Chemilumineszenz – eine universelle … – eine universelle Detektionsmethode in der HPLC für stickstoffhaltige Substanzen Dr. Christian Langfermann AMI Arzneimitteluntersuchungsinstitut

Chemilumineszenz – eine universelle Detektionsmethode in

der HPLC für stickstoffhaltige Substanzen

Dr. Christian Langfermann AMI Arzneimitteluntersuchungsinstitut-Nord GmbH, Bremen, Germany

E-Mail: [email protected]

DPhG Fachgruppensymposium Arzneimittelkontrolle/Pharmazeutische Analytik 10.10.2012 Greifswald

Gliederung

• Systemvoraussetzungen • Einsatzzweck • Prinzip der Chemilumineszenz • Eigenschaften • Response-Regeln (Literatur) • Leistungsfähigkeit (Linearität, Präzision,

Selektivität, Richtigkeit) • Beispiele


Antek 8060 CLND Quant NQAD QT-500

NQAD

CLND

CLND:Chemiluminescence Nitrogen Detector NQAD: Nano Quantity Analyte Detector


Systemvoraussetzungen

• Gasversorgung – Argon / Helium: 50 ml/min / 4-5 bar – Sauerstoff: 300 ml/min / 4-5 bar

• HPLC – Neues System – Gereinigtes System, wenn stickstoffhaltige Eluenten

(Acetonitril) verwendet wurden • Ersatz des Degassers

– Mobile Phasen: Kein Stickstoff (kein Acetonitril, Ammoniumsalze), flüchtig

• A/D Wandler


Einsatzzweck

• Quantitative Bestimmung stickstoffhaltiger Substanzen (Wirkstoff/Verunreinigungen) – Keine spezifische Referenzsubstanz – Kein Chromophor erforderlich

• Identitätsnachweis parallel durch

– HPLC/MS (Ionenfalle/TOF), GC/MS – Referenzstandards für qualitative Zwecke


Prinzip der Chemilumineszenz

• Definition: Emission von Licht im sichtbaren Bereich durch eine chemische Reaktion

• Versprühen des HPLC-Eluenten mit Sauerstoff • Pyrolyse aller Probenbestandteile mit Sauerstoff

bei 1050°C • Quantitative Oxidation der stickstoffhaltigen

Bestandteile zu NO • Oxidation des NO in der Detektorzelle mit Ozon

zu NO2* (angeregter Zustand)

• Emission von Licht bei Rückkehr in den Grundzustand


Prinzip der Chemilumineszenz

Membrantrockner

Ofen 1050°C Pyrolyse

R-N + O2 ’ NO + H2O +CO2

und andere Oxide

HPLC

Ar, O2 Abfall Reaktor

NO + O3 ’ NO2

* ’ NO2

Ozon- Generator

O3

Photo- multiplier

Vakuum- Pumpe

Daten-Aufnahme

H2O

* : angeregter Zustand

hν


Eigenschaften des Detektors

VORTEILE – Sehr empfindlich für alle stickstoffhaltigen Substanzen – Auch für flüchtige Substanzen geeignet – Signalhöhe unabhängig von der Zusammensetzung

der mobilen Phase – Gradientenkompatibel – Lineares Signal – Kein Chromophor erforderlich – Kalibration mit anderen stickstoffhaltigen Substanzen

möglich, wenn Referenzsubstanzen nicht verfügbar sind


Eigenschaften des Detektors

NACHTEILE – Sehr empfindlich für alle stickstoffhaltigen Substanzen – Keine stickstoffhaltigen HPLC-Eluenten (Acetonitril,

Ammoniumsalze…) – Sauberes Arbeiten (Stickstoff ist überall) – Response bei benachbarten Stickstoffatomen im

Molekül nicht equimolar


Response (Literatur)

• Signal proportional zur Menge an NO • Azogruppen werden nicht detektiert • N-N-Bindungen ergeben ca. ~ 50 % Signal

-N=N- ’ N2

2 -N-N- ’ 2 NO + N2

-N- ’ NO


Gliederung

• Systemvoraussetzungen • Einsatzzweck • Prinzip der Chemilumineszenz • Eigenschaften • Response-Regeln (Literatur) • Leistungsfähigkeit (Linearität, Präzision,

Selektivität, Richtigkeit) • Beispiele


Linearität

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

10 15 20 25 30 35

N

NN

N

CH3

O

CH3

CH3O

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

1 2 3 4 5

r = 0,99989

2 4 6 8 1

m V

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

1 4 0

A D C 1 B , A n t e k C L N D ( 2 0 0 1 1 1 0 2 \ C L N D 0 0 0 2 . D )

5.6

21

Coffein

µg/ml N


Linearität

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

10 15 20 25 30 35

NH2

O

O

N CH3

CH3

-20

-15

-10

-5

0

5

10

15

20

25

1 2 3 4 5

r = 0,99990

2 4 6 8 1

m V

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

1 4 0

A D C 1 B , A n t e k C L N D ( 2 0 0 1 1 1 0 2 \ C L N D 0 0 0 8 . D )

7.9

77

Procain

µg/ml N


1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

10 15 20 25 30 35

Linearität

N

NN

N

CH3

O

CH3

CH3O

r = 0,99934

NH2

O

O

N CH3

CH3

-80

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

µg/ml N


Präzision (Sechsfach-Injektion Procain)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

1 2 3 4

CLND DAD

%


Langzeitstabilität (Procain)

• ~90 Injektionen in 70 Stunden • Kein Trend • RSD 0,94 %

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

0 20 40 60 80

Are

a C

LN

D

Injection


Selektivität

• PDE-5 Hemmer in pflanzlicher Matrix

• Selektiv für stickstoff-haltige Substanzen 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5

m A U

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

2 5 0

3 0 0

3 5 0

D A D 1 A , S ig = 2 1 0 ,1 0 R e f = 4 5 0 ,1 0 0 ( 3 1 0 1 1 1 0 1 \C L N D 0 0 1 6 .D )

3.9

97 4

.573

9.3

04

10.

315

12.

326

14.

098

14.

699

5 1 0 1 5 2 0 2 5

m V

2 0

2 5

3 0

3 5

4 0

4 5

5 0

5 5

A D C 1 B , A n te k C L N D (3 1 0 1 1 1 0 1 \C L N D 0 0 1 6 .D ) 4

.963

15.

129 CLND

DAD

Hydroxyhomo-sildenafil

Hydroxyhomo-thiosildenafil


Sensitivität

• 20 ng Coffein on column (entspricht 6 ng Stickstoff) • S/N-Verhältnis 40


min0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

mV

22.9

22.95

23

23.05

23.1

23.15

23.2

23.25

23.3

ADC1 B, CLND (270812OQ\CLND0007.D)

Are

a: 1

.977

1

0.2

61

Richtigkeit– Kalibration mit Procain Substanzen mit isoliertem Stickstoff

Br

Br

NH2

NH

OH

Ambroxol: 101,4 %

N

NN

N

CH3

O

CH3

CH3O

Coffein: 98,5 %

CH3

NH OH

OH

OH

Dobutamin: 94,4 %

NH

OH

CH3

CH3

Ephedrin: 103,3 %

NH

O

O

CH3CH3

O

OCH3

Cl

Cl

CH3

Felodipin: 94,0 %

N N

O CH3

Fentanyl: 94,0 %


Richtigkeit– Kalibration mit Procain Substanzen mit isoliertem Stickstoff

Paroxetin: 98,8 % Sertralin: 100,3 % Yohimbin: 98,5 %

Physostigmin: 103,3 % Tadalafil: 94,2 %

O

O

O

NH

F

NH

CH3

Cl

Cl

NH

N

OH

O

O

CH3

N

NONH

O

CH3

CH3

CH3

CH3

NH

N

N

O

O

O

OCH3


Richtigkeit– Kalibration mit Procain Substanzen mit benachbartem Stickstoff

Phenylbutazon: 93,7 % Theoretisch: 50 %

Phenazon: 87,9 % Theoretisch : 50 %

Candesartancilexetil: 48,8 % Theoretisch : 66,6 %

Sildenafil: 91,6 % Theoretisch : 83,3 %

N N

O O

CH3

NNCH3

CH3

O

N

N

O O

OCH3

OO

O

CH3

NNH

NN

O

CH3

S O

O

NNCH3

NH

N

N

N

O CH3

CH3


Flunitrazepam

min5 10 15 20 25

mV

20

40

60

80

100

120

140

ADC1 B, CLND (28101102\IDEN0002.D)

15.

222

min5 10 15 20 25

mV

20

40

60

80

100

120

140

160

ADC1 B, CLND (28101102\IDEN0003.D)

15.

181

Kalibrierung mit Nitrazepam

Flunitrazepam

N

N

CH3 O

F

N+O

-

O

N

N

CH3 O

N+O

-

O

• Abgleich Flunitrazepam/Nitrazepam:100,1 % • Flunitrazepam Tabletten: 0,990 mg/Tabl.

(99,0 % der Dekl.)

Flunitrazepam

-12 -10

-8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8

1 2 3 4 5 6 7 8

Residuen

0 200 400 600 800

1000 1200 1400 1600 1800 2000

0,000 0,050 0,100 0,150 0,200

Mes

swer

te

Konz. [mg/ml]

Kalibration

Kalibration Proben Kal.-Gerade


Telmisartan

2 4 6 8 1 0 1 2

m V

2 0

2 5

3 0

3 5

4 0

4 5

A D C 1 A , C L N D ( 0 6 0 3 1 2 0 2 \ G E H A L T 0 8 . D )

2.1

05

2 4 6 8 1 0 1 2

m V

2 4

2 6

2 8

3 0

3 2

3 4

3 6

A D C 1 A , C L N D ( 0 7 0 3 1 2 0 1 \ G E H A L T 1 9 . D )

1.7

15

8.8

97

Kalibrierung mit Coffein

Hydrochloro-thiazid Telmi-

sartan

N

NN

N

O

CH3

O

CH3

CH3

O

OH

NN

N

N

CH3 CH3

CH3


Telmisartan

0

50

100

150

200

0,000 0,020 0,040 0,060

Mes

swer

te

Konz. [mg/ml]

Kalibration

Kalibration Proben Kal.-Gerade -2

-1,5

-1

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

1 2 3 4 5 6 7 8

Residuen

O

OH

NN

N

N

CH3 CH3

CH3

NN

CH3

O OH

O

OH

S

Telmisartan Tabletten: 91,6 % der Deklaration Wiederfindung Eprosartan: 99,6 %


Eprosartan Telmisartan

JWH 250 / JWH 122

N

O

CH3

O

CH3

JWH-250 0,326 mg/g

N

O

CH3

CH3

JWH-122 0,103 mg/g


min0 5 10 15 20 25 30 35

mV

20

40

60

80

100

ADC1 B, CLND (CANNA2\GEHALT01.D)

25.

392

26.

508

JWH-250/JWH-122

Wiederfindung JWH-018 99,7 %

N

CH3

O

min1 2 3 4 5 6 7

mV

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

ADC1 B, CLND (CANNA\GEHALT17.D)

3

.7

79

Kalibrierung mit Procain

JWH-250

JWH-122

NH2

ON CH3

CH3O


Zusammenfassung

• Lineares Signal • Sehr gute Präzision • Robust und stabil • Selektiv für stickstoffhaltige Substanzen • Equimolar für Analyten ohne benachbarte

Stickstoff-Atome • Nicht equimolar für N-N-haltige Verbindungen,

kein einheitlicher Umrechnungsfaktor - Einsatz von ähnlichen Referenzsubstanzen


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