untersucht (KAISER et al., 2001). Die Ableitung

auditorisch evozierter Potentiale zeigte eine vollständige Taubheit der Mutante im

Gegensatz zu den Kontrollen. Die Ergebnisse der Untersuchungen zur Funktion des

vestibulären Systems wiesen deutlich auf Defekte dieses Systems hin. Die

histologische Analyse des Innenohres ausgewachsener ci2/ci2-Tiere zeigte einen

praktisch vollständigen Verlust des cochleären Neuroepithels und eine Degeneration

von Zellen des Spiralganglions, wohingegen kein offensichtlicher Haarzellverlust in

den vestibulären Anteilen des Innenohres gesehen wurde. Die vestibulären

Haarzellen zeigten jedoch kleine Protrusionen des Cytoplasmas in den

endolymphatischen Raum, aus denen auf Veränderungen des Cytoskelettes der

Zellen geschlossen wurde. Aufgrund vorläufiger Hinweise auf einen Verlust

vestibulärer Haarzellen bei jungen (ca. 4 Wochen alten) ci2-Tieren wurde eine

Regeneration der vestibulären Haarzellen während der späteren Entwicklung

angenommen (KAISER et al., 2001). Die Volumenmessung der Hirnstammkerne

zeigte, dass bei der ci2-Mutante der mediale vestibuläre Nucleus signifikant kleiner

(ca. 40%) ist als bei den Kontrollen, und dass eine generelle, allerdings nicht

signifikante, Tendenz zu kleineren cochleären Kernen (im Mittel ca. 25%) bei den

ci2/ci2-Ratten besteht. Die Neuronendichte in den cochleären Kernen war bei der

58

Mutante signifikant höher, im medialen vestibulären Nucleus dagegen signifikant

niedriger als bei den Kontrollen. Im anterioren lateralen vestibulären Nucleus war die

Dichte bei der ci2-Mutante ipsilateral niedriger als contralateral. In Bezug auf die

Morphologie zeigten die Neurone der cochleären Kerne eine abnorme Form

(abgerundete Zellen) und eine reduzierte Größe. Diese Neuronenverkleinerung

wurde auf fehlende synaptische Eingänge von afferenten Fasern aus der Cochlea

zurückgeführt, die erhöhte Neuronendichte wurde als Kompensationsversuch auf das

verringerte Kernvolumen angesehen (KAISER et al., 2001).

2.9.2. Die BH.7A/Ztm-ci3- Rattenmutante

Die ci3-Rattenmutante trat im Jahr 1997 im Ztm spontan auf, allerdings nicht im

LEW-, sondern im BH.7A/Won-Stamm. Der BH.7A-Stamm ist ein zum BH-Stamm

congener Rattenstamm, der das Ptprca („protein tyrosine phosphatase, receptor type

c“)-Allel exprimiert. Er wurde durch den Transfer dieses Allels von LEW- auf BH-

Ratten innerhalb von 12 Rückkreuzungsgenerationen entwickelt. Die Mutation wird

hier wiederum in einem autosomal-rezessiven Erbgang weitergegeben (Hedrich,

1990). Die Zucht wird im Ztm geführt, indem homozygote Tiere miteinander verpaart

werden.

Weil auch diese Mutante durch spontanes Drehverhalten auffiel, wurde sie mit dem

Gensymbol „ci3“ belegt. Erste Beobachtungen ließen vermuten, dass das

Rotationsverhalten bei der ci3-Mutante ebenfalls lateralisiert auftritt und im

Gegensatz zur ci2 keine Innenohrschäden vorliegen. Aufgrund der Ähnlichkeit zum

Phänotyp der ci2-Mutante wurden ci3-Tiere auch mit homozygoten ci2-Ratten

verpaart um herauszufinden, ob die Abnormitäten der beiden Tiergruppen durch den

gleichen Gendefekt verursacht, oder durch verschiedene Gene codiert werden. Die

in diesem Komplementationstest entstandenen ci2/ci3 Nachkommen zeigten in

keinem Fall ein Rotationsverhalten. Es handelt sich hier also um Mutationen

unabhängiger Loci.

59

2.10. Aufgabenstellung

Im Rahmen des Projektes sollte eine Charakterisierung beider Mutanten

(weiterführende Untersuchungen bei der ci2-Mutante und eine Erstcharakterisierung

bei der ci3-Mutante) erfolgen. Hierbei sollten unter Berücksichtigung der

Informationen aus der Literatur und der bei der ci2-Mutante bereits gewonnenen

Erkenntnisse die Basalganglien (hier insbesondere das DA-System) und das

Innenohr im Mittelpunkt stehen. Anhand der Untersuchungsergebnisse sollte

anschließend der Modellcharakter der Mutanten überprüft werden.

Das Methodenspektrum umfasste Verhaltensbeobachtungen, Neuropharmakologie,

Neurochemie, Neuropathologie etc., um ein genaues Bild über Funktion und

Morphologie der genannten Regionen zu erhalten. Um die wechselseitigen Einflüsse

zwischen Innenohr und zentralen Bereichen und einen eventuellen Anteil des

Innenohres an der Auslösung von Rotationsverhalten zu verstehen, wurden darüber

hinaus bei normalen Ratten des LEW-Stammes mittels des oto- und neurotoxisch

wirksamen Aminoglykosids Streptomycin Innenohrschäden induziert. Der Phänotyp

der Streptomycin-behandelten Tiere wurde dann mit dem Phänotyp der Mutanten

verglichen.

60

3. Material und Methoden

3.1. Versuchstiere

3.1.1. Herkunft

Die für die Untersuchungen eingesetzten Tiere stammen aus dem Ztm und wurden

uns freundlicherweise von Herrn Professor H.-J. Hedrich (beide Mutanten, ci2/+-

Tiere und Tiere des LEW-Hintergrundstammes) und Herrn Professor K. Wonigeit

(Tiere des BH.7A-Hintergrundstammes) überlassen.

Für die Untersuchungen zur LEW/Ztm-ci2-Mutante wurden drehende, für den

Gendefekt homozygote Tiere (ci2/ci2) eingesetzt. Da bei dieser Mutante die

homozygoten, drehenden mit heterozygoten, nicht-drehenden Geschwistern verpaart

werden, konnten hier als Kontrolltiere sowohl die Geschwistertiere (ci2/+), als auch

normale Ratten des LEW-Hintergrundstammes (LEW/Ztm) verwendet werden.

Für die Studien zur BH.7A/Ztm-ci3-Mutante wurden ebenfalls drehende, für den

Gendefekt homozygote Mutanten (ci3/ci3) untersucht. Hier konnten als Kontrolltiere

nur Tiere des BH.7A-Hintergrundstammes (BH.7A/Won) eingesetzt werden, da bei

der ci3-Mutante die homozygoten, drehenden Tiere miteinander verpaart werden und

somit keine heterozygoten Geschwistertiere existieren.

Zur Erstellung von Tieren mit einem Innenohrschaden mittels Streptomycin-

Intoxikation wurden ebenfalls LEW-Ratten aus dem Ztm verwendet.

Für vergleichende elektroencephalographische Untersuchungen wurden als

Positivkontrolle WAG/Rij-Ratten der Firma Harlan Winkelmann, Borchen, eingesetzt,

weil diese im EEG Spontanentladungen in Form von „Spike-Wave“-Formationen

aufweisen (s. 3.3.).

61

3.1.2. Haltung und Fütterung

Die Tiere wurden für die Versuche aus dem Ztm in die Tierhaltung des Instituts für

Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover

transferiert und es wurde ihnen mindestens eine Woche Zeit zur Adaptation an die

Haltungsbedingungen gelassen, bevor erste Studien durchgeführt wurden.

Alle Untersuchungen wurden in Übereinstimmung mit dem deutschen

Tierschutzgesetz durchgeführt und waren durch die verantwortliche

Regierungsbehörde in Hannover genehmigt (Aktenzeichen 509c-42502-01/473).

Es standen zum einen für die ci2/ci2-Tiere, deren Geschwistertiere und die Tiere des

LEW-Hintergrundstammes und zum anderen für die ci3/ci3-Tiere und den BH.7A-

Hintergrundstamm eigene Tierräume zur Verfügung.

Die Ratten wurden einzeln in Makrolonkäfigen Typ III gehalten (aufgrund des

Drehverhaltens der homozygoten Tiere war eine Gruppenhaltung hier nicht möglich)

und wöchentlich in saubere Käfige umgesetzt.

Als Futter wurde handelsübliches Haltungsfutter (Altromin 1324-Standdarddiät,

Altromin, Lage) ad libitum eingesetzt und Wasser wurde in Makrolonflaschen

ebenfalls ad libitum zur Verfügung gestellt. Die Einstreu bestand aus staubfreiem

Weichholzgranulat. Die relative Luftfeuchtigkeit lag bei 55 ± 5%, die Temperatur bei

23 ± 1°C. Das Lichtprogramm war auf einen 12/12 Std. Licht-/Dunkel-Zyklus

eingestellt (Lichtphase begann ab 6.00 mitteleuropäischer Zeit).

3.1.3. Narkose

Für die Elektrodenimplantation zur Ableitung von EEGs, für die Ableitung auditorisch

evozierter Potentiale, sowie für die Perfusion bei histologischen und

immunhistochemischen Untersuchungen wurden die Tiere mittels Chloralhydrat in

einer Dosis von 360 mg/kg KGW narkotisiert, die für eine Narkosedauer von ca. 45

Min. ausreichend war. Bei längerer Narkosedauer wurden zur Erhaltung 180 mg/kg

KGW Chloralhydrat nachdosiert. Die Narkosetiefe wurde durch Überprüfung des

Corneal- und des Zwischenzehenreflexes beurteilt.

62

3.1.4. Generierung von Ratten mit einem Innenohrschaden durch Streptomycin

Um Tiere mit einem Innenohrschaden zu erhalten und deren Phänotyp mit dem

Phänotyp der Mutanten (insbesondere der ci2-Mutante) vergleichen zu können,

wurde entsprechend der Methode von ALLEVA und BALASZ (1978) Neonaten das

Aminoglykosid-Antibiotikum Streptomycin verabreicht.

Hierzu wurden zwei Würfe des LEW/Ztm-Inzuchtstammes mit je 9 (5 Männchen, 4

Weibchen; Tiere 19/1 – 19/9) und 11 (5 Männchen, 6 Weibchen; Tiere 20/1 – 20/11)

Tieren verwendet.

Streptomycinsulfat (Sigma-Aldrich, Deisenhofen) wurde jeden Tag frisch in Wasser

für Injektionszwecke in Lösung gebracht und mit Hilfe von 0,1 M Natronlauge (Merck,

Darmstadt) auf pH 7,5 eingestellt. Die Tiere erhielten vom 2. bis zum 22.

Postnataltag tägliche Injektionen in einer Dosierung von 300 mg/kg KGW. Es wurde

im Wechsel im Bereich des linken Thorax, im Nackenbereich und im Bereich des

rechten Thorax subcutan injiziert, wobei das Applikationsvolumen 5 ml/kg KGW

betrug. Alle behandelten Tiere überlebten die Injektionen des oto-, neuro- und

nephrotoxischen Streptomycins. Sie zeigten weder ein sichtbar gestörtes

Allgemeinbefinden, noch Störungen von Wasser- oder Futteraufnahme oder

postnataler Entwicklung. Die Tiere wurden dann in den unten beschriebenen

Untersuchungen eingesetzt.

3.2. Verhaltensbeobachtungen

3.2.1. Charakterisierung des Rotationsverhaltens

Zur Charakterisierung des Rotationsverhaltens der beiden Mutanten und der

Streptomycin-behandelten Tiere wurden verschiedene Untersuchungen

durchgeführt.

Zum einen wurde das Rotationsverhalten unter Stresseinfluß beobachtet. Hierzu

wurden ci2-Tiere, ci3-Tiere, Streptomycin-behandelte Tiere, sowie die jeweiligen

Kontrolltiere tagsüber (zwischen 9.00 und 12.00) in ihren Haltungsräumen in eine

63

fremde Umgebung (leerer Makrolonkäfig Typ III) umgesetzt und vom Moment des

Umsetzens an über 5 Min. beobachtet. Ganze (360°) Drehungen zur rechten und zur

linken Seite hin wurden für die beiden Seiten getrennt gezählt. Diese Untersuchung

wurde für die Mutanten und jeweiligen Kontrolltiere dreimal im Abstand von

mindestens drei Tagen (um eine Gewöhnung der Tiere zu vermeiden) durchgeführt.

Aus diesen drei Testungen wurde dann die Rotationspräferenz ermittelt nach der

Formel:

Ganze Rotationen in die bevorzugte Richtung x 100 Ganze Rotationen insgesamt

Bei den Streptomycin-behandelten Tiere wurde das Drehverhalten des weiteren in

unterschiedlichen zeitlichen Abständen zur Behandlung mit Streptomycin in 5-Min.

Tests untersucht, um eventuelle Veränderungen im Drehverhalten mit zunehmendem

Abstand zur Behandlung dokumentieren zu können. Erstmals wurde das

Rotationsverhalten der Tiere 2 Tage nach abgeschlossener Streptomycin-

Behandlung (am 23. Postnataltag) beurteilt. Die weiteren Testungen (bis zum 32.

Postnataltag) erfolgten zunächst im Abstand von 1 – 2 Tagen, danach wurden

monatliche Abstände gewählt (bis zu 6 Monaten post injectionem).

Um zu sehen, ob die Tiere auch ohne Stresseinfluß, welcher durch die Anwesenheit

eines Untersuchers ausgelöst werden kann, spontane Rotationen zeigen, wurden

Videoaufnahmen von ci2- und ci3-Tieren und deren Kontrollen in ihrem Heimkäfig

angefertigt. Zunächst wurden Aufnahmen in der Dunkelphase, also der

Aktivitätsphase der Tiere, von 18.00 – 22.00 mitteleuropäischer Zeit erstellt. Für

einen direkten Vergleich zwischen Dunkel- und Hellphase wurden weitere Videos am

darauffolgenden Morgen (8.00 – 12.00 mitteleuropäischer Zeit), wiederum ohne

Anwesenheit eines Untersuchers, aufgenommen.

Für diese Aufnahmen wurde eine licht-sensitive schwarz-weiß Kamera (CCD-

Kamera-Modul, Conrad Elektronik, Hirschau) eingesetzt, mit welcher 2 Tiere

gleichzeitig beobachtet werden konnten, und es wurden Videokassetten mit einer

Laufzeit von 240 Min. (Eastman Kodak Company) verwendet. Während der

Dunkelphase musste schwaches Rotlicht eingesetzt werden, um die

Videoaufnahmen zu ermöglichen.

64

Anschließend wurden die Videos ausgewertet, indem eine Auszählung der

Rotationen erfolgte und danach die Präferenz der Tiere für jedes Video nach obiger

Formel ermittelt wurde.

3.2.2. Beurteilung weiterer motorischer Anomalien

Neben der Charakterisierung des Rotationsverhaltens erfolgte eine Beurteilung

weiterer Bewegungsstörungen. Für jedes Tier wurden die Parameter

Hyperlokomotion (horizontale Lokomotion), Opisthotonus und Ataxie nach einem

Score-System von 0 – 3 bewertet (0 = abwesend, 1 = unklar, 2 = vorhanden, 3 =

stark ausgeprägt) (TRICKLEBANK et al., 1984). Die Beurteilung dieser Parameter

erfolgte zusammen mit der Erhebung der Rotationszahlen in den 5-Min. Tests.

3.2.3. Untersuchungen zur Funktion des vestibulären Systems

3.2.3.1. Schwimmtest

Dieser Test wurde bei allen Tiergruppen (Tierzahlen s. Tab. 1) angewandt, um

Aussagen über die Funktion des vestibulären Systems zu erhalten. Die Ratten

wurden hierzu in ein rundes Wasserbecken (Durchmesser 40 cm) verbracht, welches

mit 30 – 35°C warmem Wasser gefüllt war, und aus welchem sie nicht entrinnen

konnten. Sie wurden für 5 Min. in diesem Becken beobachtet und das

Schwimmvermögen wurde beurteilt. Nach Ablauf der 5 Min. wurden die Tiere aus

dem Becken entnommen. Konnten die Tiere nicht schwimmen, sondern tauchten

korkenzieherförmig ab, so erfolgte eine sofortige Entnahme aus dem Wasserbecken.

Es wurden hier Tiere aller zur Verfügung stehenden Altersgruppen (jüngstes Tier 2

Monate, ältestes Tier 24 Monate) getestet.

65

Tab. 1: Anzahl der im Schwimmtest untersuchten Tiere der verschiedenen Tiergruppen.

Tiergruppe ci2/ci2 ci2/+ LEW ci3/ci3 BH.7A

Anzahl 58 26 22 21 16

Bei den Streptomycin-behandelten Tieren (getestet wurden hier 15 Tiere) wurde der

Schwimmtest in verschiedenen Abständen (von 6 Wochen bis zu 7 Monaten) zur

Streptomycin-Applikation durchgeführt. Da aus der Literatur bekannt ist (WARCHOL et

al., 1993, TANYERI et al., 1995, ZHENG et al., 1997), dass die vestibulären Haarzellen

nach Insulten regenerieren können, sollte hier eine eventuelle Veränderung im

Schwimmvermögen der Tiere dokumentiert werden.

Insgesamt erfolgte die Beurteilung des Schwimmvermögens in den beiden

Kategorien „vorhanden“ oder „nicht vorhanden“.

3.2.3.2. „Air-Righting Test“

Auch dieser Test überprüft bestimmte Funktionen (Stellreflexe) des vestibulären

Systems (OSSENKOPP et al., 1990; RABBATH et al., 2001) (s. Kap. 2.5.2.2.). Die Tiere

wurden auf den Rücken gedreht und aus einer Höhe von 30 cm auf eine

Schaumstoffunterlage (um Verletzungen der Tiere zu vermeiden) fallengelassen. Die

Fähigkeit der Tiere, sich auf dieser kurzen Strecke so zu drehen, dass sie auf den

Gliedmaßen landen, wurde beurteilt. Dieser Test wurde dreimal hintereinander

durchgeführt (Tierzahlen s. Tab. 2). Nur bei Ratten, die in allen drei Tests ein Defizit

zeigten (auf der Seite oder auf dem Rücken landeten) wurde dieses auf einen Defekt

des vestibulären Systems zurückgeführt.

Tab. 2: Anzahl der im „Air-Righting Test“ untersuchten Tiere der verschiedenen Tiergruppen.

Tiergruppe ci2/ci2 ci2/+ LEW ci3/ci3 BH.7A

Anzahl 23 9 8 26 19

66

3.2.3.3. „Tail-Hanging Test”

Der Tail-Hanging Test (s. Kap. 2.5.2.2.) wurde als dritter Test zur Überprüfung der

Funktion des vestibulären Systems durchgeführt ( HUNT et al., 1987; RABBATH et al.,

2001).

In diesem Test wurden die Ratten an der Schwanzwurzel in die Höhe genommen

und einige Zentimeter über den Boden gehalten, und es wurde beurteilt, ob die Tiere

die Gliedmaßen zum Boden hin ausstreckten, um normal auf allen Vieren zu landen,

oder sich zur Seite oder zum Bauch hin hochdrehten, was als abnormes Landen

gewertet wurde. Auch dieser Test wurde direkt dreimal hintereinander durchgeführt

(mit den selben Tieren, die auch im „Air-Righting Test“ eingesetzt wurden)

(Tierzahlen s. Tab. 2).

3.2.4. Pharmakologische Untersuchungen

Um der Bedeutung dopaminerger Fehlfunktionen nachzugehen, wurden

neuropharmakologische Untersuchungen mit Substanzen, die dieses System

manipulieren, durchgeführt. Die Auswahl der Substanzen begründete sich auf

Literaturdaten (JERUSSI und GLICK, 1974; GLICK et al., 1976; LÖSCHER et al., 1991;

LÖSCHER et al., 1993; FEUERSTEIN und JURNA, 1996) und auf vorangegangenen

Untersuchungen zur ci2-Mutante (LÖSCHER et al., 1996).

3.2.4.1. Verwendete Substanzen und Dosierungen

In den pharmakologischen Untersuchungen wurden die Substanzen D-

Amphetaminsulfat (Sigma-Aldrich, Taufkirchen), Dizocilpin ((+)-MK-801 Hydrogen

Maleat) (Sigma-Aldrich, Taufkirchen), Haloperidol (Haldol-Janssen, Janssen GmbH,

Neuss) sowie S(-)Racloprid L-Tartrat (RBI, Natick, Maine, USA) eingesetzt. Das

Haloperidol lag in Form einer fertigen Injektionslösung (1 ml Ampullen mit 5 mg

Haloperidol) vor, welche mit Wasser für Injektionszwecke (Serum-Werk Bernburg

AG, Bernburg) verdünnt wurde. Von den weiteren Substanzen, welche als

wasserlösliche Salze vorlagen, wurden zum Versuchsbeginn Wirkstofflösungen frisch

67

angesetzt. Die Dosierungen beziehen sich hier auf das jeweilige Salz. Es wurde die

entsprechende Substanzmenge (Mindesteinwaage: 10 mg) auf einer Feinwaage

(Sartorius research R160P, Sartorius GmbH, Göttingen) abgewogen und mit Hilfe

eines Magnetrührers (MEA 11, Landgraf Laborgeräte, Langenhagen) in Wasser für

Injektionszwecke (D-Amphetaminsulfat und MK-801) gelöst. Racloprid wurde in

isotoner Natriumchlorid-Lösung gelöst. In jedem Fall wurden die Einwaagen und

Verdünnungsschritte so gewählt, dass das Injektionsvolumen 2 ml/kg KGW betrug.

Die Auswahl der Dosierungen für D-Amphetamin und MK-801 erfolgte in Anlehnung

an die bereits bei der ci2-Mutante durchgeführten Untersuchungen (LÖSCHER et al.,

1996). Die Dosierung von Haloperidol wurde den bei der „Stargazer“-Mutante

eingesetzten Dosierungen angepasst (BROCK und ASHBY, 1996). Für die

Dosisfindung beim Racloprid wurde die Doktorarbeit von Herrn REHDERS am hiesigen

Institut (1999) zugrunde gelegt.

3.2.4.2. Beurteilung der Wirkungen

Wie aus Tab. 3 hervorgeht, wurden die oben genannten Wirkstoffe bei Gruppen von

jeweils 7 bis 10 Ratten untersucht. Alle pharmakologischen Versuche erfolgten nach

einem Cross-over Design, bei dem jedes Tier sowohl Substanz, als auch Vehikel

erhielt. Zwischen Injektion der Substanz und Injektion des Vehikels lag ein Zeitraum

von mindestens einer Woche. Als Vehikel wurden Wasser für Injektionszwecke (bei

D-Amphetamin, MK-801 und Haloperidol) bzw. isotone Natriumchlorid-Lösung

(Racloprid) eingesetzt. Zum Vergleich der Wirkstoffeffekte wurden die Mutanten und

entsprechende Gruppen von Kontrollratten mit Substanz behandelt (s.Tab. 3). Dabei

wurde darauf geachtet, dass an jedem Versuchstag sowohl Mutanten und Kontrollen

unter Substanzeinfluss, als auch Mutanten und Kontrollen unter Vehikeleinfluss

beobachtet wurden, um Unterschiede besser beurteilen zu können. Wie

zusammenfassend in Tab. 4 dargestellt ist, erfolgte in den

verhaltenspharmakologischen Untersuchungen, in Anlehnung an die Methode von

TRICKLEBANK et al. (1984), eine Beurteilung verschiedener Parameter. Während der

ersten 2 Std. wurde eine Beurteilung alle 15 Min. durchgeführt, bei fortgesetzter

Beobachtung erfolgte die Beurteilung dann im Abstand von 30 Min..

68

In der Regel wurden die Versuche in der Hellphase (Beginn: 9.00 Uhr) durchgeführt.

Die Tiere wurden hierfür in Rotometertonnen (Durchmesser 35 cm,

Forschungswerkstätten, Medizinische Hochschule Hannover) verbracht. Mit dem

Umsetzen in die Rotometer begann der erste Beobachtungszeitraum, der sich über

15 Min. erstreckte. Anschließend erfolgte die intraperitoneale Injektion der jeweiligen

Substanz. Vom Zeitpunkt der Injektion an wurden die Tiere nach Gabe von D-

Amphetamin und MK-801 über 120 Min. und nach Gabe von Haloperidol und

Racloprid (aufgrund längerer Wirkungsdauer) über 240 bzw. 180 Min. beobachtet.

Bei der Beurteilung der pharmakologischen Wirkung von Haloperidol und Racloprid

kam neben der reinen Beobachtung der Tiere der „Standard Bar-Test“ (KUSCHINSKY

und HORNYKIEWICZ, 1972; SANBERG et al., 1996) zur Beurteilung einer Katalepsie (s.

Kap. 2.4.4.) zum Einsatz. Die Tiere wurden hier mit den Vorderpfoten auf einen 9,5

cm hohen Aluminiumblock gesetzt, und die Zeit bis zum Abstieg wurde gestoppt. Bei

einer Verweilzeit von über 120 Sek. wurden die Tiere vom Block genommen.

Ergänzend zu den Versuchen während der Hellphase wurden bei ci3-Ratten auch

pharmakologische Untersuchungen von D-Amphetamin in der Dunkelphase

durchgeführt, um Einflüsse der Aktivitätsphase der Tiere auf pharmakologische

Wirkungen zu ermitteln. Dazu wurde D-Amphetamin kurz vor Beginn der

Dunkelphase injiziert und die Tiere wurden dann von 18.00 – 20.00 in ihrem

Heimkäfig videobeobachtet wie unter 3.2.1. beschrieben.

69

Tab. 3: An die Tiergruppen verabreichte Substanzen unter Angabe der Dosierungen und Tierzahlen. In Klammern: Zahlen nach Geschlecht getrennt (W = Weibchen, M = Männchen), (da 2,5 mg/kg KGW Amphetamin bei Männchen keinen ausreichenden Effekt hatte, wurden hier unterschiedliche Dosen an Weibchen und Männchen verabreicht). Das Injektionsvolumen betrug für alle Substanzen 2 ml/kg KGW, alle Substanzen wurden intraperitoneal (i.p.) verabreicht. Die Verabreichung von D-Amphetamin und MK-801 an ci2-Tiere wurde bereits in früheren Studien durchgeführt (LÖSCHER et al., 1996).

Substanz

Tiergruppe

D-Amphetamin

W: 2,5 mg/kg KGW

M: 3 mg/kg KGW

Hellphase

D-Amphetamin

W: 2,5 mg/kg KGW

M: 3 mg/kg KGW

Dunkelphase

MK-801

W/M: 0,1 mg/kg

KGW

Hellphase

Haloperidol

W/M: ci2: 0,1

mg/kg KGW; ci3:

0,2 mg/kg KGW

Hellphase

Racloprid

W/M: 1 mg/kg

KGW

Hellphase

ci2/ci2 10 Tiere

(W: 5 / M: 5)

10 Tiere

(W: 5 / M: 5)

ci2/+ 10 Tiere

(W: 5 / M: 5)

10 Tiere

(W: 5 / M: 5)

ci3/ci3 8 Tiere

(W: 6 / M: 2)

10 Tiere

(W: 5 / M: 5)

10 Tiere

(W: 5 / M: 5)

10 Tiere

(W: 3 / M: 5)

BH.7A 7 Tiere

(W: 5 / M: 2)

10 Tiere

(W: 5 / M: 5)

10 Tiere

(W: 5 / M: 5)

Streptomycin-

behandelte

LEW

9 Tiere

(W: 7 / M: 2)

LEW (Kontrollen

zu Streptomycin-

behandelten

LEW)

7 Tiere

(W: 5 / M: 2)

70

Tab. 4: Angabe und Erklärung der Parameter, die in den pharmakologischen Untersuchungen bewertet wurden. Die Auswertung erfolgte anhand eines Score-Systems (TRICKLEBANK et al., 1984) von 0 – 3 (0 = abwesend, 1 = unklar, 2 = vorhanden, 3 = stark ausgeprägt).

Parameter Erklärung Bewertung

Bei allen Substanzen bewertet:

Circling links / rechts Zählung ganzer Rotationen (enge

„nose-to-tail“ Drehungen)

Erfassung der Anzahl, nach linker

und rechter Seite getrennt

Hyperlokomotion Erhöhte lokomotorische Aktivität Scoresystem 0 - 3

Hyperexzitabilität Erhöhte Schreckhaftigkeit Scoresystem 0 - 3

Opisthotonus Überstrecken des Kopfes nach

caudo-dorsal

Scoresystem 0 - 3

Ataxie Gangstörungen Scoresystem 0 – 3

Piloerektion Aufgestelltes Haarkleid Scoresystem 0 - 3

Sniffing Stereotypes Schnüffeln Scoresystem 0 – 3

Grooming Stereotypes Pflegeverhalten Scoresystem 0 – 3

Gnawing Stereotypes Kauen Scoresystem 0 – 3

Zusätzlich erfasst bei D-Amphetaminsulfat und MK-801 (typische Parameter für Beurteilung einer erhöhten

Aktivität im DA-System)

Circling links / rechts auf weiten

Kreisen

Zählung weiter Kreise, die die Tiere

in den Rotometern zeigten

Erfassung der Anzahl, nach linker

und recher Seite getrennt

Licking Stereotypes Lecken Scoresystem 0 – 3

Biting Stereotypes Nagen an der Wand

der Rotometertonne

Scoresystem 0 – 3

Rearing Stereotypes Aufrichten Scoresystem 0 – 3

Piano playing Stereotypes Übersetzen der

Vorderpfoten zu beiden Seiten im

Wechsel

Scoresystem 0 – 3

Salivation Speichelfluß Scoresystem 0 – 3

Zusätzlich erfasst bei Haloperidol und Racloprid (typische Parameter für Beurteilung einer verminderten Aktivität

im DA-System)

Katalepsie Unfähigkeit des Tieres, sich aus

einer Körperhaltung, in die es

gebracht wird, zu lösen

Messung der Zeit bis zum Abstieg

vom Block, nach 120 Sek.

Herunternahme vom Block

Hypolokomotion Verminderte lokomotorische Aktivität Scoresystem 0 – 3

Flat body posture Vorwärtsbewegung in flacher

Körperhaltung

Scoresystem 0 – 3

Tremor Muskelzittern Scoresystem 0 – 3

Ptosis Verstärkter Lidschluß Scoresystem 0 – 3

Hunched body posture Zusammengekauerte Körperhaltung Scoresystem 0 – 3

Straub tail Erhöhter Schwanztonus Scoresystem 0 – 3

71

3.3. EEGs

EEGs wurden von 4 ci2/ci2, 4 ci2/+, 2 LEW/Ztm sowie 2 WAG/Rij Ratten abgeleitet.

Aufgrund des durch die „Stargazer“ (stg)-Mausmutante (NOEBELS et al., 1990)

erhaltenen Hinweises auf die Möglichkeit eines gleichzeitigen Vorliegens von

Bewegungsstörungen und von für Absencen-Epilepsien charakteristischen „Spike-

Wave“-Formationen im EEG, wurde nach einem Rattenstamm mit Absencen-

Epilepsien gesucht, um das EEG von Tieren dieses Stammes mit dem EEG von ci2-

Tieren zu vergleichen. Ausgewählt wurden Tiere des WAG/Rij-Rattenstamms, weil

diese Verhaltensphänomene und EEG-Veränderungen zeigen, die denen der

humanen Absencen-Epilepsie entsprechen (VAN LUIJTELAAR und COENEN, 1986;

PEETERS et al., 1989). So ergab sich die Möglichkeit, einen Vergleich mit dem EEG

von ci2-Tieren und von Kontrolltieren durchzuführen, um bei diesen das

Vorhandensein von epileptogenen Veränderungen auszuschließen.

EEGs von ci3- und BH.7A-Tieren konnten aufgrund mangelnder Verfügbarkeit der

Tiere bislang noch nicht angefertigt werden, sind aber geplant.

3.3.1. Elektrodenimplantation

Zur Ableitung der EEGs wurden den Tieren 3 Schraubenelektroden stereotaktisch

implantiert. Hierzu wurden nach Narkoseeinleitung die Haare im Bereich des

Operationsfeldes entfernt und es wurde mit einer 70%igen Alkohollösung desinfiziert.

Durch Fixierung mittels Stäben in den Gehörgängen und einer Fixierung des

Oberkiefers, wurden die Ratten nach der Methode von PAXINOS und WATSON (1986)

in einen Stereotakten (Fa. David Kopf, Tujunga, California, USA) eingespannt, so

dass sich die Kreuzungspunkte der Knochennähte der Schädelknochen, die Sutura

lamdoidea und Bregma, auf gleicher Höhe befanden. Als nächstes erfolgte die

Inzision der Haut über eine rostro-caudale Ausdehnung von ca. 2 cm zur Freilegung

des Schädeldaches und die anschließende Entfernung des Periostes mittels eines

Periostschabers. Zur Blutstillung und guten Darstellung der Knochennähte wurde

30%ige Wasserstoffperoxidlösung (Merck, Darmstadt) eingesetzt. Ausgehend von

Bregma wurden mit Hilfe einer Koordinatennadel unterschiedliche

72

Trepanationsstellen anhand des Atlas von PAXINOS und WATSON (1986) aufgesucht:

bei den Mutanten sowie den LEW/Ztm (Wildtyp)-Ratten wurden die bipolaren EEG-

Elektroden, die aus teflonbeschichtetem, rostfreiem Stahl bestanden, an die

Koordinaten -2,5 mm rostro-caudal, +4 mm lateral und -2,5 mm rostro-caudal und -4

mm lateral zu Bregma (beide Elektroden befanden sich über dem Cortex und dem

limbischen System) verbracht. Die notwendige Erdungsschraube wurde ohne

Koordinatenangabe über dem Cerebellum eingesetzt.

Bei den WAG/Rij-Tieren mußten den bipolaren Elektroden andere Koordinaten

zugeordnet werden (rostro-caudal -2,5, lateral +3,5 und rostro-caudal -2,5, lateral -

3,5), da die Schädeldecke sich bei diesen Tieren schmaler darstellte. Die

Erdungsschraube wurde wiederum über das Cerebellum gebracht.

Zur Einbringung der Elektroden wurde nun mit Hilfe eines 0,8 mm Bohrers (Moto-

Flex, Modell 732 T1, Dremel, Breda, NL) die Schädeldecke soweit trepaniert, dass

die Dura mater ohne Läsionen des darunter liegenden Cortex durchstoßen war.

Dieses wurde mit einem spitzen Haken kontrolliert und noch vorhandene Durateile

wurden vorsichtig entfernt. Auftretende Blutungen wurden mit

Wasserstoffperoxidlösung gestillt, um den Halt des Steckeraufbaus später nicht zu

gefährden. Nun wurden die mit der Elektrode verbundenen Edelstahlschrauben von

1,2 mm Durchmesser mit 5 halben Umdrehungen in die Trepanationsöffnungen

gedreht. Man gelangte auf diese Weise mit den verwendeten Schrauben

oberflächlich an den darunter liegenden Cortex, ohne diesen zu verletzen.

Um die Elektroden zu fixieren wurde ein Kunststoff-Kaltpolymerisat (Dental-Zement,

Paladur, Kulzer & Co. GmbH, Wehrheim) verwendet. Ein dreipoliger Stecker wurde

mit Vaseline imprägniert und mit den entsprechenden Elektroden verbunden. Dann

wurde ein ca. 2 cm hoher Steckeraufbau geformt, aus welchem nach der Entfernung

des Steckers die Steckervorrichtung herausragte.

Abschließend wurden die Wundränder mit Hautheften adaptiert, die Tiere wurden

wieder einzeln in Makrolonkäfige verbracht, dort auf Wärmekissen gelegt und bis

zum Erwachen beobachtet.

73

3.3.2. EEG-Ableitung

Nach einer postoperativen Rekonvaleszenz von mindestens einer Woche wurden die

EEGs abgeleitet. Hierzu wurde der Heimkäfig in ein Terrarium (58,5 x 39 x 38 cm)

gestellt, der Käfigdeckel wurde entfernt. Es wurde ein Stecker in die

Steckervorrichtung eingebracht, so dass die Tiere über ein flexibles Kabel durch

einen Verstärker (Hugo Sachs, March-Hugstetten) mit dem EEG-Schreiber (Uniscript

digital, Schwarzer/Picker, München) verbunden waren. Die Tiere konnten sich in

ihrem Käfig nach Einbringung des Steckers frei bewegen. Es wurde über eine

Stunde kontinuierlich abgeleitet, wobei der Papiervorschub 5 mm/Sek. betrug.

Während dieser Zeit wurden die Tiere kontinuierlich beobachtet, so dass das

Verhalten der Tiere („aktive“ Wachheit: aktives Verhalten, Bewegung; „passive“

Wachheit: keine motorische Aktivität; Schlaf) sowie besondere Parameter

(Myoklonien im Bereich der Vibrissen, von Auge und Ohr) protokolliert werden

konnten. Anschließend erfolgte die Auswertung durch Beurteilung der Höhe der

Peaks und durch Beurteilung der Frequenzen.

Um EEGs auch mit dem Computerprogramm Chart version 3.4 (Power-Lab)

bearbeiten zu können, wurden des weiteren Tiere, wiederum in ihrem Heimkäfig,

über ein Kabel und ein Drehgelenk mit einem Verstärker (Cyber Amp 380, Axon

Instruments, Inc., Foster City, California, USA) verbunden und das analoge Signal

wurde mit PowerLab (ADInstruments Ltd., Hastings, East Sussex, U.K.) digitalisiert

und für die weitere Analyse auf einem Computer gespeichert. Auch hier wurde eine

Aufnahmezeit von einer Stunde gewählt.

3.4. Neuropathologische Untersuchungen

3.4.1. Perfusion für neuropathologische Untersuchungen

Für die Durchführung von neuropathologischen Untersuchungen mußte eine

Fixierung des Gehirnes durchgeführt werden. Diese erfolgte im Rahmen einer

Perfusion der Tiere mit Fixans. Für die Ausführung der Perfusion wurden die Ratten

74

narkotisiert und anschließend auf dem Rücken liegend in gestreckter Haltung fixiert.

Der Brustkorb wurde mit einer Schere eröffnet und die linke Herzkammer mit einer

Kanüle punktiert, welche über einen Dreiwegehahn mit zwei Behältnissen verbunden

war, von denen eines 0,01 M phosphatgepufferte, isotone Kochsalzlösung, das

andere Fixanslösung enthielt. Es erfolgte zunächst eine Spülung des Gefäßsystems

mit Kochsalzlösung, um das im Gefäßsystem befindliche Blut zu entfernen und damit

durch eine Koagulation bedingte Artefakte zu verhindern. Danach wurde mit Fixanz

gespült. Hierbei wurde für die Immunhistochemie 4%ige Paraformaldehyd-Lösung,

für die Thioninfärbung 4%ige Formalin-Lösung (in beiden Fällen wurde ca. 1 ml

Lösung/kg KGW eingesetzt), beides hergestellt unter Verwendung eines 0,1 M

Phosphatpuffers, angewendet.

Nach der Fixation wurde das Gehirn entnommen. Hierzu wurde die Schädelkalotte

mit einer Zange eröffnet und die Hirnhäute wurden entfernt. Zur Cryoprotektion

wurde das Gehirn über Nacht in einer 30%igen phosphatgepufferten Zuckerlösung

bei 4°C aufbewahrt und im Anschluß wurden mit Hilfe eines Gefriermikrotoms (Leica

Frigomobil, CM 1325, Wetzlar) Transversalschnitte (Schnittdicke: 40 µm) angefertigt.

Für die Immunhistochemie wurden die Schnitte im Bereich von Substantia nigra und

VTA verwendet. Es wurden hier 2 Serien angefertigt, von welcher eine für die

Immunhistochemie, die andere für eine Thioninfärbung verwendet wurde.

Zur Thioninfärbung wurden 2 Serien angefertigt, von welchen eine für die Färbung

genutzt wurde. Die andere diente zunächst als Reserve-Serie und wurde

anschließend verworfen.

3.4.2. TH-Immunhistochemie

In dieser Studie wurden dopaminerge Neurone der SNC und der VTA

immunhistochemisch durch Antikörper gegen das Enzym TH markiert. Dieses Enzym

katalysiert die Umwandlung von L-Tyrosin zu L-Dihydroxyphenylalanin. Dieses ist der

geschwindigkeitsbestimmende Schritt in der Biosynthese von DA, von Noradrenalin

und von Adrenalin (s. Kap. 2.4.3.). Zellen, die dieses Enzym enthalten, stellen sich

nach Bindung von spezifischen Antikörpern an die TH und nach Farbreaktion braun-

schwarz dar.

75

Entsprechend früherer TH-immunhistochemischer Studien (RICHTER et al., 1999)

wurden die Schnittpräparate in trisgepufferter, isotoner Natriumchlorid-Lösung unter

Zusatz von 0,5%igem Wasserstoffperoxid gewaschen und anschließend für 60 Min.

in eine Lösung mit 10,9 % Schweineserum, 2,9 % Rinderserumalbumin und 0,3 %

Triton X-100 in isotoner Natriumchlorid-Lösung gegeben. Darauf wurde für 18 Std.

mit primärem Antiserum (Kaninchen-anti-TH IgG, 1:5000) inkubiert. Daran schloß

sich eine neuerliche Spülung mit isotoner Natriumchlorid-Lösung und eine Inkubation

mit sekundärem Antiserum (Schwein-anti-Kaninchen IgG, 1:500) für 90 Min. an. Als

nächstes folgte die Farbreaktion mit Diaminobenzidin (0,05% Diaminobenzidin und

0,6% Ammoniumnickelsulfat in isotoner Natriumchlorid-Lösung) über 15 Min.

Die Antikörperlösungen wurden bei Raumtemperatur in isotoner Natriumchlorid-

Lösung mit 1% Schweineserum, 1% Rinderserumalbumin und 0,3% Triton X-100

inkubiert.

Abschließend wurden die Schnitte sortiert, auf Objektträger aufgezogen und in

Ethanol dehydriert, in Xylol-Ersatz-Medium gereinigt und mit Entellan®Neu

eingedeckt.

3.4.3. Thioninfärbung

Für diese Färbung wurden die Schnitte auf entfettete Objektträger aufgezogen. Nach

dem Trocknen wurden sie dann über eine absteigende Alkoholreihe (je 3 Min. in:

96%, 80%, 70%, 50% Ethanol und destilliertem Wasser) rehydriert. Darauf folgten

die Färbung mit einer wässrigen Thioninlösung, welcher die Schnitte 70 – 90 Sek.

ausgesetzt waren, und die Entwässerung der gefärbten Schnitte mit einer

aufsteigenden Alkoholreihe. Abschließend wurden die Präparate mit Entellan®

eingedeckt.

76

Verwendete Lösungen:

12,5%ige Thioninlösung:

100 ml 1M Essigsäure

36 ml 1M Natronlauge

864 ml destilliertes Wasser

1,25 g Thionin

Die Essigsäure mit Natronlauge und das destillierte Wasser wurden zunächst auf

60°C erhitzt, anschließend wurde das Thionin in Lösung gebracht. Die fertige Lösung

wurde dann filtriert und für längstens vier Wochen bei 65 °C im Wärmeschrank

aufbewahrt.

7%ige Chromalaun-Gelatine-Lösung:

3,5 g Gelatine

0,35 g Chromalaun

500 ml destilliertes Wasser

Die Gelatine wurde unter Rühren bei 60°C gelöst, das Chromalaun wurde zur

Konservierung hinzugegeben. Die fertige Lösung wurde dann bis zu einer Woche im

Kühlschrank aufbewahrt.

3.4.4. Bestimmung der Dichte TH-positiver Neurone in SNC und VTA

Die Dichte TH-positiver Neurone wurde in der SNC und VTA von 7 ci3-Tieren und 7

BH.7A-Kontrolltieren mit der Zählmethode des optischen Disektors (SAPER, 1996)

bestimmt. Die Objekte wurden auf einem, dem Mikroskop (Zeiss Axioskop, Jena)

angeschlossenen, Bildschirm abgebildet. Es wurden in den, wie in Kapitel 3.4.2.

beschrieben, angefertigten und gefärbten Hirnschnitten bei 400facher Vergrößerung

zunächst folgende Lokalisationen (nach dem Atlas von PAXINOS und WATSON, 1986)

der SNC und der VTA aufgesucht: Zu Beginn wurde für jede Serie der Schnitt

ermittelt, auf welchem sich der mediale terminale Nucleus des akzessorischen,

77

optischen Traktes am deutlichsten darstellte. Auf diesem Schnitt wurden in drei

Gesichtsfeldern die angefärbten Neurone ausgezählt und zwar in der VTA, der

medialen und der lateralen SNC. Vier Schnitte vor dem medialen, terminalen

Nucleus wurden zwei Gesichtsfelder (je eines in VTA und SNC), vier Schnitte hinter

dem medialen terminalen Nucleus zwei weitere Gesichtsfelder (SNC medial und

lateral), und acht Schnitte hinter dem medialen terminalen Nucleus noch ein

Gesichtsfeld (SNC) ausgezählt. Um die Größe des Gesichtsfeldes festzulegen wurde

eine Folie mit einem Raster auf dem Bildschirm befestigt, und es wurden für die

größere VTA die Neurone in 25 Kästchen (1 Kästchen = 3 cm x 3 cm), für die SNC

die Neurone in 20 Kästchen ausgezählt. Diejenigen Neurone, welche sich in der

obersten Schnittebene scharf einstellen ließen, wurden mit einem Folienstift markiert

und daraufhin wurden die unteren Ebenen durchmustert und markiert. Nur Neurone,

die während des Durchmusterns scharf eingestellt waren, wurden gezählt (SAPER,

1996).

Für die folgenden 8 Lokalisationen jeweils der rechten und linken Gehirnhälfte

wurden so die Neuronenanzahlen pro mm3 in drei aufeinander folgenden Schnitten

ermittelt: rostraler und caudaler Anteil der VTA, rostraler und caudaler Anteil der

lateralen, rostraler Anteil der medialen SNC, caudaler Anteil der medialen SNC,

unterteilt in anterioren, posterioren und superposterioren Anteil (s. Abb. 6). Aus den

drei Schnitten wurde anschließend für jede Region der Mittelwert errechnet. Die

erhaltenen Werte wurden mit 4 (für die VTA) oder mit 5 (für die SNC) multipliziert, um

die Anzahl Neurone auf 100 Feldern zu erhalten. Unter Berücksichtigung der

Vergrößerung (400fach) und der Schnittdicke (40 µm) erfolgte dann die Umrechnung

von den Bildschirmmaßen auf µm des Präparates, so dass sich der Faktor 174,39

ergab. Die Anzahl Neurone pro mm3 ließ sich nun mit folgender Formel errechnen:

Anzahl gefärbter Neurone in 100 Feldern x 174,39

= Anzahl Neurone/mm3

78

Abb. 6: Topographie der Subregionen der SNC und VTA, in denen die TH-positiven dopaminergen Neurone ausgezählt wurden (nach PAXINOS und WATSON, 1986). 1: VTA rostr. 5: SNC lat. rostr. 2: SNC med. rostr. 6: SNC med. caud. post. 3: VTA caud. 7: SNC lat. caud. 4: SNC med. caud. ant. 8: SNC med. caud. superpost.

79

3.4.5. Untersuchung der cochleären und vestibulären Nuclei im Hirnstamm

3.4.5.1. Kerngrößen

In dieser Studie wurden die cochleären und vestibulären Kerne (Lokalisationen s.

Abb. 7 und 8) von 5 ci3-Tieren und 6 BH.7A-Kontrolltieren, sowie von 7

Streptomycin-behandelten Tieren mit Hilfe eines Bildanalysesystems (KS 300, Zeiss,

Göttingen) histologisch untersucht. Die hier eingesetzten ci3-Ratten zeigten eine

durchschnittliche Drehpräferenz von 83%.

Für diese Untersuchung wurden die Tiere wie oben beschrieben mit

Paraformaldehyd perfundiert, es wurden Hirnschnitte angefertigt und diese mit

Thionin gefärbt.

Bei 25facher Vergrößerung wurden dann die Flächen folgender Kerngebiete

(basierend auf dem Atlas von PAXINOS und WATSON, 1986) für die beiden

Hemisphären getrennt ausgemessen:

Cochleäre Kerne: Flächen des anteroventralen cochleären Nucleus, des

posteroventralen cochleären Nucleus, sowie des dorsalen cochleären Nucleus .

Vestibuläre Kerne: Flächen des superioren vestibulären Nucleus, des inferioren

(spinale) vestibulären Nucleus, des medialen vestibulären Nucleus (mit

parvizellulärem und magnozellulärem Anteil), sowie des lateralen vestibulären

Nucleus (mit anteriorem und posteriorem Teil).

Dabei wurden alle Schnitte verwendet, auf welchen sich die gewünschten

Kerngebiete befanden, und welche frei von Artefakten waren.

Das Kernvolumen wurde anschließend nach folgender Formel berechnet:

Volumen Gesamtkern = (Fläche des Kerns auf Schnitt 1 + Fläche des Kerns auf

Schnitt 2 +…. Fläche des Kerns auf Schnitt n) x Abstand zwischen den Schnitten

Der mediale vestibuläre Nucleus wurde hierbei nicht in den magnozellulären und

spinozellulären Anteil unterteilt. Beim inferioren vestibulären Nucleus wurde die

Größe nur für den rostralen Anteil ermittelt. Das Gesamtvolumen des

80

posteroventralen cochleären Nucleus und des dorsalen cochleären Nucleus konnte

aufgrund partieller Schäden durch die histologische Präparation nicht bestimmt

werden. Aus diesem Grund wurden hier die mittleren Kerngrößen in drei aufeinander

folgenden Schnitten verglichen.

Abb. 7: Lokalisationen der cochleären Kerngebiete (nach PAXINOS und WATSON, 1986). AVCN: anteroventraler cochleärer Nucleus VCP: posteroventraler cochleärer Nucleus DC: dorsaler dorsaler cochleärer Nucleus

81

Abb. 8: Lokalisationen der vestibulären Kerngebiete (nach PAXINOS und WATSON, 1986) SVN: superiorer vestibulärer Nucleus MVN: medialer vestibulärer Nucleus LVN a: lateraler vestibulärer Nucleus, anteriorer Teil LVN b: lateraler vestibulärer Nucleus, posteriorer Teil IVN: inferiorer vestibulärer Nucleus

3.4.5.2. Morphologie der Neurone des anteroventralen cochleären Nucleus

Zusätzlich zur Untersuchung der Kerngrößen wurde auch die Morphologie der

Neurone im anteroventralen cochleären Nucleus betrachtet. Quantitativ evaluiert

wurden hierbei die Fläche in µm2, der Kreisfaktor in % (4 x π x Fläche/Umfang²) und

der Umfang in µm von 25 Neuronen je Seite. Die Neurone wurden zufällig

ausgewählt und es wurden nur Neurone untersucht, deren Nucleolus sichtbar war.

Aus diesen Einzelwerten wurde je Tier und Seite der Mittelwert errechnet.

82

3.5.6. Neurochemische Untersuchungen

3.5.1. Gewinnung und Aufarbeitung

Es sollten hier die Konzentrationen von DA und dessen Metaboliten 3,4-

Dihydroxyphenylessigsäure und Homovanillinsäure, von Serotonin und dessen

Metabolit 5-Hydroxyindolessigsäure, sowie des Noradrenalin in der Substantia nigra,

dem Striatum und dem Nucleus accumbens von ci3-Tieren, getrennt für die

ipsilaterale und die contralaterale Hemisphäre, bestimmt werden.

Hierzu wurde ein konventioneller neurochemischer Hirnhomogenat-Assay (nach

ANNIES, 1993) angewandt, in welchem die Substanzen im Homogenat durch

unterschiedlich starke Wechselwirkung mit der lipophilen Oberfläche einer Reversed-

Phase-HPLC-Trennsäule, entsprechend ihrer stoffspezifischen Kapazitätsfaktoren,

aufgetrennt wurden.

Zum Zeitpunkt des Assays lag die letzte Rotationstestung bei den verwendeten

Tieren mindestens 2 Wochen zurück. Die durchschnittliche Drehpräferenz der Tiere

lag bei 96,5 % (von 93 – 99 %).

Um die Hirnhomogenate zu erhalten, wurden die Tiere mit Hilfe einer Guillotine

(Kleine Guillotine für Ratten und Mäuse, Hugo Sachs Elektronik KG, March-

Hugstetten) dekapitiert und die Gehirne wurden nach Entfernung der Kalotte vom

Foramen magnum aus entnommen. Sie wurden dann auf den Kälteblock

(Temperatur: -10°C) eines Kältethermostaten (LAUDA Compact-Kältethermostat

RKT 20, Messgerätetechnik LAUDA, Lauda-Königshofen) verbracht und mit einem

Skalpell wurden die beiden Gehirnhälften getrennt. Anschließend wurden die

gewünschten Hirnbereiche (Striatum, Substantia nigra, Nucleus accumbens) mit

einem scharfen Löffel entnommen und auf einer elektronischen Präzisionswaage

(Sartorius universal U 3600, Sartorius GmbH, Göttingen) einzeln gewogen. Die

Gehirnregionen wurden dann jeweils zusammen mit 1 ml Enteiweißungslösung (22,3

mg Ethylendiamintetraacetat und 12,6 mg Natriumsulfit wurden zur Herstellung mit

0,2 M Perchlorsäure auf 200 ml Lösung gebracht) in Ultrazentrifugenröhrchen

verbracht und während der weiteren Verarbeitung wurden die Proben durch

Lagerung im Eiswasser ständig gekühlt, um die Enzymaktivitäten zu minimieren. Mit

83

Hilfe eines Gewebezerkleinerungsgerätes (Ultra-Turrax- T 25, Janke u. Kunkel

GmbH, Staufen) erfolgte die Homogenisierung der Proben bei 11 000 Umdrehungen

pro Min.. Das Homogenisat wurde auf einem Vibrax-VXR (Janke u. Kunkel GmbH,

Staufen) für 10 Min. geschüttelt und dann in einer Ultra-Zentrifuge (Centrikon T-2060,

Kontron) bei 4°C und 35.000 x g (18.000 Umdrehungen pro Min.) für 10 Min.

zentrifugiert. Der gesamte Überstand wurde in Eppendorf-Reaktionsgefäße (1,5 ml

Fassungsvermögen) überführt und in einer Eppendorf-Zentrifuge (Centrifuge 5415,

Eppendorf AG, Hamburg) bei Raumtemperatur und 16.000 x g (14.000

Umdrehungen pro Minute) noch einmal für 1 Min. zentrifugiert. Aus dem Überstand

wurden 2 Portionen zu 300 µl entnommen, wiederum in Eppendorf-Reaktionsgefäße

(1,5 ml) verbracht und bis zur Analyse (im Höchstfall für 7 Tage) bei –80°C

eingefroren.

3.5.2. Analytik der Monoamine

Für die Detektion der Monoamine wurde das Verfahren der „Reversed-Phase-HPLC“

angewandt, bei welchem die stationäre Phase (Säule: Nucleosil mit C18-Molekülen)

eine geringere Polarität besitzt als die mobile (Citratpuffer). Somit haben Stoffe, die

stärker geladen sind, eine höhere Affinität zur mobilen Phase, was für polare Stoffe

in kürzeren Retentionszeiten resultiert. Zur Herstellung der mobilen Phase wurden

eine Feinwaage (Sartorius GmbH, Göttingen), ein Vakuumfiltrationsgerät (Millipore,

SCK Solvent Clarification Kit) mit 0,22 µm Durapore-Filtereinlagen (Millipore GVWP

04700), betrieben von einer Vakuumpumpe (KNF Laboport Neuberger, Landgraf

Laborgeräte), sowie ein pH-Meter (Mikorprozessor-pH-Meter, Multi-Calimatic)

eingesetzt.

223 mg Ethylendiamintetraacetat und 136 mg Octylhydrogensulfat wurden in 1,4 l

bidestilliertem Wasser gelöst. Darauf wurden 42 g Citronensäure-Monohydrat und

126 ml Acetronitril hinzugefügt und es wurde mit bidestilliertem Wasser auf 1,9 l

aufgefüllt. Mit 10 M Natronlauge wurde dann der pH-Wert je nach Temperatur (bei 20

°C z.B. auf pH 2,5) eingestellt, bevor mit weiterem bidestilliertem Wasser auf 2 l

aufgefüllt wurde. Anschließend erfolgte eine Filtration und die Aufbewahrung im

Kühlschrank bis zur Verwendung als mobile Phase (im Höchstfall 7 Tage).

84

Die HPLC-Anlage bestand aus einem OnLine-Entgaser (ERC-3512, ERMA INC.) und

einer Kolbenpumpe (HPLC Pumpe Typ 364.00, Knauer, Berlin). Über eine

Injektionsstelle (Reodyne, Modell 7125) und eine Probenschleife (Reodyne,

Kapazität 290 µl) wurden die Proben mit einer HPLC-Spritze (Microspritze TP5050-

71 50 µl Gesamtvolumen, Unimetrics Corporation, Shorewood, Illinois, USA) in die

Anlage injiziert.

Die Auftrennung der Substanzen erfolgte dann in einem Reversed-Phase-

Säulensystem, bestehend aus einer Vorsäule (Patronensäule B3Y99, 60 x 4 mm,

Knauer, Berlin) und einer Hauptsäule (250 x 4,6 mm, Macherey-Nagel, Düren). Die

Säulen waren gefüllt mit „Nucleosil 120-5 C18“, so dass die Porenweite bei 120

Angström und die Korngröße bei 5 µm lag. Die Detektion wurde mit Hilfe eines

elektrochemischen Detektors (LC4C Amperometric Detector, BAS Inc., West

Lafayette, Indiana, USA) durchgeführt, an dessen Elektroden eine Spannung von +

0,7 Volt anlag. Injektionsstelle, Säulensystem und Detektorzelle waren in einem

Säulenofen (modularer HPLC-Ofen, Knauer, Berlin) gelagert, so dass sie auf 35 °C

erhitzt werden konnten. Für die Aufzeichnungen und Auswertungen wurde ein

computergestützter Integrator (C-R4A Chromatopac, Shimadzu, Düsseldorf)

eingesetzt.

Die Monoaminbestimmungen wurden für die 3 Hirnregionen an verschiedenen Tagen

durchgeführt (Beispielchromatogramm s. Abb. 9). Es wurden zunächst 20 µl der

jeden Tag frisch angesetzten Standardlösung in die HPLC-Anlage eingespritzt, um

mit Hilfe der erhaltenen Peaks die Monoaminkonzentrationen in der Probe

bestimmen zu können. Die Stammlösungen der Standards wurden hergestellt, indem

folgende Substanzmengen mit 10 ml 0,1 M Salzsäure versetzt wurden:

DA 6 mg

Dihydroxyphenylessigsäure 5 mg

Homovanillinsäure 5 mg

Noradrenalin 9 mg

5-Hydroxytryptamin 11 mg

5-Hydroxyindolessigsäure 5 mg

85

Die Lösungen wurden dann einzeln in Eppendorf-Reaktionsgefäßen in 300 µl

Portionen bei –80°C eingefroren. Direkt vor der Analyse wurden sie aufgetaut und es

wurde der Tagesstandard frisch angesetzt, indem je 100 µl der Standardlösungen

zusammengegeben und mit 400 µl 0,2 M Perchlorsäure versetzt wurden. Es folgten

weitere Verdünnungsschritte mit der Perchlorsäure bis 500 pg der Substanzen in 20

µl vorlagen, welche dann in die HPLC-Anlage eingespritzt wurden.

Die Proben wurden der Reihe nach aufgetaut, für 15 Sek. auf einem Rüttler

geschüttelt und anschließend wurden mit einer Mikrospritze (Unimetrics, Shorewood,

Illinois, USA) 40 µl der Probe in die Injektionsstelle eingespritzt. Hiervon gelangten

20 µl in die Injektionsschleife und dann in das Trennsäulensystem. Die Flussrate der

mobilen Phase betrug hierbei 0,8 ml/Min..

Die vom Detektor aufgenommenen Signale wurden an den computergestützten

Integrator übermittelt, wo die quantitative Auswertung der Daten erfolgte. Über die

Retentionszeiten, welche aufgrund von Einzelanalysen der Substanzen bekannt

waren, konnte eine Zuordnung der Peaks zu den einzelnen Substanzen

vorgenommen werden.

Die Konzentrationsberechnungen der Substanzen (Konzentration in ng/g Gewebe) in

der Probe wurden mit Hilfe der Analysen der Standardlösungen (die ja eine bekannte

Konzentration der Monoamine enthielten) nach folgender Formel durchgeführt:

Konz.[ng/g Gewebe] = Fläche Probe x Konz. STD x Uf x 1 Fläche Standard Einwaage

Hierbei ist Konz.STD die Konzentration der Standardlösung von 500 pg/20µl

Injektionsvolumen, Uf ist eine Umrechnungsfaktor, durch den die Einheit pg/20µl

Injektionsvolumen in ng/ml beziehungsweise ng/g Gewebe umgewandelt wurde.

86

Abb. 9: Beispielchromatogramm einer Standardlösung Abkürzungen: NA: Noradrenalin, DOPAC: Dihydroxyphenylessigsäure, DA: Dopamin, 5-HIAA: 5-Hydroxyindolessigsäure, HVA: Homovanillinsäure, 5-HT: 5-Hydroxytryptamin

3.6. Untersuchungen zur Funktion des auditorischen Systems

3.6.1. Auditorisch evozierte Potentiale

Entsprechend früherer Untersuchungen bei der ci2-Mutante (KAISER et al., 2001)

wurden hier die auditorisch evozierten Potentiale von 5 ci3-Tieren und 5 BH.7A-

Kontrollen, sowie 4 Streptomycin-behandelten Tieren (2 Tiere direkt nach

Beendigung der Injektionsbehandlung, 2 Tiere 7 Monate nach der

Injektionsbehandlung) abgeleitet, um eine Aussage über das Hörvermögen zu

erhalten. Nach Narkoseeinleitung wurden die Tiere auf ein Heizkissen in eine Schall-

isolierte Messkammer verbracht. Die Rektaltemperatur der Tiere wurde gemessen

87

und mit Hilfe eines Temperatur-geregelten Heizkissens auf 37°C gehalten. Zur

Überprüfung des physiologischen Status und der Narkosetiefe wurden das

Elektrokardiogramm und Muskelpotentiale abgeleitet. Für die akustischen

Stimulationen und die Aufnahmen der auditorisch evozierten Potentiale wurde

Hardware (System II) und Software (BioSig, SigGen) von Tucker-Davis Technologies

(Gainesville, Florida, USA) eingesetzt. Es wurden reine Töne mit einer Frequenz von

0,5 – 60 kHz und einem Schalldruckpegel von 20 bis 120 dB in 5-dB Schritten mit

einer 10ms-Dauer (2 ms Anstiegs-/Abfall-Zeit) und einer Rate von 4 Hz appliziert. Die

akustischen Stimuli wurden durch einen digitalen Signal-Prozessor generiert, welcher

einen Digital-zu-Analog Wandler (Tucker-Davis Technologies) kontrollierte. Der

Output des Wandlers wurde durch einen Antialiasing-Filter und digitale Abschwächer

geführt, welche mit einem Lautsprecher verbunden waren. Die Lautsprecher waren

mit einem Abstand von 5 oder 10 cm frontal vor dem Tier aufgebaut und ein ¼“ B &

K Mikrophon (Brüel und Kjaer Dänemark, Typ 4135, Spectris) wurde über dem Kopf

des Tieres angebracht, um die Ton-Stimuli aufzunehmen. Der Referenzschalldruck

für alle Messungen betrug 20 µPa. Für binaurale Ableitungen der auditorisch

evozierten Potentiale wurden 4 Insektennadeln aus rostfreiem Stahl mit einem

Durchmesser von 0,5 mm subcutan eingestochen. Die aktiven Aufnahmeelektroden

wurden ca. 5 mm lateral der dorsalen Mittellinie über das Cerebellum verbracht, die

Referenzelektroden wurden nahe der ventralen Anteile der Ohrmuscheln eingesetzt.

Zusätzlich wurde eine Erdungselektrode median im Bereich des Unterkiefers

eingebracht. Die Signale der Elektroden wurden an einen HS4 Vorverstärker

gegeben, digitalisiert und über Glasfaser-Kabel (Tucker-Davis Technologies) optisch

an eine digitale Kontrolleinheit (DB4) geleitet. Die Verstärkung der Kontrolleinheit

wurde auf 700 000 eingestellt und zwischen 0,3 kHz und 3 kHz gefiltert. Die

ausgehenden Signale wurden an einen Analog-zu-Digital Wandler (AD 1; Tucker-

Davis Technologies) gegeben, wobei die „Sampling-Rate“ auf 40 µs gesetzt wurde.

Der Analog-zu-Digital Wandler wurde über Glasfaserkabel durch einen digitalen

Signalprozessor mit Hilfe einer Software auf einem Computer kontrolliert. Jeder

Stimulus wurde 250 mal präsentiert und gemittelt, auf einer Computerfestplatte

gespeichert und dann Off-line auf das Vorhandensein von Peaks analysiert.

88

3.7. Histologische Untersuchung des Innenohres

In Analogie zur ci2-Mutante (KAISER et al., 2001) wurden die Haarzellen des

cochleären und vestibulären Systems der ci3-Mutante und der Streptomycin-

behandelten Tiere histologisch untersucht. Hierfür wurde zunächst eine Perfusion mit

4%iger Paraformaldehyd-Lösung durchgeführt, gefolgt von einer sofortigen

Entnahme der Gehirne und der Bullae mit Cochlea und Vestibularorgan. Die Crista

ampullaris, die Macula utriculi und die Macula sacculi wurden aus dem knöchernen

Labyrinth entnommen, der über der Cochlea liegende Knochen wurde mit Hilfe einer

Zange und einer Skalpellklinge verdünnt. Um eine bessere Penetration des

Einbettungsmediums zu gewährleisten, wurden das knöcherne und membranöse

Labyrinth auf einer Seite der Cochlea vorsichtig geöffnet. Auf diese Präparation

folgten die Entkalzifizierung und die Einbettung in Durcupan (Fluka, Deisenhofen).

Einige Proben wurden vor der Einbettung mit Osmium-Tetroxid fixiert, um eine

bessere Visualisierung zu ermöglichen. Auf einem Leica Mikrotom RM 2065

Supercut mit einem Diamantmesser (Diatome, CH) wurden Semidünnschnitte (3 – 5

µm) angefertigt. Diese wurden auf Objektträger verbracht und mit Toluidinblau

gegengefärbt. Die Schnitte wurden mit einem Zeiss Axiophot Mikroskop im Hellfeld

oder bei Phasenkontrast-Beleuchtung untersucht und mit einer gekühlten

Digitalkamera mit 1315 x 1035 Pixel CCD Chip und einem PC-basierten Software

Paket (SPOT Kamera, Diagnostische Instrumente, MetaMorph, Universal Imaging

Corporation) dokumentiert. Die digitale Prozessierung der aufgenommenen Bilder

beschränkte sich auf eine Schattenkorrektur und eine Kontrastverstärkung, falls

benötigt.

3.8. Statistische Auswertung

Die statistische Auswertung des Datenmaterials erfolgte mit Hilfe der EDV-

Programme INSTAT und SigmaStat. Unterschiede innerhalb der Gruppen wurden

mit dem Wilcoxon-Signed-Rank Test (bei nicht-parametrischen Daten) oder dem

Student`s t-Test (bei parametrischen Daten) berechnet, Unterschiede zwischen den

Gruppen mit dem Mann-Whitney U-Test (bei nicht-parametrischen Daten) oder dem

89

Student`s t-Test (bei parametrischen Daten). Die Auswahl des Tests hing hierbei

davon ab, ob die Daten einer Normalverteilung entsprachen oder nicht. Eine

“Repeated Measures” ANOVA wurde sowohl für die Auswertung der Rotationszahlen

beim Vergleich Dunkelphase, Hellphase, Rotationen unter Stresseinfluß, als auch für

die Evaluation der Zelldichten in den Subregionen der SNC angewandt. Um

Gruppenvergleiche im „Air-Righting Test“ und im „Tail-Hanging Test“ durchzuführen,

wurde mit dem Fisher`s Exact Test gearbeitet. Alle Tests wurden zweiseitig

durchgeführt und ein P-Wert von < 0,05 wurde als signifikant angesehen.

90

4. Ergebnisse

4.1. Verhaltensbeobachtungen

4.1.1. Charakterisierung des Rotationsverhaltens

4.1.1.1. Rotationsverhalten der ci2-Mutante

Insgesamt wurde das Rotationsverhalten von 88 ci2-Ratten (41 Weibchen und 47

Männchen) näher untersucht (s. Tab. 5), wie in Kapitel 3.2.1. beschrieben. Das

Drehverhalten trat in Salven oder „Bursts“ auf, welche normalerweise zwischen 5

Sek. und 10 Sek. andauerten. Diese engen Drehungen traten spontan auf oder

wurden durch Stressfaktoren, wie das Umsetzen in einen leeren Makrolonkäfig oder

die Anwesenheit des Untersuchers ausgelöst. ci2-Ratten drehen über die gesamte

Lebensdauer (die jüngsten Tiere wurden in einem Alter von 3 Wochen untersucht,

die ältesten in einem Alter von 2 Jahren). Die durchschnittliche Rotationszahl aller

Tiere (weiblich und männlich) in den drei aufeinanderfolgenden Tests lag bei 18,8 ±

1,4 Rotationen pro 5 Min.. Dabei zeigten 97 % (85 von 88) der Tiere eine

Seitenpräferenz von mindestens 70%. Diese Seitenpräferenz war bei 80 % der Tiere

bei wiederholten Testungen konstant ausgeprägt. Bei den ebenfalls durchgeführten

Testungen von heterozygoten Geschwistertieren (ci2/+) und Tieren des LEW-

Hintergrundstammes konnten in keinem Fall Rotationen beobachtet werden.

Von 17 (9 Weibchen, 8 Männchen) dieser 88 Tiere wurden im Anschluß

Videoaufnahmen angefertigt (s. Abb. 10 A). Die Auswertung der während der aktiven

Phase (18.00 – 22.00) aufgenommenen Videobänder ergab eine durchschnittliche

Rotationszahl von 397 (mit einer Spanne von 6 – 1614) Rotationen in 4 Std.. Die

Rotationen traten in Phasen (normalerweise mit einer Dauer von 5 Sek. bis 10 Sek.,

in einigen Fällen mit einer Dauer von bis zu 45 Sek.) dann auf, wenn die Tiere aktiv

waren, so z.B. aus der Vorwärtsbewegung heraus. Vor und nach den

Rotationsphasen verhielten sich die Tiere normal. Während der Hellphase zeigten

nur 12 der 17 Tiere Rotationen, mit einer durchschnittlichen Rotationszahl von 55

(mit einer Spanne von 3 – 174) Rotationen in 4 Std.. Auch hier wurden Rotationen

91

nur von Tieren gezeigt, die gerade aktiv waren. Verhielt sich das Tier passiv oder

schlief es, so wurden keine Drehungen ausgeführt.

4 der 17 Ratten wurden nicht von 8.00 – 12.00, sondern von 13.00 – 17.00 oder

14.00 bis 18.00 aufgenommen, um einen eventuellen Einfluß der Tageszeit auf

Frequenz und Intensität des Drehverhaltens erkennen zu können. Hierbei zeigten

sich jedoch keine Änderungen im Drehverhalten im Vergleich mit den am Morgen

aufgenommenen Tieren.

Im Bezug auf die Drehpräferenzen zeigten 11 der aufgenommenen 17 Ratten eine

konstante Drehpräferenz von mindestens 70% (im Mittel 87%) in den drei 5-Min.

Tests.

Tab. 5: Die Tabelle zeigt die folgenden Daten (Mittelwerte ± SEM) für alle 88 (weiblichen und männlichen) ci2-Ratten sowie getrennt für die beiden Geschlechter: 1) die durchschnittliche Anzahl Rotationen in drei aufeinanderfolgenden Tests (d.h. die Anzahl der Rotationen jeder Ratte in den drei Tests wurde gemittelt und für die Kalkulation der Gruppenwerte genutzt); 2) die durchschnittliche Drehpräferenz (in % aller Rotationen) der Ratten in jedem Test (ohne zu beachten, ob eine Ratte in allen Tests zur selben Seite rotierte); 3) die Anzahl der Ratten, die in jedem dieser Tests eine Drehpräferenz von mindestens 70 % zeigte (ohne zu beachten, ob die Ratte ihre Drehpräferenz zwischen den Tests wechselte); 4) die durchschnittliche Drehpräferenz (in % aller Rotationen) der Ratten, die in allen drei Tests die gleiche Drehrichtung zeigten; 5) die Anzahl Ratten, die in allen drei Tests eine Drehpräferenz von mindestens 70 % zeigten; 6) die Anzahl Ratten, die in allen drei Tests entweder zur linken oder zur rechten Seite hin drehten (zu mindestens 70%).

Richtung der

Präferenz

(Anzahl

Ratten)

Tiergruppe N Durchschnittliche

Anzahl Rotationen in

drei

aufeinanderfolgenden

5-Min Tests

Durchschnittliche

Drehpräferenz in

jedem Test (%)

Anzahl Ratten

mit einer

Drehpräferenz

von

mindestens

70 %

Durchschnittliche

konstante

Drehpräferenz in drei


5-Min Tests (%)

Anzahl Ratten

mit gleicher

Drehpräferenz

von

mindestens

70 %

Links Rechts

Alle ci2-

Ratten

88 18,8 ± 1,4 89,2 ± 1,1 85/88 (97%) 80,2 ± 1,7 70/88 (80%) 43 27

Weibchen

41 23,2 ± 2,2 87,0 ± 1,9 39/41 (95%) 77,4 ± 2.7 34/41 (83%) 25 9

Männchen

47 14.9 ± 1,6 91,1 ± 1,3 46/47 (98%) 82,7 ± 2,2 36/47 (77%) 18 18

92

A B

Abb. 10: Intensität des Drehverhaltens der ci2-Mutante während der Dunkelphase im Vergleich mit der Hellphase. Um das Circling-Verhalten in Abwesenheit von Stress zu charakterisieren, wurden 17 ci2-Ratten, in Abwesenheit eines Untersuchers oder anderer Stresseinflüsse, über 4 Std. in der Dunkel- und in der Hellphase in ihrem Heimkäfig videobeobachtet. Die Anzahl der Rotationen in dieser Zeit wurde anschließend anhand der Videoaufnahmen bestimmt. Die Daten sind hier in Graphik A als durchschnittliche Anzahl Rotationen (± SEM) während der jeweiligen 4 Std. aufgetragen. Der signifikante Unterschied zwischen der Rotationszahl während der Dunkel- und derjenigen während der Hellphase ist durch einen Stern angezeigt (P = 0,0017). Für die Charakterisierung des Drehverhaltens unter Stresseinfluß wurden die selben 17 Tiere während der Hellphase in neue, leere Makrolonkäfige transferiert und es wurden über 5 Min. die Rotationen ausgezählt . Diese 5-Min. Tests wurden dreimal durchgeführt und die Rotationen in diesen 15 Min. wurden aufaddiert. Der Mittelwert, zusammen mit dem SEM, für diese Tests ist in Graphik B dargestellt. Für einen Vergleich wurden die Rotationen in den jeweils ersten 15 Min. der Videoaufzeichnungen von Dunkel- und Hellphase mit aufgetragen. Der Datenvergleich mittels ANOVA zeigte einen hochsignifikanten Unterschied zwischen den drei in (B) gezeigten Datensätzen (P = 0,0001). Die Post hoc Analyse zeigte, dass sowohl die Daten der Dunkelphase (P = 0,000122), als auch die Daten im neuen Käfig (P = 0,000153) sich signifikant von den Daten in der Hellphase unterschieden. Bei einem Vergleich der Drehpräferenzen zwischen den 5-Min. Tests und den

Videoaufnahmen (s. Abb. 10 B) zeigte sich, dass 4 von 11 Ratten, welche unter dem

Stresseinfluß eines neuen Käfigs in den drei 5-Min. Tests eine konstante

Drehpräferenz aufwiesen, diese bei Aufnahme der Videos im Heimkäfig zur

Gegenseite änderten.

Auf Videoaufnahmen von heterozygoten ci2/+- und LEW-Tieren konnten in keinem

Fall Drehungen beobachtet werden.

Anz

ahl d

er R

otat

ione

n in

4 S

tund

en

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

Dunkelphase Hellphase

* Anz

ahl R

otat

ione

n in

15

Min

uten

0

10

20

30

40

50

60

70

Dunkelphase Hellphase Neuer Käfig

*

*

93

4.1.1.2. Rotationsverhalten der ci3-Mutante

Insgesamt wurde das Rotationsverhalten von 38 ci3-Ratten (s. Tab. 6) (22 Weibchen

und 16 Männchen) näher untersucht. Auch bei dieser Mutante traten enge

Drehungen in Salven oder „Bursts“ auf (auch bei diesen Tieren mit einer Dauer von 5

bis 10 Sek.), spontan oder ausgelöst durch Stress (neue Umgebung oder akustische

Stimuli als Stressfaktoren). Und auch bei dieser Mutante persistierte das

Drehverhalten lebenslang (die jüngsten untersuchten Tiere waren 3 Wochen alt, die

ältesten untersuchten Tiere 2,5 Jahre). Die durchschnittliche Rotationszahl aller Tiere

(weiblich und männlich) in den drei aufeinanderfolgenden Tests lag bei 24 ± 2,6

Rotationen pro 5 Min. und 95 % (36 von 38) der Tiere zeigten beim Drehen eine

Präferenz von mindestens 70%. Diese Seitenpräferenz war bei fast 70 % der Tiere

über drei 5-Min. Tests konstant. Bei den Testungen von Tieren des BH.7A-

Hintergrundstammes konnten auch hier in keinem Fall Rotationen beobachtet

werden.

Bei den ci3-Tieren wurden von 14 Tieren (10 Weibchen, 4 Männchen) Videobänder

aufgenommen (s. Abb. 11 A). Die Auswertung der während der aktiven Phase (18.00

– 22.00) aufgenommenen Videobänder ergab hier eine durchschnittliche

Rotationszahl von 189 (mit einer Spanne von 7 – 561) Rotationen in 4 Std.. Die

Rotationen traten auch bei dieser Mutante in den aktiven Phasen auf, mit normalem

Verhalten vor und nach den Rotationsphasen.

Auf den während der Hellphase aufgezeichneten Videos konnte nur bei 10 von 14

Tieren Rotationsverhalten beobachtet werden. Hier lag die durchschnittliche

Rotationszahl bei 44 (Spanne von 4 – 208) Rotationen in 4 Std..

Wie in Abb. 11 A dargestellt, zeigen die Tiere während der aktiven Dunkelphase

signifikant mehr Rotationen als in der Hellphase, also in ihrer Ruhephase. Die

Rotationszahlen können jedoch auch in der Hellphase stark erhöht werden, wenn

man die Tiere stresst. Dies zeigt der Vergleich der Rotationszahlen der jeweils ersten

15 Min. der Videobänder mit den Rotationszahlen in 15 Min. unter Stresseinfluss

(Auswertung der drei 5-Min. Tests) (Abb. 11 B).

Was die Drehpräferenzen betrifft, so zeigten 10 der aufgenommenen 14 Ratten in

den drei 5-Min. Tests eine konstante Seitenpräferenz von mindestens 70% (im Mittel

94

84%). Drei dieser 10 Tiere änderten ihre Drehpräferenz, wenn sie des Nachts

drehten, also in Abwesenheit von Stress.

Die durchschnittliche Präferenz der nächtlichen Rotationen aller 14 Ratten lag bei

76%.

Tab. 6: Die Tabelle zeigt die Rotationsdaten (Mittelwerte ± SEM) aus drei 5-Min. Tests für alle 38 (weiblichen und männlichen) ci3-Ratten sowie getrennt für die beiden Geschlechter. Weitere Erläuterungen s. Tab. 5.

Richtung der

Präferenz

(Anzahl

Ratten)



drei


5-Min Tests

Durchschnittliche

Drehpräferenz in

jedem Test (%)

Anzahl Ratten

mit einer

Drehpräferenz

von

mindestens

70 %

Durchschnittliche

konstante



5-Min Tests (%)

Anzahl Ratten

mit gleicher

Drehpräferenz

von

mindestens

70 %

Links Rechts

Alle ci3-

Ratten

38 24,7 ± 2,6 86,8 ± 1,6 36/38 (95%) 77,3 ± 2,6 26/38 (68%) 16 10

Weibchen

22 25,7 ± 3,8 87,2 ± 1,8 21/22 (95%) 78,5 ± 3,0 17/22 (77%) 11 6

Männchen

16 23,5 ± 3,3 86,2 ± 2.9 15/16 (94%) 75,6 ± 4,7 9/16 (56%) 5 4

95

A B

Abb. 11 Intensität des Drehverhaltens der ci3-Mutante während der Dunkelphase im Vergleich mit der Hellphase. Um das Circling-Verhalten in Abwesenheit von Stress zu charakterisieren, wurden 14 ci3-Ratten, in Abwesenheit eines Untersuchers oder anderer Stresseinflüsse, über 4 Std. in der Dunkel- und in der Hellphase in ihrem Heimkäfig videobeobachtet. Die Anzahl der Rotationen in dieser Zeit wurde anschließend anhand der Videoaufnahmen bestimmt. Die Daten sind hier in Graphik A als durchschnittliche Anzahl Rotationen (± SEM) während der jeweiligen 4 Std. aufgetragen. Der signifikante Unterschied zwischen der Rotationszahl während der Dunkel- und derjenigen während der Hellphase wird durch den Stern angezeigt (P = 0,0071). Für die Charakterisierung des Drehverhaltens unter Stresseinfluß wurden die selben 14 Tiere während der Hellphase in neue, leere Makrolonkäfige transferiert und es wurden über 5 Min. die Rotationen ausgezählt . Diese 5-Min. Tests wurden dreimal durchgeführt und die Rotationen in diesen 15 Min. wurden aufaddiert. Der Mittelwert, zusammen mit dem SEM, für diese Tests ist in Graphik B dargestellt. Für einen Vergleich wurden die Rotationen in den jeweils ersten 15 Min. der Videoaufzeichungen von Dunkel- und Hellphase mit aufgetragen. Der Datenvergleich mittels ANOVA zeigte einen hochsignifikanten Unterschied zwischen den drei in (B) gezeigten Datensätzen (P = 0,0001). Die Post hoc Analyse zeigte, dass sowohl die Daten der Dunkelphase (P = 0,0032), als auch die Daten im neuen Käfig (P < 0,0001), sich signifikant von den Daten in der Hellphase unterschieden. Darüber hinaus gab es auch zwischen den Daten im neuen Käfig und den Daten der Dunkelphase einen signifikanten Unterschied (P < 0,0001). 4.1.1.3. Rotationsverhalten der Streptomycin-behandelten Tiere

Alle Streptomycin-behandelten Tiere wurden, wie die ci2- und ci3-Mutante, auf ihre

Rotationszahlen hin und auf das Vorhandensein einer Drehpräferenz in drei 5-Min.

Tests (bei täglicher Testung der Tiere) untersucht, die sich direkt an die letzte

Anz

ahl d

er R

otat

ione

n in

4 S

tund

en

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

Dunkelphase Hellphase

*

Anz

ahl R

otat

ione

n in

15

Min

uten

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Dunkelphase Hellphase Neuer Käfig

*

*

96

Streptomycin-Injektion anschlossen (s. Tab. 7). Des weiteren wurde das

Drehverhalten in unterschiedlichen zeitlichen Abständen zur Injektion des

Streptomycins in 5-Min. Tests untersucht, um eventuelle Veränderungen mit

zunehmendem Abstand zur Injektion dokumentieren zu können (s. Abb. 12).

Das Rotationsverhalten dieser Tiere ähnelte stark dem Rotationsverhalten der

beiden Mutanten. Die Ratten zeigten ebenfalls enge Drehungen, die oftmals in

Salven ausgeführt wurden. Die durchschnittliche Rotationszahl lag bei 15,6 ± 1,55

Rotationen in den 5-Min. Tests. Dabei zeigten 90% (18 von 20) der Tiere eine

mindestens 70%ige Drehpräferenz, die bei der Hälfte der Tiere über die drei 5-Min.

Tests konstant war. Das Drehverhalten der Streptomycin-behandelten Ratten war

allerdings nur transient ausgeprägt: 4 Monate nach der letzten Streptomycin-Injektion

zeigte keines der Tiere mehr Rotationen. Kurz bevor die Tiere ihr Drehverhalten

einstellten wurden nur noch einzelne Drehungen gezeigt (s. Abb. 12).

Tab. 7: Die Tabelle zeigt die Rotationsdaten (Mittelwerte ± SEM) aus drei 5-Min. Tests für alle 20 (weiblichen und männlichen) Streptomycin-behandelten Ratten, sowie getrennt für die beiden Geschlechter. Weitere Erläuterungen s. Tab. 5.

Richtung der

Präferenz

(Anzahl

Ratten)



drei


5-Min Tests

Durchschnittliche

Drehpräferenz in

jedem Test (%)

Anzahl Ratten

mit einer

Drehpräferenz

von

mindestens

70 %

Durchschnittliche

konstante



5-Min Tests (%)

Anzahl Ratten

mit gleicher

Drehpräferenz

von

mindestens

70 %

Links Rechts

Alle

Streptomycin-

behandelten

Ratten

20 15,6 ± 1,55 84,0 ± 2,24 18/20 (90%) 73,0 ± 2,72 10/20 (50%) 11

9

Weibchen

10 15,0 ± 1,99 80,4 ± 3,66 10/10 (100%) 70,3 ± 4,64 3/10 (30%) 6 4

Männchen

10 16,3 ± 2,47

87,6 ± 2,24 8/10 (80%) 75,8 ± 2,83 7/10 (70%) 5 5

97

Abb. 12: Anzahl Rotationen in 5 Min. bei 13 Streptomycin-behandelten LEW-Ratten in unterschiedlichen zeitlichen Abständen zur letzten Streptomycin-Injektion. Gezeigt werden die Mittelwerte ± SEM der Rotationszahlen in Bezug auf den Testzeitpunkt. Die letzten Injektionen wurden vorgenommen am 22. Postnataltag (PND). Der Kreis zeigt die signifikante Abnahme der Rotationszahlen zwischen PND 23 und PND 32 an (P = 0,0398). Der Stern zeigt die signifikante Abnahme der Rotationszahlen zwischen PND 32 und PND 60 (P = 0,000244). An PND 90 (nicht mehr dargestellt) wurde von keinem Tier mehr Rotationsverhalten gezeigt.

Zeitpunkt der Rotationstestung

Anz

ahl R

otat

ione

n in

5 M

in.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

PND 23 PND 32 PND 60

*

0

98

4.1.2. Vergleich weiterer motorischer Anomalien zwischen ci2-, ci3- Mutante

und Streptomycin-behandelten Ratten

Tab. 8: Vorhandensein und Ausprägung der Parameter Hyperlokomotion, Opisthotonus und Ataxie bei ci2-, ci3- und Streptomycin-behandelten Tieren. Hyperlokomotion und Opsthotonus der Streptomycin-behandelten Tiere waren nur transient (über einen Zeitraum von einigen Monaten nach Beendigung der Injektionsbehandlung) ausgeprägt und entwickelten sich danach wieder zurück. Tiergruppe Parameter

ci2 ci3 Streptomycin-

behandelte Tiere

Hyperlokomotion

+ Starke

Vorwärtslokomotion, die

fast permanent während

der Bewegung gezeigt

wird. Teilweise geht die

Hyperlokomotion in

Rotationssalven über.

+ Phasenweise starke

Hyperlokomotion,

dazwischen wieder

normale, ruhige

Bewegung. Teilweise

geht die

Hyperlokomotion in


+ (transient)

Fast permanent während

der Bewegung. Teilweise

geht die

Hyperlokomotion in


Opisthotonus

+ Nach langen Phasen

normalen Verhaltens

kurzzeitiges

Überstrecken des

Kopfes nach caudo-

dorsal (1 – 2 Sek.)

- + (transient)

Ausprägung ähnlich wie

bei der ci2-Mutante,

teilweise länger

anhaltend (bis zu 3 – 4

Sek.)

Ataxie

+ Als leichtes Schwanken

von einer Seite zur

anderen permanent

vorhanden

- -

99

A B

Abb. 13 A: Vergleich des Ausmaßes der Hyperlokomotion zwischen ci2-Mutante, ci3-Mutante und Streptomycin-behandelten Tieren. Die Hyperlokomotion wurde im Rahmen der 5-Min. Rotations-Tests mit erfasst und nach dem Score- System von TRICKLEBANK et al. (1984) beurteilt. Dargestellt sind die Mittelwerte und SEM von jeweils 20 Tieren. Die Sterne zeigen einen signifikanten Unterschied in der Stärke der Hyperlokomotion, der bei P = 0,0235 zwischen ci2- und ci3-Mutante, und bei P < 0,0001 zwischen ci3-Mutante und Streptomycin-behandelten Tieren lag. Abb. 13 B: Vergleich des Ausmaßes des Opisthotonus zwischen der ci2-Mutante und den Streptomycin-behandelten Tieren (von der ci3-Mutante wurde kein Opisthotonus gezeigt). Die Art der Auswertung entspricht der Auswertung der Hyperlokomotion. Dargestellt sind wiederum die Mittelwerte und SEM von 20 Tieren je Gruppe. Der Stern gibt einen signifikanten Unterschied in der Stärke des Opisthotonus von P < 0,0001 an.

Die Stärke der Ausprägung von Hyperlokomotion, Opisthotonus und Ataxie bei den

verschiedenen Tiergruppen wurde mit Hilfe des Score-Systems von TRICKLEBANK et

al. (1984) semiquantitativ evaluiert. Alle ci2-Tiere zeigten, im Gegensatz zu den ci3-

Tieren und allen Kontrolltieren, Ataxie und Opisthotonus (s. Tab. 8). Die Ataxie

machte sich als Schwanken von einer Seite zur anderen bemerkbar. Der

Opisthotonus wurde nach langen Phasen normalen Verhaltens als plötzliches, 1 – 2

Sek. andauerndes Überstrecken des Kopfes nach caudo-dorsal sichtbar, wobei die

Tiere im normalen Bewegungsablauf inne hielten. Während des Drehverhaltens

wurde kein Opisthotonuns gezeigt. Darüber hinaus wurde eine stark erhöhte

Lokomotion der ci2-Mutante und eine leicht verstärkte Lokomotion der ci3-Mutante

Hyp

erlo

kom

otio

n (S

core

)

0

1

2

ci2-Mutanteci3-MutanteStreptomycin-behandelte Tiere

*

*

Opi

stho

tonu

s (S

core

)

0

1

2

3ci2-MutanteStreptomycin-behandelte Tiere

*

100

gegenüber den Kontrolltieren festgestellt (Hyperlokomotion war bei allen

Kontrolltieren abwesend). Der Vergleich der Hyperlokomotion zwischen ci2-Mutante

und ci3-Mutante zeigte, dass bei ci2-Tieren die Hyperlokomotion signifikant stärker

ausgeprägt ist (P = 0,0235). (s. Abb. 13 A). Die Streptomycin-behandelten Tiere und

die ci2-Tiere waren sich in ihrem Phänotyp sehr ähnlich, Hyperlokomotion und

Opisthotonus wurden von beiden Tiergruppen gezeigt. Beide Parameter waren bei

den Streptomycin-behandelten Tieren sogar signifikant stärker ausgeprägt als bei

den ci2-Tieren (s. Abb. 13 A, B). Für die Hyperlokomotion lag der Unterschied bei P

= 0,180, für den Opisthotonus bei P < 0,0001. Die Hyperlokomotion der

Streptomycin-behandelten Tiere ging jedoch, zusammen mit dem Drehverhalten,

einige Monate nach Beendigung der Streptomycin-Behandlung wieder zurück.

4.1.3. Untersuchungen zur Funktion des vestibulären Systems

4.1.3.1. Schwimmtest

Dieser Test wurde mit einer großen Anzahl an Tieren verschiedener Altersstufen

durchgeführt, um die Funktion des vestibulären Systems zu überprüfen. Die

Ergebnisse sind in Tab. 9 aufgeführt. Alle ci3-Tiere, alle heterozygoten

Geschwistertiere (ci2/+) zur ci2-Mutante, sowie alle Tiere der Hintergrundstämme

konnten ohne Einschränkungen schwimmen. Die ci3-Mutante zeigte allerdings auch

im Wasser Rotationssalven und schwamm während einer solchen Salve in engen

Kreisen. Die ci2-Tiere waren ohne Ausnahme unfähig zu schwimmen. Sie verloren

sofort nach Verbringung in das Wasserbecken die Orientierung und gingen

korkenzieher- oder schraubenförmig unter. Diese Tiere mussten sofort aus dem

Wasser genommen werden.

101

Tab. 9: Ergebnisse des Schwimmtests. Dargestellt ist die Anzahl der insgesamt getesteten Tiere, die Anzahl der Tiere, die nicht schwimmen konnten und die Anzahl der Tiere, die schwimmen konnten in Abhängigkeit von der getesteten Tiergruppe, sowie das Alter des jüngsten getesteten und des ältesten getesteten Tieres der jeweiligen Gruppen.

Tiergruppe Anzahl

getesteter

Tiere

Anzahl

Tiere, die

nicht

schwimmen

konnten

Anzahl

Tiere, die

schwimmen

konnten

Alter

jüngstes

getestetes

Tier (in

Monaten)

Alter

ältestes

getestetes

Tier (in

Monaten)

ci2/ci2 58 58 --- 2 24

ci2/+ 26 --- 26 2 24

LEW 22 --- 22 2 13

ci3/ci3 21 --- 21 4 14

BH.7A 16 --- 16 2 11

Bei den Streptomycin-behandelten Tieren wurde der Schwimmtest in verschiedenen

Zeitabständen zur letzten Streptomycin-Injektion durchgeführt, um eventuelle

Veränderungen im Schwimmverhalten in ihrem zeitlichen Verlauf beurteilen zu

können. Direkt nach Beendigung der Injektionsbehandlung wurde in Stichproben

festgestellt, dass das Schwimmvermögen der Tiere massiv gestört war (nicht

dargestellt). Ab der 6. Woche nach Streptomycin-Behandlung wurden dann

regelmäßige Testungen durchgeführt (s. Tab. 10 + 11 und Abb. 14). Ca. 7 Monate

nach der letzten Streptomycin-Injektion hatte sich das Schwimmvermögen aller Tiere

soweit gebessert, dass sie in den 5 Min. des Tests nicht aus dem Wasser

entnommen werden mussten, wie aus den Tab. 10 + 11 und Abb. 14 deutlich wird.

102

Tab. 10: Schwimmtest über 5 Min. bei Streptomycin-behandelten Tieren. Hier angegeben ist der Zeitpunkt der Entnahme der Tiere aus dem Wasser in Min. an den angegebenen Testtagen. Die Tiere wurden vor Ablauf der 5 Min. aus dem Becken entnommen, wenn bei korkenzieherförmigem Abtauchen ein Ertrinken verhindert werden musste.

Zeitpunkt

Tier

6 Wochen

nach

Streptomycin-

Behandlung

9 Wochen

nach

Streptomycin-

Behandlung

11 Wochen

nach

Streptomycin-

Behandlung

15 Wochen

nach

Streptomycin-

Behandlung

20 Wochen

nach

Streptomycin-

Behandlung

28 Wochen

nach

Streptomycin-

Behandlung

19/1 M 5 3 2 2,30 5 5

19/3 M 1,30 3 3 2,30 5 5

19/8 F 5 5 5 5 5 ---

19/9 F 5 5 5 5 5 5

20/1 M 2 1,30 4 5 5 5

20/2 M 4,45 5 5 5 5 5

20/3 M 1 4,30 2,30 5 5 5

20/4 M 2,15 3,30 2,30 5 5 5

20/5 M 5 1,50 5 5 5 ---

20/6 F 5 2,45 2,15 1,40 4,30 5

20/7 F 5 5 2,20 5 5 5

20/8 F 0,30 0,25 0,40 1,30 5 5

20/9 F 1 1,20 1,50 1 5 5

20/10 F 1,30 3,15 2,15 5 0,45 5

20/11 F 1,40 4,30 2,15 0,10 2,30 5

103

Tab. 11: Schwimmtest über 5 Min. bei Streptomycin-behandelten Tieren. Hier angegeben sind Mittelwerte ± SEM des Zeitpunkts der Entnahme der Tiere aus dem Wasser an den angegebenen Testtagen. Die Pluszeichen zeigen einen signifikanten Unterschied zwischen dem Testergebnis nach 20 Wochen und den angegebenen Testzeitpunkten an, die Sterne stehen für einen signifikanten Unterschied zwischen dem Testergebnis nach 28 Wochen und den angegebenen Testzeitpunkten (P < 0,05).

Zeitpunkt

6 Wochen

nach

Streptomycin-

Behandlung

9 Wochen

nach

Streptomycin-

Behandlung

11 Wochen

nach

Streptomycin-

Behandlung

15 Wochen

nach

Streptomycin-

Behandlung

20 Wochen

nach

Streptomycin-

Behandlung

28 Wochen

nach

Streptomycin-

Behandlung

Mittelwerte

± SEM

2,68 ±

0,52

+ *

3,20 ±

0,42

*

2,63 ±

0,37

+ *

3,34 ±

0,54

*

4,39 ±

0,39

5,00 ±

0,00

Abb. 14: Schwimmtest zur Überprüfung des Schwimmvermögens der Streptomycin-behandelten Tiere in verschiedenen Abständen zur Behandlung mit Streptomycin. Dargestellt sind die Mittelwerte und SEM der Schwimmdauer in Min. (Entnahme der Tiere aus dem Becken nach 5 Min.) zu den angegebenen Testzeitpunkten. Ein Stern zeigt ein Signifikanzniveau von P < 0,05 an.

Abstand zur Streptomycin-Behandlung in Wochen

Dau

er d

es S

chw

imm

ens

in M

inut

en

0

1

2

3

4

5

6

6 15 28

*

*

104

4.1.3.2. „Air-Righting Test“

Dieser Test wurde dreimal hintereinander durchgeführt. Nur ein Defizit in allen drei

Testungen wurde als Hinweis auf ein Defizit des vestibulären Systems gedeutet.

Die Ergebnisse für die ci2-Mutante und die Kontrollgruppe von ci2/+-Tieren und

LEW-Tieren sahen wie folgt aus: bei den ci2-Tieren stand die Anzahl der Tiere mit

Defiziten im „Air-Righting“ in den drei Tests zur Anzahl der getesteten Tiere im

Verhältnis 20/23, 15/23 und 17/23. 13 Tiere zeigten in allen drei Testungen Defizite.

Im Gegensatz hierzu zeigten alle 17 Kontrolltiere in den drei Tests normale

Stellreflexe. Der Unterschied zwischen ci2-Mutante und Kontrollen wurde signifikant

bei einem Signifikanzniveau von P = 0,0003.

Bei den ci3- und BH.7A-Tieren wurden hier, im Gegensatz zum Schwimmtest

Unterschiede zwischen der Mutante und den Kontrollen deutlich. Alle Kontrollen

zeigten in den drei aufeinanderfolgenden Tests einen normalen Stellreflex und

landeten auf den Gliedmaßen. Bei den ci3-Tieren waren die Zahlen für die drei Tests

folgendermaßen (Anzahl der Tiere mit defizitärem Stellreflex / Anzahl der getesteten

Tiere): 4/19, 9/19 und 11/19. 6 Tiere zeigten hierbei keine normale Landung

(landeten auf der Seite oder auf dem Rücken) in zwei der drei Tests, eine ci3 war

sogar in allen drei Tests nicht in der Lage, normal zu landen. Da jedoch nur ein

Defizit in allen drei Tests als Hinweis auf vestibuläre Defizite angesehen wurde,

wurde der Unterschied zwischen ci3-Mutante und Kontrolle nicht signifikant.

4.1.3.3. „Tail-Hanging Test“

Auch dieser Test wurde dreimal hintereinander durchgeführt und nur bei

abweichenden Ergebnissen in allen drei Testungen wurde von einem vestibulären

Defizit ausgegangen.

Von den 17 Kontrollratten zeigt keines ein abnormes Hochdrehen. Bei den 23 ci2-

Tieren ergaben sich folgende Zahlen (abnormes Hochdrehen zu normalem

Ausstrecken der Gliedmaßen zum Boden hin): 13/23, 17/23 und 20/23. Insgesamt

zeigten 13 der 23 Tiere ein Defizit in allen Testungen, was zu einem signifikanten

Unterschied gegenüber den Kontrollen führte (P = 0,0001).

105

Für die BH.7A-Tiere stand die Anzahl der Tiere mit abnormem Verhalten zur Anzahl

der getesteten Tiere in den drei Tests in folgendem Verhältnis: 0/19, 1/19 und 2/19.

Für die ci3-Tiere waren die Zahlen wie folgt: 5/19, 8/19 und 12/19. Bei der ci3-

Mutante wurde hierbei statt des normalen Verhaltens in diesem Test ein Hochdrehen

zu einer Seite gezeigt. Fünf der ci3-Tiere zeigten dieses Hochdrehen in allen drei

Tests, wohingegen keine Kontrollratte in allen drei Tests vom normalen Verhalten

abwich. Der Unterschied zwischen Mutante und Kontrolle wurde hier signifikant bei

einem Signifikanzniveau von P = 0,0463.

4.1.4. Pharmakologische Untersuchungen

Pharmakologische Manipulationen des DA-Systems erfolgten durch systemische

(i.p.) Applikation der Substanzen D-Amphetamin, MK-801, Haloperidol und

Racloprid. Die Versuche wurden durchgeführt wie in Kapitel 3.2.3. beschrieben.

4.1.4.1. Wirkungen von DA-Rezeptor-Antagonisten bei der ci2-Mutante und der ci3-Mutante

In Anlehnung an die pharmakologischen Untersuchungen zur „Stargazer“-

Rattenmutante wurden ci2- und ci3-Tieren, sowie den entsprechenden Kontrollen

DA-Rezeptorantagonisten verabreicht. Die durch diese Substanzen ausgelöste

Katalepsie gibt Hinweise auf die nigro-striatale DA-Aktivität. Als Substanz, die sowohl

antagonistisch auf D1- als auch auf D2-Rezeptoren wirkt, wurde Haloperidol

eingesetzt. Dieses wurde 10 ci2/ci2-Tieren und 10 ci2/+-Tieren in einer Dosis von 0,1

mg/kg KGW appliziert. Für die untersuchten 8 ci3-Tiere und 10 BH.7A-Tiere wurde

die Dosis auf 0,2 mg/kg KGW erhöht, weil diese Tiergruppen auf die niedrigere Dosis

von 0,1 mg/kg keine Reaktion zeigten. Es wurde, wie bereits in Kapitel 3.2.4.

erläutert, ein Beobachtungszeitraum von 4 Std. gewählt. Zusätzlich wurde mit den

Tieren der „Standard Bar-Test“ durchgeführt, um auf das Vorliegen von Katalepsie zu

testen.

In Bezug auf die Katalepsie zeigte sich, dass es zu einer signifikant schwächeren

Ausprägung von Katalepsie bei den ci2-Tieren im Gegensatz zu den Kontrolltieren

106

kommt (s. Abb. 15). Zwischen ci3-Tieren und BH.7A-Kontrollen ließen sich in der

Ausprägung der Katalepsie keine signifikanten Unterschiede feststellen (Abb. 18).

In Bezug auf das Rotationsverhalten der beiden Mutanten lässt sich mit

zunehmender Katalepsie eine Abnahme der Rotationszahlen feststellen, bis diese

völlig zum Erliegen kommen (s. Abb. 16, 17, 19 und 20). Von Kontrolltieren wurden

keine Rotationen gezeigt.

Abb. 15: „Standard Bar-Test“ auf das Vorliegen von Katalepsie bei 10 ci2/ci2-Tieren und 10 ci2/+-Kontrollen nach Applikation von Haloperidol (0,1 mg/kg i.p.). Gezeigt sind Mittelwerte und SEM der Sek. bis zum Abstieg. Die Tiere wurden hierzu mit den Vorderpfoten auf einen 9,5 cm hohen Aluminiumblock gesetzt und die Zeit bis zum Abstieg wurde gestoppt. Nach Erreichen von 120 Sek. ohne ein Absteigen des Tieres wurde dieses durch externes Eingreifen vom Block entfernt. Ein Stern zeigt hier ein Signifikanzniveau von P < 0,05, zwei Sterne von P < 0,01 an.

Zeitabschnitte vor und nach Applikation von Haloperidol (Applikation zum Zeitpunkt 0)

Sek

unde

n bi

s zu

m A

bstie

g

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 15 30 45 60 75 90 105 120 150 180 210 240

*

**

***

** **

**

ci2-Tiere unter Haloperidol

Kontrollen unter Haloperidol

107

Abb. 16: Verlauf des Rotationsverhaltens von 10 ci2/ci2-Tieren nach Applikation von Haloperidol (0,1 mg/kg KGW) und Vehikel (2 ml/kg KGW i.p.). Dargestellt sind Mittelwerte und SEM der Rotationsanzahl in den jeweiligen Beobachtungszeiträumen (zu Beginn wurde die Anzahl Rotationen in 15 Min. ausgezählt, ab der 120. Min. die Anzahl in 30 Min.). Mit Zunahme der Katalepsie (s. Abb. 15) zeigt sich eine Abnahme der Rotationszahlen, die jedoch gegenüber den Rotationszahlen unter Vehikeleinfluß nicht signifikant wird.

Abb. 17: Gesamtzahl der Rotationen in 240 Min. von 10 ci2/ci2-Tieren unter Haloperidol und Vehikel. Dargestellt sind die Mittelwerte und SEM der Rotationszahlen über den gesamten Beobachtungszeitraum. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in den Rotationszahlen deutlich.


Anz

ahl d

er R

otat

ione

n

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 15 30 45 60 75 90 105 120 150 180 210 240


ci2-Tiere unter Vehikel

Ges

amtz

ahl R

otat

ione

n in

240

Min

uten

0

5

10

15

20

25

30

35

40

ci2-Tiere unter Haloperidolci2-Tiere unter Vehikel

108

Abb. 18: „Standard Bar Test“ auf das Vorliegen von Katalepsie bei 8 ci3-Tieren und 10 BH.7A-Kontrollen nach Applikation von Haloperidol (0,2 mg/kg i.p.). Gezeigt sind Mittelwerte und SEM der Sek. bis zum Abstieg. Die Tiere wurden hierzu mit den Vorderpfoten auf einen 9,5 cm hohen Aluminiumblock gesetzt und die Zeit bis zum Abstieg wurde gestoppt. Nach Erreichen von 120 Sek. ohne ein Absteigen des Tieres wurde dieses durch externes Eingreifen vom Block entfernt. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen Mutante und Kontrollen.

Abb. 19: Verlauf des Rotationsverhaltens von 8 ci3-Tieren nach Applikation von Haloperidol (0,2 mg/kg KGW) und Vehikel (2 ml/kg KGW i.p.). Dargestellt sind Mittelwerte und SEM der Rotationsanzahl in den jeweiligen, 15 Min. dauernden Beobachtungszeiträumen. Mit Zunahme der Katalepsie (s. Abb. 18) zeigte sich eine Abnahme der Rotationszahlen, die jedoch gegenüber den Rotationszahlen unter Vehikeleinfluß nicht signifikant wurde. Nach 60 Min. wurden in keinem Fall mehr Rotationen gezeigt.


Sek

unde

n bi

s zu

m A

bstie

g

0

5

10

15

20

25

30

35

40


BH.7A-Tiere unter Haloperidol

0 15 30 45 60 75 90 105 120 150 180 210


Anz

ahl d

er R

otat

ione

n

0

1

2

3

4



0 15 30 45 60 75

109

Abb. 20: Gesamtzahl der Rotationen in 210 Min. von 8 ci3-Tieren unter Haloperidol und Vehikel. Dargestellt sind die Mittelwerte und SEM der Rotationszahlen über den gesamten Beobachtungszeitraum. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in den Rotationszahlen deutlich.

Als spezifischer D2-Antagonist wurde bei ci2-Tieren dann das Racloprid eingesetzt,

um eventuelle Unterschiede in der Reaktion von D1- und D2-Rezeptoren feststellen

zu können. Die Dosis, die 10 ci2/ci2-Tiere und 10 ci2/+-Tiere erhielten, lag bei 1

mg/kg i.p.. Es wurde das gleiche Versuchsdesign gewählt, wie bei Verabreichung

des Haloperidols. Erneut bestätigte sich eine erhöhte Empfindlichkeit der Kontrollen

für das Auftreten von Katalepsie (s. Abb. 21). Wiederum wirkte sich Racloprid bei

den Mutanten negativ auf das Drehverhalten aus (s. Abb. 22 + 23).

Der Vergleich der Effekte von Haloperidol und Racloprid machte deutlich, dass der

kataleptische Effekt auf ci2-Tiere und Kontrollen nach Applikation von Racloprid eher

einsetzt und stärker ausgeprägt ist, als nach Applikation von Haloperidol. Des

weiteren wird das Rotationsverhalten der ci2-Mutante von Racloprid stärker und

schneller unterdrückt als von Haloperidol.

Ges

amtz

ahl R

otat

ione

n in

210

Min

uten

0

1

2

3

4

5 ci3-Tiere unter Haloperidolci3-Tiere unter Vehikel

110

Abb. 21: „Standard Bar Test“ auf das Vorliegen von Katalepsie bei 10 ci2/ci2-Tieren und 10 ci2/+-Kontrollen nach Applikation von Racloprid (1 mg/kg i.p.). Gezeigt sind Mittelwerte und SEM der Sek. bis zum Abstieg. Die Tiere wurden hierzu mit den Vorderpfoten auf einen 9,5 cm hohen Aluminiumblock gesetzt und die Zeit bis zum Abstieg wurde gestoppt. Nach Erreichen von 120 Sek. ohne ein Absteigen des Tieres wurde dieses durch externes Eingreifen vom Block entfernt. Ein Stern zeigt hier ein Signifikanzniveau von P < 0,05, zwei Sterne von P < 0,01 und drei Sterne von P < 0,001 an.

Abb. 22: Verlauf des Rotationsverhaltens von 10 ci2/ci2-Tieren nach Applikation von Racloprid (1 mg/kg KGW) und Vehikel (2 ml/kg KGW i.p.). Dargestellt sind Mittelwerte und SEM der Rotationsanzahl in den jeweiligen Beobachtungszeiträumen (zu Beginn wurde die Anzahl Rotationen in 15 Min. ausgezählt, ab der 120. Min. die Anzahl in 30 Min.). Mit Zunahme der Katalepsie (s. Abb. 21) zeigen sich abnehmende Rotationszahlen. Die Sterne zeigen einen signifikanten Unterschied in der Rotationszahl an (P < 0,05).

Zeitabschnitte vor und nach Applikation von Racloprid (Applikation zum Zeitpunkt 0)

Anz

ahl d

er R

otat

ione

n

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 15 30 45 60 75 90 105 120 150 180

*

**

* **

**

ci2-Tiere unter Racloprid


Zeitabschnitte vor und nach Applikation von Racloprid (Applikation zum Zeitpunkt 0)

Sek

unde

n bi

s zu

m A

bstie

g

0

20

40

60

80

100

120

0 15 30 45 60 75 90 105 120 150 180

*

*

**

****

*****

ci2-Tiere unter Racloprid

Kontrollen unter Racloprid

111

Abb. 23: Gesamtzahl der Rotationen in 180 Min. von 10 ci2/ci2-Tieren unter Racloprid und Vehikel. Dargestellt sind die Mittelwerte und SEM der Rotationszahlen über den gesamten Beobachtungszeitraum. Der Stern steht für einen signifikanten Unterschied in der Rotationszahl (P < 0,05).

4.1.4.2. D-Amphetamin-Effekte

D-Amphetamin, dass durch die Freisetzung und Hemmung der Wiederaufnahme von

DA eine Erhöhung der extrazellulären DA-Konzentration hervorruft (ZETTERSTRÖM et

al., 1986; GÖTHERT et al., 1996), wurde bereits bei der ci2-Mutante in einer Dosierung

von 2,5 mg/kg KGW untersucht (LÖSCHER et al., 1996). Daher wurde die Wirkung von

D-Amphetamin im Rahmen dieser Arbeit nun auch bei der ci3-Mutante und den

Streptomycin-behandelten Tieren, sowie entsprechenden Kontrolltieren getestet.

Um zu untersuchen, ob in der Ausprägung von Verhaltenseffekten Unterschiede

zwischen ci3- und Kontrollratten bestehen, erhielt eine Gruppe von 8 ci3-Tieren und

7 BH.7A-Tieren während der Hellphase D-Amphetamin. Im Gegensatz zur

Vehikelkontrolle steigerte die Substanzgabe die Hyperlokomotion der Mutante

signifikant (Abb. 24) und löste verschiedene Stereotypien aus (Schnüffeln, Lecken,

Aufrichten). Eine Erhöhung der Rotationszahlen bei der Mutante konnte jedoch nicht

festgestellt werden.

Auch die Kontrollen zeigten nach Applikation von D-Amphetamin eine

Hyperlokomotion (Abb. 25). Zusätzlich wurden auch hier Schnüffeln, Lecken und

Aufrichten nach Substanzgabe gezeigt.

Ges

amtz

ahl R

otat

ione

n in

180

Min

uten

0

10

20

30

40

50

60

70

ci2-Tiere unter Raclopridci2-Tiere unter Vehikel

*

112

Sowohl bei der Mutante, als auch bei den BH.7A-Kontrollen begann die Wirkung des

D-Amphetamins nach ca. 15 Min. und hielt über den gesamten

Beobachtungszeitraum von 2 Std. an.

10 ci3-Ratten wurde das D-Amphetamin dann kurz vor Beginn der Dunkelphase, also

der Aktivitätsphase, verabreicht, um die Effekte von Amphetamin auf das Circling-

Verhalten anschließend über eine Videoaufzeichnung zu ermitteln. Die Auswertung

der Aufnahmen ergab im Mittel eine Rotationsanzahl von 218 ± 69,0 Rotationen in

den 2 Std. nach Amphetamingabe. Die selben Tiere hatten nach Verabreichung des

Vehikels hingegen nur 71,2 ± 22,5 Rotationen in 2 Std. gezeigt (s. Abb. 26 + 27). D-

Amphetamin bewirkte somit eine signifikante Zunahme der Rotationszahl im

Vergleich zur Vehikelapplikation (P = 0,0273).

Der Vergleich der Drehpräferenzen der Mutanten mit und ohne D-Amphetamin

machte deutlich, dass die meisten Tiere nach Amphetamininjektion dieselbe

Seitenpräferenz beibehielten. Die Rotationen nach Amphetamingabe unterschieden

sich jedoch von den spontanen, engen, in Salven auftretenden Rotationen der Tiere:

sie drehten nach Amphetaminapplikation in weiten Kreisen und zeigten nur vereinzelt

enge Rotationen. Als weitere Stereotypien zeigten sich nach Amphetamingabe

Schnüffeln und Aufrichten.

113

Abb. 24: Hyperlokomotion (Score-System nach TRICKLEBANK, 1984) von 8 ci3-Tieren unter D-Amphetamin (Weibchen 2,5 mg/kg KGW, Männchen 3 mg/kg KGW) und Vehikel (2 ml/kg KGW). Dargestellt sind Mittelwerte und SEM. Signifikante Unterschiede zwischen gezeigter Hyperlokomotion nach Substanz- und Vehikelapplikation sind durch Sterne angezeigt (P < 0,05).

Abb. 25: Hyperlokomotion (Score-System nach TRICKLEBANK, 1984) von 7 BH.7A-Tieren unter D-Amphetamin (Weibchen 2,5 mg/kg KGW, Männchen 3 mg/kg KGW) und Vehikel (2 ml/kg KGW). Dargestellt sind Mittelwerte und SEM. Signifikante Unterschiede zwischen gezeigter Hyperlokomotion nach Substanz- und Vehikelapplikation sind durch Sterne angezeigt (P < 0,05).

Zeitabschnitte vor und nach Applikation von D-Amphetaminsulfat (Applikation zum Zeitpunkt 0)

Hyp

erlo

kom

otio

n (S

core

)

0

1

2

ci3-Tiere unter Amphetamin


0 15 30 45 60 75 90 105 120

* **

*

* **

*

Zeitabschnitte vor und nach Applikation von D-Amphetaminsulfat (Applikation zum Zeitpunkt 0)

Hyp

erlo

kom

otio

n (S

core

)

0

1

2

BH.7A-Tiere unter Amphetamin

BH.7A-Tiere unter Vehikel

*

* ** * *

*

*

0 15 30 45 60 75 90 105 120

114

Abb. 26: Anzahl der von 10 ci3-Mutanten gezeigten Rotationen nach Applikation von D-Amphetamin (Weibchen: 2,5 mg/kg KGW i.p., Männchen: 3 mg/kg KGW i.p.) und Vehikel (2 ml/kg KGW i.p.). Angegeben sind die Mittelwerte und SEM der Rotationszahlen in den 15 Min. dauernden Beobachtungzeiträumen. Der Versuch wurde in der Dunkelphase durchgeführt. Die Sterne zeigen den signifikanten Unterschied in der Rotationszahl zwischen D-Amphetamin- und Vehikelapplikation an (P < 0,05).

Abb. 27: Gesamtzahl der Rotationen in 120 Min. von 10 ci3-Tieren unter D-Amphetamin und Vehikel. Dargestellt sind die Mittelwerte und SEM der Rotationszahlen über den gesamten Beobachtungszeitraum. Der Stern steht für einen signifikanten Unterschied in der Rotationszahl (P < 0,05).

Anz

ahl d

er R

otat

ione

n

0

3

6

9

12

15

18

21

24

27

30

33

36

39

42

45

48

15 30 45 60 75 90 105 120

ci3-Tiere unter Amphetamin


*

*

0

Zeitabschnitte nach Applikation von D-Amphetaminsulfat (Applikation zum Zeitpunkt 0)

Ges

amtz

ahl R

otat

ione

n in

2 S

tund

en

0

50

100

150

200

250

300

ci3-Tiere unter Amphetaminci3-Tiere unter Vehikel

*

115

In einer weiteren Studie wurde 9 Streptomycin-behandelten Tieren, sowie 7 Tieren

des LEW-Hintergrundstammes (als Kontrollen) D-Amphetamin in der oben

angegebenen Dosierung verabreicht, um herauszufinden, ob D-Amphetamin bei den

Streptomycin-behandelten Tieren Drehverhalten auslösen kann. Der Abstand zur

Streptomycin-Injektionsbehandlung betrug ca. 5 Monate, die Tiere zeigten zu diesem

Zeitpunkt keine Spontanrotationen mehr.

In der Post-Applikationsphase konnten bei beiden Tiergruppen Stereotypien

(Hyperlokomotion, Schüffeln, Lecken) beobachtet werden, es wurden jedoch in

keinem Fall Rotationen gezeigt.

4.1.4.3. MK-801-Wirkungen

Als weitere Substanz, welche bereits bei den ci2-Ratten eingesetzt wurde und

welche den DA-Umsatz erhöht (s. Kap. 2.4.4.), wurde der N-Methyl-D-Aspartat-

Antagonist MK-801 an 10 ci3-Tiere und 10 BH.7A-Kontrollen in einer Dosierung von

0,1 mg/kg intraperitoneal verabreicht. Bei der Mutante erfolgte eine signifikante

Steigerung der Rotationszahlen unter MK-801-Einfluß im Vergleich zum Vehikel

(Abb. 28 + 29). Die Kontrolltiere zeigten weder unter MK-801 noch unter Vehikel

Rotationsverhalten. Beide Tiergruppen wurden unter Substanzeinfluß stark

hyperlokomotorisch (Abb. 30 + 31).

116

Abb. 28: Anzahl der von 10 ci3-Tieren gezeigten Rotationen nach Applikation von MK-801 (0,1 mg/kg i.p.) und Vehikel (2 ml/kg i.p.). Angegeben sind die Mittelwerte und SEM der Rotationszahlen in den 15 Min. dauernden Beobachtungszeiträumen. Der Stern zeigt einen signifikanten Unterschied in der Rotationszahl an (P < 0,05).

Abb. 29: Gesamtzahl der Rotationen in 120 Min. von 10 ci3-Tieren unter MK-801 und Vehikel. Dargestellt sind die Mittelwerte und SEM der Rotationszahlen über den gesamten Beobachtungszeitraum. Der Stern steht für einen signifikanten Unterschied in der Rotationszahl (P < 0,05).

Zeitabschnitte vor und nach Applikation von MK-801 (Applikation zum Zeitpunkt 0)

Anz

ahl d

er R

otat

ione

n

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120 ci3-Tiere unter MK-801ci3-Tiere unter Vehikel

0 15 30 45 60 75 90 105 120

*

Ges

amtz

ahl R

otat

ione

n in

2 S

tund

en

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

ci3-Tiere unter MK-801ci3-Tiere unter Vehikel

*

117

Abb. 30: Hyperlokomotion (Score-System nach TRICKLEBANK, 1984) von 10 ci3-Tieren unter MK-801 (0,1 mg/kg KGW) und Vehikel (2 ml/kg KGW). Dargestellt sind Mittelwerte und SEM. Signifikante Unterschiede zwischen gezeigter Hyperlokomotion nach Substanz- und Vehikelapplikation sind durch Sterne angezeigt (P < 0,05).

Abb. 31: Hyperlokomotion (Score-System nach TRICKLEBANK, 1984) von 10 BH.7A-Tieren unter MK-801 (0,1 mg/kg KGW) und Vehikel (2 ml/kg KGW). Dargestellt sind Mittelwerte und SEM. Signifikante Unterschiede zwischen gezeigter Hyperlokomotion nach Substanz- und Vehikelapplikation sind durch Sterne angezeigt (P < 0,05).

Hyp

erlo

kom

otio

n (S

core

)

0

1

2


0 15 30 45 60 75 90 105 120

ci3-Tiere unter MK-801


** *

**

*


Hyp

erlo

kom

otio

n (S

core

)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 15 30 45 60 75 90 105 120

BH.7A-Tiere unter MK-801

BH.7A-Tiere unter Vehikel

* *

*

118

4.2. EEGs

EEGs wurden von 4 ci2/ci2, 4 ci2/+, 2 LEW/Ztm sowie 2 WAG/Rij Ratten abgeleitet

und ausgewertet, wie unter 3.3. beschrieben. Im Zustand aktiven Verhaltens der

Tiere konnten in keiner Tiergruppe Abnormitäten im EEG gefunden werden.

Bei den ci2-Tieren gab es auch während des Drehverhaltens oder während weiterer

Störungen im Bewegungsablauf kein abnormes EEG.

In den Ruhephasen (passives Verhalten) oder während des Schlafens zeigten

sowohl die Mutante (ci2/ci2), als auch die heterozygoten Geschwistertiere (ci2/+) und

die Tiere des Hintergrundstammes (LEW/Ztm) Graphoelemente mit einer Frequenz

von ungefähr 10 Hz und einer mittleren Dauer von 3,89 Sek. (von 0,8 bis 11,4 Sek.)

(Abb. 32 und 33). Diese waren durch langsame, rhythmische Aktivität im EEG

gekennzeichnet und ähnelten nicht den bei WAG/Rij aufgetretenen „Spike-Wave“-

Formationen. Des weiteren waren sie nicht von Verhaltensanomalien begleitet.

Bei den WAG-Rij-Tieren traten während Ruhe- und Schlafphasen Graphoelemente

mit einer Frequenz von ungefähr 8 Hz und einer mittleren Dauer von 5,82 Sek. (von

3 bis 15 Sek.) auf (Abb. 32 und 33). Diese bestanden aus „Spike-Wave“-Entladungen

und wurden von Verhaltensanomalien, wie myoklonischen Bewegungen der

Tasthaare oder dem Zucken von Augen und Ohren, begleitet. Sie traten bis zu 28

mal pro Std. auf.

119

Abb. 32: Corticale EEG-Ableitungen eines (A) ci2/ci2-Tieres, (B) ci2/+-Tieres, (C) normalen LEW-Hintergrundstamm-Tieres (LEW/Ztm), sowie einer (D) epileptischen WAG/Rij-Ratte. Alle Aufnahmen wurden während der Hellphase an frei-beweglichen Ratten angefertigt. „Aktives Verhalten“ bedeutet, dass sich die Tiere in der Bewegung befanden, „Ruhephase“ steht für ein passives Verhalten der Tiere. Während der hier gezeigten Aufnahmen der ci2-Mutante trat kein Circling-Verhalten auf. Die Aufnahmen wurden durch einen EEG-Schreiber aufgezeichnet.

A) ci2/ci2 B) ci2/+

D) WAG/RijC) Lew/Ztm

Aktives Verhalten

Ruhephase / Schlaf

Ruhephase / Schlaf

Ruhephase / Schlaf

Ruhephase / Schlaf

Ruhephase / Schlaf

Ruhephase / Schlaf

Ruhephase / Schlaf

Ruhephase / Schlaf

Ruhephase / Schlaf

Ruhephase / Schlaf

Ruhephase / Schlaf

Ruhephase / Schlaf

Ruhephase / Schlaf

Ruhephase / Schlaf

Ruhephase / Schlaf

Ruhephase / Schlaf

Aktives Verhalten

Aktives VerhaltenAktives Verhalten

10sec

10 sec 10 sec

10 sec

0.25 mV

0.25 mV 0.25 mV

0.25 mV

120

Abb. 33: EEG-Aufnahmen von (A) einer ci2-Mutante während aktiver Wachheit, (B) einer normalen Ratte des LEW-Hintergrundstammes (LEW/Ztm) während aktiver Wachheit, (C) einer epileptischen WAG/Rij-Ratte während passiver Wachheit oder Schlaf, sowie (D) einer normalen LEW/Ztm-Ratte während passiver Wachheit oder Schlaf. Alle Aufnahmen wurden während der Hellphase an frei-beweglichen Ratten angefertigt. Die Aufnahme der ci2-Mutante wurde kurz vor, während und nach paroxysmalem Circling-Verhalten angefertigt (der Pfeil zeigt den Beginn des Circling-Verhaltens an; die Dauer des Rotationsverhaltens lag bei ca. 5 Sek.). Die „Slow-wave“ Oszillationen im EEG der Mutante während aktiver Wachheit wurden auch bei solchen Aufnahmen von normalen LEW-Ratten gesehen (s. B) und werden als Bewegungsartefakte angesehen. Bei der WAG/Rij-Ratte markiert der Pfeil den Beginn eines epileptischen Anfalls. Für die in D gezeigte LEW/Ztm-Ratte zeigt der Pfeil den Beginn eines Schlafspindel-ähnlichen Graphoelementes. Alle Aufnahmen wurden über ein Drehgelenk angefertigt, um Bewegungsartefakte zu minimieren, und sie wurden über PowerLab Programme digitalisiert.

ci2/ci2

sec

0 5 10 15 20

mV

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

WAG Rij

sec

0 5 10 15 20

mV

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

40LEW/Ztm

sec

0 5 10 15 20

mV

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

LEW/Ztm

sec

0 5 10 15 20

mV

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

A B

C D

121

4.3. Neuropathologische Befunde

4.3.1. Bestimmung der Dichte TH-positiver Neurone in SNC und VTA

In Analogie zu früheren Untersuchungen dopaminerger Neurone bei der ci2-Mutante

(RICHTER et al., 1999) wurden die Gehirne von 7 ci3-Tieren und 7 BH-7A-Tieren

immunhistochemisch untersucht (histologische Darstellung s. Abb. 34 + 35). Die

Mittelwerte und SEM der Neuronendichten in VTA, SNL und SNC sind in Tab. 12

angegeben, die Mittelwerte und SEM der 8 ausgezählten Subregionen in Tab. 13..

Bei der Quantifizierung der Neuronendichten zeigten sich in VTA und SNL keine

signifikanten, bilateralen Asymmetrien der TH-positiven Zellen bei den ci3-Ratten. In

der SNC der Mutante war jedoch die Neuronendichte auf der zur Drehrichtung

contralateralen Seite signifikant niedriger als auf der ipsilateralen Seite (P = 0,0412).

Bei den BH.7A-Kontrollen konnten weder signifikante Unterschiede in der Zelldichte

zwischen den Hemisphären, noch signifikante Unterschiede zur Zelldichte der

Mutante festgestellt werden (Tab. 13 und Abb. 36). Für eine genauere Untersuchung

der Lateralität in der Zelldichte der SNC der Mutante wurden die Neuronendichten für

den lateralen Anteil der SNC und den medialen Anteil der SNC (nach FALLON und

LOUGHLIN, 1995), welcher das Gros der Neurone enthält, noch einmal getrennt

beurteilt. Darüber hinaus wurde die mediale SNC für die Berechnung in zwei rostrale

und zwei caudale Viertel unterteilt, da unterschiedliche funktionelle Anteile

wahrscheinlich sind (HERNANDEZ-LOPEZ et al., 1994). In der lateralen SNC ergaben

sich nun keine signifikanten Asymmetrien in der Dichte dopaminerger Neurone bei

Mutante und Kontrolle. Bei der Untersuchung der Unterschiede in den Zelldichten

zwischen den vier Vierteln der SNC zeigte sich in der ANOVA, dass die Viertel sich

bei den ci3-Ratten im Gegensatz zu den Kontrollen signifikant unterschieden (P =

0,0041). Mit Ausnahme des rostralsten Anteils gab es eine Tendenz zu niedrigeren

Neuronendichten auf der contralateralen Seite, die im caudalsten Anteil immerhin

22% Differenz zur ipsilateralen Seite ausmachte (Signifikanzniveau von P = 0,0159).

Für die Kontrolltiere konnte keinerlei signifikante Lateralität in den Subregionen der

medialen SNC gefunden werden.

122

Bei einem Vergleich der DA-Zelldichten in den einzelnen Anteilen der medialen SNC

zwischen ci3- und BH.7A-Tieren zeigte sich ein signifikanter Unterschied im vierten,

caudalsten Viertel. In diesem Bereich lag die Dichte TH-positiver Neurone auf der

contralateralen Seite der Mutante signifikant niedriger als auf der linken (P = 0,0383)

und der rechten Seite (P = 0,0466) der Kontrollen. Der relative Unterschied lag bei –

23 % und – 24% (s. Tab. 13 und Abb. 37).

Abb. 34: Histologische Darstellung der rechten VTA und SNC einer ci3-Mutante bei 25facher Vergrößerung. Die TH-positiven Neurone und Fasern sind durch die immunhistochemische Reaktion schwarz angefärbt.

123

Tab. 12: Dichte TH-positiver Neurone in VTA, SNL und SNC von ci3-Mutante und BH.7A-Kontrollen. Angegeben sind die Mittelwerte und SEM von 7 ci3-Tieren und 7 BH.7A-Kontrollen. Die Dichten sind für die Mutante ipsi- und contralateral zur Drehrichtung angegeben, für die Kontrollen erfolgte eine Aufschlüsselung nach linker und rechter Hemisphäre. Der Stern zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen den Neuronendichten der ipsi- und der contralateralen SNC der ci3-Tiere (P = 0,0412).

Region ci3/ci3 BH.7A

ipsilateral contralateral links rechts

Mittelwert ± SEM Mittelwert ± SEM Mittelwert ± SEM Mittelwert ± SEM

VTA 6870 ± 453 7295 ± 715 6691 ± 445 7359 ± 480

SNL 6675 ± 426 7000 ± 545 6594 ± 450 6716 ± 448

SNC 8164 ± 404 7720 * ± 559 8002 ± 297 7800 ± 428

Abb. 35: Histologische Darstellung TH-positiver Neurone in der SNC einer ci3-Mutante bei 400facher Vergrößerung. Die Neurone stellen sich nach der immunhistochemischen Anfärbung schwarz dar.

124

Tab. 13: Dichte TH-positiver Neurone für die folgenden Subregionen von VTA und SNC von ci3-Tieren und BH.7A-Kontrollen: 1.VTA rostral 5.SNC medial rostral 2.VTA caudal 6.SNC medial caudal anterior 3.SNC lateral rostral 7.SNC medial caudal posterior 4.SNC lateral caudal 8.SNC medial caudal superposterior Angegeben sind die Mittelwerte und SEM von 7 ci3-Ratten und 7 Kontrollen. Die Dichten sind für die Mutante ipsi- und contralateral zur Drehrichtung angegeben, für die Kontrollen erfolgte eine Aufschlüsselung nach linker und rechter Hemisphäre. Der Stern zeigt einen signifikanten Unterschied in der Zelldichte zwischen ipsi- und contralateraler SNC med. caud. superpost. von ci3-Ratten (P = 0,0159). Die Pluszeichen stehen für signifikante Unterschiede zwischen contralateraler SNC med. caud. superpost. der Mutante und linker (P = 0,0383) und rechter (P = 0,0466) SNC med. caud. superpost. der Kontrollratten.

Region ci3/ci3 BH.7A


Mittelwert ± SEM Mittelwert ± SEM Mittelwert ± SEM Mittelwert ± SEM

1. VTA

rostral

5828 ± 477 6935 ± 842 6349 ± 440 6479 ± 765

2. VTA

caudal

7912 ± 625 7660 ± 664 7033 ± 591 8238 ± 622

3. SNC lat.

rostral

9158 ± 565 8807 ± 610 8344 ± 366 8303 ± 626

4. SNC lat.

caudal

6675 ± 426 7000 ± 545 6594 ± 450 6716 ± 448

5. SNC

med.rostr.

8059 ± 366 8873 ± 871 7774 ± 443 7652 ± 454

6. SNC

med.

caud. ant.

9076 ± 745

8628 ± 1017

9117 ± 754

8710 ± 692

7. SNC

med.

caud.post.

7367 ± 442

6716 ± 719

7489 ± 660

7041 ± 519

8. SNC

med.

caud.

superpost.

7163 ± 565

5576 * ± 508

7285 + ± 531

7293 + ± 584

125

Abb. 36: Dichte der TH-positiven Neurone in VTA, SNL und SNC bei ci3-Tieren (A) und BH.7A-Kontrollen (B). Gezeigt sind die Mittelwerte ± SEM von 7 ci3-Ratten mit einer Seitenpräferenz von > 90% und 7 BH.7A-Kontrollen. Für die Mutante sind die Zelldichten auf der zur Drehrichtung ipsi- und contralateralen Seite ausgezählt worden. Bei den Kontrollen sind die Zelldichten der linken und der rechten Hemisphäre angegeben. Eine signifikante Asymmetrie zwischen den Zelldichten von Hirnregionen ist durch einen Stern gekennzeichnet (P = 0,0412). Obwohl die durchschnittliche Asymmetrie in der SNC der Mutante klein war, so wurde sie im Paired Student`s t-Test doch signifikant.

Neu

rone

ndic

hte/

mm

3

0

2000

4000

6000

8000

10000

*

Neu

rone

ndic

hte/

mm

3

0

2000

4000

6000

8000

10000

ipsilateralcontralateral

A

B

VTA SNL SNC

VTA SNL SNC

links

rechts

126

Abb. 37: Dichte der TH-positiven Neurone der Subregionen der SNC bei ci3-Tieren (A) und BH.7A-Kontrollen (B). Die Neuronendichten sind angegeben für die laterale (lat) und die mediale (med) SNC. Die mediale SNC wurde weiter über ihre rostro-caudale Ausdehnung in vier Viertel (med 1 – med 4) unterteilt. Es handelt sich um die selben Tiere wie in Abb. 36. Die Analyse der vier Viertel der medialen SNC durch die ANOVA zeigte einen signifikanten Unterschied bei der Mutante (P = 0,0041), nicht jedoch bei den Kontrollen. Der Post Hoc Test ergab eine signifikante Asymmetrie in der Zelldichte des caudalsten Viertels (med 4) der SNC, welche durch den Stern angezeigt wird (P = 0,0159).

Neu

rone

ndic

hte/

mm

3

0

2000

4000

6000

8000

10000N

euro

nend

icht

e/m

m3

0

2000

4000

6000

8000

10000


*

A

B

lat med 1 med 2 med 3 med 4

lat med 1 med 2 med 3 med 4

links

rechts

127

4.3.2. Untersuchung der cochleären und vestibulären Nuclei

4.3.2.1. Kerngrößen

4.3.2.1.1. ci3-Mutante und BH.7A-Tiere

Entsprechend vorangegangener Untersuchungen bei ci2-Ratten (KAISER et al., 2001)

wurde in diesen Untersuchungen zunächst das Volumen der cochleären und

vestibulären Kerngebiete bei 5 ci3-Ratten und 6 BH.7A-Kontrolltieren bestimmt,

wobei die Volumina für die beiden Hemisphären getrennt ermittelt und dann für die

Mutanten nach ipsilateral und contralateral zur Drehrichtung, und für die Kontrollen

nach linker und rechter Hemisphäre aufgeschlüsselt wurden (s. Tab. 14 und Abb.

38). Wie in Kapitel 3.4.5.1. erklärt wurde, konnten für den PVCN und den DCN nur

die mittleren Kerngrößen in drei aufeinander folgenden Schnitten verglichen werden.

Die Mittelwerte der Kernvolumina in mm³ oder der Kerngrößen in mm² zusammen

mit den zugehörigen SEM sind in Tab. 14 angegeben. Aufgrund von partiellen

Schäden durch die histologische Präparation konnten in die Volumenberechnung des

superioren vestibulären Nucleus und des lateralen vestibulären Nucleus der Mutante

nur jeweils 4 Tiere eingehen, bei den BH.7A-Tieren nur je 5 Tiere.

Es konnten in diesen Untersuchungen keine signifikanten, bilateralen Asymmetrien

im Kernvolumen der cochleären oder vestibulären Kerne bei ci3-Ratten und BH.7A-

Kontrolltieren gefunden werden. Darüberhinaus gab es auch keine signifikanten

Unterschiede der Volumina im Vergleich zwischen Mutante und Kontrolle. Für den

posteroventralen cochleären Nucleus und den dorsalen cochleären Nucleus ergaben

sich für die mittleren Größen ebenfalls keine signifikanten Asymmetrien oder

Unterschiede zwischen ci3- und BH.7A-Tieren.

128

Tab. 14: Volumina der cochleären und vestibulären Nuclei bei ci3-Tieren und BH.7A-Kontrollen. Für den inferioren vestibulären Nucleus ist das Volumen des rostralen Anteils dieser Subregion angegeben, für den anteroventralen cochleären Nucleus das Volumen des caudalen Teils. Im Fall des posteroventralen cochleären Nucleus und des dorsalen cochleären Nucleus konnte das Volumen aufgrund von partiellen Schäden durch die histologische Präparation nicht bestimmt werden. Hier wurde stattdessen die mittlere Größe von 2 bis 3 aufeinanderfolgenden Schnitten bestimmt (in mm²). Angegeben sind die Mittelwerte ± SEM von 5 ci3-Tieren und 6 Kontrollen. Für die Mutante sind die Daten der zur Drehrichtung ipsi- und contralateralen Seite dargestellt, für die Kontrollen die Daten der linken und rechten Hemisphäre. AVCN: anteroventraler cochleärer Nucleus, PVCN: posteroventraler cochleärer Nucleus, DCN dorsaler cochleärer Nucleus, SVN: superiorer vestibulärer Nucleus, MVN: medialer vestibulärer Nucleus, LVN: lateraler vestibulärer Nucleus, IVN: inferiorer vestibulärer Nucleus.

Volumen

ci3-Tiere BH.7A-Tiere

Region


Cochlearkern

AVCN (mm³) 0,409 ± 0,028 0,422 ± 0,060 0,445 ± 0,012 0,445 ± 0,027

PVCN (mm²) 0,631 ± 0,031 0,573 ± 0,019 0,607 ± 0,024 0,551 ± 0,018

DCN (mm²) 0,676 ± 0,077 0,856 ± 0,074 0,779 ± 0,061 0,505 ± 0,114

Vestibularkern

SVN (mm³) 0,114 ± 0,017 0,162 ± 0,015 0,127 ± 0,012 0,118 ± 0,013

MVN (mm³) 0,666 ± 0,051 0,676 ± 0,044 0,592 ± 0,037 0,574 ± 0,026

LVN (mm³) 0,230 ± 0,040 0,222 ± 0,014 0,207 ± 0,095 0,193 ± 0,020

IVN (mm³) 0,233 ± 0,012 0,235 ± 0,014 0,194 ± 0,099 0,212 ± 0,011

129

Abb. 38: Volumina der cochleären und vestibulären Hirnstammnuclei von 5 ci3-Tieren (A) und 6 BH.7A-Kontrollen (B). Für die Mutante wird das Volumen (Mittelwerte ± SEM) der Nuclei ipsi- und contralateral zur Drehrichtung gezeigt, während die entsprechenden Volumina für die Kontrolltiere für die linke und rechte Hemisphäre aufgetragen sind. Es konnten keine signifikanten Asymmetrien in der Kerngröße bestimmt werden.

Vol

umen

in m

m3

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

Vol

umen

in m

m3

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

SVN LVN MVN IVN

B

A

AVCN


SVN LVN MVN IVN AVCN

linksrechts

130

4.3.2.1.2. Streptomycin-behandelte Tiere, ci2/+-Kontrollen und ci2/ci2-Tiere

Die Volumina der cochleären und vestibulären Kerne der Streptomycin-behandelten

Tiere wurden ca. 6 Monate nach der Streptomycin-Behandlung bei 7 Tieren

ausgemessen. Als Kontrollen wurden hier 8 heterozygote ci2/+Tiere verwendet (s.

Tab. 15 und Abb. 39). Von der ci2-Mutante standen ebenfalls 8 Tiere zur Verfügung

(Daten für die ci2/+- und die ci2/ci2-Tiere übernommen aus der Dissertation von Frau

Dr. Fedrowitz). Auch bei diesen Tieren konnten für den posteroventralen cochleären

Nucleus und den dorsalen cochleären Nucleus aufgrund von partiellen Schäden

durch die histologische Präparation nur die mittleren Kerngrößen dreier aufeinander

folgender Schnitte berechnet werden. Bei den ci2/+-Tieren gingen in die

Berechnungen für den posteroventralen cochleären Nucleus und den dorsalen

cochleären Nucleus nur 7 Tiere ein. Von den Streptomycin-behandelten Tieren

konnten beim anteroventralen cochleären Nucleus nur 5 Tiere in die Wertung

eingehen, beim superioren vestibulären Nucleus 6 Tiere, beim medialen vestibulären

Nucleus 5 Tiere, beim lateralen vestibulären Nucleus ebenfalls 5 Tiere und beim

inferioren vestibulären Nucleus konnten wegen vorliegender Schäden der

Schnittpräparate nur 6 Tiere einbezogen werden. Von den ci2/ci2-Tieren gingen

beim superioren, medialen und lateralen vestibulären Nucleus je 7 Tiere in die

Wertung ein, beim inferioren vestibulären Nucleus waren es 6 und beim

anteroventralen cochleären Nucleus 5 Tiere. Die Volumina von superiorem, lateralem

und medialem vestibulärem und anteroventralem cochleärem Nucleus waren bei den

Streptomycin-behandelten Tieren signifikant geringer als bei den ci2/+-Kontrollen.

Das Signifikanzniveau lag für den superioren vestibulären Nucleus bei P = 0,0006,

für den lateralen vestibulären Nucleus bei < 0,0001, für den medialen vestibulären

Nucleus bei P = 0,0001 und der signifikante Unterschied beim anteroventralen

cochleären Nucleus betrug P = 0,0161. Bei der Betrachtung der mittleren

Kerngrößen von posteroventralem und dorsalem cochleärem Nucleus wurden

signifikante Unterschiede in der Größe des posteroventralen cochleären Nucleus

zwischen Streptomycin-behandelten und ci2/+-Tieren, sowie zwischen Streptomycin-

behandelten Tieren und ci2/ci2-Tieren gefunden (P = 0,014 bzw. P = 0,00266).

Darüber hinaus war der superiore vestibuläre Nucleus der Streptomycin-behandelten

Tiere auch noch signifikant kleiner (P = 0,00233) und der inferiore vestibuläre

131

Nucleus signifikant größer (P = 0,0152) als derjenige der ci2/ci2-Tiere. Die ci2/ci2-

Tiere unterschieden sich von den ci2/+-Tieren in einem geringeren Volumen des

medialen vestibulären Nucleus (P = 0,000622).

Tab. 15: Volumina der cochleären und vestibulären Nuclei bei Streptomycin-behandelten Tieren, ci2/+-Kontrollen und ci2/ci2-Tieren. Für den inferioren vestibulären Nucleus ist das Volumen des rostralen Anteils dieser Subregion angegeben, für den anteroventralen cochleären Nucleus das Volumen des caudalen Teils. Im Fall des posteroventralen und des dorsalen cochleären Nucleus konnte das Volumen aufgrund von partiellen Schäden durch die histologische Präparation nicht bestimmt werden. Hier wurde stattdessen die mittlere Größe von 2 bis 3 aufeinanderfolgenden Schnitten bestimmt (in mm²). Angegeben sind die Mittelwerte ± SEM von 7 Streptomycin-behandelten Tieren, 8 ci2/+-Kontrollen und 8 ci2/ci2-Tieren. Der Stern steht für signifikante Größenunterschiede zwischen den Kernen von Streptomycin-behandelten Tieren und ci2/+-Kontrollen, das Pluszeichen für solche Unterschiede zwischen Streptomycin-behandelten Tieren und ci2/ci2-Tieren, und das Minuszeichen für signifikante Unterschiede zwischen den ci2/+- und den ci2/ci2-Tieren (P < 0,05). AVCN: anteroventraler cochleärer Nucleus, PVCN: posteroventraler cochleärer Nucleus, DCN dorsaler cochleärer Nucleus, SVN: superiorer vestibulärer Nucleus, MVN: medialer vestibulärer Nucleus, LVN: lateraler vestibulärer Nucleus, IVN: inferiorer vestibulärer Nucleus.

Volumen Region

Streptomycin-behandelte

Tiere

ci2/+-Tiere ci2/ci2-Tiere

Cochlearkern

AVCN (mm³) 0,235 ± 0,046 * 0,405 ± ,0090 0,293 ± 0,024

PVCN (mm²) 0,282 ± 0,014 * + 0,515 ± 0,052 0,418 ± 0,031

DCN (mm²) 0,420 ± 0,069 0,548 ± 0,079 0,407 ± 0,028

Vestibularkern

SVN (mm³) 0,070 ± 0,012 * + 0,220 ± 0,026 0,171 ± 0,021

MVN (mm³) 0,574 ± 0,052 * 0,990 ± 0,047 - 0,626 ± 0,065

LVN (mm³) 0,212 ± 0,013 * 0,470 ± 0,022 0,423 ± 0,097

IVN (mm³) 0,485 ± 0,028 + 0,368 ± 0,025 0,295 ± 0,045

132

Abb. 39: Volumina der cochleären und vestibulären Hirnstammnuclei von 7 Streptomycin-behandelten Tieren, 8 ci2/+-Kontrollen und 8 ci2/ci2-Tieren. Dargestellt sind die Mittelwerte und SEM. Der Stern zeigt signifikante Unterschiede in der Kerngröße an (P < 0,05).

4.3.2.2. Morphologie der Neurone des anteroventralen cochleären Nucleus

4.3.2.2.1. ci3-Mutante und BH.7A-Tiere

Des weiteren wurde die Morphologie der Neurone in allen Kerngebieten

stichprobenartig betrachtet. Die Neurone der 5 untersuchten ci3-Tiere stellten sich

normal dar und zeigten auch keine morphologischen Unterschiede zu den Neuronen

der 6 Kontrolltiere.

Quantitativ evaluiert wurden Fläche, Kreisfaktor und Umfang von 25 Neuronen je

Seite im anteroventralen cochleären Nucleus. Auch bei dieser Untersuchung gab es

keine signifikanten Unterschiede in der Morphologie der Neurone, weder im

Vergleich ipsi-/contralateral ; links/rechts, noch im Vergleich zwischen Mutante und

Kontrollen.

Vol

umen

in m

m³

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Streptomycin-behandelte Tiere

ci2/+-Tiere

ci2/ci2-Tiere

SVN LVNMVN IVN AVCN

**

**

**

*

133

4.3.2.2.2. Streptomycin-behandelte Tiere, ci2/+-Kontrollen und ci2/ci2-Tiere

Bei den Streptomycin-behandelten Tieren fiel bei der stichprobenartigen Betrachtung

der Neuronenmorphologie, ähnlich wie bei der ci2-Mutante, eine im Vergleich mit den

ci2/+-Kontrolltieren abgerundete Neuronenform auf.

Die quantitative Evaluierung der oben genannten Parameter der Neurone des

anteroventralen cochleären Nucleus bestätigte dieses Ergebnis. Die Neurone der 7

Streptomycin-behandelten Tiere hatten einen signifikant höheren Kreisfaktor als

diejenigen der 7 untersuchten ci2/+-Kontrollen (P < 0,0001). Den höchsten

Kreisfaktor hatten die Neurone der ci2/ci2-Tiere. Im Vergleich mit den Streptomycin-

behandelten Tieren ergab sich ein Signifikanzniveau von P = 0,00816, im Vergleich

mit den ci2/+-Tieren von P = 0,0017. Beim Vergleich des Neuronenumfangs gab es

ähnliche Ergebnisse wie bei der Betrachtung des Kreisfaktors: die Neurone der

ci2/ci2-Tiere hatten einen signifikant geringeren Umfang als diejenigen der

Streptomycin-behandelten (P = 0,00816) und als diejenigen der ci2/+-Tiere (P =

0,00466) . Bei der Neuronenfläche gab es keine signifikanten Unterschiede zwischen

den Tiergruppen (s. Tab. 16).

Tab. 16: Angabe der Mittelwerte und SEM der Flächen (in µm²), des Kreisfaktors und des Umfangs (in µm) von 25 Neuronen des anteroventralen cochleären Nucleus von 7 Streptomycin-behandelten Tieren, 7 ci2/+-Kontrolltieren und 7 ci2/ci2-Tieren. Es wurden zunächst die Durchschnittswerte aus 25 Neuronen je Seite gebildet. Anschließend wurde aus den Werten für die beiden Hemisphären der Mittelwert errechnet. Der Stern zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen den Neuronen der Streptomycin-behandelten Tiere und der ci2/+-Kontrollen, das Pluszeichen zeigt solche Unterschiede zwischen Streptomycin-behandelten Tieren und ci2/ci2-Tieren an und das Minuszeichen gibt signifikante Unterschiede zwischen ci2/+- und ci2/ci2-Tieren an.

Mittelwerte und SEM Parameter

Streptomycin-behandelte

Tiere


Fläche (µm²) 196 ± 6,2 207 ± 10,2 181 ± 7,3

Kreisfaktor 0,721 ± 0,01 * + 0,626 ± 0,01 - 0,775 ± 0,01

Umfang (µm) 60,1 ± 1,40 + 64,7 ± 1,71 - 54,2 ± 1,44

134

4.4. Neurochemische Untersuchungen

Es wurden hier die Gehalte an DA und dessen Metaboliten 3,4-

Dihydroxyphenylessigsäure und Homovanillinsäure, an 5-Hydroxytryptamin und

dessen Metaboliten 5-Hydroxyindolessigsäure, sowie der Gehalt von Noradrenalin in

Striatum, Substantia nigra und Nucleus accumbens von 6 ci3-Ratten bestimmt. Die

untersuchten Tiere zeigten eine Drehpräferenz von mindestens 93 % (Mittelwert ±

SEM: 96,5 ± 0,96 %). Die erhobenen Werte sind in den Abb. 40 A – C nach

ipsilateraler und contralateraler Seite aufgeschlüsselt dargestellt. Der DA-Gehalt des

Striatums war auf der zur Drehrichtung contralateralen Seite signifikant niedriger als

auf der ipsilateralen (P = 0,0313). Außerdem gab es eine Tendenz zu niedrigeren

Dihydroxyphenylessigsäure-Gehalten ebenfalls im contralateralen Striatum, die

jedoch nicht signifikant wurde (P = 0,0625). In der contralateralen Substantia nigra

gab es für 5-Hydroxytryptamin tendenziell niedrigere Gehalte (im Durchschnitt um 36

%) als in der ipsilateralen, aber auch hier wurde der Unterschied nicht signifikant. Für

alle weiteren Substanzen und Hirnregionen konnten keine Asymmetrien gefunden

werden. Insgesamt waren die hier ermittelten Konzentrationen vergleichbar mit den

bei anderen Rattenstämmen ermittelten Konzentrationen (LÖSCHER et al., 1996;

RICHTER et al., 1999), so dass sich keine Hinweise auf abnorm hohe oder niedrige

Monoamingehalte bei ci3-Tieren ergaben.

135

Abb. 40 A – C: Monoamine und einige Metaboliten in Striatum, Nucleus accumbens und Substantia nigra von ci3-Tieren. Es handelt sich um die Werte (Mittelwerte ± SEM) von 6 Tieren mit einer Seitenpräferenz von über 90%. Die neurochemischen Daten sind nach zum Drehverhalten ipsi- und contralateraler Seite aufgeschlüsselt. Der Stern gibt einen signifikanten Unterschied im Monoamingehalt zwischen den Hemisphären wieder (P = 0,0313). NA: Noradrenalin; DOPAC: Dihydroxyphenylessigsäure; 5-HIAA: Hydroxyindolessigsäure; HVA: Homovanillinsäure; 5-HT: 5-Hydroxytryptamin

Substantia nigra

ng/g

Hirn

gew

ebe

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

Dopamin NA DOPAC 5-HIAA HVA 5-HT

Nucleus accumbens

ng/g

Hirn

gew

ebe

0

500

1000

1500

2000

2500

3000


Striatum

ng/g

Hirn

gew

ebe

0

2000

8000

10000

12000

14000


* ipsilateral

contralateral

A

B

C

136

4.5. Untersuchungen zur Funktion des auditorischen Systems

4.5.1. Auditorisch evozierte Potentiale

Das Hörvermögen von 5 ci3-Tieren und 5 BH.7A-Kontrollen wurde anhand dieser

Untersuchung überprüft. Die Auswertung der Audiogramme erbrachte keine

Hinweise auf ein signifikantes Defizit des Hörvermögens der Mutante (Abb. 41). Auf

die Erhöhung der Schalldruckpegel reagierten beide Tiergruppen mit einem Anstieg

der Amplitude der auditorisch evozierten Potentiale. Die Hörschwellen des linken und

rechten Ohres zeigten keine Unterschiede, so dass die Mittelwerte beider Ohren

jeder Ratte genutzt wurden, um die Gruppenmittelwerte zu errechnen. Eine leichte

Differenz zwischen ci3- und BH.7A-Tieren von ungefähr 5 dB gab es bei einer

Testfrequenz von 20 kHz, der Unterschied wurde jedoch nicht signifikant.

Abb. 41: Audiogramme von auditorisch evozierten Potentialen bei ci3-Tieren und BH.7A-Kontrollen. Die Schwellenwerte (Mittelwerte ± SEM von 5 Tieren pro Gruppe) sind in dB angegeben. Da es keinen Unterschied zwischen linkem und rechtem Ohr in jeder Gruppe gab, sind die Daten für die beiden Ohren gemittelt. Der statistische Vergleich der Schwellenwerte beider Gruppen für alle eingesetzten Frequenzen ergab keinen signifikanten Unterschied zwischen Mutante und Kontrollen.

40

50

60

70

80

90

1 10 100

Frequenz, kHz

Sch

wel

le,

dB

SP

L

BH7A

ci3

137

Die Ableitung auditorisch evozierter Potentiale bei zwei Streptomycin-behandelten

Tieren direkt im Anschluß an die Injektionsbehandlung erwies das Vorliegen einer

Taubheit. Diese blieb über den Beobachtungszeitraum von 7 Monaten bestehen, wie

eine erneute Ableitung zweier Tiere am Ende der Beobachtungsperiode zeigte.

4.9. Histologische Untersuchung des Innenohres

In der histologischen Untersuchung des Innenohres von ci3-Tieren konnten bei

ersten Betrachtungen keine Abweichungen von der normalen Zellmorphologie

festgestellt werden. Genaue Untersuchungen sind in Vorbereitung.

Bei den Streptomyin-behandelten Tieren zeigte sich direkt im Anschluß an die

Injektionsbehandlung ein kompletter Verlust der Haarzellen des auditorischen

Systems, die Untersuchung des vestibulären Systems wird gerade durchgeführt.

138

5. Diskussion

5.1. Betrachtungen zur Methodik

5.1.1. Verhaltensbeobachtungen

5.1.1.1. Rotationsverhalten und weitere motorische Anomalien

In diesen Untersuchungen wurden das Rotationsverhalten, sowie weitere motorische

Anomalien (Hyperlokomotion, Opisthotonus und Ataxie) näher charakterisiert. Als

Ansatz für die Beschreibung des Rotationsverhaltens wurden zum einen 5-Min. Tests

durchgeführt. Diese erfolgten während der Hellphase und unter Anwesenheit des

Untersuchers in einem leeren Makrolonkäfig drei Mal im Abstand von mindestens

drei Tagen. Dieser Versuchsansatz wurde ausgewählt, weil sich in langjährigen

Beobachtungen an ci2-Tieren gezeigt hat (LÖSCHER et al., 1996; RICHTER et al.,

1999), dass das Rotationsverhalten durch Stresseinfluß ausgelöst und verstärkt

werden kann. Der neue Käfig, das Handling zum Umsetzen der Tiere in diesen Käfig

und die Anwesenheit des Untersuchers sind solche Stressfaktoren. Des weiteren

konnte wiederholt beobachtet werden, dass sich die Tiere an diese Stressfaktoren

adaptieren. Um eine Habituation und damit verminderte Rotationszahlen zu

verhindern, wurde zwischen den Testungen die testfreie Periode von drei Tagen

eingeführt.

Da diese Art der Testung aber nur eine Beurteilung des Drehverhaltens unter Stress

zuließ und sich die Frage stellte, ob die Tiere auch spontan in Abwesenheit von

Stresseinflüssen rotieren, haben wir Videoaufnahmen ohne Anwesenheit des

Untersuchers im Heimkäfig der Tiere durchgeführt. Dabei wurden Aufnahmen sowohl

in der Hell- als auch in der Dunkelphase angefertigt, um zu sehen, ob es eventuell

Unterschiede in einem spontanen Rotationsverhalten zwischen der Aktivitätsphase

(Dunkelphase) der Tiere und der passiven, eigentlichen Schlafphase (Hellphase) der

Tiere gibt. Die Videoaufnahmen ermöglichten außerdem zu beobachten, ob die Tiere

nur, wie bei den 5-Min. Tests, aus der Bewegung heraus drehen, oder aber, ob auch

139

aus passivem Verhalten heraus paroxysmale Rotations-„Anfälle“ auftreten, die im

Sinne einer epileptogenen Veränderung gedeutet werden könnten.

Die Beobachtung des Rotationsverhaltens unter diesen verschiedenen Bedingungen

machte eine genauere Einordnung des Phänomens „Circling“ in

Verhaltensparadigmen möglich.

Bei der Beurteilung der weiteren Parameter, die den Phänotyp der Tiere ausmachen

(Hyperlokomotion, Opisthotonus und Ataxie), konnte bereits rein qualitativ festgestellt

werden, dass alle ci2-Tiere, im Gegensatz zu den ci3-Tieren und allen Kontrolltieren,

Opisthotonus und Ataxie zeigten. Auch war eine Hyperlokomotion der beiden

Mutanten gegenüber den Kontrolltieren eindeutig vorhanden. In den 5-Min. Tests

haben wir darüber hinaus jedoch noch eine semiquantitative (mit dem Score-System

nach TRICKLEBANK, 1984) Evaluierung vorgenommen, die eine hinreichend sichere

Beurteilung der Parameterausprägung erlaubte.

5.1.1.2. Untersuchungen zur Funktion des vestibulären Systems

Da bekannt ist, dass sich Schäden im vestibulären System in Imbalanzen und

gestörten vestibulären Reflexen äußern (STRUPP und ARBUSOW, 2001; RABBATH et

al., 2001), haben wir die Funktionen dieses Systems anhand mehrerer Testverfahren

überprüft.

Hierzu wurden die Tiere zunächst in einem Schwimmtest (RABBATH et al., 2001) in

ein Wasserbecken verbracht und über 5 Min. schwimmen gelassen. Dieser Test ist

geeignet, um eine Aussage über die Funktion des vestibulären Systems zu treffen,

da Ratten mit intaktem vestibulären System schwimmen können, Ratten mit

Dysfunktionen dieses Systems hingegen unfähig sind zu schwimmen (GRAY et al.,

1988). Abweichungen vom normalen Schwimmverhalten konnten hinreichend

beurteilt werden, denn Tiere mit Defiziten im Schwimmvermögen gingen sofort nach

Verbringen in das Wasserbecken korkenzieherförmig unter.

Um eine umfassende Bewertung der Funktion des vestibulären Systems zu

garantieren, wurden von uns zusätzlich zum Schwimmtest zwei weitere

Untersuchungen durchgeführt, die die vestibulären Reflexe überprüfen. Der „Air-

Righting Test“ (OSSENKOPP et al., 1990; RABBATH et al., 2001) (s. Kap. 2.5.2.2.)

140

wurde dreimal hintereinander durchgeführt, und nur Abweichungen in allen drei

Testungen (Landungen auf der Seite oder auf dem Rücken) wurden als Hinweis auf

ein vestibuläres Defizit verstanden. Es wurde von uns nur dieses dreimalige Defizit

als aussagekräftig angesehen, weil sich dadurch, dass die Tiere mit

Arbeitshandschuhen an den Gliedmaßen hochgehoben wurden und sie sich in

diesen verfangen konnten, bei ein- oder zweimaliger Testung Verfälschungen des

Versuchsergebnisses ergeben konnten.

Für die Auswertung des „Tail-Hanging Tests“ (HUNT et al., 1987; RABBATH et al.,

2001) (s. Kap. 2.5.2.2.) wurde dasselbe Verfahren angewandt, so dass eine

Vergleichbarkeit zum „Air-Righting Test“ gegeben war.

Mit Hilfe dieser drei Tests konnte eine Gesamtaussage über die Funktion des

vestibulären Systems getroffen werden.

5.1.1.3. Pharmakologische Untersuchungen

Für die pharmakologischen Versuche haben wir das Cross-over Design als

Versuchsansatz ausgewählt. Es wurde beurteilt, ob die Verhaltensantwort auf die

Substanzapplikation bei den Mutanten anders ausfällt als bei den Kontrolltieren. Die

Vehikelkontrolle für beide Tiergruppen sicherte die Ergebnisse, da hiermit z.B.

kontrolliert werden konnte, welchen Einfluß die Injektion und das damit verbundene

Handling der Tiere auf die Verhaltensantwort ausübt, und wie sich die selben Tiere

unter Substanzeinfluß im Vergleich zum Vehikeleinfluß verhalten.

Wir setzten hier Substanzen ein, deren Wirkungen auf das DA-System lange bekannt

und gut beschrieben sind, um gezielte Manipulationen vornehmen zu können (FOG,

1972; RANDRUP und MUNKVAD, 1975; GLICK et al., 1976; LÖSCHER et al., 1991; ALI et al.,

1994; DUGAST et al., 1997 etc.). Die Dosierungen haben wir in Anlehnung an

Literaturdaten zur „Stargazer“-Mutante (BROCK und ASHBY, 1996) und an bereits im

Institut durchgeführte Untersuchungen zur ci2-Mutante (LÖSCHER et al., 1996)

ausgewählt, so dass anschließend die Reaktionsweise des DA-Systems zwischen

den beiden Mutanten verglichen werden konnte.

Die Tiere wurden jeweils bereits 15 Min. vor der Injektion in Rotometertonnen

umgesetzt, um eine Adaptation an die neue Umgebung zu ermöglichen und somit

141

deren Einfluss auf die Verhaltensantwort zu minimieren. Der Beobachtungszeitraum

nach Substanzapplikation orientierte sich an der Wirkungsdauer und war in jedem

Fall ausreichend lange gewählt, um die Beurteilung der Substanzwirkung zu

erlauben. Während der Beobachtungszeit wurden von uns verschiedenste

Verhaltensparameter nach dem Score-System von TRICKLEBANK et al. (1984), mit

welchem am hiesigen Instut jahrelange Erfahrungen bestehen, semiquantitativ

evaluiert.

Bei Applikation der DA-Rezeptor-Antagonisten haben wir den „Standard Bar-Test“

durchgeführt, weil dieser als Instrument zur Untersuchung von

Verhaltensmechanismen neurochemischer Systeme lange etabliert ist (KUSCHINSKY

und HORNYKIEWICZ, 1972).

Die pharmakologischen Untersuchungen wurden, wie in der

Verhaltenspharmakologie allgemein üblich, in der Hellphase durchgeführt, um eine

genaue Evaluierung der Verhaltensparameter zu garantieren. In einem Fall (D-

Amphetamin bei ci3-Tieren) injizierten wir die Substanz jedoch zusätzlich kurz vor

Beginn der Dunkelphase und zeichneten die Verhaltensantwort auf Videobändern

auf, auf denen später die Rotationen ausgezählt wurden. Auf diese Weise konnten

wir beurteilen, ob die erwartete Antwort auf das D-Amphetamin, eine Erhöhung der

Rotationsanzahl, in der Aktivitätsphase der Tiere anders ausfällt als in der passiven

Schlaf- (Hell-) Phase.

5.1.2. EEGs

Vom Menschen ist eine Form der Epilepsie, die Rotationsepilepsie, bekannt, die im

Zusammenhang mit generalisierten oder fokalen Epilepsien auftreten kann und mit

Drehungen der Patienten um die eigene Achse einhergeht. Die Drehungen werden

hier auf asymmetrische Entladungen im Bereich der Basalganglien zurückgeführt

(VERCUEIL et al., 1999; RAMMELLI et al., 1999).

Darüber hinaus ist von der „Stargazer“ (stg)-Mausmutante (NOEBELS et al., 1990) ein

gleichzeitiges Vorliegen von Bewegungsstörungen und von Epilepsie, die sich im

EEG in Form von „Spike-Wave“-Entladungen darstellt und somit einer Absencen-

Epilepsie ähnelt, bekannt.

142

Um bei den Mutanten ein epileptogenes Geschehen als Ursache für das

Drehverhalten auszuschließen, wurden deshalb im Rahmen der Charakterisierung

auch EEGs abgeleitet. Neben EEGs von ci2-Tieren und Kontrolltieren wurden auch

EEGs von Ratten des WAG/Rij-Stammes abgeleitet, weil bei diesen Tieren, ähnlich

wie bei humanen Absencen-Epilepsien und bei der stg-Mausmutante, EEG-

Veränderungen in Form von „Spike-Wave“-Entladungen vorliegen (VAN LUIJTELAAR

und COENEN, 1986; PEETERS et al., 1989) und die Tiere damit als Positivkontrolle

dienen konnten.

Die Lokalisation der Ableitelektroden (s. Kap. 3.3.1.) ließ die Beantwortung der

Frage, ob eine generalisierte Epilepsie vorliegt, zu. Für eine sichere Aussage über

das eventuelle Vorhandensein einer fokalen Epilepsie wären zwar weitere EEG-

Ableitungen mit, z.B. im limbischen System platzierten, Tiefenelektroden notwendig.

Diese wurden aber aufgrund klinischer Erfahrungswerte nicht durchgeführt (s. Kap.

5.2.2.).

EEG-Untersuchungen bei ci3- und BH.7A-Tieren konnten aufgrund mangelnder

Verfügbarkeit der Tiere bislang nicht durchgeführt werden, sind aber in Vorbereitung.

5.1.3. Neuropathologische Befunde

5.1.3.1. TH-Immunhistochemie Um dopaminerge Neurone in der SNC und in der VTA zu identifizieren, wurde die

Methode der TH-Immunhistochemie gewählt. Das Enzym TH spielt sowohl in der

Synthese von DA, als auch von Noradrenalin und Adrenalin eine wesentliche Rolle,

so dass durch die immunhistochemische Reaktion alle catecholaminergen Zellen

angefärbt werden (NICHOLLS et al., 1995). Da die SNC und die VTA jedoch

neuroanatomisch als dopaminerge Regionen beschrieben sind (FALLON und

LOUGHLIN, 1995), ist davon auszugehen, dass es sich bei den schwarz angefärbten

Zellen hier wirklich um dopaminerge Neurone handelt.

Die Auszählung dieser Neurone erfolgte anhand der Methode des optischen

Disektors (SAPER, 1996). Bei diesem stereologischen Zählverfahren werden die

143

Schnitte in verschiedenen Ebenen durchmustert, um Doppelzählungen und

Auslassungen zu vermeiden. Bei Zählungen von Zellen in nur einer Ebene je Schnitt

können bei Betrachtungen des folgenden Schnittes dieselben Neurone noch einmal

gezählt werden, oder aber Neurone, die sich in der Schnittmitte befinden, eventuell

nicht erfasst werden (COGGESHALL und LEKAN, 1996). Durch die Anwendung der

Methode des optischen Disektors wurde die Genauigkeit der Auszählungsergebnisse

erhöht.

Die Unterteilung der SNC in vier Anteile von rostral nach caudal bei der statistischen

Auswertung basierte zum einen auf eigenen Beobachtungen zur Neuronendichte.

Vor allem aber wurde diese Unterteilung in Anlehnung an Literaturdaten

vorgenommen, in denen unterschiedliche funktionelle Anteile der SNC über ihre

rostro-caudale Ausdehnung beschrieben werden (HERNANDEZ-LOPEZ et al., 1994).

5.1.3.2. Histologie der cochleären und vestibulären Nuclei

Für die morphometrischen Untersuchungen der cochleären und vestibulären

Kerngebiete im Hirnstamm erwies sich die Methode der Bildanalyse mit dem KS300-

System als geeignet, weil auf diese Weise Unterschiede in den Kerngrößen erfasst

werden können, die beim reinen Durchmustern der Schnittpräparate unter dem

Mikroskop nicht erkannt werden. Subjektive Eindrücke (wie z.B. eine veränderte

Neuronenform) können mit Hilfe dieses Systems verifiziert und quantifiziert werden,

indem der Kreisfaktor, die Neuronenfläche und der Neuronenumfang ausgemessen

werden. Die Untersuchung der Einzelneurone wurde hier nur in einem Cochlearkern

durchgeführt, weil sich beim Betrachten der Schnittpräparate keine Hinweise auf

Veränderungen der Neurone in den vestibulären Kerngebieten ergaben.


Für die neurochemische Bestimmung der Konzentrationen von DA und dessen

Metaboliten, Serotonin und dessen Metabolit, sowie Noradrenalin wurde die 1993

von ANNIES im Institut etablierte Methode angewandt. Die Trennung und

144

nachfolgende Detektion der zu bestimmenden Substanzen erfolgte hier mit einer neu

entwickelten Methode, die auf der von WESTER et al. (1987 a und b) beschriebenen

Methode basierte. ANNIES verwendete eine längere Trennsäule als bei WESTER et al.

beschrieben (250 mm statt 170 mm), wodurch die Trennleistung des Systems erhöht

wurde. Des weiteren wurde die Flussrate der mobilen Phase verringert (0,6 ml/Min.

anstelle von 1,2 ml/Min. bei WESTER et al.). Die längere Trennsäule zusammen mit

der geringeren Flussrate erhöhten zwar die Retentionszeiten der zu bestimmenden

Substanzen, so dass eine Chromatogrammdauer von ca. 60 Min. in Kauf genommen

werden musste, ermöglichten aber eine vollständige Auftrennung, so dass alle

Substanzen aus einem Homogenat bestimmt werden konnten.

5.1.5. Auditorisch evozierte Potenziale

Diese Art der Untersuchung des Hörvermögens bietet die Möglichkeit, auch

Hörverluste in eng umgrenzten Frequenzbereichen aufzudecken, da hier über den

gesamten Hörbereich von 0,5 – 60 kHz abgeleitet wird.

5.1.6. Histologische Untersuchung des Innenohres

Für die histologische Untersuchung der Haarzellen des Innenohres wurde das

Material in besonderen Plastikschnitten aufgearbeitet. Diese Einbettung in Durcupan

gewährleistet eine gute Erhaltung der Ultrastrukturen. Die hier erhaltenen Ergebnisse

sind vergleichbar mit den Ergebnissen von rasterelektronenmikroskopischen

Aufnahmen.

145

5.2. Betrachtung der Versuchsergebnisse

5.2.1. Verhaltensbeobachtungen

5.2.1.1. Rotationsverhalten und weitere motorische Anomalien

In den Studien zur Charakterisierung des Rotationsverhaltens konnten wir für beide

Mutanten ein, für die ci2-Mutante bereits beschriebenes, lateralisiertes

Rotationsverhalten bestätigen (LÖSCHER et al., 1996; RICHTER et al., 1999, FEDROWITZ

et al., 2000; LESSENICH et al., 2001), welches sich durch Einfluß von Stress auslösen

und verstärken ließ. Hierbei erschienen die ci2-Tiere stressempfindlicher als die ci3-

Tiere. Die durchgeführten Videoaufnahmen zeigten zum ersten Mal, dass die Tiere

auch ohne auslösende Stressfaktoren in ihrem Heimkäfig spontanes

Rotationsverhalten zeigen. Dabei wurden in der Aktivitätsphase der nachtaktiven

Tiere signifikant mehr Rotationen gezeigt, als in der passiven Hellphase. Dies ist ein

Hinweis darauf, dass die Rotationen aus der Aktivität heraus erfolgen. In keinem Fall

wurde paroxysmales Drehverhalten aus passivem Verhalten oder einer Schlafphase

heraus gezeigt. Dieses werteten wir als Hinweis darauf, dass hier ein System,

welches bei Bewegung aktiv ist, an der Auslösung des Rotationsverhaltens beteiligt

sein muss. Von normalen Ratten einiger Stämme (so z.B. von Sprague-Dawley

Ratten) ist bekannt, dass sie ebenfalls spontanes Rotationsverhalten in ihrer aktiven

Dunkelphase zeigen (PYCOCK, 1980; CARLSON und GLICK, 1992, 1996), welches auf

eine intrinsische, bilaterale Imbalanz im nigro-striatalen DA-System zurückgeführt

wurde. Eine solche Imbalanz im DA-Gehalt zwischen rechtem und linkem Striatum

von ca. 10 – 15% wurde für normale Ratten von GLICK et al. 1976 zum ersten Mal

nachgewiesen und als Ursache der nächtlichen Rotationen angesehen. Das von der

ci2- und ci3-Mutante gezeigte Drehverhalten tritt jedoch auch während der passiven

Hellphase auf und ist stärker ausgeprägt als das Drehverhalten von normalen

Ratten. Wir schlossen deshalb auf eine stärkere Asymmetrie im DA-System, die

eventuell unilaterale Neurodegenerationen, die zu Circling-Verhalten führen können

(UNGERSTEDT, 1968; UNGERSTEDT und ARBUTHNOTT, 1970; PYCOCK und MARSDEN,

146

1978), mit einschließen könnte. Aus diesem Grund haben wir das DA-System in

weiteren Studien näher untersucht (Interpretation s. Kap. 5.2.3. und 5.2.4. ).

Ein Unterschied zwischen den beiden Mutanten wird im weiteren Phänotyp deutlich:

beide Mutanten sind hyperlokomotorisch, was bereits rein qualitativ eindeutig

sichtbar wurde. Hierbei ist die Hyperlokomotion der ci2-Mutante signifikant stärker

ausgeprägt als diejenige der ci3-Mutante. Die ci2-Tiere zeigen zusätzlich zum

Drehverhalten weitere motorische Anomalien, die sich als Ataxie und Opisthotonus

äußern. Die Interpretation dieser Phänomene wird in die weiteren Betrachtungen

eingehen.

Die Ratten des LEW-Hintergrundstammes, die früh postnatal mit Streptomycin

behandelt wurden, entwickelten im Alter von ca. drei Wochen Rotationsverhalten, wie

schon von ALLEVA und BALAZS (1978) beschrieben. Die Tiere zeigten dabei ebenfalls

eine Lateralisierung des Drehverhaltens. Zusätzlich waren auch bei diesen Tieren

Hyperlokomotion und Opisthotonus ausgeprägt, so dass sie im Phänotyp stark der

ci2-Mutante ähnelten. Das Drehverhalten und die Hyperlokomotion waren jedoch nur

transient: ca. 4 Monate nach der letzten Streptomycin-Injektion zeigte keines der

Tiere mehr Rotationsverhalten oder Hyperlokomotion, wiederum ein Befund, der mit

den Literaturdaten übereinstimmt (ALLEVA und BALAZS, 1978). Eine Interpretation wird

im Zusammenhang mit weiteren Versuchsergebnissen erfolgen.

5.2.1.2. Pharmakologische Untersuchungen

5.2.1.2.1. Wirkungen von DA-Rezeptor-Antagonisten bei der ci2-Mutante

und der ci3-Mutante

Die Applikation eines an D1- und D2-Rezeptoren wirkenden (Haloperidol), und eines

nur an D2-Rezeptoren wirkenden (Racloprid) DA-Rezeptor-Antagonisten bei ci2-

Tieren gab uns weitere Auskunft über die Funktion des DA-Systems bei dieser

Mutante. Beide Substanzen lösten Dosis- und Zeit-abhängig eine Katalepsie aus,

wobei es mit Zunahme der Katalepsie bei der Mutante zu einer Abnahme der

Rotationsanzahl kam. Die Katalepsie lässt Schlüsse auf den funktionellen Index der

nigro-striatalen DA-Aktivität zu (COSTALL und NAYLOR, 1977) und wird typischerweise

147

durch die Verabreichung von Neuroleptika induziert (COSTALL und OLLEY, 1971). In

beiden Fällen war die Ausprägung der Katalepsie bei den ci2-Tieren signifikant

geringer als bei den Kontrolltieren, so dass wir hier auf eine verminderte Sensitivität

der DA-Rezeptoren bei der Mutante schlossen.

Ein ähnliches Ergebnis brachte auch die Applikation dieses Neuroleptikums bei der

„Stargazer“ (stg)-Rattenmutante und entsprechenden Kontrollen (BROCK und ASHBY,

1996). Diese Mutante ähnelt in ihrem Phänotyp stark der ci2-Mutante: sie zeigt

Circling-Verhalten, Hyperlokomotion, Opisthotonus („Stargazing“), Taubheit und ist

unfähig zu schwimmen (TRUETT et al., 1994). Nach einer Applikation von 0,1 und 0,3

mg Haloperidol pro kg KGW entwickelten die Kontrolltiere eine Dosis- und Zeit-

abhängige Katalepsie. Die „Stargazer“-Mutante wurde bei einer Dosis von 0,1 mg/kg

KGW nicht kataleptisch. Bei der höheren Dosis von 0,3 mg/kg KGW wurde eine

Katalepsie gezeigt, sie war jedoch signifikant schwächer ausgeprägt als bei den

Kontrollen. Diese herabgesetzte Empfindlichkeit der DA-Rezeptoren wurde auf eine

genetisch vermittelte Dysfunktion des zentralen DA-Systems zurückgeführt (BROCK

und ASHBY, 1996). Eine solche Dysfunktion wird auch für die ci2-Mutante

angenommen (LÖSCHER et al., 1996; RICHTER et al., 1999) und die Ergebnisse dieser

Studie liefern eine weitere Bestätigung für diese Vermutung.

Bei der ci3-Mutante und den Kontrolltieren führte Haloperidol ebenfalls zu einer

Katalepsie, allerdings erst in einer höheren Dosierung (0,2 mg/kg KGW) als bei der

ci2-Mutante. In der Ausprägung der Katalepsie gab es keine signifikanten

Unterschiede zwischen Mutante und BH.7A-Kontrollen. Die DA-Rezeptoren scheinen

hier also keine veränderte Sensitivität aufzuweisen, weshalb auf die weiterführende

Untersuchung mit Racloprid in diesem Fall verzichtet wurde.

5.2.1.2.2. D-Amphetamin-Effekte

In Anlehnung an die bereits bei der ci2-Mutante durchgeführten Untersuchungen

(LÖSCHER et al., 1996) wurde ci3-Tieren und Streptomycin-behandelten Tieren, sowie

den entsprechenden Kontrolltieren zunächst D-Amphetamin während der Hellphase

verabreicht. Alle Tiergruppen zeigten unter Substanzeinfluß, im Gegensatz zur

Vehikelapplikation, Stereotypien, wie Schnüffeln und Hyperlokomotion. Bei der ci3-

148

Mutante wurde die, schon normalerweise vorliegende, Hyperlokomotion durch D-

Amphetamin signifikant verstärkt (LESSENICH et al., 2001).

Von Amphetamin ist bekannt, dass es die DA-„Turnover-Rate“ des Gehirns

beschleunigt (RANDRUP und MUNKVAD, 1975). Es setzt DA frei und hemmt dessen

Wiederaufnahme (ZETTERSTRÖM et al., 1986; GÖTHERT et al., 1996). Diese Wirkungen

des Amphetamins erklären die Auslösung von Stereotypien, denn stereotypes

Verhalten wird durch dopaminerge Mechanismen vermittelt (FOG, 1972). An der

Generierung von Hyperlokomotion ist wahrscheinlich ein weiterer Mechanismus des

Amphetamin beteiligt, die Freisetzung von Noradrenalin. Der Anteil des

Noradrenalins ist dabei noch nicht ausreichend geklärt. Zum einen wird davon

ausgegangen, dass die erhöhte Motilität allein in Bezug zu Noradrenalin steht (FOG,

1972). Zum anderen wird postuliert, dass die lokomotorische Aktivität sowohl durch

das dopaminerge, als auch durch das noradrenerge System beeinflusst wird

(RANDRUP und MUNKVAD, 1975).

Die Tatsache, dass nach Substanzapplikation Stereotypien und Hyperlokomotion

gezeigt wurden, bewies die Wirksamkeit und die richtige Dosiswahl des eingesetzten

D-Amphetamins.

Rotationsverhalten wurde nur von der ci3-Mutante unter Substanz- und unter

Vehikeleinfluß gezeigt, während Kontrolltiere auch unter D-Amphetamin-Einfluß

keine Rotationen zeigten. Die Rotationszahlen der ci3-Tiere nach D-Amphetamin und

Vehikel unterschieden sich jedoch nicht signifikant voneinander. Im Gegensatz dazu

zeigte die ci2-Mutante eine signifikante Erhöhung der Rotationszahlen nach Gabe

von D-Amphetamin in der Hellphase (LÖSCHER et al., 1996).

In einem Folgeexperiment wurde der Versuchsansatz deshalb mit 10 ci3-Tieren

während der Dunkelphase wiederholt. Hier ergab sich eine signifikante Erhöhung der

Rotationszahlen unter D-Amphetamin im Vergleich mit der Vehikelkontrolle

(LESSENICH et al., 2001).

Bei normalen Sprague-Dawley Ratten führt die systemische Gabe von Amphetamin

zu Rotationen (JERUSSI und GLICK, 1974; CLAUSING et al., 1996). Dieses Phänomen

wird auf eine intrinsische, bilaterale Imbalanz im DA-Gehalt des nigro-striatalen

Systems zurückgeführt, die durch die Amphetamin-induzierte Freisetzung des

vorhandenen DAs verstärkt wird. Diese starke funktionelle Asymmetrie steuert die

Ratte in eine bevorzugte Richtung, sie zeigt Drehverhalten (JERUSSI und GLICK,

149

1974). Eine Asymmetrie im DA-System entsteht auch, wenn es zu unilateralen

Degenerationen dopaminerger Neurone kommt. Im Ungerstedt-Modell der Ratte wird

diese Degeneration chemisch induziert (s. Kap. 2.7.1.). In diesem Modell zeigen die

Tiere nach Amphetamin-Applikation ebenfalls Rotationsverhalten (PYCOCK und

MARSDEN, 1978; SCHWARTING und HUSTON, 1996 a,b). Sowohl funktionelle, als auch

morphologische Asymmetrien im DA-System können also für Amphetamin-

induziertes Rotationsverhalten verantwortlich zeichnen.

Bei der ci2-Mutante wurde die erhöhte Rotationszahl unter Amphetamin auf eine

Imbalanz in der DA-Aktivität zwischen linkem und rechtem Striatum zurückgeführt

(LÖSCHER et al., 1996). Die Ergebnisse der Amphetamin-Applikation bei der ci3-

Mutante in der Hellphase ließen diesen Schluß zunächst nicht zu. Nach

Amphetamin-Applikation in der Dunkelphase ergaben sich jedoch auch hier erhöhte

Rotationszahlen. Eine Erklärung hierfür liefert die „Zwei-Komponenten-Hypothese“

(PYCOCK und MARSDEN, 1978; KOSHIKAWA, 1994). Diese besagt, dass die rotierende

Ratte zwei funktionelle DA-Komponenten benötigt: 1. Eine striatale DA-Imbalanz, die

eine Haltungsasymmetrie und Drehung des Kopfes hervorruft und 2. Eine Stimulation

des mesolimbischen DA-Systems, insbesondere des Nucleus accumbens, die für die

lokomotorische Komponente sorgt, welche die Haltungsasymmetrie in aktives

Circling-Verhalten umwandelt. Da das DA-System, und vor allem der Nucleus

accumbens, insbesondere unter Lokomotion gesteigerte Aktivität aufweisen, lässt

sich erklären, dass das Amphetamin hier erst in der Dunkelphase, der

Aktivitätsphase der Tiere, eine gesteigerte Wirkung zeigte. Des weiteren wird der

Nucleus accumbens bei Stress aktiviert. Bei einer höheren Stressempfindlichkeit der

ci2-Mutante wäre also eine stärkere Reaktion auf das Amphetamin auch in der

Hellphase verständlich. Tatsächlich scheint die ci2-Mutante auf Stress empfindlicher

zu reagieren.

Von den Streptomycin-behandelten Tieren wurden keine Rotationen nach

Amphetamingabe gezeigt, so dass sich keine Hinweise auf eine, durch Streptomycin

ausgelöste, bleibende funktionelle oder morphologische Asymmetrie im DA-System

ergaben. Ob transiente Veränderungen vorlagen ist hier nicht beurteilbar, da die

Untersuchung ca. 5 Monate nach der Injektionsbehandlung mit Streptomycin

durchgeführt wurde und die Tiere zu diesem Zeitpunkt bereits keine

Spontanrotationen mehr zeigten.

150

5.2.1.2.3. MK-801-Wirkungen

Als weitere Substanz, welche den DA-Umsatz erhöht (IMPERATO et al., 1990;

LÖSCHER et al., 1991; LÖSCHER et al., 1993), wurde der N-Methyl-D-Aspartat-

Antagonist MK-801 an ci3-Tiere und BH.7A-Kontrollen verabreicht. Wiederum traten

bei beiden Tiergruppen Stereotypien auf, an der Substanzwirkung waren somit

dopaminerge Mechanismen beteiligt. Rotationen wurden nur von den Mutanten

gezeigt, unter Substanzwirkung wurde eine signifikante Steigerung der

Rotationszahlen deutlich. Dies entspricht der bei der ci2-Mutante gesehenen

Wirkung bei Verabreichung von MK-801 in gleicher Dosis (LÖSCHER et al., 1996). Es

ist bekannt, dass MK-801 bei Ratten mit unilateralen Läsionen der Substantia nigra

Rotationsverhalten auslöst, wahrscheinlich indem es den DA-Umsatz im Striatum

erhöht (GOTO et al., 1993). Dass MK-801 bei der ci3-Mutante, im Gegensatz zu D-

Amphetamin, auch während der Hellphase eine Erhöhung der Rotationszahlen

auslöst, ist wahrscheinlich dadurch bedingt, dass MK-801eine stärkere Wirkung auf

das DA-System ausübt als D-Amphetamin. Dieses wurde auch bei der ci2-Mutante

gesehen. Auch hier nahmen die Rotationszahlen nach Applikation von MK-801 um

einiges stärker zu, als nach Applikation von D-Amphetamin (LÖSCHER et al., 1996).

Der Effekt von MK-801 bei den beiden Mutanten lässt vermuten, dass ein Lateralität

im DA-System vorliegt, die durch einen erhöhten DA-Umsatz verstärkt wird, so dass

es zu einer Induktion von Rotationsverhalten kommt.

5.2.2. EEGs

Die Auswertung der EEGs zeigte, dass das spontane paroxysmale Circling-Verhalten

der ci2-Mutante höchstwahrscheinlich nicht durch eine vorliegende Epilepsie bedingt

ist, und somit nicht der Rotationsepilepsie des Menschen (DONALDSON et al., 1986;

SAKA et al., 1996; AGUGLIA et al., 1999; VERCUEIL et al., 1999; RAMMELLI et al., 1999)

entspricht. Erste Hinweise, die gegen eine epileptogene Veränderung als Ursache für

das abnorme Drehverhalten sprachen, ergaben sich aus der Betrachtung der

angefertigten Videobänder. Hier wurde deutlich, dass die Rotationen immer aus der

Vorwärtsbewegung heraus durchgeführt wurden und nicht „anfallsartig“ während

151

passiver Phasen der Tiere auftraten. Des weiteren waren keine klinischen Anzeichen

eines epileptischen Anfalls, wie myoklonische, klonische oder tonische

Anfallsaktivität, vor oder nach dem Rotationsverhalten vorhanden. Diese Vermutung

verifizierte sich durch die EEG-Ableitungen, da hier keine EEG-Veränderungen vor,

während oder nach den Rotationsphasen beobachtet wurden (LINDEMANN et al.,

2001). Während passiver Phasen oder Schlafphasen der Tiere, in denen kein

Drehverhalten gezeigt wurde, zeigten sich nicht-epileptiforme Graphoelemente, die

nicht von abnormem Verhalten begleitet waren. Diese wurden auch bei Ableitungen

von ci2/+-, und LEW-Kontrolltieren gesehen (LINDEMANN et al., 2001) und wurden als

„Schlafspindeln“ gedeutet, die für corticale EEGs bei normalen Ratten beschrieben

wurden (GOTTESMANN, 1992). Abgesichert wurde das vorgestellte Ergebnis durch

EEG-Ableitungen von WAG/Rij-Ratten. Diese Tiere zeichnen sich durch congenitale

Absencen-Epilepsien aus, die sich im EEG als typische „Spike-Wave“-Entladungen

darstellen (VAN LUIJTELAAR und COENEN, 1986; PEETERS et al., 1989). Tatsächlich

zeigten sich bei diesen Tieren „Spike-Wave“-Formationen im EEG, so dass die von

uns gewählte Methode geeignet war, um paroxysmale Veränderungen im EEG zu

detektieren. Die „Spike-Wave“-Entladungen traten während passiver Wachheit oder

Schlaf auf und waren von Verhaltensanomalien, wie myoklonischen Bewegungen der

Tasthaare oder dem Zucken von Augen und Ohren, begleitet (LINDEMANN et al.,

2001).

Diese Ergebnisse schließen eine generalisierte Form der Epilepsie als Ursache für

das Rotationsverhalten aus. Obwohl Rotationen auch ein seltenes Phänomen bei

fokalen Epilepsien sein können (SAKA et al., 1996; VERCUEIL et al., 1999), schließen

wir das Vorliegen einer solchen Form der Epilepsie ebenfalls aus. Bei Patienten mit

fokalen Epilepsien treten oft epileptische Veränderungen des EEG im Bereich

frontaler und temporaler Regionen auf. Darüber hinaus zeigen die Patienten

zusätzlich zu den Rotationen oftmals konvulsive motorische Anfälle. Die Tatsache,

dass bei der ci2-Mutante weder Konvulsionen, noch epileptiforme EEG-

Veränderungen gesehen wurden, spricht hier unserer Meinung nach gegen das

Vorliegen einer fokalen Epilepsie. Für eine absolut sichere Abklärung wären aber

EEG-Ableitungen mittels Tiefenelektroden in z.B. limbischen Regionen notwendig.

152

5.2.3. TH-Immunhistochemie

Da Drehverhalten auf unilateralen Degenerationen dopaminerger Neurone beruhen

kann (UNGERSTEDT, 1968, UNGERSTEDT und ARBUTHNOTT, 1970; PYCOCK und

MARSDEN, 1978), wurde in dieser Untersuchung, wie zuvor bereits bei der ci2-

Mutante, die Dichte dopaminerger Neurone in der VTA (A10), der SNC (A9) und der

SNL, welche zusammen den DA-Input des Striatums bilden (FALLON und LOUGHLIN,

1995), bei ci3-Tieren und BH.7A-Tieren bestimmt (LESSENICH et al., 2001). Hierdurch

sollten eventuelle Asymmetrien in der Neuronenausstattung der beiden Hemisphären

und Unterschiede im Neuronengehalt zwischen ci3-Mutante und BH.7A-Kontrollen

untersucht werden. In der VTA, der SNL und dem lateralen Anteil der SNC fanden

sich keine signifikanten Seitenunterschiede in der Neuronenanzahl bei ci3-Tieren

und ebenso keine signifikanten Unterschiede zu den BH.7A-Tieren. Bei Betrachtung

der medialen SNC der ci3-Mutante wurde aber ein Unterschied deutlich: in den

caudalen Abschnitten dieser Region war die Dichte der dopaminergen Neurone auf

der zur Drehrichtung contralateralen Seite signifikant niedriger als auf der

ipsilateralen. Zusätzlich war sie auch im Vergleich mit diesem Anteil der SNC bei den

Kontrolltieren signifikant erniedrigt. Die Ursache für die geringere Neuronendichte ist

nicht klar, es scheint sich aber um einen lokal begrenzten Zellverlust zu handeln.

Solche Verluste an dopaminergen Neuronen sind bereits von einer Maus- und einer

Rattenmutante bekannt. Die „Weaver“-Mausmutante hat einen signifikant niedrigeren

Gehalt an TH-positiven Neuronen in der Substantia nigra im Vergleich mit nicht-

betroffenen Geschwistertieren, welcher mit um 75% erniedrigten DA-Gehalten im

Striatum einhergeht (SCHMIDT et al., 1982; GUPTA et al., 1987; TRIARHOU et al., 1988).

Die immunhistochemische Untersuchung der Substantia nigra bei AS/Agu-

Rattenmutanten zeigte ebenfalls einen Verlust an dopaminergen Neuronen. Auch

hier kommt es zu einem um ca. 30% erniedrigten Gehalt an DA im Striatum (CLARKE

und PAYNE, 1994; CAMPBELL et al., 1996; PAYNE et al., 2000). Beide Mutanten

zeichnen sich durch Gangstörungen und Tremor aus. Im Gegensatz zur ci3-Mutante

ist der Verlust an dopaminergen Neuronen sowohl bei der „Weaver“-Maus, als auch

bei der AS/Agu-Ratte aber bilateral ausgeprägt, was erklären könnte, warum diese

beiden Mutanten kein Circling-Verhalten zeigen.

153

Um die funktionelle Bedeutung der signifikanten Asymmetrie in der Neuronendichte

der SNC beurteilen zu können, wurden in der Neurochemie die DA-Gehalte im

Striatum bestimmt. Zusammen mit den Ergebnissen der Neurochemie wird eine

weitere Interpretation erfolgen.


Die Gehalte verschiedener Monoamine, insbesondere des DAs und dessen

Metaboliten, wurden im Striatum, im Nucleus accumbens und in der Substantia nigra

von ci3-Tieren gemessen (LESSENICH et al., 2001), da lateralisiertes Drehverhalten

vielfach auf Asymmetrien im nigro-striatalen DA-System zurückgeführt wird (GLICK et

al., 1974; GLICK et al., 1976; PYCOCK, 1980; CARLSON und GLICK, 1992; 1996). Im

Striatum ergab sich auf der zur Rotationsrichtung contralateralen Seite ein signifikant

niedrigerer DA-Gehalt als auf der ipsilateralen, ein Ergebnis, welches mit der, in der

Immunhistochemie detektierten, niedrigeren Anzahl dopaminerger Neurone auf der

contralateralen Seite korrespondiert, aber im Gegensatz zum Ergebnis bei der ci2-

Mutante steht. Bei dieser wurde auf der zum Drehverhalten ipsilateralen Seite ein

signifikant niedrigerer Gehalt an DA gefunden.

Nach zahlreichen pharmakologischen Untersuchungen (GLICK et al., 1976; PYCOCK,

1980) und Versuchen mit unilateralen Läsionen des DA-Systems (PYCOCK, 1980;

SCHWARTING und HUSTON 1996 a,b) wurde postuliert, dass von der Seite mit der

höheren DA-Konzentration weg gedreht wird. Das Rotationsverhalten der ci2-

Mutante war somit zunächst einmal erklärbar: die ci2-Tiere haben ipsilateral

geringere DA-Gehalte, drehen also von der contralateralen Seite mit den höheren

DA-Konzentrationen weg (RICHTER et al., 1999). Die Videoaufnahmen der ci2-Tiere

zeigten aber, dass einige Tiere ihre Drehpräferenz aus den 5-Min. Tests bei den

Aufnahmen im Heimkäfig änderten. Es scheint also weitere Faktoren zu geben, die

die Drehrichtung beeinflussen können. Auch lässt sich das Drehverhalten der ci3-

Mutante, nämlich von der Seite mit der geringeren Dichte dopaminerger Neurone

und dem geringeren DA-Gehalt weg, mit dem oben beschriebenen Denkansatz nicht

erklären. 1986 fanden SHAPIRO et al., dass es bei Sprague-Dawley Ratten 2 Arten

von Populationen beider Geschlechter gibt: solche mit einer Drehrichtung weg von

154

(„Contra > Ipsi-Ratten“), und solche mit einer Drehrichtung hin zur („Ipsi > Contra-

Ratten“) Seite mit dem höheren DA-Gehalt. Der Grad der striatalen Asymmetrie

scheint also nur die Stärke der Drehpräferenz zu bestimmen, nicht jedoch die

Drehrichtung, die von weiteren Faktoren abhängig ist (SHAPIRO et al., 1986). Ein

solcher Faktor könnte z.B. die Erregung verschiedener Typen von DA-Rezeptoren

(„excitation-mediating“ und „inhibition-mediating“) in unterschiedlichen Bereichen des

Striatums sein (PYCOCK, 1980). Des weiteren könnten weitere Hirnregionen einen

Einfluß auf die Drehrichtung ausüben. 1992 beschrieben CARLSON und GLICK, dass

der frontale Cortex die Aktivität mesolimbischer und nigro-striataler DA-Funktionen

moduliert und eine Aktivierung des mesocorticalen DA-Systems durch Stressoren

einen Wechsel der Präferenz induzieren kann. Ebenso kann eine vorliegende

Imbalanz im striatalen DA-Gehalt eine Haltungsasymmetrie auslösen, die für

Rotationsverhalten notwendig ist, während der Nucleus accumbens die Richtung und

Geschwindigkeit der Bewegungen bestimmt (CARLSON und GLICK, 1996).

Eventuell hat auch die Tatsache, dass das Zelldefizit an dopaminergen Neuronen bei

der ci3-Mutante vor allem im caudalen Bereich der SNC ausgeprägt ist, eine

Bedeutung für die Richtung des Drehverhaltens. Verschiedene Anteile der SNC

scheinen sich nämlich funktionell zu unterscheiden. So fanden VACCARINO et al.

(1985) und FRANKLIN und WOLFE (1987), dass Läsionen im medialen Anteil der SNC

zu ipsilateralem Rotationsverhalten führen, Läsionen im lateralen Anteil der SNC

jedoch zu contralateralen Drehungen. Die Ursache für diese unterschiedliche

Reaktion auf eine Läsionierung könnte darin liegen, dass unterschiedliche

Subregionen der SNC auf verschiedene Teile des Striatums projizieren (FALLON und

LOUGHLIN, 1995; JOEL und WEINER, 2000), oder auch darin, dass die

Projektionsbahnen eine unterschiedliche Rezeptorausstattung besitzen (COOLS und

VAN ROSSUM, 1976). 1994 postulierten HERNANDEZ-LOPEZ et al. eine funktionelle

Kompartimentalisierung der SNC über ihre rostro-caudale Ausdehnung: unilaterale

Injektionen des cholinergen Agonisten Carbachol in die caudalen Anteile der SNC

induzieren contralaterales Circling-Verhalten, zusammen mit einer erhöhten DA-

Ausschüttung im Striatum. Unilaterale Injektionen von Carbachol in die rostralen

SNC-Anteile bewirken das Gegenteil: ipsilaterale Rotationen zusammen mit einer

verminderten striatalen DA-Freisetzung. Bestätigt wurden diese Ergebnisse durch

elektrophysiologische Studien, die auf die Existenz von Subpopulationen nigro-

155

striataler dopaminerger Neurone hinwiesen (HERNANDEZ-LOPEZ et al., 1994). Die

Tatsache, dass die ci3-Mutante von der Hirnseite mit der reduzierten dopaminergen

Zelldichte in caudalen Bereichen der medialen SNC weg drehen, könnte folglich auf

solche funktionellen Unterschiede zurückzuführen sein.

5.2.5. Untersuchungen zum cochleären und vestibulären System

Da Schäden des Innenohres, und hier insbesondere Schäden des vestibulären

Systems, oftmals als Auslöser für Drehverhalten angesehen werden (SHIMA, 1984;

KITAMURA et al., 1991 a,b; BLOOM und HULTCRANTZ, 1994; YONEZAWA et al., 1999;

RABBATH et al., 2001), wurden beide Systeme funktionell und morphologisch

untersucht.

5.2.5.1. ci3-Mutante und BH.7A-Kontrollen

Die Ableitung auditorisch evozierter Potentiale bei ci3-Tieren und BH.7A-Kontrollen

zeigte deutlich, dass das Hörvermögen der ci3-Mutante, im Gegensatz zu dem der

ci2-Mutante, die eine Taubheit aufweist, normal ist (LESSENICH et al., 2001). Die

funktionelle Untersuchung des vestibulären Systems ergab ebenfalls keine Hinweise

auf Dysfunktionen in diesem System (LESSENICH et al., 2001). Zwar gab es einen

signifikanten Unterschied zwischen Mutante und Kontrollen im „Tail-Hanging Test“,

dieser wurde von uns jedoch nicht als Hinweis auf einen Vestibularschaden

angesehen. Dieser Test wird von einigen Gruppen angewandt, um Aussagen über

die Funktion des vestibulären Sytems zu erhalten (HUNT et al., 1987; RABBATH et al.,

2001). Andere Gruppen verwenden ihn jedoch, um Seitenpräferenzen und

Asymmetrien im DA-System von Tieren festzustellen (WILLAR und CROWNE, 1989;

BORLONGAN und SANBERG, 1995; ABROUS et al, 1998). Das Testergebnis wurde von

uns als Hinweis auf eine vorliegende Asymmetrie im nigro-striatalen DA-System

gedeutet, die sich in den Untersuchungen zum DA-System bestätigte. Die

histologische Untersuchung der cochleären und vestibulären Nuclei im Hirnstamm

erbrachten in keinem Fall ein, bilateral oder zwischen Mutante und Kontrolle,

156

signifikant unterschiedliches Ergebnis (LESSENICH et al., 2001). Damit handelt es sich

unseres Wissens nach bei der ci3-Mutante um die erste beschriebene

Rattenmutante mit abnormem Rotationsverhalten, aber wahrscheinlich normaler

Funktion von cochleärem und vestibulärem System. Bislang kann jedoch noch nicht

völlig ausgeschlossen werden, dass, ähnlich wie bei der „Waltzing“-Rattenmutante

im Long-Evans-Stamm (s. Kap. 5.2.5.2.), mit unseren Untersuchungsmethoden nicht

feststellbare Veränderungen des vestibulären Systems, die z.B. zu Abnormitäten in

der zentralen Prozessierung der vestibulären Information führen, als Ursache für das

Drehverhalten der ci3-Mutante in Frage kommen.

5.2.5.2. ci2-Mutante und Streptomycin-behandelte Tiere

KAISER et al. (2001) zeigten für die ci2-Mutante durch Ableitung von auditorisch

evozierten Potentialen eine Taubheit. Die Testungen zur Funktion des vestibulären

Systems erwiesen Defizite bei allen Tieren. Auch die histologische Untersuchung

zeigte Schäden im Bereich von Innenohr und Hirnstammkernen. Im Innenohr adulter

ci2-Tiere zeigte sich ein praktisch vollständiger Verlust des cochleären Neuroepithels

zusammen mit einer Degeneration von Zellen des Spiralganglions. Die cochleären

Kerngebiete zeigten eine reduzierte Kerngröße, sowie eine erhöhte Neuronendichte

(KAISER et al., 2001). Diese Befunde sind typische Charakteristika einer vorliegenden

Taubheit: die verringerte Zellgröße wird auf weniger afferente Eingänge aus der

Cochlea zurückgeführt, die erhöhte Zelldichte ist dann der Versuch, das verringerte

Kernvolumen zu kompensieren (WILLOTT et al., 1994; SAADA et al., 1996). Für junge,

ca. 4 Wochen alte, ci2-Tiere gibt es vorläufige Hinweise auf eine Schädigung der

vestibulären Haarzellen (KAISER et al., 2001). In den vestibulären Anteilen des

Innenohres adulter ci2-Ratten wurde jedoch kein offensichtlicher Haarzellverlust

deutlich. Es wurde von uns deshalb auf eine Regeneration der Haarzellen im

vestibulären System geschlossen, da für diese im Gegensatz zu den cochleären

Haarzellen eine Regenerationsfähigkeit nachgewiesen wurde (WARCHOL et al., 1993;

RUBEL et al., 1995; TANYERI et al., 1995). Die vestibulären Haarzellen adulter Tiere

zeigten allerdings Protrusionen des Cytoplasmas in den endolymphatischen Raum,

157

aus denen wir auf Veränderungen des Cytoskelettes der Zellen schlossen (KAISER et

al., 2001).

Die bei der ci2-Mutante entdeckten moderaten Veränderungen der vestibulären

Haarzellen finden sich in ähnlicher Form auch bei der tauben „Shaker-2“-

Mausmutante (ANNIKO et al., 1980), und auch die „Shaker-1“-Taubheits-Mutante der

Maus weist progressive Degenerationen vestibulärer Haarzellen auf (GIBSON et al.,

1995; SELF et al., 1998) (s. auch Kap. 2.8.1.). Darüber hinaus ähneln beide Mutanten

in ihrem Phänotyp mit Drehverhalten stark den ci2-Tieren. Da bei beiden Mutanten

Gene für unkonventionelle Myosine mutiert sind (ANNIKO et al., 1980; WEIL et al.,

1997; PROBST et al., 1998), sollte im Rahmen der Untersuchungen zur Genetik der

ci2-Mutante überprüft werden, ob Mutationen in den Genen für unkonventionelle

Myosine für den Phänotyp der ci2-Tiere eine Rolle spielen.

Neben den Übereinstimmungen mit diesen reinen Taubheitsmutanten gibt es jedoch

weitere Parallelen, die Hinweise auf mögliche Ursachen für das Drehverhalten der

ci2-Tiere liefern können. Die „Stargazer“ (stg)-Rattenmutante zeigt ebenfalls

Rotationsverhalten, welches aber im Gegensatz zu dem der ci2-Mutante nicht

lateralisiert ist, Hyperlokomotion, Opisthotonus und Taubheit (TRUETT et al., 1994).

Die histologische Untersuchung des Innenohres zeigte fortgeschrittene

Degenerationen der Haarzellen und von Zellen des akustischen Ganglions.

Zusätzlich wurden mit Hilfe von Funktionstests Defizite im vestibulären System

festgestellt. Es wurde vermutet, dass der „Stargazer“-Phänotyp durch eine gestörte

Entwicklung des Innenohres bedingt ist (TRUETT et al., 1994). Pharmakologische

Studien wiesen später aber auf eine herabgesetzte Empfindlichkeit der D2-

Rezeptoren hin, welche auch bei der ci2-Mutante vorliegt, so dass eine genetisch

vermittelte Dysfunktion des zentralen DA-Systems postuliert wurde (BROCK und

ASHBY, 1996). Der tatsächliche Anteil der Dysfunktionen von Innenohr und DA-

System am Phänotyp konnte für die stg bisher noch nicht geklärt werden. Ein

Komplementationstest zwischen der stg und der ci2- und ci3-Mutante (sowie

natürlich auch mit weiteren drehenden Rattenmutanten) ist sinnvoll, um

herauszufinden, ob es sich hier um Allele des gleichen, oder Allele unabhängiger

Gene handelt. Des weiteren sollte auch die Möglichkeit in Betracht gezogen werden,

dass es modulierende Hintergrundeffekte gibt, die den Phänotyp der einzelnen

Mutanten variieren, so dass LEW-/stg z.B. mit LEW-ci2 identische Phänotypen

158

zeigen könnte. Das Vorliegen solcher Hintergrundeffekte ließe sich durch die

Entwicklung congener Stämme aufdecken.

Bei der von RABBATH et al. (2001) beschriebenen „Waltzing“-Rattenmutante im Long-

Evans-Stamm tritt Circling-Verhalten zusammen mit Dysfunktionen in der

vestibulären Kontrolle von Haltung (Kopfhaltung nach abwärts) und Blick (Defizit des

horizontalen vestibulo-oculären Reflexes) auf. Schäden des vestibulären

Neuroepithels konnten bei adulten Tieren weder in licht- noch in

elektronenmikroskopischen Untersuchungen nachgewiesen werden. Aus diesem

Grund wurde angenommen, dass die vestibulären Dysfunktionen, die als Auslöser

für das Circling-Verhalten angesehen werden, Folge anderer Arten zellulärer

Veränderungen des Labyrinths und/oder Folge von Abnormitäten in der zentralen

Prozessierung der vestibulären Information sind (RABBATH et al., 2001). Solche

Veränderungen könnten natürlich auch bei der Entstehung des Phänotyps unserer

beiden Mutanten eine Rolle spielen. Ein Nachweis solcher Veränderungen ist

allerdings schwierig zu führen. Erst nach Ausschluß jeglicher anderer Ursachen für

das Drehverhalten und nach genauester Untersuchung aller vestibulären

Reflexantworten wäre eine solche Ursache wahrscheinlich.

Zur weiteren Klärung der Frage, welchen Anteil Veränderungen des Innenohres am

Rotationsverhalten und den weiteren Bewegungsanomalien der ci2-Mutante haben,

wurden über die ototoxische Wirkung des Streptomycins Ratten mit einem

Innenohrschaden erzeugt, wie von ALLEVA und BALAZS 1978 beschrieben. Deren

Phänotyp wurde anschließend mit dem Phänotyp der ci2-Mutante verglichen, wobei

sich starke Ähnlichkeiten zeigten. Die Streptomycin-behandelten Tiere zeichneten

sich durch lateralisiertes Rotationsverhalten, Hyperlokomotion und Opisthotonus aus.

Des weiteren konnte durch die Ableitung auditorisch evozierter Potentiale eine

Taubheit erwiesen werden. 6 Wochen nach Abschluß der Streptomycin-Behandlung

war das Schwimmvermögen der Tiere stark eingeschränkt. Über die Hälfte der

Ratten musste aus dem Wasser entnommen werden, um ein Ertrinken der Tiere zu

verhindern. Es ist davon auszugehen, dass der Grund für das Defizit im

Schwimmvermögen geschädigte vestibuläre Haarzellen sind (GRAY et al., 1988;

RABBATH et al., 2001). Die histologische Untersuchung der Haarzellen des

Innenohres direkt nach Beendigung der Streptomycin-Injektionsbehandlung zeigte

einen kompletten Verlust des cochleären Neuroepithels. In den histologischen

159

Untersuchungen der Volumina von Cochlear- und Vestibularkernen und der

Neuronenmorphologie zeigten sich, ähnlich der Befunde bei der ci2-Mutante (KAISER

et al., 2001), verminderte Kerngrößen und abgerundete Neuronenformen. Für die

cochleären Kerne ist bekannt, dass durch eine frühe Schädigung der Haarzellen und

die somit verminderten afferenten Projektionen auf die Kerngebiete die trophische

Unterstützung der Neurone entfällt, so dass es zu einer verminderten Entwicklung

der Kerngebiete kommt (MOORE et al., 1998). Die Taubheit der Tiere blieb über den

Beobachtungszeitraum von 7 Monaten bestehen, wie die erneute Ableitung

auditorisch evozierter Potentiale bewies. Dieses Ergebnis entsprach unseren

Erwartungen, denn cochleäre Haarzellen besitzen keine Fähigkeit zur Regeneration

(CORWIN, 1992). Interessanterweise regenerierte sich das Schwimmvermögen der

Tiere jedoch: am Ende der Beobachtungsperiode musste kein Tier vorzeitig aus dem

Wasserbecken entnommen werden. Da seit einiger Zeit bekannt ist, dass die

vestibulären Haarzellen, im Gegensatz zu den cochleären, regenerationsfähig sind

(s.o.), wurde die Verbesserung des Schwimmvermögens von uns auf eine

Regeneration der Haarzellen im vestibulären System zurückgeführt. Des weiteren

kam es einige Wochen nach Beendigung der Streptomycin-Injektionen zu einem

Rückgang des Rotationsverhaltens und der Hyperlokomotion, eine Beobachtung, die

auch von ALLEVA und BALAZS (1978) gemacht wurde. ALLEVA und BALAZS schlossen,

dass das durch Streptomycin-Behandlung entstehende neurologische Syndrom

sowohl den vestibulären Apparat, als auch höhere motorische Zentren mit

einschließt, und dass insbesondere für das Rotationsverhalten und die

Hyperlokomotion zentrale Bereiche verantwortlich zeichnen. In Folgestudien wurde

eine erhöhte D2-Rezeptorbindungsdichte im Striatum gefunden (SETH et al., 1982).

Eine solche Beobachtung konnte auch für die ci2-Mutante gemacht werden (RICHTER

et al., 1999). Warum aber sind Circling-Verhalten und Opisthotonus bei der ci2-

Mutante permanent ausgeprägt, bei den Streptomycin-behandelten Tieren hingegen

nur transient ? Es ist bekannt, dass vestibuläre Informationen über den Thalamus

auch zum Striatum transferiert werden (SHIROYAMA et al., 1999) und die vestibulären

Kerne in Basalganglienschaltkreise eingreifen können (SHIMA, 1984). Wenn nun früh

in der Ontogenese Abnormitäten im vestibulären System auftreten, so könnten diese

bestimmte, für die normale Hirnentwicklung notwendige, Projektionen zu den

Basalganglien stören und somit Veränderungen in Hirnregionen wie dem Striatum

160

bedingen, die permanent ausgeprägt bleiben. Die entstandenen sekundären

Veränderungen im DA-System bei der ci2-Mutante könnten dann verantwortlich für

das Circling-Verhalten sein. Die vestibulären Defizite hingegen könnten als Folge der

Veränderungen des Cytoskeletts der Haarzellen dieses Systems auftreten. Für viele

Mutanten (wie z.B. für die „Stargazer“-Mutante, s. TRUETT et al., 1994) ist jedoch

bekannt, dass bei der Geburt der Tiere das Innenohr noch intakt ist und es erst in

den ersten Tagen nach der Geburt zu Verlusten der Haarzellen kommt. Hier könnten

also auch Veränderungen des vestibulären Systems, die erst in der postnatalen Zeit

auftreten, an der Generierung permanenten Drehverhaltens beteiligt sein

Ein weiterer interessanter Aspekt ist die Tatsache, dass die ci2-Tiere eine

Drehpräferenz zusammen mit einer Asymmetrie im nigro-striatalen DA-System

aufweisen (LÖSCHER et al., 1996; RICHTER et al., 1999; FEDROWITZ et al., 2000), die

Veränderungen im cochleären und vestibulären System jedoch bilateral ausgeprägt

sind (KAISER et al., 2001). Eine genaue Zuordnung des Anteils dieser verschiedenen

Systeme am Phänotyp der ci2-Mutante und das Verständnis des Entstehens einer

Lateralität bleiben also schwierig und bedürfen weiterführender Untersuchungen. So

könnten Tracer-Studien Auskunft über eine physiologische oder pathologische

Ausbildung von Projektionsbahnen zwischen dem vestibulären System und zentralen

Bereichen geben. Studien zur metabolischen Aktivität auch der cochleären und

vestibulären Kerngebiete mittels der 2-Deoxyglukose-Methode (s. Kap. 5.5.) können

weitere Schlüsse auf die funktionellen Zustände dieser Systeme zulassen.

Abnormitäten in DA-Funktionen sind als Ursache für das Drehverhalten und die

Hyperlokomotion wahrscheinlich, wie aber lassen sich Opisthotonus und Ataxie der

Tiere erklären ?

Es sind sowohl Maus-, als auch Rattenmutanten, wie die „dilute-opisthotonus“ (dop)-

Rattenmutante, bekannt (DEKKER-OHNO et al., 1996; HUANG et al., 1998; FUTAKI et al.,

2000), die sich durch eine neurologische Störung mit Opisthotonus und Ataxie

auszeichnen. Als Ursache wurde eine Mutation im Gen für das unkonventionelle

Myosin 5A ausfindig gemacht, die zu Veränderungen des Endoplasmatischen

Retikulums der Purkinje Zellen des Cerebellums führt. Erneut ergibt sich hiermit ein

Hinweis auf veränderte Myosine, die verschiedene neurologische Symptombilder

bedingen können, und die einer Untersuchung bedürfen.

161

Ataxien können auf Läsionen des cerebellären Systems hindeuten (MASSAQUOI und

HALLETT, 1998). Zusätzlich sind solche Läsionen manchmal mit abnormen Haltungen

assoziiert. So führt die cerebelläre Ablation bei Katzen zu akuter Extensor-Rigidität

und Opisthotonus. Abnorme Kopfbewegungen können auch im Rahmen vestibulo-

cerebellärer Läsionen auftreten und auch Läsionen der Hemisphären scheinen als

Ursache in Frage zu kommen (MASSAQUOI und HALLETT, 1998).

Die motorischen Anomalien der ci2-Mutante ähneln des weiteren auch paroxysmalen

Tics, die z.B. im Rahmen eines Tourette-Syndroms auftreten können. So sind

einfache motorische Tics definiert als plötzliche, kurze, isolierte, myoklonusartige

Bewegungen, wie Kopfbewegungen, die aus einer normalen motorischen Aktivität

heraus entstehen (TOLOSA und JANKOVIC, 1998). Es wird angenommen, dass die

Basalganglien eine wichtige Rolle in der Pathogenese des Tourette-Syndroms

spielen. Substanzen, die die zentrale DA-Aktivität erhöhen, sorgen für eine

Exazerbation der Tics (JANKOVIC und ROHYAIDY, 1987), eine Beobachtung, die auch

für die ci2-Mutante zutrifft (LÖSCHER et al., 1996). Eine Erhöhung der DA-

Transporterbindung konnte im Striatum von Patienten mit Tourette-Syndrom

(MALISON et al., 1995) und im Striatum von ci2-Tieren (RICHTER et al., 1999)

nachgewiesen werden. Als weiteres Charakteristikum des Tourette-Syndroms wurde

eine erhöhte Sensitivität der DA-Rezeptoren postuliert (SINGER, 1997). Bei der ci2-

Mutante sind die DA-Rezeptoren jedoch im Vergleich mit den Kontrolltieren eher

hyposensitiv, ein zum Tourette-Syndrom gegensätzlicher Befund. Volumetrische

Magnet-Resonanz-Tomographien zeigten, dass die normale Asymmetrie der

Basalganglien beim Tourette-Syndrom verloren geht (PETERSON et al., 1993). In

Striatum und Thalamus von Tourette-Patienten wird darüber hinaus eine verminderte

metabolische Aktivität deutlich (EIDELBERG et al., 1997). Weitere Untersuchungen,

wie funktionelle neuroanatomische Studien der metabolischen Aktivität von

Hirnregionen mittels der 2-Deoxyglucose-Technik (SOKOLOFF et al., 1977), die

momentan mit ci2-Tieren durchgeführt werden, werden an dieser Stelle benötigt, um

genauere Schlussfolgerungen über die Art der Bewegungsstörung der ci2-Tiere

ziehen zu können.

162

5.3. Vergleichende Übersicht über die ci2-, ci3- und Streptomycin-behandelten

Tiere

Tab. 17: Vergleich der untersuchten Parameter zwischen ci2-, ci3- und Streptomycin-behandelten Tieren. Das Pluszeichen steht für ein Vorhandensein des Parameters, das Minuszeichen für die Abwesenheit. Die mit einem Fragezeichen versehenen Parameter wurden bislang noch nicht untersucht. Rotationsverhalten, Hyperlokomotion, Opisthotonus und Defizite der vestibulären Funktion waren bei den Streptomycin-behandelten Tieren nur transient (über einen Zeitraum von einigen Monaten nach Beendigung der Streptomycin-Behandlung) ausgeprägt und entwickelten sich danach wieder zurück. Tiergruppe Parameter

ci2 ci3 Streptomycin-behandelte LEW

Rotationen

+ + + (transient)

Drehpräferenz

+ + + (transient)

Hyperlokomotion + + + (transient) Opisthotonus + - + (transient) Ataxie + - - Dopamin-Lateralität im Striatum

+ (ipsilateral geringere

Konzentrationen)

+ (contralateral geringere

Konzentrationen)

?

Lateralität in der Dichte dopaminerger Neurone

+ (VTA) + (SNC) ? Verstärktes Rotationsverhalten nach D-Amphetamin

+ + (nachts)

-

Verstärktes Rotationsverhalten nach MK-801

+ + ?

Hemmung der Rotationen durch Haloperidol

+ + ?

Katalepsie durch Haloperidol

+ (signifikant schwächer

als bei Kontrollen)

+ ?

Taubheit + - + Gestörte vestibuläre Funktionen

+ - + (transient)

Morphologische Veränderungen cochleärer Kerngebiete

+ - +

Morphologische Veränderungen vestibulärer Kerngebiete

+ - +

Veränderungen im EEG - ? ?

163

5.4. Schlussbetrachtungen zur Bedeutung der ci2- und ci3-Mutante

Die Ergebnisse der zur Charakterisierung der ci2- und ci3-Mutante durchgeführten

Untersuchungen machen deutlich, dass wir es mit zwei Rattenmutanten zu tun

haben, denen ein lateralisiertes Rotationsverhalten und eine Hyperlokomotion

gemeinsam sind, die sich jedoch im weiteren Phänotyp unterscheiden.

Mit der ci3-Mutante wurde die erste Rattenmutante beschrieben, die ein

Drehverhalten bei normaler Funktion von cochleärem und vestibulärem System zeigt.

Das Rotationsverhalten kann hier wahrscheinlich nicht, wie in der Literatur oft

postuliert (BLOOM und HULTCRANTZ, 1994; TRUETT et al., 1994; PROBST und CAMPER,

1999), auf Innenohrdefekte zurückgeführt werden. Die bei Untersuchung der ci3-

Mutante erhaltenen Ergebnisse wurden von uns dahingehend interpretiert, dass die

Rotationen höchstwahrscheinlich die Folge der lateralisierten Abnormitäten im nigro-

striatalen DA-System sind. Damit eignet sich die ci3-Mutante sowohl zur

Untersuchung der funktionellen Lateralisierung von Hirnfunktionen, als auch als ein

neues Modell für Bewegungsstörungen, die mit abnormer Lateralisierung

einhergehen.

Im Gegensatz zur ci3-Mutante zeigt die ci2-Mutante sowohl Rotationsverhalten, als

auch Taubheit und gestörte vestibuläre Funktionen (LÖSCHER et al., 1996; RICHTER et

al., 1999; FEDROWITZ et al., 2000; KAISER et al., 2001). Damit weist die ci2 –Mutante

interessante Charakteristika als neues Modell in der Taubheitsforschung und für

Studien zu cochleären und vestibulären Dysfunktionen auf. Der Phänotyp der ci2-

Tiere macht sie darüber hinaus zu einem geeigneten Modell für hyperkinetische

Bewegungsstörungen. Der genetische Defekt führt bei der Mutante zu einer

klinischen Symptomatik, die auch bei humanen genetischen Störungen mit Taubheit

und Hyperkinesie, wie dem humanen Taubheits-Dystonie-Syndrom (JIN et al., 1996;

KOEHLER et al., 1999), ausgebildet wird, so dass sich mit Hilfe dieser Mutante

eventuell auch neue Erkenntnisse zu Ätiologie und Pathophysiologie solcher

Syndrome gewinnen lassen.

164

5.5. Ausblick

Für eine genaue Aufklärung von Ätiologie und Pathophysiologie des Phänomens

„Circling“ sind weiterführende Untersuchungen notwendig, die zum Teil bereits

durchgeführt werden.

Im Rahmen einer weiteren Doktorarbeit wird am Zentralen Tierlabor der

Medizinischen Hochschule Hannover an der genetischen Kartierung der Defektgene

der ci2- und ci3-Mutanten gearbeitet . Nach Klonierung und Charakterisierung der

Defektgene können dann weitere Schlüsse über die Art der Störung und beteiligte

Bereiche gezogen werden.

In Zusammenarbeit mit Herrn Dr. A. Schleicher und Herrn Prof. K. Zilles am Institut

für Hirnforschung der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf führen wir mit den

Mutanten 2-Deoxyglukose-Untersuchungen nach der Methode von SOKOLOFF et al.

(1977) durch. Diese Methode basiert auf der Glukose-Verwertung des Gehirns.

Radioaktiv-markierte 2-Deoxyglukose wird intaperitoneal appliziert und sammelt sich

in aktiven Hirnregionen an. Nach einem Beobachtungszeitraum von 45 Min. werden

die Tiere dann dekapitiert und es werden Kryostat-Schnitte des Gehirns angefertigt.

Anschließend wird die Menge der aufgenommenen 2-Deoxyglukose in

verschiedenen Kerngebieten autoradiographisch bestimmt. Dies ermöglicht die

Ermittlung abnorm aktiver Hirnregionen und damit die Auffindung weiterer, an den

motorischen Abnormitäten beteiligter, Bereiche, die dann mit Hilfe weiterführender

Methoden (Neuropathologie, Neurochemie, Mikrodialyse) näher untersucht werden

können.

Eine geeignete Methode, die mit Hilfe der 2-Deoxyglukose-Technik ausfindig

gemachten Bereiche einer näheren Untersuchung zu unterziehen, wäre auch die

Magnet-Resonanz-Tomographie. Diese erlaubt eine genaue Betrachtung und

Vermessung von Hirnregionen im Seitenvergleich und im Vergleich Mutante –

Kontrolle.

Darüber hinaus sind Untersuchungen mit der Technik der Mikrodialyse, die bei der

ci2-Mutante bereits angewandt wurde (FEDROWITZ et al., 2000), vor allem auch für die

ci3-Mutante sinnvoll, da mit dieser Technik die Funktionszustände verschiedener

Neurotransmittersysteme überprüft werden können.

165

Aus den erhaltenen Ergebnissen werden sich neue Hinweise auf durchzuführende

Studien ergeben.

166

6. Zusammenfassung

In Vorarbeiten und im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Rattenmutanten, die

LEW/Ztm-ci2 Mutante und die BH.7A/Ztm-ci3 Mutante, die sich durch anfallsweise

auftretendes, lateralisiertes Drehverhalten auszeichnen, charakterisiert. Ein solches

Drehverhalten wird von normalen Ratten bestimmter Stämme, so z.B. von Sprague-

Dawley Ratten, während ihrer nächtlichen Aktivitätsphase gezeigt und als Ausdruck

cerebraler Asymmetrien verstanden. Es wird als geeigneter Parameter angesehen,

um die funktionelle Lateralisierung von Hirnfunktionen näher zu untersuchen. In

Tiermodellen für bestimmte Hirnerkrankungen, wie dem Ungerstedt-Modell der Ratte

für den Morbus Parkinson, werden durch unilaterale Läsionen von Hirnregionen

Asymmetrien geschaffen, die Drehverhalten auslösen. Funktionelle und

morphologische Ungleichgewichte zwischen den Hemisphären, insbesondere im

Bereich des nigro-striatalen dopaminergen Systems, können sich also in

Rotationsverhalten äußern. Des weiteren sind verschiedene Maus- und

Rattenmutanten beschrieben, die in der Taubheitsforschung eingesetzt werden und

die neben der Taubheit ein massiv verstärktes Drehverhalten zeigen. Hier werden

die Rotationen auf Innenohrschäden zurückgeführt.

Aus vorangegangenen Untersuchungen war bekannt, dass sich die ci2-Mutante

phänotypisch durch lateralisiertes Drehverhalten, Hyperlokomotion, Opisthotonus

und Ataxie auszeichnet. Untersuchungen des dopaminergen Systems der ci2-

Mutante zeigten, dass hier eine Lateralität in diesem System vorliegt. Funktionelle

und morphologische Untersuchungen des cochleären und vestibulären Systems

erwiesen eine Taubheit und Funktionsdefizite des vestibulären Systems, sowie

morphologische Veränderungen des Innenohres und der cochleären und

vestibulären Hirnstammkerne.

Im Rahmen dieser Arbeit sollte eine weitere Charakterisierung der ci2-Mutante und

eine Erstcharakterisierung der ci3-Mutante vorgenommen werden. Für eine

weiterführende Charakterisierung des Rotationsverhaltens wurden erstmals

Videoaufnahmen der Tiere während der Hell- und der Dunkelphase angefertigt. Mit

Hilfe von Elektroencephalogrammen wurde bei der ci2-Mutante eine Epilepsie als

Ursache für die Rotationssalven ausgeschlossen. Bei der ci3-Mutante wurde, in

Anlehnung an frühere Untersuchungen zur ci2, das dopaminerge System in

167

neuropharmakologischen, neuropathologischen und neurochemischen Studien

überprüft. Um Funktion und Morphologie des auditorischen und vestibulären

Systems dieser Mutante zu untersuchen, wurden auditorisch evozierte Potentiale

abgeleitet und vestibuläre Reflexe getestet, sowie die Haarzellen des Innenohres

und die Kerngebiete beider Systeme im Hirnstamm histologisch untersucht.

Zusätzlich wurden mittels der Verabreichung des ototoxischen

Aminoglykosidantibiotikums Streptomycin normale Ratten des LEW/Ztm-

Inzuchtstammes Ratten mit einem Innenohrschaden erzeugt, um deren Phänotyp mit

dem Phänotyp der Mutanten, vor allem mit dem Phänotyp der ci2-Mutante, von der

bereits ein Innenohrschaden bekannt war, zu vergleichen.

Die Untersuchungsergebnisse machten deutlich, dass das Drehverhalten beider

Mutanten wirklich spontan (auch ohne Anwesenheit des Untersuchers, wie die

Videoaufnahmen bewiesen) auftritt. Die ci3-Mutante unterscheidet sich jedoch in

ihrem Phänotyp von der ci2-Mutante, denn sie zeigt zwar ebenfalls Drehverhalten

und eine leichte Hyperlokomotion, jedoch weder Opisthotonus noch Ataxie. Die

Untersuchung des dopaminergen Systems erwies für die ci3-Tiere ebenfalls eine

Lateralität im Dopamin-Gehalt des Striatums. Zusätzlich wurde eine signifikante

Asymmetrie in der Dichte dopaminerger Neurone der Substantia nigra pars

compacta gefunden. Die Funktionen von auditorischem und vestibulärem System

sind bei der ci3-Mutante, im Gegensatz zu denen der ci2-Mutante, normal.

Bei dem Vergleich des Phänotyps der Streptomycin-behandelten Tiere mit dem

Phänotyp der beiden Mutanten wurden starke Parallelen zwischen den ci2-Tieren

und den Streptomycin-behandelten Tieren deutlich. Die Streptomycin-behandelten

Tiere zeigten ebenfalls lateralisiertes Rotationsverhalten, Hyperlokomotion und

Opisthotonus, sowie Taubheit und gestörte vestibuläre Reflexe. Morphologische

Veränderungen der cochleären und vestibulären Hirnstammkerne, wie verminderte

Kerngrößen und veränderte Neuronenmorphologie, wurden in histologischen

Untersuchungen sichtbar. Der Hauptunterschied zwischen diesen Tieren und der ci2-

Mutante bestand darin, dass bei den Streptomycin-behandelten Tieren das

Rotationsverhalten und die Hyperlokomotion nur transient über einen Zeitraum von

einigen Monaten vorhanden waren, und nicht lebenslang wie bei der ci2. Diese

Tatsache gibt einen weiteren Hinweis darauf, dass das Rotationsverhalten der ci2-

168

Mutante nicht allein auf vestibuläre Defekte zurückgeführt werden kann, sondern

dass zentrale Bereiche bei der Generierung von Drehverhalten eine Rolle spielen.

Die Untersuchungsergebnisse lassen für die ci3-Mutante den Schluß zu, dass die

Ursache für das Drehverhalten bei diesen Tieren in den lateralisierten

Veränderungen im Bereich des dopaminergen Systems liegt, und diese Mutante

somit geeignet ist, die funktionelle Lateralisierung von Hirnfunktionen, sowie

Bewegungsstörungen mit abnormer Lateralisierung zu untersuchen.

Die ci2-Mutante, die gleichzeitig Taubheit und Rotationsverhalten aufweist, bietet die

Möglichkeit, Dysfunktionen des cochleären und vestibulären Systems näher zu

charakterisieren. Darüber hinaus kann sie als Modell für hyperkinetische

Bewegungsstörungen dienen.

169

Summary Lessenich, Alina: Characterization of two mutant rats with spontaneous circling behavior. 2002

Two mutant rats, the LEW/Ztm-ci2 mutant and the BH.7A/Ztm-ci3 mutant, were

characterized in prior studies and in the context of this thesis. Both mutants are

featured by attacks of lateralized circling behavior. Circling behavior is shown by

normal rats of certain strains, like the Sprague-Dawley strain, during their nocturnal

acitivity phase and is understood as an expression of cerebral asymmetry. It is

thought to be a suitable parameter to closer investigate the functional lateralization of

brain functions. In animal models for certain brain diseases, like the „Ungerstedt-

model“ of the rat for Parkinson`s disease, asymmetries are created by unilateral

lesions of brain regions, and thus circling behavior is triggered. Accordingly,

functional and morphological imbalances between the two hemispheres, particularly

within the nigro-striatal dopaminergic system, can evoke rotations. Furthermore,

numerous mouse and rat models are described, which are used in the field of

deafness research and which, in addition to deafness, show massive circling

behavior. In these cases, rotations are attributed to inner ear defects.

From prior studies it was known, that the ci2 mutant is featured by lateralized circling

behavior, hyperlocomotion, opisthotonus and ataxia. Investigations of the ci2`s

dopaminergic system revealed a laterality within this system. In functional and

morphological investigations of the cochlear and the vestibular system, deafness and

functional deficits of the vestibular system as well as morphological alterations of the

inner ear and of cochlear and vestibular brainstem nuclei were found.

In the context of this thesis, a further characterization of the ci2 mutant and a primary

characterization of the ci3 mutant should be undertaken. For further characterization

of the exhibited circling behavior, video recordings were accomplished during the

dark and the light phase. With the help of electroencephalograms, epilepsy was ruled

out as an underlying cause of rotations in the ci2 mutant rats. According to prior

studies in the ci2 mutant, the dopaminergic system of the ci3 mutant was

investigated in neuropharmacological, neuropathological and neurochemical studies.

For the purpose of studying function and morphology of the auditory and the

vestibular system in ci3 rats, auditory evoked potentials were recorded and vestibular

reflexes were tested. Additionally, inner ear hair cells and brainstem nuclei were

170

examined histologically. Furthermore, rats with an inner ear defect were created by

application of the ototoxic aminoglycoside-antibiotic streptomycin to normal

LEW/Ztm-rats for the reason of comparing their phenotype with the phenotype of the

two mutants.

The results of our investigations clearly showed, that the rotational behavior exhibited

by the two mutants is in fact spontaneous, since rotations were also shown in the

absence of any investigator. The phenotype of the ci3 mutant differs from that of the

ci2 mutant, in that the ci3 also shows circling behavior and a slight hyperlocomotion,

but neither opisthotonus nor ataxia. The investigation of the ci3s´ dopaminergic

system also revealed a laterality in dopamine content of the striatum. Furthermore, a

significant asymmetry in the density of substantia nigra pars compacta dopaminergic

neurons was found. In contrast to the ci2 mutant, the function of the auditory and the

vestibular system appeared normal in the ci3 mutant rat.

The comparison of the streptomycin-treated rats phenotype with the phenotype of the

two mutants revealed strong parallels between the streptomycin-treated rats and the

ci2 mutant. The streptomycin-treated rats also showed lateralized circling behavior,

hyperlocomotion and opisthotonus, as well as deafness and disturbed vestibular

reflexes. Histological examinations proofed morphological alterations of cochlear and

vestibular brainstem nuclei, like decreased size of nuclei and altered neuron

morphology. The main difference between those rats and the ci2 mutant rats was the

fact, that circling behavior and hyperlocomotion of the streptomycin-treated rats

persisted only transient for a few months after the streptomycin-treatment and not

lifelong as in the ci2 mutant. This gives a further hint, that the circling behavior of the

ci2 mutant cannot be attributed to vestibular defects only, but that central sites also

play a role in generating circling behavior.

The results imply, that the cause of circling behavior in the ci3 mutant lies in the

lateralized alterations of the dopaminergic system und that this mutant thus suits for

the investigation of functional lateralization of brain functions, as well as for the

investigation of movement disorders with abnormal lateralization.

The ci2 mutant, which exhibits deafness and rotational behavior at the same time,

offers the possibility of characterizing dysfunctions of the cochlear and the vestibular

system. Furthermore, it may serve as a model for hyperkinetic movement disorders.

171

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195

8. Tabellarischer Anhang

Tab. 18: Für die Anfertigung der histologischen Präparate eingesetzte Substanzen

unter Angabe des Verwendungszweckes und der Bezugsquelle.

Substanz Verwendung Bezugsquelle

Chloralhydrat Perfusion Merck, Darmstadt

Formaldehyd Perfusion Roth, Karlsruhe

Isotone Natriumchlorid-

Lösung

Perfusion,

TH-Immunhistologie

Merck, Darmstadt

Paraformaldehyd Perfusion Riedel-de-Haen, Seelze

Phosphatpuffer Perfusion Riedel-de-Haen, Seelze

Ammoniumnickelsulfat TH-Immunhistologie Fluka, Buchs, CH

1-Antiserum (Kaninchen-

anti-TH IgG)

TH-Immunhistologie Paesel und Lorei,

Frankfurt

2-Antiserum (Schwein-

anti-Kaninchen IgG)

TH-Immunhistologie DAKO, Hamburg

Bovines Serumalbumin TH-Immunhistologie Sigma, Deisenhofen

Diaminobenzidin TH-Immunhistologie Sigma, Deisenhofen

Entellan® TH-Immunhistologie,

Thioninfärbung

Merck, Darmstadt

Ethanol TH-Immunhistologie,

Thioninfärbung

CG Chemikalien, Laatzen

Schweineserum TH-Immunhistologie Paesel und Lorei,

Frankfurt

Triton X-100 TH-Immunhistologie Sigma, Deisenhofen

Wasserstoffperoxid TH-Immunhistologie Merck, Darmstadt

Xylol-Ersatz-Medium TH-Immunhistologie Roth, Karlsruhe

Chromalaun Thioninfärbung Merck, Darmstadt

Essigsäure Thioninfärbung Riedel-de-Haen, Seelze

Gelatine Thioninfärbung Merck, Darmstadt

Natronlauge Thioninfärbung Merck, Darmstadt

Thionin Thioninfärbung Sigma, Deisenhofen

196

Tab. 19: In der Neurochemie eingesetzte Chemikalien unter Angabe des Verwendungszweckes und der Bezugsquelle. Chemikalie Verwendung Bezugsquelle

DA Standard Sigma, Deisenhofen

3,4-Dihydroxyphenyl-

essigsäure

Standard Sigma, Deisenhofen

Homovanillinsäure Standard Sigma, Deisenhofen

Noradrenalin Standard Sigma, Deisenhofen

5-Hydroxytryptamin Standard Sigma, Deisenhofen

5-Hydroxyindolessigsäure Standard Sigma, Deisenhofen

Acetonitril Mobile Phase Merck, Darmstadt

Citronensäure-Monohydrat Mobile Phase Merck, Darmstadt

Ethylendiamintetraacetat Mobile Phase / Enteiweißung Merck, Darmstadt

Natriumhydroxyd-Plätzchen Mobile Phase Merck, Darmstadt

Natriumsulfit Enteiweißung Merck, Darmstadt

Octylhydrogensulfat Mobile Phase Merck, Darmstadt

Perchlorsäure 70 % Enteiweißung, Tagesstandard Merck, Darmstadt

Salzsäure 36 % Stammlösung Standards Merck, Darmstadt

197

ci3-Tiere:

VTA SNL SNC Region Tier

ipsi contra ipsi contra ipsi contra

1 5812 6382 7123 6838 6838 6234 2 6154 6382 4843 7692 7521 6553 5 7180 6268 7977 7692 7920 7408 6 5926 6496 5698 7122 7863 7009 9 6268 5499 6268 4558 7749 7237 BlHo2 7636 10123 7693 9117 9459 9630 BlHo5 9117 9915 7122 5983 9801 9972 Mean 6870,4 7295 6674,9 7000,3 8164,4 7720,4 SEM 453 714,6 425,6 545,1 403,9 559 BH.7A-Tiere:

VTA SNL SNC Region Tier

links rechts links rechts links rechts

3 6952 7635 6838 6553 8433 9345 4 9117 9231 7123 5413 7977 8376 7 6040 8091 6553 7977 9117 7521 8 6952 6724 8547 4843 6610 7009 10 5698 7066 6268 7692 7464 7009 11 5926 5128 4559 7408 8262 6325 Kontrolle 6154 7636 6268 7123 8148 9014 Mean 6691,3 7358,7 6593,7 6715,6 8001,6 7799,9 SEM 444,7 479,6 450,1 447,7 298,6 428,1 Tab. 20 + 21: Einzel- und Mittelwerte, sowie SEM der Neuronendichte [Neurone/mm³] in VTA, SNL und SNC bei ci3- und BH.7A –Ratten. Für die ci3-Tiere sind die Daten ipsi- und contralateral zur Drehrichtung aufgeschlüsselt, für die BH.7A-Tiere erfolgte eine Anordnung nach linker und rechter Hemisphäre.

198

ci3-Tiere:

Anteroventraler cochleärer Nucleus Region Tier

ipsi contra

1 0,467 0,580 2 0,419 0,247 5 0,381 0,406 6 0,465 0,528 9 0,315 0,347

Mean 0,409 0,422 SEM 0,028 0,060 BH.7A-Tiere:

Anteroventraler cochleärer Nucleus Region Tier

Links Rechts

3 0,474 0,396 4 0,476 0,426 7 0,459 0,542 8 0,408 0,379 10 0,424 0,417 11 0,427 0,509

Mean 0,445 0,445 SEM 0,012 0,027

Tab. 24 + 25: Einzel- und Mittelwerte, sowie SEM für die Volumenberechnung (mm3) des anteroventralen cochleären Nucleus bei ci3- und BH.7A -Ratten. Die Aufschlüsselung der Daten erfolgte für die Mutante nach ipsi- und contralateraler Hemisphäre, für die Kontrollen nach linker und rechter Gehirnhälfte.

199

ci3-Tiere:

Posteroventraler cochleärer Nucleus Dorsaler cochleärer Nucleus Region Tier

ipsi contra ipsi contra

1 0,745 0,538 0,962 0,725 2 0,610 0,640 0,620 0,957 5 0,641 0,579 0,590 1,081 6 0,586 0,574 0,692 0,677 9 0,571 0,532 0,516 0,838

Mean 0,631 0,573 0,676 0,856 SEM 0,031 0,019 0,077 0,074 BH.7A-Tiere:

Posteroventraler cochleärer Nucleus Dorsaler cochleärer Nucleus Region Tier

links rechts Links rechts

3 0,643 0,504 0,930 0,170 4 0,673 0,545 0,612 0,504 7 0,581 0,551 0,906 0,170 8 0,521 0,501 0,884 0,785 10 0,570 0,592 0,738 0,781 11 0,653 0,612 0,604 0,622

Mean 0,607 0,551 0,779 0,505 SEM 0,024 0,018 0,061 0,114

Tab. 26 + 27: Einzel- und Mittelwerte, sowie SEM für die Bestimmung der mittleren Kerngröße (mm²) des posteroventralen und des dorsalen cochleären Nucleus bei ci3- und BH.7A -Ratten. Die Aufschlüsselung der Daten erfolgte für die Mutante nach ipsi- und contralateraler Hemisphäre, für die Kontrollen nach linker und rechter Gehirnhälfte.

200

ci3-Tiere:

Superiorer vestibulärer Nucleus

Medialer vestibulärer Nucleus

Lateraler vestibulärer Nucleus

Inferiorer vestibulärer Nucleus

Region Tier ipsi contra ipsi contra ipsi contra ipsi contra

1 - - 0,552 0,607 0,167 0,194 0,231 0,184 2 0,709 0,133 0,642 0,572 - - 0,239 0,257 5 0,151 0,142 0,604 0,676 0,180 0,239 0,262 0,251 6 0,130 0,175 0,679 0,699 0,229 0,202 0,190 0,223 9 0,104 0,197 0,853 0,825 0,342 0,252 0,243 0,261 Mean 0,114 0,162 0,666 0,676 0,230 0,222 0,233 0,235 SEM 0,017 0,015 0,051 0,044 0,040 0,014 0,012 0,014 BH.7A-Tiere:





Region Tier links rechts links rechts Links rechts links rechts

3 0,122 0,818 0,523 0,523 0,198 0,153 0,175 0,212 4 - - 0,679 0,485 0,239 0,262 0,236 0,250 7 0,899 0,976 0,712 0,672 - - 0,171 0,237 8 0,129 0,120 0,475 0,581 0,188 0,166 0,199 0,196 10 0,139 0,139 0,597 0,589 0,218 0,176 0,203 0,204 11 0,155 0,151 0,563 0,596 0,193 0,210 0,181 0,174 Mean 0,127 0,118 0,592 0,574 0,207 0,193 0,194 0,212 SEM 0,011 0,013 0,037 0,026 0,095 0,020 0,099 0,011

Tab. 28 + 29: Einzel- und Mittelwerte, sowie SEM für die Bestimmung der Volumina (mm³) von superiorem, medialem, lateralem und inferiorem vestibulären Nucleus bei ci3- und BH.7A -Ratten. Die Aufschlüsselung der Daten erfolgte für die Mutante nach ipsi- und contralateraler Hemisphäre, für die Kontrollen nach linker und rechter Gehirnhälfte.

201

Streptomycin-behandelte Tiere: Region Tier

Anteroventraler cochleärer Nucleus

19/1 -

19/4 -

19/5 0,246

19/7 0,251

19/8 0,212

20/1 0,253

20/5 0,213

Mean 0,235

SEM 0,046

ci2/+-Tiere: Region Tier


1 0,500

2 0,388

3 0,446

4 0,327

5 0,590

6 0,286

7 0,505

8 0,196

Mean 0,405

SEM 0,009

ci2/ci2-Tiere: Region Tier


1 0,315

2 0,205

3 0,310

4 0,349

5 0,287

Mean 0,293

SEM 0,024

Tab. 30 + 31: Einzel- und Mittelwerte, sowie SEM für die Volumenberechnung (mm³) des anteroventralen cochleären Nucleus bei Streptomycin-behandelten Ratten, ci2/+-Ratten und ci2/ci2-Ratten.

202


Posteroventraler cochleärer Nucleus

Dorsaler cochleärer Nucleus

19/1 - 0,439 19/4 0,253 0,527 19/5 0,235 0,302 19/7 0,289 0,236 19/8 0,332 0,261 20/1 0,299 0,421 20/5 0,282 0,755

Mean 0,282 0,420 SEM 0,014 0,069 ci2/+-Tiere: Region Tier

Posteroventraler Cochleärer Nucleus


1 0,678 0,814 2 0,655 0,845 3 0,276 0,342 4 0,530 0,594 5 0,484 0,390 6 0,447 0,419 7 0,527 0,430

Mean 0,515 0,548 SEM 0,052 0,079 ci2/ci2-Tiere: Region Tier

Posteroventraler cochleärer Nucleus


1 0,449 0,392 2 0,561 0,442 3 0,308 0,383 4 0,366 0,372 5 0,315 0,310 6 0,504 0,377 7 0,401 0,585

8 0,443 0,396

Mean 0,418 0,407 SEM 0,031 0,028 Tab. 32 + 33: Einzel- und Mittelwerte, sowie SEM für die mittleren Kerngrößen (mm²) des posteroventralen und des dorsalen cochleären Nucleus bei Streptomycin-behandelten Ratten, ci2/+-Ratten und ci2/ci2-Ratten.

203






19/1 0,060 0,618 0,231 0,501

19/4 0,062 0,521 0,194 0,493

19/5 0,045 0,326 - -

19/7 0,059 0,424 0,175 0,382

19/8 0,125 - 0,334 0,584

20/1 - - - 0,511

20/5 0,072 0,567 0,249 0,439 Mean 0,070 0,574 0,212 0,485 SEM 0,012 0,052 0,013 0,028 ci2/+-Tiere: Region Tier





1 0,225 0,879 0,504 0,382

2 0,236 0,977 0,449 0,265

3 0,306 0,971 0,467 0,354

4 0,323 1,105 0,597 0,433

5 0,090 0,962 0,444 0,433

6 0,162 1,223 0,423 0,408

7 0,204 0,785 0,390 0,261

8 0,212 1,021 0,483 0,405 Mean 0,220 0,990 0,470 0,368 SEM 0,026 0,047 0,022 0,025 ci2/ci2-Ratten: Region Tier





1 0,074 0,497 0,265 0,216

2 0,256 0,589 0,881 0,240

3 0,191 0,733 0,469 0,179

4 0,135 0,319 0,192 0,386

5 0,176 0,752 0,433 0,468

6 0,199 0,687 0,579 0,281

7 0,164 0,804 0,142 Mean 0,171 0,626 0,423 0,295 SEM 0,021 0,065 0,097 0,045 Tab. 34 + 35: Einzel- und Mittelwerte, sowie SEM für die Volumina (mm³) von superiorem, medialem, lateralem und inferiorem vestibulären Nucleus bei Streptomycin-behandelten Ratten, ci2/+-Ratten und ci2/ci2-Ratten.

204

Tier Fläche [µ2m] Kreisfaktor Umfang (µm) ci3 ipsi contra ipsi contra ipsi contra

9 215,74 178,73 0,630 0,668 63,3 58,4 2 166,19 194,35 0,641 0,695 58,5 60,9 6 279,15 186,25 0,722 0,641 69,8 61,4 1 171,39 222,32 0,664 0,687 54,6 63,8 5 192,36 221,72 0,750 0,673 58,1 64,7

Mean 204,97 200,67 0,681 0,673 60,9 61,8 SEM 20,50 9,06 0,023 0,009 2,6 1,1

BH.7A links rechts links rechts links rechts

10 208,57 230,37 0,644 0,646 66,1 66,3 11 206,92 208,44 0,714 0,668 60,6 62,4 4 209,51 228,04 0,728 0,664 61,7 65,8 7 232,36 196,50 0,643 0,672 65,1 58,2 3 215,85 227,07 0,682 0,670 63,5 62,5 8 230,42 237,43 0,694 0,683 65,2 65,5 Mean 217,27 221,31 0,684 0,667 63,7 63,5 SEM 4,64 6,33 0,014 0,005 0,9 1,3

Tab. 36: Einzeltierdaten mit Mittelwerten und SEM von Fläche, Kreisfaktor und Umfang für die Durchschnittswerte von 25 Neuronen je Seite im anteroventralen cochleären Nucleus von ci3-Tieren und BH.7A-Tieren. Die Werte sind für die ci3-Mutante nach ipsilateraler und contralateraler Hemisphäre aufgeschlüsselt, für die Kontrollen erfolgte eine Gruppierung nach linker und rechter Gehirnhälfte.

Tier Fläche (µm²) Kreisfaktor Umfang (µm) Streptomycin-

behandelte Tiere


Streptomycin- behandelte Tiere


Streptomycin- behandelte Tiere


1 191,95 227,80 186,53 0,65 0,60 0,76 60,93 69,50 55,37 2 175,00 169,32 152,13 0,71 0,64 0,76 54,69 58,37 50,15

3 181,00 244,52 185,23 0,72 0,62 0,79 56,02 70,13 54,17

4 194,48 217,69 178,24 0,73 0,64 0,81 60,47 65,79 52,52

5 207,11 213,24 173,46 0,76 0,63 0,79 61,50 65,17 52,47

6 223,70 202,03 172,55 0,73 0,61 0,74 65,69 64,64 60,38

7 203,75 176,40 215,95 0,75 0,64 -- 61,59 59,33 --

Mean 196,71

207,29

180,58

0,72

0,63

0,78

60,13

64,70

54,18

SEM 6,23

10,20

7,30

0,01

0,01

0,01

1,4

1,7

1,44

Tab. 37: Einzeltierdaten mit Mittelwerten und SEM von Fläche, Kreisfaktor und Umfang von 50 Neuronen im anteroventralen cochleären Nucleus für Streptomycin-behandelte Tiere, ci2/+-Tiere und ci2/ci2-Tiere. Es wurden hier die Durchschnittswerte von 25 Neuronen je Seite bestimmt und anschließend aus den Werten der beiden Seiten der Mittelwert gebildet.

205

Tier/ Präferenz

Substantia nigra li [ng/g]

Substania nigra re [ng/g]

Nucleus accumbens li [ng/g]

Nucleus accumbens re [ng/g]

Striatum li [ng/g]

Striatum re [ng/g]

NA 392,78 185,77 904,23 1791,86 77,11 154,45 DOPAC 175,93 121,13 622,88 275,48 1169,72 1273,20 DA 819,87 618,20 3522,48 1682,03 12663,60 12417,40 5-HIAA 370,86 360,58 177,97 200,52 220,95 325,13 HVA 87,83 61,47 223,31 85,94 716,47 869,18

E 001/1 links

5-HT 901,03 894,77 590,90 706,70 322,15 343,40 NA 159,77 218,33 1019,59 1294,01 164,87 386,03 DOPAC 142,63 94,37 358,84 82,82 1800,85 1156,68 DA 727,37 496,59 2523,74 490,04 13821,90 9093,70 5-HIAA 492,93 283,99 181,79 148,10 298,48 416,70 HVA - 94,14 164,89 31,35 881,65 711,04

E 001/2 links

5-HT 1108,26 374,29 642,69 383,49 399,98 487,02 NA 144,82 199,73 1027,36 1030,67 86,66 187,25 DOPAC 116,38 191,39 447,55 526,47 1515,00 1189,42 DA 525,55 751,30 2338,93 2817,68 12831,10 11009,40 5-HIAA 259,95 533,44 249,34 252,89 270,68 300,31 HVA 85,19 - 159,84 234,42 828,26 838,60

E 5/10 links

5-HT 719,74 1164,80 654,03 701,63 277,35 450,18 NA 392,13 182,38 502,84 732,80 99,40 98,95 DOPAC 232,14 107,00 315,17 472,70 1395,06 1185,99 DA 1193,03 604,57 1693,48 3048,94 12167,30 11076,10 5-HIAA 466,50 314,07 412,59 325,84 301,15 283,05 HVA 125,47 74,68 206,81 223,85 929,13 824,93

E 5/11 links

5-HT 1263,62 841,11 478,47 635,16 453,34 470,53

NA 408,32 195,58 873,63 566,03 110,56 85,28 DOPAC 159,26 114,35 517,78 475,76 2105,19 1318,38 DA 953,64 622,47 3417,90 2633,80 13257,20 13087,60 5-HIAA 396,98 271,40 117,19 124,83 317,91 446,69 HVA 432,88 222,76 286,50 306,91 748,05 838,85

157 links

5-HT 893,82 687,15 1559,84 363,84 313,15 338,93 NA 184,74 55,90 1042,13 1031,92 83,12 128,04 DOPAC 212,65 66,45 597,63 327,89 1639,34 1768,33 DA 1586,82 398,00 3162,61 2091,80 11862,70 13278,00 5-HIAA 228,29 201,75 411,35 117,51 311,62 365,79 HVA 217,61 117,65 309,81 130,22 693,13 775,90

158 rechts

5-HT 602,05 2246,59 708,41 387,88 324,20 390,07

Tab. 38: Einzeltierdaten Neurochemie. Angegeben sind die gemessenen Mengen ng Monoamin pro g Hirngewebe in Substantia nigra, Nucleus accubmens und Striatum der linken und rechten Hemisphäre von ci3-Tieren. Unter Kenntnis der Drehpräferenz erfolgte anschließend eine Aufschlüsselung der Werte ipsilateral und contralateral zur Drehrichtung. NA: Noradrenalin; DOPAC: Dihydroxyphenylessigsäure; 5-HIAA: 5-Hydroxyindolessigsäure; HVA: Homovanillinsäure; 5-HT: 5-Hydroxytryptamin

206

Substantia nigra: Monoamin Mean

ipsi Mean contra

SEM ipsi

SEM contra

Dopamin 769,6 780 117,6 164,71 Noradrenalin 259 194,4 63,78 5,52 DOPAC 148,80 140,15 22,8 20,1 5-HIAA 364,8 332 46,7 44,1 HVA 169,80 134,1 66,2 35,5 5-HT 1188,80 760,70 225,2 110,7 Nucleus accumbens: Monoamin Mean

ipsi Mean contra

SEM ipsi

SEM contra

Dopamin 2598,1 2305,9 298,5 422 Noradrenalin 893,3 1076,3 82,9 177,1 DOPAC 431,7 405,1 49,6 77,9 5-HIAA 209,4 243,9 45,3 44,7 HVA 195,3 198,7 22,8 47,1 5-HT 719 583,2 173,3 67,2 Striatum: Monoamin Mean

ipsi Mean contra

SEM ipsi

SEM contra

Dopamin 13003 11424,5 234,8 567,7 Noradrenalin 111,11 165,85 13,0 47,2 DOPAC 1625,7 1293,8 135,9 73,4 5-HIAA 295,8 347,3 19,7 27,6 HVA 813,2 796 33,3 30,4 5-HT 359,3 402,4 26,9 30,4 Tab. 39 – 41: Mittelwerte und SEM der bei ci3-Tieren gemessenen Monoamin-Konzentrationen in Substantia nigra, Nucleus accumbens und Striatum. Es erfolgte eine Aufschlüsselung nach ipsi- und contralateral zur Drehrichtung.

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Danksagung

Herrn Prof. Dr. W. Löscher gilt mein großer Dank für die Überlassung des Themas, die wissenschaftliche Anleitung bei der Durchführung der Versuche und der Abfassung dieser Ph.D.-Arbeit und besonders für die stets gewährte freundliche Unterstützung. Weiterhin bedanke ich mich bei Herrn Prof. Dr. H.-J. Hedrich, Institut für Versuchstierzucht und Zentrales Tierlabor der Medizinischen Hochschule Hannover, für die Überlassung der Tiere und die freundliche Betreuung während des Ph.D.-Studiums; Frau Prof. Dr. E. Zimmermann ebenfalls für die freundliche Betreuung während der Ph.D.-Zeit; Frau Prof. Dr. A. Richter für die freundliche Unterstützung und wissenschaftliche Anleitung bei der Abfassung der Ph.D.-Arbeit; Frau Dr. M. Fedrowitz für die umfangreiche Einführung in die Thematik und die Erläuterung zahlreicher Methoden; Herrn Dr. F. Tergau und Herrn PD Dr. U. Ebert für die freundliche Hilfe bei der Ableitung und Auswertung der EEGs; Frau C. Bartling und Herrn M. Weißing für die große Hilfe bei den histologischen Arbeiten; Frau M. Gramer und Frau M. Halves für die nützlichen Anregungen und die tatkräftige Mitwirkung bei der HPLC-Analytik.; Herrn Dr. S. Lindemann für die vollbrachte Betreuungsleistung; den Tierpflegern, insbesondere der Tierpflegermeisterin Frau G. Zivkovic für die sorgsame Betreuung der Tiere; allen Mitarbeitern des Instituts herzlich für die freundliche Aufnahme und die immer gewährte Hilfsbereitschaft; der H. Wilhelm Schaumann Stiftung für die Gewährung eines Stipendiums; der DFG für die Bereitstellung von Mitteln im Rahmen des Antrages LO 274/8-1. Und Papa und Mama: vielen, vielen Dank für alles ! Ich liebe Euch. Und Oma: Dich natürlich auch !

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Erklärung

Zur Anfertigung der Ph.D.-Arbeit wurden folgende Hilfen Dritter in Anspruch genommen: Herr Dr. A. Kaiser (wissenschaftlicher Angestellter am Institut für Zoologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover) führte in einer Kooperation mit unserer Arbeitsgruppe die histologische Untersuchung des Innenohres, sowie die Ableitung der auditorisch evozierten Potentiale durch; Herr Dr. S. Lindemann (wissenschaftlicher Angestellter am Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover) führte die HPLC-Analytik durch und arbeitete als Projektleiter mit mir zusammen an den durchgeführten Studien; Frau C. Bartling (Technische Angestellte am Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover) war an einigen Perfusionen der Versuchstiere beteiligt; Herr M. Weißing (Technischer Angestellter am Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover) führte die immunhistochemische Färbung durch.

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Charakterisierung zweier Rattenmutanten mit spontanem ... · Aus dem Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover Charakterisierung