78 ]3ericht: Spezielle analytische Methoden.

Sflicagel a u f z u b e w a h r e n . - 250 ml Urin s~uert man mit 25 ml 40~oiger H~SO~ (v/v) an, nach Zusatz yon 50 ml Benzol wird 3 rain gekoeht, sehnell abgekfihlt~ das Benzol abgetrennt und die Extraktion unter Kochen am RiickfluB noch zwei- mal mit 50 und 40 ml Benzol wiederholt. Die vereinigten Extr~,kte werden einmal mit 30 ml Wasser, viermal mit 30 ml 2 n I%tronlauge und dreimul mit je 30 ml Wasser gewaschen. Das V o h m e n ffillt man mit Benzol auf 150 ml auf und verdampft 2 Portionen yon 5 ml zur Trockne. Die letzten Spuren yon ]3enzol werden im Vakuum entfernt und die 17-Ketosteroide nach W. Z I ~ a - E ~ J ~ 1 wie folgt be- s t immt: (Es ist dabei wiehtig, auf den Wassergehalt zu achten, da die Farbent- wieklung auch durch verh~Itnism~Big geringen Wassergehal~ sehr gehemmt wird.} Der Rfickstand wird in 0,2 ml reinem Alkohol gelSst, 0,2 ml DinitrobenzollSsung werden zugesetzt, desgleichen 0,2 ml alkoholische KOH-LSsung. Die Ansatze ein- schliel]lich der Leerwerte bleiben 1 Std bei 25 ~ C im Dunkeln stehen, werden dann mit Alkohol auf 10 ml aufgeffillt und bei 520 m# photometriert. Von dem rest- lichen Extrakt werden 135 ml auf 2--3 ml eingedampft, dann vorsichtig zur Troekne gebraeht. Der Rfickstand wird in 9 ml reinstem Benzol durch Er- wiirmen gelSst. I-Iiervon entnimmt man einen aliqnoten Tefl, der 1,8 mg rohen 17-Ketosteroiden entsprich~, verdampft wieder zur Trockne, setzt dann 0,1 ml Eisessig und 5 nag GIRA~DS Reagens zu, erhitzt leich~ verschlossen 4 rain im Wasser- bad, versetzt dann mit 4 ml 2,1~oiger 1X~CQ-LSsung,entfernt CO~ mtiglichst voll- st~tndig und extrahiert dreimal mit je 4 ml ~ther. Der Ather wird mit 2 ml Wasser gewasehen und dieses mit dem wal3rigen Extrakt vereinigt. Der wiil~rige Extrakt wird mit 0,5 ml konzentrierter Salzs~ure anges~uert, der Scheidetrichter gut aus- gewasehen, das Volumen auf 8 ml aufgeffillt und die saure LSsung 3--5 rain auf 50--60 ~ C, zum Schhil~ noch 5 rain im kochenden Wasserbad erhitzt, um die Hydra- zone zu ersetzen. Der wi~13rige Extrakt wird jetzt dreimal mit je 4 ml Xther ex- trahiert, der Xther mit Wasser, Sodal5sung und wieder mit Wasser gewaschen und der feuchte Ext rak t schlieBlieh nach Zusatz yon 2 ml Benzol guf dem C)lbad verdampft und ira Vakuum vol]kommen getrocknet. Den Rfickstand 15st man unter Erwgrmen in 2 m] reinem Alkohol und verwendet 0,2 ml zur Z I ~ h ~ A S X - Reaktion. Der Rest der LSsung der Ketosteroide in Alkohol wird zur Troekne ver- dampft, in 0,2 ml Alkohol gelSst und mit 0,2 ml 2% iger DigitoninlSsung in 80~oigem Alkohol gef~llt (4 rain, 70--75~ I~ach dem Abkfihlen setzt man 0,1 ml Ather zu, l~l]t fiber 1Naeht im Eisschrank stehen und zentrifugiert den ausgef~llten fl-Steroid- Digitoninkomplex ab. Die fiberstehende Flfissigkeit wird sorgf~ltig abgegossen, die W~nde des Gef~Bes werden getrocknet und zweimal mit 1 ml ~ther, dann nochmal mit 2 ml ~ ther ausgewasehen. Man 15st sehliel~lich in 0,5 ml Alkohol, verdampft zur Troekne, lSs~ wieder in 0,2 ml Alkohol and stellt die Z ~ A ~ - R e a k t i o n an. M~n bekommt so den Wert ffir die fl-17-Ketosteroide. X. I - I I ~ s ~ .

Cortison und verwandte Ketosteroide~ die am Kohlenstoffatom 20 eine Keto- gruppe und am Kohlenstoffatom 21 eine Carbinol- oder Carbino]estergruppe ent- halten, reagieren mit Tetrazoliumsalzen hi Gegenwart yon Tetmmethylammonium- hydroxyd unter ]3ildung der bekannten Formazane. W. J . ~ L ~ t r und R. R. Bvcl~ 2 verwenden diese Eigenschaft zur colorimetrischen Bestimmung, indem sie entweder 2,3,5 - Triphenyltetrazoliumchlorid oder 3,3 - Dianisol - bis - 4,4 - ( 3,5 - diphenyl ) tetr- azoliumchlorid (]3. T.) verwenden. ]3is zu 0,3 mg Cortisonacetat gilt d~s ]3]~Rsche Gesetz. Die maximale Absorption liegt bei 490 bzw. 510 m# und ist nach 15~20 mii1 erreicht. Andere Steroide stSren nicht. M~n verwendet rehie LSsungen mit 120 bis 130 #g Cortisonacetat in 10 ml ~thylalkohol oder entsprechende Auf]Ssungen won

Vgl. diese Z. 137, 316 (1952). An~lyt. Chemistry 24, 666 (1952). Merck & Co., Inc., Rahway, N. J . (USA).

4. Auf Physiologie und Pathologie beziigliche. 7 9

Tabletten. Gleichzeitig setzt man einen Standardwert mit 125/~g and einen Leer- wert an und gibt zu allen Proben 1 ml Tetramethylammoniumhydroxydl6sung (10 ml ]0~o iger wgBriger LSsung mit 95% igem Alkohol auf 100 ml aufgefifllt) und 1 ml B. T. (0,5% in 95~oigem Alkohol). Die Extinktion wh'd nach 15--20 rain bet 510 m# gemessen. K. 1LIIN-SBEIRG.

Zur Best immung des andrenoeorticotrol0en Hormons (ACTH) im Blur ver- wenden KAT~IEt~t~E L. SYDNO~ und G. SAu 1 die Oxycellulose-Technik yon AsTwooD und Mitarbeitern 2. ])as Blur yon Bat ten wird aus tier Aorta abdominalis entnommen, hiiparinisiert und mit dem 4fachen Volumen Essigs~Lure gut gemiseht. Nach l~s t t ind igem Erwarmen auf 70--75~ C wird mit dem 13fachen Volumen Wasser versetzt, 0,1 g ttyflo-Super-cel pro ml Blur eingeriihrt und die iiberstehende Fliissigkeit nach 24 Std dekantiert. Pro ml Blur vermischt man nun mit je 0,04 g vorbehandelter Oxycellulose, worauf das ACTK absorbiert wird. Der nach 24 Std abgesetzte Bfickstand wird mit 0,1 n Essigsaure gewaschen, bis er farblos ist, und dann mit 0,1 n Salzsaure eluiert, so dag etwa eine 4fache Anreicherung resultiert. Der Hormongehalt wird nun an hypophysektonierten l~atten durch Bestimmung des Vitamin C-Gehaltes der Ncbennieren bestimmt. Hypophysektonierte Bat ten haben kein ACTH im Blur. Zugesetzte Mengen werden zu 82 • 12% wieder- gefunden. Bet normalen Rat ten finden sich 2--3 mE, bet adrenalektonierten Tieren 10--12 mE/ml Blur. K. HI~SB~RG.

Zur spektrophotometrischen Bestimmung yon Diiithylstilh6strol and ver- wandten (}strogenen ist nach C. A. K~L~Y und A. E. J ~ m s 8 das Phenol- reagens nach FoLI~-D~IIs wegen seiner Unspezifitat ungeeignet. Die Farbe be- sitzt auch kein ausgesprochenes Absorptionsmaximmn. Es soll besser sein, mit diazotiertem m-Nitroanilin zu kuppeln und die Farbe bet 510 ln,u zu messen. Das Diazoreagens wird hergestellt durch LSsen yon 50 rag m-Nitroanilin in 2 ml 6 n Salzs/~ure unter Erw~rmen. Unter Eiskiihlung setzt man 1 ml 5% ige NaNO2-LSsung zu und naeh ungefiihr 2 rain 95 ml kaltes Wasser nnd 1 ml 5% ige Amidosulfonsiiure- 15sung. Man fiillt auf 100 ml auf und litBt in Eiswasser bis zum Gebraueh stehen. Zur Messung des Dfiithylstilb6strols nimmt man 0- -4 ml einer StandardiSsung, d. h. 20--80#g, verdiinnt mit 50~oigem Alkoho] uuf 5 ml und gibt 1 rnl 5~oige NatrinmboratlSsung and dann 2 ml Diazoreagens zu. Der Ansatz bleibt 10 rain bet Baumtemperatur stehen, wird dann mit 1 ml 10% iger NaOI-I-LSsung alkalisiert, auf ]0 ml aufgeftillt und colorimetriert. Leerwert ohne DigthylstflbSstrol. Das BEm~sche Gesetz gilt. Der Fehler betr~gt im Mittel etwa 5~o. - - Zur Untersuchung yon Tabletten werden 20 Sttick abgewogen, um das mittlere Gewieht zu bestimmen, dann ein Teil der 1--4 mg Di~ithylstflbSstrol enth~lt, in 25 ml absolutem Alkohol aufgekoeht and mit 25 ml destilliertem Wasser versetzt. Aus der filtrierten L5sung werden entsprechende Proben entnommen. K. HINSBERG.

Eine fluoreseenzspektrophotometrisehe Nethode zur Bestimmung yon ()stron und a-(~stradiol in binaren Gemischen wurde yon B. I)E L~R~IA und A. Bo~l~I.~m ~ attsgearbeitet. Die Methode beruht auf der F]uorescenz, die 0stron und a-0stradiol naeh 2 0 - 3 0 rain ]anger Einwirkung yon konzen~rierter Schwdelsaure (D 1,84)

1 Proc. Soe. exp. Biol. Med. 79, 432 (1952). Univ. of Utah, College of Medic., Salt Lake City, Utah.

ASTWOOI), E. B., M. S. I~ABE~, R. W. PA~'~-~ andA. B. GI~AFf: J. Amer. chem. Soc. 75, 2929 (1951).

3 j . Amer. pharmac. Assoc., sci. Edit. 41, 97 (1952). Temple Univ., School o f Pharm., Philadelphia, Pa.