Darstellung und Eigenschaften von Verdoglobinen

Aus dem Pharmakologisehen Institut. und dem Physiologisch-Chemisehen Institut der Universitat Kiel ia Kappeln an der Schlei.

Darstellung und EigensehaRen von Verdoglobinen. Von

MANFRED KIESE. Mit 9 Textabbildungen.

(Eingegangen am 22. Mai 1946.)

Der rote Blutfarbstoff kann durch verschiedene Reaktionen in grüne Farbstoffe übergeführt werden. Diese Verdoglobine bestehen wie das Hi~moglobin aus einem nativen Protein und einer aus dem ~ ä m ent- standenen prosthetischen Gruppe, dem Verd. Gleich dem Häm enthält das Verd Eisen. Die hier beschriebenen Untersuchungen beschäftigen

, sich vornehmlich mit 3 Verdoglobinen, n~mlich dem VerdoglobincN, Verdo- globin s und VerdoglobinNo« Es gelingt bisher nur durch e inen Reaktions- mechanismus ein Verdoglobin zu erhalten, das nur noch geringe Spuren von unverändertem H~moglobin enthält. In schwach saurer Lösung wird in Gegenwart einer hohen Konzentration von Blausäure Hgmoglobin durch einen großen Überschuß von Wasserstoffperoxyd zu Verdoglobin oxydiert 1,2. Dabei wird der größte Teil des Globins denaturiert, aber der in Lösung verbleibende Teil besteht nur mehr zu 3--0,5% oder weniger aus unverändertem H~moglobin. Wir fanden später, als wir Verdoglobin für fermentative Gallenfarbstoffbildung brauchten a, daß die Vollständig- l~eit der Umwandlung nicht so gut reproduzierbar war wie in den ersten Untersuchungen. Sie ist jedoch immer zu erreichen, wenn die Reaktion bei einer Wasserstoffionenkonzentr&tion von PH 6,0--6,3 verlAuft. Die wechselnde Zusammensetzung der zur Blaus~ureherstellung verwendeten Cyanidprgparate erfordert jeweils Einstellung mit der verwendeten Phos- phorsi~ure auf ein P]t von etwa 6. Mit anderen Reaktionen konnte bisher eine ebenso weitgehende Umwandlung des Hämoglobins in Verdoglobin nicht erreicht werden. Die Reaktion von Schwefelwasserstoff, Sauerstoff und Hämoglobin, die überhaupt am längsten bekannte Reaktion zur Bildung eines Verdoglobins 4, ist wiederholt auf die Möglichkeit einer voll- stgndigen Umwandlung des ttämoglobins in Verdoglobin untersucht worden S. «, 7, s, aber nie wurde eine auch nur annähernd vollständige

1 KIESE, M . u . I-I. KAESKE: Biochem. Z. 312, 121 (1942). - - « KIES~, M.: Klin. Wschr. 1942, 565. - - • KESZTYÜS, L. v. u. M. KIESE: Klin. Wschr. 1943, 746. - -

Horr~-S]~YL~.~, F.: Zbl. med. Wiss. 1, 433 (1863). - - » HAUROWrrZ, F.: Z. physiol. Chem. 151, 130 (!926). - - « D]aABKI)T, D. L. u. J. H. AUSTI~r: J. biol. Chem. (Am.) 112, 51 (1936). - - 7 MIcH]~L, H. O.: J. biol. Chem. (Am.) 126, 323 (I938). - - 8 HAuRowlTz, F.: J. biol. Chem. (Am.) 137, 771 (1941).

Arch iv für exper iment . Pa th . u. Pha rmako l . Bd. 204. 2 5

386 M_aNFRED KIESE :

Umwandlung erreicht. Auch die Reaktion von t tamoglobin mit Ascorbin- säure und Sauerstoff (LEMBERO, LE~OE und LOCKWOOD ~) sowie die von Hamiglobinnitri t mit Wasserstoffperoxyd (HAvEMANN 1°) erreichen keine vollständige Um~vandlung.

Durch die verschiedenen Reaktionen werden verschiedene Typen von Verdoglobinen gebildet, die sich in ihrer Lichtabsorption und anderen Eigenschaften unterscheiden n. In den Mechanismen der Bildung der verschiedenen Verdoglobine bestehen gewisse Ähnlichkeiten, jedoch sind sie durchaus spezifisch. Es handelt sich jeweils um die Einwirkung eines Oxydationsmittels wie Sauerstoff oder Wasserstoffperoxyd auf Hgmo- globin und einen weiteren Stoff wie Blaus~iure, Sehwefelwasserstoff, Nitrit, Phenylhydrazin, Arsenwasserstoff und andere 1~. Dabei wird entweder eine Verbindung des betreffenden Stoffes mit dem Hamoglobin von dem Oxydationsmittel oxydiert oder es erfolgt eine Reaktion im Dreierstoß. Da die Verdoglobinbildung mit Blausgure und Wasserstoffperoxyd sehr schnell und sehr weit t~bl~uft, ferner beim Zusammentreffen von Sauerstoff mit Schwefelwasserstoff, Ascorbins~ture, Arsenwasserstoff und anderen die Bildung von Wasserstoffperoxyd nachgewiesen wurde 1~,13 und schließlich die Verschiedenheit der einzelnen Verdoglobine noch nicht klar heraus- gestellt war, erschien dié Einwirkung von Wasserstoffperoxyd auf das Hgmoglobin schlechthin als das wesentliche bei der Verdoglobinbildnng. Diese Auffassung schien durch die Mitteilung gestützt zu werden, daß die Bildung von Verdoglobins im Gemisch von Hgmoglobin, Schwefel- wasserstoff und Sauerstoff durch Zusatz von Wasserstoffperoxyd oder Perborat s tark beschleunigt würde 7. Das trifft jedoch nicht zu. Durch 0xydat ion von H~moglobin und Schwefelwasserstoff mit Wasserstoff- peroxyd wird zwar auch ein Verdoglobin gebildet, aber nicht Verdoglobins, sondern" Verdoglobinc~ oder ein diesem nahe verwandtes. Unter Aus- schluß von Sauerstoff und schneller Abfuhr des durch Zerfall von Wasser- stoffperoxyd anfallenden Sauerstoffs entsteht nut b Verdoglobinc~- , bei An- wesenheit von Sauerstoff ein Gemisch von Verdoglobin s und Verdo° globincN. Andererseits vermag Wasserstoffperoxyd durch Reaktion mit H~Lmiglobinnitrit ein Verdoglobin zu bilden, das sowohl vom Verdo- globin s wie Verdoglobincl~ verschieden ist.

Wie schon diese Feststellungen zeigen, führt aber nicht jede verdoglobinbildende Reaktion zu einem besonderen Verdoglobin, sondern ein bestimm- tes Verdoglobin kann durch verschiedene Reaktionen entstehen. Er- wßhnenswert ist hier das biologisch besonders interessante Verdoglobins, das nicht nur bei der gekoppelten 0xydat ion von H~moglobin und Schwefel-

LEMB~RG, R., J. W. LEGO~, W. H. LOCKWOOD: Biochem. J. (Brit.) 3], 754 (1939). - - ~0 HAVE~IA~I~, R.: Biochem. Z. 308, 1 (1941). - - 1~ KIESE, M. u..L. SEI- PELT: Arch. exper. Path. (D) 200, 648 (1943). - - 1~ SCgAL1SS, 0.: Ber. dtsch, ehem. Ges. 71, 447 (1938). - - is Hm¢zE, C.: Klin. Wschr. 1918 1, 24.

Darstellung und Eigenschaften von Verdoglobinen. 387

wasserstoff durch Sauerstoff entsteht, sondern auch durch die Umsetzung von I-Iämoglobin mit Hydroxylamin und Sauerstoff oder von ttämoglobin mit Arsenwasserstoff und Sauerstoff. Diese Tatsache ist von Bedeutung für die Vorstellungen, die wir vom Bau des Verdoglobin s haben können. Bisher wurde in verschiedenen Formen die Vorstellung HorPE-SE¥LERs aufrecht erhalten, daß es sich beim Verdoglobin s um eine Schwefelver- bindung des Hämoglobins handle - - daher der alte Name,,Sulfhämoglobin". Noch jüngst wurde die Bildung einer - - S02-Brücke zwischen Methin- und Vinylgruppe des Porphyrins als wesentliche Ver/~nderung des Hi~moglobins angenommen (HAvROWITZ~). Die Umwandlung einer Methin- brücke in eine >C--~S-Brücke (NIZELD 14) ist wohl noch wahrscheinlicher, wenn es sich- überhaupt um :Einführung von Schwefel ins Molekül handelt. Der Schwefel würde dann nämlich an Stelle von Sauerstoff treten, der bei anderen Verdoglobinen an dieser Stelle vorhanden ist. Verschiedene Reaktionen, die das gleiche Verdoglobin bilden, können sich unterstützen. So wird die Bildung von Verdoglobin s aus Hämoglobin, Schwefelwasser- stoff und Sauerstoff durch den Zusatz von Hydroxylamin stark beschleunigt. t tydroxylamin allein bildet nur verhältnismäßig wenig Verdoglobin.

Während bei der Bildung von Verdoglobiu durch Blausäure und Wasser- stoffperoxyd oder Schwefelwasserstoff und Sauerstoff Hämiglobin nicht oder nur sehr wenig reagiert und vornehmlich das Hämoglobiu reaktions- fähig ist, entsteht das Verdoglobin~o~ aus H~miglobin in Gegenwart eines Überschusses von Nitrit, das mit Hämiglobin eine reversible Verbindung

bi ldet (HAvEMAN~~5). Dies Hämiglobinnitrit wird von Wasserstoff- peroxyd zu Verdoglobin~-o~ oxydiert. Als 0xydationsmittel kann wohl auch Sauerstoff oder salpetrige S~ure dienen, jedenfalls kann die Verdo- globinbildung in saurer Lösung durch Nitrit auch ohne Zusatz von Wasser- stoffperoxyd erfolgen, allerdings wesentlich langsamer. Das ist zuerst am Muskelh/imoglobin beobachtet worden, das sowohl in Pökellake wie in gepökeltem Fleisch vergrünen kann als auch in saurer Lösung nach Zusatz von Nitri t (BECttTOLD 16, HAVEMAI~/~~5). Ähnliche Verhältnisse liegen wahrscheinlich bei der Verdoglobinbildung durch Hydroxylamin vor. t tydroxylamin oxydiert H/~moglobin zu Hämiglobin und bildet im Überschuß mit dem tti~miglobin eine Verbindung, deren Lichtabsorption der des H/~miglobinnitrits ähnlich ist. Diese Verbindung wird durch über: schüssiges Hydroxylamin und Sauerstoff in geringem Ausmaße zu Verdo- globin oxydiert. Sie reagiert aber schnell und weitgehend mit Schwefel- wasserstoff und Sauerstoff. Darauf beruht wahrscheinlich die starke Be- schleunigung der Bildung »-on Verdoglobin s mit Sehwefelwasserstoff und Sauerstoff durch Zusatz von Hydroxylamin.

14 XNIJELD, H. A. W.: Rec. Trav. chim. Pays-Bas 62, 293 (1943). - - 1~ HxvE: ~A~~, R.: Klin. Wschr. 1944, 179. - - i« BECHTOLD, E.: Der Muskelfarbstoff. Stutt- gart 1935. - - Biochem. Z. 311, 426 (1942).

25*

388 MANFRED KIESE :

Der Nachweis einer Verbindung des Hydroxylamins mit dem H£miglobin ist auch von Interesse für die Reaktion von H/~miglobin mit Nitrit und dürfte eine weitere Stützung der Schlüsse von KOB]~RT lv, HAVE- MA~N a5 und REMMER ls sein, daß Nitrit eine Verbindung mit Hämi- globin bildet.

Dem zweiten Stoff, der neben dem H~moglobin in die gekoppelte Reaktion zur Verdoglobinbildung eingeht, kommt eine wichtige reaktions- lenkende Wirkung zu, wodurch bei Anwendung des gleichen Oxydation~- mittels verschiedene Verdoglobine entstehen können und auch die Neben- reaktionen beeinflußt werden. In Gegenwart von Nitrit oxydiert Wasser- stoffperoxyd tIiimoglobin zu Verdoglobini~o,, in Gegenwart von Blau- s~ure oder Schwefelwasserstoff aber zu Verdoglobinc~ ¢. Blaus~ure wie Schwefelwasserstoff hemmen die 0xydat ion des Hi~moglobins durch Wasserstoffperoxyd zu Hi~miglobin, wie die Anwesenheit von H~moglobin im Gemisch von Hämoglobin, Verdoglobin, Schwefelwasserstoff und Wasserstoffperoxyd zeigt. Da unter diesen Bedingungen nur H£moglobin und nicht l-Iämiglobin zu Verdoglobin oxydiert wird, ist die Bedeutung der Wirkung des zweiten Stoffs für die Verdoglobinbildung leicht ein- zusehen. Auch die Ausbeute an Verdogtobin, bezogen auf das verbrauchte Wasserstoffperoxyd ist verschieden. Um das in 1 ccm roten Zellen ent- haltene Hämoglobin zu mehr als 90 % in Verdoglobin umzuwandeln, wurden bei Gegenwart von Nitrit 0,04 cem 30 %iges Wasserstoffperoxyd verwendet, bei Gegenwart von Schwefelwasserstoff 0,06 ccm und bei Gegenwart von Blausäure 0,33 ccln. Die Einwirkung größerer Mengen von Wasserstoff- peroxyd in Gegenwart von Schwefelwasserstoff baut das t t~m und das Verd zu farblosen Produkten ab. Auch in Gegenwart von Nitrit können so große Wasserstoffperoxydmengen wie in Gegenwart von Blaus~ure nicht angewandt werden, ohne das Protein vollst'~ndig auszufällen. Die anzuwendende Menge Wasserstoffperoxyd betriigt auch bei Gegenwart von Schwefelwasserstoff oder Nitrit weit mehr als die für die Oxydation des Porphyrins selbst erforderliche Menge.

Die verdoglobinbildenden Reaktionen werden durch eine Reihe von Faktoren wesentlich beeinflußt: Konzentration der Reaktionspartner, Konzentration der Wasserstoffionen und Temperatur. Für die Verdo- gl0binbildung ist sowohl hinsichtlich Geschwindigkeit wie Ausmal~ eine Wasserstoffionenkonzentration von p~ etwa 6 am günstigsten. Da dies bei den drei verschiedenen Bildungsmechanismen, die hier behandelt werden, in gleicher Weise zutrifft, ist anzunehmen, daß der Lösungszustand des Hämoglobins für die Reaktion von Bedeutung ist. Die Bildung von Verdoglobincl ~ verliiuft am vollständigsten, wenn H~moglobin und vor allem Blausäure und Wasserstoffperoxyd in hoher Konzentration vorhanden

17 KORERT, 1~.: Arch. ges. Physiol. 82, 603 (1900). - - is R~M~ER, K.: Diss. Berlin 1945.


sind 1. Die Mischung der verschiedenen Reaktionspartner bedingt e i n e n erheblichen Anstieg der Temperatur der Lösung. Bei größeren AnsEtzen, wie sie in früheren Untersuchungen gemacht wurden l, h~lt die Temperatur- erhöhnng eine Weile an. Kleinere Ansetze werden zweckmäßig eine Stunde im Wasserbad von 3 8 J0 ° gehalten und dann in der Kä.lte dialysiert.

Die Oxydation von tt~moglobin zu Verdoglobin s liefert die besten Ausbeuten, wenn eine H~moglobinlösung von 5--7 g il1 100 ccm bei PH 6 mit Schwefelwasserstoff von 700--750 mm Hg Druck und Sauerstoff von 10--20 mm Hg reagiert. Die Reaktion verläuft mit höheren Sauerstoff- drucken schneller, doch ist die Ausbeute an Verdoglobins dann geringer. Unter den oben genannten Bedingungen werden Lösungen gewonnen, die etwa 80% des Globins als Verdoglobin s und den Rest als unverändertes H~moglobin enthalten. Erhöhung der Temperatur erhöht de~ Anteil an Verdoglobin nicht. Obwohl Hydroxylamin die Verdoglobinbildung sehr beschleunigt, wird durch seine Mitwirkung der Anteil an Verdoglobin im Reaktionsprodukt ebenfalls nicht erhöht.

Mit dem geringsten Verlust an Blutfarbstoff verläuft die Oxydation von I-D~miglobinDitrit zu Verdoglobin~o« Die Hamoglobinkonzentration ist auch hier am zweckmäßigsten etwa 5 g in 100 ccm. Nitrit ist in einer Konzentration von 0,01 mol je Liter erforderlich. Höhere Konzentrationen verbessern die Ausbeute nicht mehr merklich. Wasserstoffperõxyd genügt in einer Konzentration von 5--10 • 10 -3 Mol je Liter. Höhere Konzentra- tionen denaturieren mehr Protein, ohne den Anteil an Verdoglobin in der endlichen Lösung zu erhöhen. Diese enthalten neben dem Ver:[oglobinNo ' 3--8 % des in Lösung verbliebenen Globins als H~miglobin. Die Reaktion zwischen H~miglobinnitrit und Wasserstoffperoxyd verläuft recht schnell, so daI~ die Lösung 1--2 Min. nach der Mischung bereits von dunkelgrüner Farbe ist. Erhöhung der Temperatur auf 400 beschleunigt die Reaktion ohne den Rest von unverändertem H~moglobin zu vermindern. Zusatz von Kupfer beschleunigt in niedriger Konzentration die Bildung von VerdoglobinNo 2 und ermöglicht die besten Ausbeuten.'

Die Unvollst~ndigkeit des Ablaufs der Verdoglobinbildung kann zweierlei Ursachen haben. Einerseits kann das H~moglobin durch Neben- reaktionen dem Zugr i f f der veldoglobinbildenden Reaktion entzogen werden. Das ist tatsächlich der Fall. Bei der Reaktion mit Blaus~ure und Wasserstoffperoxyd sowohl wie der mit Schwefelwasserstoff und Sauerstoff wird ein Teil des Hämiglobins zu Hämoglobin oxydiert. Aus HEmiglobin wird aber unter diesen Bedingungen kein Verdoglobin gebildet. Jedoch bilden Sehwefelwasserstoff und Sauerstoff in Gegenwart von Hydroxylamin auch aus H~miglobin Verdoglobins, und die Bildung von Verdoglobin~o-Nitrit und Wasserstoffperoxyd verläuft überhaupt mit Hamiglobin. Es ist somit als weitere Möglichkeit zu erw~gen, daß die Ver- doglobinbildung eine Reaktion ist, die bei einem Gleichgewicht stehen bleibt

390 MANFRED KIESE :

• Einen direkten Hinweis darauf bietet auch die Beobachtung, daß aus dem Verdoglobins gebildeteVerdochromogene wenig beständig sind. Gewichtiger ist schon die Beobachtung, daß die Absorptionskurven der verschiedenen Gemische bei der Überführung von H~moglobin in Verdoglobins einen isobestischen Punkt bilden, wie er für reversibel ineinander über- führbare Verbindungen charakteristisch ist. Bestätigt wird die Vermutung durch die wirkliche Überführung von Verdoglobin in eine Verbindung, die von Häxaoglobin spektrophotometrisch nicht zu unterscheiden ist. Am besten gelingt die Reduktion des Verdoglobins zu Hämoglobin mit dem VerdoglobinNo 2. In Karbonatlösung vom p~ l0 unter Luftabschluß wird im Laufe von 10--20 Stunden mehr als die Hälfte des Verdoglobins~~o.. durch Dithionit zu Hämoglobin reduziert. Schneller verliiuft die Reaktion des Verd zu Hi~nl als Verdochromogen, und zwar in Pyridin schneller als in Hydrazinhydrat. Aus dem Verd~o 2 wird in wäßriger Hydrazin- hydratlösung ein Hämochromogen mit dem Maximum der a-Bande bei 552 m# gebildet. Das Verd s liebt sich nur schwieriger zu H~nl reduzieren und das VerdcN ist mit den angewandten einfachen Verfahren nicht in Häm zurückzuführen.

Ebenso wie die Bindung an Kuhlenoxyd das H~moglobin gegen den Übergang in Verdoglobin stabilisiert, wird auch Verdoglobin durch Bindung an Kohlenoxyd beständiger gegen die Reduktion zu t{~moglobin. Die bei der Umwandlung von HydrazinverdochromogenNo, in Hydrazin- hi~moehromogen wahrnehmbaren spektroskopischen Ver~nderungen hat BECHTOLD 15 bereits beschrieben. Allerdings gibt er keine spektrophoto- metrischen D~ten, die sicher beweisen, daß in dem ihm vorliegenden Ge- misch von Verdochromogen und H~mochromogen nicht lediglich das Verdochromogen zerstört wurde und das iibrigbleibende H~mochromogen die Lösung rot f~rbte. BECHTOLD beobachtete die Veri~nderung offenbar nur gelegentlich und konnte die Bedingungen, unter denen sie eintritt, nicht näher definieren. Die Reduktion des Verd~o ' zu Häm durch ~Iydra- zinhydrat gelingt' immer in einer Lösung von 20---30% ttydrazinhydrat unter Ausschluß von Sauerstoff. Die Umwandlung eines grünen Chromo- gens in ein rotes beschreiben auch LEMBERG, CORTIS-JONES nnd NORRIE 19. Die Oxydation von Pyridinhi~mochromogen mit Wasserstoffperoxyd in Gegenwart von Ascorbins~ure und unter Ausschluß von Sauerstoff ergibt eine grüne Verbindung mit einer Bande bei 639 m/~, aus der durch Reduk- tion mit Dithionit wieder eine rote mit Banden bei den gleichen Wellen- l~ngen wie Protoh~mochromogen erhalten wird. :Die Autoren nehmen an, daß die nach Reduktion wieder erhaltene rote Verbindung ein Oxyhämo- chromogen und die grüne Verbindung das entsprechende Hi~michromogen ist. Die hier beschriebenen grünen Verbindungen, welche zu Hämoglobin

19 LEMBERG, 1~., B. CORTIS-JoI~ES U. M. NORRIE: Biochem. J. (Bri$.) 82, 171 (1938).


bzw. H/~mochromogen reduziert werden können, sind zweifellos solche mit zweiwertigem Eisen, denn sie bilden Kohlenoxydverbindungen.

Unter Berücksichtigung dieser Beobachtungen erscheint es verständ- lich, daß eine vollständige Überführung des I-Iämoglobins in Verdoglobin~¢o. " nicht gelingt. Andererseits überrascht nicht, daß Verdoglobinc~ mit nur geringsten Verunreinigungen von Hämiglobin erhalten werden kann. Der Stillstand der Bildung von Verdoglobins fast auf halbem Wege dürfte im wesentlichen auf die weniger stark oxydie-

renc[e Wirkung von Schwefelwasserstoff mit Sauerstoff zurückzufüh- ren sein verglichen mit den hohen Konzentra- tionen von Wasserstoff- peroxyd in den beiden anderen Fällen.

Lichtextinktionskur- ven von Verdoglobinen, insbesondere dem Ver- doglobins, sind bereits in größerer Zahl veröf- fentlicht worden. Abge- sehen von den Extink-

Tabe l l e 1. Wellenlänge und Extinktlonskonstante der Extinktionsmaxima von Ferdoglobinen, Hämiglobin

und Verdoperox]dase.

Protein

Rotes Maximum I

n ]$x- l~n Itl ktmns- ! i'elle - "n "

ge Ikonstante | m~ • K" 10 -7 [

I õ95 I 2,5 I V e r d i g l o b i n c N

V e r d o g l o b i n c N

Verdiglobinl~o: Verdoglobint~o~ Verdoglobin s . Hämiglobin . Verdoper-

oxydase . . . Verdiper-

oxydase . . .

630

615

62O 620 630

638

625

Blaues Maximum

Wellen- länge

418 3,5 I 430 3,i 400 3,7 420 2,9 420 1,0 405

4,2 475

1,5 430

Ex- ellen- tinktions- Bnge konstante mg K " 10 -7

16,0 21,0 13,7 11,6 14,0 36,0

15,0

15,6

tionskurven des VerdoglobincN beziehen sie sich auf Gemische von Verdo- globin mit einem erheblichen Anteil von unverändertem l-Iäm. Auch die durch ]~xtrapolatiou ermittelten Extinktionswerte für,,reines Verdoglobins" (DRABKIN und AVST1-N 2°) sind solche eines Gemisches von Verdoglobin s und Hämiglobinsulfid. Die vorhandenen Daten beschränken sich auch auf einen Bereich von 700 450 m/z. Neben den Extinktionskonstanten in diesem Gebiet sind die des violetten Bereichs von besonderem Interesse, da das Hämoglobin und seine Derivate hier die weitaus stärkste Extink- tion besitzt. Die im folgenden veröffentlichten Extinktionskurven dreier Verdoglobine erstrecken sich auf den Bereich von 700---300 mg. Sie beziehen sich jeweils auf das reine Verdoglobin.

In Tabelle 1 sind die Wellenlängen und ]~xtinktionskonstanten der ]~xtinktionsmaxima der Verdoglobine zusammengestellt und zum Vergleich Hämiglobin und Verdoperoxydase angefügt. Die ExtinktionskQnstanten der Verdoglobine im roten Gebiet sind wesentlich höher als die des ttämi- globins. Diese Tatsache hat eine praktisch-medizinische Bedeutung. Sowohl Hämiglobin wie Verdoglobin können unter pathologischen Be- dingungen vermehrt im Blute auftreten und verleihen dem Patienten dann

~0 DRX~KIN, D. L. u. J. H. AUSTI~: J. biol. Chem. (Am.) 112, 57 (1935).

392 MANFRED K~ESE :

cyanotisches Aussehen. Es genügt also vom Verdoglobin eine weit geringere Konzentration als vom H~miglobin eine Cyanose zu erzeugen. Die Ex- finktion im blauen Gebiet ist bei allen Verdoglobinen erheblich geringer als die des H~moglobins. Abgesehen vom Verdiglobin~o2, das eine breite von 500--300 m# reichende Bande mit nur wenig hervortretendem Maxi- raum aufweist, sind die Extinktionskurven in diesem Gebiet insofern denen des tt~moglobins ~hnlieh als sie schmale intensive Banden zwischen 450 und 400 m# besitzen. Zwischen 400 und 300 nvt ist die Extinktion ebenso groß bzw. größer als die des H~moglobins. Aus den weißen Blut- zellen hat AGNER ~1 eine grüne Peroxydase isoliert. Diese Verdoperoxydase steht vielleicht den Verdoglobinen nahe. Eitler starken Extinktion im roten Gebiet, die bei der Verdo-Form die der Verdoglobine noch ein wenig übertrifft, verdankt sie grüne Farbe. Die St~rke der Extinktion im blauen Gebiet entspricht der der Verdoglobine. Jedoch liegen die Absorptions- maxima etwas mehr im langwelligen Gebiet. W~hrend bei den Verdi- globinen ein zweites Maximum um 560---570 m# n u r eben wahrnehmbar ist, weist die Verdiperoxydase ein Maximum bei 570 m# auf mit fast der doppelten Extinktion wie bei 625 m/t. Bilirubin, das vergleichsweise noch interessiert hat in Chloroformlösung eine breite Bande zwischen 500 und 400 m#. Ih r Ext inkt ionsmaximum liegt bei 445 rote und hat eine Extink- tionskonstante von K = 9" 10 ~. Die Extinktionskurven der Verdo- globine im violetten und ultravioletten Gebiet entsprechen mehr denen des H~moglobins als des Bilirubins.

Die Extinktionskurven des Verdoglobins und VerdoglobinNo ~ legen die Vernmtung nahe, daß diese Verbindungen identisch w~ren. Beide lassen sich wieder zu H ä m reduzieren. Jedoch verl~tuft die Reduktion beim VerdoglobinNo ~ wesentlich leichter als beim Verdoglobins. Einwand- freie Unterschiede bestehen auch in der Extinktion der I-Iydrazinverdo- chromogene. Das Hydrazinverdochromogen s hat ein Maximum bei 605 mtt , das Hydrazinverdochromogen~o ~ aber bei 615 m/~. Ferner ist das Eisen im Verdoglobin s in der zweiwertigen Form sehr besti~ndig. Nach der Dialyse des Ansatzes zur Darstellung liegt das Protein als Verdoglobin vor, w~hrend mit Nitri t und Wasserstoffperoxyd Verdiglobin~o ' erhalten wir&

Die Verdiglobine unterscheiden sich vom H~miglobin auch darin, daß ihre Lichtextinktion im Bereich von pg 5--10 von Wasserstoffionen nicht beeinflußt wird. Zusatz von Blaus~ure oder Stickstoffwasserstoff- s~nre /inder t ihre Extinktion auch nicht. Ferner -¢ermögen Azid und Fluorid die Reduktion des Verdiglobinc~ durch Ascorbins/~ure nicht zu hemmen wie die Rednktion des H~miglobins. Man darf somit annehmen, daß Verdiglobin diese Verbindungen nicht an sein Eisen bindet. Entweder enth~lt das Eisen des Verdiglobins keine elektrolytisch abtrennbare Hy-

21 AO~~R, K.: Acta physiol, seind. I I Suppl. 8 (1941).


droxylgruppe, oder ihre Dissoziationskonstante ist so klein, daß auch bei PH 5 noch keine Dissoziation eintritt.

Über die Kons t i tu t ion der prothetischen Gruppe der Verdoglobine kann freilich erst nach ihrer Abtrennung und Analyse Sicheres ausgesagt werden. Immerhin lassen die vorliegenden Untersuchungen bereits einige Annahmen zu. So spricht die Reduktion des Verdoglobin~o: zu Hämo- globin dafür, daß bei dieser Verbindung der Porphinring noch nicht ge- öffnet ist. Die Herausspaltung einer Methingruppe ist jedenfalls auszu- schließen. Dafür spricht auch der geringe Sauerstoffverbrauch bei der Oxydation. Zur Umwandlung eines -~quivalent Hämoglobin in Verdo- globinz~o~ werden weniger als 2 Mole Wasserstoffperoxyd verbraucht (Tabelle 7). Wahrscheinlich wird als() bei dieser Reaktion nur ein Sauer- stoffatom in das Porphyr in aufgenommen. Auf die Verschiedenheit der einzelnen Verdoglobine ist schon wiederholt hingewiesen worden. Beob- achtungen, die ausführlich in einer weiteren Mitteilung beschrieben werden, zeigen, dag nicht bei allen Verdoglobinen eine Oxydation an einer Methin- brücke vorliegt, die zur Bildung von Gallenfarbstoff in Eisessig führt. Vielmehr gibt es Verdog]obirm, bei denen die Seitenketten des Proto- porphyrins ver'~ndert sind.

Versuche. I. Methodik.

Für alle Untersuchungen wurde krysta]lines Pferdeh/~moglobin 22-25 ()der Rinderhämoglobin verwendet, das aus gewaschenen roten Zellen durch Hämolyse mit der gleichen Menge Wasser erhalten wurde. Die Best immung des I-Iämoglobingehaltes erfolgte als H/~miglobin nach dem Verfahren von EVELYN 2s und HAVEMANN 27. ~[n Lösungen von Verdo- globin oder Gemisehen von Verdoglobin und Hämoglobin wurde der Ge- ha l t an Gösamtglobin nach Dialyse aus dem ]]isengehalt ermittelt . Der Anteil an unverändertem I-Ii~m wurde aus der Differenz der Extinktion der Hydrazin- oder Pyridinchromogene oder der Kohlenoxydverbindungen zwischen einem Maximum und Minimum im Gebiet von 550--500 rett errechnet. Eisen wurde alsPhenanthrolinkomplex photometrisch best immt.

]~xtinktionsmessungen im sichtbaren Gebiet wurden mit dem Spektro- photometer von Zeiss-Ikon durchgeführt. Zur Extinktionsmessung im violetten und ultravioletten Gebiet diente ein Doppelmonochromator nach POHL mit Steinsalzprismen, Quarzlinsen und Photozellen mit Na- tr iumkathode. Als Lichtquellen fiir das violette und ultraviolette Gebiet

~~ HEIDELBEROEa, M.: J. biol. Chem. (Am.) äg, 31 (1922). - - 23 FERRY, R. M. u. A. A. GR~E)Z: J. biol. Chem. (Am.) 81, 175 (1929). - - 24 GI¢EE~, A. A.: J. biol. Chem. (Am.) 93, 495 (1931). - - 25 TAYLOR, J. F. u. A. B. HASTI~¢GS: J. bio]. Chem. (Am.) 131, 649 (1939). - - se EVELY~, K. A. u. H. T. MALLOY: J. biol. Chem. (Am.) 126, 655 (1938). - - 2~ HAVE~IAN~, R., F. JVNG, B. v. ISSEKUTZ jun.: Biochem. Z. 3@1, 116 (1939).

394 M A N F R E D K I E S E :

wurden verwandt: Eine 1000-Watt-Glühlampe, die Quecksilber- und die Cadn{iumspektrallampe von 0sram, ferner der Eisenbogen nach PFUNDT 28.

Als Maß für die Extinktion wurde die Extinktionskonstante angegeben,

K ---- In ? 1 1 • ~ - . ~ .

c Konzentration in Grammatom Eisen im ccm, d Schichtdicke in cm.

II. Darstellung des VerdoglobincN. Die früher erreichte vollständige Umwandlung des Hämoglobins in

Verdoglobinc~ 1 hatte sich bei späteren Versuchen nicht mit gleicher Regel- gg

gg

/8

16

i .

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0 680 6qO 800 560 520 ¢80 ~¢0 qO0 360 J20 2.80

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Abb. 1. Ex t ink t ion des VerdoglobincN und Verdig]obinc~T. ooo V e r d o g l o b i n , ... V e r d i g l o b i n . A b s z i s s e : W e l l e n l ä n g e

i n m # . O r d i n a t e : E x t i n k t t o n s k o n s t a n t e K = ] n I , 1 1

¢ K o n z e n t r a t i o n i n G r a m m a t o m F e / c c m ; d S c h i c h t e i n c m .

mäßigkeit reproduzieren lassen. Als Ursache ergaben sich Schwankun- gen der Wasserstoff- ionenkonzentration in Abhängigkeit von dem angewandten Cyanid- präparat. Darum wxtrde jeweils die für ange- wandte Cyanidmenge zur Erreiehung eines p~ von 6,0 erforderliche Menge Phosphorsäure durch Bestimmung der Wasserstoffionen mit der Glaselektrode ermittelt.

In ein Reagenzglas von 100 ccm wurden 2 g Kaliumcyanid eingewo- gen und in 31 ccmWasser gelöst. Sofort nach Zu- satz von 5 ccm Phosphor- säure (50 g HaPO 4 in 100 cem) wurden in der Lösung 9 ecm rote Zellen

vom Rinde suspendiert und unter kräftigem Rühren 3 cem Perhydrol (Merck) zugefügt. Dann wurde das Gef/~ß mit einem Korkstopfen leicht verschlossen und für eine Stunde in ein Wasserbad von 38 400 gebracht. Anschließend wurde mehrere Tage im Cellophanschlauch in der Kälte gegen fließendes Wasser dialysiert. Bei der Umsetzung war der größte Teil des Globins den~turiert worden, l~acl~ dem Zentrifugieren blieb eine Lösung mit 0,5--1 g Verdiglobin in 100 ecm.

28 P F U N D T , Æ. H.: Astrophysic. J. 27, 296 (1908).


III. Extinktionskonstanten des VerdoglobincN. Für die Messung der Extinktion des Verdoglobinc~ wurden Lösungen

verwendet, die weniger als 5 % des Globins als unverändertes H~moglobin enthielten. Der Farbstoff lag nach der Dialyse als Verdiglobin vor. Vom denaturierten Protein wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und dann von der Stammlösung geeignete Verdünnungen her- gestellt. Diese enthielten 0,01 Mol/1 Phosphat vom PK 6,8. Das Verdoglobin wurde durch Reduktion mit Di- thionit erhalten. Aus dem Mittel von je 6 Messungen wurden die in Abb. 1 wiedergegebenen Kurven konstru- iert. Die genauen Werte der 680

660 Extinkt ionskonstanten bei 640 verschiedenen Wellenl~ngen 620 sind aus Tabelle 2 zu ent- 600

595 nehmen. VerdoglobincN hat 585 sowohl im roten wie im 570 blauen Gebiet eine stärkere 565 55O Extinkt ion als Verdiglobin. 530

Die Ext inkt ionsmaxima 510 48O

liegen ein wenig weiter im 460 kurzweiligen Gebiet. Beide 440 haben noch im gelben bzw. 430

423 grünen Gebiet ein eben er- 418 kennbares Maximum, das 410 VerdiglobincN etwa bei 400 38o 565 m# und das Verdoglobin 360 bei 580 m,u. I m blauen Ge- 340

320 biet steigen die Extinktions- 300 kurven steil an und fallen 290 auch wieder steil ab wie die

Tabelle 2. Extinktion«konstanteu des VerdiglobincN und VerdoglobincN. K : l n /o . 1 . 1 .

I c d ' c Konzentration in GrammatomFe/ccm d Schichte in ccm.

Verd ig lob inc5 T V e r d o g l o b i n c N

K " 10 -~ m # m/~

0,86 680 1,12 660 1,49 640 1,92 630 2,39 620 2,44 610 2,35 590 2,14 580 2,10 570 1,80 550 1,64 530 1,67 510 4,0 490 7,3 480

12,4 460 15,0 440 18,0 435 16,0 430 12,0 420 10,0 410 9,0 400 8,5 390 8,4 38O 8,6 9,5

10,0

K " 10 -~

0,62 1,36 2,72 3,53 2,97 2,42 1,86 1,86 1,54 1,36 1,23 1,36 1,54 1,8 4,0

11,0 17,0 21,0 19,0 13,5 10,8 8,7 7,6

des Hiimog]ohins, doch erreichen, sie nur etwa die halbe Höhe der des H~moglobins. Auch ist c~ie Lage des Maximums von der des H/~miglobins und H~moglobins verschieden, n~mlich VerdiglobincN bei 423 m/~ und Verdoglobincx 430 m/~. I m langwelligen ultravioletten Gebiet ist die :Extinktion des Verdiglobincz ~ höher als die des H~miglobins und steigt gegen 290 m# noch an. Für das Verdoglobinc~ und Verdoglobinz~o, werden Konstanten für dieses Gebiet nicht angegeben, da das zur Reduktion ver- wendete Dithionit hier sehr s tark absorbiert.

396 MANFRED KIEs~:

Die Ex t i nk t i on des Verdiglobinc~ n wurde von Wassers tof f ionen im Bereich von PH 5 - - 1 0 n ich t bee inf luß t und wurde auch durch Zusa tz von Blausäure oder St ieks toffwassers toffsäure n ich t ve rände r t .

IV. Eigenscha•ten des YerdoglobincN. Über das chemische Verha l ten des Verdoglobinc~ i s t in f rüheren Ver-

öffent l ichungen 1,11 schon einiges be r ich te t worden, so die le ichte Oxyda- t ion durch Sauerstoff , d ie

Tabelle 3. Die Reduktion von Hämiglobin und Verdiglobinc~ durch Ascorbinsäurc.

Hämiglobin . . . . . . . . bzw. Verd~globincN . . . . Asc0rbinsäure . . . . . . . Pyrophosphat p~ 6,9 . . . Natriumazid . . . . . . . .

Temperatur: 370 .

1,8 g/100cem 1,9 g/100ccm 0,05 g/100 ccm 0,03 Mol/1 0,003 Mol/1

Anfangsgeschwindigkeit der Reduktion. Auf- nahme von ccm CO durch 3,6 ¢cm der Lösung in l0 Min.

{ .~.~. ~~iiI

Ohne Azid . . . . . . . . . { 10,0 7,0 Mit 0,003 Mo]/1 Azid . . . . 6,5

Tabelle 4. Wirkung des Fluorids au/die Reduktion von Hämiglobin und VerdiglobincN durch

Ascorbinsäure. Hämiglobin . . . . . . . . bzw. Verdiglobin . . . . . . Ascorbinsäure . . . . . . . Phosphat PH 7,4 . . . . . Natriumfluorid . . . . . . .

Temperatur: 370 .

2,9 g/100 ccm 1,9 g/100 ccm 0,05 g/100 ccm 0,02 Mol]l 0,2 Mol/1

Anfangsgeschwindigkeit der Reduktion. Auf- nahme von.cmm CO durch 3,6 ccm der Lösung in l0 Min.

H b I I I . ~III VDc•

Ohne Fluorid . . . . . . . . 10,0 7,0 Mit 0,2 Mol/1 Fluorid . . . . 4,5 7,0

geringe Fes t i gke i t de r K o h l e n o x y d b i n d u n g , E ine der auffä l l igs ten Erschei- nungen is t das Feh len e iner Ände rung der L ich tabsorp- t ion des Verdiglobinc~~ u n t e r dem Einf luß von Wassers to f f ionen und Blau- s~ure, das ve rmu ten l ieß, daß das Verdiglobinc~ mi t Cyanid, Azid, F luo r id u. a. keine Verb indung b i lde t . Diese A n n a h m e wurde auf e inem anderen Wege be- s tä t ig t . Die R e d u k t i o n des Hämig lob ins durch die ver- schiedensten Stoffe wurde gehemmt , wenn das H ä m i - g lobin in eine Verb indung

wie H/~miglobincyapid, -azid, -f luorid oder ähnl iche übergeführ t würde. Es i s t anzunehmen, daß die Re- duk t ion des ve rd ig lob in s zu Verdoglobin ebenfal ls gehemmt würde, wenn es eine Verb indung mi t Cyanid bi ldete . Fe rne r ve rmag Hgmig lob in die Oxyda t ion

des H~moglobins zu Hämig lob in durch Chlora t zu ka t a lys i e ren 29, 30. Diese Wi rkung se tz t wahrscheinl ich eine Bindung des Chlorats an das Eisen des ]-Iämiglobins voraus , denn sie wird durch Cyanid gehemmt .

~9 HEUB•ER, W, u. F. Ju~c: Schweiz. med. Wschr. 1941, 247. - - Ber. dtsch. chem. Ges. 7~, 1636 (1942). - - 30 KI~SE, M., E. SAVlk~-I u. W. SeHWARTZKOPFF: Bio- chem. Z, 817, 32 (1944).


Die Reduktion des Hämiglobins und Verdiglobins wurde mit Ascorbin- säure durchgeführt und wie in früheren Untersuchungen sl manometrisch im WARBURo-Apparat gemessen durch Best immung der von dem gebildeten Hämoglobin bzw. Verdoglobin aus dem Gasraum aufgenommene Menge Kohlenoxyd. Die angewandten Konzentrationen des Hämiglobins bzw. Verdiglobins, der Ascorbinsäure, des Puffers und des Azids bzw. Fluorids sind aus Tabelle 3 und 4 zu entnehmen. Die in diesen Tabellen v«iedergegebenenVersuche zeigen einwandfrei, daß die Reduktion desVerdi- globins durch Azid und Fluorid nicht gehemmt wird, während die des

Tabelle 5. Ein/luft von VerdiglobincN und Hämiglobin au/ die Oxydation des Hämoglobins durch Chlorat zu Hämiglobin.

Hb II . . . . . . . . 0,12 g/100 eem Hb III . . . . . . . 0,002 g/100 cem NaC10 a . . . . . . . 0,1 Mol/1 Phosphat PH 6,6 . . 0,02 Mol/1

Temperatur: 17%

Zlmatz Hb I I I in g/I00 ccm gebildet in ]Y[inuten nach Zugabe von Chlorat

Vl~II I 0,011 g/100 ccm -~'c~ " •

0,012g/100 ecm Hb III . .

2 0,002 0,002

0,005

4 0,005 0,006

0,012

6 8 0,010 0,017 0,010 0,018

0,020 0,030

H~miglobins durch Azid vollständig gehemmt und durch Fluorid in der angewandten Konzentration auf die halbe Geschwindigkeit vermindert wird.

Die Bedingungen, unter denen die katalytische Wirkung des Hämi- globins und Verdiglobins auf die Oxydation des Hämoglobins durch Chlorat zu Hämiglobin geprüft wurde, sind aus Tabelle 5 ersichtlich. Die ebenfalls in der Tabelle 5 enthaltenen Messungsergebnisse lassen erkennen, dal~ das Verdiglobinc~ eine katalytische Wirkung auf die Reaktion zwischen

• Hämoglobin und Chlorat nicht besitzt. Zusammen mit dem Fehlen spektrophotometrischer Änderungen dürften

die vorstehend beschriebenen Versuchsergebnisse es im höchsten Maße wahrscheinlich machen, daß Verdiglobinc~- nicht mit Cyanid oder Azid u. a. eine Verbindung bildet entsprechend dem Hämiglobincyanid.

V. Darstellung des VerdoglobinNo« Durch systematische Änderung der wesentlichen die Bildung von Verdo-

globinNo~ beeinflussenden Faktoren, nämlich der Konzentrationen von H~miglobin, ~Titrit, Wasserstoffperoxyd, Wasserstoffionen und der Tem- peratur, ergaben sich folgende Bedingungen als die günstigsten für die

31 KIES:E, M.: Bioehem. Z. 316, 264 (1944).

398 * MANFRED KIESE:

Bildung von VerdoglobinNo.: t tämoglobin 3" 10-aÄquivalente/1, Nitr i t 0,15 Mol/1, Wasserstoffperoxyd 5--10" 10 -a Mol/1, Wasserstoffionen 10 -«,2 Mol/1, Phosphat 0,1 Mol/1. Als Reaktionstemperatur wurde Zimmer- temperatur gew~hlt. Zwar konnte durch Erhöhung der Temperatur auf

Tabelle 6. Einfluß der Nitritkonzentration au] die Bildung von Verdoglobin~o ~ durch

Nitrit und Wassersto//peroxyd. Hämoglobin 3 • 10 -a Äquivalent/1

Wasserstoffperoxyd 5 • 10 -a Mol/1, Pl~ 6,2 Reaktionsdauer 1 Stunde.

l~itrit Verdoglobin Mol/1 Äquivalent/1 • 10 ~

0,008 0,025 0,075 0,15 0,30

1,3 2,0 2,50 2,75 2,75

400 die Reaktionsgeschwindigkeit so beschleunigt werden, dal~ die Re- aktion in 3 Min. beendet war, doch wurde der Rest von unverändertem ]-Iämoglobin dabei nicht merklich vermindert. Verringerung der Was- serstoffperoxydkonzentration unter 3.10 -a Mol/1 - - unter sonst gleichen Bedingungen - - verlangsamte die Reaktion und verminderte die Aus- beute, während ihre Erhöhung über 10 -3 Mol/1 eine stark zunehmende Denaturierung des Proteins verur-

sachte. Der Einfluß der Nitri tkonzentration ist aus Tabelle 6 ersichtlich. Wasserstoffionen beschleunigen die Verdoglobinbildung. Unterhalb Pn 6 wird jedoch die Ausbeute an Verdogl0bin wieder geringer und der durch Denaturierung ausfallende Anteil des Proteins wird größer. In der Tabelle 7

Tabelle 7. Einfluß der Wassersto//- ionenkonzentration au] die Bildung VerdoglobinNo ~ durch Æitrit u ~

Wassersto]]Teroxyä. Hämoglobin 3 • 10 +a Äquivalent/1 Wasserstoffperoxyd 5 • l0 -a Mol/1

~qitrit 0,15 Mo]/1 1)hosphat 0,1 Mol/1

Reaktionsdauer 1 Stunde.

P H Verdoglobin Äquivalent]l - 103

6,0 6,75 7,3 7,7 8,5

2,8 2,6 2,2 1,9 1,4

sind einige Messungen des Anteils an Verdoglobin enthalten, der bei verschiedenen Wasserstoffionenkonzentrationen nach einer Stunde erreicht wurde. Durch kleine Mengen von Kupfersalzen, z .B. Kupfersulfat in einer Konzentration von etwa 5-10-4Mol/1, wurde die Reaktion beschleunigt, w/~hrend der Zusatz von Eisen-, Kobalt- , Cer- oder Mangansalzen ohne merklichen Einfluß war. Durch Zu- satz von Kupfersulfat wurden die besten Ausbeuten erhalten, nämlich Umwand- lungen von 95--96% des Hämoglobins. Die Gegenwart von Ferrieyanid war ohne Einfluß auf die Bildung von Verdiglobin~-o~ ,

durch Cyanid wurde die Reaktion stark gehemmt. Wurde die Lösung nach Ablauf der verdoglobinbildenden Reaktion dialysiert und nachher erneut mit Zqitrit und Wasserstoffperoxyd behandelt, so wurde damit keine weitere Umwandlung von Hämoglobin in Verdoglobin erreicht.

In der oben erwähnten Zusammensetzung wurden meist Ansätze von insgesamt 14--15 ccm gemacht. Je nach Hämoglobingehalt wurden 2- -3 cem rote Zellen mit Wasser auf 10 ccm verdünnt. Nach der I-Iämo-

Darstellung und Eigenschaften von Verdoglobinen. ' 399

lyse wurden 2 ccm Phosphat und 2 ccm Nitrit 1,0 Mol/1 zugesetzt und gleich danach unter kräftigem Umrühren 1 Tropfen Perhydrol Merck oder 0,5 bzw. 1 cem einer entsprechend verdünnten Lösung von Wasser- stoffperoxyd. Die Ansätze blieben 6--8 Stunden bei Zimmertemperatur unter gelegentlichem Umrühren stehen und wurden dann in Cellophan- schli~uchen mehrere Tage in der K~lte gegen fließendes Wasser dialysiert. In der Lösung, die durch Zentrifugieren von denaturiertem Protein befreit war, lag der grüne Farbstoff als Verdiglobin vor.

VI. Extinktionskonstanten des VerdoglobinNo. Zur Bestimmung der ]~xtinktionskonstanten des Verdoglobin~o ~

wurden Lösungen verwendet, die 5--10% des gesamten Globins als unver- ändertes ttämoglobin 1~ A ] enthielten. Die Stamm- / I [ lösungen wurden mit ,1~ /~!/at/~n~Veßd&/ob/n 0,01 Mol/1 Ph0sphat- ~. 10 lösung von PH 6,8 auf geeignete Konzentration

I/er~ " verdünnt. Die in Abb. 2 dargestellten Extink- ~~ / ':

tionskurven wurden nach dem Mittel von ~ j ~ j ' ~ . . _ _ _~~ / je 4 Messnngen mit ge- . ~ ringer Streuung gezeich- net. Die genauen Werte 7~ »so szo t~0 -5~ ~ ~~v .««o ag0 «¢o sog

Wellen/Onge ~~

der Extinktionskonstan- A b b . 2 . E x t i n k t i o n d e s V e r d o g l o b i n l ~ 0 2 u n d V e r d i g ] o b i n N o s;

ten sind in Tabelle 8 o o o V e r d o g l o b i n , . . . V e r d i g l o b i n . A b s z i s s e : W e l l e n l ä n g e i n I c ] 1 enthalten, m ~ , O r d i n a t e : E x t i n k t i o n s k o n s t a n t e , K = i n ~ - • 7 " d- ;

Verdiglobin~o2hatim c = K o n z e n t r a t i o n i n G r a m m a t o m F e ] c c m ; " d = S c h i c h t e i n c m .

roten Gebiet ein Maxi- mum bei 615 m/t und Verdoglobin~o~ ein solches mit etwas größerer Extinktion bei 620 mit. HAV]~MA~NS 1° etwas abweichende Angaben be- dürfen wohl einer Korrektur wie seine Daten über die Extinktion des Verdoglobinc~ (KI]~SE und KAESKE1). Beide Formen des Farbstoffs haben wahrscheinlich ebenso wie Verdoglobinc~ noch je ein schwach ausge- prägtes Maximum zwischen 600 und 550m/t. Die Beimischung von H~moglobin in den untersuchten Lösungen macht ihre genaue Bestim- mung unmöglich.

Die ]~xtinktion des Verdiglobins im blauen und violetten Gebiet ist erheblich geringer als die des Hämiglobins und auch geringer als die des Verdiglobinc~. Die ]~xtinktionskurve erhebt sich sehr allmählich zu einem wenig ausgeprägten Maximum bei400mtt. Im ultravioletten Gebiet zwischen 400 und 300mit ist die ]~xtinktion erheblich größer als die des Hämiglobins.

400 M A N F R E D K I E S E :

Das durch Reduktion mit Dithionit aus dem Verdiglobin~o2 erhal tene Verdoglobin weist eine schmSlere Extinktionsbande inl blauen Gebiet auf

nlit einem Maximum bei Tabelle 8. Ext ink t ionskons tanten des Verdi91obini~ o ,

und VerdoflobinNoù.

K = l n I ° - 1 . ! . I c d '

r. Konzentration in Grammatom Fe/ccm d Schichte in ccm.

VerdiglobiaNo o. VerdoglobinNoù

m i t K • 1 0 - 7 mt~ K " 1 0 - ~

690 0,80 670 1,18 650 1,80 630 2,49 615 3,05 600 2,73 58O 2,37 560 2,05 540 2,05 520 2,18 500 2,73 480 4,0 460 6,3 440 9,2 420 11,9 410 13,0 400 13,7 390 12,0 380 11,0 360 10,0 350 9,2 330 7,6 310 7,2

690 0,80 670 1,24 650 2,05 630 3,36 620 3,73 610 3,48 590 2,67 570 2,30 550 2,05 530 1,93 510 1,93 490 2,98 480 4,0 460 6,2 440 9,2 430 11,0 420 I 1,6 410 10,5 400 9,5 38O 7,6

420 m#. Die Extinktion im Maximum ist geringer als die des VerdiglobinsNo~ bei 400 m#.

Die Extinktionskurven des Verdiglobin~-o, und Ver- doglobin~o ~ sind denen des H~miglobins und H/~moglobins weniger /~hnlich als die der anderen Verdogtobine.

¥II. Reduktion des Verdo- globinNo~ zu H[imoglobin.

Die Oxydation von Hä- moglobin zu Verdoglobin wurde von Wasserstoffionen in dem Sinne beeinflußt, daß mit steigender Wasserstoff- ionenkonzentration bis zu einer gewissen Grenze die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Verdoglobin- bildung zunahm. Für eine Umkehr der Reaktion war dann niedrige Wasserstoff- ionenkonzentration als gün-

stige Bedingung zu erwarten. Während bei neutraler oder saurer Reak- tion das Verdoglobin~To, in Gegenwart von Dithionit recht beständig war, wurde es in alkalischer Lösung langsam zu H~moglobin reduziert. In Abb. 3 ist ein Versuch wiedergegeben, der die Reduktion des Verdoglo- binNo~ zu Hämoglobin zeigt: Das Verdoglobin wurde in eine Lösung von 0,10 Mol Carbonat vom PH 10 gebracht, und der Trog nach Zusatz von Dithionit ohne Zurücklassung von Luftblasen mit einem Gummistopfen fest verschlossen. Nach 12 Stunden bei Zimmertemperatur war ein großer Teil des Verdoglobins zu ttämoglobin reduziert. In weiteren 12 Stunden lief die Reaktion noch ein wenig weiter, w/~hrend in den folgenden 36 Stunden keine meßbaren Ver/~nderüngen eintraten. Die Reaktion blieb bei einem Gemisch stehen, das noch einen leicht nachweisbaren Anteil von Verdoglobin enthielt. Wahrscheinlich war hier auch wieder ein Gleich- gewicht erreicht, wie bei der umgekehrten Reaktion. Ebenso wie im roten


und grünen Gebiet t ra t bei der Reduktion auch im violetten Gebiet eine entsprechende Änderung der Extinktionen ein. Die Extinktion nahm zu, und das für das Hämoglobin charakteristische Maximum bei 429 m,u t ra t deutlicher hervor (Abb. 4). Aus der Extinktionskonstanten, die als Ordinate aufgetragen ist, ist ersichtlich, daß dieUmwand- lung keineswegs vollständig ist, denn Hämoglobin hat bei 430m H eine Extinktionskonstante von K ~ 30.10L ])as aus dem Ver- doglobin~qo, erhaltene Hämo- globin unterschied sich in seiner Kohlenoxydverbindung nicht meßbar von Hämog]obin, das vorher nicht in Verdoglobin verwandelt war.

4°i I I I I I I I ] / / 2,~ --Exh'nk#on «oforl noch Zus~Iz von D/lh/on/l~

J ~,.;

~ESO 660.8qO Ggo 600 5gO 500 5qO 520 500 qSO~~ -*--- We/lenldnge I

Abb, 3. R e d u k t i o n von Verdog]obinl~O~ zu Hämo- g l o b i n . V e r d o g l o b i n 2,2 • 10 -~ Ä q u i v a l e n t / c e m i n C a r b o n a t 0,1 m o l P H 10. % × × E x t i n k t i o n s o f o r t n a c h Z u s a t z v o n D i t h i o n i t ; ooo n a c h 16 S t u n d e n ;

• . n a c h 36 S t u n d e n .

Schneller und vollständiger verlief die Reduktion des Verd~¢o, zu Häm, wenn es nicht an Globin gebunden war in Form des Verdoglobins, sondern als Verdochromogen an eine organische Base. Die Reduktion des Pyridin-

20

/8

1 is

verdochromogen~¢o2 durch Dithionit verlief schnell, aber auch nicht vollständig, sondern bis zu einem Rest Verdochromogen. Zur Durchführung der Reduktion wurde Verdo- globinNo ~in einer Konzentration von 2- -3 .10 -4 Äquivalent in eine wäßrige Lösung von 20 ccm Pyridin in 100 ccm gebracht, im vollständig gefüllten Untersuchungstrog mit Dithionit reduziert, und der Trog sofort zum Ausschluß von Sauerstoff mit einem Gummistopfen verschlossen. Der Ablauf der Reduktion des Verdochromogens war beim Hydrazinverdo- chromogen leicht spektrophotometrisch zu ver- folgen. Abb. 5 gibt den Verlauf der Reaktion wieder. Verdoglobin war in einer Konzentra- tion von 2 m 3 . 1 0 -4 Äquivalent/1 in einer wäßrigen Lösung von 30 ccm Hydrazinhydrat in ]00 ecm gehSst. Der Untersuchungstrog wurde mit der Lösung vollständig gefüllt und ohneZurücklassung von Luft mit einem Gummi-

/ \ \

~~/Inkll'on.sofoPt nach 2 - - ~ --Z/.malz von ~~/on#----

I I 1 I 500 qSO q6'O q~tO q30 qO0 380"1~B,

WelleMOnge A b b . 4. E x t i n k t i o n s ~ n d e r u n g i m v i o l e t t e n G e b i e t be i d e r R e d u k t i o n v o n V e r d o g l o b i n N 0 s zu H ~ m o g l o b i n . 0 r d i n a t e : E x - t i n k t i o n s k o n s t a n t c . . . . E x t i n k - t i o n s o f o r t n a c h Z u s a t z v o n D i t h i o n i t . ooo 36 S t u n d e r i s p ä t e r .

stopfen verschlossen. Die Geschwindigkeit der Reduktion nahm mit dem Fortschreiten schnell ab (vgl. Kurve 1, 2 und 3, je 30 Min. Abstand) und blieb noch mehrere Stunden unter Erhaltung eines Restes von unverän- dertem Verdochrom0gen stehen.

Archiv f i ir exper iment . Pa t l l . u. Pharmakol . Bd. 204. 26

402 MANFRED K I E S E :

Die Reduktion von Ammoniakverdochromogen~o~ zu Hgmochromogen durch Dithionit verlief noch langsamer als die des Hydrazinverdochromo- gens. Somit sind auch für die Reduktion des Verds zu H/~m Eigenschaften des Chromogenbildners von Bedeutung. Entsprechende Beziehungen sind für

« ffin.nadl Zusa/z von

e

ach 7« ,7/d

\ . . /

I 700 680 660 6qO 6"JO 800 580 560 5qO ~ 0 500 qSO q60

WellenlOnge ~1.~ A b b . 5. R e d u k t i o n v o n H y d r a z i n v e r d o c h r o m o g e n N o s z u H y d r a z i n h ä m o c h r o m o g e n . V e r d o g l o b i n N o 2 i n 50 % H y d r a z i n h y d r a t . × x × 2 Min . n a c h Z u s a t z v o n H y d r a -

z i n h y d r a t . 00o n a c h 40 M i n . . . . n a c h i 2 S t u n d e n .

die Oxydation des Harns zu Verd ebenfalls bekannt a2.

Aus den Extinktions-" kurven ist zu entnehmen, daß weder bei der Reduk- tion des Verdoglobins zu Hämoglobin noch bei der Reduktion des Verdochro- n~ogens zu Hamochromogen Verd ausschließlich in Harn übergefiihrt wird, vielmehr muß ein Teil des Verd in andere Verbindungen ohne charakteristische Extink- tion übergehen.

Bindung des Verdoglo- bins an Kohlenoxyd ver-

hinderte seine Reduktion zu I-I~moglobin. In Karb0nat vom PH 10 wurde KohlenoxydverdoglobinNo 2 auch durch tagelange Einwirkung von Di- thionit nicht verändert. Die Reduktion des ]-Iydrazinverdoehromogens zu H~mochromogen erfuhr durch Bindung des Verdochromogens aa Kohlenoxyd eine erhebliche Verlangsamung.

VIII. Weitere Eigenschaften des VerdoglobinNo« VerdiglobinNo 2 ~nderte seine Extinktion mit Änderung der Wasserstoff-

ionenkonzentration im Bereich von p• 5--10 nicht. Auch der Zusatz von Blaus~ure war ohne Einfluß auf die Extinktion. Es ist daher wahrscheinlich, daß das Verdiglobin im Bereich der genannten Wasserstoffionenkonzentra- tionen die Ladung seines Eisens nicht ~ndert und Blausi~ure nicht bindet.

Besonders hervorgehoben sei die in Abb. 5 wiedergegebene Extink- tionskurve des I-Iydrazinverdochrõmogen);o« Die Kurve besitzt ein Maximum bei 615 m/z. Die Kohlenoxydverbindung des Hydrazinverdo- chromogens hat ein Maximum ebenfalls bei 615 m#. Die Lage des Maxi. nmms des Hydrazinverdoehromogen~o 2 bei 615 m/t ist b~sher der einzige sichere Unterschied in der Extinktion des Verdöglobin~o ~ und Verdo- globin s. Dieses bildet - - wie unten noch gezeigt ,wird - - ein Hydrazin- verdochromogen mit einem Maximum bei 605 m#. Das Pyridinverdochro- mogen~o 2 hatte im roten Gebiet ein Maximum bei 610 m/z.

32 KIESE, M.: Naturw. 30, 587 (1942).


IX. Darstellung des Verdoglobins.

Ausführliche schon früher erw/ihnte Messungen der Umsatzgeschwindig- keit der einzelnen ReaktionslSartner haben gezeigt, daß die Reaktion von H~moglobin mit Schwefelwasserstoff und Sauerstoff zu Schwefel und Verdoglobins eine gekoppelte Reaktion ist in dem Sinne, daß einerseits der Schwefelwasserstoff die Oxydation des H~moglobins zu Verdoglobin katalysiert und andererseits das H~moglobin die Oxydation des Schwefel- wasserstoffs zu Schwefel- und anderen Oxydationsprodukten beschleunigt 33. Die Beschleunigung der Oxydation des Schwefelwasserstoffs ist durch den Anfall unter Umständen großer Mengen von elementarem Schwefel sinnf~llig. HAUROWITZ s4 hat sie bereits manometrisch gemessen. Die Kopplung der Reaktionen ist aber nicht so fest, daß ein stöchiometri- scher Umsatz erfolgte, vielmehr war das Verhältnis von oxydiertem Sehwe- felwasserstoff zu gebildetem Verdoglobin von den Konzentrationen der Reaktionspartner, besonders dem Verhältnis der Schwefelwasserstoff- konzentration zur Sauerstoffkonzentration abhängig. War der Sauerstoff- druck hoch (1500 mm Hg) im Verhältnis zum Schwefelwasserstoffdruck (500 mm Hg), so wurde schnell eine große Menge Schwefelwasserstoff oxydiert und schnell Verdoglobin s gebildet, dieses aber nur in geringer Menge. Höchstens die Hälfte des Hänmglobins wurde zu Verdoglobin oxydiert. Bei hohem Sehweielwasserstoffdruck (750 mm Hg) und niedrigem Sauerstoffdruek (15 mm Hg) verlief die Oxydation des Schwefelwasser- stoffs wesentlich langsamer. Auch die Verdoglobinbildung verlief langsamer, doch wurde bei genügend langer Einwirkung eine weitere Um- wandlung des H~moglobins in Verdoglobin erreicht als durch gleic h lange Behandlung mit Schwefolwasserstoff und hohem Sauerstoffdruck. Unter der Einwirkung hohen Schwefelwasserstoff- und Sauerstoffdrucks wurde Verdoglobin auch in beträchtlichem Umfange zerstört.

Wasserstoffionen begünstigten bis zu einer Konzentration von 10 -6 Mol/1 die Bildung des Verdoglobins ebenso wie die der anderen Verdoglobine.

Als Produkt der Reaktion von H~moglobin mit Schwefelwasserstoff und Sauerstoff wurde regelmäßig neben Verdoglobins H~miglobinsulfid erhalten. Das gesamte Hi~moglobin, das nicht in Verdoglobin verwandelg war, lag in dieser Form vor. Es mußte also in einer Nebenreaktion I-Igmo- globin zu Hämiglobin oxydiert worden sein, das dann mit dem Schwefel- wasserstoff Hämiglobinsulfid bildete. Eine Verbesserung der Ausbeute an Verdoglobin s erschien möglich, wenn die verdoglobinbildende Reaktion gegenüber dieser Nebenreaktion beschleunigt werden konnte. Zusatz von Hydroxylaminchlorid beschleunigte die Verdoglobinbildung stark, ohne allerdings die Ausbeute wesentlich zu verbessern.

a3 Die Protokolle dieser Untersuchungen sind zur Zeit nicht zugänglich und werden später veröffentlicht werden. - - 34 HAUROWITZ, F. : Enzymologia (Nd.) 10, 141 (1941).

26*

404 }IANFRED KIESE :

Die spektrophotometrische Verfolgung der Umwandlung von Hämo- globin in Verdoglobin ergab einen weiteren Hinweis dara.uf, daß diese Reaktion zu einem Gleichgeu4cht führt (Abb. 6). Wurde in eine Lösung von 0,5 g Hämoglobin/100 ccm vom PH 6,3 Sehwefelwasserstoff einge- leitet, so entwickelte sich schnell die Bande des Verdoglobins im roten Gebiet, während die Extinktion bei 550 m# abnahm. Die Extinktions- kurven der Gemische bildeten zwei Schnittpunkte bei 580 und 535 m/~. Die Verdoglobinbildung verlangsamte schon nach 10Min. sehr stark. Später erst traten dann die beiden Maxima des Hamiglobinsulfids im

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Abb. 6. U m w a n d l u n g v o n H ~ m o g l o b i n i n ~ d o g l o b i n s ( lurch Sehwefe lwasse rs to f f u n d Sauers tof f . t t ä m o g l o b i n 3"10 -7 Ä q u i v a l e n t je c c m in P h o s p h a t 0,05 mol PI t 6,2. Schichte 1 cm. Schwefe lwasse rs to f f e inge le i t e t u n d ver - schlossen. T e m p . 16 °. K u r v e 1 n a c h 1 Min., l~n rve 2 n a c h 5 Min., I~urve 3 n a c h 10 Min.,

K u r v e 4 n a c h 15 Min.

grünen Gebiet hervor. Eine Verbesserung der Aus-

beute an Verdoglobin erschien unter diesen Bedingungen nur noch möglich durch Verstärkung der oxydierenden Wirkung. Wasser- stoffperoxyd und andere Peroxyde wurden als Oxydationsmittel ge- nannt, die in Gegenwart v(m Schwefehvasserstoff ans ]~ämo- globin "Verdoglobin bilden (MI- CHELT). Wie weiter unten gezeigt wird, entsteht jedoch bei der Oxy- dation von Hämoglobin durch Wasserstoffperoxyd in Gegenwart von Schwefelwasserstoff nicht Ver- doglobins, sondern Verdoglobincx.

Eine allzu lange Behandlung des Gemisches von Hämoglobin und Verdoglobin, insbesondere mit hohen Sauerstoffdrucken, führte zu weiteren Veränderungen des Verdoglobins, die sich in der Entwicklung einer Erhebung der Extinktionskurve um 640 m/z manifestiert und schließlich zu einer Zerstörung des Verdoglo- bins führt.

Als Verfahren zur Darstellung des Verdoglobins, d. h. eines Gemisches von Veßdoglobin s mit möglichst wenig Hämiglobin wurde schließlich folgendes benutzt: 2,5 ccm rote Zellen wurden in ein schlankes Stand- gefäß von 150 ccm Inhalt gegeben und mit 7,5 ccm Wasser hämolysiert. Nach Zusatz von 2 cem Phosphat 1,0 Mol/1 PH 6,2 wurde das Gefäß mit einem Gummistopfen, der von einem Hahn durchbohrt war, fest verschlossen. An der inneren Seite des Gummistopfens war eine kleine Glas- schale befestigt zur Aufnahme von Hydroxylamin oder anderen Zusätzen, die nach Herstellung der gewünschten Gasmischung der Lösung zugesetzt werden sollten. Das Gefäß wurde nun zur Entfernung des Sauerstoffs evakuiert und danach Sehwefelwasserstoff bis zu einem Druck von 760 mm


Hg eingelassen. Schließlich wurde noch Sauerstoff mit einem Part ialdruck von 15 mm Hg zugesetzt. Nach kurzem Durchmischen Wurden 40 bis 50 mg Hydroxylaminhydrochlorid, die vorher in die kleine Schale ein- gewogen waren, in die Lösung eingekippt. Unter langsamem Rotieren des Gefäßes konnte die Reaktion dann 12 Stunden lang ablaufen. Danach wurde wieder evakuiert und für 12---24 Stunden nur Schwefelwasserstoff zur Reduktion des Hämiglobins in das Gefäß eingelassen. Nunmehr wurde wieder evakuiert und das Gefäß kurz geöffnet zur Füllung der Schale mit t tydroxylamin. Die ganze Operation zur Oxydation des Hämoglobins wurde anschließend noch zweimal wiederholt. Nach der letzten 0xydat ion wurde der Schwefelwasserstoff wieder, durch :Evakuierung entfernt und die Lösung zur Dialyse angesetzt. Wenig denaturiertes Protein und elementarer Schwefel wurden schließlich durch Zentrifugieren abgetrennt. Die Lösung enthielt etwa 5 g Globin in 100 ccm, davon etwa 80% als Verdogl0bins, den Rest als t tämiglobin.

X. Bildung von Yerdoglobins durch Arsenwasserstoff und Sauerstoff. Die gekoppelte Oxydation von Hämogh)bin und Schwefe•wasserstoff

liefert Verdoglobin nur in mäßiger Ausbeute, wie eben dargelegt wurde. Ein anderer Weg, der eine voilst~ndigere Überführung des H~moglobins in Verdoglobin s ermöglichte, ist bisher nicht bekannt. E s ist aber für unsere Vorstellungen vom Bau des Verdoglobin s von großem Wert, daß es überhaupt möglich ist, dieses Verdoglobin auch ohne die Anwendung von Schwefelwasserstoff oder einer anderen Schwele]verbindung zu erzeugen, wenn auch in weit schlechterer Ausbeute als mit Schwefelwasser- stoff und Sauerstoff. ~Eine solche Reaktion ist die Umsetzung von Hämo- globin mit Arsenwasserstoff und Sauerstoff, e ine andere die Umsetzung von Hämoglobin mi t Hydroxylamin und Sauerstoff.

Das Eintreten grüner Verfärbung bei der Behandlung von H~moglobin mit Arsenwasserstoff in Gegenwart von Sauerstoff war bereits MEIsSNER3» aufgefallen, aber das Verdoglobin war bisher noch nicht identifiziert worden. JUNG 36 fand eine Zunahme des , leicht abspaltbaren :Eisens" nach dem Einwirken von Arsenwasserstoff auf Oxyh~moglobin, was ebenfalls auf Verdog]obinbildung hinwies. Wir haben Verdog]obin s nicht nur bei der ]~inwirkung von Arsenwasserstoff auf sauerstoffhaltiges Blut in vitro beobachtet, sondern auch in vivo bei akuten Arsenwasserstoffvergiftungen. Wenn durch entsprechend hohe Konzentration von Arsenwasserstoff der Tod in einer halben bis einer Stunde eintrat, wurde im Blut von Katzen Verdoglobin s in einer Konzentrat ion von 2- -3 g/100 ccm gefunden. In vitro verlief die Bildung des Verdoglobins am günstigsten, wenn ~hnlich wie bei der Umsetzung mit Schwefelwasserstoff die Konzentration des

35 MEISS~]~R, R.: Z. exper. Path. u. Ther. 13, 284 (1913). - - a« JVNO, F.: Bio- chem. Z. 302, 294 (1939).

406 MARSHES KIES~:

Arsenwasserstoffs hoch und die des Sauerstoffs niedrig war. Es wurde ebenso verfahren wie im vorigen Abschnitt fiir die Darstellung yon Verdo- globin s beschrieben, mit dem Unterschied, da{~ Arsenwasserstoff s tat t Schwefelwasserstoff verwendet und Hydroxylamin fortgelassen wurde. Das Verdoglobin wurde durch folgende Daten a]s Verdoglobins identifiziert : ])as Verdoglobin mit einem Ext inkt ionsmaximum bei 620 m/~, dessen Kohlenoxydverbindung mit st~,rkerer Extinktion und dem Maximum bei

35 I I I I [

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0 ?00 #60 o'2o 580 5/10 500 /160 ¢~0 380

------ Wel/enl~nge n ~ .

Abb. 7. E x t i n k t i o n des ~ , m i g i o b i n - H y d r o x y | - a m i n s . A b s z i s s e : V ~ ' e t l e n l ~ n g e i n m~t. O r d i n a t e :

E x t i n k t i o n s k o n s t a n t e K = I n - ~ : - ~ - ; c K o n -

z e n t r a t i o n i n G r a m m a t o m F e / e c m , d S e h i c h t e i n c m . I m E i n s a t z : E x t i n k t i o n s k u r v e z w i s e h e n

7 6 0 u n d 5 0 0 m ~ m i t 1 0 f a c h v e r g r 6 ~ e r t e r O r d i n a t e .

615 m/~, ferner das Hydrazin- verdochromogen mit einem Ex- t inkt ionsmaximum bei 605 m/t nnd dessert Kohlenoxydverbin- dung mit einem Maximum bei 615 m#.

XI. Die Umsetzung des Hydro- xylamins mit H[imoglobin. Es ist bekannt, dab Hydro-

xylamin in vitro und in vivo in Gegenwart yon Sauerstoff Ha- moglobin zu H~miglobin oxydiert aT, as, a0, 40, und dab es in vivo Verdoglobin zu bilden vermag 1. Beim Hunde wurde nach Injektion von 50 mg/kg Hydro- xytaminchlorid nach einer Stunde eine Konzentration von 1,2 g Verdoglobin in 100 ccm Blut erreicht.

In vitro verliefen die Um- setzungen des Hydroxylamins

mit I-Iamoglobin bei PH 6,8 verhaltnismaBig langsam. Freilich war die Geschwindigkeit tier Bildung yon Hamiglobin yon der Konzentrat ion des Hydroxylamins abhangig. Jedoch verlief die Oxydation langsamer als durch Nitr i t in gleicher Konzentration. Andererseits wurde die Oxydation des Hiimoglobins zu Hamiglobin durch Verminderung der H+-Konzen- tration (Karbonat yore PK 10) s tark beschleunigt.

Wurde dem Hamiglobin in saurer LSsung ein groBer UberschuB yon Hydroxylamin zugefiigt, so bildete sich eine neue Verbindung: Hami- globin-Hydroxylamin. Ihre Extinlction ist in Abb. 7 wiedergegeben. Die ]~xtinktionskonstanten sind im einzelnen in Tabelle 9 enthalten. Die

a7 BI~z, C.: Virchows Arch. 118, 1 (1888). - - 3s L•wIN, L.: Arch. exper. Path. (D.) 25, 306 (1889). - - a9 LETSCHE, E.: Z. physiol. Chem. 80, 412 (1912). - - 40 H~UB- NER, W.: Arch. exper. Path. (D.) 72, 239 {1913).

Darstellung und Eigenschaften von Verdoglobinen. 4(17

Tabelle 9. Extinktionskonstanten des Hämiglobin-Hydroxylamins.

K = In I° 1 1 , T ' T ' - d

c = Konzentration in Grammatorn Fe/ecm, d = Schichte in cm.

A K • 1 0 - ~ ~ K ' 1 0 - 7 ~" K ' 1 0 - ~ m/L in/z m l t

700 670 650 630 620 610 600 590 580 570

0,21 0,43 0,60 0,82 0,85 0,89 0,96 1,2 1,5 1,9

560 550 540 530 520 510 500 480 460 446

2,0 2,1 2,3 2,4 2,3 2,1 1,9 1,7 2,5 3,9

432 420 414 409 406 404 399 389 379

6,1 18,0 24,9 31,2 28,0 25,8 20,5 15,2 6,5

Verbindung hat ebenso wie das Hämiglobin ein Ext inkt ionsmaximum bei 630 m/z; aber mit einer etwas geringeren ]~xtinktion. ]~in wenig aus- geprägtes Maximum ist zwischen 560 und 570 m# und ein weiteres um 530 m# gelegen. Die SORET-Bande der Verbindung ha t ihr Maximum bei 409 m# mit einer Extinktionskonstanten von K = 3,12. l0 s. Die Ex- t inktion dieser Verbindung war im sichtbaren Gebiet nur schwierig von der des H~miglobinnitritsl~,z», is zu unterscheiden. I m violetten und ultravioletten Gebiet sind die Extinktionen nicht vergleichbar, da Nitri t selbst bei 405 m# eine ]~xtinktionskonstante von K = 0,07.104 und bei 365 m# von K = 6" 10 ~ (Konzentration in Mol/ccm) hat. Die beiden wenig scharfen Maxima im grünen Gebiet liegen beim H~miglobinnitrit offenbar wenige m/z weiter im langwelligen Gebiet. Die Dissoziationskonstante des Hämiglobin-Hydroxylamins ist weit größer als die des Hämiglobinnitrits, n/~mlieh etwa K' ~ 0,02 bei p~ 6---8 gegenüber K ' =- 0,003 für Hämiglobin- nitrit. Genaue Messungen der Konstanten werden übrigens besonders beim Hämiglobin-I-Iydroxylamin durch weitere Ver/~nderungen dieser Ver- bindung gestört.

Die Ident i tä t der beiden beim Zusatz von Nitr i t bzw. Hydroxylamin gebildeten Verbindungen war auszuschließen. Selbst wenn durch Um- setzung mi t dem Hämiglobin in der Nitritlösung t tydroxylamin oder in der Hydroxylaminlösung /qitrit gebildet würde, könnte es keine höhere Konzentrat ion erreichen, da sich Hydroxy lamin und Nitr i t zu Wasser und Stickstoffoxydul umsetzen. Daß in der Lösung von Hämiglobin und Hydroxylamin keine beachtenswerten Konzentrationen von Nitr i t auftreten, wurde durch die Reduktion des Gemisches mit Dithionit besti~tigt. Wahrend I-[~miglobin mit • i tr i t durch Reduktion Stickoxyd- h~moglobin bildete, wurde das tt~miglobin im Gemisch mit Hydroxyl- amin durch Reduktion mit Dithionit in freies Hämöglobin übergeführt. Hydroxylamin bildete auch mi t t I ämat in eine Verbindung. In stark

4 0 8 MANFRED K1ESE :

alkalischer Lösung hatte sie eine breite Bande im grünen Gebiet mit einem Maximum bei 550 rote.

Die Verbindung das Hgmiglobins mit Hydroxylamin war nicht be- ständig. In dem Gemisch von Hgmig]obin und Hydroxylamin liefen weitere Reaktionen ab. Eine Reduktion des H~miglobins entsprechend der von Ferriionen in saurer Lösung 41 wurde nicht beobachtet. Wie LIPSCHITZ und WEBER 42 gefunden haben, katalysiert H/~miglobin den Zerfall von Hydroxylamin zu Stickstoff und Ammoniak, was Eisen in stark alkalischer Lösung ebenfalls tut 43. Dadurch wird die Hydroxyl- aminkonzentration vermindert. Entweder im Zusammenhang mit dieser Oxydoreduktion oder durch weitere Reaktionen wurde ein Teil des I-Ißmo-

• globins in Verdoglobins übergeführt. Ferner wurde ein Teil des Globins denaturiert und fiel aus.

Um das durch Hydroxylamin gebildete Verdoglobin in mSgliehst hoher Konzentration im Vergleich zur Konzentration des Hgmiglobins zu erhalten, wurden Hgmoglobin]ösungen vom PtI 6,2 wiederholt mit Hydroxylaminhydrochlorid ersetzt. Dazu wurden 2,5 ecm rote Zeilen vom Rinde mit 7,5 cem Wasser h/~molysiert, 2 ccm Phosphat 1,0 MoI/1 p~ 6,2 zugefügt und im Laufe von 12----24 Stunden dreimal je 70~100 nlg Hydroxylaminhydrõehlorid zugesetzt. Ausgef/~lltes Protein wurde durch Zentrifugieren abgetrennt. Die Lösung enthielt das Verdoglobin neben viel Hgmiglobin. Wurde die starke Extinktion des H~miglobins im roten Gebiet durch Reduktion beseitigt, so war das Verdoglobin mit einenl Extinktionsmaximum bei 620 m# erkennbar. Die Kohlenoxydverbindung hatte ihr Maximum bei 615 mtt, das Hydrazinverdochromogen etwa bei 605mju und das Kohlenoxydverdoh~mochromogen bei 615m/ , Diese Daten stimmten mit denen des Verdoglobin s überein.

Im Gegensatz zvm ttgmiglobinnitrit ließ sich Hgmiglobin-Hydroxyl- amin nur sehr wenig mit Wasserstoffperoxyd zu Verdoglobin oxydieren.

XH. Einfluß des Hydroxylamins auf die Verdoglobinbildung durch Schwefelwasserstoff und Sauerstoff.

Zur Darstellung von Verdoglobins wurde die beschleunigende Wirkung des Hydroxylamins herangezogen und bei der Beschreibung auch erwghnt. LEwI~I ~ hatte bereits beobachtet, daß in einer Lösung von Blut und Schwefelwasserstoff die Bande des Verdoglobins stgrker hervortrit t , wenn dem Gemisch Hydroxylamin zugesetzt-wird. Er nahm allerdings an, daß es sich dabei um eine Addition der Extinktion des Yerdoglobins und der des durch Hydroxylamin gebildeten Hümiglobins handle. TatsgcJalich t ra t jedoch durch den Zusatz von I{ydroxylamin eine Beschleunigung der

41 KURr•NACXER, A. u. R. NEVSS~R: Z. anorg. Chem. 131, 39 (1923). - - 43 LIP- scHrrz, W. u. J. WEBER: Z. physiol. Chem. 132, 251 (1923). - - ,3 Km~T~.NACX~.R, A. u. F . W]$NGEFELD: Z. anorg. Chem. 140, 315 (1924).


Bildung von Verdoglobin s ein. Diese entsprach nicht etwa nur der Verdo- globinbildung durch Hydroxylamin selbst. Es ist aber auch nicht möglich, den Einfluß katalytisch zu nennen im strengen Sinne e iner katalytisehen Wirkung.

Wurde in eine Lösung von Hämoglobin, Sauerstoff und Schwefelwasser- stoff ~Iydroxylamin hineingegeben, so t ra t nach wenigen Sekunden eine tief dunkelgrüne Verfärbung ein. Später nahm die Lösung eine hellere Farbe an, so daß man die Bildung einer Zwischenverbindung unbekannter -Natur annehmen möchte, die in das Veräog]obin übergeht.

.Nitrit beeinflußte die Reaktion zwischen ttämog]obin, Sehwefelwasser- stoff und Sauerstoff nicht in gleicher Weise ~4e Hydroxylamin. Vielmehr bildete Nitr i t in dem Gemisch nur ttämiglobin, das weiter nfit Schwefel- wasserstoff unter Bildung von tIämiglobinsutfid reagierte. Die rote Lösung blieb lange Zeit unverändert .

XIII. Extinktionskonstanten des Yerdoglobins. Die Extinktion des Verdoglobin s mußte aus Messungen errechnet

werden, die an Gemischen von etwa 80% Verdoglobin und 20% Hämi- globin bzw. Hämoglobin gemacht worden waren. Die aus verschiedenen Messungen errechneten Werte zeigten nur geringe Abweichungen. Für das Verdoglobin ergaben sich die gleichen Extinktionskonstanten, wenn von der hämiglobinhaltigen Lösung die Extinktion des t tämiglobins wie wenn nach Reduktion mit Dithionit die Extinktion des Hämoglobins ab- gezogen wurde. Das bedeutet, daß in der nach der Dialy.se erhaltenen Lösung Verdoglobin mit zweiwertigem Eisen vorlag. Es zeigt ferner, daß das Verfahren zur ]~limination der Extinktion des Hämiglobins bzw. Hämoglobins korrekt war. Allerdings konnte die Extinktion im Gebiet von 500--600 m# nicht genügend genau ermittelt werden, um zu entscheiden, ob hier noch eine eben erkennbare Bande vorhanden ist wie beim VerdoglobincN. Die Bande im roten Gebiet hat ihr Maximum bei 620 m/z mit einer nur wenig kleineren Extinktionskonstanten als die der beiden anderen Verdoglobine. Die SoR],~T-Bande im violetten Gebiet ist schmal mit einem scharf ausgeprägten Ext inkt ionsmaximum bei 420 rote und einer Extinktionskonstanten von K = 14. l0 T. Diese ist wenig gröl~er als die des Verdoglobin~o * tmd erheblich kleiner als die des VerdoglobincN. Zwischen 400 und 300 m/t ist die Extinktion noch verhältnismäßig hoch, K = 6 - 7 • l0 T, und fällt unterhalb 300 m# ab. In Abb. 8 ist die Ex- t inktionskurve des Verdoglobin s für den Bereich von 300--700 m# wiedergegeben. Die Werte der Extinktionskonstanten sind aus Tabelle 10 zu entnehmen.

Der hier mitgeteilte Wert der Extinktionskonstanten bei 620 m/~ ist etwas höher als der aus den von DRABKIN und AUSTIN « extrapolierten Werten errechenbare, der sich zu K ~ 2,5. l07 ergibt. Der Wert von

410 I~IANFRED KIESE :

Tabelle 10. Extinktionskonstanten des Verdo«lobins.

K In 1° ] 1

I c d ' c : Konzen t r a t i on in G r a m m a t o m Fe/ccm, d ~ Schichte in cm.

K ' 1 0 - « K ' 1 0 - ~ K ' 1 0 -7 m p m p m ~

lg

I 12

g

z i

0!

670 650 630 620 610 590 570 550

0,90 1,44 2,40 2,88 2,64 2,04 1,80 1,68

530 510 490 470 460 440 430 420

1,74 1,80 1,92 2,4 3,4 7,0

11,3 14,0

410 390 370 350 330 310 290

10,0 7,0 6,5 6,2 6,0 5,2 4,0

J

/ 680 6~0 600 ~0 ~ 0 ~0 ¢~

.---.-We/len/#nge

F

J \ I

~00 360 «gO 280

DRABKIN und AUSTIN i s t

somit nur um 15% zu niedrig und nicht, wie wir früher annahmen 44, um 30%.

Abb. 8. Extinktion des Verdoglobin S. Abszisse: ~Vellen- 1/~nge in mp. Ordinate: Extinktionskonstante

1 1 K = In " c " d ; c Konzentration in Grammatom

Fe/cem, d Schichte in cm. chromogen gebildet, und

es war nicht sicher zu entscheiden, ob dieses aus dem Verdoglobin ent- stand oder aus dem noch vorhandenen HtLmoglobin. Dagegen war wie mit Verd~o ~ die Reduktion des Verdochromogens zu H/~mochromogen durch Hydrazinhydrat durchführbar. Die Extinktions/~nderungen waren ähnlich den in Abb. 5 wiedergegebenen nur nicht so ausgeprtLgt. Die Re- duktion in 30%iger Hydrazinhydratlösung verlief langsamer als die des Verdoehromogent¢o., sie kam auch früher zum Stillstand als diese. D i e ~]xtinktion bei 605 m/~ nahm ab, und die bei 551 nahm zu. Nach etwa 4 Stunden t ra t eine allmählich fortschreitende allgemeine Extinktions- abnahme ein. Weitere Umwandlung von Verd in H/~m war darin nicht erkennbar. Die Lage der a-Bande des entstehenden HtLmochromogens bei 551 m# weist darauf hin, da ] auch aus dem Verdochromogen s wahr- seheinlich nicht Protohänmchromogen, sondern ein nahe verwandtes gebildet wurde.

¢¢ GAEDE, D. u. M. KIESE: Klin. Wschr . 1944, 92.

XIV. Reduktion des Yerds zu Häm.

Die Reduktion des Verdoglobin s zu Hämo- globin in Karbonat vom p~ 10 gelang nicht ebenso einwandfrei wie die des Vordoglobin~o« I m Laufe der langsamen Reaktion wurde HtLmo-


Zusatz von Hydroxylamin zur Lösung des Hydrazinverdochromogens beschleunigte die Abnahme der Extinktion bei 605 m/~. Doch war nicht klar zu erkennen, ob tatsächlich eine entsprechend schnellere Bildung von Häm stattfand, da das Hydroxylamin das Hydrazinhämochromogen langsam in Häm-/-Iydroxylamin überführte.

XV. Bildung von Verdoglobin durch Einwirkung von Schwefelwasserstoff und Wasserstoffperoxyd.

MICHEL 7 hat te besehrieben, daß die Bildung von Verdoglobin s dureh Einwirkung von Schwefelwasserstoff und Sauerstoff auf I-Iämoglobin durch Zusatz von Wasserstoffperoxyd beschleunigt würde, und nahm an, daß die Peroxydbildung wesentlich für die Bildung des Verdoglobins wäre. Die eigenen Untersuchungen über die gekoppelte Reaktion von Hitmo- globin und Schwefelwasserstoff mit Sauerstoff sowie über Bildung anderer Verdoglobine machte eine Nachprüfung dieser Angaben erforderlich. Um die Einwirkung von Wasserstoffperoxyd auf Hämoglobin in Gegenwart v o n Schwefelwasserstoff zu prüfen, mußte die Reaktion von Sauerstoff mit Hämoglobin und Schwefelwasserstoff ausgeschlossen werden.

In einem geschlossenen Gefäß mit Zu- und Ableitungsrohr, einem gasdicht eingeführten Rührer und einer ebenfalls gasdicht eingesetzten Bürette wurden 130 ccm einer Lösung von 10 g Hämoglobin in 100 ccm Phosphat 0,05 Mol/1 PR 6,0 vom Sauerstoff befreit, indem Kohlendioxyd unter Rühren der Lösung 15 Min. lang durch das Gefäß geleitet wurde. Um Schaumbildung zu vermeiden, wurde die Lösung nur gerührt und nicht vom Gase durchperlt; das Einleitungsrohr endete unmittelbar über der Lösung. Danach wurde ein starker Schwefelwasserstoffstrom durchgeleitet, um etwa auftretenden Sauerstoff sofort zu entfernen, und dabei langsam aus der Bürette eine Lösung von 3 g Wasserstoffperoxyd in 100 ccm zugetropft. Nachdem 40 ccm eingetropft waren, wurde noch etwa 3 Stunden Schwefelwasserstoff durchgeleitet und schließlich der Schwefel- wasserstoff durch einen Kohlendioxydstrom ausgewaschen. Ein kleiner Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt.

Die so erhaltene Lösung hatte in geeigneter Verdünnung die in Abb. 9 wiedergegebene Extinktion: eine Bande bei 637 m# und zwei weitere bei 578 und 540 m/z. Diese kamen unverändertem Oxyhämoglobin zu, denn durch Einleitung von Kohlenoxyd wurde die Bande von 578 m/z nach 572 m/z verschoben. Das Maximum bei 637 mbe wurde durch die Einleitung von Kohlenoxyd nicht verändert. Wurde nun in Gegenwart von Kohlen- oxyd mit Dithionit reduziert, so nahm die Extinktion im roten Gebiet stark zu und das Maximum wanderte nach 627 m~~. Durch die Behand- lung mit Wasserstoffperoxyd in Gegenwart von Schwefelwasserstoff war also das Eisen im Hämoglobin nicht oxydiert worden, wohl aber war Verdiglobin gebildet worden, das erst nach Reduktion zu Verdoglobin Kohlenoxyd zu binden vermochte. Reduktion des Verdiglobins ohne

412 " MANFRED NIESE:

Kohlenoxyd erhöhte die Extinktion im roten Gebiet ebenfalls. Das Ex- tink ionsmaximum des Verdoglobins lag bei 630 m/s. Zur weiteren Charak- terisierung wurden Pyridin-" und ttydrazinverdochromogen sowie deren Kohlenoxydverbindungen gebildet. Die beobachteten Extinktionsmaxima hatten folgende Lage: Pyridinverdichromogen 61Sm/s, Pyridinverdo- chromogen 61Sm/s, Kohlenoxydpyridinverdochromogen 630m/s, ttydrazinverdochromogen 615 m/s und Kohlenoxydhydrazinverdochromogen 627 m/s.

B/Idung von ~hl«nox/dvero~g/o~/» un«l(oh/enüx/dh~mog/o$/n 2,5 ~\» noch [Inle/lung von lóhl«nox/dund£edu~

/ ~ lion~~tDykJon# I I I I l~ o . / . x; <~«~~<+,»,~,~,~»,, <,=,» '~1", ,5 ~ --×~--~-v°n.~\ l Ve.zdl:¢lo[;in~ J und üxyh~mog/o~in{_.~.j~f.ofi

~ ~ Bi~dung von/(ohlenoxydh~mogloSin neóen dem • 0,5 ~rdi'g/o~in nach Eiih/eitlzng von/(ohlen¢xydin das ~e--

o I i I I I l I I n,X«» 700 080 6"80 OqO 6"20 600 580 500 5410 820 SO0 qgOTl~lli

Wellenlänge Abb. 9. V e r d o g l o b i n g e b i l d e t ( lurch E i n w i r k u n g v o n S e h w e f e l w a s s e r s t o f f u n d ~Wasse r s to f fpe roxyd au f Itt~- m o g l o b i n u n t e r A u s s c h l u ß v o n Saue r s to f f . xx× D u r c h die R e a k t i o n e r h a l t e n e s G e m i s c h v o n V e r d i g l o b i n u n d O x y h i i m o g l o b i n . o°o B i l d u n g v o n K o h l e n o x y d h l i m o g l o - b in n e b e n V e r d i g l o b i n n a c h E i n l e i t u n g v o n Kohlen- o x y d in das G e m i s c h . . . . B i l d u n g v o n K o h l e n o x y d - v e r d o g l o b i n u n d l ~ o h l e n o x y d h ä m o g l o b i n n a c h E in - l e i t u n g v o n K o h l e n o x y d u n d R e d u k t i o n m i t D i t h i o n i t .

Keine der Verbindungen des Verdoglobins hatte eine Bande an gleicher Stelle wie eine entsprechende Verbindung des Verdoglobin s. Mit Aus- nahme des Verdiglobins und des Pyridinverdichro- mogen s stimmten aber alle Verbindungen mit denen des Verdoglobincx überein.

Das durch die ]~inwirkung von Wasserstoffper- oxyd und Schwefelwasser- stoff gebildete Verdoglobin war also ganz sicher kein

Verdoglobins, sondern dem VerdoglobincN nahe verwandt oder gar mit ihm identisch und die Abweichungen in der Extinktion 'des Verdiglo- bins und Pyridinverdichromogens durch Nebenbedingungen verursacht.

Wurde der Sauerstoff bei der ]]inwirkung ¥on Wasserstoffperoxyd und Schwefelwasserstoff auf tt~moglobin nicht vollständig ausgeschlossen, so wurden Gemische von Verdoglobin s und Verdoglobinc~ r erhalten. Solch ein Gemisch wurde z. B. in folgendem Ansatz erhalten: 2,5 ccm rote Zellen vom Rinde mit 7,5 ccm Wasser hgmolysiert und 2 ccm Phosphat 1,0 Mol/1 p~ 6,2 zugesetzt. Das Gemisch wurde kurze Zeit evakuiert, so daß der größte Teil des Sauerstoffs, aber nicht der gesamte, entfernt wurde. Dann wurde Schwefelwasserstoff bis zu einem Druck von etwa 760 mm Hg eingelassen und aus dem Einsatz ein Tropfen Perhydrol eingekippt. ~Tach einer Stunde wurde wiederevakuiert. Das Gemisch zeigte eine breiteßande zwischen 600 und 650 m#, bedingt durch die beiden Extinktionsmaxima bei 637 und 620 m/s. Die Extinktion der Kohlenoxydverbindungen ließ neben dem Maximum des KohlenoxydverdoglobincN bei 627 m/t das des Kohlenoxydverdoglobin s bei 615 mg erkennen.

Ebenso waren in der ~xtinktion der Hydrazinchromogene zwei Maxima nachweisbar, n~mlich bei 615 m/s das des HydrazinverdochromogencN und bei 605 m# das des Verdochromogens.


Die Zugabe einer größeren Menge von Wasserstoffperoxyd zu der sauerstofffreien Lösung von Hämoglobin und Schwefelwasserstoff, als oben angegeben, machte die Umwandlung des Hämoglobins in Verdoglobin nicht vollständiger, sondern zerstörte bereits wieder Verdoglobin. Schließ- lich wurde eine braune Lösung erhalten, in der kein Häm und kein Verd mehr nachweisbar waren. Eine sehr stabile Lösung kolloiden Schwefels war gebildet worden, die sich auch nach 10tägiger Dialyse nicht merklich verändert hatte.

Zusammen]assung. Die Bildungsreaktionen dreier Verdoglobine wurden untersucht und

einige Eigenschaften der Verdoglobine besehrieben. Die Umwandlung von I-Iämoglobin zu Verdoglobin gelang nur beim

Verdoglobinc~ bis auf einen Rest von weniger als 3% unveränderten Hämoglobins. Beim Verdoglobin~o~ wurde eine Umwandlung bis auf 5m10% Hämoglobin erreicht, und Verdoglobin s wurde nur mit Verun- reinigungen von etwa 20% Hämoglobin erhalten.

Es wurde angenommen, daß die Bildungsreaktionen zu einem Gleich- gewicht führen, zumal auch Verdoglobin~¢o2, weniger Verdoglobins und gar nicht Verdoglobinc~ wieder zu Hämoglobin reduziert werden konnte. Während die Oxydation des H/~moglobins zu Verdoglobin bei PH 6 am günstigsten verlief, war die Reduktion des Verdoglobins zu Hämoglobin nur in alkalischer Lösung, PH 10, möglich.

Verdoglobin s und VerdoglobincN konnten durch verschiedene Reak- tionspartner gebildet werden. Dieses sowohl durch Blausäure und Wasser- stoffperoxyd wie durch Schwefelwasserstoff und Wasserstoffperoxyd; jenes durch Schwefelwasserstoff und Sauerstoff, durch Arsenwasserstoff und Sauerstoff wie auch durch Hydroxylamin und Sauerstoff.

Hydroxylamin beschleunigte die Bildung von Verdoglobin s durch Schwefelwasserstoff und Sauerstoff.

Hydroxylamin oxydierte in geringer Konzentration Hämoglobin zu Hämiglobin. In großem Überschuß bildete es mit Hämiglobin eine Ver- bindung mit charakteristischem Spektrum.

Die Extinktionskonstanten der drei Verdoglobine und Verdiglobine wurden für den Bereich von 700---300 m# bestimmt. Wie das Hämoglobin hatten auch die Verdoglobine ihre stärkste Extinktion im blauen Gebiet, in der Nähe von 400 takt. Die Lage der Extinktionsmaxima ,wich von der des Hämiglobins und Hämoglobins ab, und die Extinktionskonstanten waren zum Teil erheblich geringer. Im sichtbaren Gebiet lag die stärkste Extinktion der Verdoglobine im roten Gebiet. Außer dem dort zwischen 600 und 630 mg gelegenen Maximum war beim Verdoglobinc~ und Verdo- globin~o, noch ein zweites sehwächeres zwischen 560 und 580 m/t nach- zuweisen. Verdiglobincz ¢ und Verdiglobinz~o: änderten im Gegensatz zum lYämiglobin ihre Extinktion nicht bei Änderung der Wasserstoffionen- konzentration von PH 5--10. Sie bildeten keine Verbindungen mit Cyanid, Azid und Fluorid.

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Darstellung und Eigenschaften von Verdoglobinen