Cyclin-abhängige Kinasen (CDKs) Dr. F. Neuschäfer-Rube

Regulation des Zellcylus

Cyclin-abhängige Kinasen (CDKs)

Dr. F. Neuschäfer-Rube

Cyclin-abhängige Kinasen: Motoren und Schalter des Zellzyclus

Dr. F. Neuschäfer-Rube

M

S

Der Zellzyklus

S = DNA-Synthese (Replikation)

Der Zellzyklus

M

M = MitoseVerteilung der Chromosomen

S = DNA-Synthese

Der Zellzyklus

Der Zellzyklus: Teilschritte der Mitose

Prophase Metaphase Anaphase Telophase

M = Mitose

S = DNA-Synthese

G1

Der Zellzyklus

G2

S = DNA-Synthese

G2 = Kontrolle der DNA-Synthese

Der Zellzyklus

M = Mitose

G1

M = Mitose

S = DNA-Synthese

G1 = Zellwachstum

Der Zellzyklus


M = Mitose

S = DNA-Synthese

Go = Ruhezustandz.B. ausdifferenzierte

Zellen

G1 = Zellwachstum


Der Zellzyklus

M = Mitose

S = DNA-Synthese

Go = Ruhezustand

G1 = Zellwachstum


Kontrollpunkte des Zellzyklus

Wie wird der korrekte Abblauf des Zellzyklus

kontrolliert?

M = Mitose

S = DNA-Synthese

Go = Ruhezustand

G1 = Zellwachstum



Wie wird der korrekte Abblauf des Zellzyklus

kontrolliert?

Kontrollpunkte

M = Mitose

S = DNA-Synthese

Go = Ruhezustand

G1 = Zellwachstum



Restriktionspunktintrinsisch: Zellgröße erreicht?

M = Mitose

S = DNA-Synthese

Go = Ruhezustand

G1 = Zellwachstum



Restriktionspunktintrinsisch: Zellgröße erreicht?extern: Wachstumsfaktoren?

M = Mitose

S = DNA-Synthese

Go = Ruhezustand

G1 = Zellwachstum



G2-KontrolleReplikation vollständig?

DNA intakt?

Restriktionspunktintrinsisch: Zellgröße erreicht?extern: Wachstumsfaktoren?

M = Mitose

S = DNA-Synthese

Go = Ruhezustand

G1 = Zellwachstum



G2-KontrolleReplikation vollständig?

DNA intakt?

Metaphasen-Kontrollekorrekte

Chromosomenanlagerung?

Restriktionspunktintern: Zellgröße erreicht?

extern: Wachstumsfaktoren?

M = Mitose

S

Go

G1G2


Durch welche biochemischenFaktoren wird der Übergang

der Zellzyklusphasen reguliert?

S-Phase

S-Phase

G1

G2

G1G2

Zellfusionsexperimente mit synchronisierten HeLa-Zellen

+

+

+

S-Phase

S-Phase

G1

G2

G1G2


+

+

+

S-Phase

S-Phase

G1

G2

G1G2


+

+

+

Zellfusionsexperimente zeigen 3 Phänomene:

1. Nur Zellen in der G1-Phase sind kompetent, um in die S-Phase ( DNA-Replikation) überzugehen

2. Nur Zellen in der S-Phase besitzen einen Aktivator,der die DNA-Replikation in kompetenten Zellen der G1-Phase

stimulieren kann.

3. Kerne von Zellen der G2-Phase können keine DNA-Replikation durchführen, solange die M itose nicht abgeschlossen ist.

Auslösen der DNA-Synthese in der frühen S-Phase durch löslichen Faktor

G1/S-Phase: S-Phase-promoting- factor (SPF)G2/M-Phase: Mitosis-promoting-factor (MPF)




stimulieren kann.







stimulieren kann.







stimulieren kann.







stimulieren kann.




Leland H Hartwell

Identifizierung von Zellzyklusregulatoren: CDKs

25°C

35°C

Identifizierung Temperatur-sensitiver CDC (Cell-Division-Cycle) Mutanten Modell: Saccharomyces sereviciae

Mutagenisierte Zellen




25°C

35°C

35°Cnicht CDC-Mutanten


Knospung

Eintritt in den Zellzyklus



25°C

35°C

35°C

CDC-START-Mutante

nicht CDC-Mutante


kein Eintritt in den Zellzyklus

35°C 35°C

Identifizierung des CDC-START Gens

Wt CDC-START-Gen


CDC-START-Mutante

Wt Gen X

35°C 35°C

Identifizierung des CDC-START-Gens

Wt CDC START Gen


CDC-START-Mutante

Wt Gen X

Cyclin-abhängige Kinase (CDK)

Analyse

Entdeckung Cyclin-abhängiger Kinasen (CDKs): Medizin Nobelpreis 2001

Leland H Hartwell Tim HuntPaul Nurse

CDKs der Hefe Cycline des Seeigels

Cyclin-abhängige Kinasen (CDKs): Heterodimere Proteine

C.L. Card et al., EMBO Journal 2000

katalytische Untereinheit: CDK regulatorische Untereinheit: Cyclin


C.L. Card et.al., EMBO Journal 2000

katalytische Untereinheit: CDK- Serin/Threonin-Kinasen- Hefe: eine CDK- Säugetiere: CDK1 - CDK7- hohe Identitität- konservierte Cyclin-Bindungsstelle

regulatorische Untereinheit: Cyclin

C.L. Card et.al., EMBO Journal 2000

katalytische Untereinheit: CDK- Serin/Threonin-Kinasen- Hefe: eine CDK- Säugetiere: CDK1 - CDK7- hohe Identität- konservierte Cyclin-Bindungsstelle-

regulatorische Untereinheit: Cyclin- Cyclin A-H- heterogene Proteinfamilie- zyklische Konzentrationsänderungen im Zellzyklus- Kernlokalisation


M

S

G1

G2

CDK/Cyclin-Komplexe im Wirbeltier-Zellzyklus

Restriktionspunkt

Go

CDK2/CyclinDCDK4/CyclinDCDK6/CyclinD

CDK2/CyclinE

G1/S-PhasenÜbergang

M

S

G1

G2


Restriktionspunkt

Go

CDK2/CyclinE

CDK2/CyclinA



M

S

G1

G2


Restriktionspunkt

Go

CDK2/CyclinE

CDK1/CyclinB


G2/M-PhasenÜbergang


CDK2/CyclinA

CDKs: Motoren des Zellzyklus

Welche "Motorwirkung" haben CDKs im Zellzyklus ?

Durch die Phosphorylierung welcher Substratewerden Zellzyklusphasen eingeleitet ?

CDK Substrate: Initiation der S-Phase

Bedeutung von CDKs bei der Initiation der S-Phase


NH2- -COOHA B

Retinoblastom-Protein (Rb)- Schlüsselsubstrat der S-Phase -

nucleäres Protein, 110 kDa


NH2- -COOHA B



Bindung des Transkriptionsfaktors E2F


NH2- -COOHA B




Rb wirkt als Tumorsupressorgen


NH2- -COOHA B

E2F: zentraler Transkriptionsfaktor bei der Induktion von S-Phase Genen





NH2- -COOHA B


P P P P P P P P PP



E2F: zentraler Transkriptionsfaktor bei der Induktion von S-Phase Genen

Rb wirkt als Tumorsupressorgen


Rb

E2F

Rb

Repression E2F-kontrollierter Gene


Rb

E2F

InduktionE2F-kontrollierter Gene

P P P

CDK 2

Cyclin E

Rb

E2F

Rb

Repression E2F-kontrollierter Gene

E2F: Initiator der S-Phase

E2F

E2F-kontrollierter Gene

DNA-Pol I

dNTP-Synth.

CDK 2

Cyclin E

Rb

P P P


E2F


Cyclin E

E2F

DNA-Pol I

dNTP-Synth.

CDK 2

Cyclin E

Rb

P P P

positiv autoregulatorischerVerstärkungsmechanismus!


E2F


Cyclin E

E2F

DNA-Pol I

dNTP-Synth.

CDK 2

Cyclin E

Rb

P P P

positiv autoregulatorischerVerstärkungsmechanismus!

"Lawinenhafter"Übergang über denRestriktionspunkt

S-Phase

CDK Substrate: Mitose

Bedeutung von CDKsbei der Mitose


Ein Teilschritt der Mitose ist die Auflösung der Kernmembran

InterphaseMitose


Chromatin Kernlamina

innere Kernmembran



Desintegration der Kernlamina

Auflösen der Kernmembran

Mitose



CDK 1

Cyclin B



Mitose

ATP



CDK 1

Cyclin B

Lamintetramer



Mitose

Laminnetzwerk

ATP



CDK 1

Cyclin B

Lamintetramer

-P P--P P-

phosphorylierteLamindimere



Laminnetzwerk

Mitose

ATP ATP

M

S

G1

G2


Restriktionspunkt

Go

CDK2/CyclinE

CDK1/CyclinB


G2/M-PhasenÜbergang


CDK2/CyclinA

Lamin-P

Rb-P E2F

CDKs: Schalter des Zellzyklus

Wie wird die Aktivität der CDKs im Zellzyklus an- und ausgeschaltet?

Regulation der CDK-Aktivität

CDKinaktiv

Regulation der CDK-Aktivität: Cyclinkonzentration

inaktivCDK

CyclinCyclin

CDKinaktiv


inaktivCDK

CyclinCyclin

CDKinaktiv

P

nur CDK-Cyclin Komplexesind Substrate

Threonin-Kinase (CAK)

aktiv

T160 PCDK

Cyclin

PATP

Veränderungen der CDK Struktur durch Cyclin-Bindung

Veränderungen der CDK Struktur durch Cyclin-Bindung

+ CAK


inaktivCDK

CyclinCyclin

CDKinaktiv

P

Cyclinkonzentration

aktiv

T160 PCDK

Cyclin

ATP


Wie wird die Konzentration der Cycline im Zellzyklus reguliert?


Cyclin



Neusynthesedurch transkriptionelle

Induktion

Cyclin

Regulation der Cyclinkonzentration: transkriptionelle Induktion

P

Beispiel: Induktion durch Wachstumsfaktorsignalketten


P

Beispiel: Induktion durch Wachstumsfaktorsignalketten W

F-RWF


P

WF

-RWF

TF-OH TF-O-P


Proteinkinasen


P

WF

-RWF

TF-OH TF-O-P

immediate early genes


Proteinkinasen


P

WF

-RWF

TF-OH TF-O-P


c-jun/c-fos (TF)


Proteinkinasen


P

WF

-RWF

TF-OH TF-O-P


c-jun/c-fos (TF)

delayed genes

c-jun

c-fos


Proteinkinasen


P

WF

-RWF

TF-OH TF-O-P


c-jun/c-fos (TF)

delayed genes

Cyclin DCyclin E

CDK2CDK4

c-jun

c-fos


Proteinkinasen


P

WF

-RWF

TF-OH TF-O-P


c-jun/c-fos (TF)

delayed genes

Restriktionspunkt(G1 S-Phase)

c-jun

c-fos


Cyclin DCyclin E

CDK2CDK4

Proteinkinasen



Neusynthesedurch trankriptionelle

Induktion

Cyclin

Restriktionspunkt(G1 S-Phase)

Abbaudurch Proteolyse

Regulation der Cyclinkonzentration: proteolytischer Abbau

CD

K1

-Ak

tiv

ität

Zellzyclus-Phase

G1 S G2 M G1 S G2 M

Beispiel: Regulation der CDK1-Aktivität durch Abbau von Cyclin B

Metaphase


CD

K1

-Ak

tiv

ität

Zellzyclus-Phase

G1 S G2 M G1 S G2 M

CDK1-Konzentration


Metaphase



Abbau von CyclinB

CD

K1-

Akt

ivit

ätC

yclinB

-Ko

nzen

tration

Zellzyclus-Phase

G1 S G2 M G1 S G2 M

CDK-1 KonzentrationMetaphase


NH2 COOH

Cyclin A,B

Destruction-Box


NH2 COOH

Cyclin A,B

Destruction-Box

NH2 COOH

Ubiquitin


NH2 COOH

Cyclin A,B

Destruction-Box

NH2 COOH

Ubiquitin Anaphase-promoting-complex (APC, Ubiquitin-Ligase-Komplex)


NH2 COOH

Cyclin A,B

Destruction-Box

NH2 COOH

Ubiquitin

Markierung für proteolytischen Abbau

Anaphase-promoting-complex (APC, Ubiquitin-Ligase-Komplex)


NH2 COOHProteasom

Abbau

NH2 COOH

Cyclin A,B

Destruction-Box

NH2 COOH

Ubiquitin

Markierung für proteolytischen Abbau

Anaphase-promoting-complex (APC, Ubiquitin-Ligase-Komplex)


Wie wird der proteolytische Abbau von Cyclin B reguliert?


CDK1

Cyclin B

G1-Phase

APC

inaktiv


Cyclin BSynthese

Cyclin B

S, G2-Phase

G1-PhaseCDK1

APC

inaktiv


CDK1

Cyclin B

Cyclin BSynthese

P

Metaphase

Cyclin B

APCAPC

P

inaktiv aktiv

S, G2-Phase

G1-PhaseCDK1


CDK1

Cyclin B

Cyclin BSynthese

P

Metaphase

Cyclin B

APCAPC

P

inaktiv aktiv

S, G2-Phase

G1-PhaseCDK1

ATP


CDK1

Cyclin B

CDK1

Cyclin BCyclin BSynthese

P

Polyubiquitinylierung

Metaphase

Cyclin B

APCAPC

P

inaktiv aktiv

ProteasomAbbau

S, G2-Phase

G1-PhaseCDK1

ATP


CDK1

Cyclin B

CDK1


P


Metaphase

Anaphase

Cyclin B

APCAPC

P

inaktiv aktiv

ProteasomAbbau

S, G2-Phase

G1-PhaseCDK1

ATP


CDK1

Cyclin B

CDK1


P


Metaphase

Anaphase

Cyclin B

APCAPC

P

inaktiv aktiv

ProteasomAbbau

S, G2-Phase

G1-PhaseCDK1

negativ autoregulatorischer Mechanismus

ATP


Neusynthesedurch transkriptionelle

Induktion

Cyclin

RestriktionspunktG1 S-Phase

Abbaudurch Proteolyse

Metaphase Anaphase Abschluss der Mitose

Wachstumsfaktoren Autoregulation

Regulation der CDK-Aktivität: Phosphorylierung

inaktivCDK

CyclinCyclin

aktiv

T160 PCDK

Cyclin

CDK

Cyclin

CDK

T14

Y15

P

P

inaktiv

inaktivP

T160 P

Threonin/Tyrosin-Kinase

Cyclinkonzentration ATP

ATP


inaktivCDK

CyclinCyclin

aktiv

T160 PCDK

Cyclin

CDK

Cyclin

CDK

T14

Y15

P

P

inaktiv

inaktiv

Threonin/TyrosinPhosphatase

P

T160 P

Regulation der CDK-Aktivität: Dephosphorylierung

Cyclinkonzentration

Threonin/Tyrosin-Kinase

P

Pi

ATP

ATP


Regulation der CDK-Aktivität: Dephosphorylierung

Wie wird die Aktivierung der CDK durch Dephosphorylierung reguliert?

CDK1

CyclinBT14

Y15

P

Pinaktiv

P

T160 P

Regulation der CDK-Aktivität: Dephosphorylierung von CDK1

G2-Phase


inaktiv

G2-Phase


P P


aktiv


inaktiv

CDK1

CyclinBT14

Y15

P

Pinaktiv

P

T160 P

CDK1

CyclinB

aktiv

T160 P

G2-Phase

Mitose

G2-Phase

Mitose

Pi


Aktivierung

P P


aktiv


inaktiv

CDK1

CyclinBT14

Y15

P

Pinaktiv

T160 P

CDK1

CyclinB

aktiv

T160 P

P

G2-Phase

Mitose

G2-Phase

Mitose

Pi

ATP


Aktivierung

P P


aktiv


inaktiv

CDK1

CyclinBT14

Y15

P

Pinaktiv

T160 P

CDK1

CyclinB

aktiv

T160 P

G2-Phase

Mitose

G2-Phase

Mitose

positiv autoregulatorischer Verstärkungsmechanismus

Pi

ATP

Regulation der CDK-Aktivität: Inhibitoren

inaktiv

inaktivCDK

CyclinCyclin

aktiv

T160 PCDK

Cyclin

T160 PCDK

CKI

CDKinaktiv

Cyclin

CKI

P

Cyclinkonzentration

PhosphorylierungDephosphorylierung

CDK-Inhibitoren

CDK

CyclinT14

Y15

P

Pinaktiv

T160 P

ATP

Pi

ATP


Beispiel: CKI p21

isosterische Hemmung durch Bindung im aktiven Zentrum

CDK 2

Cyclin E

CKI p21

G1 S-Phase


Wie wird die Konzentration von CKI p21 reguliert?

Regulation der CDK-Aktivität: Induktion des Inhibitors p21

p53 Transkriptionsfaktor, Tumorsupressor-Gen


p53

p53

CKI p21

Transkriptionsfaktor, Tumorsupressorgen


p53

p53

CKI p21

CDK 2

Cyclin E


CKI p21


p53

p53

CKI p21

T1

/2 =

30

min

p53

Abbau


CDK 2

Cyclin E

CKI p21


p53

p53

CKI p21

T1

/2 =

30

min

p53

Abbau

DNASchäden

T1

/2 =

15

0 m

in


CDK 2

Cyclin E

CKI p21


p53

p53

CKI p21

T1

/2 =

30

min

p53

Abbau

DNASchäden

T1

/2 =

15

0 m

in


CDK 2

Cyclin E

CKI p21

G1-Phasen Arrest


p53

p53

CKI p21

T1

/2 =

30

min

p53

Abbau

DNASchäden

T1

/2 =

15

0 m

in


CDK 2

Cyclin E

CKI p21

Zeit für DNA-Reparatur vor der Replikation

G1-Phasen Arrest

p53

M dm 2p53

M dm 2

A bbau

Ubiquitin-Ligase

Regulation der CDK-Aktivität: Regulation von p53

p53

M dm 2p53

M dm 2p53

P

A bbau


p53

M dm 2p53

M dm 2p53

P MAPK

A bbau

W achs tum sfakto r-hype rstim u la tion


p53

M dm 2p53

M dm 2p53

P

D N A -S chaden

DNA-PKATMMAPK

A bbau


Proteinkinase


p53

M dm 2p53

M dm 2p53

P

D N A -S chaden

DNA-PKATM ATR

M dm 2

P

MAPK

A bbau


Proteinkinase


p53

M dm 2p53

M dm 2 p19 /A rfp53

P

D N A -S chaden

DNA-PKATM ATR

M dm 2

P

MAPK

A bbau



p53

M dm 2p53

M dm 2 p19 /A rf

M dm 2 p19 /A rf

p53

P

D N A -S chaden

DNA-PKATM ATR

M dm 2

P

MAPK

A bbau



p53

M dm 2p53

M dm 2 p19 /A rf

M dm 2 p19 /A rf

p53

P

D N A -S chaden

DNA-PKATM ATR

M dm 2

P

MAPK

A bbau


Induktion von:p21G A D D 4514-3 -3 -Zellzyklus-Arrest


Regulation der CDK-Aktivität: Übersicht

inaktivCDK

CyclinCyclin

aktiv

T160 PCDK

Cyclin

CDKinaktiv

P

CyclinkonzentrationP

G1 S M G1ATP


inaktivCDK

CyclinCyclin

aktiv

T160 PCDK

Cyclin

CDKinaktiv

P

Cyclinkonzentration


G2 M

G1 S M G1

G2 M

ATP

CDK

CyclinT14

Y15

P

Pinaktiv

T160 P

ATP

Pi


inaktiv

inaktivCDK

CyclinCyclin

aktiv

T160 PCDK

Cyclin

T160 PCDK

CKI

CDKinaktiv

Cyclin

CKI

P

Cyclinkonzentration


CDK-Inhibitoren

G1 S

G2 M

G1 S M G1

G2 M

ATP

CDK

CyclinT14

Y15

P

Pinaktiv

T160 P

ATP

Pi

M

S

G1G2

Cyclin-abhängige Kinasen: Motoren und Schalter des Zellzyclus

R

Dephosphorylierung Cyclinabbau

Cyclinsynthese

Inhibitoren

pRb/E2F

Lamin-P

Documents

Cyclin-abhängige Kinasen (CDKs) Dr. F. Neuschäfer-Rube