Anja Sonst

Das gastrale Hormon Ghrelin,

seine Expression im oberen Gastrointestinaltrakt

und seine Einbindung in bekannte hormonelle Regelkreise

Aus dem Pathologischen Institut

der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

zur

Erlangung des Doktorgrades Dr. med.

vorgelegt von

Anja Irene Sonst

aus

Nürnberg

Anja Sonst

2

Als Dissertation genehmigt

von der Medizinischen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

Tag der mündlichen Prüfung: 10. Oktober 2013

Vorsitzender des Promotionsorgans:

Prof. Dr. med. Dr. h.c. J. Schüttler

Gutachter/in: Prof. Dr. med. A. Hartmann

Prof. Dr. rer. nat. R. Schneider-Stock

Anja Sonst

3

Meiner Familie in Dankbarkeit gewidmet.

Anja Sonst

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Inhaltsverzeichnis

Seite

1 Zusammenfassung ______________________________________ 1

2 Summary ______________________________________________ 3

3 Einleitung _____________________________________________ 5

3.1 Das Hormon Ghrelin __________________________________________ 5

3.2 Ghrelinexpression im Magen ___________________________________ 6

3.3 Ghrelinwirkung im Gesamtorganismus ___________________________ 7

3.3.1 Ghrelin als Regulator der Energiehomöostase des Körpers _________ 7

3.3.1.1 Physiologie ___________________________________________ 7

3.3.1.2 Pathophysiologie ______________________________________ 8

3.3.2 Physiologische Hormonsysteme und Ghrelin ____________________ 9

3.3.2.1 Ghrelin und Gastrin ____________________________________ 9

3.3.2.2 Ghrelin und Insulin _____________________________________ 9

3.4 Ghrelin in entzündlich verändertem Gewebe _____________________ 10

3.4.1 Barrett-Mucosa __________________________________________ 10

3.4.2 Autoimmungastritis und atrophe Gastritis _____________________ 11

3.4.3 Chronisch-entzündliche Darmerkrankung _____________________ 12

3.5 Ghrelin als Therapeutikum ____________________________________ 12

4 Zielsetzung der Arbeit __________________________________ 14

5 Material und Methoden _________________________________ 15

5.1 Normales Gewebe des oberen Gastrointestinaltrakts _______________ 15

5.1.1 Ösophagus ______________________________________________ 15

5.1.2 Magencorpus ___________________________________________ 16

5.1.3 Magenantrum ___________________________________________ 16

5.1.4 Duodenum ______________________________________________ 16

5.1.5 Pankreas _______________________________________________ 16

5.2 Metaplasien und Entzündungen im oberen Gastrointestinaltrakt _____ 17

5.2.1 Refluxösophagitis ________________________________________ 17

5.2.2 Barrett-Mucosa __________________________________________ 17

Anja Sonst

5

5.2.3 Pankreatische Metaplasie __________________________________ 17

5.2.4 Autoimmungastritis_______________________________________ 18

5.2.5 Hp-Gastritis _____________________________________________ 18

5.2.6 Gastrale Metaplasie ______________________________________ 18

5.3 Immunhistochemischer Nachweis von Ghrelin ____________________ 19

5.4 Immunfluoreszenzfärbung ____________________________________ 20

5.4.1 Ghrelin-Chromogranin-Doppelfärbung ________________________ 20

5.4.2 Ghrelin-Gastrinrezeptor-Doppelfärbung ______________________ 21

5.4.3 Ghrelin-Amylase-Doppelfärbung ____________________________ 21

5.5 Fotodokumentation __________________________________________ 22

5.6 ELISA ______________________________________________________ 23

5.6.1 Gewinnung der Blutproben_________________________________ 23

5.6.2 Patienten- und Kontrollkollektiv _____________________________ 23

5.6.3 ELISA für Gastrin, aktives Ghrelin und Gesamtghrelin ____________ 24

6 Ergebnisse ____________________________________________ 25

6.1 Immunhistochemischer Nachweis von Ghrelin ____________________ 25

6.1.1 Ghrelinexpression im normalen Humangewebe ________________ 25

6.1.2 Unterschiedliche Ausprägung von Ghrelin in verschiedenen

Metaplasien und entzündlich verändertem Gewebe ____________________ 29

6.2 Immunfluoreszenzfärbung ____________________________________ 37

6.2.1 Ghrelinzellen als neuroendokrine Zellen ______________________ 37

6.2.2 Expression des Gastrinrezeptors auf Ghrelinzellen ______________ 42

6.2.3 Ghrelinexpression in der Pankreatischen Metaplasie ____________ 44

6.3 ELISA ______________________________________________________ 46

6.3.1 Korrelation von Ghrelin und Gastrin im Gesamtkollektiv __________ 46

6.3.2 Korrelation von Ghrelin und Gastrin bei Patienten mit

Autoimmungastritis______________________________________________ 47

7 Diskussion ____________________________________________ 48

8 Literaturverzeichnis ____________________________________ 56

9 Abkürzungsverzeichnis __________________________________ 65

Anja Sonst

6

10 Abbildungsverzeichnis __________________________________ 66

11 Tabellenverzeichnis ____________________________________ 69

12 Danksagung ___________________________________________ 70

13 Lebenslauf ____________________________________________ 71

Anja Sonst

1

1 Zusammenfassung

Hintergrund und Ziele

Das Hormon Ghrelin, welches hauptsächlich im Magen, jedoch auch in anderen Ge-

weben gebildet wird, wurde erstmalig 1999 von Kojima et al. entdeckt und spielt

eine große Rolle in der Energiehomöostase des Körpers. Hauptsächlich wurde Ghre-

lin als serologischer Marker für Erkrankungen des Magen-Darm-Trakts untersucht.

Über die Verteilung und Expression in krankhaft verändertem Gewebe ist wenig

bekannt.

Ziel dieser Arbeit war es, morphologische Veränderungen des Ghrelinzellbildes in

entzündlichem und metaplastischem Gewebe des oberen Gastrointestinaltrakts

herauszuarbeiten und mit gesundem Gewebe zu vergleichen. Ein besonderes Au-

genmerk wurde auf die Autoimmungastritis gelegt. Darüber hinaus sollte der Zu-

sammenhang zwischen Ghrelin und Gastrin untersucht werden.

Methoden

Verschiedene Gewebearten des oberen Gastrointestinaltrakts (Ösophagus, Magen-

corpus, Magenantrum, Duodenum, Pankreas, Refluxösophagitis, Barrett-Mucosa,

Pankreatische Metaplasie, Autoimmungastritis, Hp-Gastritis, Gastrale Metaplasie)

wurden immunhistochemisch bzw. mittels Doppelimmunfluoreszenzfärbung teils

mit konventioneller Mikroskopie, teils mit konfokaler Lasermikroskopie untersucht.

Weiterhin wurden das Serumghrelin und Serumgastrin von Autoimmungastritispa-

tienten gemessen und mit Werten von gesunden Probanden verglichen.

Ergebnisse

Ghrelinzellen konnten in normalem Gewebe wie erwartet bevorzugt im Magen de-

tektiert werden. Das Ghrelinzellbild ändert sich in entzündlichen und metaplasti-

schen Geweben deutlich. Hier entstehen teilweise Ghrelinkonglomerate und eine

lineare Progression der Ghrelinzellen. Dies betrifft vor allem die Autoimmungastri-

Anja Sonst

2

tis. Diskrete Veränderungen in diese Richtung zeigten sich auch in der Hp-Gastritis.

Weiterhin wurde auf humanen Ghrelinzellen erstmalig der Gastrinrezeptor nachge-

wiesen, was bislang nur im Rattenmodell gezeigt wurde. Als serologischer Marker

wurde Ghrelin bei Autoimmungastritispatienten, bei denen eine Hypergastrinämie

vorherrscht, untersucht. Der Spiegel des aktiven Ghrelins war signifikant erniedrigt

und korrelierte damit negativ zu den Gastrinwerten.

Schlussfolgerungen

Mit dieser Studie ist es gelungen, ein differenziertes Modell der Ghrelinexpression

in entzündlichen und metaplastischen Geweben des oberen Gastrointestinaltrakts

zu zeichnen. Zudem konnte aufgrund des gefundenen Gastrinrezeptors auf huma-

nen Ghrelinzellen, der starken Expression des Rezeptors bei der Autoimmungastri-

tis, des Mitreagierens im Rahmen der endokrinen Zellknötchen und durch Blutana-

lysen Hinweise gesammelt werden, dass Ghrelin durch Gastrin wesentlich beein-

flusst wird.

Somit ermöglicht diese Arbeit eine Erweiterung und bessere Definition des komplex

gesteuerten gastralen Hormonsystems.

Anja Sonst

3

2 Summary

Objective

Ghrelin is a hormone which is mainly produced in the stomach but also in other

tissues. It was detected in 1999 by Kojima et al. and plays an important role in the

energy homeostasis of the body. So far, Ghrelin has been examined mainly as a

serological marker for diseases of the gastrointestinal tract. Little is known about

the distribution and expression of ghrelin cells in pathologically modified tissues.

The aim of this study was to examine morphologic changes in inflammatory and

metaplastic tissue and to compare it to normal tissue of the upper gastrointestinal

tract. Special attention was payed to the autoimmune gastritis. Furthermore, the

interaction of ghrelin and gastrin was investigated.

Methods

Different types of tissue of the upper gastrointestinal tract (esophagus, gastric

corpus, gastric antrum, duodenum, pancreas, reflux esophagitis, barrett mucosa,

pancreatic metaplasia, autoimmune gastritis, Hp gastritis, gastral metaplasia) were

examined using classic immunohistochemistry and double immunofluorescence.

Conventional microscopy and confocal laser microscopy were applied.

Moreover, serum ghrelin and serum gastrin levels of patients with autoimmune

gastritis were measured and compared to levels of healthy subjects.

Results

As expected, Ghrelin cells were detected in all normal tissues. The picture of ghrelin

cells changes in inflammatory and metaplastic tissues. Conglomerates and linear

progression occur especially concerning the autoimmune gastritis. The Hp gastritis

also showed such modifications. Furthermore, the gastrin receptor, which had only

been found on ghrelin cells of the rat, could be detected on human ghrelin cells. As

a serological marker, ghrelin was examined in patients with autoimmune gastritis

Anja Sonst

4

showing hypergastrinemia. Serum levels of active ghrelin were significantly lower

and were negatively correlated with gastrin levels.

Conclusions

This study shows a differentiated model of ghrelin expression in inflammatory and

metaplastic tissues of the upper gastrointestinal tract. Moreover, evidences that

ghrelin is essentially influenced by gastrin were found by the detected gastrin

receptor on human ghrelin cells, the strong expression of this receptor in

autoimmune gastritis, the reaction within the endocrine cell conglomerates and by

serum assays. Therefore, this study is an enhancement and allows a better defini-

tion of the complexly controlled gastric hormone system.

Anja Sonst

5

3 Einleitung

Beginnend soll das Hormon Ghrelin mit seinen Eigenschaften beschrieben und seine

Expression im Magen, die Wirkung auf den Gesamtorganismus, sein Stellenwert in

entzündlich verändertem Gewebe und die Aussicht Ghrelin als Therapeutikum ein-

zusetzen erörtert werden.

3.1 Das Hormon Ghrelin

Ghrelin ist ein aus 28 Aminosäuren bestehendes Peptidhormon, welches erstmalig

1999 von Kojima et al. entdeckt wurde [39]. Das Peptid wurde nach „ghre“, der pro-

to-indo-europäischen Wurzel des Wortes „wachsen“, benannt. Außerdem stellen

„GH“ und „relin“ die Abkürzung für „growth-hormone-release“ dar [37]. Die Entde-

ckung des Hormons Ghrelin basierte auf der Suche nach einem endogenen Liganden

für den „Growth hormone secretagogue receptor" (GHS-R). Als endogener Ligand

besitzt Ghrelin die Fähigkeit zur Freisetzung von Wachstumshormon aus dem Hypo-

physenvorderlappen [39].

Es existieren zwei Arten von Ghrelin: Die acylierte aktive Form, bei welcher sich eine

n-octanoyl-Modifikation an der dritten Aminosäure Serin findet, bindet an den

GHS-R, wohingegen die des-acylierte Form (des-n-octanoyl Ghrelin) dieses Potential

nicht besitzt [7, 32].

Abb. 1 Struktur des menschlichen Ghrelins [46]

Das Hormon Ghrelin wird von zahlreichen Geweben wie z.B. dem Hypothalamus,

der Hypophyse, der Niere, dem Pankreas oder der Plazenta, hauptsächlich jedoch

Anja Sonst

6

im Magen produziert [37]. Ghrelin spielt eine wichtige Rolle in der Regulation des

Energiehaushaltes des Körpers. Die Ghrelinsekretion zeigt einen Anstieg im Zustand

einer negativen Energiebilanz, wie Fasten, Kachexie und Anorexia nervosa, um so-

mit durch Appetitsteigerung die negative Energiebilanz wieder auszugleichen, wo-

hingegen die Ghrelinexpression bei Hyperglykämie und Adipositas abnimmt [31,

46]. Dieser Kompensationsmechanismus fehlt im Zustand nach einer Magenopera-

tion, bei der der säureproduzierende Magencorpus entfernt wurde und somit der

Ghrelinplasmaspiegel erniedrigt ist [19].

3.2 Ghrelinexpression im Magen

Den wichtigsten Produktionsort stellen die neuroendokrinen Zellen im säureprodu-

zierenden Magencorpus dar, was durch den um 80% niedrigeren Serumghrelinspie-

gel nach einer Fundektomie bzw. Gastrektomie belegt werden kann [19]. In dem

säureproduzierenden Teil des Magens finden sich zahlreiche endokrine Zellen wie

somatostatinsezernierende D-Zellen, enterochromaffine Zellen, Enterochromaffin-

ähnliche Zellen (ECL) und A-ähnliche Zellen [67]. Dornonville de la Cour et al. stell-

ten die These auf, dass es sich bei den A-ähnlichen Zellen um Ghrelinzellen handelt

[19]. Die Ghrelinzellen sind im menschlichen sowie im Rattenmagen vom Hals bis

zur Basis der Magendrüsen gleichmäßig verteilt, jedoch seltener in der Pylorusregi-

on und noch seltener im Dünndarm anzutreffen [15]. Der prozentuale Anteil der

verschiedenen endokrinen Zellen in den humanen säureproduzierenden Magendrü-

sen verhält sich wie folgt: A-ähnliche Zellen/Ghrelinzellen 20 %, D-Zellen 22 %, ECL-

Zellen 30 %, enterochromaffine Zellen 7 % [15].

Basierend auf diesen Grundlagen wurden in vorliegender Arbeit gesundes sowie

pathologisch verändertes Gewebe des oberen Gastrointestinaltrakts histologisch

betrachtet.

Die Ghrelinsekretion im Magen wird durch die Kombination von neuralen (Vagus),

mechanischen (Magendehnung), chemischen (Osmolarität der Nahrung) und hor-

monellen Faktoren (Insulin) mit unbekannter Priorität beeinflusst [20].

Anja Sonst

7

Der exakte Mechanismus der Ghrelinfreisetzung ist jedoch noch weitgehend unbe-

kannt. Verschiedene Mechanismen scheinen eine Rolle zu spielen, u.a. auch die

Interaktion zwischen Ghrelin und Gastrin (s. 3.3.2.1 Ghrelin und Gastrin), was in der

vorliegenden Studie untersucht wurde.

3.3 Ghrelinwirkung im Gesamtorganismus

3.3.1 Ghrelin als Regulator der Energiehomöostase des Körpers

3.3.1.1 Physiologie

Ghrelin spielt eine große Rolle in der Regulation von Appetit und Nahrungsaufnah-

me.

Kojima et al. bestimmten die zirkulierende Serumkonzentration von Ghrelin bei

Normalgewichtigen mit 117,2 ± 37,2 fmol/ml (= pmol/l) [39], Ariyasu et al. erzielten

ähnliches Ergebnis mit 166,0 ± 10,1 fmol/ml (= pmol/l) [3].

Bei einer negativen Energiebilanz steigt die Ghrelinkonzentration im Serum, post-

prandial wird ein Abfall des Serumghrelins gemessen [13].

In einer randomisierten, doppelblinden Cross-Over-Studie, durchgeführt durch

Wren et al., führte eine intravenöse Ghrelingabe bei gesunden Probanden im Ver-

gleich zu einer Kochsalzinjektion zu einer gesteigerten Nahrungsaufnahme [71].

Dies wird durch den neuronalen Signalweg über Neuropeptid Y und Orexin, welche

als appetitanregende Peptide im Hypothalamus wirken, vermittelt [66].

Cummings et al. verglichen das Ghrelin-24-Stunden-Serumprofil zweier Probanden-

gruppen [14]: 1. Diät-induzierter Gewichtsverlust 2. Gewichtsverlust nach einer Ma-

genbypassoperation. Nach einem diätinduzierten Gewichtsverlust von 17% des ini-

tialen Körpergewichts ergab sich ein Anstieg der AUC des Ghrelinprofils um 24%,

wohingegen nach einem Gewichtsverlust von 36% der Magenbypassgruppe die AUC

des Ghrelinprofils um 72% niedriger war als in oben genannter Kontrollgruppe. Die

normalen mahlzeitbezogenen Schwankungen, sowie der Tagesrhythmus des Ghre-

linlevels fehlten nach einer Magenbypassoperation. Möglicherweise verursacht die

Anja Sonst

8

permanente Abwesenheit von Nahrung im Magen und Duodenum ein stimulieren-

des Signal, welches die Ghrelinproduktion durch „override inhibition“ unterdrückt

[14].

Andere Studien zeigten jedoch unveränderte Ghrelinwerte nach einer Magenby-

passoperation [59] oder sogar einen Anstieg des Serumghrelins [23] und die inverse

Korrelation des BMIs mit dem Serumghrelin [29].

Stoeckli et al. beschrieben einen Gewichtsverlust von 50 bis 80% nach einer Magen-

bypassoperation verglichen mit einer Gewichtsabnahme von 30 bis 50% nach

Gastric-Banding-Operation [60]. Nach zuletzt genannter Intervention stieg Ghrelin

im Serum an, nicht jedoch bei Patienten mit Magenbypass. Der Gewichtsverlust

alleine bestimmt somit nicht den Serumghrelinspiegel. Der genaue Mechanismus,

warum ein Magenbypass in langer Sicht zu niedrigem Serumghrelin führt, ist unklar.

Es wird vermutet, dass das permanente Fehlen von Nahrung im Magen die Ghrelin-

sekretion unterdrückt.

3.3.1.2 Pathophysiologie

Bei Störungen der Nahrungsaufnahme und des Appetits wurde zwischenzeitlich

eine Ghrelinresistenz bzw. eine erhöhte Sensitivität für Ghrelin postuliert.

Bei einer durch Krebs induzierten Kachexie steigen als Kompensation zum Ge-

wichtsverlust sowohl das aktive Ghrelin im Serum, als auch der Quotient „aktives

Ghrelin : Gesamtghrelin“. Das Hungergefühl wird jedoch nicht gesteigert, was Gar-

cia et al. als Ghrelinresistenz bezeichneten [27].

Dostalova et al. gelangten zu folgenden Ergebnissen [20]: Wohingegen normalge-

wichtige Personen mit Werten des Gesamtghrelins zwischen 400-1000 pg/ml (vgl.

3.3.1.1 Physiologie) postprandial eine Ghrelinantwort, d.h. eine verringerte Ghrelin-

konzentration, aufweisen, fehlt diese Antwort bei adipösen Patienten und bei Pati-

enten mit Anorexia nervosa teilweise oder komplett. Patienten mit Anorexia nervo-

sa, bei denen Ghrelinspiegel im Serum von >1000 pg/ml nachgewiesen werden,

zeigen dennoch eine verminderte Nahrungsaufnahme aufgrund einer verminderten

Sensitivität des Ghrelineffekts. Adipöse Patienten mit einem Ghrelinspiegel <400

pg/ml reagieren sensitiver gegenüber dem appetitstimulierenden Ghrelineffekt.

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9

3.3.2 Physiologische Hormonsysteme und Ghrelin

3.3.2.1 Ghrelin und Gastrin

Es wurde bisher in nur wenigen Untersuchungen versucht einen Zusammenhang

zwischen Ghrelin und Gastrin herzustellen. In den Experimenten, in denen man bis-

lang die Interaktion dieser beiden Hormone untersuchte, gelangte man allerdings zu

unterschiedlichen Ergebnissen.

Checci et al. zeigten, dass Ghrelin und Gastrin bei Patienten, bei denen Parietalzell-

antikörper (PCA) nachgewiesen wurden, im Serum invers korreliert sind [11]. Bei

PCA-positiven Patienten waren die Serumghrelinwerte signifikant niedriger (238 ±

107 pmol/l), die Gastrinwerte signifikant höher (81,2 ± 128,3 ng/ml), im Vergleich zu

PCA-negativen Patienten (282 ± 104 pmol/l und 20,7 ± 13,3 ng/ml).

In zwei weiteren Studien wurde die Beziehung zwischen Ghrelin und Gastrin disku-

tiert.

Eine Gastrininfusion führte bei Ratten zu keinem Anstieg des Serumghrelins [19].

Ein weiteres Studienergebnis zeigte einen synergistischen Zusammenhang zwischen

den beiden Peptidhormonen, wobei Gastrin Ghrelinzellen stimulierte und beide

Hormone zusammen bei Ratten zu einer Zunahme der Säuresekretion im Magen

führten. In diesem Rahmen wurde ein Gastrinrezeptor auf Ghrelinzellen im Ratten-

modell, jedoch bislang nicht auf humanen Ghrelinzellen, nachgewiesen [26].

Es stellt sich daher die Frage, ob der Gastrinrezeptor auch auf humanen Zellen zu

finden ist und dadurch eine potentielle Ansteuerung der Ghrelinzellen durch Gastrin

möglich ist.

3.3.2.2 Ghrelin und Insulin

In verschiedenen Studien wurde gezeigt, dass Ghrelin das Potential besitzt, die Insu-

linsekretion zu stimulieren [1, 16, 43]. Die Insulinfreisetzung durch Ghrelin wurde an

isolierten Inselzellen des Rattenpancreas nachgewiesen [16], sowie bei Ratten in

vivo [43].

Anja Sonst

10

Beim Menschen führte die Administration von Ghrelin zu einem signifikanten An-

stieg der Blutglucose, überraschenderweise gefolgt von einer reduzierten Insulinse-

kretion [6].

Im Gegensatz dazu verringerte sich der Ghrelinspiegel nach einer Insulininfusion.

Lucidi et al. folgerten aus ihren Ergebnissen, dass die postprandiale Hyperinsulin-

ämie möglicherweise verantwortlich für die Reduktion des Plasmaghrelins während

der Nahrungsaufnahme sein könnte [44].

Somit scheinen Ghrelin und Insulin negativ korreliert zu sein und gemeinsam Ein-

fluss auf die Energiehomöostase des Körpers zu nehmen.

3.4 Ghrelin in entzündlich verändertem Gewebe

3.4.1 Barrett-Mucosa

Welche Rolle Ghrelin bei der Entstehung des Barrett-Adenokarzinoms spielt, unter-

suchten Konturek et al. [41]. Die Forschungsgruppe zeigte, dass der Ghrelinrezeptor

(GHS-R1a) in der Barrett-Mucosa verstärkt exprimiert wird im Vergleich zum gesun-

den Plattenepithel. Ghrelin verursachte eine Abnahme der TNFα-induzierten Ex-

pression der Entzündungsmediatoren COX-2 und IL-1β im Zellversuch mit humanen

Barrett-Adenokarzinomzellen, was für einen antiinflammatorischen Effekt des Ghre-

lins spricht. Neben Ghrelin hatte Adiponectin durch die Verstärkung der Apoptose

einen protektiven Einfluss auf die Genese des Barrett-Adenokarzinoms. Adipositas

stellt bekanntlich einen Risikofaktor für die Entstehung des Barrett-Adenokarzinoms

dar [42]. Dies lässt sich nun dadurch erklären, dass bei Adipositas sowohl Ghrelin als

auch Adiponectin vermindert ist. Dieses Faktum dürfte mitverantwortlich für die

Progression des Barrett-Adenokarzinoms bei adipösen Patienten sein, da der anti-

entzündliche bzw. apoptotische Effekt weniger zum Tragen kommt [41].

Ghrelinpositive Zellen wurden jedoch noch nicht in der Barrett-Mucosa dargestellt.

Dies sollte mit dieser Arbeit überprüft werden.

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11

3.4.2 Autoimmungastritis und atrophe Gastritis

Die Autoimmungastritis kann zu einer atrophen Corpusgastritis führen. Eine wichti-

ge Rolle bei der Entstehung der Autoimmungastritis spielen die Parietalzellantikör-

per (PCA).

Checchi et al. bestimmten das Serumghrelin von PCA-positiven und PCA-negativen

Patienten [11]. PCA-positive Patienten zeigten durchschnittlich ein vermindertes

Serumghrelin (238 ± 107 pmol/l). Der cut-off Ghrelinwert, welcher mit der höchsten

Sensitivität und Spezifität für Schleimhautatrophie assoziiert ist, wurde bei 188

pmol/l definiert. Man schlussfolgerte, dass die Ghrelinsekretion durch Autoimmun-

gastritis negativ beeinflusst wird.

In einer Studie von Kawashima et al. konnten vorherig genannte Ergebnisse bestä-

tigt werden, nämlich dass die Konzentration des acylierten Plasmaghrelins im Zu-

stand einer Magenschleimhautatrophie sinkt [38].

Wie sich jedoch das Zellbild der Ghrelinzellen im Magen durch eine Atrophie der

Schleimhaut verändert, wurde bis dato noch nicht klar dargestellt, was in dieser

Arbeit erarbeitet wurde.

Auch Suzuki et al. gelangten zu dem Ergebnis, dass der Serumghrelinwert mit zu-

nehmendem Ausmaß der gastralen Schleimhautatrophie abnimmt [62].

Kontroverse Ergebnisse erzielten Campana et al. [9]. Bei Patienten mit atropher

Gastritis wurde im Vergleich zu gesunden Probanden eine signifikante Erhöhung des

acylierten Ghrelins und des Verhältnisses von acyliertem Ghrelin zum Gesamtghre-

lin im Serum festgestellt. Überdies war im Zustand der atrophen Gastritis das Se-

rumgastrin erhöht. Als Schlussfolgerung wurde die Hypothese aufgestellt, dass der

Ghrelinacylierungsprozess eine kompensatorische Antwort zur atrophen Gastritis

darstellt, ein Zustand, der den Verlust von ghrelinproduzierenden Zellen und einen

pH-Anstieg des Magenmilieus verursacht.

Bisher wurde Ghrelin im klinischen Alltag noch nicht als Atrophiemarker eingesetzt.

Ghrelin scheint in diesem Zusammenhang ein vielversprechender serologisch be-

stimmbarer Marker zu sein, um Aussagen bezüglich der Integrität der Magen-

schleimhaut zu treffen.

Anja Sonst

12

3.4.3 Chronisch-entzündliche Darmerkrankung

Bei chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen steigt die Ghrelinsekretion, was zu

einer verstärkten Prostazyklinproduktion in Endothelzellen und zu einer Hemmung

der proinflammatorischen Zytokinexpression führt. Somit besitzt Ghrelin das Poten-

tial, inflammatorischen Zuständen vorzubeugen. Karmiris et al. identifizierten Ghre-

lin in T- und B-Lymphozyten [36]. Weiterhin zeigten sie, dass T-Zellen aktiv Ghrelin

sezernieren.

Auch bei Patienten mit postoperativer Sepsis nach einer abdominalen Operation

konnten erhöhte Serumghrelinwerte gemessen werden [45].

Ghrelin besitzt möglicherweise einen therapeutischen Effekt in entzündlichen Zu-

ständen.

3.5 Ghrelin als Therapeutikum

Den ersten experimentellen Schritt, Ghrelin als Therapeutikum anzuwenden, führ-

ten Ceranowicz et al. im Tiermodel durch [10]. Durch Säureapplikation wurde bei

Ratten ein chronisches Magenulkus induziert. Die eine Hälfte der Versuchstiere be-

saß eine intakte Hypophyse, die andere Hälfte wurde hypophysektomiert. Bei den

Tieren mit intakter Hypophyse kam es durch die Gabe von exogenem Ghrelin zur

Ausschüttung von Wachstumshormon (GH) aus dem Hypophysenvorderlappen und

zum Anstieg von IGF-1 im Serum, was zu einer gesteigerten Zellproliferation in der

Magenmucosa führte. Bei den hypophysektomierten Ratten hatte die Ghrelingabe

keinen Einfluss auf GH und IGF-1, die exogene Gabe von IGF-1 führte wiederum zur

Mucosazellproliferation. Ceranowicz et al. schlussfolgerten, dass die Behandlung

mit Ghrelin die Heilung von chronischen Magenulzera beschleunigt, jedoch nur bei

intakter Hypophyse [10]. Ghrelin besitzt damit schleimhauterneuerndes Potential.

In verschiedenen Studien wurden Ghrelinrezeptoragonisten im Tiermodell als The-

rapeutikum erprobt. Die prokinetische Wirkung von Ghrelin verbesserte den Zu-

stand eines postoperativen Magenileus. Weiterhin wurden Dyspepsiebeschwerden

Anja Sonst

13

wie Magenentleerungsstörung und Erbrechen vermindert und der Appetit gestei-

gert [53].

Aufgrund des appetitanregenden Effekts des Ghrelins könnten eines Tages Ghrelin-

antagonisten zur Behandlung der Adipositas eingesetzt werden [14]. Im Tiermodell

wurde bisher ein GHR-S-Antagonist erprobt, um dadurch dem endogenen Liganden

Ghrelin keine Andockmöglichkeit zu bieten und dadurch die Nahrungsaufnahme zu

reduzieren [4]. Darüber hinaus könnte durch Ghrelinsubstitution kachektischen und

anorektischen Patienten geholfen werden.

Anja Sonst

14

4 Zielsetzung der Arbeit

In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression von Ghrelinzellen in verschiedenen

Stationen des Gastrointestinaltraktes betrachtet, um die histologischen Unterschie-

de zwischen gesundem und entzündlichem bzw. metaplastischem Gewebe heraus-

zuarbeiten.

Ein besonderes Augenmerk wurde auf die Autoimmungastritis gelegt. Patienten, die

an dieser Erkrankung leiden, unterliegen einem erhöhten Risiko der Schleimhaut-

atrophie und folglich einem erhöhten Krebsrisiko. Diesem Risiko konnte man seither

nur durch regelmäßige Gastroskopien vorbeugen, was für den Patienten eine unan-

genehme Prozedur bedeutete. Durch die Korrelation des Serumghrelins mit dem

Zustand der Magenschleimhaut könnte der Abstand zwischen Kontrollgastroskopien

verlängert werden.

Da eine erhöhte Expression des Ghrelinrezeptors in der Barrett-Mucosa nachgewie-

sen wurde [41], sind in dieser Arbeit auch morphologische Veränderungen des

Ghrelinzellbildes in entzündlichen und metaplastischen Geweben von Interesse.

Untersucht wurden in diesem Rahmen die Refluxösophagitis, die Barrett-Mucosa,

die Autoimmungastritis, die Hp-Gastritis, die Pankreatische und die Gastrale Meta-

plasie.

Weiterhin wurde der Zusammenhang zwischen Ghrelin und Gastrin untersucht.

Zum einen sollte überprüft werden, ob neuroendokrine Ghrelinzellen einen Gastrin-

rezeptor besitzen und somit von Gastrin angesteuert werden können. Zum anderen

wurde die Korrelation zwischen dem Serumghrelin und dem Serumgastrin unter-

sucht, um den Mechanismus der Ghrelinfreisetzung genauer zu verstehen.

Anja Sonst

15

5 Material und Methoden

Alle Gewebeproben wurden aus dem Archiv des Pathologischen Instituts des Uni-

versitätsklinikums Erlangen entnommen. Es handelt sich um einen Nachgebrauch

von medizinischem Untersuchungsgut, das nach den Richtlinien der örtlichen Ethik-

kommission (24.01.2005) zu Forschungszwecken verwendet werden darf. Das Biop-

siematerial wurde nach Standardprotokollen in Formalin fixiert und in Paraffin ein-

gebettet.

Für die Blutentnahmen wurde der vorgelegte Antrag inklusive Patientenaufklärung

von der örtlichen Ethikkommission am 05.07.2010 geprüft und genehmigt.

5.1 Normales Gewebe des oberen Gastrointestinaltrakts

Die Diagnose Normalgewebe wurde am histologischen Schnitt in HE-Färbung (Hä-

matoxylin-Eosin-Färbung) verifiziert. Im Rahmen der Ergebnisse werden die gewe-

betypischen Merkmale erwähnt.

5.1.1 Ösophagus

Probenanzahl m:w Altersdurchschnitt in Jahren (Spanne)

12 6:6 19,0 (1-84)

Tab. 1 Kollektiv Ösophagus

Anja Sonst

16

5.1.2 Magencorpus

Probenanzahl m:w Altersdurchschnitt in Jahren (Spanne)

12 7:5 51,2 (11- 81)

Tab. 2 Kollektiv Magencorpus

5.1.3 Magenantrum

Probenanzahl m:w Altersdurchschnitt in Jahren (Spanne)

11 6:5 32,7 (1-66)

Tab. 3 Kollektiv Magenantrum

5.1.4 Duodenum

Probenanzahl m:w Altersdurchschnitt in Jahren (Spanne)

11 7:4 58,7 (34-83)

Tab. 4 Kollektiv Duodenum

5.1.5 Pankreas

Probenanzahl m:w Altersdurchschnitt in Jahren (Spanne)

9 5:4 52,1 (33-75)

Tab. 5 Kollektiv Pankreas

Anja Sonst

17

5.2 Metaplasien und Entzündungen im oberen Gastrointesti-

naltrakt

Das metaplastisch bzw. entzündlich veränderte Gewebe wurde wie das gesunde

Gewebe anhand von HE-Färbungen bzw. einer Wartin-Starry-Färbung im Rahmen

der Hp-Diagnostik überprüft.

5.2.1 Refluxösophagitis

Probenanzahl m:w Altersdurchschnitt in Jahren (Spanne)

9 7:2 46,9 (11-77)

Tab. 6 Kollektiv Refluxösophagitis

5.2.2 Barrett-Mucosa

Probenanzahl m:w Altersdurchschnitt in Jahren (Spanne)

12 6:6 65,1 (22-82)

Tab. 7 Kollektiv Barrett Mucosa

5.2.3 Pankreatische Metaplasie

Probenanzahl m:w Altersdurchschnitt in Jahren (Spanne)

10 5:5 58,4 (44-76)

Tab. 8 Kollektiv Pankreatische Metaplasie

Anja Sonst

18

5.2.4 Autoimmungastritis

Probenanzahl m:w Altersdurchschnitt in Jahren (Spanne)

20 9:11 71,5 (47-84)

Tab. 9 Kollektiv Autoimmungastritis

5.2.5 Hp-Gastritis

Probenanzahl m:w Altersdurchschnitt in Jahren (Spanne)

10 4:6 63,9 (26-90)

Tab. 10 Kollektiv Hp-Gastritis der Corpusmucosa

Probenanzahl m:w Altersdurchschnitt in Jahren (Spanne)

10 1:9 69,8 (41-86)

Tab. 11 Kollektiv Hp-Gastritis der atrophen Corpusmucosa

5.2.6 Gastrale Metaplasie

Probenanzahl m:w Altersdurchschnitt in Jahren (Spanne)

11 7:4 56,8 (43-81)

Tab. 12 Kollektiv Gastrale Metaplasie

Anja Sonst

19

5.3 Immunhistochemischer Nachweis von Ghrelin

Gesundes Gewebe des Ösophagus (s. 5.1.1), des Magencorpus (s. 5.1.2), des Ma-

genantrums (s. 5.1.3) und des Duodenums (s. 5.1.4) wurden nach folgender im-

munhistochemischen Färbemethode behandelt.

Zunächst erfolgte die Entparaffinierung der Schnitte in der Xylol-Reihe für 30 Minu-

ten und anschließend die Entwässerung über eine absteigende Alkoholreihe für

zwei bis drei Minuten pro Küvette: 100%, 100%. 96%, 96%, 70%.

Die Schnitte wurden mit Tris-Puffer gespült, in eine Küvette mit Zitronensäurepuffer

gestellt und für drei Minuten im Dampfkochtopf behandelt.

Nach dem Auskühlen wurden die Schnitte für 15 Minuten in 1:10 verdünntem Was-

serstoffperoxid zur Blockade der endogenen Peroxidase eingestellt und darauf er-

neut mit Tris-Puffer gespült.

Anschließend wurden die Objektträger in Steckschienen eingebracht und wiederum

mit Tris-Puffer gespült.

Über Nacht wurden die Präparate bei Raumtemperatur mit dem Primärantikörper

(Goat-anti-Ghrelin-Antikörper; Santa Cruz Biotechnology, Inc.; USA) inkubiert. Pro

Schnitt wurden 200µl des in Albuminpuffer vorverdünnten Antikörpers angesetzt.

Am folgenden Tag wurden die Schnitte zunächst mit Tris-Puffer (mit Brij) ein- bis

zweimal gespült. Danach wurde der Sekundärantikörper (Rabbit-anti-Goat-

Antikörper; Dako; Denmark) nach einer Verdünnung von 1:100 mit Tris-Puffer dazu-

gegeben.

Nach einer Inkubation von 30 bis 45 Minuten bei Raumtemperatur wurde erneut

ein- bis zweimal mit Tris-Puffer gespült.

Es wurden pro Steckschiene vier Tropfen des HRP-Komplexes hinzugegeben

(horseradish peroxidase complex; Dako; Denmark), welcher vor der Anwendung 30

Minuten im Kühlschrank vorinkubiert worden war.

Nach 30 Minuten wurde ein letztes Mal mit Tris-Puffer gespült.

Anschließend erfolgte die Färbung der Schnitte mit AEC-Lösung für drei Minuten (3-

amino-9-ethylcarbazole; Dako; Denmark).

Anja Sonst

20

Danach wurden die Objektträger in eine Glasküvette mit Leitungswasser gestellt

und für einige Minuten fließend gewässert.

Die Gegenfärbung erfolgte mit Hämalaun für zehn Sekunden mit nachfolgender

Wässerung für eineinhalb Minuten. (Herstellung der Hämalaun-Lösung: 1g Häma-

toxylin in 1000ml Wasser lösen und 0,2g Natriumiodat und 50g Aluminiumkali-

umsulfat zugeben. Nach Auflösung wurden 50g Chloralhydrat und 1g Citronensäure

zugefügt.)

Zum Schluss wurden die Schnitte in eine Küvette mit Aqua dest. gestellt und schließ-

lich eingedeckelt.

5.4 Immunfluoreszenzfärbung

Die Schnitte wurden, wie schon in 5.3 (Immunhistochemischer Nachweis von Ghre-

lin) beschrieben, behandelt. Die Visualisierung der Immunreaktion erfolgte mit fluo-

reszierenden Sekundärantikörpern (sämtlich von Jackson ImmunoResearch Labora-

tories, Inc.; USA), die gegen die speziesabhängigen Primärantikörper gerichtet sind.

5.4.1 Ghrelin-Chromogranin-Doppelfärbung

Bei der Ghrelin-Chromogranin-Doppelfärbung wurden die oben genannten Kollekti-

ve „normaler Magencorpus“ (s. 5.1.2), „Autoimmungastritis“ (s. 5.2.4) und „pankre-

atische Metaplasie“ (s. 5.2.3) untersucht. Als Primärantikörper wurde ein Goat-anti-

Ghrelin-Antikörper (1:500; Santa Cruz Biotechnology, Inc.; USA) und ein Mouse-anti-

Chromogranin-Antikörper verwendet (1:1000; Santa Cruz Biotechnology, Inc.; USA).

Nach der Inkubation über Nacht wurden für eine Stunde ein Cy2-gekoppelter Don-

key-anti-Goat-Antikörper (1:100; grüne Fluoreszenz; Jackson ImmunoResearch La-

boratories, Inc.; USA) und ein Cy3-gekoppelter Rabbit-anti-Mouse-Antikörper

(1:100; rote Fluoreszenz; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.; USA) hinzu-

gegeben.

Anja Sonst

21

Schließlich wurden die Präparate mit DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindol; 1:5000),

einem blau fluoreszierenden Farbstoff zur Markierung des Kernchromatins, gegen-

gefärbt.

5.4.2 Ghrelin-Gastrinrezeptor-Doppelfärbung

Für diese Färbung wurden die unter 5.1.2 und 5.2.4 genannten Kollektive „Magen-

corpus“ und „Autoimmungastritis“ verwendet. Als Primärantikörper dienten ein

Goat-anti-Ghrelin-Antikörper (1:500; Santa Cruz Biotechnology, Inc.; USA) und ein

Rabbit-anti-Gastrinrezeptor-Antikörper/Cholezystokinin-B-Rezeptor-Antikörper

(1:100; GeneTex, Inc.; USA).

Als Sekundärantikörper wurden ein Cy2-gekoppelter Donkey-anti-Goat-Antikörper

(1:50; grüne Fluoreszenz; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.; USA) und ein

Cy3-gekoppelter Goat-anti-Rabbit-Antikörper (1:50; rote Fluoreszenz; Jackson Im-

munoResearch Laboratories, Inc.; USA) verwendet.

Die Kerngegenfärbung erfolgte mit Dapi (1:5000).

5.4.3 Ghrelin-Amylase-Doppelfärbung

Mit der Ghrelin-Amylase-Doppelfärbung wurden die oben genannten Kollektive

„normaler Magencorpus“ (s. 5.1.2) und „pankreatische Metaplasie“ (s. 5.2.3) unter-

sucht und mit dem Kollektiv „normaler Pankreas“ (s. 5.1.5) verglichen.

Als Primärantikörper wurde ein Goat-anti-Ghrelin-Antikörper (1:500; Santa Cruz

Biotechnology, Inc.; USA) und ein Rabbit-anti-Amylase-Antikörper (1:1000; Santa

Cruz Biotechnology, Inc.; USA) verwendet.

Als Sekundärantikörper wurden dieselben, wie unter 5.4.2 beschrieben, verwendet.

Anja Sonst

22

5.5 Fotodokumentation

Für die Licht- und Fluoreszenzmikroskopie wurden die Schnitte mit dem Olympus

BX60 Mikroskop betrachtet und mit der Color-View Kamera (Olympus) fotografiert.

Zur digitalen Bilderfassung wurde die AnalySIS-Software (Soft Imaging System) ver-

wendet.

Konfokale Bilder wurden mit dem Bio-Rad MRC 1000 Confocal Laser Scanning Sys-

tem (Bio-Rad, Hemel Hempstead, UK) erstellt, welches mit einem Krypton-Argon-

Laser (American Laser Corporation, Salt Lake City, UT, USA) ausgestattet und an eine

Nikon Diaphot 300 (Nikon, Düsseldorf, Deutschland) angeschlossen war. Die Präpa-

rate wurden mit zwei Laserlinien gescannt, um eine grüne Fluoreszenz durch eine

488nm-Anregung (blaue Anregung) und eine rote Fluoreszenz durch eine 568nm-

Anregung (gelbe Anregung) darzustellen.

Ein Öl-Immersionsobjektiv (Numerische Apertur 1.4; Nikon) mit einer 60-fachen

Vergrößerung wurde mit einem elektronischen Zoom bis zu 3.0 kombiniert.

Anja Sonst

23

5.6 ELISA

Mit Hilfe des ELISA wurde die Ghrelin- und Gastrinkonzentration im humanen Se-

rum bestimmt.

5.6.1 Gewinnung der Blutproben

Es wurden über hausärztliche Praxen diejenigen Patienten kontaktiert, deren Biop-

sien für das Autoimmungastritiskollektiv (s. 5.2.4) ausgewählt worden waren. Nach

Zustimmung der Patienten wurde präprandiales EDTA-Blut abgenommen und dieser

Studie zur Verfügung gestellt.

Die Blutproben wurden mit einem EDTA-Röhrchen präprandial entnommen. Vor der

Durchführung des Immunoassays wurde das Blut zentrifugiert und das Plasma abpi-

pettiert.

5.6.2 Patienten- und Kontrollkollektiv

Das Kollektiv von ursprünglichen 20 Autoimmungastritispatienten differiert, da nur

von acht Patienten Blutproben akquiriert werden konnten. Als Kontrollgruppe wur-

den zehn gesunde Probanden ausgewählt.

Autoimmungastritis m:w Altersdurchschnitt in Jahren (Spanne)

8 1:7 70,1 (53 - 83)

Kontrollkollektiv m:w Altersdurchschnitt in Jahren (Spanne)

10 5:5 56,4 (51 - 63)

Tab. 13 Autoimmungastritispatienten und Kontrollkollektiv der Blutproben

Anja Sonst

24

5.6.3 ELISA für Gastrin, aktives Ghrelin und Gesamtghrelin

Mittels ELISA wurden die Konzentrationen des Gastrins (Gastrin (human), Cat. No. S-

1209, Peninsula Laboratories, LLC, USA), des aktiven Ghrelins (Human Ghrelin (Ac-

tive), Cat. No. EZGRA-88K, EMD Millipore Corporation, USA) und des Gesamtghre-

lins (Desacyl-Ghrelin-ELISA Kit, SCETI-Mitsubishi Kagaku Iatron, (Tokyo, Japan)) be-

stimmt.

Die Durchführung erfolgte nach den beigefügten Protokollen.

Es wurde ein Absorptionsspektrum von 450nm für Gastrin verwendet, für das aktive

und das Gesamtghrelin ein Absorptionsspektrum von 450nm, korrigiert durch das

Absorptionsspektrum bei 590nm.

Anja Sonst

25

6 Ergebnisse

Zur Darstellung der Ergebnisse der immunhistochemischen und Immunfluoreszenz-

färbungen wurde aus jedem Kollektiv ein passender Schnitt exemplarisch ausge-

wählt, welcher fotografiert und in diesem Kapitel abgebildet wurde.

6.1 Immunhistochemischer Nachweis von Ghrelin

6.1.1 Ghrelinexpression im normalen Humangewebe

Ösophagus

Untersucht wurden zwölf Biopsiepräparate des Ösophagus ohne pathologische Be-

funde.

Weder das mehrschichtige, unverhornte Plattenepithel, noch die submukösen Drü-

sen wiesen Ghrelinzellen auf und wurden damit als ghrelinnegativ bezeichnet

(0/12).

Abb. 2 Immunhistochemische Ghrelinfärbung von normalem Ösophagusgewebe, 100-fache Vergrößerung

Abb. 3 HE-Färbung von normalem Ösophagus-gewebe, 100-fache Vergrößerung

Anja Sonst

26

Magencorpus

Es wurden zwölf Biopsien des gesunden Magencorpus untersucht.

Die Verteilung der ghrelinpositiven Zellen verhielt sich gleichmäßig in der gesamten

Schleimhaut. Innerhalb der Ghrelinzellen waren die Zellkerne luminal angeordnet,

die ghrelinhaltigen Granula basolateral, was auf die endokrine Sekretion von Ghre-

lin hinweist. Vermehrt fand man Ghrelinzellen im Hauptteil der Glandulae gastricae,

wo sie einzeln, aber auch in Gruppen von zwei oder drei Zellen nebeneinander, lo-

cker gestreut zwischen den Haupt- und den Parietalzellen zu finden waren. Im Be-

reich der oberflächlichen Drüsenkörperzellen präsentierten sich jedoch nur in weni-

gen Fällen Ghrelinzellen. In den Foveolen waren sie nicht nachweisbar.

Im Einzelfall waren auch Konglomerate von etwa zehn Ghrelinzellen zu finden. Ein

Präparat zeigte offenbar aus technischen Gründen keine Ghrelinfärbung (11/12).

Abb. 4 Immunhistochemische Ghrelinfärbung von normalem Magencorpusgewebe, 100-fache Vergrößerung

Abb. 5 HE-Färbung von normalem Magencor-pusgewebe, 100-fache Vergrößerung

Anja Sonst

27

Magenantrum

Absolut betrachtet waren acht von elf Proben des Magenantrums ghrelinpositiv

(8/11).

Im Vergleich zum Magencorpus zeigte sich jedoch im Magenantrum eine geringere

Zellzahl und Intensität ghrelinpositiver Zellen. Bekanntermaßen finden sich in den

pylorischen Antrumdrüsen vor allem muzinsezernierende Zellen, außerdem gastrin-

bildende G-Zellen und somatostatinbildende D-Zellen (vgl. auch Abb. 48) [35].

Abb. 6 Immunhistochemische Ghrelinfärbung von normalem Magenantrumgewebe, 100-fache Vergrößerung

Abb. 7 HE-Färbung von normalem Magencor-pusgewebe, 100-fache Vergrößerung

Anja Sonst

28

Duodenum

Die elf Präparate des Duodenums wiesen alle ghrelinpositive Zellen auf (11/11).

Diese fand man einzeln im Zottenepithel, meist im Bereich der Zottenbasis. Bei drei

Präparaten waren auch einzelne Zellen in den Brunner Drüsen ghrelinpositiv. Auch

hier war eine deutlich geringere Zellzahl und Intensität ghrelinpositiver Zellen im

Vergleich zum Magencorpus und zum Antrum nachzuweisen.

Abb. 8 Immunhistochemische Ghrelinfärbung von normalem Duodenumgewebe, 100-fache Vergrößerung

Abb. 9 HE-Färbung von normalem Duodenum-gewebe, 100-fache Vergrößerung

Anja Sonst

29

6.1.2 Unterschiedliche Ausprägung von Ghrelin in verschiedenen Me-

taplasien und entzündlich verändertem Gewebe

Im folgenden Abschnitt werden Gewebe des ösophagogastralen Übergangs be-

trachtet.

Refluxösophagitis

Refluxbeschwerden sind ein häufiges Symptom in den industrialisierten westlichen

Ländern [30]. Die Refluxösophagitis ist Folge einer Insuffizienz des gastroösopha-

gealen Übergangs [48, 49]. Dadurch kommt es zu vermehrtem Reflux von Magen-

und Duodenalsaft. Durch Adipositas wird dieser Vorgang zusätzlich begünstigt. Mik-

roskopisch ist die Basalzellschicht hyperplastisch und nimmt mehr als 50% der

Schleimhautdicke ein. Charakteristischerweise zeigen sich leukozytäre und gra-

nulozytäre Infiltrationen in der Lamina propria des Ösophagusepithels.

Es konnten in allen neun Präparaten der Refluxösophagitis keine Ghrelinzellen de-

tektiert werden (0/9).

Abb. 10 Immunhistochemische Ghrelinfärbung von normalem Ösophagusgewebe, 100-fache Vergrößerung

Abb. 11 HE-Färbung von normalem Ösophagus-gewebe, 100-fache Vergrößerung

Barrett-Mucosa

Die Barrett-Metaplasie wird durch gallehaltiges Refluxat bei Patienten mit gast-

roösophagealer Reflux-Krankheit initiiert. Histologisch ist die Barrett-Mucosa cha-

rakterisiert durch das Auftreten von zylindrischem Schleimhautepithel mit Becher-

Anja Sonst

30

zellen innerhalb des verhornten Plattenepithels [34]. Zusätzlich muss jedoch für die

korrekte Diagnose eine Korrelation mit der endoskopischen Bildgebung in Form von

fingerförmigen Schleimhautzungen in der distalen Speiseröhre gegeben sein [51].

In der Barrett-Mucosa zeigten zehn von elf Präparaten eine Ghrelinexpression

(10/11). In dem für die Barrett-Schleimhaut charakteristischen flachen Zylin-

derepithel und der inkompletten intestinalen Metaplasie mit eingelagerten Becher-

zellen fand man die ghrelinpositiven Zellen auf der basalen Epithelseite. Die Expres-

sion der einzeln auftretenden Ghrelinzellen variierte von mäßig bis stark. In der ge-

sunden Ösophagusschleimhaut wurden keine Ghrelinzellen nachgewiesen (s. 6.1.1).

Abb. 12 Immunhistochemische Ghrelinfärbung von Barrett Mucosa, 100-fache Vergrößerung

Abb. 13 Immunhistochemische Ghrelinfärbung von Barrett Mucosa, 200-fache Vergrößerung

Abb. 14 HE-Färbung von Barrett Mucosa, 100-fache Vergrößerung

Abb. 15 HE-Färbung von Barrett Mucosa, 200-fache Vergrößerung

Pankreatische Metaplasie

Die Pankreatische Metaplasie erkennt man im Magengewebe an einer organischen

Struktur mit lobulärer Gliederung und gemischt muzinösen und azinären Zellen.

Anja Sonst

31

Letztere zeigen ein charakteristisch amphophiles Muster. Dies bedeutet eine azido-

phile Färbung im apikalen und mittleren Bereich der azinären Zellen und eine baso-

phile im basolateralen Teil der Zelle [18]. Die Lokalisation der mit Reflux assoziierten

Pankreatischen Metaplasie befindet sich erfahrungsgemäß häufig in der Cardia bzw.

im cardianahen Fundusbereich.

In der Pankreatischen Metaplasie waren einzelne ghrelinpositive Zellen zu finden.

Im angrenzenden Fundus- und Cardiagewebe schienen jedoch die Ghrelinzellen

angereichert vorzuliegen. Hier fanden sich Ghrelinknötchen und Ghrelinzellen in

linearer Anordnung. In erster Linie scheint dieses Muster auf eine Art Verdrän-

gungsprozess hinzuweisen.

Um noch genauer beurteilen zu können, ob ghrelinpositive Zellen in der Pankreati-

schen Metaplasie auftreten, wurde zusätzlich eine Doppelimmunfluoreszenzfärbung

mit Ghrelin und Amylase durchgeführt (s. 5.4.3).

Abb. 16 Immunhistochemische Ghrelinfärbung von Pankreatischer Metaplasie, 100-fache Ver-größerung

Abb. 17 HE-Färbung von Pankreatischer Meta-plasie, 100-fache Vergrößerung

Da Ghrelinzellen hauptsächlich im Magencorpus erwarten werden, werden im Fol-

genden Gastritisformen behandelt, die den Magencorpus betreffen, allen voran die

Autoimmungastritis. Außerdem wird in diesem Zusammenhang die Hp-Gastritis

betrachtet, die zwar ihre Hauptlokalisation im Magenantrum hat, jedoch auch im

Magencorpus vorkommt [17].

Anja Sonst

32

Autoimmungastritis

Die Präparate wurden nach für die Autoimmungastritis typischen histologischen

Kriterien ausgewählt. Hierzu zählen der Verlust von Belegzellen im Corpusbereich,

Atrophie der Mucosa der Corpusschleimhaut, das Auftreten von pseudopylorischer

und intestinaler Metaplasie, sowie die endokrine Zellhyperplasie [22, 49].

In der Autoimmungastritis erschien das Zellbild im Vergleich zum gesunden Magen-

corpus stark verändert.

Wie bereits erwähnt sind für die Autoimmungastritis atrophe/pseudopylorische

Drüsen charakteristisch [52], die aufgrund des Untergangs der Belegzellen die säu-

reproduzierende Corpusmucosa ersetzen, was einen Ghrelinverlust nach sich zieht.

Die atrophen/pseudopylorischen Drüsen enthielten in Analogie zum Magenantrum

nur sehr vereinzelt Ghrelinzellen.

Es fanden sich zahlreiche Ghrelinzellen, die jedoch häufig Konglomerate bildeten.

Solche „Ghrelinknötchen“ konnten in allen Präparaten nachgewiesen werden

(20/20). Diese neuroendokrinen Zellknötchen kamen vor allem im Interstitium der

Drüsen zum Vorschein.

Weiterhin konnten Ghrelinzellen zwischen den Haupt- und Parietalzellen nachge-

wiesen werden. Der Unterschied zu normalem Corpusgewebe lag darin, dass ghre-

linpositive Zellen häufig eine lineare Progression innerhalb der Drüsen aufwiesen

(17/20).

Abb. 18 Immunhistochemische Ghrelinfärbung von Autoimmungastritis, 100-fache Vergröße-rung

Abb. 19 HE-Färbung von Autoimmungastritis, 100-fache Vergrößerung

Anja Sonst

33

Zusammenfassend präsentierten sich neuroendokrine Ghrelinzellen in der Autoim-

mungastritis als Zellkonglomerate bzw. als lineare Hyperplasie. Neuroendokrine

Zellknötchen, welche vermutlich aufgrund der durch Hypoazidität verursachten Hy-

pergastrinämie entstehen, beschrieben bereits Faller et al. [22].

In 16 von 20 Präparaten zeigte sich in der Autoimmungastritis eine intestinale Me-

taplasie, welche in den meisten Fällen ghrelinnegativ war. Nur sehr vereinzelt fan-

den sich Ghrelinzellen, was dem Ghrelinzellbild im Duodenum entspricht.

Helicobacter pylori-Gastritis

Die Hp-Gastritis gilt als der wesentliche Risikofaktor für eine atrophe Gastritis und

für ein Magenkarzinom. Durch die Wartin-Starry-Färbung wurde Helicobacter den

Präparaten eindeutig nachgewiesen. Wie bereits erwähnt wurde Hp-positive

Schleimhaut aus dem Magencorpus gewonnen, da hier die Ghrelinzellen hauptsäch-

lich erwartet werden, und nicht aus dem für die Hp-Gastritis typischen Magenant-

rum.

Abb. 20 Wartin-Starry-Färbung von Hp-Gastritis, 400-fache Vergrößerung

Anja Sonst

34

Hp-Gastritis in der Corpusschleimhaut

Wie im normalen Corpusgewebe lagen in der Helicobacter-besiedelten Corpus-

schleimhaut die Ghrelinzellen einzeln verteilt vor. Wie in Abbildung 21 und 22 zu

sehen ist, sind die inflammatorischen Infiltrate typischerweise verstärkt in der ober-

flächlichen Schleimhaut nachzuweisen. Basal zeigen sich sogenannte sekundäre

Lymphfollikel. Die Ghrelinzellen werden durch inflammatorische Infiltrate verdrängt

und sind nur noch in den tieferen Schichten zu sehen. Die Ghrelinzelldichte nimmt

sozusagen von oben nach unten zu.

Abb. 21 Immunhistochemische Ghrelinfärbung von Hp-Gastritis, inflammatorische Infiltrate durch geschweifte Klammern gekennzeichnet, 100-fache Vergrößerung

Abb. 22 HE-Färbung von Hp-Gastritis, inflamm-atorische Infiltrate durch geschweifte Klam-mern gekennzeichnet, 100-fache Vergrößerung

Anja Sonst

35

Hp-Gastritis in der atrophen Corpusschleimhaut

Des Weiteren wurden Hp-Präparate ausgewählt, bei denen die Entzündung bereits

weiter fortgeschritten und somit auch eine Atrophie der Schleimhaut zu verzeich-

nen war.

Auch hier lagen Ghrelinzellen einzeln verteilt vor. Je mehr die Entzündungsreaktion

jedoch auf den Drüsenkörper übergreift, desto weniger Ghrelinzellen sind vorhan-

den. Die Ghrelinzellen werden von den sekundären Lymphfollikel verdrängt. In ei-

nem Fall waren auch Knötchen wie bei der Autoimmungastritis zu sehen (s. Abb.

23). Somit ist es wahrscheinlich, dass sich das Zellbild bei fortschreitender Atrophie

immer mehr dem Zellbild der Autoimmungastritis angleicht. Faller et al. beschrie-

ben bereits die morphologischen Parallelen zwischen der Autoimmungastritis und

der atrophen Hp-Gastritis, nämlich die Hauptlokalisation im Magencorpus, das Auf-

treten der intestinale Metaplasie und der Zelluntergang der Magendrüsen [22].

Abb. 23 Immunhistochemische Ghrelinfärbung von Hp-Gastritis, 100-fache Vergrößerung

Abb. 24 HE-Färbung von Hp-Gastritis, 100-fache Vergrößerung

Die C-Gastritis, die sich hauptsächlich durch den Gallereflux auf das Antrum be-

schränkt und mit foveolärer Hyperplasie vergesellschaftet ist [17], wurde in dieser

Arbeit nicht betrachtet, da im Magenantrum keine verstärkte Ghrelinexpression zu

erwarten ist.

Nach den entzündlich und metaplastisch veränderten Geweben von Ösophagus und

Magen wird im Folgenden noch die Gastrale Metaplasie im Dünndarm betrachtet.

Anja Sonst

36

Gastrale Metaplasie

Die Entstehung der Gastralen Metaplasie ist auf eine Hyperazidität des Bulbusin-

halts im Duodenum zurückzuführen. Durch die vermehrte Säure entstehen ober-

flächliche Erosionen, die dann nicht mehr durch Epithel der Duodenalschleimhaut,

sondern durch Oberflächenepithel vom Magenschleimhauttyp überkleidet werden.

Mikroskopisch lässt sich die Gastrale Metaplasie in der Duodenalschleimhaut mit-

tels der Alcian-PAS-Färbung nachweisen, was für die Auswahl des Kollektivs durch-

geführt wurde. Dabei zeigt das Oberflächenepithel eine gleichmäßig starke Rotfär-

bung (PAS-Färbung), während die Enterozyten in der Duodenalschleimhaut nur eine

lumenwärts gelegene schwächere Färbung des Bürstensaums und durch die Alcian-

Färbung blau angefärbte, eingelagerte Becherzellen enthalten [49].

Die gastrale Metaplasie in der Duodenalschleimhaut wies eine vergleichbare spärli-

che positive Ghrelinexpression wie die normale Duodenalschleimhaut auf. Acht von

neun Präparaten waren ghrelinpositiv (8/9). Im Oberflächenepithel vom Magen-

schleimhauttyp an sich waren keine Ghrelinzellen zu sehen. Bei sechs Präparaten

fielen außerdem einzelne Ghrelinzellen in den Brunner-Drüsen auf. Einen Unter-

schied zum normalen Duodenum hinsichtlich der Anordnung der Ghrelinzellen

konnte jedoch nicht erkannt werden.

Abb. 25 Immunhistochemische Ghrelinfärbung von Gastraler Metaplasie, 100-fache Vergröße-rung

Abb. 26 Alcian-PAS-Färbung von Gastraler Me-taplasie, 100-fache Vergrößerung

Anja Sonst

37

6.2 Immunfluoreszenzfärbung

6.2.1 Ghrelinzellen als neuroendokrine Zellen

Neuroendokrine Zellen enthalten Chromogranin A und können somit durch Chro-

mogranin-Antikörper markiert werden [67].

Magencorpus

Bei der Ghrelin-Chromogranin-Färbung konnte bestätigt werden, dass Ghrelinzellen

zu den neuroendokrinen Zellen zählen.

Abb. 27 Ghrelin-Immunfluoreszenzfärbung von normalem Magencorpusgewebe, 200-fache Vergrößerung

Abb. 28 Chromogranin-Immunfluoreszenzfär-bung von normalem Magencorpusgewebe, 200-fache Vergrößerung

Abb. 29 Ghrelin-Chromogranin-Doppelfärbung von normalem Magencorpusgewebe, 200-fache

Vergrößerung

Der Sekundärantikörper für Ghrelin fluoresziert grün (s. Abb. 27), der Sekundäranti-

körper für Chromogranin rot (s. Abb. 28). Nach der Überlagerung beider Bilder er-

Anja Sonst

38

kennt man die Kolokalisation der Zellen an der gelben Farbe (s. Abb. 29). Dabei wird

deutlich, dass alle Ghrelinzellen neuroendokrine Zellen sind, dass aber wie bereits

bekannt nicht alle neuroendokrinen Zellen Ghrelin produzieren. Im Schnitt sind

schätzungsweise ca. 10-20% der neuroendokrinen Zellen Ghrelinzellen, was die Er-

gebnisse von Date et al. bestätigt [15].

Anja Sonst

39

Autoimmungastritis

In der Autoimmungastritis wurden mit der Ghrelinfärbung Konglomerate von Ghre-

linzellen nachgewiesen. Zur Darstellung der neuroendokrinen Zellhyperplasie wurde

standardgemäß, wie unter 5.4.1 beschrieben, die Chromograninfärbung eingesetzt.

Durch die Immunfluoreszenzfärbung konnte belegt werden, dass in diesen Zellknöt-

chen auch ein erheblicher Anteil aus ghrelinpositiven Zellen besteht. Diese Knöt-

chen kann man in gelber Fluoreszenz in Abbildung 30 erkennen. In zwei Fällen

schienen jedoch die neuroendokrinen Konglomerate ghrelinnegativ zu sein. Somit

fluoreszieren die ghrelinnegativen Konglomerate rot (s. Abb. 31). Neuroendokrine

Zellhyperplasien lassen sich auch diagnostisch mit Chromogranin nachweisen [8],

Ghrelin wurde jedoch kaum mit diesen neuroendokrinen Zellhyperplasien im Rah-

men der Autoimmungastritis in Zusammenhang gebracht. So beschäftigt sich bis-

lang nur eine Studie mit Ghrelin in ECL-Zellhyperplasien bzw. ECL-Zell-Karzinoiden

[58]. Absolut lässt sich schwer schätzen, ob Ghrelinzellen bei der Autoimmungastri-

tis prozentual den gleichen Anteil, wenn nicht sogar einen etwas höheren Anteil im

Vergleich zum gesunden Magengewebe ausmachen. Ghrelin ist nämlich in atrophen

Arealen vermindert, in endokrinen Zellknötchen jedoch anzutreffen. Das heißt, dass

Ghrelinzellen im Rahmen der durch die Schleimhautatrophie bedingten Hypergas-

trinämie offenbar mitreagieren.

Abb. 30 Ghrelin-Chromogranin-Doppelfärbung von Autoimmungastritis, 200-fache Vergröße-rung

Abb. 31 Ghrelin-Chromogranin-Doppelfärbung von Autoimmungastritis, 200-fache Vergröße-rung

Anja Sonst

40

Die neuroendokrinen Zellen lagern sich primär linear als sogenannte lineare endo-

krine Zellhyperplasie an. In dieser linearen Progression fielen unterschiedliche Aus-

prägungen der Ghrelinzellen auf. Wie erwartet zeigten sich die Ghrelinzellen als

Subgruppe der chromograninpositiven neuroendokrinen Zellen. Teilweise dominiert

diese Subruppe, wie in Abbildung 32 zu sehen ist. In anderen Fällen kommen mehr

ghrelinnegative neuroendokrine Zellen zum Vorschein (s. Abb. 33 und 34) bis hin zur

Dominanz der ghrelinnegativen neuroendokrinen Zellen (s. Abb. 35).

Abb. 32 Ghrelin-Chromogranin-Doppelfärbung von Autoimmungastritis, 200-fache Vergröße-rung

Abb. 33 Ghrelin-Chromogranin-Doppelfärbung von Autoimmungastritis, 200-fache Vergröße-rung

Abb. 34 Ghrelin-Chromogranin-Doppelfärbung von Autoimmungastritis, 200-fache Vergröße-rung

Abb. 35 Ghrelin-Chromogranin-Doppelfärbung von Autoimmungastritis, 200-fache Vergröße-rung

Anja Sonst

41

Pankreatische Metaplasie

Eine Pankreatische Metaplasie wird häufig im Rahmen einer chronischen atrophen

Gastritis gesehen [18, 22]. In der läppchenartigen Struktur der pankreatischen Me-

taplasie konnten Ghrelinzellen als neuroendokrine Zellen angefärbt werden (s. Abb.

36 und 37). Sie zeigen wie in der Autoimmungastritis knötchenartige und lineare

Anordnungen. Die Ghrelinzellen sind eher im angrenzenden Gewebe und im In-

terstitium der Pankreatischen Metaplasie angeordnet. Auch hier zeigen sich wieder

sowohl die Knötchen als auch die lineare Progression der Ghrelinzellen.

Um noch besser beurteilen zu können, ob die neuroendokrinen Zellen innerhalb der

Pankreatischen Metaplasie liegen oder im umliegenden Gewebe, wurde zusätzlich

die Ghrelin-Amylase-Fluoreszenzfärbung durchgeführt (s. 5.4.3).

Abb. 36 Ghrelin-Chromogranin-Doppelfärbung von Pankreatischer Metaplasie, 200-fache Ver-größerung

Abb. 37 Ghrelin-Chromogranin-Doppelfärbung von Pankreatischer Metaplasie, 200-fache Ver-größerung

Anja Sonst

42

6.2.2 Expression des Gastrinrezeptors auf Ghrelinzellen

Magencorpus

Wie erwartet zeigten zahlreiche Zellen, u.a. Parietal- und ECL-Zellen innerhalb des

Drüsenkörpers im Magencorpus einen Gastrinrezeptor auf. Bekanntermaßen besit-

zen Parietalzellen und ECL-Zellen Gastrin-/CCKB-Rezeptoren [56]. Die Ghrelinzellen,

die in grüner Fluoreszenz dargestellt wurden, zeigten fast ausnahmslos einen

Gastrinrezeptor. Dieser Rezeptor konnte als roter Saum, d.h. membranös nachge-

wiesen werden (s. Abb. 38). Der Gastrinrezeptor wurde bislang nur im Rattenmagen

identifiziert, jedoch nicht in humanem Gewebe [26]. Somit ergibt sich ein entschei-

dender Hinweis, dass im humanen Organismus Ghrelinzellen von Gastrin angesteu-

ert werden könnten.

Abb. 38 Ghrelin-Gastrinrezeptor-Doppelfärbung von normalem Magencorpusgewebe, Zytoplasma (Ghre-lin) = grün, Gastrinrezeptor = rot, N = Nucleus

N

Anja Sonst

43

Autoimmungastritis

Auch bei der Autoimmungastritis präsentierten sich Gastrinrezeptoren auf allen

Ghrelinzellen. Es fiel auf, dass die Färbung des Gastrinrezeptors auf den Konglome-

raten und der linearen Progression der neuroendokrinen Zellen stärker fluoreszierte

als auf den übrigen Zellen. Da bei der Autoimmungastritis der Zustand einer Hyper-

gastrinämie herrscht, wird möglicherweise in diesem Zusammenhang auch der

Gastrinrezeptor vermehrt exprimiert. Somit könnte durch die vermehrte Expression

des Gastrinrezeptors eventuell eine höhere Suszeptibilität für Gastrin herrschen.

Abb. 39 Ghrelin-Gastrinrezeptor-Doppelfär-bung von Autoimmungastritis, 200-fache Ver-größerung

Abb. 40 Ghrelin-Gastrinrezeptor-Doppelfär-bung von Autoimmungastritis, 200-fache Ver-größerung

Auch bei der Autoimmungastritis wurde die Doppelimmunfluoreszenzfärbung mit

dem konfokalen Mikroskop fotografiert. Abbildung 41 zeigt ein Ghrelinknötchen,

auf dem der Gastrinrezeptor exprimiert ist.

Abb. 41 Ghrelin-Gastrinrezeptor-Doppelfärbung von Autoimmungastritis

Anja Sonst

44

6.2.3 Ghrelinexpression in der Pankreatischen Metaplasie

Magencorpus

Die Ghrelin-Amylase-Färbung bestätigte, dass im normalen Magencorpus keine

amylasepositiven Zellen existieren. Ghrelinzellen liegen einzeln und in gleichmäßi-

ger Verteilung vor, wie unter 6.1.1 beschrieben wurde.

Abb. 42 Ghrelin-Amylase-Doppelfärbung von normalem Magengewebe, Negativkontrolle, 200-fache Vergrößerung

Anja Sonst

45

Pankreas

Im normalen Pankreasgewebe erkennt man wie erwartet zahlreiche amylasepositi-

ve Zellen. Ghrelinzellen sind vereinzelt im Drüsenkörper anzutreffen (s. Abb. 43),

jedoch auch in den amylasenegativen Langerhansinseln (s. Abb. 44).

Abb. 43 Ghrelin-Amylase-Doppelfärbung von normalem Pankreasgewebe, 200-fache Vergrö-ßerung

Abb. 44 Ghrelin-Amylase-Doppelfärbung von normalem Pankreasgewebe, 200-fache Vergrö-ßerung

Pankreatische Metaplasie

Durch die Amylasefärbung konnte das Vorhandensein von metaplastischen Pan-

kreaszellen in der Magenschleimhaut bewiesen werden. Durch die Überlagerung

der beiden Immunfluoreszenzfärbungen zeigten sich Zellen, die sowohl Amylase als

auch Ghrelin produzieren. Möglicherweise ist dies eine gemischt exo- und endokri-

ne Zellpopulation als Ausdruck einer Mischdifferenzierung.

Abb. 45 Ghrelin-Amylase-Doppelfärbung von Pankreatischer Metaplasie, 200-fache Vergrö-ßerung

Abb. 46 Ghrelin-Amylase-Doppelfärbung von Pankreatischer Metaplasie, 200-fache Vergrö-ßerung

Anja Sonst

46

6.3 ELISA

Es wurden Plasmaproben von Patienten mit Autoimmungastritis und von einem

Kontrollkollektiv akquiriert. Mittels ELISA wurden die Konzentrationen des aktiven

Ghrelins, des Gesamtghrelins und des Gastrins bestimmt. In diesem Versuch sollte

der Zusammenhang zwischen Ghrelin und Gastrin näher untersucht werden.

Zum besseren Vergleich der Ghrelinkonzentrationen mit Werten aus der Literatur

wurde die Einheit pmol/l, für die Gastrinkonzentrationen pg/ml verwendet.

Die statistischen Berechnungen erfolgten mit der IBM SPSS Statistics Software (Ver-

sion 19).

6.3.1 Korrelation von Ghrelin und Gastrin im Gesamtkollektiv

Alle Fälle (acht Patienten mit Autoimmungastritis und zehn Kontrollprobanden) be-

trachtend zeigte sich eine negative Korrelation zwischen Gastrin und aktivem Ghre-

lin, d.h. je höher der Gastrinspiegel, desto niedriger das Serumghrelin. In der Pear-

son-Korrelation zeigte sich jedoch nur ein Trend mit einem p-Wert von 0,277. Au-

ßerdem korrelierte Gastrin mit dem Gesamtghrelin negativ. Auch hier ließ sich al-

lerdings keine Signifikanz nachweisen.

Im Student`s T-Test zeigten Patienten mit Autoimmungastritis wie erwartet einen

signifikant erhöhten Gastrinmittelwert im Vergleich zur Kontrollgruppe (366,63

pg/ml vs. 20,90 pg/ml, p = 0,007, Abb. 47). Der Mittelwert des aktiven Ghrelins war

bei Autoimmungastritispatienten signifikant erniedrigt (0,39 pmol/l vs. 0,81 pmol/l,

p = 0,009, Abb. 47). Auch war bei Patienten mit Autoimmungastritis im Vergleich zur

Kontrollgruppe ein geringerer Mittelwert des Gesamtghrelins zu messen (91,72

pmol/l vs. 163,42 pmol/l, Abb. 47). Es lässt sich eine Tendenz, jedoch keine Signifi-

kanz erkennen, dass bei Autoimmungastritispatienten das Gesamtghrelin niedriger

ist (p = 0,07).

Zusammenfassend weisen Patienten, die an einer Autoimmungastritis leiden, einen

tendenziell erniedrigten Mittelwert des Gesamtghrelins auf, einen signifikant er-

niedrigten Mittelwert des aktiven Ghrelins und in negativer Korrelation einen signi-

fikant erhöhten Gastrinmittelwert.

Anja Sonst

47

Abb. 47 Präprandiale Werte von Gastrin, aktivem/octanoyliertem Ghrelin und Gesamtghrelin bei Patienten mit Autoimmungastritis (AIG) und Kontrollpersonen

6.3.2 Korrelation von Ghrelin und Gastrin bei Patienten mit Autoim-

mungastritis

Nach der Betrachtung des Gesamtkollektivs wurden anschließend nur die Autoim-

mungastritispatienten untersucht. Im Student`s T-Test mit separaten Gruppen be-

trug bei diesen Patienten der Gastrinmittelwert 366,6 pg/ml, der Mittelwert des

aktiven Ghrelins 0,39 pmol/l und der Mittelwert des Gesamtghrelins 91,72 pmol/l.

Untersucht man diese Werte bezüglich ihrer Korrelation, so stellt man fest, dass

Gastrin nicht mit dem aktiven Ghrelin, sondern nur mit dem Gesamtghrelin negativ

korreliert. Hierbei zeigte sich im Student`s T-Test auch eine Signifikanz (p = 0,042).

Ein limitierender Faktor ist hierbei jedoch die geringe Fallzahl von acht Autoimmun-

gastritispatienten, wofür die niedrige Prävalenz der Autoimmungastritis mitverant-

wortlich ist.

Anja Sonst

48

7 Diskussion

Das Hormon Ghrelin, welches in einer Vielzahl humaner Gewebearten produziert

wird, weist seinen Hauptproduktionsort im Magen auf [46].

In vorliegender Arbeit wurde durch immunhistochemische Färbungen das Ghrelin-

zellbild in verschiedenen Gewebearten des oberen Gastrointestinaltrakts dargestellt

und die histologischen Unterschiede zwischen gesundem und entzündlichem bzw.

metaplastischem Gewebe herausgearbeitet. Darüber hinaus wurde mittels ELISA

der Zusammenhang zwischen Ghrelin und Gastrin beleuchtet.

Im gesunden Ösophagusgewebe zeigte weder das Plattenepithel, noch die submu-

kösen Drüsen eine Ghrelinexpression. In der Literatur wurde allerdings das Vorhan-

densein von mRNA durch RT-PCR im humanen Ösophagus nachgewiesen [28]. Bei

dieser Studie wurde das chirurgisch entnommene Gewebe allerdings nicht durch

einen Pathologen histologisch kontrolliert. Falsch positive Ergebnisse z.B. durch Hia-

tushernien oder Heterotopien lassen sich so nicht ausschließen.

Im gesunden Magencorpus fanden sich die meisten Ghrelinzellen im Hauptteil der

Glandulae gastricae zwischen den Haupt- und den Parietalzellen. Auch Tanaka-

Shintani et al. beobachteten eine positive Korrelation zwischen Ghrelin- und Parie-

talzellen im humanen Gewebe und dass diese beiden Zelltypen im Fundusbereich

reichlich zu finden sind, jedoch nicht in der Pylorusregion [63]. Sowohl Date et al. als

auch Kojima et al. beschrieben eine Verteilung der Ghrelinzellen vom Hals bis zur

Basis der Magendrüsen sowohl in humanem Gewebe als auch im Rattenmagen [15,

39]. Somit werden durch vorliegende Experimente die bisherigen Aussagen in der

Literatur bestätigt. Auch in der Immunfluoreszenzfärbung zeigte sich im gesunden

Magencorpus eine gleichmäßige Verteilung der Ghrelinzellen. Außerdem konnte

durch die Kolokalisation mit Chromogranin dargestellt werden, dass es sich bei

Ghrelinzellen um neuroendokrine Zellen handelt. Der Anteil der Ghrelinzellen an

Anja Sonst

49

allen neuroendokrinen Zellen betrug schätzungsweise 10-20%. Einen prozentualen

Anteil von 20% beschrieben bereits Dates et al. [15].

Im Vergleich zum Magencorpus zeigte sich im Magenantrum eine geringere Zellzahl

und Intensität ghrelinpositiver Zellen, wie zuvor bereits beschrieben wurde [63].

Weiterhin wurden bereits in der humanen Duodenalschleimhaut Ghrelinzellen dar-

gestellt [69]. Die genaue Lokalisation der Ghrelinzellen wurde jedoch bislang nicht

beschrieben. In dieser Studie zeigten sich lediglich vereinzelte Ghrelinzellen in der

duodenalen Mucosa. Diese waren im Zottenepithel meist im Bereich der Zottenba-

sis gelegen, teilweise auch in den Brunner Drüsen.

Neben der Ghrelinexpression im Magen und in der Duodenalschleimhaut wurde

auch die Gastrale Metaplasie der Duodenalschleimhaut betrachtet. In der Gastralen

Metaplasie sind im Vergleich zum Magen weniger Ghrelinzellen zu sehen. In der

Literatur findet man bisher keine Information zu Ghrelinzellen in der Gastralen Me-

taplasie. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass sich Ghrelinzellen auch in

dem Falle bilden, wenn Magengewebe metaplastisch in anderen Geweben ensteht.

Das Ausmaß ist jedoch geringer als im Magen selbst.

Im Pankreasgewebe demonstrierten Volante et al. die Kolokalisation von Ghrelinzel-

len mit insulinproduzierenden β-Zellen [68]. Ghrelinzellen wurden auch in anderen

Studien im humanen Pankreasgewebe nachgewiesen, jedoch fanden z.B. Wierup et

al. keine Kolokalisation mit α- oder β-Zellen [70]. Date et al. identifizierten Ghrelin-

zellen in der Peripherie der Langerhans-Inseln. Weiterhin zeigten sie in isolierten

Langerhans-Inseln die Stimulation von Insulin durch Ghrelin [16]. Die Expression der

Ghrelinzellen, ob im Tiermodell oder in humanem Pankreasgewebe, wurde unter-

schiedlich lokalisiert in α-, in β- oder in weder α- noch β-Zellen. Ghrelinproduzieren-

de Zellen im Pankreas wurden zuvor bereits als ԑ-Zellen beschrieben [2]. In vorlie-

gender Arbeit konnten Ghrelinzellen in der Immunfluoreszenzfärbung vereinzelt im

Pankreasgewebe dargestellt werden. Man fand sie vereinzelt in Drüsenläppchen,

jedoch auch in Langerhans-Inseln, hauptsächlich jedoch im interstitiellen Gewebe.

Ob die Ghrelinzellen mit α- oder β-Zellen übereinstimmen, wurde nicht untersucht.

In dieser Studie wurden nicht nur Ghrelinzellen im gesunden Pankreasgewebe son-

dern auch in der Pankreatischen Metaplasie untersucht, welche im Rahmen einer

Anja Sonst

50

chronischen Gastritis auftritt [18, 22]. Die Ghrelinzellen in der Pankreatische Meta-

plasie wurden mittels Immunhistochemie und Immunfluoreszenzfärbung angefärbt.

In der immunhistochemischen Färbung zeigten sich einzelne Ghrelinzellen innerhalb

der Pankreatischen Metaplasie. Im umliegenden Magengewebe war jedoch eine

vermehrte Ghrelinzellexpression auffällig, auch Ghrelinkonglomerate. Dies scheint

ein Kompressionseffekt zu sein. Durch das Entstehen der Pankreatischen Metaplasie

wird das umliegende Gewebe verdrängt. Somit häufen sich die Ghrelinzellen in die-

sen Bereichen an. Bei der Immunfluorezenzfärbung sieht man, dass sich im amy-

lasepositiven Bereich Ghrelinzellen befinden. Dies bestätigt die vorherige immun-

histochemische Ghrelinfärbung, nämlich dass Ghrelinzellen im pankreatischen Ge-

webe existieren.

Ghrelin wurde bereits mit entzündlichen Zuständen wie u.a. chronisch entzündli-

chen Darmerkrankungen, Barrett Mucosa und Sepsis in Verbindung gebracht [36,

41, 45]. In Präparaten mit Refluxösophagitis war jedoch keine Ghrelinexpression

festzustellen. In der Barrett-Mucosa zeigten sich allerdings Ghrelinzellen, eingebet-

tet in das flache Zylinderepithel mit der inkompletten intestinalen Metaplasie. Das

Vorhandensein ghrelinpositiver Zellen in der Barrett-Mucosa deutet eventuell auf

einen Mechanismus der Gegenregulation hin, um die Progression der Barrett-

Mucosa in ein Barrett-Adenokarzinom zu verhindern. Somit können dem Hormon

Ghrelin antiinflammatorische Eigenschaften zugeschrieben werden, wie in der Lite-

ratur bereits erwähnt wurde [41].

Bei einer Hp-Gastritis sind die Ghrelinzellen wie auch im gesunden Magencorpus

einzeln verteilt, wie in dieser Studie gezeigt werden konnte. Wo das Entzündungs-

geschehen auf den Drüsenkörper übergreift, finden sich weniger Ghrelinzellen. Da-

neben werden sie auch durch sekundäre Lymphfollikel verdrängt. Wie bereits in der

Literatur bekannt ist, führt eine Hp-Gastritis im Verlauf zur Atrophie des Drüsenkör-

pers mit einem Verlust der säureproduzierenden Parietalzellen [5]. Mit fortschrei-

tender Atrophie verändert sich das Ghrelinzellbild und nähert sich dem Zellbild ei-

ner Autoimmungastritis an, nämlich dass sich Ghrelinzellen zu Konglomeraten an-

ordnen, was im Verlauf noch genauer diskutiert wird. Nach erfolgreicher Hp-

Anja Sonst

51

Eradikationstherapie beschrieben Nwokolo et al. einen Anstieg des Plasmaghrelins

[47]. Das heißt, dass auch bei einer Hp-Gastritis ein erniedrigter Ghrelinspiegel vor-

liegt. Wie im Zustand einer Autoimmungastritis kann dies auf eine (beginnende)

Atrophie der Magenschleimhaut hindeuten. Einen erniedrigten Plasmaspiegel des

aktiven Ghrelinspiegels bei Hp-positiven im Vergleich zu Hp-negativen Patienten

konnten auch Kawashima et al. messen. Auch diese Forschungsgruppe erreichte bei

Hp-positiven Patienten einen Ghrelinanstieg nach erfolgreicher Eradikationsthera-

pie. Entscheidend war jedoch, dass der Ghrelinspiegel bei Patienten mit schwerer

Schleimhautatrophie signifikant erniedrigt war, unabhängig von der Hp-Infektion.

Nach diesen Ergebnissen wird die Magenschleimhautatrophie als ein entscheiden-

der Faktor, der den Ghrelinspiegel moduliert, bezeichnet [38].

Somit kann man schlussfolgern, dass Ghrelin eine gastroprotektive Wirkung besitzt.

Durch den Wegfall von Ghrelin wird die Atrophie und somit die Karzinogenese ge-

fördert.

Das Ghrelinzellbild zeigte sich in der Autoimmungastritis deutlich verändert im Ver-

gleich zur gesunden Magenschleimhaut. Durch eine Atrophie der Magenschleim-

haut, welche mit dem Verlust von Parietalzellen einhergeht, kommt es zur Achlor-

hydrie und Hypazidität. Dieser Zustand verursacht die reaktive Freisetzung von

Gastrin aus Zellen des Magenantrums, was in einer Hypergastrinämie resultiert. Das

Ergebnis ist eine Hyperplasie endokriner Zellen des Magencorpus.

Anscheinend gruppieren sich die ghrelinpositiven Zellen in der atrophen Schleim-

haut zu Konglomeraten ähnlich der ECL-Zellen, die bekanntermaßen durch Gastrin

angesteuert werden (s. Abb. 48) [12, 25, 57]. Es wurden bereits ECL-Hyperplasien

beschrieben, die wohl Ghrelin sezernieren [58]. Ghrelinzellen sind jedoch eigen-

ständige Zellen, teilweise als „A-like cells“ beschrieben [15, 19, 65], und bilden zu-

sammen mit weiteren neuroendokrinen Zellen wie den ECL-Zellen Konglomerate.

Diese endokrinen Zellkonglomerate können als Kompensation der Atrophie des

Drüsenkörpers in der Autoimmungastritis interpretiert werden, da in diesem Fall

das Serumghrelin abnimmt. Eine Abnahme des Serumghrelins bei atropher Gastritis

beschrieben bereits Checci et al. [11]. In der Immunfluoreszenzfärbung zeigte sich

neben Konglomeraten von Ghrelinzellen auch eine lineare Progression. Möglicher-

Anja Sonst

52

weise entstehen die Ghrelinzellkonglomerate und die lineare Anordnung der Ghre-

linzellen durch die Atrophie der Schleimhaut und durch den Untergang des Drüsen-

körpers. Dieser Zelluntergang betrifft anscheinend hauptsächlich die Haupt- und

Parietalzellen, die im gesunden Zustand die Ghrelinzellen örtlich voneinander tren-

nen und ein locker verteiltes Ghrelinzellbild erscheinen lassen.

Da der prozentuale Anteil der Ghrelinzellen in der Autoimmungastritis im Vergleich

zum gesunden Magengewebe gleich bleibt (10-20% Ghrelinzellen anteilig an allen

neuroendokrinen Zellen) bzw. sogar etwas ansteigt, reagieren Ghrelinzellen an-

scheinend wie die ECL-Zellen auf Gastrinstimulation, was in einer endokrinen Zell-

hyperplasie resultiert.

An dieser Stelle soll der Zusammenhang zwischen Ghrelin und Gastrin erörtert wer-

den, welcher bereits durch verschiedene Forschungsgruppen untersucht wurde.

Man gelangte jedoch zu widersprüchlichen Ergebnissen [11, 19, 26, 59, 72].

In nachfolgendem Schaubild soll das gastrale Hormonsystem mit der möglichen Ein-

bindung von Ghrelin dargestellt werden (s. Abb. 48). Gastrin stimuliert bei Nah-

rungsaufnahme die Parietalzellen, welche Magensäure bilden und diese ins Magen-

lumen sezernieren. Gastrin verstärkt diesen Effekt durch die Stimulation der ECL-

Zellen, welche über Histamin die Parietalzellen zur HCl-Bildung anregen. Die Nah-

rungsaufnahme hat zuvor den pH-Wert zu neutralen Werten gepuffert. Der pH-

Wert sinkt nun durch die vermehrte Magensäure im Magenlumen, womit der Aus-

gangszustand vor Nahrungsaufnahme wieder hergestellt wird. Über diesen ausge-

glichenen pH-Wert wird über die somatostatinsezernierende D-Zelle die Gastrinfrei-

setzung gehemmt. Der luminale pH-Wert und Gastrin sind über einen negativen

Feedbackmechanismus gekoppelt. Möglicherweise spielt Ghrelin in diesem Regel-

kreis eine wichtige Rolle.

Anja Sonst

53

In vorliegender Arbeit wurde erstmalig ein Gastrinrezeptor auf humanen Ghrelinzel-

len identifiziert. Bislang wurde dieser Rezeptor immunhistologisch nur im Ratten-

modell angefärbt [26]. Der Gastrinrezeptor konnte auf Ghrelinzellen im gesunden

Corpusgewebe als auch in der Autoimmungastritis mittels Immunfluoreszenzfär-

bung dargestellt werden. In der Autoimmungastritis fiel auf, dass der Rezeptor in

den Konglomeraten und in der linearen Progression der neuroendokrinen Zellen

stärker fluoreszierte als auf den restlichen Zellen, was möglicherweise eine höhere

Suszeptibilität für Gastrin bedeutet.

Die Tatsache, dass Ghrelinzellen einen Gastrinrezeptor besitzen, unterstützt die

Hypothese, dass Gastrin Einfluss auf die Ghrelinsekretion nimmt. Im Zustand einer

atrophen Schleimhaut stellt sich, wie zuvor erwähnt, physiologischerweise eine Hy-

pergastrinämie ein. Bei Autoimmungastritispatienten, bei denen eine Hypergas-

trinämie vorherrscht, war in dieser Arbeit der Spiegel des aktiven Ghrelins signifi-

kant erniedrigt, der Spiegel des Gesamtghrelins nur tendenziell. Dies deckt sich mit

der Aussage durch Isomoto et al., die einen erniedrigten Ghrelinplasmaspiegel bei

chronischer Gastritis nachwiesen [33]. Die Hypergastrinämie bei Patienten mit Au-

toimmungastritis konnte durch den erhöhten Gastrinspiegel belegt werden. Somit

waren im durchgeführten ELISA dieser Arbeit Gastrin und Ghrelin negativ korreliert.

Bei niedrigen Fallzahlen bedarf es jedoch weiterer Untersuchungen.

Mucosa G D PECL

HCl

Gastrin

HistaminSomatostatin

Inhibition

HCl

+

+

+

+

-

Blut

Lumen

HCl

Antrum Corpus

Ghr

???

Abb. 48 Mögliche Einbindung von Ghrelin in das gastrale Hormonsystem

Anja Sonst

54

In unserer Arbeitsgruppe wurde der Zusammenhang zwischen Ghrelin und Gastrin

in weiteren Experimenten untersucht. In einem Primärzellkulturversuch konnte in

frisch isolierten Magenzellen der Ratte die Ghrelinexpression durch steigende Pen-

tagastrinkonzentrationen gehemmt werden [50].

Diese gesamten Fakten deuten auf einen Zusammenhang zwischen Ghrelin und

Gastrin hin.

Auch Somatostatin spielt im gastralen Hormonsystem eine wichtige Rolle und

hemmt, wie in obiger Grafik gezeigt, die Gastrinfreisetzung. Einen Zusammenhang

zwischen Ghrelin und Somatostatin demonstrierten Egido et al., die einen hem-

menden Effekt durch Ghrelin auf die Somatostatinfreisetzung beschrieben [21]. Im

Vergleich zu dieser Studie bietet die Untersuchung von Strickertsson et al. kontro-

verse Ergebnisse [61]. Diese Forschungsgruppe zeigte einen inhibitorischen Effekt

durch Somatostatin auf die Ghrelinzellen. Allerdings wurde dieser Versuch mit Gast-

rin-Knockout-Mäusen durchgeführt. Da Gastrin für die Integrität der Magen-

schleimhaut mitverantwortlich ist und da es bei Wegfall des Gastrins zur Achlor-

hydrie und zur Schleimhautatrophie kommt [24], muss man davon ausgehen, dass

auch Ghrelinzellen zugrunde gehen und dies dann ursächlich für die beobachtete

Suppression ist.

Zuletzt soll noch der in dieser Studie gemessene Ghrelinspiegel mit den Werten aus

der Literatur verglichen werden.

Dostalova [20] 118,4-296 pmol/l Gesamtghrelin

Kojima [39]

Kojima [40]

117 pmol/l

100-150 pmol/l

10-20 pmol/l

?

Gesamtghrelin

Aktives Ghrelin

Ariyasu [3] 166 pmol/l ?

Checci [11] 282 pmol/l ?

Eigene Werte 163,42 pmol/l

0,81 pmol/l

Gesamtghrelin

Aktives Ghrelin

Tab. 14 Ghrelinkonzentrationen Zum besseren Vergleich in pmol/l ausgewiesen; fmol/ml = pmol/l. pg/ml x 0,296 = pmol/l [64].

Anja Sonst

55

Tabelle 14 kann man entnehmen, dass die Werte durchaus vergleichbar sind, bis auf

die Werte des aktiven Ghrelins. Leider wird in der Literatur häufig aktives nicht vom

Gesamtghrelin unterschieden, was auch Tham et al. bemängeln [64]. Eine weitere

Kontroverse ist, dass teilweise bei Desacyl-Ghrelin vom Gesamtghrelin ausgegangen

wird [55], andere sind der Meinung, dass sich das Gesamtghrelin aus acyliertem und

desacyliertem Ghrelin zusammensetzt [64]. Außerdem ist es oft nicht klar, ob es

sich um prä- oder postprandiale Werte handelt. Die Werte des aktiven Ghrelins aus

vorliegender Studie sind deutlich erniedrigt im Vergleich zu den Werten von Kojima

et al. [40]. Die Problematik daran ist, dass die Blutproben in vorliegender Arbeit

teilweise zugeschickt wurden. Außerdem wurde das Blut in EDTA-Röhrchen abge-

nommen und kein Aprotinin hinzugefügt, was die schnelle Degradation verhindern

soll [54]. Dabei ist das aktive Ghrelin bekanntermaßen weitaus anfälliger für eine

Degradation als das stabile Gesamtghrelin.

Mit dieser Studie ist es gelungen, ein differenziertes Modell der Ghrelinexpression

in metaplastischen und entzündlichen Geweben des oberen Gastrointestinaltrakts

zu zeichnen. Zudem konnte aufgrund des gefundenen Gastrinrezeptors auf huma-

nen Ghrelinzellen, der starken Expression des Rezeptors bei der Autoimmungastri-

tis, des Mitreagierens im Rahmen der endokrinen Zellknötchen und durch Blutana-

lysen Hinweise gesammelt werden, dass Ghrelin offenbar durch Gastrin wesentlich

beeinflussbar ist.

Somit ermöglicht diese Arbeit eine Erweiterung und bessere Definition des komplex

gesteuerten gastralen Hormonsystems. Lediglich funktionelle Zellkulturansätze feh-

len als weiterer Beleg und sollten weiter verfolgt werden.

Als Ausblick könnte Ghrelin in vielerlei Hinsicht eine Rolle in der modernen Medizin

spielen, sei es als Bedside-Marker im Rahmen der Autoimmungastritis, als Thera-

peutikum bei Ulkusleiden oder zur Gewichtsregulation, antagonistisch bei der Be-

handlung von Adipositas oder zur Substitution bei anorektischen/kachektischen

Patienten.

Anja Sonst

56

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Anja Sonst

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9 Abkürzungsverzeichnis

AIG Autoimmungastritis

AUC area under the curve

BMI body mass index

CCK Cholezystokinin

COX-2 Cyclooxigenase 2

ECL enterochomaffin-like cell

ELISA enzyme linked immunosorbent assay

GH growth hormone

GHS-R growth hormone secretagogue receptor

Hp Helicobacter pylori

HE-Färbung Hämatoxylin-Eosin-Färbung

IGF-1 insuline-like growth factor 1

mRNA messenger Ribonucleinsäure

PAS periodic acid-Schiff reaction

PCA parietal cell antibody

PPI Protonenpumpenhemmer

RT-PCR Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion

TNF-α Tumornekrosefaktor α

Anja Sonst

66

10 Abbildungsverzeichnis

Abb. 1 Struktur des menschlichen Ghrelins [46] ......................................................... 5

Abb. 2 Immunhistochemische Ghrelinfärbung von normalem Ösophagusgewebe,

100-fache Vergrößerung ............................................................................................ 25

Abb. 3 HE-Färbung von normalem Ösophagusgewebe, 100-fache Vergrößerung ... 25

Abb. 4 Immunhistochemische Ghrelinfärbung von normalem Magencorpusgewebe,

100-fache Vergrößerung ............................................................................................ 26

Abb. 5 HE-Färbung von normalem Magencorpusgewebe, 100-fache Vergrößerung 26

Abb. 6 Immunhistochemische Ghrelinfärbung von normalem Magenantrumgewebe,

100-fache Vergrößerung ............................................................................................ 27

Abb. 7 HE-Färbung von normalem Magencorpusgewebe, 100-fache Vergrößerung 27

Abb. 8 Immunhistochemische Ghrelinfärbung von normalem Duodenumgewebe,

100-fache Vergrößerung ............................................................................................ 28

Abb. 9 HE-Färbung von normalem Duodenumgewebe, 100-fache Vergrößerung ... 28

Abb. 10 Immunhistochemische Ghrelinfärbung von normalem Ösophagusgewebe,

100-fache Vergrößerung ............................................................................................ 29

Abb. 11 HE-Färbung von normalem Ösophagusgewebe, 100-fache Vergrößerung . 29

Abb. 12 Immunhistochemische Ghrelinfärbung von Barrett Mucosa, 100-fache

Vergrößerung ............................................................................................................. 30

Abb. 13 Immunhistochemische Ghrelinfärbung von Barrett Mucosa, 200-fache

Vergrößerung ............................................................................................................. 30

Abb. 14 HE-Färbung von Barrett Mucosa, 100-fache Vergrößerung ......................... 30

Abb. 15 HE-Färbung von Barrett Mucosa, 200-fache Vergrößerung ......................... 30

Abb. 16 Immunhistochemische Ghrelinfärbung von Pankreatischer Metaplasie, 100-

fache Vergrößerung ................................................................................................... 31

Abb. 17 HE-Färbung von Pankreatischer Metaplasie, 100-fache Vergrößerung ....... 31

Abb. 18 Immunhistochemische Ghrelinfärbung von Autoimmungastritis, 100-fache

Vergrößerung ............................................................................................................. 32

Anja Sonst

67

Abb. 19 HE-Färbung von Autoimmungastritis, 100-fache Vergrößerung .................. 32

Abb. 20 Wartin-Starry-Färbung von Hp-Gastritis, 400-fache Vergrößerung ............. 33

Abb. 21 Immunhistochemische Ghrelinfärbung von Hp-Gastritis, inflammatorische

Infiltrate durch geschweifte Klammern gekennzeichnet, 100-fache Vergrößerung . 34

Abb. 22 HE-Färbung von Hp-Gastritis, inflammatorische Infiltrate durch geschweifte

Klammern gekennzeichnet, 100-fache Vergrößerung ............................................... 34

Abb. 23 Immunhistochemische Ghrelinfärbung von Hp-Gastritis, 100-fache

Vergrößerung ............................................................................................................. 35

Abb. 24 HE-Färbung von Hp-Gastritis, 100-fache Vergrößerung............................... 35

Abb. 25 Immunhistochemische Ghrelinfärbung von Gastraler Metaplasie, 100-fache

Vergrößerung ............................................................................................................. 36

Abb. 26 Alcian-PAS-Färbung von Gastraler Metaplasie, 100-fache Vergrößerung ... 36

Abb. 27 Ghrelin-Immunfluoreszenzfärbung von normalem Magencorpusgewebe,

200-fache Vergrößerung ............................................................................................ 37

Abb. 28 Chromogranin-Immunfluoreszenzfärbung von normalem

Magencorpusgewebe, 200-fache Vergrößerung ....................................................... 37

Abb. 29 Ghrelin-Chromogranin-Doppelfärbung von normalem

Magencorpusgewebe, 200-fache Vergrößerung ....................................................... 37

Abb. 30 Ghrelin-Chromogranin-Doppelfärbung von Autoimmungastritis, 200-fache

Vergrößerung ............................................................................................................. 39

Abb. 31 Ghrelin-Chromogranin-Doppelfärbung von Autoimmungastritis, 200-fache

Vergrößerung ............................................................................................................. 39

Abb. 32 Ghrelin-Chromogranin-Doppelfärbung von Autoimmungastritis, 200-fache

Vergrößerung ............................................................................................................. 40

Abb. 33 Ghrelin-Chromogranin-Doppelfärbung von Autoimmungastritis, 200-fache

Vergrößerung ............................................................................................................. 40

Abb. 34 Ghrelin-Chromogranin-Doppelfärbung von Autoimmungastritis, 200-fache

Vergrößerung ............................................................................................................. 40

Abb. 35 Ghrelin-Chromogranin-Doppelfärbung von Autoimmungastritis, 200-fache

Vergrößerung ............................................................................................................. 40

Anja Sonst

68

Abb. 36 Ghrelin-Chromogranin-Doppelfärbung von Pankreatischer Metaplasie, 200-

fache Vergrößerung ................................................................................................... 41

Abb. 37 Ghrelin-Chromogranin-Doppelfärbung von Pankreatischer Metaplasie, 200-

fache Vergrößerung ................................................................................................... 41

Abb. 38 Ghrelin-Gastrinrezeptor-Doppelfärbung von normalem

Magencorpusgewebe, Zytoplasma (Ghrelin) = grün, Gastrinrezeptor = rot, N =

Nucleus ....................................................................................................................... 42

Abb. 39 Ghrelin-Gastrinrezeptor-Doppelfärbung von Autoimmungastritis, 200-fache

Vergrößerung ............................................................................................................. 43

Abb. 40 Ghrelin-Gastrinrezeptor-Doppelfärbung von Autoimmungastritis, 200-fache

Vergrößerung ............................................................................................................. 43

Abb. 41 Ghrelin-Gastrinrezeptor-Doppelfärbung von Autoimmungastritis .............. 43

Abb. 42 Ghrelin-Amylase-Doppelfärbung von normalem Magengewebe,

Negativkontrolle, 200-fache Vergrößerung ............................................................... 44

Abb. 43 Ghrelin-Amylase-Doppelfärbung von normalem Pankreasgewebe, 200-

fache Vergrößerung ................................................................................................... 45

Abb. 44 Ghrelin-Amylase-Doppelfärbung von normalem Pankreasgewebe, 200-

fache Vergrößerung ................................................................................................... 45

Abb. 45 Ghrelin-Amylase-Doppelfärbung von Pankreatischer Metaplasie, 200-fache

Vergrößerung ............................................................................................................. 45

Abb. 46 Ghrelin-Amylase-Doppelfärbung von Pankreatischer Metaplasie, 200-fache

Vergrößerung ............................................................................................................. 45

Abb. 47 Präprandiale Werte von Gastrin, aktivem/octanoyliertem Ghrelin und

Gesamtghrelin bei Patienten mit Autoimmungastritis (AIG) und Kontrollpersonen 47

Abb. 48 Mögliche Einbindung von Ghrelin in das gastrale Hormonsystem .............. 53

Anja Sonst

69

11 Tabellenverzeichnis

Tab. 1 Kollektiv Ösophagus ........................................................................................ 15

Tab. 2 Kollektiv Magencorpus .................................................................................... 16

Tab. 3 Kollektiv Magenantrum ................................................................................... 16

Tab. 4 Kollektiv Duodenum ........................................................................................ 16

Tab. 5 Kollektiv Pankreas ........................................................................................... 16

Tab. 6 Kollektiv Refluxösophagitis ............................................................................. 17

Tab. 7 Kollektiv Barrett Mucosa ................................................................................. 17

Tab. 8 Kollektiv Pankreatische Metaplasie ................................................................ 17

Tab. 9 Kollektiv Autoimmungastritis .......................................................................... 18

Tab. 10 Kollektiv Hp-Gastritis der Corpusmucosa...................................................... 18

Tab. 11 Kollektiv Hp-Gastritis der atrophen Corpusmucosa ...................................... 18

Tab. 12 Kollektiv Gastrale Metaplasie ........................................................................ 18

Tab. 13 Autoimmungastritispatienten und Kontrollkollektiv der Blutproben .......... 23

Tab. 14 Ghrelinkonzentrationen ................................................................................ 54

Anja Sonst

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12 Danksagung

Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. Tilman Rau für die hervorragende fachliche

Betreuung, für sein unermüdliches Engagement bei der Entstehung dieser Arbeit,

seine ständige Diskussions- und Hilfsbereitschaft und zuletzt für das stets schnelle

Korrekturlesen.

Ebenso bedanke ich mich herzlich bei Herrn Prof. Dr. Arndt Hartmann für die Mög-

lichkeit der Promotion am Pathologischen Institut und für die Bereitstellung der

Laborausstattung, um diese interessante Themenstellung zu bearbeiten.

Herrn Prof. Dr. Winfried Neuhuber möchte ich sehr herzlich danken, dass er mir sein

Elektronenmikroskop zur Verfügung gestellt hat und mir bei der Mikroskopie und

Fotografie eine große Hilfe war.

Des Weiteren danke ich Herrn Prof. Dr. Peter Konturek, der im Wesentlichen zur

Initiation dieser Studie beigetragen hat und maßgeblich am Patientenmanagement

beteiligt war.

Ganz besonders möchte ich Katja Sesselmann (ehemals Zänker) und Angela

Neumann für die geduldige technische Unterstützung bei der Laborarbeit danken.

Ein herzlicher Dank gilt außerdem Frau Zimmermann für ihre Hilfe bei der Organisa-

tion der histologischen Schnitte aus dem Archiv und Frau Winkelmann für die Be-

reitstellung der Schnittpräparate.

Zuletzt möchte ich mich bei meinen Eltern bedanken, die mir durch ihre Unterstüt-

zung das Medizinstudium und somit in diesem Rahmen die Promotion ermöglicht

haben.

Anja Sonst

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13 Lebenslauf

Persönliche Daten

Name Sonst, geb. Mathews

Vorname Anja Irene

Geburtsdatum 22.07.1982

Geburtsort Nürnberg

Eltern Harald und Brigitte Mathews

Schwester Martina Mathews

Ehemann Michael Sonst

Bildungsgang

09/89-07/93

09/93-06/02

Beckmann-Grundschule Nürnberg

Sigmund-Schuckert-Gymnasium Nürnberg

06/02 Allgemeine Hochschulreife

10/03-11/09 Studium der Humanmedizin an der Friedrich-Alexander-

Universität Erlangen-Nürnberg

09/05 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

11/09 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

Beruflicher Werdegang

03/10-06/11 Wissenschaftliche Mitarbeiterin am Institut für Klinische

Pharmakologie der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

seit 03/10 Assistenzärztin in der Zentralen Notaufnahme am

Klinikum Fürth

Anja Sonst

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Publikationen

Dormann H*, Sonst A*, Müller F, Vogler R, Patapovas A, Pfistermeister B, Plank-Kiegele B, Kirchner M, Hartmann N, Bürkle T, Maas R: Unerwünschte Arzneimittel-ereignisse bei betagten Notaufnahmepatienten – Bedeutung der potenziell inadä-quaten Medikation für ältere Menschen (PRISCUS). Dtsch Arztebl Int 2013; 110(13): 213-9; DOI: 10.3238/arztebl.2013.0213 *geteilte Erstautorenschaft Kirchner M, Bürkle T, Patapovas A, Mathews A, Sojer R, Müller F, Dormann H, Maas R, Prokosch HU: Building the technical infrastructure to support a study on drug safety in a general hospital. Stud Health Technol Inform. 2011;169:325-9. Bürkle T, Müller F, Patapovas A, Sonst A, Pfistermeister B, Plank-Kiegele B, Dormann

H, Maas R: A new approach to identify, classify and count drug-related events. British Journal of Clinical Pharmacology, 76: 56–68. doi: 10.1111/bcp.12189 Sedlmayr B, Patapovas A, Kirchner M, Sonst A, Müller F, Pfistermeister B, Plank-Kiegele B, Vogler R, Criegee-Rieck M, Prokosch HU, Dormann H, Maas R, Bürkle T: Comparative evaluation of different medication safety measures for the emergency department: physicians' usage and acceptance of training, poster, checklist and computerized decision support. BMC Med Inform Decis Mak. 2013 Jul 29;13:79. doi: 10.1186/1472-6947-13-79. Patapovas A, Dormann H, Sedlmayr B, Kirchner M, Sonst A, Müller F, Pfistermeister B, Plank-Kiegele B, Vogler R, Maas R, Criegee-Rieck M, Prokosch HU, Bürkle T: Me-dication safety and knowledge-based functions: a stepwise approach against in-formation overload. Br J Clin Pharmacol. 2013 Sep;76 Suppl 1:14-24. doi: 10.1111/bcp.12190.